JPH09510088A

JPH09510088A - 最終補体インヒビター融合遺伝子およびタンパク質

Info

Publication number: JPH09510088A
Application number: JP7523093A
Authority: JP
Inventors: ロザー、ラッセル・ピー; ローリンズ、スコット; スクウィント、ステファン・ピー
Original assignee: アレクション・ファーマシューティカル・インク
Priority date: 1994-03-03
Filing date: 1995-03-01
Publication date: 1997-10-14
Also published as: AU683158B2; AU1985895A; CA2184356A1; DE69531607D1; DE69531607T2; EP0750458B1; ES2204944T3; US5847082A; EP0750458A1; EP0750458A4; WO1995023512A1

Abstract

(57)【要約】ＣＤ５９のような親最終補体インヒビタータンパクの機能的部分および非相同膜貫通ドメインを含むキメラタンパクをコードする核酸分子を提供する。親最終補体インヒビタータンパクは、そのＧＰＩシグナル配列を不活性化するように改変されている。非相同膜貫通ドメインは、最終補体インヒビターの補体阻害活性に実質的に干渉することなく細胞表面にキメラタンパクをつなぐのに役立つ。これらの核酸配列およびコードされるキメラタンパクは、細胞を補体侵襲から保護するために用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】最終補体インヒビター融合遺伝子およびタンパク質発明の分野本発明は、細胞表面への付着を変えるように遺伝子工学的に処理された最終補体インヒビタータンパク質（terminal complement inhibitory proteins）およびそのような新規な分子の医学的な用途に関する。発明の背景Ｉ．補体系補体系は、体の他の免疫学的系とともに作用して、細胞性およびウイルス性病原因子の侵入に対して防御する。少なくとも２５の補体タンパクがあり、これらは血漿タンパクまたは膜コファクターの複雑な集合物として見出されている。これらの血漿タンパクは、脊椎動物の血清中のグロブリンの約１０％を構成する。補体成分は、その免疫防御機能を、複雑な、しかし正確な一連の酵素的切断および膜結合事象として相互作用することにより達成する。結果として生じる補体カスケードは、オプソニン機能、免疫調節機能および溶解機能を有する生成物の産生をもたらす。補体機能の溶解の側面は、個別には「最終補体成分」として知られ、またはその機能的会合体においては膜侵襲複合体(membrane attack complex)すなわち「ＭＡＣ」として知られる補体タンパクの会合体の直接的作用として、標的細胞膜を浸透性にすることにより行われる（Esser,1991; およびBhakdi，et al.，1991 を参照されたい）。ＭＡＣの作用（以下、「補体侵襲」と呼ぶ）は、標的細胞において浸透圧およびイオンの勾配の破壊をもたらす孔または漏出性の区域を作りだし、これは、十分に高いＭＡＣ濃度では、細胞死を引き起こす。ＭＡＣ濃度が低いと、内皮細胞および血小板の活性化を含む他の効果を生じることができる。不適切なＭＡＣ活性は、細胞および組織に病理学的損傷をもたらし得る。補体カスケードは、古典的経路（主経路）または第二経路（副経路）を通じて進行する。これらの経路は多くの成分を共有し、初期の段階では異なっているが、両者は合流して、補体侵襲と標的細胞の活性化および／または破壊の原因となる同じ最終補体成分を共有する。古典的補体経路は、典型的には、抗体の、標的細胞の抗原性部位の認識およびそれに対する結合により開始される。第二経路は、通常、抗体には依存せず、病原因子表面上のある種の分子により開始され得る。両経路は、補体Ｃ３が（各経路で異なる）活性プロテアーゼにより切断されて、Ｃ３ａおよびＣ３ｂを生じる点で合流する。補体侵襲を活性化する他の経路は、後で、ＭＡＣ形成を含む補体機能の種々の側面を導く一連の事象において作用し得る。Ｃ３ａは、マスト細胞の脱顆粒化を誘導し得るアナフィラトキシンであり、ヒスタミンおよび他の炎症媒介物質の放出をもたらす。Ｃ３ｂは複数の機能を有する。これは、オプソニンとして、細菌、ウイルスおよび他の細胞および粒子に結合し、循環からそれらを除去するための印をつける。また、Ｃ３ｂは、各経路に特有の他の成分と複合体を形成し、古典的または代替的Ｃ５コンベルターゼ（転換酵素）を形成することができる。これは、Ｃ５をＣ５ａ（別のアナフィラトキシンである）とＣ５ｂとに切断する。Ｃ５ｂは、ＭＡＣを構成する最終補体成分の最初のものである（補体侵襲を開始し得るいくつかの手段の中で、プラスミン、エラスターゼおよびカテプシンＧを含む、比較的広い標的タンパク特異性を有するタンパク分解的酵素が、Ｃ５コンベルターゼの作用を真似て活性Ｃ５ｂを生成するようにＣ５を切断することができる）。Ｃ５ｂは、標的細胞の表面で、連続的にＣ６、Ｃ７およびＣ８と結合してＣ５ｂ〜８複合体を形成する。いくつかのＣ９分子が結合すると、活性ＭＡＣ（Ｃ５ｂ〜９）が形成される。II．補体系の調節通常、補体系は、連続的な自発的ターンオーバーの状態にある。Ｃ３は、自発的にＣ３ｂの機能を獲得して、機能的Ｃ３コンベルターゼを形成し、より多くのＣ３ｂの形成を導くことができる。この自発的な方式で生成されたＣ３ｂもまた、Ｃ５コンベルターゼを形成することができ、したがって、ＭＡＣを形成するカスケードにおける最終段階を開始することができる。通常の条件下では、血流が低レベルの自発的に活性化された補体成分を希釈し、拡散させて、脈管構造のいかなる位置においてもＭＡＣの蓄積を防ぐのを助けている。その上、自己免疫侵襲を防ぐための自己補体タンパクの作用の恒常的調節は、ほとんどのヒト細胞の表面に見い出すことができる内在的な特異的補体インヒビタータンパク（ＣＩＰ）によって媒介される。一般的には、血流およびＣＩＰの作用は、損傷または溶解なしの、通常のレベルの自発的補体活性化に対して細胞を抵抗性にするのに十分である。急性炎症の条件下では、そして補体活性化およびＭＡＣ形成が加速される種々の疾患状態においては、内在性補体インヒビターの量および活性は、自己細胞をＭＡＣ誘導性溶解および／または半溶解性ＭＡＣ誘導性細胞活性化から保護するには不適当である可能性がある。内在性ＣＩＰ活性は、うっ血がある場合、および／または天然のインヒビターに欠陥があるか欠乏している場合には、不十分である可能性もある。一致する種からの補体により媒介される損傷から細胞を保護するのに役立つ多くのＣＩＰが同定されている。Zalman，et al.，1986; Schonermark，et al.，1 986; Nose，et al.，1990; およびSugita，et al.，1988を参照されたい。これらのインヒビターは、補体カスケードの種々の決まったポイントで作用する。例えば、崩壊促進因子（ＤＡＦ）としても知られるＣＤ５５は、Ｃ３コンベルターゼの作用に対してその主要な阻害作用を及ぼす。例えばスペクトルの広いプロテアーゼによる活性Ｃ５ｂの生成を通じて、Ｃ３コンベルターゼ段階の後の経路中のポイントで補体カスケードが開始された場合には、カスケード進行のより初期の段階に作用するＤＡＦおよび他の補体インヒビターは有効ではない。しかし、この欠点を共有しないインヒビターが存在する。これらのインヒビターは、ＭＡＣ会合における最終段階で作用し、したがって、ほとんどいかなる手段によって開始された補体侵襲も効果的にブロックすることができる。これらのインヒビターは、「最終補体インヒビター（terminal com plement inhibitors）」または「最終ＣＩＰ」として知られている。III．最終ＣＩＰ最も徹底的に特徴付けされた最終ＣＩＰは、ヒトタンパクＣＤ５９（「プロテクチン」、「ＭＡＣＩＦ」または「ｐ１８」としても知られる）である。ＣＤ５９は、見かけの分子量が１８〜２１kdの糖タンパクであり、補体媒介性溶解から細胞を保護する。ＣＤ５９は、これを細胞膜に固定するグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）糖脂質部分によって、細胞の外側につながれている。ＣＤ５９は、赤血球、リンパ球および血管内皮細胞を含むほとんどのヒト細胞の表面を形成する膜に連結していることが見い出されている（例えば、Si ms，et al.,米国特許第５１３５９１６号を参照されたい）。ＣＤ５９は、Ｃ５ｂ〜８複合体中のＣ８に対する結合に関してＣ９と競合し、それによってＣ５ｂ〜９ＭＡＣの形成を減少させることにより、機能するようである（Rollins，et al.，1990）。したがって、ＣＤ５９は、ＭＡＣによる細胞の刺激および細胞の溶解の両方を減少させるよう作用する（Rollins，et al.，1 990; Rollins，et al.，1991; Stefanova，et al.，1989; Sugita，et al.，198 8; Davies，et al.，1989; Holguin，et al.，1989; Okada，et al.，1989a; Me ri，et al.，1990; Whitlow，et al.，1990; およびHarada，et al.，1990）。ＣＤ５９のこの活性は、ほとんど種選択的であり、Ｃ８およびＣ９が同種の（すなわちヒト）血清に由来する条件下でＭＡＣの形成を最も効率よくブロックする（Venneker，et al.，1992）。非ヒト赤血球（これらは、それ自身の細胞表面補体インヒビタータンパクの作用によって同種の非ヒト補体侵襲から保護されていると信じられている）およびオリゴデンドロサイト（細胞表面タンパクによっては、あるとしても少ししか保護されていないが、脳血液関門により生体内（in v ivo ）で保護されている可能性があると信じられている脳細胞）の原形質膜中への精製ＣＤ５９の同化は、ＣＤ５９がこれらの細胞をヒト補体により媒介される細胞溶解から保護しうることを示した（Rollins，et al.，1990; Rollins，et a l.，1991; Stefanova，et al.，1989; Meri，et al.，1990; Whitlow，et al.,1 990; Okada，et al.，1989b; およびWing，et al.，1992）。ＣＤ５９をコードするｃＤＮＡがクローニングされ、ＣＤ５９遺伝子が特徴づけされた（Davies，et al.，1989; Okada，et al.，1989b; Philbrick，et al. ，1990; Sawada，et al.，1989; およびTone，et al.，1992）。クローニングされたＣＤ５９ｃＤＮＡでトランスフェクトされ、それゆえその表面にヒトＣＤ５９タンパクを発現する非ヒト哺乳動物細胞は、補体媒介性細胞溶解に対して抵抗性を獲得することが示された（Zhao，et al.，1991; およびWalsh，et al .，1991）。ＣＤ５９は、マウスのＬｙ−６抗原と構造的に関連していることが報告された（Philbrick，et al.，1990; およびPetranka，et al.，1992）。これらの抗原（Ｔ細胞活性化タンパクとしても知られる）をコードする遺伝子は、Ｌｙ−６多重遺伝子ファミリーのメンバーであり、Ｌｙ−６Ａ．２、Ｌｙ−６Ｂ．２、Ｌｙ −６Ｃ．１、Ｌｙ−６Ｃ．２およびＬｙ−６Ｅ．１を含む。マウス胸腺細胞Ｂ細胞抗原ＴｈＢをコードする遺伝子も、このファミリーのメンバーである（Shevac h，et al.