JPH09511395A

JPH09511395A - HIV Vpr and Vpx proteins

Info

Publication number: JPH09511395A
Application number: JP7524870A
Authority: JP
Inventors: エー．アザド，アームド; ジー．マクレディ．イアン; アルナギリ，チンニアー
Original assignee: バイオモレキュラーリサーチインスティテュートリミティド
Priority date: 1994-03-25
Filing date: 1995-03-24
Publication date: 1997-11-18
Also published as: EP0753006A4; EP0753006A1; CA2186398A1; WO1995026361A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト免疫不全ウィルスのVpr蛋白質の生物学的に活性なペプチドフラグメント、これらのペプチド又はその生物学的に活性なアナログを含む医薬的組成物、前記ペプチドのアンタゴニスト、及びこれらのアンタゴニストを含む医薬的組成物、並びに本発明の化合物及び組成物を利用する治療及びスクリーニング方法に関する。１つの好ましい実施形態において、本発明は、HFRIG及びHSRIGから選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むヒト免疫不全ウィルス(HIV)のVpr蛋白質の、又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログのアンタゴニストであって、該アンタゴニストが、増殖停止、細胞複製停止、細胞毒性、細胞骨格破壊、及び小胞体に対する効果からなる群から選択されるVprにより媒介される１以上の活性を阻害する能力を有することを特徴とするアンタゴニストを提供する。本発明は、細胞増殖により媒介される、又は真核細胞により引きおこされる病状の治療において、共通配列を含むVpr蛋白質又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの使用にも関する。 (57) [Summary] The present invention provides biologically active peptide fragments of the human immunodeficiency virus Vpr protein, pharmaceutical compositions containing these peptides or biologically active analogs thereof, antagonists of said peptides, and antagonists thereof. Pharmaceutical compositions comprising and methods of treatment and screening utilizing the compounds and compositions of the invention. In a preferred embodiment, the invention provides a human immunodeficiency virus (HIV) Vpr protein, or a biologically active fragment or analog thereof, comprising at least one amino acid sequence motif selected from HFRIG and HSRIG. Of the ability to inhibit one or more activities mediated by Vpr selected from the group consisting of growth arrest, cell replication arrest, cytotoxicity, cytoskeletal disruption, and effects on the endoplasmic reticulum. An antagonist characterized by having is provided. The invention also relates to the use of a Vpr protein comprising a consensus sequence or a biologically active fragment or analog thereof in the treatment of pathological conditions mediated by cell proliferation or caused by eukaryotic cells.

Description

【発明の詳細な説明】 HIVのVpr及びVpx蛋白質本発明は、ヒト免疫不全ウィルスのVpr蛋白質の生物学的に活性なペプチドフラグメント、これらのペプチド又はその生物学的に活性なアナログを含む医薬的組成物、前記ペプチドのアンタゴニスト、及びこれらのアンタゴニストを含む医薬的組成物、並びに本発明の化合物及び組成物を利用する治療及びスクリーニング方法に関する。発明の背景 AIDSの原因となる因子であるHIV−１は、単なるレトロウィルスには見い出されていない遺伝子tat，rev，vif，vpr，vpu 、及びnef を有する他の霊長類動物レンチウィルス様の複合レトロウィルスである。tat 及びrev の機能はかなりよく理解されているが、ウィルスの試験管内感染性に本質的でないので補助的遺伝子としてしばしば言及される残りのものは、病因における役割についてほとんど理解されていない。 HIV−１ウィルス蛋白質Ｒ(Vpr)(Wong−Staal et al ，1987)は、ビリオン会合性蛋白質である（Cohen et al ，1990ａ；Yuan et al ，1990）。HIV-１Vprは弱い転写活性化因子であり（Ogawa et al ，1990；Cohen et al ，1990ｂ）、HIV- １Gag蛋白質に結合する(Lu et al ，1993；Paxton et al ，1993；Lavallee e t al ，1994)ことが報告されている。Vprは、確立された細胞系におけるウィルス複製に本質的でない(Dedera et al ，1989；Cohen et al ，1990ｂ）が、それが初期のマクロファージにおけるウィルス複製に重大な機能を有する可能性があることを示唆する証拠がある（Balotta et al ，1993；Matsuda et al ，1993）。そのビリオことの会合のため、Vprがおそらくウィルスの侵入又は未コート化において、HIV−１感染において早期の役割を有することが示唆されている（Cohen et al ，1990ａ；Yuan et al ，19 90；Yu et al ，1990）。 Vprは、HIV−１の最も高度に保存された蛋白質の１つであり、全ての霊長類動物レンチウィルスによいてVpr及び／又はVpxとして存在する（Tristem et al ， 1990；図４Ａを参照のこと）。Vpxは同様にビリオン会合性である（Cohen et al ，1990ａ；Yuan et al ，1990；Yu et al ，1988，1990，1993）。HIV-２Vpr は、ヒトマクロファージの生産的感染に本質的である（Hattori et al ，1990）がHIV−１Vprのように、確立された細胞系における複製において重要でない（Pe dera et al，1989）。同様にHIV-２Vpxは確立された細胞系に重要でない（Yu e t al ，1988；Guyader et al ，1989；Hu et al ，1989）が、新しいマクロファージにおける感染に必要とされ（Guyader et al ，1989；Yu et al ，1991）、末梢血液リンパ球におけるウィルス感染性を増大させる（Kappes et al ，19 91）。全ての中でおそらく最も説得力があるのは、完全なvpr 読み枠の保持のための生体内推進力があること及びVprにおける変異がアカゲザルにおける低ウィルス負荷を導くことが観察されている（Lang et al，1993）。我々はイーストにおいてVpr遺伝子をクローニングし、単相のイースト細胞に対するVpr蛋白質の効果と蛋白質Vif，Vpu及びNefの効果とを比較した。我々はVp r蛋白質が細胞増殖に絶大な効果を有するのに対して、テストされた他の蛋白質は効果を有さないという驚くべき発見をした。Vpr蛋白質は増殖阻止を引きおこし、これは細胞骨格への効果により媒介されるようである。我々は、この活性に重大なVpr 蛋白質の部分を同定した。この重大な部分は、保存されたアミノ酸配列モチーフ、即ちH(S／F)RIGを含み、この部分を含むペプチドは、哺乳動物又はイースト細胞に細胞外的に添加された時に活性を有する。Vpr蛋白質はHIV感染における早期の及びおそらく重大な役割を有するようであるのでこれは有用な治療標的を表す。我々は、Vpr蛋白質、及び特にそのＣ末端配列が真核細胞に対して一般的な抗増殖効果を有し、それゆえ細胞増殖により媒介される状態の治療において有用であることも見い出した。発明の概略１つの態様によれば、本発明は、HIV感染の治療方法であって、HFRIG及びHSRI Gから選択される少くとも１つのモチーフを含むVpr蛋白質のアンタゴニストの、又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの効果的な量を前記治療の必要な患者に投与するステップを含み、それによりHIV感染を防ぐこと、症状的AIDSへのHIV感染の進行を防ぐこと、又はAIDSの症状を緩和することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、前記Vpr蛋白質は、HSRIG，HFRIG，HSRIS，HFRAG，HIRAG，HLRAG ，RSRKG，RSRIS及びRSRIGからなる群から選択される少くとも１つの配列を含む。第２の態様において、本発明は、増殖阻止、細胞複製阻止、細胞毒性、細胞骨格破壊、及び小胞体への効果からなる群から選択されるVprにより媒介される１以上の活性を阻害する能力を有する、Vpr蛋白質の、又は先に定義される生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログのアンタゴニストを提供する。このようなアンタゴニストは、HIV感染の治療のための治療剤として有用であろうと考えられる。本発明は、医薬として許容される担体と共に活性構成物として先に定義される Vprのアンタゴニストを含む医薬的組成物も含む。 Vpr又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログに対する特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体、並びにVprの、又は前記生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの発現を防ぐアンチセンスRNAもしくは三本鎖DNAが、Vprの活性の阻害の方法を供し、結果として本発明の範囲内であることを当業者は認識するであろう。与えられたペプチド配列に対するモノクローナル抗体の製造方法、並びに標的細胞におけるアンチセンスRNAもしくは三本鎖D NA製造を誘導するための方法は、当該技術において公知である。例えば、Vpr蛋白質のＣ末端部分をコードする領域が抑制性アンチセンス配列により、又は抑制性ペプチドをコードする配列により置換されているvpr 遺伝子を、HIV感染又はA IDSの遺伝子治療のために用いることができるであろう。第３の態様において、本発明は、Vpr蛋白質の、又は先に定義される生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログのアンタゴニストとして有用であると推測される化合物をスクリーニングする方法であって、本明細書に記載されるような、増殖阻止、細胞複製阻止、細胞毒性、細胞骨格破壊、及び小胞体への効果からなる群から選択される生物学的活性のアッセイにおいて、Vprの活性を阻害することにおけるテスト化合物の効果性を測定するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。我々の結果は、Vpr蛋白質又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログが、細胞内又は細胞外のレベルのいずれにおいても攻撃され得る活性を有することを示し、それゆえ両方のタイプの生物学的活性は本発明の範囲内である。第４の態様によば、本発明は、HIV感染を防ぐための、又はHIV感染の効果を緩和するためのワクチンであって、医薬として許容される担体と共に、Vpr配列の少くともＣ末端21アミノ酸をコードするHIVゲノムの部分が削除されているヒト免疫不全ウィルス−１又はヒト免疫不全ウィルス−２を含むことを特徴とするワクチンを提供する。好ましくは、Vpr配列の少くともＣ末端33アミノ酸をコードする前記ゲノムの部分が削除される。更に好ましくは、Vpr配列のＣ末端領域をコードするゲノム部分とNef遺伝子のＮ末端をコードするHIVゲノムの部分との両方が削除される。Nef遺伝子の関連した部分は、1994年３月18日に出願された我々の同時係属特許出願第PCT／AU94／00254号(WO94／26776)に記載される。第５の態様によれば、本発明は、細胞増殖により媒介される病気の治療方法であって、Vpr蛋白質の、又は本明細書に記載される共通配列の少くとも１つを含む生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの効果的な量を、前記治療の必要な哺乳動物に投与し、それにより前記病気と媒介する細胞の増殖を阻害することを含むことを特徴とする方法を提供する。細胞増殖により媒介される病気は、これらに限定されないが、癌、白血病及び乾癬を含む。増殖している細胞は、高度にカルシウム依存性である。我々は、Vprペプチドの抗増殖効果がＣ²⁺−チャンネル輸送のインヒビターにより妨げられることを見い出した。それゆえ本発明のこの態様において、Vpr蛋白質又はフラグメントもしくはそのアナログは、Ｃ²⁺−チャンネル輸送のエンハンサーと組み合わせて任意に用いられ得る。第６の態様によれば、本発明は、病原体により引きおこされる病気を治療する方法であって、Vpr蛋白質の、又は本明細書に記載される共通配列の少くとも１つの配列を含む生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの効果的な量を、前記治療の必要な哺乳動物に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。バクテリア、寄生虫、イースト、又は真菌により引きおこされる病気は全て本発明のこの態様の範囲内である。第７の態様によれば、本発明は、細胞膜に、又は細胞の内部に医薬的に活性な物質を輸送するための薬剤であって、該薬剤が、Vprペプチド、又はHFRIG及びHS RIGから選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含む生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログを含み、前記ペプチド、フラグメント又はアナログが前記医薬的に活性な物質に結合されていることを特徴とする薬剤を提供する。本発明は、細胞膜又は細胞の内部に医薬的に活性な物質を輸送する方法であって、前記細胞を先に定義される薬剤に接触させるステップを含むことを特徴とする方法も提供する。前記活性物質は、ペプチドに結合することができるいずれの化学的実在物でもあり得、特にペプチド又はヌクレオチドであり得る。カップリングはいずれの慣用の手段によってもおこされ得、例えばカルボジイミドのような薬剤を用いる化学的カップリングによりおこされ得る。活性物質がペプチドである場合、Vprペプチド及び医薬的に活性なペプチドが、融合蛋白質として組換え手段により共に合成され得る。当業者は、この方法において輸送され得る適した種々の医薬活性剤、及び方法を知り、それによりVpr蛋白質に結合され得るであろう。当業者は、結合が効果的であるか否か、及び薬剤が要求される医薬的活性を維持するか否かも知っているであろう。本発明の好ましい実施形態において、Vpr蛋白質は少くともVpr 配列のＣ末端21アミノ酸、更に好ましくは少くともVpr配列のＣ末端配列33アミノ酸を含むフラグメントである。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST) のような相体又は融合蛋白質に結合したVpr蛋白質又はその生物学的に活性なフラグメントが本発明の範囲内であることが明らかに理解されよう。組換え、合成及び天然由来のVpr蛋白質並びにフラグメント及びそのアナログが本発明の範囲内であることが更に理解されよう。本明細書内の記載は特にHIV-１のVpr蛋白質に関するが、上述のように、HIV- ２もVpr蛋白質を有するので、本発明は、HIV−２由来のVpr蛋白質及びH(S／F)RI Gモチーフの同等物、並びに他のレトロウィルスのVpr蛋白質に同様に適用できる。本明細書を通して、アミノ酸のための略号の一文字コードを用いる。Ｓ／ＦはＳ又はＦのいずれもが存在し得ることを示す。発明の詳細な記載本発明は、以下の非限定の実施例及び図面のみの参照により詳細に記載されるであろう：図１は、イーストにおけるvpr 遺伝子のクローニングに用いられるスキームを示す；図２は、イーストにおけるHIV−１補助蛋白質の発現の増殖への効果を示す。図３は、Vprを発現するイースト細胞における形態変化を示す。銅誘導イースト細胞を光学顕微鏡により検査した。DY150(pYEULCBX)対照形質転換細胞を上部パネル（ａ）に示し、典型的に大きいDY150(pYEULCBX．Vpr)形質転換細胞を下部パネル（ｂ）に示す。バーは10μｍを表す。図４は、フローサイトメトリーによる誘導された細胞の分析の結果を示す；図５は、Vprにおける毒性領域の同定を示す；一連のVpr構成物を示す。構成物により製造されたVprの領域をうす暗いブロックで示し、暗いブロックはGSTを表す；GSTはスケールを示していない蛋白質配列に関するBamHI(Ｂ)、EcoRI（Ｅ）及びSalＩ（Ｓ）部位を示す。ボールドで示されるH(S／F)RIGは、Sal Ｉ部位の両方の部位上の配列によりコードされる。これらの蛋白質を製造する形質転換されたイースト細胞の増殖を、右のコラムに記載する。図６はHIV−１VprとHIV−２，SIV及びイースト由来の蛋白質との関係を示す。Ａ．HIV−１Vprと関連するVprとのアラインメント Vpr及びVpx蛋白質をその全体についてのアラインメントさせる。配列は、HIV- １Vpr NL４−３(Adachi et al ，1992)，HIV−２ROD（Clavel et al ，1992）及びSIVmac 239（Regier and Desrosiers，1990）から得られる。３以上の同一アミノ酸の領域を影で示す。Ｂ．Sac１ｐ及びHIV−１Vprのアラインメント Vprの完全なアミノ酸配列をSac１ｐのアミノ酸77〜176とアラインメントした（Cleves et al ，1990）。同一残基を影で示し、H(S／F)RIGにおける残基を下線で示す。図７は、Vprを発現するイーストの浸透感応性(osmosensitivity)を示す。図８は、変異ウィルスの作製のために用いられるストラテジーを示す。図９は、逆転写酵素アッセイにより測定されるヒトPBMCにおける変異ウィルスの複製速度を示す。Ａ．刺激された細胞；Ｂ．未刺激の細胞。図10は、イーストコロニー形成への合成Vprペプチドの効果を示す。Ａ．ペプチドなし；Ｂ．ペプチド１；Ｃ．ペプチド２；Ｄ．ペプチド３。図11は、合成Vprペプチドへのイースト細胞の応答の結果を要約する。処理条件は実施例11に記載される。図12は、ペプチド３についての投与応答関係を示す。ペプチド３を濃度範囲にわたりイースト細胞に添加し、細胞をコロニー形成についてアッセイした。図13は、Vprペプチドの存在中でのコロニー形成に対するイースト細胞濃度の効果を示す。種々の細胞濃縮物を５μＭペプチド３の存在中でインキュベートし、細胞をコロニー形成についてアッセイした。図14は、１時間の合成Vprペプチドでのイースト細胞のインキュベーションの後のプロピジウムイオジド（PI）取り込みのフローサイトメトリー分析の結果を示す。サンプルは、ペプチドなし、ペプチド１、ペプチド２及びペプチド３である。図15は、種々の時間でのペプチド３でのイースト細胞のインキュベーションの後のプロピジウムイオジド取り込みのフローサイトメトリー分析の結果を示す。図16は、合成Vpr蛋白質でエレクトロポレーションされたRC２ａ細胞におけるプロピジウムイオジド取り込みのフローサイトメトリー分析の結果を示す。図17は哺乳動物細胞がエレクトロポレーションされ、前及び横散乱により測定された細胞構造における変化についてのフローサイトメトリーにより分析された時に得られた結果を示す。図18は、TMB−８によるイースト細胞の保護を示す。図19は、（Ａ）エレクトロポレーション及び（Ｂ）エレクトロポレーションなしの細胞外添加の後にフローサイトメトリーにより測定されたCD⁴⁺ヒト細胞との FITC（フルオレセインイソチオシアネート）標識ペプチドの会合を示す。図20は、フローサイトメトリーにより測定されたＳ．セレビシアエ(S．cerevi siae) イースト細胞におけるエレクトロポレーションなしでのFITC−標識ペプチドの会合を示す。図21は、ヒトCD⁴⁺細胞（Ａ）及び（Ｂ）イースト細胞におけるインターナリゼーションされたFITC−標識ペプチド３を示す。図22は、Vpr及びSac１ｐとアクチンとの間の遺伝的相互作用を示す。イースト及びバクテリア本研究において用いられるイースト株は、サッカロマイセス・セレビシアエ（ Saccharomyces serevisiae）株DY150（MATa ura 3-52．leu 2-3，112 Trp 1-1 ade 2-1 his 3-11 can 1-100)、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）臨床的単離体JRW５、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）株Ｌ５（Leu ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）株MW−98−８ｃ（α uraＡ arg lys）及びスキゾサッカロマイセス・ポンブ(Schizosaccharomyc es pombe)株SpULA(ade6-704 ura4-D18 leu1-32 )ｈ^-である。株をYEPD（１％イースト抽出液、２％ペプトン、２％グルコース）中で増殖させた。大腸菌株TG１ Δ(lac-proAB )sup Ethi hsd Δ５Ｆ′（tra D36 proAB⁺ lacI^q lacZ ΔM15 ）も毒性研究のために用い、ZxYT培地(1.6％トリプトン、１％イースト抽出液、0.5％ Na Cl)上にプレートした。哺乳動物細胞２つのCD⁴⁺細胞系、RC２ａ及びJurkatを10％熱不活性化胎児ウシ血清(HIFCS) を含むRPMI−1640中に保持した。標準的なFicoll／Hypaque密度勾配法により血液バンク有志者から得られたHIV−１漿液陰性血液から単核細胞を単離した。末梢の単核白血球細胞（PBMC）をフィトヘマグルチニン(PHA：10μｇ／10⁶細胞)で 37℃で48時間刺激し、洗浄して、10％ HIFCSを有するRPMI−1640培地、10％組換えヒトインターロイキン−２（Boehringer Mannheim）、５mM Hepes，０.１％重炭酸ナトリウム、25μｇ／mlグルタミン、100IU／mlペニシリン、100μｇ／mlストレプトマイシン、２μｇ／mlポリブレン(Sigma)及び１：1000抗インターフェロン(Miles)を含む、IL−２培地中に懸濁した。実施例１ HIV遺伝子の分子クローニング HIV−１ゲノムクローンpNL４−３をポリメラーゼ鎖反応(PCR)による増幅のためのHIV−１遺伝子のソースとして用いた。pNL４−３（Adachi et al，1986）を National Institutes of Health CNIH）AIDS Research and Reference Reagent Program，National Institutes of Allergy and Infections Diseases，NIH（Ad achi et al ，1986）から得た。vpr のクローニングのために用いられるスキームを図１に示す。一方vif のクローニングにはPCR及び類似の周知の手順を用いた。PCR及び示されるプライマーを用いてHIV−１ゲノムクローンpNL４−３(Adac hi et al ，1986)からvpr を増幅した。PCR産物をBam HI＋Sma Ｉで切断し、イースト−大腸菌シャトルベクターpYEULCBX（Macreadie et al ，1992）内にクローニングし、Bam HI＋Eco RI(T4 polished)で消化してpYEULCBX．Vprを製造した。このように他のHIV−１遺伝子、nef ，vpu 及びvif もpYEULCBX内にクローニングし、pYEULCBX．Nef27(Macreadie et al ，1993)，pYEULCBX．Vpu（Macreadie et al ，1992）及びpYEULCBX．Vifを作製した。これらのプラスミドを各々にNef ，Vpu及びVifの銅誘導可能な産物を支配するよう設計した。vif プライマーは5 ′GCTCCGGATCCATGGAAAACAGATGGCAGG及び5′CGCCCGGGAGCTCTAAAAGCTCTAGTGTCCである。vif PCR産物をBam HI−Sma Ｉフラグメントとしてクローニングした。プライマーにおけるBam HI及びSma Ｉクローニング部位（上述）は下線であり、斜体の配列はvif開始及び停止コドンを表す、全ての増幅されたDNAを誤りのないことを確かめるために並べた。イースト発現ベクターpYEULCBX内へのnef ，vpr ，vpu 及びvif のクローニングを各々Nef，Vpu及びVifの銅誘導可能産物を支配するように設計した。実施例２内在的に発現されたvpr蛋白質はイーストにおける増殖停止を引きおこす。本研究において、我々はイースト内のvpr を、その機能を認識するために発現させた。同時に、簡単な細胞の機能へのHIV−１調節蛋白質の効果の全般の検査の一部として、我々は、ハプロイドイースト中にVif，Vpu及びNefも製造し、細胞増殖へのそれらの効果を捜した。これは、vpr 及び他のHIV−１補助蛋白質の遺伝子を発現ベクター、pYEULCBX内へクローニングし、pYEULCBX．Vpr(図１参照 )、pYEULCBX．Nef27(Macreadie et al ，1993)、pYEULCBX．Vpu(Macreadie et a l ，1992）、及びpYEULCBX．Vif(本研究)を作製することにより達成される。 University of Utah Medical Centerのデビッドスティルマン博士(Dr David S tillman)から得られた株DY150(MATa ura ３−52．leu ２−３，112 Tri １−１ ade ２−１ his ３−11 can １−100; Macrea die et al，1993)を上述のイーストベクター＋グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(GST)の銅誘導可能産物のためのベクターで形質転換し、Vpr．DY150に融合されたGSTをYEPD培地（１％イースト抽出液、２％ペプトン、２％グルコース）上で増殖させた。イースト細胞をBecker and Guarente(1991)のエレクトロポレーション手順により形質転換し、形質転換体を、必要な場合３％Phytagar^TM(Gib co)を有する、20μｇ／mlヒスチジン、アデニン及びトリプトファンを含み、固体化された最小選択培地上で増殖させた。示された量までCuSO₄を添加することによって発現を誘導し、増殖をアッセイした。形質転換体を滅菌状で懸濁し、28 ℃での増殖のためにプレート上にドロップした。この結果を図21に示す。これは、0.25mM CuSO₄，20μｇ／mlヒスチジン、アデニン及びトリプトファンを含み、３％ Phytagar^TM(Gibco)で固体化されたSDプレート（0.67％イースト窒素ベース(Difco)、２％グルコース）を示す、形質転換体により産生された蛋白質を示す。図２に示すように、細胞増殖に対する顕著な効果はVpr蛋白質により、一方、テストされた他のHIV−１蛋白質は植物細胞増殖への効果を有さない。低レベル（0.25mM）のCuSO₄は、Vprを発現する細胞における全体の増殖停止を引きおこし、一方、逆の効果は、１mM CuSO₄程度の高さの誘導レベルでさえ、他の蛋白質により引きおこされなかった。CuSO₄を添加しないで、CUP1プロモーターからの基底の発現は誘導されたレベルの５％である（Macreadie et al ，1994）場合、 Vpr形質転換体は対照形質転換体より遅い増殖比率で増殖するので、Vprの効果は銅の毒性とは無関係であった。 Vpr毒性は、誘導された細胞が、インデューサーの存在中24時間の後でさえ、銅が添加されていない培地上にプレートされた時コロニーを形成するので、増殖停止のため殺さないことが見い出された。アッセイから増殖したDY150〔pYEULCBX．Vpr〕形質転換コロニーは、DY150〔pYEULCBX〕形質転換コロニーよりかなり小さかった。これらの“小さな”コロニーは、銅を添加しない後の培養における親YD150〔pYEULCBX．Vpr〕形質転換体様に増殖した。これは、Vpr合成の誘導の後の細胞周期停止を示し、次に最後に回収して通常の細胞周期にもどることを示す。実施例３停止した細胞は非常に大きくされる光学顕微鏡による細胞の検査は、Vprを産生する誘導された細胞が著しく変化した形態を有することを示した。図３に示すようにＶpr産生性細胞は、同じ条件下で増殖した参照DY150〔pYEULCBX〕形質転換体の２倍の直径である16μｍの直径を有していた。この大きな細胞内の細胞内スペースのほとんどは構造がなく、単一の大きなオルガネラ、おそらく空胞により占有されているようであった。これは、DY150〔pYEULCBX．Vpr〕形質転換体が細胞分裂の前の成長において停止されていることを示唆する。実施例４フローサイトメトリー分析析し、分類した。照度は、488nmアルゴンイオンレーザーで（細胞サイズに関係して）前方角光散乱であり、側方散乱を記録した。細胞を前方角光散乱を基礎として分類した。生きた細胞は、プロピジウムイオジドによりゲートされ、２μｇ／mlプロピジウムイオジドでの染色の後600nmより大きい蛍光発光の欠如により示される。変化した細胞の割合を測定するために、誘導されたイースト細胞をフローサイトメトリー前方角光散乱（細胞サイズの割合）により分析した。この結果を図４に示す。これは、細胞集団においてVpr形質転換体がそれらのより大きいサイズを示すより大きい範囲の前方光散乱を示すことを確かにした。50,000細胞超を含む集団は、示されるように DY150〔pYEULCBX〕及びDY150〔pYEULCBX．Vpr〕についてである。実施例５増殖停止を引きおこす配列の位置はH(S／F)RIG繰り返しモチーフを含む増殖停止を引きおこす原因である配列を、細胞増殖への効果についてVpr蛋白質の種々の部分をテストすることにより同定した。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(GST)に融合されたVprも、増殖停止を引きおこす（図２；構成物GST−V pr、図５）ので、我々は、イーストGST−融合ベクター、pYEULCGT（Ward et al ，1994）における一連のGST融合蛋白質も製造した。 EcoRIフラグメント（構成物 VprBE及びGST−VprBE.図５）によりコードされる Vprの最後の33アミノ酸の欠失が増殖停止を和らげ、一方Vprのこの部分のGSTへの付加（構成物 GST-VprEE、図５）は増殖停止を引きおこし、これは、このドメインが増殖停止の原因であることを示す。Vprのちょうど最後の21アミノ酸のGST への付加（構成物 GST−VprSE、図５）により、部分的増殖停止も見られた。各々の場合において、増殖停止は、フローサイトメトリー分析及び光学顕微鏡により判別されるような細胞の大きさに相互関係があった。重要なのは、このＣ末端配列は、Ｔ挿入のため73アミノ酸の端を切り取ったvpr 遺伝子産物をコードするHIV−１単離物を多くの試験所において欠失している領域である（Yuan et al ，1990；Ogawa et al ，1990；Lavallee et al ，1990）。これらの単離物におけるVprは、ビリオンと会合せず（Ogawa et al ，1990）、これはおそらく端を切り取ったためであろう。我々の発現は、同じＣ末端領域の重要性を確かにするが、もう１つの理由も確かにする。このイーストにおける増殖停止はAIDSの病因と関連している可能性がある。細胞増殖停止を引きおこすHIV-１Vprの領域を周知のVpr関係物と比較した。最も近い関係物はSIVVpr、次にHIV−２Vpr、その次にVpx蛋白質であった（図６Ａ）。この配列は33％アルギニンを含み、これはVpx蛋白質の相当する部分において見い出されるものより著しく高いアルギニン含量である。Vpr種において繰り返しモチーフ、H(S／F)RIGの保存があることは注目に値する。このモチーフは（Eco RI−SalＩフラグメントにおいてコードされる）アミノ酸72〜75において、及び（Sal Ｉ−EcoRIフラグメントにおいてコードされる）アミノ酸78〜82において存在する。２つの複製をコードするフラグメントにより引きおこされるより大きな毒性は、複製数効果又はおそらく構造的効果を示し得る。プログラムALIGNを用いるVprとの細胞関係物についての研究において、我々は、イースト蛋白質、Sac１p（Cleves et al ，1983）が、Genbankデータベース（ release 82.0）においてリストされる細胞の蛋白質の最も重大な配列類似性を有する。