JPH09275987A

JPH09275987A - コードされたアルカリリパーゼ遺伝子のｄｎａ断片、及びこの酵素出現をコントロールするｄｎａ断片

Info

Publication number: JPH09275987A
Application number: JP8119638A
Authority: JP
Inventors: Junfu Rin; 林順富; Kenmei Kyu; 邱建銘; Kosho So; 荘光祥
Original assignee: DAIDO KOFUN YUUGENKOUSHI; Tatung Co Ltd
Current assignee: DAIDO KOFUN YUUGENKOUSHI; Tatung Co Ltd
Priority date: 1996-02-26
Filing date: 1996-04-17
Publication date: 1997-10-28
Also published as: US5766913A

Abstract

(57)【要約】【課題】コードされたアルカリリパーゼ遺伝子のＤＮ
Ａ断片、及びこの酵素出現をコントロールするＤＮＡ断
片を提供する。【解決手段】疑似性単細胞菌属Ｆ−１１１（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓＰｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
Ｆ−１１１）のコードされたアルカリリパーゼ遺伝子
のＤＮＡ断片である。それは５´ターミナルコントロー
ル区、分泌信号配列を含むコードされたアルカリリパー
ゼ遺伝子ＤＮＡ断片、及びこの酵素の出現をコントロー
ルするＤＮＡ断片である。またこのＤＮＡ断片の使用方
法をも示している。このＤＮＡ断片を用い、大腸菌中に
このアルカリリパーゼを出現させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はアルカリリパーゼの
製造方法に関するものである。この方法を用いた新型微
生物、及びこの方法を用いて製造された新型微生物のＤ
ＮＡ断片である。

【０００２】

【従来の技術】リパーゼは一般生物体の重要な代謝酵素
で、脂肪を加水分解し、遊離脂肪酸を生産することがで
きる。ここ数年、リパーゼは脂肪を分解できるばかりで
なく、多くの多様な反応を行うことが次々と発見されて
いる。リパーゼは有機溶剤中ではさらに安定し、驚くべ
きは１００℃以下で反応することができ、しかも多様な
反応を行うことができる。この多くの革命的な研究の発
展は製薬、油脂、香料、化学、農薬、食品等工業会の注
目を広く集めている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】アルカリリパーゼを住
宅用洗剤中に添加しようという試みは、また一つの応用
の方向である。住宅用洗剤中への酵素の添加について
は、早くからアルカリプロテアーゼの添加が行われてお
り、広く流行している。数年前セルラーゼを添加した商
品が衣料用洗剤革命を引き起こした。またアルカリリパ
ーゼ酵素を利用し衣服上の油汚れを除去し洗浄力を高め
た。これは、また一つの工業用途である。［Ｓａｔｓｕ
ｋｉ，Ｔ．，ｅｔａｌ（１９９０）Ｂｉｏ．Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｙ，７：５０１］

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明使用の菌株は疑似
性単細胞菌属Ｆ−１１１（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＰｓ
ｅｕｄｏａｌｃ−ａｌｉｇｅｎｅｓＦ−１１１）であ
る。その寄託番号はＣＣＲＣ９１０００８（中華民国
食品工業発展研究所、微生物寄託センター）である。本
発明はコードされたアルカリリパーゼ遺伝子の塩基配
列、及びコードされたアルカリリパーゼ遺伝子の出現を
コントロールする塩基配列を含む疑似性単細胞菌属Ｆ−
１１１染色体のＤＮＡ断片の採取に関するものである。
本発明は、アルカリリパーゼを製造するために上述のＤ
ＮＡ断片を利用する方法に関するものである。

【０００５】（ａ）疑似性単細胞菌属Ｆ−１１１から染
色体ＤＮＡを分離する。（ｂ）制限酵素Ｓａｕ３Ａを用いて疑似性単細胞菌属
Ｆ−１１１の染色体ＤＮＡを部分消化し、コードされた
アルカリリパーゼ遺伝子配列、及びコードされたアルカ
リリパーゼ遺伝子出現をコントロールする塩基配列のＤ
ＮＡ断片を得る。（ｃ）担体を得るため、大腸菌体中に出現するプラスミ
ド（例えばｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋１））に当該ＤＮＡ断
片を移植する。（ｄ）当該出現した形質転換担体を大腸菌中に移植す
る。（ｅ）当該形質転換大腸菌を培養する。（ｆ）アルカリリパーゼを分離する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明は疑似性単細胞菌属Ｆ−１
１１染色体のＤＮＡ断片からコードされたアルカリリパ
ーゼ遺伝子の塩基配列、及びコードされたアルカリリパ
ーゼ遺伝子出現をコントロールする塩基配列を得るもの
である。当該ＤＮＡ断片の塩基配列は図１の通りであ
る。それが含むコードされたアルカリリパーゼ遺伝子の
塩基配列（ＬＩＰＡと命名）は図４乃至図５の通りで
あり、コードされたアルカリリパーゼ遺伝子出現をコン
トロールする塩基配列（ＬＩＰＢと命名）は図６乃至
図７の通りである。