，1989;およびGumley，et al.，1992）。構造および機能においてＣＤ５９に類似の、多くのウイルスおよび非ヒト霊長類の補体インヒビタータンパクが記載されている（Rother，et al.，1994; Albr echt，et al.，1992; William L．Fodor，Scott Rollins，Russell RotherおよびStephen P．Squintoによる、１９９３年８月１１日出願の、「非ヒト霊長類の補体インヒビタータンパク」なる発明の名称の、本願出願人の譲り受けた別出願である米国特許出願第０８／１０５７３５号）；およびBernhard Fleckenstein およびJens-Christian Albrechtによる、１９９３年１月１２日出願の、「ヘルペスウイルス・サイミリ（Herpesvirus Saimiri）の補体調節タンパク」なる発明の名称の、本願出願人の譲り受けた別出願であるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００６７２号を参照されたい）。これらのタンパク、ＢＡＢＣＩＰ（配列番号１）、ＡＧＭＣＩＰ（配列番号２）、ＳＱＭＣＩＰ（配列番号３）、ＯＷＭＣＩＰ（配列番号４）、ＭＡＲＣＩＰ（配列番号５）およびＨＶＳ−１５（配列番号６）は、すべて、アミノ酸配列中のシステインの区別できる保存された配置を含む、顕著な配列相同性を共有する。これらの保存されたパターンは、図１に示すように、システイン残基を整合させてタンパクの配列を整列させることにより最も容易に認められる。多くのタンパクのシステイン残基は、当業界において「システイン骨格」と呼ばれる構造的要素を形成する。これらを有するタンパクにおいては、システイン骨格は、分子の三次元フォールディング、三次構造および究極的な機能の決定に本質的な役割を果たす。Ｌｙ−６多重遺伝子ファミリーのタンパク、ならびにいくつかの他のタンパクは、本明細書中で「Ｌｙ−６モチーフ」と呼ぶ特定のシステイン骨格構造を共有する。例えば、ヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター（ｕＰＡＲ；Roldan，et al.，1990）および機能の不明なイカのいくつかの糖タンパクの１つ（Ｓｇｐ２；Williams，et al.，1988）は、Ｌｙ− ６モチーフを含む。Ｌｙ−６モチーフを有するタンパク質のサブセットは、システイン残基のすぐ隣に保存されたアミノ酸が存在することによって同定することができる。タンパク質のサブセット中のこのような特異的なアミノ酸の保存は、タンパクのフォールディング、三次構造および究極的機能の特定の側面に関連し得る。これらの保存されたパターンは、システイン残基を整合させるようにタンパクの配列を整列させることによって、最も容易に認められる。上記で参照した別出願である米国特許出願第０８／１０５７３５号（この関連部分は参照により本明細書中に包含されるものとする）において十分に考察されているように、一連の非ヒト霊長類Ｃ５ｂ〜９阻害性タンパクが同定されており、これらは一般的Ｌｙ−６モチーフの特定のサブセットを定義するシステイン骨格構造を特徴とする。具体的には、これらの非ヒト霊長類ＣＩＰは、式：を特徴とするＬｙ−６モチーフを有するシステイン骨格を含むポリペプチドを包含する。さらに、非ヒト霊長類Ｃ５ｂ〜９阻害性タンパクは、以下の式：に従うアミノ酸配列を含む。両方の式において、Ｘ_nにおけるＸは、任意のアミノ酸の組み合わせを含むペプチドを示し、Ｘ_nにおけるｎは、ペプチドのアミノ酸残基の長さを表し、そして任意の位置の各Ｘは、他の任意の位置の同じ長さの他の任意のＸと、同一であっても、異なっていてもよい。上記で参照した本願出願人の譲り受けた別出願であるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００６７２号（この関連部分は参照により本明細書中に包含されるものとする）およびAlbrecht，et al.，1992において十分に考察されているように、Ｃ５ｂ〜９阻害活性を有するHerpesvirus saimiriのタンパクが発見されている（本明細書中で「ＨＶＳ−１５」と呼ぶ）。このウイルスタンパクは、上記で考察した、すなわちその構造を上記式（１）および（２）で示した、非ヒト霊長類Ｃ５ｂ〜９阻害性タンパクに特徴的なＬｙ−６モチーフを有する。以下の考察において、Ｌｙ−６モチーフを含む最終ＣＩＰを、「Ｌｙ−６最終ＣＩＰ」と呼ぶ。これらのＣＩＰは、一般に、上記式（１）を満足し、好ましくは式（２）も満足する。しかし、他の種の未だ特徴づけされていない最終ＣＩＰには、Ｌｙ−６モチーフを構成する１０個のシステインの任意の２個の間の間隔および隣接するアミノ酸に、いくらかの変異が予想される。また、Petranka et al.，1993およびNorris，et al.，1993は、ＣＤ５９（配列番号７）において、Ｃｙｓ６とＣｙｓ１３との間のジスルフィド結合、ならびにＣｙｓ６４とＣｙｓ６９との間のジスルフィド結合は、これらのシステインをセリンで置換することにより、ＣＤ５９の機能性を実質的に損なうことなく破壊し得ることを報告した。これらのシステインは、上記式中、２番目、３番目、９番目および１０番目のシステインに相当する。したがって、本明細書中で用いる場合、「Ｌｙ−６最終ＣＩＰ」という用語は、上記式に従うが、２番目、３番目、９番目および１０番目のシステインのいくつかまたは全部がセリンまたは他のアミノ酸で置換されている最終補体インヒビタータンパクをも包含することを意図している。IV．他の細胞表面補体インヒビタータンパク上記で考察したＬｙ−６最終ＣＩＰに加えて、他の膜結合型ＣＩＰが文献に記載されている。例えば、以下のものがある：（ａ）ＣＤ４６（膜コファクタータンパク、ＭＣＰ、例えばＰＣＴ特許公報ＷＯ９１／０２００２を参照されたい）は、赤血球を除いてすべての細胞に見い出される３５０アミノ酸の膜貫通（トランスメンブレン、ＴＭ）タンパクである。ＣＤ４６は、Ｃ３ｂに結合し、いったん結合すると、Ｃ３ｂを不活性断片に切断するプロテアーゼの活性を促進し、それによって細胞表面上へのＣ３ｂの蓄積を防止し、補体侵襲から細胞を保護する。ＣＤ４６の膜結合型および分泌型の両方の形態が文献に報告されている（Purcell et al.，1991）。（ｂ）上記で言及したＣＤ５５（崩壊促進因子、ＤＡＦ）は、赤血球を含むすべての細胞に存在する、ＧＰＩアンカーでつながれた細胞表面タンパクである。ＣＤ４６とは異なり、ＣＤ５５は、Ｃ３ｂを破壊しない。むしろ、ＣＤ５５は、Ｃ３ｂが他の補体成分と反応するのを防止し、それによって補体媒介性細胞溶解を防害する。ＣＤ５５の膜結合型および分泌型の両方の形態が文献に報告されている（Moran，et al.，1992）。（ｃ）ＣＤ３５（補体レセプター１、ＣＲ１）は、リンパ球の選択されたグループ、ならびに赤血球、好中球および好酸球に見い出され、近接する細胞に付着しているＣ３ｂ分子の分解を引き起こす。（ｄ）ファクターＨおよびＣ４ｂ結合タンパクは、ともに代替的Ｃ３コンベルターゼ活性を阻害する。Ｖ．移植提供者（ドナー）器官の保存中の第二経路を通じての補体侵襲の複雑な活性化は、Ｃ５ｂ〜９ＭＡＣによる内皮細胞刺激および／または溶解の結果として生じる、器官移植に付随するある種の問題の原因となる（Brasile，et al.，1985）。半ビボ（ex vivo）での補体侵襲は、保存された器官を移植する場合、血管の生存率の減少および血管の完全性の減少をもたらし、移植物の拒絶の可能性を高める。ＨＬＡ同一性を有する同種移植の腎臓の１０％は、in vivoの免疫学的メカニズムにより拒絶される（Brasile，et al.，1987）。これらの条件下で器官を拒絶する患者の７８％において、血管内皮細胞の表面上の分子に結合する細胞傷害性抗体が見られる（Brasile，et al.，1987）。このような抗体細胞傷害性は、補体侵襲により媒介され、腎臓および心臓を含む移植された固体器官の拒絶の原因となる（Brasile，et al.，1987; Brasile，et al.，1985）。抗体により開始される補体媒介性の拒絶は、通常、迅速かつ不可逆的な、超急性拒否反応と呼ばれる現象である。非ヒト器官をヒト患者に移植する場合のような、異種移植の状況においては、ドナー器官の脈管をおおう内皮細胞の表面上の分子に対する抗体による補体侵襲の活性化は、ほとんど常に観察される。このような異種反応性抗体の出現率は、移植片の超急性拒否反応のほとんど普遍的な発生の原因である（Dalmasso，et a l.，1992）。ヒトを含む旧世界霊長類には、一致しない種からの異種細胞の表面に発現される炭水化物抗原決定基を主に認識する、あらかじめ存在する高レベルの循環「天然」抗体を有する。最近の証拠は、これらの抗体のほとんどが、ガラクトース（Ｇａｌ（α１−３）Ｇａｌ）を有するα１−３連鎖中のガラクトースと反応することを示している（Sandrin et al.，1993）。旧世界霊長類には、適切な機能的α１，３−ガラクトーストランスフェラーゼが欠けており、それゆえこの炭水化物エピトープは発現されない。したがって、血管新生した異種ドナー器官の移植に続いて、これらの高力価の抗体が、血管内皮のＧａｌ（α１−３）Ｇａｌエピトープに結合し、古典的経路を通じて受容者（レシピエント）の補体を活性化する。補体カスケードの活性化から起こる大規模な炎症応答は、数分から数時間以内にドナー器官の破壊をもたらす。異種反応性抗体は、すべての場合において排他的に一致しない器官の超急性拒否反応の原因となるわけではない。例えば、ある種からの赤血球は、第二経路を通じてヒト補体を活性化することができるし、あらかじめ形成される抗体を持たないように育てられた新生児ブタは、ほとんど直ちに異種移植片を拒絶する。したがって、いくつかの種の組み合わせにおいては、第二補体経路の活性化が移植片拒絶反応に寄与している可能性が高い。内在的に発現された、膜結合型補体インヒビタータンパクは、通常、自己補体から内皮細胞を保護する。しかし、これは、補体インヒビターの種に関する制限により、一致しない異種血清補体を調節することに関してはあまり効果的ではない。この抗体および補体媒介性超急性拒否反応を排除することを目的とする効果的な治療法の欠如は、一致しない動物の器官をヒト受容者に成功裡に移植することに対する主要な障壁となっている。最近、ヒヒからヒトへの肝臓移植に関する報告が刊行され、この中では、異種ドナー器官は超急性拒否反応の徴候をしめさなかった（Starzl，et al.，1993）。ヒト血中に存在すると思われる低レベルの抗ヒヒ抗体は、超急性応答を起こりにくくする。しかし、最近発見されたヒヒＣＩＰが、ＣＤ５９に関連していること、およびヒト補体に対して効果的であることが示されており、これもこの異種移植された器官の完全性を維持するのにある役割を果たしていると信じられている（上記で引用した米国特許出願第０８／１０５７３５号を参照されたい）。上述のヒヒからヒトへの異種移植において見られた超急性拒否反応の欠如は、ヒト補体に対して効果的である補体インヒビタータンパクが、他の拒絶反応防止戦略と組み合わせることによって、このようなタンパクを発現するトランスジェニック動物の器官をヒト患者に安全かつ効果的に異種移植することを可能にし得ることを示唆する。VI．ＧＰＩアンカーを有するＣＩＰおよびその改変ＧＰＩアンカーを有する最終ＣＩＰは、移植された細胞または器官の保護のための補体阻害性薬剤としての用途に関して、膜貫通（ＴＭ）タンパクより望ましくないある特性を共有する。ＣＤ５９、ＢＡＢＣＩＰおよびＡＧＭＣＩＰを含む、ＧＰＩアンカーを有する最終ＣＩＰは、ＧＰＩアンカーを加水分解する特異的ホスホリパーゼ酵素により細胞表面から切断され得る。