Sac１p及びVprのアラインメント（図６Ｂ）において、Sac１pが、Vpx中に全体的によく保存されているモチーフの１部である末端Gsを含むH(S／F)RIGモチーフにおいて60％の同一性を有することが見い出され得る。実施例６ペプチド合成製造したペプチドは以下の通りである： α−アミノ基が塩基−不安定Fmoc（９−フルオレニルメチロキシカルボニル）基により保護されるFast Mac固相技術を用いて、Applied Biosystems 430A Pept ide Synthesizer上でペプチドを合成した。最も短い配列を樹脂上に合成し、その後ペプチド／樹脂のおおよそ３分の１を反応容器から除去した。その後、第２のペプチドを集めるまで残りのものにおいて合成を続けた。この段階において、ペプチド／樹脂の半分を反応容器から除去した。その後残ったペプチド／樹脂上に第３のペプチドを集めた。Ｏ−tert−ブチル基によりtert−ブチル基及びグルタミン酸によりアルギニン側鎖を保護した。アミノ酸の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート活性化及び溶媒としてＮ−メチルピロリドンを用いることによりカップリングを行った。このペプチドをトリフルオロ酢酸（＋スカベンジャーとしてフェノール、エタンジチオール、チオアニソール及び水）で樹脂から切断した。このペプチドをエレクトロポレーションの前にエレクトロポレーション緩衝液(0.213ｇ／ｌ．Na₂HPO₄ ，0.068ｇ／ｌ KH₂PO₄，93.1ｇ／ｌスクロース)(Wojchowski and Sytkonski，19 86)に対して透析した。ペプチド４〜６について、保護を以下の通り行った：基に−不安定９−フルオレニルメチロキシカルボニル（Fmoc）基によるα−アミノ基；２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル(Pnc)によるアルギニン側鎖；tert−ブチル基によるセリン及びトレオニン；トリチルによるアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン及びシステイン；並びに０−tert−ブチル基によるグルタミン酸。アミノ酸の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）活性化及び溶媒としてＮ−メチルピロリドン(NMP)を用いてカップリングを行った。このペプチドをTFAで、スカベンジャーとしてフェノール、エタンジチオール、チオアニソール及び水を足して、樹脂から切断した。実施例７合成ペプチドにおけるH(S／F)RIGモチーフは浸透感受性を引きおこす我々は、合成ペプチド：を用いてH(S／F)RIGモチーフの機能を更に研究した。このペプチドは、実施例６において作製され、Vprの各々最後から２番目の14，21及び26アミノ酸を含む。H (S／F)RIGモチーフ（下線）は、これらのペプチド内に各々0.1及び２の複製において存在する。これらのペプチドをイースト細胞内にエレクトロポレーションして、その後浸透感受性について分析した。２mg／mlのエレクトロポレーション緩衝液中に溶解されたペプチドを、Baekon 2000(Saratoga，CA)を用いてイースト細胞内にエレクトロポレーションした。Baekon 2000における処理のための条件は：２¹¹パルス、８kv，0.8秒バースト時間、100μ秒パルス時間、10サイクル、溶液と上部電極との間のギャップ１mmである。このキュベットは、５μｌのDulb ecco 's Phosphate-Buffered Saline及び５μｌのペプチド溶液を足した新鮮なYEPD増殖培地中に30μｌのイースト懸濁液を含んでいる生存している細胞の不均一の浸透を達成するため60〜80％を殺すことが必要であることが見い出された。 YEPD培地並びに1.2Ｍ KCl，1.8Ｍソルビトールもしくは0.9Ｍ NaClを含むYEP D培地にプレートし、Chowdhuvy et al(1992)により開示されるようにコロニー形成単位の数を計数することにより、細胞を浸透感受性について検査した。２つの培地上のコロニー形成単位の相対数を比較することにより浸透感受性を計算した。浸透感受性細胞を含む全ての生きている細胞はYEPD上で増殖するが、浸透感受性であるものは高浸透力培地上で増殖しなかった。図７に示す結果は、H(S／F)R IGモチーフを欠如するペプチドが本質的に乱されないことを示す。しかしながら、H(S／F)RIGモチーフを含むペプチドは浸透の感受性の原因となり、50％までの細胞が高浸透力培地上で殺された。この効果は、存在するH(S／F)RIGモチーフの複製の数に比例し、これは、この配列の直接的役割を示す。実施例８病原性はH(S／F)RIGモチーフを含む配列に関連する H(S／F)RIGモチーフを含むVpr蛋白質の領域は、ヒト及びサル免疫不全ウィルスの病原性に相互に関連し得る。ヒト及びサル免疫不全ウィルス由来のVpr及びV pxの配列の簡単な編集を表１に示す。高病原性ウィルスであるHIV−１における２つの繰り返しH(S／F)RIGモチーフを含むアミノ酸のほとんど全ての保存性あがる。７つのサル免疫不全ウィルスVpr配列は、H(S／F)RIGモチーフを含む配列の高度な保存性（２つの変化）を示す。しかしながら、アスタリスクにより示される２つの配列は、配列の保存性ががほとんどない（８又は９の変化）。マンドリルウィルス及びSykes’monkeyウィルスの両方は、ほとんど配列保存性がなく、無症候性感染の原因となることが報告されている（Hirsch et al ，1993；Tsujimoto et al ，1989）。 HIV−２単離物において、標準配列から２〜５の変換がある。HIV−２はHIV− １より病原性が小さく、これらの変換は病原性の減少の理由となり得ると我々は確信する。更に、Vpxの存在は病原性を削減し得る。Matsuda et al （1993）は、HIV−１においてVpxをVprのかわりにおきかえた時、そのウィルス状その感染性を喪失することを示した。これにより、Vpxを産生するいずれのウィルスも、V prのみを産生するものより小さい病原性であることが予想される得ることを我々は予測する。アスタリスクにより表されるものを除くVpr配列についての全体の共通は：である。要約すると、配列HFRIGCRHSRIGにおいて、下線の残基がVprにおいて不変である。ＦはＩ又はＬであり得る；ＩはＬ，Ｇ，Ｓ又はＭであり得る；最後のＧはＳであり得る。モチーフ間のＣが不変であることも注意すべきである。実施例９変異プロウィルスの複製速度ウィルス培養物の製造及び滴定変異体の半クローン及び野生型HIVDNAをLipofectamine(GIBCO−BRL)法によりＴ25フラスコ内でHeLa細胞（５×10⁶細胞）に共に移入した。移入後12時間にPBM L（20×10⁶細胞）を加えて無細胞ウィルス産生量を規則的な間隔で測定した。上清を無細胞ウィルスの最大産生量において取り出し、保存ウィルスとして用いた。24ウェル Linbroプレートにおいてウィルス保存液の滴定を行い、逆転写酵素（RT）活性及び生存能細胞変性効果の両方により終点希釈率を評価した。標準的な方法に従ってマイクロタイタープレート内のRTアッセイを行った。変異プロウィルスの作製 HIVNL 4.3分子クローン（Adachi et al ，1986）を、nef 及びvpr 遺伝子の開始コドンの点変異のためにpKP５のベクター内に２つの半分のフラグメントとして再クローニングした。表２に概説される変異誘発スキームを用いて、図８に記載される手順に従って、変異プロウィルスを作製した。用いたHIV-１分子クローンはpNL４−３である。大腸菌における全長のクローンの不安定性のため、低複製ベクター、pKP59において半クローンを作製し、大腸菌内に安定に維持させた。５′配列をStu Ｉ−Eco RIフラグメントとして導入し、一方、３′配列をEco RI−Avr IIフラグメントとして導入した。これらの半クローンをほぼ消化させることができ（５′クローンについてXba Ｉ＋Eco RIフラグメント及び３′クローンについてEco RI＋Hae II）、この切断DNAを、生体内において組換えが野生型ウィルスを元に戻す哺乳動物細胞内に導入した。変異ウィルスを得るために、pNL４−３の適切なセグメントをファージミド（phagemid）内にクローニングし、一本鎖DNAを作製し、そして特異的vpr 及びnef 変異を導入するよう設計された表３に示すオリゴヌクレオチドの存在中で第２の鎖を合成した。精製及び配列変換の検定の後、DNAをpKP59−半クローンにサブクローニングし、野生型配列を変異配列におきかえた。変異クローンはNefを発現しないかVprを発現しないか、又はいずれの蛋白質も発現しない。 PMMCの感染末梢血液単核細胞を0.01の感染の多重度(MOI)で感染させ、無細胞上清を、標準的技術により、逆転写酵素（RT）産生について毎日アッセイした。刺激を受けたPBMCにおいて、Nef又はVprの産生について欠損のある変異プロウィルスは、両方の場合において親ウィルス株におけるよりかなり少い無細胞ウィルス粒子の類似量を産生した。ウィルス複製に対するVprの効果は、表４に示すようにH(S／F)RIGモチーフにより媒介されるようである。 Nef及びVprの両方の産生において欠損のある変異プロウィルスウィルス製造において激しく抑制され、遅れた複製速度を示した（図９ａ）。生体内細胞集団に極めて似た未刺激のヒト初期細胞において、Nef及びVprの両方は無細胞ウィルス産生のために欠くことのできないものである（図９ｂ）。Vpr^-変異体はより少量のウィルスを産生し、Nef^-変異体は遅れた複製速度を示し、一方Nef^- Vpr^-２重変異体は共同的に作用するようである。実施例10 合成ペプチド内のH(S／F)RIGモチーフはイーストにおける増幅停止の原因となるペプチドをPBSに対して透析し、最終容量200μｌの水における10⁶細胞／mlの密度に懸濁されたイースト細胞に、最終濃度２μＭで添加した。１時間のインキュベーションの後５×10⁴細胞を固体化YEPD上に広げ、このプレートを28℃で48 時間のインキュベーションの後コロニー増殖について検査した。ペプチド溶液の定量アミノ酸分析によりペプチド濃度を決定した。ペプチド２又はペプチド３の添加により細胞はコロニー形成能力を完全に失い、一方ペプチド１の添加は効果を有さなかった（図10）。これを実施例５と比較することで、我々は、浸透感受性により評価されるような生物活性とH(S／F)RIGモチーフの細胞内の存在との相関関係を見い出した。それゆえ、我々はH(S/F)RIGモチーフのみを含み、図11に示すようにいくつかの浸透感受性の原因にもなるペプチド４のようなペプチドを更に研究した。ペプチド４はコロニー形成能力の完全な損失も引きおこす。ペプチド２様であるがシステインを欠損するペプチド５もかなりの効果を引きおこしこれは、システインは活性に本質的でないが、おそらく構造的効果のため、活性を増加させることを示す。投与応答関係を確立するために我々はペプチド３を用いた。特定の範囲の濃度のペプチド３での細胞の処理は、完全な増殖停止を誘導する最も低いペプチド濃度は図12に示すように約１μＭであることを示す。0.05μＭまで下がった濃度は部分的に効果的であるが、この濃度未満においては効果がない。実施例11 細胞塊による増殖停止効果の妨害細胞濃度により引きおこされる効果もある。高細胞濃度において、ペプチドの効能は限定される。図13は、５μＭのペプチド３での特定の範囲の細胞濃度におけるイーストの処理の後のコロニー形成を示す。10⁵細胞／mlまでの細胞濃度において、完全な効果が見られた；しかしながら、10⁶細胞／mlの濃度においては、効果が観察されなかった。これは、細胞当りペプチドの約10⁶分子がコロニー形成の阻害に必要とされることを示す。我々は、この効果が培地の存在により排除され得ることも観察されている；例えば、この効果は、通常の強度の１／10程度の低さの濃度においてでさえ、YEPDの存在中で大きく削減される。実施例12 他の微生物に対する合成ペプチドの効果我々は、いくつかの付加的な微生物の増殖に対するこれらのペプチドの効果を研究した。この結果を表５に示す。大腸菌及び３つの出芽イースト；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans ）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）及びクルイベロマイセス（Kluy veromyces）において、並びに分裂イースト、スキゾサッカロマイセス・ポンブ( Schizosaccharomyces pombe)において、結果はＳ．セレビシアエ(S．cerevisiae ) で見られるのと同様であった。培養プレート表面上のローンのRC２ａ細胞による形成をペプチドが阻害する効果が哺乳動物細胞上においても見られた。我々は、処理された細胞を２％グルコース／50mN HEPS中に懸濁した他は、イーストと同様にペプチド１，２及び３で大腸菌を処理した。表５中のデータは、 H(S／F)RIGモチーフを含むペプチドが大腸菌の生存能力に影響を及ぼすことを示す。しかしながら、大腸菌をPBS中に懸濁してこれらのペプチドで処理した時に、コロニー形成能力の損失が観察されないことを我々は見い出した。それゆえ、この活性は用いた培地によると思われる。実施例13 イースト細胞浸透性に対するペプチドの効果我々はFungolight Live/Dead Stain（Molecular Probes）で細胞を検査し細胞がペプチド処理の後数時間行き続けている、即ち代謝的に活性があることを見い出した；しかしながら、それらはコロニー形成能力を失っていた。これにより、ペプチドの効果は、不可逆的増殖停止を作ることのようである。我々は、フローサイトメトリーの後にプロピジウムイオジドでの染色、生体染色によりペプチド処理された細胞を更に検査した。図14に示される結果は、１時間後にペプチド２及び３により引きおこされる著しい効果があることを確かにする。ペプチド１での処理又は処理なしにおいて、細胞の95％がほとんど又は全くプロピジウムイオジドを取り込まない。ペプチド２及び３において、細胞の半分未満がプロピジウムイオジドを取り込む。プロピジウムイオジド取り込みは、イーストに対する細胞の死又は膜損傷を通常示す。この分析は、この時において重大な細胞溶解が起こらないことを示す。図15に示されるペプチド３の効果の速度分析は、この効果が直ちに表れ、ペプチドを添加して数分以内に細胞がプロピジウムイオジドを取り込むことを示す。実施例14 VPRペプチドはCD⁴⁺細胞を殺す我々は、２つのCD⁴⁺細胞系、RC２ａ及びジャーカットを、各々前単球及びＴリンパ球細胞を表現するために用いた。ペプチドのエレクトロポレーション 55μｌ Baekon緩衝液(1.5mM Na₂HPO₄，0.5mM KH₂PO₄，0.27ＭスクロースpH7 .0)及び10μｌのPBS(リン酸で緩衝された塩類溶液)中に懸濁された１百万のCD⁴⁺ 細胞に10μｇのペプチドを添加した。Baekon 2000 Advanced Macromolecule Tra nsfer System(San Francisco，CA)におけるエレクトロポレーション条件は、２¹ ¹ パルス８kV，0.8秒バースト時間、62.5μ秒パルス時間、３サイクル、溶液と上部電極との間の85mmギャップである。ペプチド−エレクトロポレーションされた細胞を１ml RPMI−1640 10％HIFCS中に懸濁し、37℃で増湿された５％CO₂インキュベーターにおいてインキュベーションした。再エレクトロポレーション及び細胞の前処理ペプチド−エレクトポレーションされた細胞をペプチドを用いて又はペプチドなしで各々の細胞の再エレクトロポレーションのために24時間、収集し、24時間後にフローサイトメトリーによりこの細胞をアッセイした。エレクトロポレーションの前30分に１百万の細胞を0.5nM TMB−８塩酸塩((８−（ジエチルアミノ） −オクチル−３，４，５−トリメトキシベンゾエート）、HCl)又は0.5μＭプロスタグランジンのいずれかで前処理した。エレクトロポレーションの後、細胞を各々の試薬の同じ濃度において保持した。フローサイトメトリーのための細胞の調製１百万の細胞を収集してPBS中で1600rpmで５分間、１回洗浄し、このペレットをフローサイトメトリーのための調製において２μｇプロピジウムイオジドを含む200μｌPBS中に再懸濁した。エレクトロポレーションの後48時間に、細胞をパラメーターの数24について、Coulter Epics Elite Flowサイトメーターを用いて分析した。488nmアルコンイオンレーザーの前方及び側方散乱を測定した。600nm 超の蛍光発光の欠如により、プロピジウムイオジド排除を測定した。図16は、擬似エレクトロポレーションされた細胞と比較してペプチド３がRC２ａ細胞を重大な程度まで殺すことを示す。ペプチド２は、ペプチド３より少い数の細胞を殺し、この結果は、両細胞系において比較できる。しかしながら、H(S ／F)RIGモチーフを欠くペプチド１は、これらの細胞系に影響を及ぼさない。ペプチド２及び３の効果はプロスタグランジンＥ２での前処理により増強されたので、二重のエレクトロポレーションの必要性を除去する。ペプチドの効果はCa²⁺ −チャンネル遮断体TMB−８ HClでの前処理により改良される。H(S／F)RIGモチーフは、図17に示すような前方及び側方散乱により測定されるような細胞構造にも影響を与える。ペプチド３は、擬似エレクトロポレーションされた及び他のペプチドがエレクトロポレーションされた細胞と比較して側方及び前方散乱の両方の右シフトを作る。これは、ペプチド３が細胞サイズ及び細胞粒状度の両方における増加を誘導することを示す。実施例15 TMB８及び高イオン強度によりイースト細胞増殖停止の阻止ペプチドの添加前30分におけるTMB−８の添加は、図18に示すようにペプチド３の効果を排除する。種々の濃度のTMB−８をイースト細胞で30分間予備インキュベートした後、細胞を５μＭペプチド３の存在又は欠損下でインキュベートした。その後、細胞をコロニー形成についてアッセイした。低濃度のTMB−８は約13％の細胞を保護した。 TMB−８は高濃度においていくらかの毒性をもたらすが、低濃度においては毒性は観察されなかった。これら低レベルのTMB−８において、Vpr蛋白質は、イースト細胞のコロニー形成能力を阻害するのに全体的に効果的でなかった。ナトリウム、カルシウム、カリウム又はリチウムイオンは、ペプチド３の添加前30分、又は添加後直ちに添加された時、Vprペプチドの効果を全体的に排除した。浸透支持ソルビトールも部分的な保護を供し、全体の保護は0.1×YEPDでのインキュベーションにより供された。これらの結果を表６に概説する。塩の存在下でのこの明らかな保護は、イースト細胞がH(S／F)RIGモチーフを含むペプチドに結合してインターナリゼーションできないためである。しかしながら、哺乳動物細胞の場合、これらのペプチドの取り込みが標準的な血清含有培地において観察された。実施例15 Vprを産生するバクテリア細胞の生存能力細胞をインデューサーIPTGで処理し、アリコートを適当な時間後に２×YT＋アンビシリンプレート上にプレートし、プレートの一晩のインキュベーションの後にコロニーの数を計数した。このデータは、(vpr のBam HI−Eco RIフラグメントによりコードされる)GST及びGST−Vpr.BEの産生が大腸菌細胞を殺さないが誘発が増殖を遅くすることを示す。全長のVpr蛋白質に融合されたGSTの産生は、３時間の誘発後の同様の効果を導く；しかしながら、インデューサー中に30時間おいた後、ml当りのアンピシリン耐性細胞の数の実際の削減がある。これは、一晩のインキュベーション後に培地が典型的に最適な濃度に達するのにかかわらず、培養内の細胞のほとんど大部分がAmp^x決定因子を失っている（及びもはやvpr を発現しない）ことを示す。更に、それは、細胞の死においてVprのＣ末端領域に影響を与える。未誘導の細胞が数において増加しないことも明らかであり、これはインデューサーの欠如下における細胞静止効果を示す。しかしながら、細胞が10⁸細胞／mlまで増殖したことは、毒性効果が消費された培地のような特定の条件に特異的である可能性があることを示唆する。実施例16 蛍光標識ペプチドと細胞との相互作用図19は、（Ａ）エレクトロポレーション、及び（Ｂ）エレクトロポレーションなしの細胞外添加の後にフローサイトメトリーにより測定されたFITC（フルオレセインインチオシアネート）標識ペプチドとCD⁴⁺ヒト細胞と会合を示す。図20はフローサイトメトリーにより測定されたＳ．セレビシアエ(S.cerevisia e)イースト細胞におけるエレクトロポレーションなしでのFITC−標識ペプチドの会合を示す。ペプチド２〜４は、イースト細胞との高程度の会合を示し、一方ペプチド５のかなり少い会合を示す、H(S／F）RIGモチーフを欠くペプチドは、ペプチド２及び３より細胞との会合が100倍超少い。光学顕微鏡により、我々は、図21に示されるようにFITC−標識ペプチド３がイースト及び哺乳動物細胞を効果的に標的にすることを観察している。ペプチド２及び４も同様である。これらのデータは、H(S／F）RIGモチーフが細胞内を標的とすることのために十分であることを示し、それら又はその配列のサブセットでもあり得る関係する誘導体が、病気の治療のための細胞内への薬剤の輸送のための有用な担体であろう。図21は、ヒトCD⁴⁺細胞内（Ａ）及びイースト細胞内（Ｂ）におけるインターナリゼーションされたFITC標識ペプチド３を示す。FITC標識ヒト細胞は、なお完全であるいくらかの細胞及び溶解している他のものを含んでいる。実施例17 Vpr及びSac1pとアクチンとの間の遺伝相互作用イースト act１及び sac１変異体、各々DBY1195及びDBY1715をpYEULCBX及びpY EULCBX-Vprで形質転換した。その後、形質転換体を、0.5mM硫酸銅を含むプレート上に誘導し、Vprの効果についてアッセイした。DY150〔pYEULCBX〕及びDY150 〔pYEULCBX.Vpr〕形質転換体は先に記載されている。Sac1−vpr 相互作用についてのこれらの結果の例を図22に示す。 Vprがイースト蛋白質Sac1pとの構造的な相同性を示すことを我々は発見した。イースト細胞のアクチン細胞骨格のアセンブリーにおけるSac1pの正確な機能はまだ研究中である；しかしながら、Sac1変異体は著しい細胞骨格欠如及び低温での増殖停止を示す(Cleves etal,1989；Novick etal，1989；Whitters etal，199 3)。イーストにおけるVprの産生は、Sac1p及びVprの間の配列及び機能的類似性のため、Sac1変異体と類似した効果をおそらく引きおこすであろう；Vprの産生は、通常のSac1p機能と拮抗し得、大きい細胞サイズ及び最終的な増殖停止を含む細胞骨格欠如を導く。実際に細胞骨格が欠如したイーストの多くの研究において、母細胞は異常に大きく、娘細胞は異常に小さい（例えば、Liu及びBretscher ，1992を参照のこと）。我々は、Vprを産生する新しく誘導された細胞の時間経過分析が同じ現象を示すことを見いだしている。浸透感受性もVprにより誘導される可能な細胞骨格欠如を示した。Vprを産生する大きな細胞をフローサイトメトリーにより単離し、高浸透力を含む培地及び通常の培地上にプレートした。通常の培地上で増殖することができる細胞の50％だけが高浸透力培地上で増殖することができ、これは、これらの細胞における構造的な欠如を示す。 Vprは哺乳動物細胞及びイースト細胞において細胞骨格欠如をおこすようである。Levyらによる研究は、横紋筋肉腫細胞系において、Vprが細胞複製停止及び大きな細胞の大きさをひきおこすことを示す(Levy etal，1993)。更に、CD⁴⁺Ｔ −リンパ芽球型（T-lymphoblastold）細胞系において、HIV-１が、感染の最初の時間、膜破壊、“バルーニング（ballooning）”及び小胞体の空胞化を含む超構造変化の原因となることが示されている(Fermin and Garry，1992)。これらのデータは細胞骨格欠如と一致しており、これらの細胞における細胞骨格の研究が関心事となろう。 HIV−１生活環におけるVprの役割は何か、及びこれに関連する増殖停止に何が誘導されるのか。時にHIV−１及び他のレトロウィルスの間の区別に関するジレンマがある；レトロウィルスは感染のために細胞増殖を必要とし、一方、HIV− １は最終的に分化したマクロファージのような非増殖の細胞に感染する。Lenis etal （1993）はCD⁴⁺細胞系がＧ２増殖期において停止している時、HIV−１に生産的に感染され得ることを示した。従って宿主細胞の非増殖は、全て又はいくつかの細胞型の生産的感染に最初に必要とされ得るであろう。Vprの機能は、組み込み様の過程がおこり得るように増殖停止を引きおこす可能性がある。これが本当であるなら、それが初期の出来事が起こり得るようにVpr（及びVpx類似物）がビリオンと会合していることの原因であろう。Vprに対する抗体は、AIDS患者の1 7％のみにおいて検出されているが、無症候性の個人の47％において見い出されている(Wong-Stoal etal，1987)。これは、Vprが感染における早期に存在し、それゆえそれがこの時点のみにおいておそらく本質的であることを示唆する。Vprのインヒビターが感染又はウィルスのゆっくりした細胞外への広がりを防止するはずであることも示唆される。本研究において、我々は、配列HFRIGCRHSRIGを含むVprの部分又はRHSRIGを含む部分でさえも、イースト細胞に添加された時、細胞損傷及び不可逆的な増殖停止を引きおこす。この効果は、細胞類及びペプチド濃度に関連し、最小で細胞当りペプチドの10⁶分子がその効果を観察するのに要求される。我々は、同じ配列が、この配列を含むペプチドから細胞内にエレクトロポレーションされた時に浸透感受性及び構造的欠如を引きおこすことに関連することも示した。エレクトロポレーション培地中のYEPDが細胞外効果を排除するので、エレクトロポレーション後に細胞内効果のみを検査した。 H(S／F)RIGモチーフを含むペプチドは哺乳動物及びイースト細胞の両方において増加した浸透性及び細胞溶解を生じる細胞損傷の原因となるようである。我々は、H(S／F)RIGモチーフを含むVprペプチドが細胞会合されることを観察した；F ITC標識ペプチドを用いた蛍光顕微鏡は、それらが１時間以内にインターナリゼーションされることを示す。我々は、H(S／F)RIGモチーフがペプチドの活性的取り込みの原因となることを確かめている；FITC標識ペプチド１の取り込みは、H( S／F)RIGモチーフを含むペプチドの取り込みより100倍低いようであり、これは、このモチーフが取り込みを促進することを示している。実施例７において、ペプチド取り込みは、エレクトロポレーションにより人為的に得られ、研究した結果は、浸透感受性であった；エレクトロポレーション技術自体は、種々の程度の細胞死又はコロニー形成能力の損失を誘導した。しかしながら、コロニーを形成した多数の細胞において、高い程度の浸透感受性があった。実施例10〜15において観察された効果は、コロニー形成能力の全体の損失において全く異なっている。これらの違いは、細胞内のペプチドの局在化に関連している可能性がある。コロニー形成能力の損失よりむしろ浸透感受性が、実施例２に記載されるようにより生活様の条件におけるイースト中のvpr 遺伝子の発現においても観察された。何のAIDSの現象が我々の結果と関係しているのであろうか。Levy etal（1994 ）による現在の研究は、Vprが血清中に存在していることを示し、これはそれが感染した細胞から遊離されることを示し、この蛋白質の推定されるアンタゴニストを設計することにおいて、それは、細胞内効果の他に未感染の宿主細胞をHIV が殺すことの原因となり得るVprの細胞外効果を考えることに関連する。 Vprの生物学的活性フラグメントを用いて、我々は、Vprの部分、おそらく完全なVpr蛋白質が、Vpr内のH(S／F)RIGモチーフの作用を通してコロニー形成能力に不可逆的に影響を与えることを示した。この効果の作用の方法は、Ca²⁺イオンチャンネルに関連している可能性がある。というのは、Ca²⁺イオンチャンネルブロッカーTMB−８が実施例14及び15に示されるようにこの効果を排除するからである。本明細書内に言及される引用を、以下のページにリストし、引用により本明細書内に組み込む。本発明が明快さ及び理解の目的でいくらか詳細に記載されているが、本明細書内に記載される実施形態及び方法への種々の改良及び変換が、本明細書内に記載される本発明の概念の範囲から離れることなしに行われ得ることは、当業者に明らかであろう。 Detailed Description of the Invention HIV Vpr and Vpx proteins The present invention provides a biologically active peptide subunit of the human immunodeficiency virus Vpr protein. Lagment, a pharmaceutical containing these peptides or biologically active analogues thereof Compositions, antagonists of said peptides, and doctors containing these antagonists Pharmaceutical compositions, and therapeutics and screenins utilizing the compounds and compositions of the present invention Regarding the way to go. BACKGROUND OF THE INVENTION HIV-1, the causative agent of AIDS, was not found in mere retroviruses. Not a genetat, rev, vif, vpr, vpu,as well asnefOther primates with It is a lentivirus-like composite retrovirus.tatas well asrevIs pretty functional Well understood, but it is not essential for the in vitro infectivity of the virus, so auxiliary genetics The rest, often referred to as offspring, are mostly about their role in etiology. Not understood. HIV-1 viral protein R (Vpr) (Wong-Staalet al, 1987) is the virion meeting. It is a sex protein (Cohenet al, 1990a; Yuanet al, 1990). HIV-1 Vpr is weak Is a transcriptional activator (Ogawaet al, 1990; Cohenet al, 1990b), HIV- It binds to 1Gag protein (Luet al, 1993; Paxtonet al, 1993; Lavalleee t al , 1994) has been reported. Vpr Will in established cell lines Not essential for replication (Dederaet al, 1989; Cohenet al, 1990b) Will in early macrophages Evidence suggests that replication may have significant functions (Balottaet al , 1993; Matsudaet al, 1993). Due to the meeting of that Brio, Vpr Early in HIV-1 infection, probably in viral entry or uncoated Has been suggested to have a role (Cohenet al, 1990a; Yuanet al, 19 90 ； Yuet al, 1990). Vpr is one of the most highly conserved proteins of HIV-1 and is responsible for all primate animal movements. Present as Vpr and / or Vpx depending on the product lentivirus (Tristemet al, 1990; see Figure 4A). Vpx is also virion-associative (Cohenet al , 1990a; Yuanet al, 1990; Yuet al, 1988, 1990, 1993). HIV-2Vpr Is essential for productive infection of human macrophages (Hattoriet al, 1990) Is not important for replication in established cell lines, such as HIV-1 Vpr (Pe dera et al, 1989). Similarly, HIV-2V px is not important for established cell lines (Yue t al , 1988; Guyaderet al, 1989; Huet al, 1989) is the new Is required for infections in the cage (Guyaderet al, 1989; Yuet al, 1991) Increases viral infectivity in peripheral blood lymphocytes (Kappeset al, 19 91). Perhaps the most compelling of all is the completevprKeep reading frame In vivo and mutations in Vpr are associated with low