JPH09113448A - レーザ誘起２光子蛍光相関分光分析を実施する装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 サンプルをいっそう効果的かつ迅速にしかも
いっそう僅かなコストで検査できるようにしたレーザ誘
起２光子蛍光相関分光分析用の装置を提供する。 【解決手段】 複数のボリューム６ａ，６ｂ，６ｎ内に
配置されたサンプル３ａ，３ｂ，３ｎが、ただ１つのレ
ーザ１により励起され並行して観察されるよう、それら
のボリューム６ａ，６ｂ，６ｎが装置内に規定されてい
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、レーザ誘起２光子
蛍光相関分光分析（ＴＰＡ−ＦＣＳ）を実施する装置に
関する。

【０００２】

【従来の技術】著しく小さい分子の構造を検査する場
合、適用領域および分析ないし観察すべきサンプルの構
造やタイプに応じて、種々の分光分析手法および相応の
測定装置が用いられる。

【０００３】ＦＣＳは、サンプルボリュームすなわち観
察ボリュームの著しく小さいセクションからの蛍光の観
察に基づくものである。このセクションには、平均的に
僅かな個数の蛍光粒子しか存在していない。被観察ボリ
ュームにおける粒子の個数は統計的にこの平均値付近
で、静止した液体中の熱拡散あるいは流動する液体中の
集団運動により変動する。観察ボリュームにおける蛍光
粒子の個数が変動することで蛍光が時間的に変動する。

【０００４】文献 D. Magde, E.L. Elson, W.W Webb, P
hys. Rev. Lett. 29 (1972), 705-708, R.Riegler, P.
Grasselli, M. Ehrenberg, Phys. Scr. 19 (1979), 486
-490, および N.L. Thompson, "Topics in Fluorescen
ce Spectroscopy, Vol. 1" (J.R. Lakovicz, Ed.), Ple
num Press, New York, 1991, 337-410 には、蛍光相関
分光分析を用いた従来の測定装置について記載されてお
り、この場合、特別に規定された観察ボリュームが共焦
点顕微鏡と称する装置により得られる。共焦点顕微鏡に
ついては、文献 T. Wilson, C. Sheppard "Theory and
Practice of Scanning Optical Microscopy", Academic
Press, New York, 1984 および T. Wilson (Ed,) に
よる "Confocal Microscopy" Academic Press, London
(1984) に記載されている。この場合、標準的な顕微鏡
装置が用いられ、照明用レイパスおよび観察用レイパス
中の中間結像面内にそれぞれピンホール絞りが設けられ
ており、その結果、被検体における照明絞りの像が観察
絞りの開口部に精確に当たるようになる。これにより被
観察ボリュームは被検体平面内の著しく狭い範囲に局限
されるが、装置はきわめて複雑になってしまう。このよ
うに装置が著しく複雑になることに加えてさらに調節も
複雑になり、また、汚れや揺れに対して著しく弱くなっ
て、その結果、殊に現場での測定が行えない。

【０００５】文献 K.M. Berland, P.T.C So, E. Graton
"Two-Photon Fluorescence Correlation Spectroscop
y: Method and Application to the Intracellular Env
iroment", Biophy. J. 68 (1995), 694-701 では、細胞
間環境においてＴＰＡ−ＦＣＳが用いられる。この場合
も複雑な顕微鏡を用いることで動作するが、ここでは光
学レイパス中にピンホール絞りは設けられていない。こ
の装置の欠点は、複雑な顕微鏡ゆえにやはり現場での測
定が行えないことであり、しかも一度にただ１つのサン
プルしか観察できないことである。また、サンプルの交
換ならびにそれに続いて必要とされる顕微鏡の調節がか
なり長くかかるため、測定には著しい時間と測定コスト
が伴う。さらに、比較的大きなスケールの検査はこの種
の実験室用測定構造では実施できない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがって本発明の課
題は、サンプルをいっそう効果的にいっそう迅速にしか
もいっそう僅かなコストで検査できるようにしたＴＰＡ
−ＦＣＳ用の装置を提供することにある。さらに本発明
の課題は、作用物質のスクリーニングに使用できるよう
にしたＴＰＡ−ＦＣＳ用の装置を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段および利点】本発明によれ
ば上記の課題は、複数のボリュームが、該ボリューム内
に配置されたサンプルがただ１つのレーザにより励起さ
れ並行して観察されるよう、装置内で境界づけられない
しは規定されていることにより解決される。