このようなホスホリパーゼは、血清中に存在し（ホスホリパーゼＤ、Davitz，et al.，1987）、また、虚血に応答して細胞から放出され得る（ホスホリパーゼＣ、Vakeva，et al.，1992）。虚血は、移植に不可避的に付随するので、移植の過程は、本来の（ネイティブな）および／または人為的に導入したＧＰＩアンカーを有するＣＩＰを、それらが保護しようとする移植された器官内のまさにその細胞から除去するように働き得る。ＧＰＩアンカーを有するタンパクを細胞表面から除去する別のメカニズムは、このようなタンパクの膜小胞（ベシクル）への取り込みと、それに続くこのベシクルの細胞からの離脱である。このようなベシクル化は、種々の刺激、例えば、虚血誘発性補体侵襲に応答して起こり得る。ＧＰＩアンカーを有するタンパクは細胞膜での濃度に比較してこれらのベシクル中に濃縮されているという、これらのタンパクがベシクル化自体の過程に関与することを反映する可能性がある現象が報告されている（Butikofer，et al.，1989; Brown，et al.，1992; Whitlow ，et al.，1993）。離脱ベシクルへのこのような優先的な取り込みは、細胞表面のＧＰＩアンカーを有するタンパクの濃度（ＧＰＩアンカーを有する最終ＣＩＰの濃度を含む）を減少させ得る。このような最終ＣＩＰ濃度の減少、特に補体侵襲に応答して起こるものは、補体の阻害が最も必要とされるちょうどそのときに起こり得る。細胞表面からの除去を受け得ることに加えて、ＧＰＩアンカーを有するタンパクは、種々の細胞タイプでその産生が限られているという問題をも有する。これは、ある一定の時間枠内において細胞がＧＰＩアンカーを有する分子を通常大変多く産生し得るので、さらなるＧＰＩアンカーを有するタンパクの遺伝子を導入しても、実際、細胞表面に実際に存在するタンパク質の量の実質的な増加をもたらさない可能性がある、ということである。この問題の制限的なケースは、ＧＰＩアンカーを有するいかなるタンパクも産生することができない細胞に関与する。発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ P aroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria）の臨床的疾患は、このタイプの細胞、具体的にはＧＰＩアンカーを有する最終ＣＩＰを産生しない血液細胞に関与する。 Russel Rother，Scott A．Rollins，Seth A．FidelおよびStephen P．Squintoにより、本願対応米国特許と同時に米国において出願されている、「発作性夜間ヘモグロビン尿症の治療方法」なる発明の名称の、本願出願人が譲り受けた別出願の、米国特許出願第０８／２０６１８９号において考察されているように、ＰＮＨ細胞は、本明細書に記載の膜貫通最終ＣＩＰの使用を通じて、補体侵襲に対して抵抗性にすることができる。ＧＰＩアンカーを有するタンパクのさらなる欠点は、特異的抗体により架橋された際、そしておそらくその天然のリガンドと結合した際、細胞内にシグナルを伝達するこれらのタンパクの能力に関与する（Okada，et al.，1989b; Seaman， et al.，1991; Su，et al.，1991; Deckert，et al.，1992; Cinek，et al.，19 92; Card，et al.，1991; Groux，et al.，1989;およびStefanova，et al.，199 1）。このような細胞内シグナルに対する望ましくない可能な細胞応答としては、ホスホリパーゼ活性化および／または放出、ならびにベシクル形成および離脱の刺激を挙げることができる。これらの両方が、上記で考察したとおり、細胞表面からのＧＰＩアンカーを有するタンパクの喪失をもたらし得る。したがって、移植された器官の細胞を補体侵襲から保護するために使われる、まさにそのＧＰＩアンカーを有する最終ＣＩＰは、細胞表面からそれらを除去することにつながる細胞事象を活性化する可能性がある。細胞外表面へのＧＰＩアンカーを有するタンパクの付着の手段を、他のアンカー部分との置換によりその天然のＧＰＩアンカーから変化させる研究がなされてきた（Su et al.，1991;およびLublin，et al.，1991）。例えば、ＣＤ５５のキメラ誘導体は、ＣＤ４６の膜貫通ドメイン（すなわち、ＣＤ４６のアミノ酸２７０〜３５０）を含むフラグメントまたはヒト主要組織適合性タンパクＨＬＡ−Ｂ４４の膜貫通ドメイン（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ４４のアミノ酸２６２〜３３８）を含むフラグメントに融合したＣＤ５５のアミノ酸１〜３０４を含み、本来のＣＤ５５と同等の機能レベルを保持していることが報告された（Lublin，et al.，1991）。重要なことに、本発明に関しては、ＣＩＰについてこのような置換はまったくなされず、臨床的使用のため、特に移植のためのトランスジェニック器官の作成における使用のために、このような分子をまったく開発しない。VII．タンパク質の構造および機能タンパク質一次構造（アミノ酸配列）のわずかな変化は、その機能的特性に重大な影響を与え得る。この現象の最もよく知られた例は、鎌状赤血球貧血の場合であり、この場合、単一のアミノ酸の変化、すなわちヘモグロビンのβ鎖の６番目の残基の、ＧｌｕからＶａｌへの変化は、ヘモグロビン分子の酸素結合特性を変化させ、それによって鎌状細胞疾患を引き起こすのに十分である。新規なドメイン構造を表す非相同のアミノ酸配列の、タンパク質への挿入もまた、そのタンパク質の機能的特性に有為な影響を与えることができる。例えば、ｃ−ｍｙｃガン原遺伝子（プロトオンコジーン）の１０アミノ酸のエピトープ（ｍｙｃタッグとして知られる）の、ｉｎｔ−１プロトオンコジーンへの導入は、ｉｎｔ −１の機能的特性を変化させる。具体的には、Ｃ５７ＭＧ乳房上皮細胞は、野生型のｉｎｔ−１により形質転換（トランスフォーム）し、ｍｙｃタッグを有するｉｎｔ−１によってはトランスフォームしないが、ｍｙｃタッグを有するｉｎｔ −１遺伝子の他の機能は、Drosophilaの発生に対する効果を調べるより高感度の検定において見られる（McMahon，et al.，1989）。さらに、非相同タンパクからの相同配列の置換は、タンパク質の機能に顕著な影響を与え得る。例えば、マウス神経成長因子遺伝子の２つの最もカルボキシル末端側の１２アミノ酸のセグメントのいずれかを、関連するマウス脳由来神経栄養性（neurotrophic）因子遺伝子からの相同セグメントで置き換えると、分子の活性が５０％減少する。これは、このカルボキシル末端領域が非相同タンパクからの相同配列での置換に対して特に感受性があり、このような置換が、タンパク質の機能に対して活性を５０％減少させるのに十分な影響を有するということである。同様の活性の減少は、アミノ末端の置換の後にも見られる（Suter，et al .，1992）。すべてのＬｙ−６最終ＣＩＰは、ＧＰＩ連鎖により細胞膜に付着する特性を共有すると信じられている。当業界で理解されているように、生成期のタンパクに対するこのようなＧＰＩ部分の付加は、ポリペプチドのカルボキシル末端からある数のアミノ酸残基を除去するタンパク分解的プロセッシング工程と一致する。したがって、成熟Ｌｙ−６最終ＣＩＰは、それをコードする完全長の核酸分子により特定されるアミノ酸のすべてを含まない。具体的には、これらは、システイン骨格Ｌｙ−６モチーフの下流のアミノ酸残基、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７（ＣＤ５９）のシステイン６９の下流のアミノ酸および配列番号３のシステイン７２の下流のアミノ酸のいくつかまたは全部を含んでいない（本明細書において用いる場合、「下流」は、ポリペプチドのカルボキシル末端に向かうこと、またはポリペプチドをコードする核酸分子のコード鎖の３′末端に向かうことを意味し、「上流」は、ポリペプチドのアミノ末端に向かうこと、またはポリペプチドをコードする核酸分子のコード鎖の５′末端に向かうことを意味する）。これらの最終ＣＩＰが、成熟してＧＰＩアンカーを有する状態にある場合に、それらのいずれかにおいてＬｙ− ６システイン骨格モチーフの下流のどのアミノ酸が存在または欠如しているかは不明である。以下に詳細に考察するように、本発明は、Ｌｙ−６モチーフの下流のこのようなＬｙ−６最終ＣＩＰの選択されたアミノ酸の除去に関する。先行技術水準から見て、本発明以前には、このようなアミノ酸の除去が最終ＣＩＰの機能にどのような効果を与え得るかは知られていなかった。特に、そのような除去の後に、Ｌｙ−６最終ＣＩＰが何らかの補体阻害活性を保持し得るかは知られていなかった。タンパク質の機能に対するＧＰＩアンカーの効果を調べるために種々の試みがなされた。ＣＤ５５の場合には、膜貫通ドメインを含むタンパクフラグメントでの、ＧＰＩアンカーの付加に関与すると信じられているカルボキシル末端配列（以下、「ＧＰＩシグナル配列」と呼ぶ）の置換は、本来のＧＰＩアンカーを有するタンパクと等しい活性を持つタンパク質をもたらした（Lublin，et al.，1991 ）。ＣＤ５９に構造的に関連する、ＧＰＩアンカーでつながれた細胞表面タンパクであるＬｙ−６タンパク、Ｌｙ−６Ｅ（Ｌｙ−６Ｅ．１）の場合には（Philbr ick，et al.，1990）、膜貫通ドメインを含むフラグメントでの、Ｌｙ−６モチーフの下流のカルボキシル末端ＧＰＩシグナル配列の置換は、機能的でないタンパク、すなわちＴ細胞を活性化することのできないタンパクを生み出す（Su，et al.，1991）。発明の概要上記の観点から、本発明の目的の一つは、ヒトおよび他の動物の補体系を制御することに使用し得る新規なタンパク質を提供することである。さらに、このようなタンパク質を生体内（in vivo）または生体外（in vitro）で産生させるための核酸配列および関連遺伝子工学構築体を提供することも本発明の目的である。より具体的には、Ｌｙ−６最終補体インヒビターであるが、ＧＰＩアンカーに依存しない手段によって細胞表面につながれている新規なタンパク質を提供することが、本発明の目的である。抗体との架橋の後、またはリガンドに対する最終ＣＩＰの結合の際に、それらが結合している細胞、例えば、内皮細胞、リンパ球または血小板に活性化シグナルを伝えないであろうこのタイプの分子を提供することは、本発明のさらなる目的である。それらが結合している細胞の表面からホスホリパーゼのような脂質切断酵素の作用によって除去され得ない、そして離脱ベシクル中に優先的に取り込まれない、このタイプの分子を提供することは、本発明のさらなる目的である。上記の、そしてその他の目的を達成するために、本発明は、そのある種の側面に従って、非相同の膜貫通（ＴＭ）ドメインとのＬｙ−６最終ＣＩＰの融合物を含むキメラタンパク生成物をコードするキメラ遺伝子の完全ｃＤＮＡ配列を提供する。融合に先立って、最終ＣＩＰのＬｙ−６モチーフの下流に位置する選択されたアミノ酸残基を削除する。本発明は、これらの遺伝子によってコードされるキメラタンパク生成物をも含み、このようなキメラ分子を、以下、ＴＭＴＣＩＰ（すなわち、膜貫通最終補体インヒビタータンパク）と呼ぶ。本発明の好ましい態様においては、キメラタンパクは、その活性を好ましくは後記の実施例４のタイプの色素放出検定を用いて測定した場合、ＴＭＴＣＩＰが由来するもとのネイティブなＧＰＩアンカーを有する最終ＣＩＰの補体阻害活性の５０％を越える活性を有する。本発明のＴＭＴＣＩＰにより与えられる補体侵襲からの保護は、（例えば、移植における）病理学的補体侵襲の治療的予防のために、遺伝子移入（トランスファー）を通じて提供することができる。