wisdom in rhesus monkeys. It has been observed to lead to loose load (Lang et al, 1993). We cloned the Vpr gene in yeast and transformed it into monophasic yeast cells. The effect of Vpr protein and the effects of proteins Vif, Vpu and Nef were compared. We are Vp The r protein has a profound effect on cell proliferation, whereas other proteins tested Made an amazing discovery that it had no effect. The Vpr protein causes growth inhibition. And this is It appears to be mediated by effects on the cytoskeleton. We are critical to this activity Vpr A portion of the protein was identified. This crucial part is a conserved amino acid sequence motif That is, a peptide containing H (S / F) RIG and containing this portion is It has activity when added extracellularly to cells. Vpr protein is early in HIV infection This represents a useful therapeutic target as it appears to have a significant role . We have found that the Vpr protein, and in particular its C-terminal sequence, has a general It has a proliferative effect and is therefore useful in the treatment of conditions mediated by cell proliferation. I also found out that there is. Summary of the invention According to one aspect, the present invention provides a method of treating HIV infection, comprising HFRIG and HSRI. Of an antagonist of Vpr protein containing at least one motif selected from G, Or a therapeutically effective amount of a biologically active fragment or analog thereof. Administering to a patient in need of treatment, thereby preventing HIV infection. Characterized by preventing the progression of HIV infection of AIDS or alleviating the symptoms of AIDS And provide a method. Preferably, the Vpr protein is HSRIG, HFRIG, HSRIS, HFRAG, HIRAG, HLRAG. , At least one sequence selected from the group consisting of RSRKG, RSRIS and RSRIG . In a second aspect, the present invention relates to growth inhibition, cell replication inhibition, cytotoxicity, cell bone. 1 mediated by Vpr selected from the group consisting of case disruption and effects on the endoplasmic reticulum Vpr protein, or a biology as defined above, which has the ability to inhibit the above activities Antagonists of biologically active fragments or analogs thereof. This Anne like Tagonists are expected to be useful as therapeutic agents for the treatment of HIV infection . The present invention has been previously defined as an active composition with a pharmaceutically acceptable carrier. Also included are pharmaceutical compositions that include an antagonist of Vpr. Specific for Vpr or biologically active fragments or analogs thereof Antibody, preferably a monoclonal antibody, as well as Vpr or said biologically active antibody. Antisense RNA or Triple stranded DNA provides a method of inhibiting the activity of Vpr and is consequently within the scope of the invention. One of ordinary skill in the art will recognize that. Monochrome for a given peptide sequence Method for producing null antibody, and antisense RNA or triple-stranded D in target cells Methods for inducing NA production are known in the art. For example, Vpr The region coding for the C-terminal part of white matter is suppressed by a suppressive antisense sequence or Substituted by a sequence encoding a sex peptidevprHIV infection or A It could be used for gene therapy of IDS. In a third aspect, the invention provides a Vpr protein, or a biological protein as defined above. Useful as an antagonist of the active fragment or its analog A method of screening a compound suspected of being described herein. Inhibition of proliferation, inhibition of cell replication, cytotoxicity, cytoskeletal disruption, and effects on endoplasmic reticulum Inhibition of Vpr activity in a biological activity assay selected from the group consisting of fruits. Characterized in that it comprises the step of measuring the effectiveness of the test compound in harming And provide a method. Our results indicate that the Vpr protein or biologically active fragment or its The analog has activity that can be attacked either at the intracellular or extracellular levels. Indicates that both types The biological activity of is within the scope of the present invention. According to a fourth aspect, the present invention provides a method for preventing or reducing the effects of HIV infection. A Vpr sequence of a Vpr sequence with a pharmaceutically acceptable carrier. Humans with a deleted portion of the HIV genome encoding at least the C-terminal 21 amino acids Wa containing an immunodeficiency virus-1 or a human immunodeficiency virus-2 Provides Kuching. Preferably, it encodes at least the C-terminal 33 amino acids of the Vpr sequence. The part of the genome that is deleted is deleted. More preferably, the C-terminal region of the Vpr sequence is Both the encoding genome part and the HIV genome part encoding the N-terminus of the Nef gene One is deleted. The relevant part of the Nef gene was filed on Mar. 18, 1994. Various copending patent applications are described in PCT / AU94 / 00254 (WO94 / 26776). According to a fifth aspect, the invention provides a method of treating a disease mediated by cell proliferation. And includes at least one of the Vpr proteins, or a consensus sequence described herein. The effective amount of biologically active fragment or analog thereof. Administered to mammals in need of treatment, thereby inhibiting cell proliferation that mediates the disease A method is provided that includes: Diseases mediated by cell proliferation include, but are not limited to, cancer, leukemia and Including psoriasis. Proliferating cells are highly calcium dependent. We are the Vpr peptide Has an antiproliferative effect of C²⁺-See what is hindered by inhibitors of channel transport I started. Therefore, in this aspect of the invention, the Vpr protein or fragment also Or the analog is C²⁺− Combined with channel transport enhancer It can be used at will. According to a sixth aspect, the invention relates to a disease caused by a pathogen. A method of treating qi, comprising a Vpr protein or a consensus sequence as described herein Biologically active fragment comprising at least one sequence of Administering to a mammal in need of such treatment an effective amount of A characterizing method is provided. Caused by bacteria, parasites, yeast, or fungi All of the illnesses that occur are within the scope of this aspect of the invention. According to a seventh aspect, the invention provides a pharmaceutically active compound on the cell membrane or inside the cell. A drug for transporting a substance, which comprises Vpr peptide, or HFRIG and HS Biologically active containing at least one amino acid sequence motif selected from RIG Various fragments or analogs thereof, A drug is provided, characterized in that the analogue is linked to said pharmaceutically active substance. Offer. The present invention is a method for transporting a pharmaceutically active substance into a cell membrane or the inside of a cell. And contacting the cells with a drug as defined above. It also provides a way to The active substance can be any chemical entity capable of binding to the peptide. It can be, in particular a peptide or a nucleotide. Coupling is either Can also be done by means of Can be done by biological coupling. If the active substance is a peptide, the Vpr Peptide and pharmaceutically active peptide together as a fusion protein by recombinant means. Can be synthesized. Those of ordinary skill in the art will appreciate that various suitable pharmaceutical activities that can be delivered in this manner. One would know the agent, and the method by which it could be bound to the Vpr protein. Those skilled in the art , Whether the binding is effective and whether the drug retains the required pharmaceutical activity You probably know. In a preferred embodiment of the invention, the Vpr protein is at least Vpr The C-terminal 21 amino acids of the sequence, more preferably at least the C-terminal sequence 33 amino acids of the Vpr sequence. It is a fragment containing no acid. Glutathione-S-transferase (GST) Vpr protein or its biologically active protein bound to a phase protein or fusion protein such as It will be clearly understood that the lagment is within the scope of the invention. Recombinant, synthetic And naturally occurring Vpr proteins and fragments and analogs thereof are within the scope of the present invention. It will be further understood that within. Although the description in this specification particularly relates to the Vpr protein of HIV-1, as described above, HIV- Since 2 also has a Vpr protein, the present invention provides a Vpr protein derived from HIV-2 and H (S / F) RI. Equivalent to G motif, as well as other retroviral Vpr proteins . Throughout this specification the abbreviation one-letter codes for amino acids are used. S / F Indicates that either S or F can be present. Detailed description of the invention The present invention is described in detail by reference to the following non-limiting examples and drawings only Will: Figure 1 in EastvprThe scheme used to clone the gene Show; Figure 2 shows the effect on proliferation of the expression of HIV-1 accessory protein in yeast. FIG. 3 shows morphological changes in yeast cells expressing Vpr. Copper-induced yeast cells were examined by light microscopy. DY150 (pYEULCBX) control trait The transformed cells are shown in the upper panel (a) and typically show the large DY150 (pYEULCBX.Vpr) trait. Converted cells are shown in the lower panel (b). Bars represent 10 μm. Figure 4 shows the results of the analysis of induced cells by flow cytometry. Show fruit; Figure 5 shows the identification of toxic regions in Vpr; A series of Vpr constructs are shown. A dark block fading the area of Vpr produced by the construct. The dark blocks represent GST; GST is the protein sequence not shown. BamHI (B), EcoRI (E) and SalI (S) sites for are shown. Shown in bold H (S / F) RIGSalIt is encoded by sequences on both sites of the I site. this Growth of transformed yeast cells producing these proteins is described in the right column. I do. FIG. 6 shows the relationship between HIV-1 Vpr and proteins derived from HIV-2, SIV and yeast. A. Alignment of HIV-1 Vpr with related Vpr Align the Vpr and Vpx proteins in their entirety. Sequence is HIV- 1Vpr NL4-3 (Adachiet al, 1992), HIV-2ROD (Clavelet al, 1992) And SIVmac 239 (Regier and Desrosiers, 1990). 3 or more identical Amino acid regions are shaded. B. Alignment of Sac1p and HIV-1Vpr The complete amino acid sequence of Vpr was aligned with amino acids 77-176 of Sac1p (Cleveset al, 1990). Identical residues are shaded and residues in H (S / F) RIG are shown below. Shown by lines. FIG. 7 shows the osmosensitivity of yeast expressing Vpr. FIG. 8 shows the strategy used for the production of mutant viruses. Figure 9: Mutant virus in human PBMC measured by reverse transcriptase assay. Shows the replication speed of. A. Stimulated cells; B. Unstimulated cells. FIG. 10 shows the effect of synthetic Vpr peptides on yeast colony formation. A. Pep No tide; B. Peptide 1; C.I. Peptide 2; D. Peptide 3. Figure 11 summarizes the results of yeast cell responses to synthetic Vpr peptides. Treatment The matter is described in Example 11. FIG. 12 shows the dose-response relationship for Peptide 3. Peptide 3 in concentration range Cells were added to yeast cells and assayed for colony formation. FIG. 13 shows the concentration of yeast cells on colony formation in the presence of Vpr peptide. Show the effect. Incubating different cell concentrates in the presence of 5 μM Peptide 3 , Cells were assayed for colony formation. Figure 14 shows the incubation of yeast cells with synthetic Vpr peptide for 1 hour. Results of flow cytometric analysis of subsequent propidium iodide (PI) uptake Show. Samples were no peptide, peptide 1, peptide 2 and peptide 3 You. Figure 15 shows the incubation of yeast cells with peptide 3 at various times. Results of flow cytometric analysis of subsequent propidium iodide incorporation are shown. Figure 16 shows in RC2a cells electroporated with synthetic Vpr protein. 5 shows the results of flow cytometric analysis of propidium iodide incorporation. Figure 17 shows mammalian cells electroporated and measured by front and side scatter Analyzed by flow cytometry for changes in cell structure The results obtained from time to time are shown. FIG. 18 shows protection of yeast cells by TMB-8. FIG. 19 shows (A) electroporation and (B) electroporation. CD measured by flow cytometry after extracellular addition of broth⁴⁺With human cells 3 shows the association of FITC (fluorescein isothiocyanate) labeled peptides. Figure 20: Measured by flow cytometryS. S. cerevi siae) FITC-labeled peptides without electroporation in yeast cells Shows the meeting of the De. Figure 21 shows a human CD⁴⁺Internalase in cells (A) and (B) yeast cells 3 shows the FITC-labeled peptide 3 which has been labeled. FIG. 22 shows the genetic interaction between Vpr and Sac1p and actin. Yeast and bacteria The yeast strain used in this study was Saccharomyces cerevisiae ( Saccharomyces serevisiae) strain DY150 (MATaura3-52.leu2-3, 112Trp1-1ade 2-1his3-11can1-100),Candida albicans Clinical isolate JRW5,Candida glabrataStock L5 (Leu ),Kluyveromyces lactisStock MW-98-8c (α uraA arg lys) And Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyc es pombe) Stock SpULA (ade6-704 ura4-D18 leu1-32) h^-It is. Share YEPD (1% East extract, 2% peptone, 2% glucose). E. coli strain TG1 Δ (lac-proAB)sup Ethi hsd Δ5F '(tra D36 proAB ⁺ lacI ^q lacZ ΔM15) Too toxic Used for research, ZxYT medium (1.6% tryptone, 1% yeast extract, 0.5% Na Cl). Mammalian cells Two cds⁴⁺Cell lines, RC2a and Jurkat, 10% heat inactivated fetal calf serum (HIFCS) And maintained in RPMI-1640. Blood is processed by standard Ficoll / Hypaque density gradient method. Mononuclear cells were isolated from HIV-1 serum negative blood obtained from volunteers in a liquid bank. End Phytohemagglutinin (PHA: 10 μg / 10⁶Cells) Stimulated at 37 ° C for 48 hours, washed, RPMI-1640 medium with 10% HIFCS, 10% recombinant Human interleukin-2 (Boehringer Mannheim), 5 mM Hepes, 0.1% weight Sodium carbonate, 25 μg / ml glutamine, 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml suspension Treptomycin, 2 μg / ml polybrene (Sigma) and 1: 1000 anti-interferer The cells were suspended in IL-2 medium containing Miles.Example 1 Molecular cloning of HIV gene The HIV-1 genomic clone pNL4-3 was amplified by polymerase chain reaction (PCR). Used as a source of the HIV-1 gene. pNL4-3 (Adachi et al, 1986) National Institutes of Health CNIH) AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institutes of Allergy and Infections Diseases, NIH (Ad achiet al, 1986).vprSkis used for cloning The frame is shown in FIG. on the other handvifPCR and similar well known procedures for cloning Was. The HIV-1 genomic clone pNL4-3 (Adac hiet al, 1986)vprWas amplified. PCR productsBamHI +SmaCut with I, Host-E. Coli shuttle vector pYEULCBX (Macreadieet al, 1992) Ni AndBamHI +EcoDigest with RI (T4 polished) and pYEULCBX. Manufactured Vpr. This Other HIV-1 genes, such asnef,vpuas well asvifAlso cloned into pYEULCBX And pYEULCBX. Nef27 (Macreadieet al, 1993), pYEULCBX. Vpu (Macreadieet al , 1992) and pYEULCBX. Vif was made. Nef each of these plasmids , Vpu and Vif were designed to dominate the copper-inducible products.vif5 primer ′ GCTCCGGATCCATGGAAAACAGATGGCAGG and 5'CGCCCGGGAt AGCTCTAAAAGCTCTAGTGTCC is there.vifPCR productsBamHI−SmaIt was cloned as an I fragment. Step In the LimerBamHI andSmaThe I cloning site (above) is underlined and crosshatched. The body sequence represents the vif start and stop codons, ensuring that all amplified DNA is error-free. I lined up to confirm Into the yeast expression vector pYEULCBXnef,vpr,vpu as well asvifControl of Nef, Vpu and Vif copper-inducible products respectively Designed to.Example 2 Endogenously expressed vpr protein triggers growth arrest in yeast. Rub In this study, wevprTo recognize its function I let it. At the same time, a general examination of the effects of HIV-1 regulatory proteins on simple cell function As part of our, we also manufacture Vif, Vpu and Nef in haploid yeast, We sought their effect on cell growth. this is,vprAnd other HIV-1 accessory proteins The gene was cloned into an expression vector, pYEULCBX, pYEULCBX. Vpr (See Figure 1 ), PYEULCBX. Nef27 (Macreadieet al, 1993), pYEULCBX. Vpu (Macreadieet a l , 1992), and pYEULCBX. This is achieved by creating Vif (this study). Dr. David Stillman of the University of Utah Medical Center strain DY150 (MATaura3-52.leu 2-3,112Tri1-1ade2-1his3-11can1-100; Macrea die et al, 1993) above with the yeast vector plus glutathione S-transferr Of the vector for the copper inducible product of GST (GST), Vpr. Fused to DY150 GST prepared with YEPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) Proliferated on. Yeast cells were electroporated by Becker and Guarente (1991). Transformation procedure and transformants with 3% Phytagar if required.