【０００８】測定装置を並行動作するよう構成したこと
により、複数のサンプルを同時に並行して観察すること
ができるようになる。必要とされるレーザビームは、複
数のサンプルボリュームが境界づけられそのようにして
規定されたボリュームを互いに無関係に検査できるよう
投入される。したがってたとえば、他のサンプルの観察
を中断する必要なくあるサンプルを別のサンプルと交換
することもできる。このようにすれば、装置をそのつど
新たに設定しなおす必要なく複数のサンプルを工業的に
検査することができる。検査全体はただ１つのレーザに
より実施され、したがって効果的で迅速かつ低コストの
サンプル検査が可能になる。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の殊に有利な実施例によれ
ば、レーザのレーザビームが以下のようにして変形され
た装置が設けられている。すなわちレーザビームは、半
径方向の寸法においてたとえば３μｍよりも小さく有利
には１μｍよりも小さい焦点領域を有しており、これに
よりボリュームが規定されそこにおいてサンプルを観察
可能である。レーザビームを様々に変形することができ
る。その際、レーザビームをビームスプリッタにより分
割し種々異なるビーム経路でフォーカシングすることが
できる。しかし、レーザビームをたとえば第１のフォー
カシング領域内にフォーカシングさせ、第２の素子によ
り再びまっすぐにし、あるいは第２のフォーカシング領
域にフォーカシングさせるという具合にすることもでき
る。このようにして１つのビーム経路で相前後するフォ
ーカシング領域から成る”チェーン構造”を簡単に形成
することができ、そこにおける個々のフォーカシング領
域ないし測定セルにおいて相応のサンプルを観察するこ
とができる。また、これら両方の装置構成を互いに結合
することもでき、その結果、種々の並列のビーム路自体
を直列に順次連続させて種々のフォーカシング領域に分
けることができる。この場合、通常はガウスビームであ
るレーザのビーム路の半径方向の寸法を、ｚ方向で最小
の寸法で２μｍよりも小さく有利には１μｍより小さい
寸法が得られるよう選定することができる。このように
して、ＴＰＡ−ＦＣＳを作動できる程度に高いレーザビ
ームの強度を有するボリュームが明確に規定される。蛍
光とレーザによる励起強度との二次の関係に基づき、被
観察サンプルボリュームを数μｍ³ 程度に、たとえば１
μｍ³ に制限することができる。このことはまさに作用
物質のスクリーニングにおいて有利である。その理由は
他のサンプルの成分の損傷が回避されるからであって、
つまり他のサンプルにおいては、ガウスビームの極端な
フォーカシングゆえにそれらを損傷するにはレーザ強度
が過度に低いからである。このような理由で、この手法
を細胞組織にも適用できる。さらに別の利点としてみな
せるのは、小さい観察ボリュームゆえに平均値付近の統
計的な変動が、平均値に比べて評価のために十分に大き
いことである。

【００１０】本発明による装置のさらに別の有利な実施
例によれば、レーザビームが何度もフォーカシングされ
るよう対物レンズたとえば光学対物レンズが設けられ
る。レーザビームのフォーカシングは、熱レンズまたは
光学レンズであれ光導波体の特定の特性を利用すること
であれ、基本的に種々のやり方で行うことができる。光
学対物レンズを使用することの利点は容易に入手でき安
価な点にあり、そのためレーザビームは有利には光学対
物レンズつまりたとえばレンズまたは顕微鏡レンズによ
りフォーカシングされる。この種のレンズを通って入射
される際にレーザビームの損失をいっそう僅かにしか受
けなければ受けないほど、いっそう多くのサンプルを直
列に配置し並行して観察できるようになる。サンプルを
通り抜ける際の損失はごく僅かである。単一モード光フ
ァイバを浸けることで、測定溶液中でのフォーカシング
も行える。

【００１１】本発明による装置のさらに別の有利な実施
例によれば、レーザ源としてＴｉ：サファイアレーザ、
たとえば８０〜１００ｆｓのＦＷＨＭ（full width @ h
alfminimum ）のパルスを有するモード結合されたパル
スレーザが設けられている。このレーザは７６ＭＨｚの
繰り返しレートで駆動できる。Ｔｉ：サファイアレーザ
の採用により、種々の波長領域で使用可能であり信頼の
おける市販のレーザが組み込まれることになる。

【００１２】サンプルの性状ないしは基準物質の種々の
標識に基づき様々な励起範囲が必要とされる場合に、励
起同調領域内のフレキシビリティは殊に有利である。短
いパルスにより、僅かな平均出力レベルでも観察ボリュ
ームにおいてＴＰＡ−ＦＣＳに必要な出力を生じさせる
ピーク出力が得られる。さらに、７６ＭＨｚの繰り返し
レートによって相関を良好に捕捉検出できるようにな
る。このレーザはたとえば１Ｗの平均出力で駆動でき
る。効果的な２光子励起のための前提条件である高い励
起強度は、高いピーク出力による光パルスの使用により
得られる。

【００１３】本発明による装置の別の有利な実施形態に
よれば、少なくとも４つのサンプル有利には少なくとも
１０個のサンプルたとえば１００個までのサンプルを、
並行して観察することができる。被観察サンプル数は、
得られるビーム形態特性や使用される光学素子における
損失に依存するし、さらにはレーザを駆動する電力、サ
ンプルの透過性、評価ユニットのキャパシティ等に依存
する。相応のパラメータを適切に選定すれば、１０００
個までのサンプルを並行して観察することもできる。

【００１４】また、本発明による装置の殊に有利な実施
例によれば、１つの評価電子ユニットと接続可能な少な
くとも１つの光検出器（光電子増倍管または半導体検出
器）が設けられており、この検出器上に各サンプルの蛍
光ビームが有利には９０゜の角度で結像される。この装
置構成により、サンプルからの蛍光を後続の評価ユニッ
トにおいて自己相関分析を用いて評価できる。測定され
正規化された自己相関関数の経過特性から、観察ボリュ
ームにおける粒子の平均滞留時間を求めることができ
る。正規化された自己相関関数の５０％値を求めること
で複合している粒子と自由な粒子とを簡単に判別するこ
とができ、上記の値は複合していればいっそう長い時間
へとずれる。このようにして簡単に、複合粒子と自由粒
子を分離して作用物質スクリーニングを行うことができ
る。

【００１５】また、本発明によれば蛍光粒子のボリュー
ム密度も測定できる。

【００１６】検出器上に当たる全蛍光強度は蛍光粒子の
密度とともに直線的に上昇し、励起光源のピーク出力と
ともに二次的に上昇する。一定の励起強度における粒子
の既知の密度を用いてプローブを較正すれば、未知の密
度をその全蛍光信号から求めることができる。

【００１７】蛍光ビームの結像は、有利には第２の対物
レンズを介してないしはたとえば光学レンズおよび／ま
たはフィルタを介して行われる。これにより、到来する
ビームの強度および波長を適正に調整し制限することが
できる。したがって、粒子蛍光の検出はレンズを用いた
簡単な光学的結像により、ないしは光ファイバにより行
われ、この場合、もとへ戻っていく蛍光が位相結合器を
介して光電子増倍管の光電陰極または半導体検出器へ向
けて出力結合される。ＴＰＡ励起光は、検出器よりも手
前で干渉フィルタまたはショートパスフィルタによって
蛍光から分離される。評価電子ユニットは有利には、光
電子増倍管からの信号のための増幅器および／または相
関器および／またはコンピュータを有することができ
る。このようにして情報をもう１度いっそう明確にフィ
ルタリングして抽出し、増幅し評価することができる。
コンピュータカード、ディジタルフィルタ等のようなそ
のほかのコンポーネントを任意に使用できる。本発明に
よるこのような実施形態は、複雑な顕微鏡機器を用いず
に済ますことができる点で優れている。

【００１８】本発明による装置の別の有利な実施例によ
れば、サンプルごとに１つの光電子増倍管が設けられて
おり、これらの光電子増倍管のすべての信号が１つのコ
ンピュータへ転送されるように構成されている。したが
って測定ボリュームごとに１つの光電子増倍管を使用す
ることで各サンプルボリュームからの蛍光ビームを同時
にないし並行して捕捉検出することができ、結果として
得られたそれらの信号を１つのコンピュータへ転送し、
そこにおいてたとえば多重化方式によりそれらの信号を
評価することができる。このようにすれば、多数のサン
プルを並行して検査し多数の信号を並行して捕捉検出し
て評価する効果的な手法が得られる。

【００１９】本発明による装置の別の有利な実施形態に
よれば、各サンプルは一列に配置されており、レーザビ
ームは直線的にそれらのサンプルを通過する。このよう
な配置構成により、レーザビームをその全エネルギーで
通過させて導くことができ、その結果、光学系や個々の
サンプルを通過するときの無視できる程度の損失を差し
引いても、レーザの中庸なポンプパワーによって十分に
高いレーザビーム強度を得ることができる。さらにこの
ような配置構成により、各測定セルを直線的に相前後し
てつなげることで簡単かつほとんど障害を受けない構造
が得られる。

【００２０】本発明によるさらに別の有利な実施形態に
よれば、レーザビームおよび／または蛍光ビームのため
に調整されフォーカシングされた対物レンズが固定保持
されている装置が設けられている。所定のサンプルボリ
ュームに合わせて光学系をこのように固定保持すること
により、この装置を工業的に利用することができる。つ
まり、いったん固定保持した装置は個々のサンプルの交
換後、もはや新たに調節および設定する必要はない。蛍
光ビームは光電子増倍管を介して捕捉され評価される。
その後、サンプルを交換してそのまま新たなサンプルを
さらに検査することができる。複数の測定セルを利用で
きるので、同時にｎ個の新たなサンプルを装置に取り込
むことができ、したがってサンプルの工業用評価が可能
となる。自動化されたサンプル処理により、複雑な保守
および調整の要求される装置を必要とせずに高いサンプ
ル処理量が達成される。

【００２１】本発明による装置の殊に有利な実施例によ
れば、この装置は作用物質のスクリーニングに利用され
る。このようにすれば、本発明による装置の長所を作用
物質の検査に利用することができ、したがってたとえば
複数の被検査作用物質を観察することができ、試験結果
が否定的であればそれらの作用物質は一度にそのまま排
除される。複数の測定セルと自動化されたサンプル処理
の併用により、装置をそのつど再設定することなく最短
時間内に大量の作用物質を試験できる。静止した液体に
おいて、蛍光粒子の翻訳拡散係数およびそれらの粒子数
密度を測定できる。さらに、たとえば別の粒子が蛍光粒
子に付加したときに生じるような拡散係数の変化を測定
できる。したがって、関与している反応成分のうち１つ
だけが固有に蛍光しているかまたは蛍光色素で標識され
ていれば、物理的および生化学的特性の複合反応を測定
できる。同時に複数の蛍光粒子タイプが用いられている
場合、個々の色素の放出スペクトルが適切に選定されて
いれば、相応の検出用フィルタを介した観察波長の選択
により、粒子タイプを区別することができる。

【００２２】この手法は、他の非蛍光粒子の強いバック
グラウンドを伴う適用事例にも適している。それという
のは、蛍光粒子のみ検出されるからである。この特性に
よって、この種の装置は直接的にも追い出し実験におい
ても、生化学的な認識反応の検出に適するとみなせるよ
うになる。

【００２３】この手法の簡単な光学的構造は多数の測定
チャネルの並行動作にも適しており、このことで連続的
な検査の際の所要時間が著しく短くなる。

【００２４】本発明による装置のその他の適用事例とし
て、たとえばリガンド／受容体結合の追い出し手法のよ
うな検査が挙げられ、たとえば生物学的反応メディエー
タ（biological response mediators）の結合の検査、
殊に成長因子／成長因子受容体、ＤＮＡ結合タンパク質
／特異的ＤＮＡ配列、および／または抗体／抗原の検査
に有利である。このような追い出し実験ないし追い出し
手法は以下のようにして行われる。すなわち、追い出し
手法による作用物質のスクリーニングにおいて、蛍光標
識された既知の基準作用物質が受容体と結合する。被検
査液体中にいっそう有効なリガンド（つまりいっそう良
好な作用物質）が存在していれば、蛍光標識されたもと
の基準物質が追い出される。ＴＰＡ−ＦＣＳにより蛍光
標識された基準作用物質の拡散特性を測定する場合、自
由になった（つまりいっそう小さい質量およびいっそう
小さい体積の）追い出された基準作用物質の拡散運動の
増加が得られる。簡単な測定構造、短い測定時間および
簡単に達成可能な並行動作により、高いサンプル処理量
で効果的な作用物質スクリーニングを行うことができ
る。

【００２５】次に、図面を参照しながら本発明の実施例
について説明する。

【００２６】

【実施例】図１による装置にはパルスレーザ１が用いら
れており、このレーザは顕微鏡対物レンズ２ａ，２ｂ，
２ｎを介し複数の測定セル３ａ，３ｂ，３ｎを通って導
かれ、それらの測定セル内でフォーカシングされる。各
測定セル３のフォーカシング領域６ａ，６ｂ，６ｎ内に
それぞれ１つのサンプルがおかれている。サンプル内の
粒子蛍光の検出は、レンズ４ａ，４ｂ，４ｎを介した光
電子増倍管７ａ，７ｂ，７ｎへの光学的結像により行わ
れる。各光電子増倍管７ａ，７ｂ，７ｎの前にはフィル
タ５ａ，５ｂ，５ｎが取り付けられている。複数の蛍光
粒子タイプが用いられ、個々の色素の発光スペクトルを
適切に選択する際、分子の各タイプにおいて観察波長の
選択を異ならせるために、これらの検出用フィルタ５
ａ，５ｂ，５ｎを用いることができる。各光電子増倍管
７ａ，７ｂ，７ｎの情報は評価電子ユニット８へ導か
れ、そこにおいて処理される。

【００２７】本発明によれば、ＦＣＳ方式により著しく
小さいサンプルボリュームからの蛍光相関を簡単に測定
することができ、そのために複雑な共焦点光学系を用い
る必要はない。殊に、蛍光により標識された基準作用物
質の変化による方式にしたがった作用物質スクリーニン
グに対し簡単な手段を用いて並行させるのに適してお
り、このため低コストで迅速に実施するのに適してい
る。結合された蛍光により標識された基準作用物質の追
い出しにより、翻訳拡散係数が著しく減少する。この効
果を新たな作用物質を識別するために利用できる。

【００２８】これまで一般的だった１光子吸収に比べサ
ンプル損傷のおそれが著しく抑えられる。それというの
は２光子吸収の場合、励起はレーザの焦点においてのみ
行われ、実際の測定ボリュームにおいてのみ行われるか
らであり、そのほかではレーザビームは長い波長ゆえに
相互作用なくサンプルを通り抜ける。

【００２９】２光子蛍光相関分光分析を用いることで、
蛍光により標識された粒子の拡散特性を求めるための測
定方法を簡単に並行させることができ、したがって効果
的かつ低コストの作用物質スクリーニングを行うことが
できる。また、ただ１つのパルスレーザ光源からの光を
複数の測定セルを通して導くことができ、その際にそれ
ぞれ各測定セル内でフォーカシングさせることができ
る。そしてそれらの測定セルは簡単な構造（標準の顕微
鏡対物レンズないし励起用の単一モード光ファイバおよ
びきわめて単純な検出用の光学系）のため、著しく安価
に構成できる。さらに、先に述べた欠点を伴う共焦点顕
微鏡の使用に基づく慣用の蛍光相関分光計に比べて光学
的構造が単純になり、調節しやすくなり、しかも並行動
作のためのコストならびに所要時間が劇的に減少する。

【００３０】この方法および構成の適用により一般に作
用物質スクリーニングが可能になり、特に並行動作形式
で低コストかつ時間的に効率よく行えるようになる。

【００３１】この場合、複雑で過敏かつ高価な共焦点光
学系をまったく用いなくてよい。また、顕微鏡には適し
ていないサンプル容器においても測定を行える。さら
に、並行動作による測定を簡単かつ低コストで行える。

【００３２】これまで一般的であった１光子吸収に比べ
てサンプル損傷のおそれが著しく低減される。それとい
うのは２光子吸収の場合には電子的な励起はレーザの焦
点つまり実際の測定ボリュームにおいてのみ行われるか
らであり、そのほかでは線形の吸収スペクトル外の長い
波長ゆえにレーザビームは相互作用を伴わずにサンプル
を通り抜ける。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｎ個の測定セルを備えた本発明による実施例の
構成を示す図である。

【符号の説明】

１ パルスレーザ ２ａ，２ｂ，２ｎ 対物レンズ ３ａ，３ｂ，３ｎ 測定セル ４ａ，４ｂ，４ｎ レンズ ５ａ，５ｂ，５ｃ フィルタ ６ａ，６ｂ，６ｃ フォーカシング領域 ７ａ，７ｂ，７ｎ 光電子増倍管 ８ 評価電子ユニット

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ディーター ホルン ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク シュ レーダーシュトラーセ 69 (72)発明者 エルマール マイアー ドイツ連邦共和国 アウグスブルク ゲシ ュヴィスター−ショル−シュトラーセ 12

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 レーザ誘起２光子蛍光相関分光分析（Ｔ
   ＰＡ−ＦＣＳ）を実施する装置において、 複数のボリューム（６ａ，６ｂ，６ｎ）が、該ボリュー
   ム内に配置されたサンプル（３ａ，３ｂ，３ｎ）がただ
   １つのレーザ（１）により励起され並行して観察される
   よう、装置内で境界づけられないしは規定されているこ
   とを特徴とする、 レーザ誘起２光子蛍光相関分光分析を実施する装置。