このような療法の好ましい形態においては、ＴＭＴＣＩＰの発現は、非ヒト動物器官、例えば、非ヒトトランスジェニック動物の器官を、ヒト患者への移植の際に補体侵襲から保護するために、このような器官の細胞の表面に向けることができる。添付の図面は、本明細書に取り込まれ、その一部を構成するものであり、本発明の好ましい態様のいくつかの側面を説明し、記載とともに、本発明のある原理を解説するのに役立つものである。もちろん、図面および記載の両方が説明のためだけのものであり、本発明を制限するものではないことは理解されるべきである。図面の簡単な説明図１は、ヒト、アフリカミドリザル、ヒヒ、ヨザル、マーモセット、リスザル、およびヘルペルウイルスSaimiriのＬｙ−６最終ＣＩＰ（各々、ＣＤ５９、ＡＧＭＣＩＰ、ＢＡＢＣＩＰ、ＯＷＭＣＩＰ、ＭＡＲＣＩＰ、ＳＱＭＣＩＰおよびＨＶＳ−１５）のアミノ酸配列の整列図を示す。各タンパクのＬｙ−６骨格モチーフを構成するシステイン残基に下線を付してある。図２は、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞でのＣＤ５９エピトープの細胞表面の発現の比較を示す。３つの軌跡は、ＣＤ５９−ＭＣＰＴＭＴＣＩＰを発現する陽性（ポジティブ）Ｂａｌｂ／３Ｔ３クローン（ＣＤ５９−ＴＭ）、陽性対照としてネイティブなヒトＣＤ５９トランスフェクタント（ＣＤ５９−ＧＰＩ）および陰性対照として挿入物（インサート）なしのベクター（ｐｃＤＮＡ３、Invitrogen，Sa n Diego，CA）トランスフェクタント（ベクター対照）の細胞表面発現プロフィールを表す。図３は、マウスＬ細胞でのＣＤ５９エピトープの細胞表面の発現の比較を示す。幅の広い軌跡は、ｐＬ−ＣＤ５９−ＭＣＰ−ＴＭ−ＳＮベクターを用いて生成したレトロウイルスビリオン粒子で形質導入したプールＬ細胞の細胞表面発現プロフィールを表す（ＣＤ５９−ＴＭ）。ｐＬ−ＣＤ５９−ＧＰＩ−ＳＮベクターを用いて生成したレトロウイルスビリオン粒子（ＣＤ５９−ＧＰＩ）または陰性対照としてインサートを持たないｐＬＸＳＮベクターを用いて生成したレトロウイルスビリオン粒子（ベクター対照）で形質導入したプールＬ細胞の細胞表面発現プロフィールも示す。図４は、ＰＩ−ＰＬＣ消化の前後の、安定にトランスフェクトされたＢａｌｂ／３Ｔ３細胞でのＣＤ５９抗原の細胞表面レベルを示す。図４Ａは、ネイティブなヒトＣＤ５９分子を発現するクローンを用いて得られたデータを示す（ＣＤ５９−ＧＰＩ）。図４Ｂは、ＣＤ５９−ＭＣＰＴＭＴＣＩＰを発現するクローンを用いて得られたデータを示す（ＣＤ５９−ＴＭ）。各パネルにおいて、「Ａ」および「Ｂ」と標識された軌跡は、各々、ＰＩ−ＰＬＣ処理をして、またはせずに、二次抗体単独で染色した細胞を表す。各パネルにおいて、「Ｃ」および「Ｄ」と標識された軌跡は、各々、ＰＩ−ＰＬＣ処理をして、またはせずに、一次抗体（ＣＤ５９特異的）および二次抗体の両方で染色した細胞を表す。図５は、図２および図４のデータを得るのに使用した、形質転換したＢａｌｂ／３Ｔ３細胞を用いて行った色素放出検定により得られたデータを示す。細胞に、精製Ｃ８およびＣ９の等量混合物を加えた、Ｃ８を破壊した２０％ヒト血清により抗原投与した。添加したヒトＣ８およびＣ９の混合物の量（μg／mL、最終濃度）を横座標に示し、色素放出（％）を縦座標に示す。図６は、図３のデータを得るのに使用した、形質転換したマウスＬ細胞を用いて行った色素放出検定により得られたデータを示す。細胞に、精製Ｃ８およびＣ９の等量混合物を加えた、Ｃ８を破壊した２０％ヒト血清により抗原投与した。添加したヒトＣ８およびＣ９の混合物の量（μg／mL、最終濃度）を横座標に示し、色素放出（％）を縦座標に示す。好ましい態様の説明上記で考察したように、本発明は、非相同膜貫通ドメインおよびＬｙ−６最終ＣＩＰの融合物を含むキメラタンパク生成物をコードするキメラ遺伝子の完全ｃＤＮＡ配列を提供する。Ｉ．最終ＣＩＰ本発明の実施には、様々な最終ＣＩＰを使用することができる。特に、Ｌｙ− ６最終ＣＩＰを使用することができる。上記の式（１）および（２）に示す相同性を共有することに加えて、Ｌｙ−６最終ＣＩＰは、図１の整列させたアミノ酸配列に見ることができる様々な他の相同性をも共有する。これらの最終ＣＩＰのＬｙ−６システインモチーフの下流に見い出される相同性としては、Ｌｙ−６モチーフの最後のＣのすぐ後のＮ、Ｌｙ−６モチーフの最後のＣの下流の別の６〜８個のＮ残基（本明細書中で「トランケーション（truncation）−Ａｓｎ」と呼ぶ）、および配列の３番目の位置に上述のトランケーション−Ａｓｎを含む以下のコンセンサス配列（以下、「下流コンセンサス配列」と呼ぶ）：（ＬまたはＩ）（ＥまたはＫ）Ｎ（ＧまたはＩ）（ＧまたはＫ）（ＴまたはＲ）（ＳまたはＴ）（ＬまたはＩ）Ｓ（ＫまたはＥまたはＤ）Ｋ（ＴまたはＡ）（ＶまたはＩまたはＬ）（ＬまたはＶ）ＬＬ（ＶまたはＬ）（ＡまたはＴまたはＩ）（ＰまたはＬ）（ＦまたはＬ）Ｌ（ＡまたはＶ）（ＡまたはＴ）ＡＷ（ＳまたはＣまたはＮ）（ＬまたはＲまたはＦ）（ＨまたはＰ）（ＰまたはＬ）が挙げられる。これらの構造的共通性に加えて、図１のＬｙ−６最終ＣＩＰの試験から、これらがヒト補体の活性を実質的に阻害する能力を共有することがわかっている（上記で引用した米国特許出願第０８／１０５７３５号およびＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００６７２号を参照されたい）。特に、ＣＤ５９、ＡＧＭＣＩＰ、ＢＡＢＣＩＰ、ＯＷＭＣＩＰ、ＳＱＭＣＩＰおよびＨＶＳ−１５の各々は、かなりのヒト補体阻害活性を有していた。ＭＡＲＣＩＰは試験しなかったが、これもそのような活性を有することが予期される。II．膜貫通ドメイン当技術分野で知られているように、膜貫通タンパクは、そのアミノ酸鎖の長さに沿って、１回または数回、膜を横断しうる。一般に、膜を１回だけ横断する膜貫通タンパクが膜に埋め込まれ得る２つの異なる方法がある。最も一般的には、これらのタンパク質は、ポリペプチド鎖のカルボキシル末端に向かって位置する単一の膜貫通ドメインを有しており、膜貫通ドメインのアミノ末端側の領域が細胞の外側または非細胞質細胞区画にあって、膜貫通ドメインのカルボキシル末端側の領域が細胞質区画にあるように向いている。単一の膜横断膜貫通ドメインを有する膜貫通タンパクの第二の向きは、この一般的な配置の反対であり、つまり、膜貫通ドメインのアミノ末端側の領域が細胞質区画の中にあって、膜貫通ドメインのカルボキシル末端側の領域が細胞の外側または非細胞質細胞区画の中にある。他の膜貫通タンパクは、膜を数回横切る。最も一般的には、このタイプの膜貫通タンパクの真核生物の代表的なものは、７個の連続する膜貫通ドメインを有し、それらのほとんどが短い親水性ループ領域で連結されている。一般に、膜貫通タンパクは、脂質二重層膜中に存在する、少なくとも１つの、連続的なアミノ酸残基のストレッチ（以下、「膜アミノ酸」と呼ぶ）と、膜から伸びて、１つは一般に細胞質にある（以下、「細胞質アミノ酸」と呼ぶ）、そして１つは一般に細胞外にあるかまたは非細胞質細胞区画にとどまる（以下、「細胞外アミノ酸」と呼ぶ）、少なくとも２つの連続的なアミノ酸残基のストレッチとを含む。本明細書において呼ぶ場合、細胞質アミノ酸および細胞外アミノ酸は、常に、膜アミノ酸のすぐ隣に少なくとも１個の荷電したアミノ酸残基を含む（本明細書中で、各々、「第一の細胞質アミノ酸」および「第一の細胞外アミノ酸」と呼ぶ）。膜アミノ酸は、そのほとんどが疎水性（非荷電）アミノ酸である少なくとも約２０個（一般に膜を横断するのに必要な最小数）のアミノ酸のグループとして特徴づけられる。荷電（親水性）アミノ酸は、通常、このグループには存在しないが、いくつかの場合には、反対の電荷を有する２個の親水性残基が膜中で互いに近接して存在し、そこで互いを中和している可能性がある。様々な膜貫通タンパクに由来する膜貫通ドメインを、本発明の実施において用いることができる。しかし、第一の細胞質アミノ酸の近傍にシステイン残基を含む細胞質アミノ酸を有する膜貫通ドメインは、このようなシステインを含まない膜貫通ドメインよりも、低いレベルで細胞表面上に発現される可能性がある。この減少した発現は、これらのシステイン残基が、隣接する生成期の膜貫通タンパク分子に同様に位置するシステインと、分子間結合を形成する傾向に起因すると信じられている。このような分子間システイン連結は、一般にはゴルジ装置内（ここで、典型的細胞内で新規に合成された膜貫通タンパクがプロセッシングされる）で、生成期の膜貫通タンパクの凝集を引き起こし、それにより細胞表面へのこのような生成期のタンパクの輸送をブロックする。本発明のＴＭＴＣＩＰ分子に関しては、ヘルペスウイルスsaimili ＣＣＰＨ遺伝子からの推定膜貫通ドメインを含むキメラ最終ＣＩＰをコードする発現ベクターでの哺乳動物細胞のトランスフェクション（上述のＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００６７２号を参照されたい）は、ＦＡＣＳ解析により検出されるのに十分に高いレベルの最終ＣＩＰエピトープの細胞表面での発現をもたらさないことが注目される（実施例１を参照されたい）。この推定膜貫通ドメインの細胞質アミノ酸は、第一の細胞質アミノ酸であるヒスチジンから２個および５個のアミノ酸の間隔をおいたシステイン残基を含む。これらのシステインの存在は、この推定膜貫通ドメインを用いて見られる低レベルの発現の原因であると信じられている。この理由のために、このタイプの膜貫通ドメインは、本発明について使用するには好ましくない。本明細書で用いる場合、「膜貫通ドメイン」という用語は、以下のものを含むことを意図している：１）膜を横断する膜貫通タンパクのその部分、すなわち、この目的のために通常必要とされる少なくとも約２０個の膜アミノ酸、２）膜アミノ酸から約５〜約１０残基以内の、隣接する優勢に荷電した細胞質アミノ酸、および３）膜アミノ酸から約５〜約１０残基以内の、隣接する優勢に荷電した細胞外アミノ酸。これらの隣接する優勢に荷電した細胞質および細胞外アミノ酸は、タンパク質を膜につなぎ止めること（アンカーリング）に関与する。上記で考察したように、好ましい膜貫通ドメインは、第一の細胞質アミノ酸の５アミノ酸以内に、システイン残基である細胞質アミノ酸を含まない。タンパク質配列を調べて、約２０の連続する疎水性アミノ酸を有する領域を拾い上げることは可能であるが、上記で考察したように、いくつかの膜貫通ドメインは、その優勢に疎水性である残基内に散在する少数の親水性アミノ酸を含む。したがって、膜貫通ドメインは、疎水性スケールを用いて疎水性／親水性（ハイドロパシー）プロットを計算することにより最も効果的に同定することができる（Branden，et al.，1991）。疎水性スケールは、個々のアミノ酸の疎水性について数値的な値を提供する。これらのスケールは、異なる溶媒中でのアミノ酸の溶解性測定値、側鎖アナログの蒸気圧、可溶性タンパク内での側鎖分布の解析、および理論的エネルギー計算に基づいて開発された（Kyte，et al.，1982; およびEngelman，et al.，1986）。ハイドロパシープロットは、疎水性値を用いてアミノ酸配列から以下のようにして計算される。最初に、配列中の各位置について、疎水性インデックスを算出する。疎水性インデックスは、各位置の周囲の、通常１９残基の長さの「ウインドウ」内のアミノ酸の疎水性の平均値である。次に、疎水性インデックスを、アミノ酸配列位置に対してプロットし、ハイドロパシープロットを作成する。