^TM(Gib co) with 20 μg / ml histidine, adenine and tryptophan, It was grown on miniaturized selective medium. CuSO up to the indicated amount_FourAdding Expression was induced by and assayed for proliferation. Suspend transformants in sterile form and Dropped on plates for growth at ° C. The result is shown in FIG. this is , 0.25 mM CuSO_Four, Containing 20 μg / ml histidine, adenine and tryptophan 3% Phytagar^TM(Gibco) solidified SD plate (0.67% yeast nitrogen plate (Difco, 2% glucose) showing the protein produced by the transformant Show. As shown in FIG. 2, the remarkable effect on cell proliferation was due to Vpr protein, while The other HIV-1 proteins tested have no effect on plant cell growth. Low level (0.25 mM) CuSO_FourCauses an overall growth arrest in Vpr-expressing cells. On the other hand, the opposite effect is 1 mM CuSO_FourOther proteins, even at high induction levels Was not caused by. CuSO_FourWithout addingCUP1From the promoter Basal expression is 5% of the induced level (Macreadieet al, 1994), Since Vpr transformants grow at a slower growth rate than control transformants, the effect of Vpr is It was unrelated to the toxicity of copper. Vpr toxicity was induced by induced cells, even after 24 hours in the presence of the inducer. When plated on medium without added copper It was found not to kill due to growth arrest as it forms a knee. Assay? DY150 [pYEULCBX. Vpr] transformed colonies are DY150 [pYEULCBX] type It was much smaller than the transmuted colonies. These “small” colonies are copper-plated. Parent YD150 [pYEULCBX. Vpr] transformants were proliferated. This indicates cell cycle arrest after induction of Vpr synthesis, then finally harvested to normal Indicates that the cell cycle is reinstated.Example 3 Arrested cells are made very large Examination of cells by light microscopy reveals significantly altered induced cells producing Vpr It was shown to have the morphology. As shown in FIG. 3, Vpr-producing cells were treated under the same conditions. 16 μm straight diameter, which is twice the diameter of the reference DY150 [pYEULCBX] transformant grown under Had a diameter. Most of the intracellular space in this large cell has no structure, It appeared to be occupied by a single large organelle, probably a vacuole. This This is DY150 [pYEULCBX. Vpr] transformants are arrested in growth prior to cell division Suggest thatExample 4 Flow cytometry analysis It was analyzed and classified. Illuminance was measured with a 488 nm argon ion laser (related to cell size. Forward angle light scatter and side scatter was recorded. Cells based on forward angle light scattering And classified. Live cells were gated with propidium iodide and 2 μg Due to lack of fluorescence emission greater than 600 nm after staining with / ml propidium iodide Is shown. Flow cytosed the induced yeast cells to determine the percentage of altered cells. Analyzed by tomometric forward angle light scattering (percentage of cell size). This result is shown in Figure 4. Shown in This is because the Vpr transformants Before the larger range indicating It was confirmed that it showed direction light scattering. A population containing more than 50,000 cells, as shown DY150 [pYEULCBX] and DY150 [pYEULCBX. Vpr].Example 5 Positions of sequences that cause growth arrest include H (S / F) RIG repeat motifs. M The sequence that causes the growth arrest was identified as Vpr protein for its effect on cell growth. It was identified by testing various parts of the quality. Glutathione S-Trans Vpr fused to proteinase (GST) also causes growth arrest (Fig. 2; constituent GST-V). pr, Fig. 5), so we used the yeast GST-fusion vector, pYEULCGT (Wardet al , 1994) and a series of GST fusion proteins were also produced. Encoded by the EcoRI fragment (constructs VprBE and GST-VprBE. Figure 5). Deletion of the last 33 amino acids of Vpr relieves growth arrest, whereas GST in this part of Vpr Addition (construct GST-VprEE, Fig. 5) caused a growth arrest, which It shows that in is the cause of growth arrest. Just the last 21 amino acid GST of Vpr A partial growth arrest was also seen upon addition to the construct (construct GST-VprSE, Figure 5). In each case, growth arrest was determined by flow cytometric analysis and light microscopy. There was an interrelationship in the size of the cells as discriminated by. The important thing is this C The terminal sequence was truncated at 73 amino acids for T insertionvprCode gene product Is a region lacking HIV-1 isolates in many laboratories (Yuanet al , 1990; Ogawaet al, 1990; Lavalleeet al, 1990). These isolates Vpr did not meet with Villion (Ogawaet al, 1990), which is probably Probably because the end was cut off. Our expression confirms the importance of the same C-terminal region Yes, but for one more reason. Growth arrest in this yeast may be associated with the etiology of AIDS. The region of HIV-1 Vpr that causes cell growth arrest was compared to known Vpr-related entities. Most Closely related were SIVVpr, then HIV-2Vpr, and then Vpx protein (Fig. 6A). ). This sequence contains 33% arginine, which is located in the corresponding part of the Vpx protein. Arginine content is significantly higher than that found in. Repeated in Vpr species It is worth noting that there is a conserved return motif, H (S / F) RIG. This motif is (Eco At amino acids 72-75 (encoded in the RI-SalI fragment) as well as(SalAt amino acids 78-82 (encoded in the I-EcoRI fragment) Exist. Than caused by a fragment that encodes two copies Greater toxicity may indicate a copy number effect or perhaps a structural effect. In a study of cellular relationships with Vpr using the program ALIGN, we , Yeast protein, Sac1p (Cleveset al, 1983) is the Genbank database ( release 82.0) has the most significant sequence similarity of cellular proteins listed in I do. In the alignment of Sac1p and Vpr (FIG. 6B), Sac1p was detected in Vpx. H (S / F) RIG mochi containing terminal Gs that is part of a well-conserved motif overall It can be found to have 60% identity in the roof.Example 6 Peptide synthesis The peptides produced are as follows: α-amino group is base-labile Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl) Applied Biosystems 430A Pept using Fast Mac solid phase technology protected by groups Peptides were synthesized on ide Synthesizer. The shortest sequence is synthesized on the resin and Approximately one third of the post peptide / resin was removed from the reaction vessel. Then the second The synthesis was continued in the rest until the peptides were collected. At this stage, Half of the peptide / resin was removed from the reaction vessel. On the remaining peptide / resin The third peptide was collected at. O-tertBy the butyl grouptert-Arginine with butyl group and glutamic acid The side chains were protected. The amino acid 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1 , 1,3,3-Tetramethyluronium hexafluorophosphate activation and Coupling was performed by using N-methylpyrrolidone as a solvent. This Peptide of trifluoroacetic acid (+ scavenger phenol, ethane Cleavage from the resin with thiol, thioanisole and water). Elect this peptide Before porporation, electroporation buffer (0.213 g / l.Na₂HPO_Four , 0.068 g / l KH₂PO_Four, 93.1 g / l sucrose) (Wojchowski and Sytkonski, 19 It was dialyzed against 86). Peptides 4-6 were protected as follows: based on -labile 9-fluor. Α-amino group based on a renylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group; 2,2,5,7, 8-pentamethylchroman-6-sulfo Arginine side chain by Nil (Pnc);tert-Serine and threonine with butyl group ; Trityl asparagine, glutamine, histidine and cysteine; 0-tert-Glutamic acid due to the butyl group. The amino acid 2- (1H-benzotri Azol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethylronium hexafluoro Phosphate (HBTU) activation and using N-methylpyrrolidone (NMP) as solvent Coupling. This peptide was labeled with TFA as a scavenger The resin, ethanedithiol, thioanisole and water were added and cleaved from the resin.Example 7 H (S / F) RIG motif in synthetic peptides causes permeation sensitivity We have synthetic peptides: Was used to further study the function of the H (S / F) RIG motif. This peptide is shown in Example 6. And contains the penultimate 14, 21 and 26 amino acids of Vpr, respectively. H The (S / F) RIG motif (underlined) is responsible for replication of 0.1 and 2 within these peptides, respectively. Exist. Electroporation of these peptides into yeast cells And then analyzed for permeation sensitivity. 2 mg / ml electroporation Peptides dissolved in the buffer were yeast-treated with Baekon 2000 (Saratoga, CA). Electroporated into cells. Conditions for processing in Baekon 2000 Is: 2¹¹Pulse, 8kv, 0.8 second burst time, 100μs pulse time, 10 cycles, The gap between the solution and the top electrode is 1 mm. This cuvette contains 5 μl of Dulb ecco Add's Phosphate-Buffered Saline and 5 μl peptide solution to add fresh YEPD Heterogeneous immersion of live cells containing 30 μl of yeast suspension in culture medium It was found that it was necessary to kill 60-80% to achieve transparency. YEPD medium and YEP containing 1.2M KCl, 1.8M sorbitol or 0.9M NaCl Plate in D medium and colonize as described by Chowdhuvy et al (1992). Cells were examined for permeation sensitivity by counting the number of growth units. Two Permeability was calculated by comparing the relative numbers of colony forming units on the medium . All living cells, including permeabilized cells, grow on YEPD but are permeabilized. Those that were sex did not grow on high osmolarity media. The results shown in Fig. 7 are H (S / F) R It shows that peptides lacking the IG motif are essentially undisturbed. However Peptides containing the H (S / F) RIG motif cause permeation sensitivity and up to 50% Cells were killed on high osmolarity medium. This effect is due to the existing H (S / F) RIG motif Proportional to the number of replications, indicating a direct role for this sequence.Example 8 Pathogenicity is associated with sequences containing the H (S / F) RIG motif The region of the Vpr protein containing the H (S / F) RIG motif is a human and monkey immunodeficiency virus. Can be correlated with the pathogenicity of Vpr and V from human and simian immunodeficiency virus A simple edit of the px array is shown in Table 1. In HIV-1, a highly pathogenic virus Conservation of almost all amino acids containing two repeating H (S / F) RIG motifs You. The seven simian immunodeficiency virus Vpr sequences have high levels of sequences containing the H (S / F) RIG motif. Shows a good storability (two changes). However, indicated by an asterisk The two sequences have little sequence conservation (8 or 9 changes). Mandrill Both the virus and the Sykes'monkey virus have little sequence conservation and no Symptomatic infection Has been reported to cause (Hirschet al, 1993; Tsujimotoet al , 1989). There are 2-5 conversions from the canonical sequence in HIV-2 isolates. HIV-2 is HIV- We are less virulent than 1, and we believe that these conversions could be the reason for the reduced virulence. Believe. Moreover, the presence of Vpx can reduce pathogenicity. Matsudaet al(1993) is , When HIV-1 replaced Vpx instead of Vpr, its viral form and its infection It has been shown to lose sex. This ensures that any virus that produces Vpx We get expected to be less virulent than those that produce only pr Predicts. The overall common for Vpr sequences except those represented by asterisks is: It is. In summary, the arrayHFRIGCRHSRUnderlined residues in IG are invariant in Vpr You. F can be I or L; I can be L, G, S or M; the last G is S Can be. It should also be noted that the C between the motifs is invariant.Example 9 Replication rate of mutant provirus Production and titration of virus cultures Mutant half clone and wild type HIV DNA were analyzed by Lipofectamine (GIBCO-BRL) method. HeLa cells (5 x 10⁶Cells). PBM 12 hours after transfer L (20 x 10⁶Cells) and the cell-free virus production was measured at regular intervals. Up Qing was taken out at the maximum production of cell-free virus and used as a preservation virus . 24 well The virus preservation solution was titrated on a Linbro plate to determine its reverse transcriptase (RT) activity. End point dilution was evaluated by both viability and cytopathic effect. Follow standard methods RT assay was performed in microtiter plates. Construction of mutant provirus HIVNL 4.3 molecular clone (Adachiet al, 1986)nefas well asvprGene opening Due to the point mutation of the start codon, two half fragments were created in the vector of pKP5. It was recloned. Using the mutagenesis scheme outlined in Table 2, Mutant provirus was generated according to the procedure described. The HIV-1 molecular clone used is pNL4-3. Full-length claw in E. coli Due to the instability of the gene, half clones were made in the low replication vector, pKP59, and It was kept stable in enterobacteria. 