【０００７】（１）遺伝子クローニングの方法本遺伝子クローニング実験の方法については、図９を参
照されたし。ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＰｓｅｕｄｏａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓＦ−１１１の染色体ＤＮＡをＳ
ａｕ３Ａを用いて部分切断し、さらに大腸菌宿主中に
於いてｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋１）プラスミドを用いて散
弾式クローニングを行う。トリブチンリン（ｔｒｉｂｕ
ｔｙｒｉｎ）寒天培地に於いて培養し、コードされたア
ルカリリパーゼ遺伝子の塩基配列を出現させることがで
きる形質転換株を選抜する

【０００８】（２）遺伝子のクローニングこのＤＮＡの挿入に適したプラスミドは、大腸菌から得
られるｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋１）［Ｐｒｏｍｅｇａ，
Ｕ．Ｓ．Ａ．］、ｐＢＲ３２２［Ｇｅｎｅ，２：９５
（１９７７）］、ｐＢＲ３２５［Ｇｅｎｅ，４：１２１
（１９７８）］、及びｐＵＣ１３［Ｇｅｎｅ，１９：２
５９，（１９８２）］である。また宿主内に於いて複
製、及び維持可能なその他のあらゆるプラスミドも使用
可能である。このＤＮＡをプラスミドに挿入する方法
は、例えばＭｉｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，第２３９ペ
ージ（１９８２）で述べられている。大腸菌を使用する
実例は、例えば大腸菌ＤＨ１０Ｂ［Ｌｏｒｏｗ，Ｄ．，
ａｎｄＪｅｓｓｅｅ，Ｊ．，（１９９０）ＦＯＣＵ
Ｓ，１２：１９］、ＨＢ１０１［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，４１，４５９（１９６９）］、Ｋ１２，ＤＨ１
［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．
Ａ．，６０，１６０（１９６８）］である。プラスミド
を用い宿主に形質転換を起こさせる方法は、例えばＭｉ
ｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、第２３９ページ（１９８
２）で述べられている塩化カルシウム法、或いは塩化カ
ルシウム／塩化ルビジウムを用いる方法がある。上述の
方法によりコードされたアルカリリパーゼＤＮＡのＰｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓＰｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓＦ−１１１の遺伝子ライブラリーが得られる。必
要、或いは適当であれば、このクローニングを経たコー
ドされたアルカリリパーゼＤＮＡは、引き続きｐＢＲ３
２２、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１
９のプラスミド内でクローニングを行うことができる。

【０００９】（３）コードされたアルカリリパーゼ遺伝
子のスクリーニング酵素活性を使用し、アルカリリパーゼ遺伝子の出現を直
接観察する。ｔｒｉｂｕｔｙｒｉｎを含む寒天培地（１
％ｔｒｉｂｕｔｙｒｉｎ、１％Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔ
ｏｎｅ、０．５％イースト抽出物、０．５％塩化ナト
リウム、０．００５％ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎをブレン
ダーで攪拌し均一に乳化させた）中に入れ、透明リング
を作る菌株得た。或いは疑似性単細胞菌属Ｆ−１１１
（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＰｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓＦ−１１１）が生み出すアルカリリパーゼ
のアミノ酸配列に基づき、化学合成したオリゴヌクレオ
タイド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を用いてコ
ロニー混成法を試みた。

【００１０】（４）ｐＣＫＨ４プラスミド及びそのサブ
クローン体のアルカリリパーゼ遺伝子に対する出現コードされたアルカリリパーゼ遺伝子のｐＣＫＨ４プラ
スミドに於ける位置を知るため、脱離テスト、及び共形
質転換作用（ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用
い、表１が示すように、このコードされたアルカリリパ
ーゼ遺伝子の出現にはもう一つのコントロールＤＮＡ断
片の協力が必要なことがわかった。この種の反相コント
ロール現象（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ）は、多くのＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属生産のアルカリリパーゼ［Ｊａ
ｎｅＧｉｌｂｅｒｔ，Ｅ．，（１９９３）Ｅｎｚｙｍ
ｅＭｉｃｒｉｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：６３４］
中に存在する。このコードされたアルカリリパーゼ遺伝
子の出現をコントロールする塩基配列は、およそ１．５
から２．９Ｋｂｐの間に位置する。

【００１１】

【表１】 B:BamHI,C:CLaI,E:EcoRI,ER:EcoRV,H:HindIV,P:PstI, S:SphI,Sa:SacI,X:XbaI.

【００１２】（５）コードされたアルカリリパーゼの塩
基配列の確定ｄｉｄｅｏｘｙｓｅｇｕｅｎｃｉｎｇ法［Ｓａｎｇｅ
ｒ，Ｆ．，Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．，ａｎｄＣｏｕｌｓ
ｏｎ，Ａ．Ｒ．，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．ＳｃＩ．，７４：５４６３．］により得られたＤ
ＮＡは２９１０塩基ペア配列を示している。そしてこの
塩基配列は、公知のアルカリリパーゼのアミノ酸配列と
比較したところ、存在しているコードされたアルカリリ
パーゼ遺伝子は、完全にＯＲＦ（ｏｐｅｎｒｅａｄｉ
ｎｇｆｒａｍｅ）配列で、アミノ酸を組成する３３８
個のタンパク質に転換できるＬｉｐＡ（４１３から１
４２６ｂｐｓ）であることが実証された。タンパク質の
Ｎターミナル配列と控除分泌信号配列を比較したとこ
ろ、完全に成熟したアルカリリパーゼ配列はＦ−Ｌ−Ｆ
−Ｇ−Ｓ−Ｓで始まる２９０個のアミノ酸配列であるこ
とがわかった。またその計算された分子量は、３０，８
２６Ｄａｌｔｏｎで、実際にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
測定した酵素分子量３２，０００Ｄａｌｔｏｎと近似
している。下記に示す実施例１で得られるコードされた
アルカリリパーゼのＤＮＡは、本発明コードされたアル
カリリパーゼのＤＮＡ断片の典型的実例である。その制
限酵素による切断図は図８の通りである。

【００１３】（６）コードされたアルカリリパーゼ遺伝
子出現をコントロールする塩基配列の確定実施例３の形質転換株の酵素活性に対する結果により、
このコードされたアルカリリパーゼ遺伝子が出現するに
はもう一つのＤＮＡ断片の協力が必要であることがわか
った。実施例３（表１）によれば、このコードされたア
ルカリリパーゼ遺伝子の配列は１．５２．９Ｋｂｐの間
である。またアルカリリパーゼ出現をコントロールする
遺伝子の塩基配列はＬＩＰＢ（１４６９−２４９１
ｂｐ）で、３４０個のアミノ酸組成のタンパク質に転換
することができる。

【００１４】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説
明する。［実施例１］疑似単細胞菌属Ｆ−１１１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ＰｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓＦ−１１１）染
色体ＤＮＡの分離ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＰｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓをＬＢ液体培養地４００ｍｌの１１三角瓶中
に於いて３７℃、２４時間振とう培養し、次いで遠心分
離（４℃、６０００ｒｐｍ、３０分）を行い細胞の沈殿
を得た。菌体を抽出し緩衝液（３６ｍｌ、ＴＥ、ｐＨ
８）に懸濁し、細胞を分散させた後、最終濃度１ｍｇ／
ｍｌのタンパク溶菌酵素（ｐｒｐｔｅｉｄｉｎ）に入れ
３７℃で、ゆっくりと３０分振とうした。その後、濃度
１％のＳＤＳに入れ６０℃で３０分軽く回転混合し、同
体積のフェノール、及びクロロフォルム（体積比１：
１）に入れ６０分ゆっくりと回転混合し、２０分遠心分
離（９０００ｒｐｍ）し、水溶のＤＮＡを抽出した。３
回この方法を繰り返した後、体積１／１０の３Ｍ酢酸カ
リウム、及び体積２倍の冷却エタノールをＤＮＡに加え
ＤＮＡを沈殿させた。次に遠心分離により沈殿したＤＮ
Ａを収集し、さらに７０％のエタノールで洗浄し、真空
乾燥後、２ｍｌの蒸留水に加えＤＮＡを溶解させ、−２
０℃で保存した。

【００１５】［実施例２］コードされたアルカリリパーゼ遺伝子のクローニング（Ａ）遺伝子ライブラリーの整備（ａ）制限リパーゼＳａｕ３ＡＩを用いてＰｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓＰｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓＦ
−１１１の染色体ＤＮＡを部分消化する実施例１で分離したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＰｓｅｕ
ｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓＦ−１１１の染色体ＤＮＡ
を３３ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅを含む緩衝液
（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、６６ｍＭ
酢酸カリウム、０．５ｍＭｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔ
ｏｌ、１０ｕｇ染色体ＤＮＡ、及び１．２単位活性のＳ
ａｕ３Ａを総体積２００ｕｌの反応システム内で３７℃
で２０分反応させる。続いてフェノールクロロフォルム
処理を行い、反応混合物からタンパク質を除去し、体積
２倍のエタノールを加え消化されたＤＮＡを回収した。

【００１６】（ｂ）制限リパーゼＢａｍＨＩを用いてｐ
ＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）担体ＤＮＡを消化するｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）担体ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｕ.Ｓ.Ａ）とクロロフォルム１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ緩衝液（ｐＨ８.０）、５ｍＭ塩化マグネシウム、１
００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオトレイトル、１
ｕｇ染色体ＤＮＡ、活性ＢａｍＨＩを体積２０ｕｌの反
応システム内に於いて３７℃で２時間反応させ、フェノ
ールクロロフォルムにより処理し、タンパク質を除去し
た。続いて、体積２倍のエタノールを加え消化されたＤ
ＮＡを回収した。

【００１７】（ｃ）連接及び形質転換上述（ａ）により得られた染色体ＤＮＡ５００ｎｇと、
上述（ｂ）により得られたｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）担体
ＤＮＡ１００ｎｇを合わせ、６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ
を含む緩衝液（ｐＨ７．９）、５ｍＭ塩化マグネシウ
ム、１ｍＭジチオトレイトルｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉ
ｔｏｌ、１ｍＭＡＴＰ、及び１単位の活性Ｔ４ＤＮ
Ａｌｉｇａｓｅを総体積２０ｕｌの反応システム内に
於いて４℃で１夜混合反応させた。続いて、Ｍａｎｄｅ
ｌ等の塩化カルシウムによる［Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．，ａ
ｎｄＨｉｇａ，Ａ．１９７０，Ｊ．Ｍｉｏｌ．，
５３：１５９］処理後、ＤＨ１０Ｂ大腸菌中に入
れ、Ｘ−ｇａｌ及びａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含むＬＢ培
地に塗布し、白色菌斑の単一菌株を得た。最終的には約
２００株の形質転換株を得た。

【００１８】（Ｂ）コードされたアルカリリパーゼ遺伝
子のスクリーニング上述の２０００株余りの形質転換株をようじを用いてｔ
ｒｉｂｕｔｙｒｉｎを含む寒天培地（１％ｔｒｉｂｕｔ
ｙｒｉｎ、１％Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５
％イースト抽出物、０．５％塩化ナトリウム、０．０
０５％ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎをブレンダーで攪拌し均
一に乳化させた）中に移植しスクリーニングを行い、透
明リングを作る菌株得た。１０株余りの活性を具えた形
質転換株を得た後、純化、クローニングを経て、その内
の一株にＴＩＴ−７形質転換株と命名した。図１０のよ
うに、それはｔｒｉｂｕｔｙｒｉｎスクリーニング寒天
培地上ではっきりした透明のリングを見せており、コー
ドされたアルカリリパーゼの遺伝子を含んでいる。

【００１９】Ｂｉｒｎｂｏｉｍ等［Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，
Ｈ．Ｃ．，ａｎｄＤｏｌｙ，Ｊ．，１９７９，Ｎｕｃ
ｌｅｉＡｃｉｄＲｅｓ．，７：７１５．］による方
法を用い、ＴＩＴ−７形質転換株のプラスミドＤＮＡを
採取した。その結果、採取されたプラスミドＤＮＡの寒
天培地上に出現したサイズは７．２Ｋｂｐで、ｐＧＥ
Ｍ−３Ｚｆ（＋）担体ＤＮＡのサイズ３．２Ｋｂｐを
除き、その内ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）担体の染色体ＤＮ
Ａに挿入されたサイズは４．０Ｋｂｐで、そのサイズ
により、ＴＩＴ−７形質転換株から得られたプラスミド
をｐＣＫＨ４と命名した。

【００２０】［実施例３］形質転換株出現のコントロールこのヌクレオタイド（ｎｕｎｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列を
見極めるために、ｐＣＫＨ４プラスミドの配列表に基づ
き各断片のサブクローニングを行い、異なる制限の元で
リパーゼを処理後、１０種の異なるサブクローン株を得
た。ｔｒｉｂｕｔｙｒｉｎ培地に於ける生長を観察し酵
素活性を比較した所、結果は図１乃至図３のようであっ
た。ｐＣＫＨ−ＥＥ３．９プラスミドが活性を示す他
は、他のプラスミドには活性は見られなかった。その原
因は、この遺伝子が活性を示すには他のタンパク質の手
助けが必要であるためと推測される。他のサブクローン
プラスミドを混合しＨＢ１０Ｄ宿主に加え共形質転換
を進めた時の、ｐＣＫＨ−ＰＥ２．７、及びｐＣＫＨ−
ＸＣ１．７等のプラスミドの共形質転換の結果により、
このコントロール遺伝子は１．３Ｋｂｐの後に位置して
いるらしいことが示された。さらにｐＣＫＨ−ＸＣ１．
７、及びｐＣＫＨ−ＣＳａ２．３プラスミドの共形質転
換の結果により、このコントロール遺伝子は１．７Ｋｂ
ｐの前に位置しているらしいことが示された。さらにｐ
ＣＫＨ−ＸＣ１．７、及びｐＣＫＨ−ＨＥＲ２．５プラ
スミドの共形質転換の結果により、このコントロール遺
伝子は１．５Ｋｂｐの後に位置しているらしいことが示
された。さらにｐＣＫＨ−ＳＳ２．２、及びｐＣＫＨ−
ＸＣ１．７プラスミドの共形質転換の結果により、この
コントロール遺伝子は２．９Ｋｂｐの後に位置している
らしいことが示された。

【００２１】［実施例４］コードされたアルカリリパーゼ遺伝子の塩基配列の確定ｐＣＫＨ４のサブクローン株はｄｉｄｅｏｘｙｓｅｇ
ｕｅｎｃｉｎｇ法［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｎｉｃｋｌｅ
ｎ，Ｓ．，ａｎｄＣｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．，１９７
９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７
４：５４６３．］により、ＤＮＡを抽出しＤＮＡ挿入部
分の配列を確定した。全長４０００個のヌクレオタイド
（ｎｕｎｃｌｅｏｔｉｄｅ）中、２個のＯＲＦがそれぞ
れ４１３と１４２９ｂｐ（ＬＩＰＡ）間、及び１４６
９と２４９１ｂｐ（ＬＩＰＢ）間に位置するのを含む
２９１０個のヌクレオタイド（ｎｕｎｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ）の配列が確定された。さらにこの２個のＯＲＦの距
離はわずか４１塩基ペアのみで、ＥｃｏＲＶ制限酵素の
切断位置（ＧＡＴＡＴＣ）は、この塩基配列５´ターミ
ナルの部分アミノ酸配列に位置しており、純化アルカリ
リパーゼＮターミナルの２０個前のアミノ酸配列：Ｐｈ
ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙと一致する。完成したＬＩＰＡ
の遺伝子のそのイニシエイターは、（１）ＴＡＡＴＴＧ
ＧＴＣＡＣＴＴＴＴＣＡＧＣＣ［Ｄｅｒｅｔｉｃ
Ｖ．，ｅｔａｌ（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ７：１２４９．］、及びＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇ
ａｒｎｏ配列のような５´ターミナルコントロール配
列、（２）４８個のアミノ酸のペプチド［Ｖ．Ｈｅｉ
ｊｎｅ，Ｇ．Ｖ．，（１９８６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓＲｅｓ．，１４：４６８３．］である分泌信
号配列、（３）構造遺伝子を含んでいる。このコードを
含むアルカリリパーゼのＤＮＡ配列もまた、リパーゼの
共通の活性センターＧ−Ｈ−Ｓ−Ｈ−Ｇ［Ｗｉｎｋｌｅ
ｒ，Ｆ．Ｋ．，ｅｔａｌ，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，
３４３：７７１］を含んでいる。

【００２２】これらの特性に基づき、このコードされた
アルカリリパーゼ遺伝子はこのＬＩＰＡ中に位置する
と考えられる。コードされたアルカリリパーゼ遺伝子の
完成した配列（４１３から１４２６ｂｐｓまで）は分泌
信号配列を差し引き後、２９０個のアミノ酸組成のタン
パク質に置き換えることができる。実際の分子量のサイ
ズは３０、８２６で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したサイ
ズ３２，０００に近似している。

【００２３】［実施例５］コードされたアルカリリパーゼ遺伝子の出現をコントロ
ールする塩基配列の確定（表１）このコードされたアルカリリパーゼ遺伝子の塩
基配列は、１．５から２．９Ｋｂｐまでの間に位置す
る。この区域は別のＬＩＰＢ（１４６９−２４９１）
があり、コードされたアルカリリパーゼ遺伝子（ＯＲＦ
１）との距離はわずか６１塩基ペアのみである。この
出現をコントロールする遺伝子とコードされたアルカリ
リパーゼ遺伝子は相互に関連しており、同様なイニシエ
イターとＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を共用して
いる。この出現をコントロールする遺伝子の塩基配列と
公知のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の塩基配列［Ｊａｎ
ｅＧｉｌｂｅｒｔ，Ｅ．，（１９９３）Ｅｎｚｙｍｅ
Ｍｉｃｒｉｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：６３４］とを
比較したところ、相似性がないため、これは新型のコン
トロール配列と考えられる。

【００２４】［実施例６］大腸菌形質転換株（ＴＩＴ−７）を用いアルカリリパー
ゼを生産する実施例２で得られた大腸菌形質転換株（ＴＩＴ−７）
を、竹製のようじを用いアンピシリン（５０ｕｇ／ｍ
ｌ）を含む１０ｍｌＬＢ培地に植え付け、３７℃で１
８時間振とう培養した。さらに０．５ｍｌの培養物をア
ンピシリン（５０ｕｇ／ｍｌ）を含む５０ｍｌＬＢ培
地に植え付け、３７℃で５時間振とう培養し、０．５ｍ
ｌ０．１ＭＩＰＴＧ（イソプロピル βチオガラクト
ースグルコピラオサイド（最終濃度１ｍＭ））を加え
た。その後５時間培養を続け、細胞（１０，０００ｒｐ
ｍ，２０分）を収集し、２０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣ１緩
衝液（５０ｍＭ，ＰＨ８．５）に懸濁し、超音波で２０
分処理した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，２０
分）で細胞破裂物を除去し、上清から公知の方法でアル
カリリパーゼ活性を測定した。図１１が示しているのは
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。その
内（１、２はＴＩＴクローン株、３は大腸菌宿主、４は
純化されたアルカリリパーゼ、５は分子量の標示）であ
る。ＴＩＴクローン株が生産する分子量は約３２０００
ダルトンで、また定形外のタンパク質色帯はＤＨ１０Ｂ
宿主が形成できないものである。よってこれにより実証
された。

【００２５】

【配列表１】配列番号：ｌｉｐＡ配列の長さ：１０１６ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源生物名：Pseudomonas Pseudoalcaligenes F-111 株名：ＣＣＲＣ９１０００８配列の特徴特徴を表す記号：ｐＣＫＨ４存在位置：特徴を決定した方法：Ｓａｎｇｅｒｄｉｄｅｏｘｙ法備考：ＣＣＲＣ９１００８中華民国食品工業発展研究所微生物寄託番号第９１００
８号配列 GGATTCATCCTGACAATATCCGGATGCCAGAGCGCACGAC TAATTGGTCACTTTTCAGCCGCCT A Putative promoter GGTCAACCCCGCTGAACCCTGCGCCGCGCCTTCAATTCATCACC AGGC CTGACT Putative S-D sequence -48 -40 5' ATG CTC CCG GAC AGC CTC TGT GAT GCA GTC AGA GAC ACA ACA ACA ATA AAA CCG M L P D S L C D A V R D T T T I K P Signal peptide (413 bp.) -30 -20 CAC AAG GAC TCG CAT TAT GCG CAA CAA GAC TCG CGT CTC GCT CCG CCT CGG GCT H K D S H Y A Q Q D S R L A P P R A -10 -1 1 GGC CAC TAC GCT GGG CAT CAG CAC CCA GCC CAG GCC TTC CTG TTC GGC TCC TCG G H Y A G H Q H P A Q A F L F G S S 563 bp. Mature alkaline lipase 10 20 AAC TAC ACC AAG ACC CAG TAC CCG ATC GTC CTG ACC CGC GGC ATG CTC GGC TTC N Y T K T Q Y P I V L T R G M L G F 30 40 GAC AGC CTG CTT GGG GTC GAC TAC TGG TAC GGC ATT CCC TCA GCC CAG CGT AAA D S L L G V D Y W Y G I P S A Q R K 50 60 GAC GGC GCC ACC GTC TAC TTC ACC GAA GTC AGC CAG CTC GAC ACC TCC GAA GCC D G A T V Y F T E V S Q L D T S E A 70 CGG GGT GAG CAA CTG CTG ACC CAG GTC GAG GAA ATC GTC GCC ATC AGC GGC AAA R G E Q L L T Q V E E I V A I S G K 80 90 CCC AAG GTC AAT CTG TTC GGC CAC AGC CAT GGC GGG CCT ACC ATC CGC TAC GTT P K V N L F G H S H G G P T I R Y V Active site 100 110 GCC GCC GTG GCC CCG GAT CTG GTC GCC TCG GTC ACC AGC ATT GGC GCG CCG CAC A A V A P D L V A S V T S I G A P H 120 130 AAG GGT TCG GCC GCC GCC GAC TTC ATC CGC CAG GTG CCG GAA GGA TCG GCC AGC K G S A A A D F I R Q V P E G S A S 140 150 GAA GCG ATT CTG GCC GGG ATC GTC AAT GGT CTG GGT GCG CTG ATC AAC TTC CTC E A I L A G I V N G L G A L I N F L 160 TCC GGC AGC AGT TCG GAC ACC CCA CAG AAC TCG TTG GGC ACG CTG GAG TCG CTG S G S S S D T P Q N S L G T L E S L 170 180 AAC TCC GAA GGC GCC GCA CGG TTC AAC GCC CGC TTC CCC CAA GGT GTG CCG ACC N S E G A A R F N A R F P Q G V P T 190 200 AGC GCC TGC GGC GAG GGT GAT TAC GTA GTC AAT GGC GTG CGC TAT TAC TCC TGG S A C G E G D Y V V N G V R Y Y S W 210 220 AGC GGC ACC AGC CCG CTG ACC AAC ATA CTC GAC CCT TCC GAC CTG CTG CTC GGC S G T S P L T N I L D P S D L L L G 230 240 GCC ACC TCC CTG CCA TTC GGT TTC GAG GCC AAC GAT GGT CTG GTC GGA CGC TGC A T S L P F G F E A N D G L V G R C 250 AGC TCC CGG CTG GGT ATG GTG ATC CGC GAC AAC TAC CGG ATG AAC CAC CTG GAT S S R L G M V I R D N Y R M N H L D 260 270 GAG GTG AAT CAG ACC TTC GGG CTG ACC AGC ATA TTC GAG ACC AGC CCG GTA TCG E V N Q T F G L T S I F E T S P V S 280 290 GTC TAT CGC CAG CAA GCC AAT CGC CTG AAG AAC GCC GGG CTC TGA 3' V Y R Q Q A N R L K N A G L * 1427 bp.

【００２６】

【配列表２】配列番号：ｌｉｐＢ配列の長さ：１０２３ｂｐ配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源生物名：Pseudomonas Pseudoalcaligenes F-111 株名：ＣＣＲＣ９１０００８配列の特徴特徴を表す記号：ｐＣＫＨ４存在位置：特徴を決定した方法：Ｓａｎｇｅｒｄｉｄｅ法備考：ＣＣＲＣ９１００８中華民国食品工業発展研究所微生物寄託番号第９１００
８号配列 ATCGCCTGAAGAACGCCGGGCTC TGA AATAGGCTCCACAACCAGACAGGGCTGGCCTCAGG GGCC Alkaline lipase (lip A) stop codon 1 10 5' ATG CAC AGG TAC CGA TAT CGA CAT GAA GCC GCT GAT TTA TCT GCC GTT GC T ACT M H R Y R Y R H E A A D L S A V A T 1469 bp. 20 30 CGG CCT CGG CTG CTC GGC TGG CAC CTG AGC ACA CCG ACA CCC AGC CCC TC C GCG R P R L L G W H L S T P T P S P S A 40 50 CCC ACA TCA ACG CCG CTA CAA GCC GGC AGT GAA CAA CCC GCC ACA ACT CC T GTG P T S T P L Q A G S E Q P A T T P V 60 70 AGT CTG ACC CGT CCG ACC ACG CGC AGC ACC GAC CAG CAC CTG CCC GCC TC A CTG S L T R P T T R S T D Q H L P A S L 80 90 CGC GAT ACC GAC ATC GAT GGT CAA CTG GAA GTC GAC GCC CAG GGC AAT CT G GTG R D T D I D G Q L E V D A Q G N L V 100 ATT ACC GAC CAA CTG CGT CAC CTG TTC GAT TAT TTC TTC AGC ACC GTC GG C GAA I T D Q L R H L F D Y F F S T V G E 110 120 CAG TCG TTC GAG CAG GCC AGC AGC GCT ATC CGT GAC TAT CTG GCC AGC CA G CTG Q S F E Q A S S A I R D Y L A S Q L 130 140 CGT GAC GCG GCT CTG GCT CAG GCC CTG GAT CTT CTG GAT CGC TAT ATC GA C TAC R D A A L A Q A L D L L D R Y I D Y 150 160 AAA ACT GAG CTG GTG GAG CTG GAG CGA CGC TTC CCG ATG GTG ACC GAA CT G GAC K T E L V E L E R R F P M V T E L D 170 180 GGC CTG CGC GCC CGC GAA GAT GCC GTA CAA CGC CTG CGC GCC AGT CTG TT C AAC G L R A R E D A V Q R L R A S L F N 190 GCG CAG GAG CAC GCC GCC TTC TTC GCC AGC GAA GAG GTC TAT AAC CAG TT C ACT A Q E H A A F F A S E E V Y N Q F T 200 210 CTT GAG CGT CTG GCG ATA CTG CAC GAT CCG TCG CTG GAT CCG CAG ACA CA G GCC L E R L A I L H D P S L D P Q T Q A 220 230 GAA CGG ATT GAA CGG CTG CGC GAA GGG CTG CCC GAC GAG TTG CAA CAA TT G CTG E R I E R L R E G L P D E L Q Q L L 240 250 GTA CCG CAA TTG CAC CTG ACC CTG CGC CAC GAC CCA GCA GTT GCT GAC CA A GGT V P Q L H L T L R H D P A V A D Q G 260 270 GCC GAG CCG GAA CAG CTA CGC CAG TTG CGC CTG AAC CTG TTC GGG CCT CA G GCA A E P E Q L R Q L R L N L F G P Q A 280 ACC GAG CGG CTG GAA CGG CTG GAC CGC CAA CGC AGC GAA TGG GAT CAG CG C CTT T E R L E R L D R Q R S E W D Q R L 290 300 GAG CGG TTC AAT CGC GAA CGT CAG GCG ATC ATC AGC CAG CCG GGC GCG TG G ACA E R F N R E R Q A I I S Q P G A W T 310 320 GCG ACA AGC AGG CCG CGA TTG AGG CCT GCT GCA CGA GCA GTT CAG CGA GC A CGA A T S R P R L R P A A R A V Q R A R 330 340 GCG CTC AGG GTC AAT AGC CTG TTG GAA CTC GAT AGC CGC GCC GAA CGC TA G 3' A L R V N S L L E L D S R A E R * 24 91 bp.

【図面の簡単な説明】

【図１】疑似性単細胞菌属Ｆ−１１１染色体のＤＮＡ断
片の塩基配列を示している。

【図２】図１の続きである。

【図３】図２の続きである。

【図４】コードされたアルカリリパーゼ遺伝子の塩基配
列（ＬＩＰＡと命名）を示している。

【図５】図４の続きである。

【図６】コードされたアルカリリパーゼ遺伝子の出現を
コントロールする塩基配列（ＬＩＰＢと命名）を示し
ている。

【図７】図６の続きである。

【図８】コードされたアルカリリパーゼ遺伝子断片の制
限酵素による切断位置を示している。

【図９】プラスミドｐＣＨＫ４作出のフローチャートを
示している。

【図１０】ＴＩＴ−７クローン株のトリブチリン（ｔｒ
ｉｂｕｔｙｒｉｎ）スクリーニング培地に於ける出現の
状況を示している。

【図１１】ＴＩＴ−７クローン株が生産したアルカリリ
パーゼのＳＤＳポリアクリルアミドゲルに於ける電気泳
動分析図を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コードされたアルカリリパーゼ遺伝子の
配列、及びコードされたアルカリリパーゼ遺伝子の出現
をコントロールする一種のＤＮＡ断片である。
【請求項２】請求項１記載の疑似性単細胞菌属（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓＰｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ）Ｆ−１１１から得られたＤＮＡ断片である。
【請求項３】以下を含むアルカリリパーゼの製造方
法。（ａ）疑似性単細胞菌属（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＰ
ｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）Ｆ−１１１から染
色体ＤＮＡを分離した。（ｂ）制限酵素Ｓａｕ３Ａを用いて疑似性単細胞菌属
（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＰｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓ）Ｆ−１１１の染色体ＤＮＡを部分消化し、
コードされたアルカリリパーゼ遺伝子配列、及びコード
されたアルカリリパーゼ遺伝子出現をコントロールする
塩基配列のＤＮＡ断片を得た。（ｃ）担体を得るため、当該ＤＮＡ断片を大腸菌体中に
出現することができるプラスミドに移植した。（ｄ）当該形質転換担体を大腸菌中に移植した。（ｅ）当該形質転換大腸菌を培養した。（ｆ）アルカリリパーゼを分離した。
【請求項４】請求項３記載の大腸菌中に出現するプラ
スミドは、ＰＧＥＭ−３Ｚｆ（１＋１）である。