膜貫通ドメインは、次に、配列中の連続する多くの位置について疎水性インデックスが高い領域を検索すること、例えば、高ポジティブ（すなわち、疎水性）値の太いピークを有する領域を検索することにより、ハイドロパシープロットから同定する。本発明に関しては、好ましくは、膜貫通ドメインは、Kyte et al.のスケール（Kyte，et al.，1982）および１９アミノ酸のウインドウを用いて、少なくとも約１２アミノ酸残基の領域にわたって、約＋０．５を越える疎水性インデックスを有する。膜貫通タンパクのさらなる連続するアミノ酸は、それらのさらなるアミノ酸が、膜への膜貫通ドメインの挿入、細胞表面への生成期のキメラタンパクの輸送、またはキメラ分子の最終ＣＩＰ部分の補体阻害活性を妨げない限り、本発明のキメラ分子に含まれているか、それにコードされていることができる。本発明の分子は、任意の機能的膜貫通ドメインを用いて作成することが可能である一方、単一の膜貫通ドメインのみを有し、細胞質中にその膜貫通ドメインのカルボキシル末端側の領域を有するタンパク質に由来するものが好ましい。このようなタンパク質は、文献に多数報告されており、以下のものが挙げられる：ＣＤ４６；主要組織適合性抗原、および細胞間接着分子、例えば、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＶＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）およびＨＣＡＭ（ＣＤ４４）を含む、免疫グロブリン多重遺伝子スーパーファミリーの関連膜貫通タンパク；セレクチン、例えば、Ｅ−セレクチン、Ｌ −セレクチンおよびＰ−セレクチン（ＣＤ６２）；アルツハイマーのアミロイド前駆体タンパク；インシュリンレセプター；上皮成長因子レセプター；ＡＩＤＳウイルス、ＨＩＶのｇｐ４１タンパク；ＨＴＬＶ１およびＨＴＬＶ２のｐ２１タンパク；およびマウスおよびネコ白血病ウイルスのｐ１５Ｅタンパク。これらのタンパク質のいずれかに由来するＴＭドメイン、ならびに他の膜貫通タンパクに由来するものを、本発明の実施において使用することができる。これらのドメインは、膜貫通ドメインの上流のある点に始まる膜貫通タンパクのカルボキシル末端全体を、キメラ分子に取り入れることによって、最も容易に用いることができる。特に好ましいＴＭドメインは、ＣＤ４６のアミノ酸２９４〜３２６を構成するもの（ＭＣＰ、配列番号８）である。このドメインは、ＣＤ４６タンパクの膜貫通ドメインの下流のこの分子のカルボキシル末端を含むアミノ酸３２７〜３５０とともに、そして、細胞膜中へのＣＤ４６ＴＭドメインの挿入に干渉せず、以下に示すように、Ｌｙ−６最終ＣＩＰの補体阻害活性を阻害しない、ＴＭドメインの上流のアミノ酸２７０〜２９３とともに、好都合に使用することができる。本発明における使用に好適なＴＭドメインを、ハイドロパシープロットを用いて同定することに加えて、このようなドメインは、例えば、プロテアーゼ消化技術を用いて、またはシグナル配列に作動可能に連結された可溶性タンパクを含み、推定膜貫通ドメインを含むキメラ分子を作成して、キメラタンパクの膜挿入について検定することにより、生化学的に同定することもできる。III．ＴＭＴＣＩＰ遺伝子およびこのような遺伝子を含むベクター最終ＣＩＰおよびＴＭドメインをコードする核酸フラグメントの単離、短縮（トランケーション）および融合は、所望のフラグメントのＰＣＲ生成および／またはクローニングした遺伝子の制限酵素消化；所望のフラグメントのＰＣＲ融合；または制限酵素消化生成物の酵素的連結（Sambrook，et al.，1989; およびAu subel，et al.，1992）を含む、当技術分野において公知の組換え核酸技術を用いて行うことができる。あるいは、本発明のＴＭＴＣＩＰをコードする核酸分子、またはＴＭＴＣＩＰのためのキメラ遺伝子を組み立てるのに用いる核酸フラグメントのいずれかまたは全部は、化学的手段によって合成することもできる（Ta lib，et al.，1991）。本発明のキメラ遺伝子は、１）正常なＧＰＩシグナル配列を不活性化するために、Ｌｙ−６モチーフの下流の選択されたアミノ酸残基を除去するように、Ｌｙ −６最終ＣＩＰに関する核酸配列を切り取り、２）短縮された配列を、選択したＴＭドメインおよびＴＭドメインの周囲の所望のアミノ酸をコードする配列に融合させることによって、調製する。Ｌｙ−６最終ＣＩＰをコードする核酸配列の短縮は、Ｌｙ−６モチーフの最後の（１０番目の）Ｃｙｓの後ろの６および８アミノ酸残基の間に位置するＡｓｎの下流のカルボキシル末端アミノ酸残基の少なくともいくつかを除去することになる。このＡｓｎは、上記に呈示した下流コンセンサス配列中の第３位にも位置する。すなわち、それが、上記で定義したトランケーション−Ａｓｎである。すべての公知のＬｙ−６最終ＣＩＰは、このようなトランケーション−Ａｓｎを含む。いくつかの場合には、トランケーション−Ａｓｎの後のアミノ酸残基のすべてを除去する。あるいは、ＧＰＩシグナル配列が作動不能であるのに十分な数の残基を除去することを基準として、全部より少ない数を除去することもできる。一般に、最も簡便なアプローチは、トランケーション−Ａｓｎの下流のすべてのアミノ酸残基を除去することである。望ましい場合には、短縮は、トランケーション−Ａｓｎからさらに上流に広げることもでき、好ましくは、Ｌｙ−６モチーフの最後のＣｙｓから下流の点で開始させる。Ｌｙ−６モチーフの最後のＣｙｓの上流で始まる短縮は、一般に好ましくないが、所望であれば用いることができる。トランケーション−Ａｓｎの上流の短縮の基準は、親の（ネイティブな）Ｌｙ −６最終ＣＩＰの補体阻害活性の５０％より多くをＴＭＴＣＩＰが有するという要件である。図１のＬｙ−６最終ＣＩＰについては、好ましい短縮は、ＢＡＢＣＩＰ（配列番号１）のＡｓｎ７７、ＡＧＭＣＩＰ（配列番号２）のＡｓｎ７５、ＳＱＭＣＩＰ（配列番号３）のＡｓｎ８０、ＯＷＭＣＩＰ（配列番号４）のＡｓｎ７７、ＭＡＲＣＩＰ（配列番号５）のＡｓｎ７７、ＨＶＳ−１５（配列番号６）のＡｓｎ７７、およびＣＤ５９（配列番号７）のＡｓｎ７７の下流のすべてのアミノ酸を含む。これらのＬｙ−６最終ＣＩＰのうち、ＣＤ５９が好ましい。上記で考察したように、好ましいＴＭドメインは、ＣＤ４６由来のものである。したがって、本発明の特に好ましい態様は、ＣＤ４６（配列番号８）のアミノ酸２７０〜３５０に融合したＣＤ５９（配列番号７）の残基１〜７７を含む。上述のものに加えて、本発明は、本発明のキメラＴＭＴＣＩＰをコードする核酸フラグメントを含む組換え発現ベクターを提供する。このようなキメラタンパクをコードする核酸分子は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパクコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに、挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは、本発明の融合遺伝子を構築するのに用いた遺伝子および／またはその隣接（フランキング）領域から供給することもできる。脊椎動物細胞において発現を指示するのに用いるべき発現ベクター系のための転写および翻訳調節配列は、ウイルス供給源から提供してもよい。例えば、一般に使用されるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、そのロングターミナルリピート（ＭＭＬＶ−ＬＴＲ）、ならびにヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、そのサイトメガロウイルス初期（immedi ate-early）遺伝子１プロモーターおよびエンハンサーから由来する。レトロウイルス発現ベクターは、本発明のＴＭＴＣＩＰの発現に関して好ましい系である。レトロウイルスベクターを構築するためのレトロウイルス核酸およびパッケージング細胞の操作は、当業界で公知の技術を用いて達成する。Ausubel，et al. ，1992、１巻、セクションIII（ユニット９．１０．１〜９．１４．３）；Sambr ook，et al.，1989; Miller，et al.，1989; Eglitis，et al.，1988; 米国特許第４６５０７６４号、第４８６１７１９号、第４９８０２８９号、第５１２２７６７号、および第５１２４２６３号；ならびにＰＣＴ特許公報ＷＯ８５／０５６２９号、ＷＯ８９／０７１５０号、ＷＯ９０／０２７９７号、ＷＯ９０／０２８０６号、ＷＯ９０／１３６４１号、ＷＯ９２／０５２６６号、ＷＯ９２／０７９４３号、ＷＯ９２／１４８２９号、およびＷＯ９３／１４１８８号を参照されたい。特に、本発明のレトロウイルスベクターは、以下のように調製し、使用することができる。最初に、ＴＭＴＣＩＰレトロウイルスベクターを構築し、両栄養性（amphotropic）パッケージング系、好ましくは遺伝子治療での適用に使用するのに好適なものを使用して、非感染性の形質導入ウイルス粒子（ビリオン）にパッケージングする。このようなパッケージング系の例は、例えば、Miller，et al.，1986; Markow itz，et al.，1988; Cosset，et al.，1990;米国特許第４６５０７６４号、第４８６１７１９号、第４９８０２８９号、第５１２２７６７号、および第５１２４２６３号；ならびにＰＣＴ特許公報ＷＯ８５／０５６２９号、ＷＯ８９／０７１５０号、ＷＯ９０／０２７９７号、ＷＯ９０／０２８０６号、ＷＯ９０／１３６４１号、ＷＯ９２／０５２６６号、ＷＯ９２／０７９４３号、ＷＯ９２／１４８２９号、およびＷＯ９３／１４１８８号に見い出される。好ましいパッケージング細胞は、ＰＡ３１７パッケージング細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ９０７８）である。「プロデューサー細胞」の生成は、レトロウイルスベクターをパッケージング細胞に導入することにより達成する。このようなレトロウイルスベクターの例は、例えば、Korman，et al.，1987; Morgenstern，et al.，1990;米国特許第４４０５７１２号、第４９８０２８９号、および第５１１２７６７号；ならびにＰＣＴ特許公報ＷＯ８５／０５６２９号、ＷＯ９０／０２７９７号、およびＷＯ９２／０７９４３号に見い出される。好ましいレトロウイルスベクターは、ＭＭＬＶ由来発現ベクターであるｐＬＸＳＮ（Miller，et al.，1989）である。本発明の実施に使用するレトロウイルスベクターは、ＴＭＴＣＩＰをコードするキメラ遺伝子を含むように改変する。上述の手順で生成されたプロデューサー細胞は、レトロウイルスベクター粒子（ビリオン）を作成するのに使用する。これは、細胞を好適な生育培地中で培養することによって達成する。好ましくは、ビリオンは、培養物から収穫し、形質導入すべき標的細胞、例えば、ＴＭＴＣＩＰのＬｙ−６最終ＣＩＰにより補体を阻害されうる患者への移植に使用すべき異種細胞、このような患者への移植に使用すべき異種器官の細胞、患者自身の細胞、および補体侵襲から保護すべき他の細胞、ならびに胚性幹細胞のような幹細胞に投与する。これらは、移植のためのトランスジェニック細胞、組織または器官を生成するのに使用することができる。あるいは、実施可能な場合には、標的細胞をプロデューサー細胞と同時培養することもできる。ビリオンの安定な保存およびその後の使用のために好適な緩衝液および条件は、例えば、Ausubel，et al.，1992に見い出すことができる。本発明のレトロウイルスベクター粒子を含有する医薬組成物は、様々な単位用量形態で投与することができる。用量は、例えば、特定のベクター、投与の仕方、治療する特定の疾患およびその重症度、患者の総合的健康状態および年齢、処置する細胞の状態、および医師の判断によって変化する。哺乳動物細胞の形質導入のための投薬レベルは、一般に、１処置あたり約１０⁶〜１０¹⁴コロニー形成単位のレトロウイルスベクター粒子の間である。本発明のレトロウイルスベクター粒子の投与には、様々な医薬製剤を用いることができる。好適な製剤は、例えば、「レミントンの医薬科学（Remington's Ph armaceutical Sciences）」、第１７版、Mack Publishing Company，Philadelph ia，PA(1985)に見い出され、生理食塩水、緩衝（例えば、リン酸緩衝）生理食塩水、ハンクス液、リンガー溶液、デキストロース／生理食塩水、ブドウ糖溶液のような医薬的に有効な担体、その他を含有する。製剤は、必要に応じて医薬的に許容可能な補助物質、例えば、浸透圧調整剤（tonicity adjusting agents）、湿潤剤、殺菌剤、保存剤、安定剤などを含有していてもよい。IV．トランスジェニック動物本発明のある側面に従って、本発明の核酸分子は、当技術分野で公知の技術を用いて細胞（例えば、内皮細胞）の表面に本発明のＴＭＴＣＩＰを発現する工学処理されたトランスジェニック動物（例えば、齧歯類、例えばマウス、ラット、キャピバラなど、ウサギ目、例えばウサギ、ノウサギなど、有蹄類、例えばブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど）を生成するのに用いられる。これらの技術としては、（例えば前核の）マイクロインジェクション、卵または接合子の電気穿孔法（エレクトロポレーション）、核移植、および／または選択した動物由来の胚性幹細胞の安定なトランスフェクションまたは形質導入が挙げられるが、それらに制限されない。これらの技術の共通の要素は、移入遺伝子（transgene）転写単位の調製に関する。このような単位は、一般に、１）プロモーター、２）目的の核酸配列、すなわち本発明のＴＭＴＣＩＰをコードする配列、および３）ポリアデニル化シグナル配列、を含むＤＮＡ分子を包含する。他の配列、例えば、エンハンサーおよびイントロン配列は、所望であれば含ませることができる。この単位は、ＴＭＴＣＩＰタンパクを（例えば哺乳動物細胞で）発現するプラスミドベクターの制限フラグメントを単離することにより好都合に調製することができる。好ましくは、制限フラグメントは、細菌宿主細胞で複製を指示する配列を含まない。これは、そのような配列が胚の生存率に対して悪影響を有することが知られているためである。トランスジェニック動物の作成のための最もよく知られた方法は、ドナー雌の排卵過度化、卵の外科的除去、胚の前核への移入遺伝子転写単位の注入、および通常は同じ種である偽妊娠宿主母の生殖管へのトランスジェニック胚の導入によって、トランスジェニックマウスを作成するのに用いられた方法である。 Wagnerの米国特許第４８７３１９１号；Brinster，et al.，1985; Hogan et al. ，1986; Robertson，1987; Pedersen，et al.，1990を参照されたい。トランスジェニック家畜を作成するためのこの方法の使用も、当業者により広く行われている。一例としては、トランスジェニックブタは、ブタ胚への移入遺伝子転写単位のマイクロインジェクションにより日常的に作成されている。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／１１７５７号を参照されたい。手短に述べると、この手順は、以下のように実施し得る。最初に、移入遺伝子転写単位をゲルで単離し、例えばＥＬＵＴＩＰカラム（Sc hleicher & Schuell，Keene，NH）を通して徹底的に精製して、発熱物質（パイロジェン）無含有注入緩衝液（パイロジェン無含有水中、１０mMトリス、pH７．４および０．１mMＥＤＴＡ）に対して透析し、胚注入に用いる。胚を、ホルモンにより同調させた、排卵誘発した雌の卵管から、好ましくは前核段階で回収する。これらを、約０．５mlの胚移入培地（１０％ウシ胎児血清を含むリン酸緩衝生理食塩水）を含有する１．５ml微量遠心管に入れる。これを、微量遠心機で１６０００×ｇで１２分間遠心分離する。先を細くして磨いたパスツールピペットで微量遠心管から胚を回収し、検査のために３５mmペトリ皿に入れる。前核が明確に見えないように細胞質が脂質でまだ不透明だったら、さらに１５分間、胚を再び遠心分離する。マイクロインジェクションに用いるべき胚を、１００mmペトリ皿の蓋の中央の１滴の培地（約１００μl）中に置く。シリコーン油を用いて、この１滴をおおい、培地が蒸発するのを防ぐために蓋を満たす。胚を含むペトリ皿の蓋を、加熱したステージ（３７．５〜３８℃）およびホフマンモジュレーションコントラスト部材（Hoffmann moduration contrast optic s）を装着した倒立顕微鏡（最終拡大率２００倍）の上に設置する。細く延ばして磨いたマイクロピペットを用いて胚を安定化しながら、別の細く延ばして磨いたマイクロピペットで、約２００〜５００コピーの精製された移入遺伝子転写単位を含有する約１〜２pl（ピコリットル）の注入緩衝液を、核、好ましくは雄性前核中に送り込む。形態学的観察により判断して、マイクロインジェクションの過程を生き残った胚を、レシピエントの偽妊娠ブタへの移入のためにポリプロピレン管（内径２mm）に入れる。子孫を、各仔ブタの尾から採った組織からゲノムＤＮＡを単離し、このゲノムＤＮＡ約５μgを、移入遺伝子特異的プローブを用いる核酸ハイブリダイゼーション解析に付すことによって、移入遺伝子の存在について試験する。トランスジェニック動物の作成のために一般に用いられる別の技術は、ＰＣＴ特許公報ＷＯ９３／０２１８８号およびRobertson，1987に記載されているように、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の遺伝子操作に関する。この技術に従えば、ＥＳ細胞は、例えば、Robertson，1987およびWilliams et al.に対する米国特許第５１６６０６５号に記載されているように生育させる。遺伝物質を、例えばMacMahon ，et al.，1990に従って、電気穿孔法などにより、または例えばRobertson，et al.，1986の方法に従って、レトロウイルスベクターでの形質導入により、またはLovell-Badge，1987に記載されている種々の技術のいずれかにより、胚性幹細胞中に導入する。キメラ動物は、例えば、Bradley，1987に記載のように生成する。手短に述べれば、遺伝的に改変したＥＳ細胞を胚盤胞に導入し、次に改変した胚盤胞を偽妊娠雌動物に移植する。キメラは、例えば、ＥＳ細胞の調製に用いた系統と胚盤胞の調製に用いた系統との差異によって生じるモザイク状の外皮の色を観察することにより、子孫から選択して、非キメラトランスジェニック動物を生成するために交配する。トランスジェニック動物の作成のための他の方法は、Wagner et al.に対する米国特許第５０３２４０７号およびＰＣＴ公報ＷＯ９０／０８８３２号に開示されている。他の応用の中で、本発明に従って調製したトランスジェニック動物は、その工学処理された組織または器官の異種移植の試験のためのモデル系として、そして、異種移植のための工学処理された組織または器官の供給源として有用である。トランスジェニック動物の組織または器官の内皮細胞および／または他のタイプの細胞（例えば、膵臓の小島中のもののようなホルモン産生細胞）の表面での機能的ＴＭＴＣＩＰの発現は、これらの細胞、組織および器官に対して、レシピエント動物、例えばＴＭＴＣＩＰのＬｙ−６最終ＣＩＰによりその補体を阻害し得るヒトのような動物における異種移植後の超急性補体媒介性拒絶反応からの、強化された保護を提供する。移植用の器官の生成における用途に加えて、本発明のＴＭＴＣＩＰ核酸構築体は、移植における後の使用のために種々の種の培養細胞（例えば、内皮細胞）を工学処理するためにも使用することができる。Ｖ．代表的な改変態様本発明の特定の態様を本明細書において記載し、説明するが、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、変更を加えることができることは理解されるべきである。例えば、本発明のＴＭＴＣＩＰの一次アミノ酸構造は、アミノ酸置換または核酸突然変異を作ることにより改変してもよい。そのような改変の後、少なくともいくらかの補体調節活性は保持されるはずである。同様に、アミノ酸配列を変えない核酸突然変異、例えば、縮重コドンの３番目のヌクレオチドの変化は、本発明の範囲内に包含される。ＴＭＴＣＩＰを作成するのに用いるＣＩＰおよびＴＭ遺伝子の天然の対立遺伝子変異体として見い出される変化を含む配列もまた、包含される。本発明を、いかなる形においても制限することを意図せずに、以下の実施例において、より十分に説明する。実施例１ＣＤ５９／ＭＣＰＴＭＴＣＩＰを包含するレトロウイルスビリオン粒子および発現ベクターＣＤ５９の膜貫通形態（ＣＤ５９−ＴＭ）は、本発明に従って、ＣＤ５９のＧＰＩアンカーシグナルを含むカルボキシル末端領域を、膜貫通ドメインを含む、ＭＣＰ（ＣＤ４６）のカルボキシル末端領域で置き換えることにより、構築した。上記の「トランケーション−Ａｓｎ」、すなわち成熟タンパクのアミノ酸７７で短縮したＣＤ５９を含む約３１４bpの制限フラグメント（以下、ＣＤ５９₇₇と呼ぶ）は、プラスミドｐＣＤ５９／ＣＣＰＨ（以下を参照されたい）をＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより調製した。ＣＤ４６のカルボキシル末端を、鋳型としてＨｅＬａ細胞逆転写ｍＲＮＡを用い、以下のプライマー：５′−ＣＧＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＴＴＡＣＡＡＧＣＣＴＣＣＡＧ−３′（配列番号９）および５′−ＣＧＣＧＣＴＡＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＣ−３′（配列番号１０）を用いてＰＣＲ増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは、以前に機能的膜貫通ドメインを含むことが示された領域である（Lublin，et al.，1991）、成熟ＣＤ４６タンパクのアミノ酸２７０〜３５０をコードするフラグメントを増幅した。このＰＣＲ反応により生成された約２５０bpのフラグメントを、Ｔ／Ａクローニングキット（Invi trogen，San Diego，CA）を用いてプラスミドベクター中にクローニングした。このキットに含まれていたｐＣＲＩＩプラスミドベクターをレシピエントとして役立て、結果として生じたプラスミド構築体を、E．coliで増幅し、精製した。次に、ＭＣＰインサートを配列決定して、プラスミドが配列番号１１に示す配列を含むことを確認した。ＣＤ４６のＰＣＲフラグメントの５′末端に見い出される内在性ＳｔｕＩ部位を利用して、このドメインを、真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen ，San Diego，CA）中のＣＤ５９₇₇の３′末端のＳｓｐＩ部位に連結し、プラスミドｐｃＤＮＡ／ＣＤ５９−ＭＣＰ−ＴＭ（ＡＴＣＣ命名：６９５３０）を作成した。得られた構築体をＥｃｏＲＩで直線化し、対を形成していない末端を充填して、生じた平滑末端にＢａｍＨＩリンカー（＃１０７１、New England Biolabs，T ozer，MA）を連結した。このリンカー付構築体をＢａｍＨＩで消化し、放出されたフラグメントを、レトロウイルスベクターｐＬＸＳＮ（Miller，et al.，1989 ）のＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、ｐＬ−ＣＤ５９−ＭＣＰ−ＴＭ−ＳＮを作成した。発現のための正しい向きを有する構築体を制限酵素解析によって同定し、配列決定により確認した。ＣＣＰＨ遺伝子のカルボキシル末端をコードするＤＮＡフラグメントを、鋳型としてプラスミドｐＫＳ−／ｍＣＣＰＨ（ＡＴＣＣ命名：６９１７８）を用い、以下のプライマー：５′−ＣＣＧＧＡＣＣＴＧＴＧＴＡＡＣＴＴＴＡＡＣＧＡＡＣＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＧＧＴＡＧＧＡＴＡＴＧＣＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＣＡＡＣ−３′（配列番号１２）および５′−ＴＡＧＴＴＡＣＴＧＣＣＣＧＧＡＣＡＴＧＣ−３′（配列番号１３）を用いてＰＣＲ増幅により調製した。ＭＣＰのＰＣＲフラグメントについて上述したように、約２５０bpのＣＣＰＨのＰＣＲ生成物をプラスミドｐＣＲＩＩにクローニングして、プラスミドｐＣＲＩＩ／ＣＣＰＨを作成し、ＣＣＰＨインサートを配列決定して、このプラスミドが所望の配列（この場合、配列番号１４）を含むことを確認した。次に、ｐＣＲＩＩ／ＣＣＰＨプラスミドをＡｖａIIおよびＥｃｏＲＩで消化し、インサートフラグメントを、精製して、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐｃＤＮＡ／ＡＭＰ（Invitrogen）と、ｐＵＣ１９中の全長ＣＤ５９ｃＤＮＡ構築体（Philbrick，et al.，1990）から単離した約３００bpのＢａｍＨＩ−ＡｖａIIフラグメントとを用いて、三方連結（three-way ligation）反応においてサブクローニングした。この三方連結の生成物を、本明細書中でプラスミドｐＣＤ５９／ＣＣＰＨと呼ぶ。このプラスミドを、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞にトランスフェクトし、細胞を、以下の実施例２に記載するように、間接免疫蛍光法によってＣＤ５９エピトープの細胞表面発現について検定した。上記で考察したように、ＣＣＰＨの推定ＴＭドメインは、第一の細胞質アミノ酸から５アミノ酸以内に、システインである２個の細胞質アミノ酸を含む。これは、低レベルの細胞表面発現をもたらすと信じられている特徴である。ＣＤ５９エピトープの細胞表面発現は、確かに間接免疫蛍光法で検出し得るレベルを下回っていた。対照ベクターＧＰＩアンカーシグナルを含む全長ＣＤ５９（ＣＤ５９−ＧＰＩ）を、プラスミドｐｃ８−ｈＣＤ５９−１０３（ＡＴＣＣ命名：６９２３１）から得られたＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化したｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）にクローニングし、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＣＤ５９−ＧＰＩを作成した。レトロウイルスベクタープラスミドｐＬ−ＣＤ５９−ＧＰＩ−ＳＮは、ｐＵＣ１９中の全長ＣＤ５９ｃＤＮＡ構築体（Philbrick，et al.，1990）からの約１１００bpのＥｃｏＲＩフラグメントを単離し、このフラグメントをプラスミドｐＬＸＳＮに連結することにより作成した。発現のための正しい向きを有する構築体は、制限酵素解析によって同定した。両栄養性（amphotropic）ウイルス作成両栄養性ウイルスは、Warren，et al.，1987に記載されたように、中間的なエコトロピック（ecotropic）パッケージング細胞株を通じて作成した。手短に述べると、ｐｓｉ２細胞（Stephen L．Warren博士，Department of Pathology，Ya le University School of Medicine，New Haven，CTから入手した）を、ＤＭＳＯショックと、それに続いての５００μg／ml（活性）Ｇ４１８および１０％熱非働化ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中での選択を用いて、ｐＬＸＳＮまたは上記のｐＬＸＳＮ構築体、すなわちｐＬ−ＣＤ５９−ＭＣＰ−ＴＭ−ＳＮもしくはｐＬ−ＣＤ５９−ＧＰＩ−ＳＮでトランスフェクトした。トランスフェクタントをプールして、９０％の集密度の細胞から２４時間上清を収穫した。このエコトロピックウイルス保存液（ストック）を、両栄養性パッケージング細胞株ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ命名：ＣＲＬ９０７８）を感染させるのに使用した。これらの細胞は、Ｇ４１８を含む同じ培地中でも選択し、その後、Ｇ４１８を含まない同じ培地中のプールしたトランスフェクタントからウイルスストックを集めた。実施例２哺乳動物細胞によるＣＤ５９／ＭＣＰＴＭＴＣＩＰの発現マウス繊維芽細胞株Ｂａｌｂ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ命名：ＣＣＬ１６３）の細胞を、ｐｃＤＮＡ３−ＣＤ５９−ＧＰＩ、ｐｃＤＮＡ３／ＣＤ５９−ＭＣＰ−ＴＭ、またはｐｃＤＮＡ３単独により、リン酸カルシウム法を用いて安定にトランスフェクトした（Ausubel，et al.，1992）。細胞を、１０％熱非働化ＦＣＳおよび５００μg／mlのＧ４１８（活性）を含有するＤＭＥＭ中で選択し、クローニングシリンダーを用いてコロニーを単離した。マウスＬ細胞は、Peter Cresswell博士，Immunobiology Department，Yale Un iversity School of Medicine，New Haven，CTから入手した。このようなマウスＬ細胞は、ＧＰＩアンカーを有するタンパク質を発現することができない（Ferg uson，et al.，1988）。Ｌ細胞を、ｐＬ−ＣＤ５９−ＧＰＩ−ＳＮ、ｐＬ−ＣＤ５９−ＭＣＰ−ＴＭ−ＳＮ、またはｐＬＸＳＮ単独を用いて得られた両栄養性ウイルス上清を用いて、ウイルスストック１mlを８μg／mlのポリブレンを含有する培地中の５×１０⁵個のＬ細胞に添加することにより形質導入した。一晩インキュベーションした後、５００μg／mlのＧ４１８を含有する培地を添加し、選択を１４日間続けた。形質導入されたＬ細胞は、プールとして選択し、解析した。Ｇ４１８耐性細胞を、モノクローナルおよびポリクローナル抗体調製物を用いて間接免疫蛍光法によって細胞表面のＣＤ５９抗原の存在について検定した。ウサギポリクローナル抗ＣＤ５９抗体調製物である＃３４９は、Sims，et al.，1989により記載されたようにヒト赤血球から精製したＣＤ５９をウサギに注射して作成されたものであり、Peter Sims博士（Blood Research Institute， Milwaukee，WI）から提供を受けた。抗ＣＤ５９モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるＭＥＭ−４３は、Biodesign International，Kennebunkport，MEから購入した。細胞表面間接免疫蛍光解析法は、典型的には、２％ウシ胎児血清を含有する１倍ＰＢＳ中の５０μg／mlの一次ポリクローナル抗体または２０μg／mlのモノクローナル抗体を用いて、２．５×１０⁵細胞について実施した。ヤギ抗ウサギＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧＦＩＴＣ結合（コンジュゲート化）抗血清を二次抗体として用いた（Zymed Laboratories，South San Francisco，CA）。蛍光は、ＦＡＣＳｏｒｔ機（Becton-Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose ，CA）を用いて測定した。図２は、ＣＤ５９−ＴＭを発現する陽性Ｂａｌｂ／３Ｔ３クローン、ならびに陽性対照としてネイティブなヒトＣＤ５９のトランスフェクタント（ＣＤ５９− ＧＰＩ）、および陰性対照としてインサートを含まないベクター（ｐｃＤＮＡ３）のトランスフェクタント（ベクター対照）の細胞表面発現プロフィールを示す。そこに示されるように、ネイティブなＣＤ５９を発現する陽性対照細胞に結合したのと実質的に同じ量の抗ＣＤ５９抗体が、ＣＤ５９−ＴＭ融合タンパクを発現する細胞の表面に結合した。この結果は、同等の量の抗原が、本発明のＢａｌｂ／３Ｔ３細胞上（ＣＤ５９−ＴＭ）および陽性対照細胞上（ＣＤ５９−ＧＰＩ）に存在することを示す。プールしたＬ細胞トランスフェクタントは、ＧＰＩアンカーを有するタンパク質を発現できない細胞に予期されたように、ＣＤ５９−ＧＰＩは発現されなかったのに対し、広い範囲のＣＤ５９−ＴＭの発現を示した（図３）。実施例３哺乳動物細胞で発現されるＴＭＴＣＩＰはホスファチジルイノシトール−ホスホリパーゼＣ消化に影響されないＧＰＩアンカーの存在について試験するために、ＦＡＣＳ解析に先立って、細胞を、１U／mlのホスファチジルイノシトール−ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ、Boehringer-Mannheim Corporation，Biomedical Products Division，India napolis，Indiana）で、３７℃で１時間処理した。この処理は、ＧＰＩアンカーを加水分解（切断）し、それにより細胞表面からＧＰＩアンカーを有するタンパク質を遊離させる。ＰＩ−ＰＬＣ消化は、ＣＤ５９−ＴＭＴＭＴＣＩＰ（または対照としてＣＤ５９−ＧＰＩ）を発現するＢａｌｂ／３Ｔ３細胞に行った。これらの実験の結果を図４に示す。これらの実験においては、疑似（モック）処理した細胞（ＰＩ−ＰＬＣなし）は、ＴＭＴＣＩＰおよびネイティブなＣＤ５９をその細胞表面上に保持していた（図４Ａおよび図４Ｂの曲線Ｄを参照されたい）のに対し、ＰＩ−ＰＬＣ処理は、ネイティブなＣＤ５９対照細胞では細胞表面ＣＩＰの喪失をもたらしたが（図４Ａの曲線Ｃを参照されたい）、ＣＤ５９−ＴＭ細胞ではもたらさなかった（図４Ｂの曲線Ｃを参照されたい）。これらの実験は、ＣＤ５９−ＴＭはＧＰＩ連鎖を通じて細胞表面につながれていないこと、およびＣＤ５９−ＴＭはグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを切断し得るリパーゼ酵素の作用に対して実質的に抵抗性であることを明らかにする。実施例４マウス細胞におけるＣＤ５９−ＴＭの機能解析トランスフェクトしたマウスＢａｌｂ／３Ｔ３細胞および形質導入したマウスＬ細胞において発現されたＴＭＴＣＩＰ分子の機能的活性を、色素放出検定によって評価した。この検定は、細胞質からの分子、特に細胞質指示薬色素、カルセイン（Calcein）ＡＭ（Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon）の流出を測定することからなっている。ＣＤ５９−ＴＭＴＭＴＣＩＰを発現するトランスフェクトした細胞、ならびに（対照として）ＣＤ５９−ＴＭをコードするインサートを持たない親発現ベクターでトランスフェクトした細胞を、９６ウェルプレートで集密状態（コンフルエントの状態）まで生育させた。１０mg／mlウシ血清アルブミンを含有するハンクス液（ＨＢＳＳ／ＢＳＡ）２００μlで、細胞を２回洗浄した。カルセインＡＭを添加し（最終１０μM）、プレートを３７℃で３０分間インキュベートして、色素が、細胞に内在化され、細胞のエステラーゼにより、損傷していない細胞の内側に保持される極性蛍光性誘導体に変換されるようにした。