5'sequenceStuI-EcoIntroduced as RI fragment While the 3'sequence isEcoRI-AvrIt was introduced as a II fragment. These half The clone can be almost digested (for 5'cloneXbaI +EcoRI About Lagment and 3'cloneEcoRI +HaeII), this cleaved DNA Recombination in which the wild-type virus is restored It was introduced into animal cells. Appropriate segmentation of pNL4-3 to obtain mutant virus Cloned into a phagemid to make single-stranded DNA, Then specificvpras well asnefThe oligonucleotides shown in Table 3 designed to introduce mutations The second strand was synthesized in the presence of Otide. After purification and sequence conversion assays, the DNA was subcloned into the pKP59-half clone. , The wild-type sequence was replaced with the mutant sequence. Mutant clone does not express Nef or Vpr Does not express or expresses any protein. PMMC infection Peripheral blood mononuclear cells were infected at a multiplicity of infection (MOI) of 0.01, and the cell-free supernatant was Reverse transcriptase (RT) production was assayed daily by a quasi technique. Mutant plough deficient in Nef or Vpr production in stimulated PBMCs. The virus was significantly less cell-free in both cases than in the parental virus strain. A similar amount of loose particles was produced. The effect of Vpr on virus replication is shown in Table 4. Like H (S / F) RIG mochi Seems to be mediated by eruf. For the production of mutant provirus viruses with defects in the production of both Nef and Vpr It was severely suppressed at room temperature and showed a delayed replication rate (Fig. 9a). In vivo cell population Both Nef and Vpr are cell-free viruses in very similar unstimulated human early cells. It is essential for production (Fig. 9b). Vpr^-Lesser variants Produces the virus of Nef^-Mutants show delayed replication rates, while Nef^- Vpr^-Double The variants appear to act synergistically.Example 10 The H (S / F) RIG motif within the synthetic peptide is the stop of amplification in yeast. Cause Peptides were dialyzed against PBS, 10 in a final volume of 200 μl water.⁶Cells / ml A final concentration of 2 μM was added to the yeast cells suspended in the density. 1 hour ink After incubation 5 × 10^FourSpread cells on solidified YEPD and plate at 48 ° C for 48 hours. After a period of incubation, colonies were inspected for growth. Peptide solution Peptide concentration was determined by quantitative amino acid analysis. The ability of cells to form colonies by the addition of peptide 2 or peptide 3 Were completely lost, while the addition of peptide 1 had no effect (FIG. 10). This By comparison with Example 5, we show that biological activity as assessed by osmotic sensitivity We found a correlation between and the intracellular presence of the H (S / F) RIG motif. Therefore, we only include the H (S / F) RIG motif, and as shown in FIG. Peptides such as peptide 4, which is also responsible for the osmotic susceptibility of P. Pep Tide 4 also causes a complete loss of colony forming capacity. Peptide 2-like but Stain-deficient peptide 5 also produced a considerable effect, which was due to the cysteine Is not essential for activity, but is likely to increase activity, probably due to structural effects. Show. We used peptide 3 to establish a dose response relationship. Concentration in a specific range Treatment of cells with Peptide 3 of the lowest concentration of peptide induces complete growth arrest. The degree is about 1 μM as shown in FIG. The concentration down to 0.05 μM Partially effective, but below this concentration no effect.Example 11 Interfering with growth arrest effect by cell mass There is also an effect caused by the cell concentration. At high cell concentrations, peptides The efficacy is limited. Figure 13 shows a range of cell concentrations for peptide 3 at 5 μM. 7 shows the colony formation after treatment of yeast. Ten^FiveCell concentration up to cells / ml The full effect was seen; however, 10⁶At the concentration of cells / ml , No effect was observed. This is about 10 peptides per cell⁶Molecule is a colony It is shown to be required for inhibition of formation. We find that this effect is eliminated by the presence of medium. It has also been observed that it can be eliminated; for example, this effect is about 1/10 of normal intensity Even at low concentrations, it is greatly reduced in the presence of YEPD.Example 12 Effects of synthetic peptides on other microorganisms We show the effect of these peptides on the growth of some additional microorganisms. Researched. The results are shown in Table 5. E. coli and 3 budding yeasts;Candida albicans ) ,Candida glabrataas well asKluyveromyces (Kluy veromyces) , As well as fission yeast, Schizosaccharomyces pombu ( (Schizosaccharomyces pombe)S. S. cerevisiae ) It was similar to that seen in. By using RC2a cells on the surface of the culture plate. The effect of the peptides to inhibit the formation of erythrocytes was also seen on mammalian cells. We used the same method except that the treated cells were suspended in 2% glucose / 50mN HEPS. E. coli was treated with peptides 1, 2 and 3 in the same manner as the yeast. The data in Table 5 is It was shown that peptides containing the H (S / F) RIG motif affect the viability of Escherichia coli. You. However, when E. coli was suspended in PBS and treated with these peptides, We have found that no loss of colony forming ability is observed. therefore, This activity seems to depend on the medium used.Example 13 Effect of peptides on yeast cell permeability We test cells with Fungolight Live / Dead Stain (Molecular Probes) Found to be on for several hours after peptide treatment, ie metabolically active Issued; however, they had lost the ability to colonize. This allows The effect of peptides appears to create an irreversible growth arrest. We used flow cytometry followed by staining with propidium iodide and vital staining. Cells that were peptide treated by color were further examined. The result shown in Figure 14 is 1 o'clock Ensure that there is a significant effect caused by peptides 2 and 3 after You. 95% of cells with little or no treatment with Peptide 1 Do not incorporate propidium iodide. Half of cells in peptides 2 and 3 Less than incorporates propidium iodide. Incorporation of propidium iodide It usually indicates cell death or membrane damage to the yeast. This analysis is It shows that no major cell lysis occurs. A kinetic analysis of the effect of peptide 3 shown in FIG. It shows that the cells take up propidium iodide within minutes of the addition of tide.Example 14 VPR peptide kills ^{CD4 +} cells We have two cds⁴⁺Cell lines, RC2a and Jurkat, were used to pre-monocyte and T cell, respectively. It was used to express the lymphoid cells. Electroporation of peptides 55 μl Baekon buffer (1.5 mM Na₂HPO_Four， 0.5mM KH₂PO_Four, 0.27M sucrose pH7 .0) and 1 million CD suspended in 10 μl PBS (phosphate buffered saline)⁴⁺ 10 μg of peptide was added to the cells. Baekon 2000 Advanced Macromolecule Tra Electroporation conditions for nsfer System (San Francisco, CA) are 2¹ ¹ Pulse 8kV, 0.8sec burst time, 62.5μsec pulse time, 3 cycles, solution and above It is an 85 mm gap with the partial electrode. Peptide-electroporated The cells were suspended in 1 ml RPMI-1640 10% HIFCS and humidified at 37 ° C in 5% CO 2.₂Inn Incubated in a cubator. Re-electroporation and cell pretreatment Peptide-electroporated cells with peptides or with peptides 24 hours for re-electroporation of each cell without and 24 hours The cells were later assayed by flow cytometry. Electroporation One million cells were treated with 0.5 nM TMB-8 hydrochloride ((8- (diethylamino) -Octyl-3,4,5-trimethoxybenzoate), HCl) or 0.5 μM pro Pretreated with either staglandin. Cells after electroporation The same concentration of each reagent was kept. Preparation of cells for flow cytometry 1 million cells were collected and washed once in PBS at 1600 rpm for 5 minutes, this pellet Containing 2 μg propidium iodide in the preparation for flow cytometry. Resuspended in 200 μl PBS. 48 hours after electroporation, culture the cells. Using the Coulter Epics Elite Flow cytometer for 24 parameters analyzed. The forward and side scatter of a 488 nm Alcon ion laser was measured. 600 nm Propidium iodide exclusion was measured by the lack of superfluorescence. Figure 16 shows that peptide 3 has RC2 compared to quasi-electroporated cells. It is shown to kill a cells to a significant extent. Peptide 2 is less than Peptide 3 Cells are killed and the results are comparable in both cell lines. However, H (S Peptide 1 lacking the / F) RIG motif does not affect these cell lines. Pe The effects of peptides 2 and 3 were enhanced by pretreatment with prostaglandin E2 Eliminates the need for double electroporation. The effect of peptides is Ca²⁺ -Improved by pretreatment with the channel blocker TMB-8 HCl. H (S / F) RIG mochi The eruf has a cellular structure as measured by forward and side scatter as shown in Figure 17. Also affects. Peptide 3 was quasi-electroporated and other peptides. Both side and forward scatter compared to cells in which the peptide was electroporated Make a right shift of. This means that peptide 3 has both cell size and cell granularity. It is shown that it induces an increase in stroke.Example 15 Prevention of yeast cell growth arrest by TMB8 and high ionic strength The addition of TMB-8 30 minutes before the addition of the peptide was Eliminate the effect of 3. Various concentrations of TMB-8 were pre-incubated with yeast cells for 30 minutes before Vesicles were incubated in the presence or absence of 5 μM Peptide 3. Then the cells It was assayed for colony formation. Low concentrations of TMB-8 protect about 13% of cells Was. TMB-8 causes some toxicity at high concentrations but poisons at low concentrations. No gender was observed. At these low levels of TMB-8, the Vpr protein It was totally ineffective in inhibiting the colony forming ability of the streak cells. Sodium, calcium, potassium or lithium ion addition of peptide 3 When added 30 minutes before or immediately after addition, totally eliminated the effect of Vpr peptide. Was. The osmotic support sorbitol also provided partial protection, with total protection at 0.1 x YEPD. Served by incubation. These results are outlined in Table 6. The presence of salt This apparent protection below is due to the fact that yeast cells contain peptides containing the H (S / F) RIG motif. This is because it cannot be combined with and internalized. However, feeding In the case of product cells, uptake of these peptides was observed in standard serum-containing medium. Was perceived. Example 15 Viability of bacterial cells producing Vpr The cells were treated with the inducer IPTG and aliquoted 2XYT + Ah after an appropriate time. Plate on mubicillin plate and after overnight incubation of plate The number of colonies was counted. This data is (vprofBamHI−EcoRI Fragmen Production of GST and GST-Vpr.BE does not kill E. coli cells but induces Shows that development slows growth. The production of GST fused to the full-length Vpr protein is 3 Leads to a similar effect after the induction of time; however, 30 hours during the inducer There is an actual reduction in the number of ampicillin resistant cells per ml. This is overnight Although the media typically reach optimal concentrations after incubation of Most of the cells in culture are Amp^xMissing determinants (and no longervprTo Not expressed). Furthermore, it is the C-terminal region of Vpr in cell death. Affect the area. It is also clear that uninduced cells do not increase in number, This shows a cytostatic effect in the absence of inducer. However, 10 cells⁸Proliferation up to cells / ml means that the toxic effect is specific to the spent media such as Suggesting that it may be specific to the condition. Example 16 Interaction between fluorescent labeled peptide and cells FIG. 19 shows (A) electroporation and (B) electroporation. FITC measured by flow cytometry after extracellular addition without fluorescein (fluorescein Cein inthiocyanate) labeled peptide and CD⁴⁺Shows association with human cells. FIG. 20 shows the S. cerevisiae measured by flow cytometry. S. cerevisia e) of FITC-labelled peptides without electroporation in yeast cells Indicates a meeting. Peptides 2-4 show a high degree of association with yeast cells, while peptides Peptides lacking the H (S / F) RIG motif, which show significantly less association of peptide 5, It is more than 100 times less associated with cells than peptides 2 and 3. With an optical microscope, we As shown in FIG. 21, FITC-labeled peptide 3 had an effect on yeast and mammalian cells. I'm observing the target. The same applies to peptides 2 and 4. these The data shows that the H (S / F) RIG motif is the cell Is sufficient for targeting within Related derivatives, which can also be a set, are the infusion of drugs into cells for the treatment of diseases. It would be a useful carrier for delivery. Figure 21 shows a human CD⁴⁺Intracellular (A) and yeast intracellular (B) 3 shows the FITC-labeled peptide 3 that has been localized. FITC-labeled human cells are still complete It contains some cells and others that are lysed.Example 17 Genetic interactions between Vpr and Sac1p and actin Eastact1 andsacOne mutant, DBY1195 and DBY1715, respectively, was added to pYEULCBX and pY It was transformed with EULCBX-Vpr. Then, transformants were plated with 0.5 mM copper sulfate. And assayed for the effect of Vpr. DY150 [pYEULCBX] and DY150 The [pYEULCBX.Vpr] transformants have been described previously.Sac1-vprAbout interaction An example of all these results is shown in FIG. We found that Vpr exhibits structural homology with the yeast protein Sac1p. The precise function of Sac1p in the assembly of the actin cytoskeleton of yeast cells It is still under study; however, the Sac1 mutant has significant cytoskeletal deficiency and low temperature. Growth arrest (Clevesetal, 1989 ； Novicketal, 1989 ； Whittersetal199 3). The production of Vpr in yeast shows sequence and functional similarity between Sac1p and Vpr. for,Sac1Probably cause similar effects to mutants; Vpr production Can antagonize normal Sac1p function, including large cell size and eventual growth arrest. It leads to a lack of cytoskeleton. In many studies of yeast that actually lacked a cytoskeleton , The mother cells are unusually large and the daughter cells are unusually small (eg Liu and Bretscher , 1992). We show the time course of newly induced cells that produce Vpr. We find that overanalysis shows the same phenomenon. Penetration Passivity also showed a possible cytoskeleton deficiency induced by Vpr. Big to produce Vpr Cells are isolated by flow cytometry, medium containing high osmolarity and normal medium Plated on top. Only 50% of cells that can grow on normal medium are highly soaked Can grow on permeable medium, which is a structural defect in these cells Is shown. Vpr appears to cause cytoskeleton deficiency in mammalian cells and yeast cells. You. A study by Levy et al. Showed that Vpr arrested cell replication and arrested in rhabdomyosarcoma cell lines. It is shown to cause the size of large cells (Levy et al, 1993). In addition, the CD⁴⁺T -In lymphoblastoid (T-lymphoblastold) cell lines, HIV-1 Superstructure including time, membrane disruption, "ballooning" and vacuolization of the endoplasmic reticulum It has been shown to cause structural changes (Fermin and Garry, 1992). These de Data is consistent with a lack of cytoskeleton, which is relevant for studies of cytoskeleton in these cells. Let's be careful. What is the role of Vpr in the HIV-1 life cycle and what is its associated growth arrest? Will you be induced? Sometimes a gilet on the distinction between HIV-1 and other retroviruses Retroviruses require cell proliferation for infection, while HIV- 1 eventually infects non-proliferating cells such as differentiated macrophages. Lenisetal (1993) is a CD⁴⁺Lives in HIV-1 when the cell line is arrested in the G2 growth phase. It has been shown that it can be infected productively. Therefore, non-proliferation of host cells may be It could initially be required for productive infection of some cell types. The function of Vpr is It can cause growth arrest so that a crowd-like process can occur. This is a book If so, Vpr (and Vpx analogues) is so that early events can occur. It may be the cause of meeting with the virion. Antibodies to Vpr are one of the patients with AIDS Detected in only 7%, but 47% of asymptomatic individuals Found in (Wong-Stoaletal, 1987). This is due to Vpr infection Exist at an early stage, and therefore it is probably essential only at this point. And suggest. Inhibitors of Vpr slowly infect or get out of the cell It is also suggested that it should prevent the spread of In this study, we have included a portion of Vpr containing the sequence HFRIGCRHSRIG or RHSRIG. Even the dead part, when added to yeast cells, causes cell damage and irreversible growth arrest. Cause a stop. This effect is related to cell and peptide concentration and is minimally equivalent to the cell. 10 of peptides⁶The molecule is required to observe its effect. We have the same array Enter the cell when it is electroporated from a peptide containing this sequence. It was also shown to be associated with causing permeability and structural deficits. Electro Since YEPD in the poration medium eliminates extracellular effects, electroporation After that, only the intracellular effect was examined. Peptides containing the H (S / F) RIG motif are found in both mammalian and yeast cells It appears to cause cell damage resulting in increased permeability and cell lysis. we Observed cell-association of a Vpr peptide containing the H (S / F) RIG motif; F Fluorescence microscopy using ITC-labeled peptides showed that they were It is indicated that the We have found that the H (S / F) RIG motif is the active peptide It has been confirmed that the FITC-labeled peptide 1 is incorporated into H ( The uptake of peptides containing the (S / F) RIG motif appears to be 100-fold lower, which is , Show that this motif promotes uptake. In Example 7, The peptide uptake was artificially obtained by electroporation and was studied. The fruits were osmosensitive; the electroporation technique itself was of varying degrees. Induced cell death or loss of colony forming ability. But However, there was a high degree of penetration sensitivity in a large number of colony-forming cells. . The effect observed in Examples 10-15 was in the overall loss of colony forming ability. And is completely different. These differences are related to the localization of peptides in cells Could be. Permeation sensitivity, rather than loss of colony forming ability, was demonstrated in Example 2. As described invprFor gene expression It was also observed. What AIDS phenomenon is related to our results? Levyetal(1994 ) Showed that Vpr is present in serum, which A putative Antagonis of this protein, which is shown to be released from infected cells In designing a bot, in addition to its intracellular effects, it It is relevant to consider the extracellular effects of Vpr that may cause killing. Using a biologically active fragment of Vpr, we find that it is part of Vpr Vpr protein enhances colony forming ability through the action of H (S / F) RIG motif in Vpr. It was shown to affect irreversibly. The method of action of this effect is Ca²⁺Ionchi It may be related to the channel. Because Ca²⁺Ion channel block Kerker TMB-8 eliminates this effect as shown in Examples 14 and 15. You. The citations referred to within this specification are listed on the following pages and are hereby incorporated by reference. Include in the book. Although the present invention has been described in some detail for purposes of clarity and understanding, the present specification Various improvements and conversions to the embodiments and methods described therein are described herein. It will be apparent to those skilled in the art that it can be done without departing from the scope of the inventive concept that is carried out. It will be clear.

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年３月１５日【補正内容】明細書発明の概略１つの態様によれば、本発明は、HIV感染の治療方法であって、HFRIG及びHSRI Gから選択される少くとも１つのモチーフを含むVpr蛋白質のアンタゴニストの、又はVpr蛋白質の生物学的に活性なフラグメントもしくはアナログの効果的な量を前記治療の必要な患者に投与するステップを含み、それによりHIV感染を防ぐこと、症状的AIDSへのHIV感染の進行を防ぐこと、又はAIDSの症状を緩和することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、前記Vpr蛋白質は、HSRIG，HFRIG，HSRIS，HFRAG，HIRAG，HLRAG ，RSRKG，RSRIS及びRSRIGからなる群から選択される少くとも１つの配列を含む。第２の態様において本発明は、増殖阻止、細胞複製阻止、細胞毒性、細胞骨格破壊、及び小胞体への効果からなる群から選択されるVprにより媒介される１以上の活性を阻害する能力を有する、先に定義されるVpr蛋白質の、又はVpr蛋白質の生物学的に活性なフラグメントもしくはアナログのアンタゴニストを提供する。このようなアンタゴニストは、HIV感染の治療のための治療剤として有用であろうと考えられる。本発明は、医薬として許容される担体と共に活性構成物として先に定義される Vprのアンタゴニストを含む医薬的組成物も含む。 Vpr又はVpr蛋白質の生物学的に活性なフラグメントもしくはアナログに対する特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体、並びにVprの、又は前記生物学的に活性なフラグメントもしくはアナログの発現を防ぐアンチセンスRNAもしくは三本鎖DNAが、Vprの活性の阻害の方法を供し、結果として本発明の範囲内であることを当業者は認識するであろう。与えられたペプチド配列に対するモノクローナル抗体の製造方法、並びに標的細胞におけるアンチセンス RNAもしくは三本鎖DNA製造を誘導するための方法は、当該技術において公知である。例えば、Vpr蛋白質のＣ末端部分をコードする領域が抑制性アンチセンス配列により、又は抑制性ペプチドをコードする配列により置換されているvpr 遺伝子を、HIV感染又はAIDSの遺伝子治療のために用いることができるであろう。第３の態様において、本発明は、先に定義されるVpr蛋白質の、又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログのアンタゴニストとして有用であると推測される化合物をスクリーニングする方法であって、本明細書に記載されるような、増殖阻止、細胞複製阻止、細胞毒性、細胞骨格破壊、及び小胞体への効果からなる群から選択される生物学的活性のアッセイにおいて、Vprの活性を阻害することにおけるテスト化合物の効果性を測定するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。我々の結果は、Vpr蛋白質又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログが、細胞内又は細胞外のレベルのいずれにおいても攻撃され得る活性を有することを示し、それゆえ両方のタイプの生物学的活性は本発明の範囲内である。第４の態様によれば、本発明は、HIV感染を防ぐための、又はHIV感染の効果を緩和するためのワクチンであって、医薬として許容される担体と共に、Vpr配列の少くともＣ末端21アミノ酸をコードするHIVゲノムの部分が削除されているヒト免疫不全ウィルス−１又はヒト免疫不全ウィルス−２を含むことを特徴とするワクチンを提供する。好ましくは、Vpr配列の少くともＣ末端33アミノ酸をコードする前記ゲノムの部分が削除される。更に好ましくは、Vpr配列のＣ末端領域をコードするゲノム部分とNef遺伝子のＮ末端をコードするHIVゲノムの部分との両方が削除される。Nef遺伝子の関連した部分は、1994年３月18日に出願された我々の同時係属特許出願第PCT／AU94／00254号(WO94／26776)に記載される。請求の範囲１．HFRIG及びHSRIGから選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むヒト免疫不全ウィルス(HIV)のVpr蛋白質の、又はVpr蛋白質の生物学的に活性なフラグメントもしくはアナログのアンタゴニストであって、該アンタゴニストが、増殖停止、細胞複製停止、細胞毒性、細胞骨格破壊、及び小胞体に対する効果からなる群から選択されるVprにより媒介される１以上の活性を阻害する能力を有することを特徴とするアンタゴニスト。２．前記Vpr蛋白質が、HSRIS，HFRAG，HIRAG，HLRAG，RSRKG，RSRIS及びRSRIG からなる群から選択される少くとも１つの配列を更に含むことを特徴とする請求項１に記載のアンタゴニスト。３．前記Vpr蛋白質が、Vpr配列の少くともＣ末端21アミノ酸を含むフラグメントであることを特徴とする請求項１又は２に記載のアンタゴニスト。４．前記Vpr蛋白質がVpr配列の少くともＣ末端33アミノ酸を含むフラグメントであることを特徴とする請求項３に記載の方法。５．抗体、アンチセンスRNA、及び３本鎖DNAからなる群から選択される請求項１〜４のいずれか一に記載のアンタゴニスト。６．抗体であることを特徴とする請求項５に記載のアンタゴニスト。７．モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項６に記載のアンタゴニスト。８．アンチセンスRNAであることを特徴とする請求項５に記載のアンタゴニスト。９．三本鎖DNAであることを特徴とする請求項５に記載のアンタゴニスト。 10．医薬として許容される担体と共に、活性構成物として請求項１〜９のいずれか一に記載のアンタゴニストを含むことを特徴とする医薬的組成物。 11．Vpr蛋白質の、又はVpr蛋白質の生物学的に活性なフラグメントもしくはアナログのアンタゴニストとして役立つと予想される化合物をスクリーニングする方法であって、増殖停止、細胞複製停止、細胞毒性、細胞骨格破壊、及び小胞体に対する効果からなる群から選択される生物学的活性のアッセイにおいて、Vpr の活性を阻害することにおけるテスト化合物の有効性を測定するステップを含むことを特徴とする方法。 12．HIV感染の防止のための、又はHIV感染の効果の緩和のためのワクチンであって、該ワクチンがNef遺伝子内にヌル変異を有するヒト免疫不全ウィルスを含まない条件において、Vpr配列の少くともＣ末端21アミノ酸をコードするHIVゲノムの部分が削除されているヒト免疫不全ウィルス−１又はヒト免疫不全ウィルス −２を、医薬として許容される担体と共に含むことを特徴とするワクチン。 13．Vpr配列の少くともＣ末端33アミノ酸をコードする前記ゲノムの部分が削除されていることを特徴とする請求項12に記載のワクチン。 14．Vpr配列のＣ末端領域をコードするゲノムの部分及びNef遺伝子のＮ末端をコードするHIVゲノムの部分の両方が削除されていることを特徴とする請求項12 又は13に記載のワクチン。 15．Vpr蛋白質のＣ末端部分をコードする領域が、抑制性アンチセンス配列により、又は抑制性ペプチドをコードする配列により置換されていることを特徴とするvpr遺伝子。 16．HIV感染の治療の方法であって、請求項１〜９のいずれか一に記載のVpr蛋白質の、又はVpr蛋白質の生物学的に活性なフラグメントもしくはアナログのアンタゴニストの効果的な量を前記治療の必要な患者に投与し、それによりHIV感染を防ぐか、症候性AIDSへのHIV感染の進行を防ぐか、又はAIDSの症候を緩和するステップを含むことを特徴とする方法。 17．細胞増殖により媒介される病気の治療の方法であって、HFRIG及びHSRIGから選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むVpr蛋白質の、又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの効果的な量を前記治療の必要な哺乳動物へ投与し、それにより前記病気を媒介する細胞の増殖を阻害するステップを含むことを特徴とする方法。 18．前記細胞増殖により媒介される病気が癌、白血病、又は乾癬であることを特徴とする請求項17に記載の方法。 19．前記Vpr蛋白質又はフラグメントもしくはそのアナログがCa²⁺チャンネル輸送のエンハンサーと組み合わせて用いられることを特徴とする請求項17又は18 に記載の方法。 20．病原体により引きおこされる病気の治療の方法であって、HFRIG及びHSRIG から選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むVpr蛋白質又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの効果的な量を前記治療の必要な哺乳動物に投与するステップを含むことを特徴とする方法。 21．前記病気がバクテリア、寄生虫、イースト又は真菌により引きおこされることを特徴とする請求項20に記載の方法。 22．細胞膜への、又は細胞の内部への医薬的に活性な物質の輸送のための薬剤であって、該薬剤がHFRIG及びHSRIGから選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むVprペプチド又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログを含み、前記Vprペプチド、フラグメント又はアナログが前記医薬的に活性な物質に結合されていることを特徴とする薬剤。 23．細胞膜への、又は細胞の内部への医薬的に活性な物質の輸送の方法であって、請求項22に記載の薬剤に前記細胞を接触させるステップを含むことを特徴とする方法。 24．細胞増殖により媒介される病気の治療における、HFRIG及びHSRIGから選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むVpr蛋白質の、又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの使用。 25．病原体により引きおこされる病気の治療における、HFRIG及びHSRIGから選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むVpr蛋白質の、又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの使用。 26．HCKKG，CLGEG，CLGEE，CLGGE，CLGRG，HVRKG，HYTKG，HFKRG，HFKKG，HAK RD，CLQEG，CLGGG，CRGEG，CWGED，HFRCG及びRRQPFからなる群から選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むヒト免疫不全ウィルス−２（HIV−２）のVpx蛋白質の、又はVpx蛋白質の生物学的に活性なフラグメントもしくはアナログのアンタゴニストであって、前記アンタゴニストが集団停止、細胞複製停止、細胞毒性、細胞骨格破壊及び小胞体に対する効果からなる群から選択されるVp xにより媒介される１以上の活性を阻害する能力を有することを特徴とするアンタゴニスト。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年７月２４日【補正内容】明細書図15は、種々の時間でのペプチド３でのイースト細胞のインキュベーションの後のプロピジウムイオジド取り込みのフローサイトメトリー分析の結果を示す。図16は、合成Vpr蛋白質でエレクトロポレーションされたRC２ａ細胞におけるプロピジウムイオジド取り込みのフローサイトメトリー分析の結果を示す。図17は哺乳動物細胞がエレクトロポレーションされ、前及び横散乱により測定された細胞構造における変化についてのフローサイトメトリーにより分析された時に得られた結果を示す。図18は、TMB−８によるイースト細胞の保護を示す。図19は、（Ａ）エレクトロポレーション及び（Ｂ）エレクトロポレーションなしの細胞外添加の後にフローサイトメトリーにより測定されたCD⁴⁺ヒト細胞との FITC（フルオレセインイソチオシアネート）標識ペプチドの会合を示す。図20は、フローサイトメトリーにより測定されたＳ．セレビシアエ(S．cerevi siae) イースト細胞におけるエレクトロポレーションなしでのFITC−標識ペプチドの会合を示す。図21は、ヒトCD⁴⁺細胞（Ａ）及び（Ｂ）イースト細胞におけるインターナリゼーションされたFITC−標識ペプチド３を示す。図22は、Vpr及びSac１ｐとアクチンとの間の遺伝的相互作用を示す。図23は、H(S／F)RIG繰り返しモチーフを含むVpr蛋白質及び合成ペプチドが哺乳動物細胞におけるDNAフラグメンテーション及び細胞周期の原因となることを示す。図24は、H(S／F)RIG繰り返しモチーフを含む細胞外Vpr蛋白質及びペプチドがヒトCD⁴⁺細胞における膜透過性上昇の原因となることを示す。図25は、ヒトCD⁴⁺細胞内へのVprの細胞外Ｃ末端ペプチドの浸透及び細胞損傷の誘導を示す。イースト及びバクテリア本研究において用いられるイースト株は、サッカロマイセス・セレビシアエ（ Saccharomyces serevisiae）株DY150(MATa ura 3-52．leu 2-3，112 Trp 1-1 a de 2-1 his 3-11 can 1-100)、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）臨床的単離体JRW５、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）株Ｌ５（Leu ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）株MW−98−８ｃ（α ura A arg lys）及びスキゾサッカロマイセス・ポンブ(Schizosaccharomyc es pombe)株SpULA(ade6-704 ura4-D18 leu1-32 )ｈ^-である。株をYEPD（１％イースト抽出液、２％ペプトン、２％グルコース）中で増殖させた。大腸菌株TG１ Δ（lac-proAB ）sup Ethi hsd Δ５Ｆ′（tra D36 proAB⁺ lacI^q lacZ ΔM15 ）も毒性研究のために用い、ZxYT培地(1.6％トリプトン、１％イースト抽出液、 0.5％ NaCl)上にプレートした。イーストにおけるVprの産生は、Sac１ｐ及びVprの間の配列及び機能的類似性のため、Sac1変異体と類似した効果をおそらく引きおこすであろう；Vprの産生は、通常のSac１ｐ機能と拮抗し得、大きい細胞サイズ及び最終的な増殖停止を含む細胞骨格欠如を導く。実際に、細胞骨格が欠如したイーストの多くの研究において、母細胞は異常に大きく、娘細胞は異常に小さい（例えば、Liu及びBrets cher，1992を参照のこと）。我々は、Vprを産生する新しく誘導された細胞の時間経過分析が同じ現象を示すとを見いだしている。浸透感受性もVprにより誘導される可能な細胞骨格欠如を示した。Vprを産生する大木な細胞をフローサイトメトリーにより単離し、高浸透力を含む培地及び通常の培地上にプレートした。通常の培地上で増殖することができる細胞の50％だけが高浸透力培地上で増殖することができ、これは、これらの細胞における構造的な欠如を示す。 Vprは哺乳動物細胞及びイースト細胞において細胞骨格欠如をおこすようである。Levy５による研究は、横紋筋肉腫細胞系において、Vprが細胞複製停止及び大きな細胞の大きさをひきおこすことを示す(Levy et al，1993)。更に、CD^4-Ｔ −リンパ芽球型（Ｔ−lymphoblastoid）細胞系において、HIV-１が、感染の最初の時間、膜破壊、“バルーニング(ballooning)”及び小胞体の空胞化を含む超構造変化の原因となることが示されている（Fermin and Garry，1992）。これらのデータは細胞骨格欠如と一致しており、これらの細胞における細胞骨格の研究が関心事となろう。実施例18 H(F／S)繰り返しモチーフを含む細胞外Vpr及びペプチドは、哺乳動物細胞のDNAフラグメンテーション及び細胞周期停止の原因となる。ヒトCD⁴⁺前単球（RC２ａ）及びＴリンパ球（Jurkat and CEM）細胞系を10％胎児ウシ血清を有するRPMI1640内で培養し、増殖期において収集し、リン酸緩衝塩類溶液(PBS)，pH7.2で１回洗浄し、等張グルコース−HEPES緩衝液( 2.4％グルコース、13mM HEPES，68mM NaCl，1.3mM KCl，４mM Na₂HPO₄及び0.7mM KH₂PO₄，pH7.2)中に再懸濁（10⁷細胞／ml）した。10⁶細胞当り１μｇペプチド又は５μｇ蛋白質の濃度において、ペプチドを細胞に添加した。グルコース−HE PES緩衝液中でのVpr蛋白質又はペプチド処理の30分後、Vpr蛋白質及びペプチド処理したCEM細胞を処理後18及び36時間において収集した。収集した細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、0.1％クエン酸ナトリウム、pH7.2中0.1％Tri ton X-100で透過性上昇させた。供給者により本質的に記載されるように、インシテュー細胞死検出キット（Cell Death Detection Kit）、フルオレセイン(Boe hringer Mannhein)を用いるフラグメンテーションされたDNAを“ニック翻訳する ”のにFITC標識dUTPを用いた。ペプチド１及びペプチド３で処理された細胞は、次のようにPIでも染色した。100万のパラホルムアルデヒドで固定され、ニック翻訳された細胞をPBS中で２回洗浄し、４mMクエン酸ナトリウム、pH7.2中に15mg のPEG6000，25μｇのPI，９単位のRNase A，0.1％Triton X-100を含む500μｌのプロピジウムイオジド（PI）染色溶液で処理した。37℃での20分間のインキュベーションの後15mgのPEG6000，25μｇのPI及び0.1％Triton X-100を含む160mM Na Cl溶液500μｌを添加した。その後、細胞を暗所で４℃で一晩インキュベートし、その後、FITC標識及びPI染色についてCoulter EPICS Eliteフローサイトメーターにおいて10⁶細胞をアッセイした。凝集体及び破片の寄与を除去するようにヒストグラムをゲートした。これらの細胞の特定のdUTP組み込み、PI蛍光並びに前方及び右方角光散乱を測定した。ペプチド１及びペプチド３で処理された細胞のDNA含量（PI染色）をMac Cycle（Phoenix Flow System，California）を用いて分析した。DNAフラグメンテーション及びDNA含量の速度分析を、高い蛍光についてゲートされた細胞について行った。ペプチド３−誘導細胞損傷により、VprがDNAフラグメンテーションによるアポプトシスの原因となる可能性を検査することを我々は思いついた、アポプトシスの一般の診断測定は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Gorczy ka et al ，1992）の存在中のDNA中の１本鎖ニックにおけるdUTPの組み込みである。この技術を用いて、図23Ａに示すように全長のGST-Vprで、又はペプチド３及び６で18時間処理された細胞において増加した右角（90％）右方散乱及びdU TPの増加した組み込みがあったが、端を切りとったGST−Vpr又はペプチド１で処理された細胞（図23Ｂ）においてはないことを我々は見い出した。これは、DNA フラグメンテーションがH(F／S)RIG繰り返しモチーフを含む細胞外蛋白質又はペプチドで処理された細胞においておこることを証明する。Vprで、及びH(F／S)RI G繰り返しモチーフを含むペプチドで外部的に処理された細胞において、（図23 Ｃ及びＤに示されるような）細胞周期の広範囲にわたる停止があることを我々は見い出した。実施例９ VprのＣ末端領域と関連した膜活性大腸菌における可溶性Vpr蛋白質の十分な量の製造が困難であったので、我々はほとんどの研究を合成ペプチドで行った。ペプチド３は細胞の迅速な浸透性上昇を引きおこすことにおいて、GST-Vprより有効であったので、Vpr誘導膜孔が膜一体性及び膜を横切るイオンコンダクタンスに影響を及ぼすか否かを研究するのにペプチド３を用いた。膜のポテンシャル（Cohen and Salzberg，1978）を測定するために、細胞膜の液体区画中に溶解し、膜を横切ってポテンシャル勾配に依存して蛍光を発する染料、DiS−Ｃ₃−（５）を用いた。DiS−Ｃ₃−（５）（３，３′−ジプロピルチオジカルボシアニン）染料（Molecular Probes，Eugene，Oregon）を50μＭの濃度の緩衝液中に室温で15分間封入することによりCEM細胞(PBS中10⁶細胞／ml)内に予備充填した。ペプチド１〜３を添加（１μｇ／100μｌ細胞）し、（633nm超で測定された）DiS−Ｃ₃− （５）蛍光の励起について633nmにおける照度をフローサイトメトリーにより0.5 及び30分間後に染料蛍光測定した。DiS−Ｃ₃−（５）からの増加した蛍光シグナルは、増加した膜ポテンシャルを示す。DiS−Ｃ₃−（５）染料で処理された細胞へのペプチド３の添加は、（図23Ｄに示すように）５分後に膜ポテンシャルの重大な増加を、30分後に劇的な増加を引きおこした。Ｎ末端HFRIGCRHSTIG配列を欠くペプチド１は、この効果を示さなかった。我々は、Vpr蛋白質又はＣ末端ペプチドのヒトCD⁴⁺細胞への細胞外添加がプロピジウムイオジド（PI）取り込みにより測定されるような脱透過性上昇を引きおこすことも証明している。PI取り込みは進行的であり、図24に示すようにH(F／S)RIGアミノ酸繰り返しモチーフの存在に依存した。実施例20 Vprの細胞外Ｃ末端ペプチドは、ヒトCD⁴⁺細胞に浸透することができ、粒状体内に局在化し、細胞損傷も誘導する。次に我々は、細胞外培地中に存在する合成ペプチドの取り込み及び局在化を検査した。FITC標識ペプチドでの処理後３時間のCD⁴⁺細胞のフローサイトメトリー分析は、培地からの取り込みを示すペプチド２及び３でインキュベートされた細胞に関連する増加した蛍光があることを示した。可視光及び蛍光下においてOlym pus BH２−RFCA蛍光顕微鏡で顕微鏡検査を行った（励起キューブ／フィルターＧ）。FITC標識ペプチドで処理された細胞の顕微鏡検査は、ペプチド３と対比して、30分後にペプチド１を取り込んだ細胞がほとんどないことを示した。より高い倍率は、５分後にペプチド３で処理された細胞の表面上を染色する蛍光物質があり、30分後に細胞内染色が非常に濃くなり明るく濃厚なパッチが見られ得ることを示した。FITC標識ペプチド３は３時間以内に明るく蛍光を発する粒状体内に局在化し、ペプチド３処理した細胞をDNA染色（DAPI）させた時極めて類似した染色パターンも見られた。細胞をFITC標識ペプチドで処理し、30分間、１％ホルモル塩溶液で固定し、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール (DAPI)(Sigma Chemicals)（１μｇ／10⁶細胞）で10分間染色した。この処理した細胞をUV光下での顕微鏡検査の前にPBSで１回洗浄した。我々は、FITC標識されたペプチド３で処理され、DAPIで染色されたイースト細胞において、同様のペプチド局在化がおこることも見つけた。図25Ａ及びＢに示される未処理の細胞、並びにペプチド１で処理された細胞（図25Ｃ及びＤ）と対照的に、ペプチド３で処理さた細胞は、（減少した細胞サイズを示す）前方光散乱の削減及び（増加した粒状性を示す）光の増加した右角（90°）散乱を示し、これは、これらの細胞が構造的に損傷したことを示す（図25Ｅ及びＦ）。細胞内膜小胞を横切るCa²⁺の動きに作用する細胞内Ca²⁺チャンネルブロッカーTMB８は、細胞がTMB−８で予備インキュベートされTMB８が培地中に維持されたなら、ペプチド３により引きおこされるCD⁴⁺細胞への損傷を削減する（図25Ｇ及びＨ）。