次に、ウェルをＨＢＳＳ／ＢＳＡで２回洗浄して、細胞の外側に残っている色素を除去した。次いで、細胞を、古典的補体経路の活性剤として役立つ抗Ｂａｌｂ／３Ｔ３ＩｇＧ（ＨＢＳＳ／ＢＳＡ中、２mg／ml）とともにインキュベートした。２３℃で３０分間のインキュベーションの後、結合していないＩｇＧを洗い落とした。細胞を、次に精製Ｃ８およびＣ９を加えたヒトＣ８欠損血清の存在下で３７℃ で３０分間インキュベートし、補体媒介性損傷が起こるのを可能にした。ヒトＣ８破壊血清ならびに精製Ｃ８およびＣ９は、Quidel Corporation，San Diego，C Aから入手した。次いで、蛍光測定のために、細胞を浸す培地を清浄な９６ウェルプレートに移した。この検定の条件下では、カルセインＡＭの蛍光性極性誘導体は、細胞膜の完全性が損なわれている場合、試験細胞を浸す培地中に放出されるのみである。したがって、試験細胞を浸す培地中へ放出されたカルセインＡＭの蛍光に対する細胞に保持されたそれは、細胞が受けた補体媒介性損傷のレベルの、間接的ではあるが正確な測定値を提供する。残っている細胞付随色素は、９６ウェル培養プレート中に保持された細胞の１％ＳＤＳ溶解物（ライセート）から決定した。これは、以下の式を用いて色素放出（％）を算出することを可能にした：総量＝放出量＋保持量、および放出（％）＝（放出量／総量）×１００。蛍光は、ミリポア（ Millipore）ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ２３５０蛍光プレートリーダー（４９０nm励起、５３０nm放射）を用いて測定した。色素放出検定により、同等のレベルのＣＤ５９−ＧＰＩまたはＣＤ５９−ＴＭを発現するトランスフェクトしたＢａｌｂ／３Ｔ３クローンについては（図２）、ＣＤ５９−ＴＭは、ネイティブなＧＰＩアンカーを有するＣＤ５９− ＧＰＩ分子により付与されるのと同等のレベルの、補体侵襲からの保護を提供したことが示された（図５）。特に、これらの分子のいずれかを発現する細胞は、２．５μg／mlのＣ８／Ｃ９での補体媒介性溶解の防止において、ｐｃＤＮＡ３ベクターでトランスフェクトした細胞（これは直ちに溶解した）よりも約３倍、より効果的であった。これらの結果は、１）ＣＤ５９−ＴＭは、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞の表面で安定に発現され得ること、および２）このキメラ分子は、ネイティブなＣＤ５９に匹敵する機能を有することを明らかにする。ＣＤ５９−ＴＭによる野生型レベルの補体調節活性の保持は、それがＴＭドメインの付加に付随する短縮によってＣＤ５９分子の機能性が実質的に変えられないことを示す点において、非常に重要である。この結果は、前もって予測し得なかったものである。これは、特に、ＣＤ５９分子の他の変更、例えばＴＭドメインの付加を伴わないカルボキシル末端の短縮、または単一のアミノ酸の変更が、実質的に変化した発現および／または機能性を有する分子を生み出すことが示されていたためである。例えば、Nakano， et al.，1993; Norris，et al.，1993;およびPetranka，et al.，1993を参照されたい。色素放出検定は、ｐＬ−ＣＤ５９−ＭＣＰ−ＴＭ−ＳＮベクター、ｐＬ−ＣＤ５９−ＧＰＩ−ＳＮベクター、またはインサートなしのｐＬＸＳＮベクターを用いて生成したレトロウイルスビリオン粒子で形質導入したマウスＬ細胞についても行った。これらの実験の結果を図６に示す。ｐＬ−ＣＤ５９−ＭＣＰ−ＴＭ− ＳＮを用いて生成したレトロウイルス粒子で形質導入したＬ細胞のみが、補体侵襲に対する実質的な保護を証明した。これらの結果は、キメラＣＤ５９−ＴＭ分子はＧＰＩアンカーを有するタンパク質を発現することができない細胞株において成功裡に発現されうること、およびこの分子は補体による溶解から細胞を保護するように機能することを明らかにする。上述の結果は、ＣＤ５９が、ＧＰＩアンカーではなく、非相同膜貫通ドメインによって細胞膜につながれている場合に、Ｌｙ−６最終補体インヒビター活性を保持していることを示す。この基本的な結果は、すべての既知のＬｙ−６最終補体インヒビタータンパクの保存された性質（米国特許第０８／１０５７３５号およびＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００６７７２号を参照されたい）との組み合わせにより、非相同膜貫通ドメインは、Ｌｙ−６最終補体インヒビタータンパクのＧＰＩシグナル配列を、このタンパクの補体阻害活性を実質的に変えることなく置換しうることを示す。ネイティブなＬｙ−６最終ＣＩＰを用いることと比較して、本発明のＴＭＴＣＩＰは、ネイティブなＬｙ−６最終ＣＩＰのＧＰＩアンカーの存在に依存するタイプの細胞活性化を生じ得ないこと、およびホスホリパーゼ酵素の作用により細胞表面から除去され得ず、ベシクル離脱を受けにくいこと、という利点を有する。これらの利点により、本発明のＴＭＴＣＩＰは、異種器官の移植の容易化を含む、種々の医学的応用に、ネイティブなＬｙ−６最終ＣＩＰよりも好適である。本発明の、好ましい、またはその他の態様を本明細書において記載したが、様々な改変態様を含む他の態様を、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者は看取し、実施することができる。例えば、本発明の融合タンパクの一次アミノ酸構造は、アミノ酸突然変異体を作り出すことにより改変してもよい。このような突然変異体は、親の最終ＣＩＰの補体調節活性の５０％を越える活性を保持するべきである。他の改変および変異としては、他のタンパク質またはポリペプチドとのタンパク質またはそのフラグメントの共有結合または凝集コンジュゲートを含む融合タンパクの誘導体の形成が挙げられる。後記のクレーム（請求の範囲）は、本明細書に記載の具体的な態様ならびにこのような改変体、変異体および等価物をカバーすることを意図するものである。この出願を通じて、種々の刊行物、特許および特許出願が引用されている。これらの刊行物、特許および特許出願の教示および開示全体は、本発明が属する技術水準をより十分に説明するために、参照により本出願に包含される。寄託物上述のプラスミドｐｃＤＮＡ３／ＣＤ５９−ＭＣＰ−ＴＭ、ｐｃ８−ｈＣＤ５９−１０３、およびｐＫＳ−／ｍＣＣＰＨは、E．coli中で米国American Type C ulture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland，20852に寄託され、各々６９５３０、６９２３１、および６９１７８と命名されている。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（1977）に基づいて行った。ＡＴＣＣ受託番号６９５３０、６９２３１、および６９１７８を有する上記の寄託は、各々１９９４年１月６日、１９９３年１月２９日、および１９９３年１月６日に行った。寄託物第６９５３０号は、Escherichia coli株ＴＯＰ１０Ｆ′ 中に作成されたものであり、これは以下の遺伝子型を有する：F′｛lacI^qTN10(T et^R)｝mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15 ΔlacX74deoR recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(Str^R)endA1nupG 寄託物第６９２３１号および第６９１７８号は、Escherichia coli株ＤＨ５α中に作成されたものであり、これは以下の遺伝子型を有する： F^-φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsd17(r_k-,m_k+)supE44 λ thi-1 gyrA96 relA1

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 9356−4ＨＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 9356−4Ｈ 14/81 14/81 9356−4Ｈ 19/00 19/00 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＢ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者スクウィント、ステファン・ピーアメリカ合衆国、コネチカット州 06524、ベサニー、コーチマンズ・レーン 16

Claims

【特許請求の範囲】１．以下のもの： (a) (i)親最終補体インヒビタータンパクの部分であって、完全なＬｙ−６モチーフを含み、かつグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの付着を指示する作動可能なシグナル配列を含まない部分を包含する、第一のポリペプチド領域、および(ii)非相同タンパクからの膜貫通ドメインを含む、第一のポリペプチド領域に連結された第二のポリペプチド領域；または (b) (a)に相補的な配列；または (c) (a)および(b)の両方を含み、(a)、(b)または(c)を含まない核酸分子を実質的に包含しない核酸分子。２．上記キメラタンパクが、親最終補体インヒビタータンパクの補体阻害活性の５０％を越える活性を有する、請求項１記載の核酸分子。３．上記親最終補体インヒビタータンパクの部分が、そのＬｙ−６モチーフの下流のアミノ酸残基を除いたそのタンパクを含む、請求項１記載の核酸分子。４．上記キメラタンパクが、ヒト補体に対する補体阻害活性を有する、請求項１記載の核酸分子。５．そのベクターを含む宿主が上記キメラタンパクを発現するよう、第二の核酸分子に作動可能に連結された請求項１記載の核酸分子を含む核酸ベクター。６．請求項４記載のベクターを含む組換え宿主。７．ヒト補体侵襲から非ヒト器官を保護する方法であって、請求項４記載の核酸分子を、非ヒトトランスジェニック動物を生成することができる多能性細胞に導入する工程、および上記細胞から非ヒトトランスジェニック動物を生成する工程を含み、それによりヒト補体侵襲に対する上記非ヒトトランスジェニック動物の器官の抵抗性を強化することを特徴とする方法。８．請求項７記載のトランスジェニック動物から単離された細胞。９．以下のもの： (i) 親最終補体インヒビタータンパクの部分であって、完全なＬｙ−６モチーフを含み、かつグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの付着を指示する作動可能なシグナル配列を含まない部分を包含する、第一のポリペプチド領域、および (ii) 非相同タンパクからの膜貫通ドメインを含む、第一のポリペプチド領域に連結された第二のポリペプチド領域を含むキメラタンパク。 10．親最終補体インヒビタータンパクの補体阻害活性の５０％を越える活性を有する、請求項９記載のキメラタンパク。 11．上記親最終補体インヒビタータンパクの部分が、そのＬｙ−６モチーフの下流のアミノ酸残基を除いたそのタンパクを含む、請求項９記載のキメラタンパク。 12．ヒト補体に対する補体阻害活性を有する、請求項９記載のキメラタンパク。 13．グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを切断しうるリパーゼ酵素の作用に対して実質的に抵抗性である膜結合型最終補体インヒビタータンパク。 14．Ｌｙ−６モチーフを含む、請求項１３記載の膜結合型最終補体インヒビタータンパク。