しかしながら、TMB８はペプチド３により引きおこされる膜ポテンシャルの増加を阻害しなかった。 HIV−１生活環におけるVprの役割は何か、及びこれに関連する増殖停止に何が誘導されるのか。時にHIV−１及び他のレトロウィルスの間の区別に関するジレンマがある；レトロウィルスは感染のために細胞増殖を必要とし、一方、HIV− １は最終的に分化したマクロファージのような非増殖の細胞に感染する。Leuis et al ，(1993)はCD⁴⁺細胞系がＧ２増殖期において停止している時、HIV−１に生産的に感染され得ることを示した。従って宿主細胞の非増殖は、全て又はいくつかの細胞型の生産的感染に最初に必要とされ得るであろう。【図１】【図２】【図３】【図４】【図５】【図６】【図７】【図８】【図９】【図１０】【図１１】【図１２】【図１３】【図１４】【図１５】【図１６】【図１７】【図１８】【図１９】【図２０】【図２１】【図２２】【図２３】【図２３】【図２４】【図２５】 [Procedure of Amendment] Patent Law Article 184-8 [Date of submission] March 15, 1996 [Content of amendment] Outline of the Invention According to one aspect, the present invention is a method for treating HIV infection. , An antagonist of a Vpr protein containing at least one motif selected from HFRIG and HSRIG, or an effective amount of a biologically active fragment or analog of the Vpr protein is administered to a patient in need of such treatment. Provided is a method characterized by preventing HIV infection, preventing progression of HIV infection to symptomatic AIDS, or alleviating symptoms of AIDS. Preferably, the Vpr protein comprises at least one sequence selected from the group consisting of HSRIG, HFRIG, HSRIS, HFRAG, HIRAG, HLRAG, RSRKG, RSRIS and RSRIG. In a second aspect, the invention provides the ability to inhibit one or more activities mediated by Vpr selected from the group consisting of growth inhibition, cell replication inhibition, cytotoxicity, cytoskeletal disruption, and endoplasmic reticulum effects. An antagonist of a Vpr protein as defined above, or of a biologically active fragment or analog of a Vpr protein is provided. It is believed that such antagonists would be useful as therapeutic agents for the treatment of HIV infection. The present invention also includes a pharmaceutical composition comprising an antagonist of Vpr as defined above as the active component together with a pharmaceutically acceptable carrier. A specific antibody, preferably a monoclonal antibody, against Vpr or a biologically active fragment or analog of Vpr protein, and an antisense RNA or triple that prevents the expression of Vpr or of said biologically active fragment or analog One of skill in the art will recognize that the strand DNA provides a method of inhibiting the activity of Vpr and, as a result, is within the scope of the invention. Methods for producing monoclonal antibodies against a given peptide sequence, as well as methods for inducing antisense RNA or triple stranded DNA production in target cells, are known in the art. For example, the vpr gene in which the region encoding the C-terminal portion of the Vpr protein is replaced by an inhibitory antisense sequence or a sequence encoding an inhibitory peptide can be used for gene therapy of HIV infection or AIDS. You can do it. In a third aspect, the invention provides a method of screening compounds suspected of being useful as antagonists of a Vpr protein as defined above, or a biologically active fragment or analog thereof. Inhibits the activity of Vpr in an assay for biological activity selected from the group consisting of growth inhibition, cell replication inhibition, cytotoxicity, cytoskeletal disruption, and endoplasmic reticulum effects as described herein. Providing a method of measuring the efficacy of a test compound in Our results indicate that the Vpr protein or a biologically active fragment or analog thereof has an activity that can be attacked either at the intracellular or extracellular level and therefore both types of biological Activity is within the scope of the invention. According to a fourth aspect, the invention relates to a vaccine for preventing HIV infection or for alleviating the effects of HIV infection, which comprises at least the C-terminal 21 of the Vpr sequence together with a pharmaceutically acceptable carrier. A vaccine comprising human immunodeficiency virus-1 or human immunodeficiency virus-2 in which a part of the HIV genome encoding amino acids has been deleted. Preferably, the part of the genome coding for at least the C-terminal 33 amino acids of the Vpr sequence is deleted. More preferably, both the genomic part encoding the C-terminal region of the Vpr sequence and the part of the HIV genome encoding the N-terminal of the Nef gene are deleted. The relevant portion of the Nef gene is described in our co-pending patent application No. PCT / AU94 / 00254 (WO94 / 26776), filed Mar. 18, 1994. Claims 1. An antagonist of a human immunodeficiency virus (HIV) Vpr protein, or a biologically active fragment or analog of a Vpr protein, comprising at least one amino acid sequence motif selected from HFRIG and HSRIG, wherein the antagonist is An antagonist characterized by the ability to inhibit one or more activities mediated by Vpr selected from the group consisting of: growth arrest, cell replication arrest, cytotoxicity, cytoskeletal disruption, and effects on the endoplasmic reticulum. 2. The antagonist according to claim 1, wherein the Vpr protein further comprises at least one sequence selected from the group consisting of HSRIS, HFRAG, HIRAG, HLRAG, RSRKG, RSRIS and RSRIG. 3. 3. The antagonist according to claim 1 or 2, wherein the Vpr protein is a fragment containing at least the C-terminal 21 amino acids of the Vpr sequence. 4. 4. The method according to claim 3, wherein the Vpr protein is a fragment containing at least the C-terminal 33 amino acids of the Vpr sequence. 5. The antagonist according to any one of claims 1 to 4, which is selected from the group consisting of an antibody, antisense RNA, and triple-stranded DNA. 6. The antagonist according to claim 5, which is an antibody. 7. The antagonist according to claim 6, which is a monoclonal antibody. 8. The antagonist according to claim 5, which is an antisense RNA. 9. The antagonist according to claim 5, which is a triple-stranded DNA. Ten. A pharmaceutical composition comprising an antagonist according to any one of claims 1 to 9 as an active constituent together with a pharmaceutically acceptable carrier. 11. A method for screening a compound that is expected to serve as an antagonist of Vpr protein, or a biologically active fragment or analog of Vpr protein, which comprises growth arrest, cell replication arrest, cytotoxicity, cytoskeletal disruption, and small Measuring the effectiveness of a test compound in inhibiting the activity of Vpr in an assay for biological activity selected from the group consisting of effects on the endoplasmic reticulum. 12． A vaccine for the prevention of HIV infection or for alleviation of the effects of HIV infection, provided that the vaccine does not include human immunodeficiency virus with a null mutation in the Nef gene. A vaccine comprising human immunodeficiency virus-1 or human immunodeficiency virus-2 in which a part of the HIV genome encoding the terminal 21 amino acids has been deleted, together with a pharmaceutically acceptable carrier. 13. 13. Vaccine according to claim 12, characterized in that the part of the genome coding for at least the C-terminal 33 amino acids of the Vpr sequence has been deleted. 14. 14. The vaccine according to claim 12, wherein both the part of the genome encoding the C-terminal region of the Vpr sequence and the part of the HIV genome encoding the N-terminal of the Nef gene are deleted. 15. A vpr gene characterized in that the region encoding the C-terminal portion of the Vpr protein is replaced by an inhibitory antisense sequence or a sequence encoding an inhibitory peptide. 16． A method of treatment of HIV infection, wherein an effective amount of an antagonist of the Vpr protein, or a biologically active fragment or analog of the Vpr protein according to any one of claims 1 to 9 is provided in said treatment. Administering to a patient in need thereof, thereby preventing HIV infection, preventing progression of HIV infection to symptomatic AIDS, or alleviating symptoms of AIDS. 17． A method for the treatment of diseases mediated by cell proliferation, which comprises the effective treatment of a Vpr protein containing at least one amino acid sequence motif selected from HFRIG and HSRIG, or a biologically active fragment or analogue thereof. Administering the amount to a mammal in need of said treatment, thereby inhibiting the growth of cells which mediate said disease. 18. 18. The method of claim 17, wherein the disease mediated by cell proliferation is cancer, leukemia, or psoriasis. 19. The method according to claim 17 or 18, wherein the Vpr protein or fragment or analog thereof is used in combination with an enhancer of Ca ²⁺ channel transport. 20. A method of treating a disease caused by a pathogen, which comprises the step of administering an effective amount of a Vpr protein containing at least one amino acid sequence motif selected from HFRIG and HSRIG or a biologically active fragment or analog thereof. A method comprising the step of administering to a mammal in need thereof. twenty one. 21. Method according to claim 20, characterized in that the disease is caused by bacteria, parasites, yeasts or fungi. twenty two. An agent for the transport of a pharmaceutically active substance to the cell membrane or to the inside of a cell, said agent comprising a Vpr peptide or a biology comprising at least one amino acid sequence motif selected from HFRIG and HSRIG. A therapeutically active fragment or an analog thereof, wherein the Vpr peptide, fragment or analog is linked to the pharmaceutically active substance. twenty three. 23. A method of transporting a pharmaceutically active substance to the cell membrane or into the interior of a cell, comprising the step of contacting the cell with the agent of claim 22. twenty four. Use of a Vpr protein comprising at least one amino acid sequence motif selected from HFRIG and HSRIG, or a biologically active fragment or analog thereof in the treatment of diseases mediated by cell proliferation. twenty five. Use of a Vpr protein comprising at least one amino acid sequence motif selected from HFRIG and HSRIG, or a biologically active fragment or an analogue thereof, in the treatment of a disease caused by a pathogen. 26. Human immunity containing at least one amino acid sequence motif selected from the group consisting of HCKKG, CLGEG, CLGEE, CLGGE, CLGRG, HVRKG, HYTKG, HFKRG, HFKKG, HAK RD, CLQEG, CLGGG, CRGEG, CWGED, HFRCG and RRQPF. An antagonist of the Vpx protein of deficiency virus-2 (HIV-2), or a biologically active fragment or analog of the Vpx protein, wherein the antagonist is mass arrest, cell replication arrest, cytotoxicity, cytoskeletal disruption and An antagonist characterized in that it has the ability to inhibit one or more activities mediated by Vp x selected from the group consisting of effects on the endoplasmic reticulum. [Procedure Amendment] Patent Law Article 184-8 [Date of submission] July 24, 1996 [Amendment content] Description Fig. 15 shows propidium io after incubation of yeast cells with peptide 3 at various times. The result of the flow cytometric analysis of zido incorporation is shown. FIG. 16 shows the results of flow cytometric analysis of propidium iodide uptake in RC2a cells electroporated with synthetic Vpr protein. Figure 17 shows the results obtained when mammalian cells were electroporated and analyzed by flow cytometry for changes in cell structure measured by front and side scatter. FIG. 18 shows protection of yeast cells by TMB-8. FIG. 19 shows the association of FITC (fluorescein isothiocyanate) labeled peptides with CD ⁴⁺ human cells measured by flow cytometry after (A) electroporation and (B) extracellular addition without electroporation. . FIG. 20 shows the S. cerevisiae as measured by flow cytometry . Shows the association of FITC- labeled peptide without electroporation in cerevisiae (S.cerevi siae) yeast cells. Figure 21 shows internalized FITC-labeled peptide 3 in human ^{CD4 +} cells (A) and (B) yeast cells. FIG. 22 shows the genetic interaction between Vpr and Sac1p and actin. FIG. 23 shows that Vpr protein and synthetic peptide containing H (S / F) RIG repeat motif are responsible for DNA fragmentation and cell cycle in mammalian cells. Figure 24 shows that extracellular Vpr proteins and peptides containing the H (S / F) RIG repeat motif are responsible for increased membrane permeability in human ^{CD4 +} cells. FIG. 25 shows penetration of extracellular C-terminal peptide of Vpr into human CD ⁴⁺ cells and induction of cell damage. Yeast and Bacteria Yeast strains used in this study are Saccharomyces serevisiae strain DY150 (MATa ura 3-52. Leu 2-3, 112 Trp 1-1 a de 2-1 his 3-11 can 1- 100), Candida albicans clinical isolate JRW5, Candida glabrata strain L5 ( Leu ), Kluyveromyces lactis strain MW-98-8c ( α ura A) arg lys ) and Schizosaccharomyces pombe strain SpULA ( ade6-704 ura4-D18 leu1-32 ) h ⁻ . Strains were grown in YEPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose). E. coli strain TG1 Δ ( lac-proAB ) sup Ethi hsd Δ5 F ′ ( tra D36 proAB ⁺ lacI ^q lacZ ΔM15 ) was also used for toxicity studies, using ZxYT medium (1.6% tryptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl). Plated on top. The production of Vpr in yeast will likely cause similar effects to the Sac1 mutant due to the sequence and functional similarities between Sac1p and Vpr; the production of Vpr may antagonize normal Sac1p function, It leads to a lack of cytoskeleton including large cell size and eventual growth arrest. Indeed, in many studies of yeast lacking a cytoskeleton, mother cells are unusually large and daughter cells are unusually small (see, eg, Liu and Brets cher, 1992). We find that time course analysis of newly induced cells producing Vpr shows the same phenomenon. Osmotic sensitivity also showed a possible cytoskeleton deficiency induced by Vpr. Large Vpr-producing cells were isolated by flow cytometry and plated on medium containing high osmolarity and normal medium. Only 50% of the cells able to grow on normal medium were able to grow on high osmolarity medium, indicating a structural lack in these cells. Vpr appears to cause cytoskeleton deficiency in mammalian and yeast cells. Studies with Levy5 show that Vpr causes cell replication arrest and large cell size in rhabdomyosarcoma cell lines (Levy et al, 1993). Furthermore, CD ^4-T - in lymphoblastic (T-lymphoblastoid) cell lines, superstructure including HIV-1 is the first time the infection, membrane disruption, vacuolization "ballooning (ballooning)" and endoplasmic reticulum It has been shown to cause changes (Fermin and Garry, 1992). These data are consistent with the lack of cytoskeleton, and the study of cytoskeleton in these cells would be of interest. Example 18 Extracellular Vpr and peptides containing H (F / S) repeat motifs cause DNA fragmentation and cell cycle arrest in mammalian cells. Human CD4 ⁺ promonocyte (RC2a) and T lymphocyte (Jurkat and CEM) cell lines were cultured in RPMI1640 with 10% fetal bovine serum, collected in the growth phase, phosphate buffered saline (PBS), Wash once with pH 7.2 and in isotonic glucose-HEPES buffer (2.4% glucose, 13 mM HEPES, 68 mM NaCl, 1.3 mM KCl, 4 mM Na ₂ HPO ₄ and 0.7 mM KH ₂ PO ₄ , pH 7.2). The cells were resuspended (10 ⁷ cells / ml). Peptides were added to cells at a concentration of 1 μg peptide or 5 μg protein per 10 ⁶ cells. After 30 minutes of Vpr protein or peptide treatment in glucose-HE PES buffer, Vpr protein and peptide treated CEM cells were harvested at 18 and 36 hours post treatment. Harvested cells were fixed in 4% paraformaldehyde and permeabilized with 0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate, pH 7.2. The FITC-labeled dUTP was used to "nick-translate" the fragmented DNA using the in situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Boe hringer Mannhein), essentially as described by the supplier. . Cells treated with peptide 1 and peptide 3 were also stained with PI as follows. Nick-translated cells fixed with 1 million paraformaldehyde were washed twice in PBS and 15 mg PEG6000, 25 μg PI, 9 units RNase A, 0.1% Triton in 4 mM sodium citrate, pH 7.2. It was treated with 500 μl of propidium iodide (PI) staining solution containing X-100. After 20 minutes of incubation at 37 ° C., 500 μl of 160 mM NaCl solution containing 15 mg PEG6000, 25 μg PI and 0.1% Triton X-100 was added. The cells were then incubated overnight at 4 ° C. in the dark, after which 10 ⁶ cells were assayed on a Coulter EPICS Elite flow cytometer for FITC labeling and PI staining. Histograms were gated to remove aggregate and debris contributions. Specific dUTP incorporation, PI fluorescence and forward and right angle light scatter of these cells were measured. The DNA content (PI staining) of cells treated with peptide 1 and peptide 3 was analyzed using Mac Cycle (Phoenix Flow System, California). DNA fragmentation and kinetic analysis of DNA content was performed on cells gated for high fluorescence. We came up with the possibility that peptide 3-induced cell damage could cause Vpr to cause apoptosis due to DNA fragmentation, a common diagnostic measure of apoptosis is terminal deoxynucleotidyl transferase (Gorczy ka et al , 1992). ) Is the incorporation of dUTP at a single-stranded nick in the presence of DNA. Using this technique, increased right-angle (90%) right scatter and increased incorporation of dUTP in cells treated with full-length GST-Vpr as shown in Figure 23A, or with peptides 3 and 6 for 18 hours. We found, but not in cells treated with truncated GST-Vpr or peptide 1 (FIG. 23B). This demonstrates that DNA fragmentation occurs in cells treated with extracellular proteins or peptides containing the H (F / S) RIG repeat motif. We find that there is extensive arrest of the cell cycle (as shown in FIGS. 23C and D) in cells externally treated with Vpr and with peptides containing the H (F / S) RI G repeat motif. Found out. Example 9 Membrane-Activity Associated with the C-Terminal Region of Vpr Due to the difficulty of producing sufficient amounts of soluble Vpr protein in E. coli, we have done most of our work with synthetic peptides. Since Peptide 3 was more effective than GST-Vpr in causing a rapid increase in cell permeability, we investigated whether Vpr-induced membrane pores affect membrane integrity and transmembrane ionic conductance. Peptide 3 was used for. Use (5) - To determine the potential of the membrane (Cohen and Salzberg, 1978), dissolved in the liquid compartment of a cell membrane, a dye that fluoresces in dependence on the potential gradient across the membrane, DiS-C ₃ I was there. DiS-C _3- (5) (3,3′-dipropylthiodicarbocyanine) dye (Molecular Probes, Eugene, Oregon) was encapsulated in a buffer having a concentration of 50 μM for 15 minutes at room temperature to obtain CEM cells ( Pre-filled in 10 ⁶ cells / ml in PBS). Peptides 1 to 3 were added (1 μg / 100 μl cells) and DiS-C ₃ − (5) fluorescence excitation (measured above 633 nm) fluorescence intensity was measured at 633 nm by flow cytometry for 0.5 and 30 minutes after dye fluorescence measurement. did. DiS-C ₃ - increased fluorescent signal from (5) shows the increased membrane potential. DiS-C ₃ - Addition of (5) Peptide 3 to dye treated cells (as shown in FIG. 23D) significant increase in 5 minutes after the membrane potential, draw a dramatic increase after 30 minutes Raised. Peptide 1 lacking the N-terminal HFRIGCRHSTIG sequence did not show this effect. We have also demonstrated that extracellular addition of Vpr protein or C-terminal peptide to human ^{CD4 +} cells causes increased de-permeability as measured by propidium iodide (PI) uptake. PI uptake was progressive and depended on the presence of the H (F / S) RIG amino acid repeat motif as shown in FIG. Example 20 The extracellular C-terminal peptide of Vpr is able to penetrate human ^{CD4 +} cells , localize within the granule and also induce cell damage. We next examined the uptake and localization of synthetic peptides present in extracellular medium. Flow cytometric analysis of CD ⁴⁺ cells 3 hours after treatment with FITC-labeled peptide showed that there was increased fluorescence associated with cells incubated with peptides 2 and 3 indicating uptake from the medium. Microscopy was performed with an Olympus BH2-RFCA fluorescence microscope under visible light and fluorescence (excitation cube / filter G). Microscopic examination of cells treated with FITC-labeled peptide showed that few cells incorporated peptide 1 after 30 minutes compared to peptide 3. Higher magnification indicated that after 5 minutes there was a fluorophore that stained on the surface of the peptide 3 treated cells and after 30 minutes the intracellular staining was very dark and bright patches could be seen. The FITC-labeled peptide 3 was localized within the granular body which fluoresces brightly within 3 hours, and when the cells treated with peptide 3 were subjected to DNA staining (DAPI), a very similar staining pattern was also observed. Cells were treated with FITC-labeled peptide, fixed with 1% formol salt solution for 30 minutes and stained with 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Sigma Chemicals) (1 μg / 10 ⁶ cells) for 10 minutes. . The treated cells were washed once with PBS before microscopic examination under UV light. We also found similar peptide localization in yeast cells treated with FITC-labeled peptide 3 and stained with DAPI. In contrast to the untreated cells shown in Figures 25A and B, and the cells treated with Peptide 1 (Figures 25C and D), cells treated with Peptide 3 showed forward light (indicating reduced cell size). A reduction in scatter and an increased right-angle (90 °) scatter of light (indicating increased graininess) are shown, indicating that these cells were structurally damaged (FIGS. 25E and F). The intracellular Ca ²⁺ channel blocker TMB8, which acts on Ca ²⁺ movement across intracellular membrane vesicles, is caused by peptide 3 if cells are preincubated with TMB-8 and TMB8 is maintained in culture. Reduces damage to CD ⁴⁺ cells (FIGS. 25G and H). However, TMB8 did not inhibit the increase in membrane potential caused by peptide 3. What is the role of Vpr in the HIV-1 life cycle and what is associated with its associated growth arrest? Sometimes there is a dilemma on the distinction between HIV-1 and other retroviruses; retroviruses require cell proliferation for infection, while HIV-1 ultimately defers non-proliferating cells such as differentiated macrophages. Get infected with. Leuis et al , (1993) showed that the CD4 ⁺ cell line can be productively infected with HIV-1 when arrested in the G2 growth phase. Thus, non-proliferation of host cells could initially be required for productive infection of all or some cell types. FIG. [Fig. 2] [Figure 3] FIG. 4 [Figure 5] FIG. 6 FIG. 7 [Figure 8] [Figure 9] [Figure 10] FIG. 11 FIG. FIG. 13 FIG. 14 FIG. FIG. 16 FIG. FIG. FIG. FIG. FIG. 21 FIG. FIG. 23 FIG. 23 FIG. 24 FIG. 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 ＡＤＺ 9051−4ＣＡ６１Ｋ 48/00 ＡＤＹ 48/00 ＡＤＹ 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 ＢＣ０７Ｈ 21/04 9356−4ＨＣ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 9356−4Ｈ 7/08 7/08 9356−4Ｈ 14/155 14/155 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 9358−4Ｂ 21/08 21/08 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者マクレディ．イアンジー. オーストラリア国，ビクトリア 3052，パークビル，ロイヤルパレード 343，バイオモレキュラーリサーチインスティテュートリミティド (72)発明者アルナギリ，チンニアーオーストラリア国，ビクトリア 3052，パークビル，ロイヤルパレード 343，バイオモレキュラーリサーチインスティテュートリミティド─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Internal reference number FI A61K 39/395 ADZ 9051-4C A61K 48/00 ADY 48/00 ADY 8615-4C C07H 21/04 B C07H 21 / 04 9356-4H C07K 7/06 C07K 7/06 9356-4H 7/08 7/08 9356-4H 14/155 14/155 9637-4B C12P 21/02 C C12P 21/02 9358-4B 21/08 21 / 08 7823-4B C12Q 1/02 C12Q 1/02 9051-4C A61K 37/02 ABD // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:92) (C12P 21/02 C12R 1: 865) (81) Designated country EP ( AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, R, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AU, CA, JP, US (72) inventor McCready. Ian G. Australia, Victoria 3052, Parkville, Royal Parade 343, Bio-Molecular Research Institute Limited (72) Inventor Arnagiri, Chinnia Australia, Victoria 3052, Parkville, Royal Parade 343, Bio-Molecular Research Institute Limited

Claims

[Claims] 1. An antagonist of a human immunodeficiency virus (HIV) Vpr protein containing at least one amino acid sequence motif selected from HFRIG and HSRIG, or a biologically active fragment or an analogue thereof, wherein the antagonist is a proliferation An antagonist characterized in that it has the ability to inhibit one or more activities mediated by Vpr selected from the group consisting of arrest, cell replication arrest, cytotoxicity, cytoskeletal disruption, and effects on the endoplasmic reticulum. 2. The antagonist according to claim 1, wherein the Vpr protein further comprises at least one sequence selected from the group consisting of HSRIS, HFRAG, HIRAG, HLRAG, RSRKG, RSRIS and RSRIG. 3. 3. The antagonist according to claim 1 or 2, wherein the Vpr protein is a fragment containing at least the C-terminal 21 amino acids of the Vpr sequence. 4. 4. The method according to claim 3, wherein the Vpr protein is a fragment containing at least the C-terminal 33 amino acids of the Vpr sequence. 5. The antagonist according to any one of claims 1 to 4, which is selected from the group consisting of an antibody, antisense RNA, and triple-stranded DNA. 6. The antagonist according to claim 5, which is an antibody. 7. The antagonist according to claim 6, which is a monoclonal antibody. 8. The antagonist according to claim 5, which is an antisense RNA. 9. The antagonist according to claim 5, which is a triple-stranded DNA. Ten. A pharmaceutical composition comprising an antagonist according to any one of claims 1 to 9 as an active constituent together with a pharmaceutically acceptable carrier. 11. A method of screening for compounds that are expected to serve as antagonists of the Vpr protein, or biologically active fragments or analogs thereof, for growth arrest, cell replication arrest, cytotoxicity, cytoskeletal disruption, and endoplasmic reticulum. A method comprising the step of measuring the effectiveness of a test compound in inhibiting the activity of Vpr in an assay for biological activity selected from the group consisting of effects. 12． A vaccine for preventing HIV infection or for alleviating the effects of HIV infection, wherein human immunodeficiency virus-1 in which a part of the HIV genome encoding at least the C-terminal 21 amino acids of the Vpr sequence has been deleted Alternatively, a vaccine comprising human immunodeficiency virus-2 together with a pharmaceutically acceptable carrier. 13. 13. Vaccine according to claim 12, characterized in that the part of the genome coding for at least the C-terminal 33 amino acids of the Vpr sequence has been deleted. 14. 14. The vaccine according to claim 12, wherein both the part of the genome encoding the C-terminal region of the Vpr sequence and the part of the HIV genome encoding the N-terminal of the Nef gene are deleted. 15. A vpr gene characterized in that the region encoding the C-terminal portion of the Vpr protein is replaced by an inhibitory antisense sequence or a sequence encoding an inhibitory peptide. 16． A method for the treatment of HIV infection, wherein an effective amount of an antagonist of the Vpr protein or a biologically active fragment or analogue thereof according to any one of claims 1 to 9 is required for said treatment. Administering to a patient, thereby preventing HIV infection, preventing the progression of HIV infection to symptomatic AIDS, or alleviating the symptoms of AIDS. 17． A method of treatment of a disease mediated by cell proliferation, which comprises the effective treatment of a Vpr protein containing at least one amino acid sequence motif selected from HFRIG and HSRIG, or a biologically active fragment or analog thereof. Administering the amount to a mammal in need of said treatment, thereby inhibiting the growth of cells which mediate said disease. 18. 18. The method of claim 17, wherein the disease mediated by cell proliferation is cancer, leukemia, or psoriasis. 19. The method according to claim 17 or 18, wherein the Vpr protein or fragment or analog thereof is used in combination with an enhancer of Ca ²⁺ channel transport. 20. A method of treating a disease caused by a pathogen, which comprises the step of administering an effective amount of a Vpr protein containing at least one amino acid sequence motif selected from HFRIG and HSRIG or a biologically active fragment or analog thereof. A method comprising the step of administering to a mammal in need thereof. twenty one. 21. Method according to claim 20, characterized in that the disease is caused by bacteria, parasites, yeasts or fungi. twenty two. An agent for the transport of a pharmaceutically active substance to the cell membrane or to the inside of a cell, said agent comprising a Vpr peptide or a biology comprising at least one amino acid sequence motif selected from HFRIG and HSRIG. A therapeutically active fragment or an analog thereof, wherein the Vpr peptide, fragment or analog is linked to the pharmaceutically active substance. twenty three. 24. A method of transporting a pharmaceutically active substance to the cell membrane or into the interior of a cell, comprising the step of contacting the cell with the agent of claim 23. twenty four. Use of a Vpr protein comprising at least one amino acid sequence motif selected from HFRIG and HSRIG, or a biologically active fragment or analog thereof in the treatment of diseases mediated by cell proliferation. twenty five. Use of a Vpr protein comprising at least one amino acid sequence motif selected from HFRIG and HSRIG, or a biologically active fragment or an analogue thereof, in the treatment of a disease caused by a pathogen. 26. Human immunity containing at least one amino acid sequence motif selected from the group consisting of HCKKG, CLGEG, CLGEE, CLGGE, CLGRG, HVRKG, HYTKG, HFKRG, HFKKG, HAK RD, CLQEG, CLGGG, CRGEG, CWGED, HFRCG and RRQPF. Defective virus-2 (HIV-2) Vpx protein, or an antagonist of a biologically active fragment or an analog thereof, wherein said antagonist is mass arrest, cell replication arrest, cytotoxicity, cytoskeletal disruption and endoplasmic reticulum An antagonist characterized by having the ability to inhibit one or more activities mediated by Vpx selected from the group consisting of: