JPH08500967A - ヒトＡ１，Ａ２ａおよびＡ２ｂアデノシン受容体をエンコードするＤＮＡ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトＡ１，Ａ２ａ及びＡ２ｂアデノシン受容体をエンコードするＤＮＡ配列に関し、かつＤＮＡ組換え技術を用いたヒトＡ１，Ａ２ａ及びＡ２ｂアデノシン受容体の生産におけるこれらＤＮＡ配列の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトＡ１、Ａ２ａおよびＡ２ｂアデノシン受容体をエンコードするＤＮＡ配列 発明の利用分野 本発明は、ヒトＡ１，Ａ２ａ及びＡ２ｂアデノシン受容体をエンコードするＤ ＮＡ配列に関し、かつＤＮＡ組換え技術を用いたヒトＡ１，Ａ２ａ及びＡ２ｂア デノシン受容体の生産におけるこれらＤＮＡ配列の使用に関する。発明の背景 アデノシンは心臓血管の機能に（心拍数の減少及び血圧の低下により）影響を 及ぼし、かつ神経系の機能にも（鎮静及び抗てんかん作用を介して）影響する。 加えて、アデノシンにより気管支収縮を誘発することもできる。アデノシンは、 少なくとも３つの受容体、Ａ１，Ａ２ａ及びＡ２ｂに特異的に結合する。アデノ シン受容体は、多くの第２メッセンジャー系に連結して観察され、かつ更なる亜 型が存在する可能性もある。アデノシン受容体の作動薬及び拮抗薬は、抗高血圧 薬、睡眠薬、抗精神病薬、及び気管支収縮薬として商業的価値を有しているため 、ＤＮＡ組換え技術によるアデノシン受容体が生産できることは好都合である。 本発明者らは、ヒト海馬ｃＤＮＡから、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction ）法及び特異的なプローブを生じる独自の変性オリゴヌクレオチド、または、ｃ ＤＮＡライブラリのスクリーニングのため特異的に一致するオリゴヌクレオチド プローブを用いて、ヒトＡ１，Ａ２ａ及びＡ２ｂアデノシン受容体をエンコード する、３つの関連したｃＤＮＡ断片を単離した。これら３つの受容体の完全なｃ ＤＮＡクローンは、それぞれヒト海馬ｃＤＮＡライブラリから単離された。また 、これら受容体の配列は、哺乳類細胞内での発現及び、エンコードされた受容体 の種々のアデノシン類似体に対する親和性ならびにｃＡＭＰ合成における受容体 活性の影響の測定から、ヒトＡ１，Ａ２ａ及びＡ２ｂアデノシン受容体のそれと 同定された。更に、これら受容体の配列は、イヌＡ１及びＡ２ａアデノシン受容 体（MAENHAUT，C.，VAN SANDE，J.，LIBERT，F.，ADRAMOWIC，M.，PERMENTIER， M. ，VANDERHAEGEN，J.，DUMONT，D.，VASSART，G.及びSCHUFFMANN，S.(1990)；LIB ERT，F.，SCHUFFMANN，S.M.，LEFORT，A.，PARMENTIER，M.，GERARD，C.，DUMON T，J.E.，VANDERHAEGEN，J.J.，VASSART，G.(1991)）、ならびにウサギＡ２ｂア デノシン受容体（STEHLE，J.H.，RIVKEES，S.A.，LEE，J.J.WEAVER，D.，R.，DE EDS，J.D.及びREPPERT，S.M.(1992)）をエンコードするｃＤＮＡと相同性を示し た。これら海馬ｃＤＮＡ配列は、臨床及び商業的に重要性を有する新規なヒト受 容体を示している。発明の要約 すなわち、本発明の第１点は、ヒトＡ１アデノシン受容体をエンコードするＤ ＮＡ分子にある。このＤＮＡ分子は基本的に図１に示す配列または機能的に同様 な配列を有している。 本発明の第２点は、ヒトＡ２ａアデノシン受容体をエンコードするＤＮＡ分子 にある。このＤＮＡ分子は基本的に図２に示す配列または機能的に同様な配列を 有している。 本発明の第３点は、ヒトＡ２ｂアデノシン受容体をエンコードするＤＮＡ分子 にある。このＤＮＡ分子は基本的に図３に示す配列または機能的に同様な配列を 有している。 ここで使用される「機能的に同様な配列」という用語は、結果的に異なるポリ ペプチドをエンコードする配列とならないよう、ＤＮＡ暗号が制限されたＤＮＡ 配列のバリエーションを網羅している。更に、この用語は、エンコードされたポ リペプチドを変化させるようなＤＮＡ暗号の交替をも網羅している。しかし、こ の変化は、このポリペプチドの生物学的活性に影響を及ぼすものではない。 また、ここで使用される「ＤＮＡ分子」という用語は、ゲノムＤＮＡ及びｃＤ ＮＡの双方を網羅している。 本発明の第４点は、本発明の第１点に示すＤＮＡ分子が形質転換された細胞の 、ＤＮＡ配列の発現によりヒトＡ１アデノシン受容体が細胞表面に発現され、か つ必要に応じてヒトＡ１アデノシン受容体を取り出されるような環境下での培養 を含む、ヒトＡ１アデノシン受容体の生産方法から構成されている。 本発明の第５点は、本発明の第２点に示すＤＮＡ分子が形質転換された細胞の 、ＤＮＡ配列の発現によりヒトＡ２ａアデノシン受容体が細胞表面に発現され、 かつ必要に応じてヒトＡ２ａアデノシン受容体を取り出されるような環境下での 培養を含む、ヒトＡ２ａアデノシン受容体の生産方法から構成されている。 本発明の第６点は、本発明の第３点に示すＤＮＡ分子が形質転換された細胞の 、ＤＮＡ配列の発現によりヒトＡ２ｂアデノシン受容体が細胞表面に発現され、 かつ必要に応じてヒトＡ２ｂアデノシン受容体を取り出されるような環境下での 培養を含む、ヒトＡ２ｂアデノシン受容体の生産方法から構成されている。 また、本発明は更に、上記第４，第５及び第６点に示す方法により生産された ヒトＡ１，Ａ２ａ及びＡ２ｂアデノシン受容体と分子との接触を含む、アデノシ ンに対し作動または拮抗活性を有する分子のスクリーニング方法から構成されて いる。 しかも、本発明は更に、以下に述べるオリゴヌクレオチド３０５，３７７，３ ７６から構成されている。 本発明のＤＮＡ分子は、新規なヒトアデノシン受容体を表すものである。これ ら受容体は、体内の多くの部分で発現し、アデノシンを広範な系で作用させるも のとして、臨床及び商業的に重要である。 単離された完全なＤＮＡクローンは、作動薬または拮抗薬のスクリーニングに 用いられる受容体を生産する細胞系の確立に使用可能な、これら受容体が全て暗 号化された部位を含有している。受容体のＤＮＡ配列は、この受容体系に属する 新たな受容体を同定するための、更なる相同性のスクリーニングにも使用可能で ある。 本発明の本質をより明確に理解するための望ましい様体について、以下の実施 例及び図面を参照して説明する。 すなわち、図１は、ヒトＡ１アデノシン受容体のｃＤＮＡのヌクレオチド及び アミノ酸の配列を示すものである。 図２は、ヒトＡ２ａアデノシン受容体のｃＤＮＡのヌクレオチド及びアミノ酸 の配列を示すものである。 図３は、ヒトＡ２ｂアデノシン受容体のｃＤＮＡのヌクレオチド及びアミノ酸 の配列を示すものである。 図４ａは、ヒトＡ１アデノシン受容体が発現した啼乳類のＣＨＯ Ｋ１細胞に 対する、アデノシン受容体拮抗薬ＤＰＣＰＸ（８−シクロフェニル−１，３ジプ ロピルキサンチン）の、総結合量（白三角）、特異的結合量（黒丸）、及び非特 異的結合量（白四角）の飽和曲線を示すものである。 図４ｂは、ヒトＡ２ａアデノシン受容体が発現した哺乳類のＨＥＫ２９３細胞 において、ＣＧＳ−２１６８０（２−ｐ−（２−カルボキシエチル）フェネチル アミノ−５′−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシンハイドロクロライド）を、 異なるアデノシン作動薬または拮抗薬（ＮＥＣＡ＝５′−Ｎ−エチルカルボキサ ミドアデノシン、ＣＡ＝２−クロロアデノシン、ＣＰＡ＝Ｎ⁶−シクロフェニル アデノシン、ＸＡＣ＝キサンチンアミノコンジナー、Ｔ＝８−（ｐ−スルフォフ ェニル）−スレオフィリン）に置き換えた場合の、競合結合曲線を示すものであ る。 図５は、異なるアデノシン受容体、Ａ１，Ａ２ａ及びＡ２ｂが、サイクリック ＡＭＰの生産に及ぼす影響を示すものである。Ａ１アデノシン受容体の活性は、 フォルスコリン（forskolin）による阻害を上回り、ｃＡＭＰの生産を剌激して いる。Ａ２ａ及びＡ２ｂアデノシン受容体の活性は、（それぞれＣＧＳ−２１６ ８０及びＮＥＣＡにより）ｃＡＭＰの生産を剌激している。方法 オリゴヌクレオチドの設計及び合成 Ｇタンパクが結合した受容体のトランスメンブランII（ＴＭ II）及びIV（ＴＭ IV）部位に対応し、５′EcoRI制限酵素の認識部位（ＴＭ IIの３７７オリゴヌ クレオチド）または３’HindIII制限酵素の認識部位（ＴＭ IVの３０５及び３ ７６オリゴヌクレオチド）を含有する独自かつ制限されたオリゴヌクレオチドを 、アプライド バイオシステム製自動ＤＮＡ合成装置により合成した。そのオリ ゴヌクレオチド配列を以下に示す。 このＤＮＡ配列はイノシン（Ｉ）残基を含有している。この粗製のオリゴヌク レオチドを、ＰＣＲ法による増殖に供した。ＰＣＲ法による増殖 Ｇタンパクが結合した受容体のオリゴヌクレオチドに相当する配列は、ＰＣＲ 法及びハイバイドサーモサイクラー （Hybaid thermocycler）法を用いて、ヒ トｃ ＤＮＡから増殖した。ＤＮＡは、ラムダgt10内のヒト神経芽腫（クローンテック 製）ｃＤＮＡライブラリ及びラムダZapII内の海馬（ストラタジーン製）ｃＤＮ Ａライブラリから調製した。ＤＮＡは、約１０⁸のライブラリファージのフェノ ール及びクロロホルム抽出物から調製し、エタノールで沈澱させてＤＮＡを回収 した。ｃＤＮＡライブラリより得たＤＮＡ（１〜５μｇ）は、それぞれ５０ｍＭ のＫＣ１、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、及び１．５ｍＭのＭｇＣ ｌ₂（１％ＰＣＲバッファ）中に、２００μＭのｄＮＴＰＮ ０．５μＭのオリ ゴヌクレオチド、０．５ユニットのTth酵素（東洋紡製）とともに保持し、また 、反応時の体積は５０μｌとした。この試料に、５０μｌの明白色鉱油（シグマ 製）を重層した。 反応に際しては、まず試料を９５℃で５分間加温して変性させた。ＰＣＲの条 件を以下に示す。９２℃で２分間加温して変性させた後、５５℃で２分間加温し てアニーリングを行った。更に、９２℃で２分間、５０℃で２分間、及び７０℃ で２分間の加温を５回繰り返した後、９５℃で２分間、４５℃で２分間、及び７ ０℃で２分間の加温を３回繰り返して伸長させた。増幅されたＤＮＡ断片のサブクローニング及びシークエンシング 増幅されたＤＮＡ（２０μｌ）を分離し、１％のアガロース及び３％のＮｕシ ーブ（シーケン製）中にて、ゲル電気泳動により分析した。増幅による生産物の うち、２６０〜３３０塩基対の部分をゲルから抽出し、ジーンクリーン（genecl ean）により精製した。このＤＮＡ断片をHindIIIにより３７℃で１時間消化し、 次いでEcoRIにより３７℃で１時間消化した後、更にジーンクリーンで精製して から、１０μｌの水に溶解させた。消化されたＤＮＡ断片をM13mp19によりサブ クローンした後、ファルマシアまたはプロメガ製のＤＮＡシークエンシングキッ トを用いて、サンガーのジデオキシチェーンターミネーション法（dideoxychain -termination method）によりシークエンシングを行った。シークエンス反応は ７Ｍの尿素と６％のアクリルアミドからなるゲルにて分析し、ワットマン製３Ｍ 炉紙上で乾燥後、ｘ線フィルム（コダック製Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ５）を用い、 室温で一晩にわたり１６時間感光させた。新規なＤＮＡ配列の配列解析 ＰＣＲ法による増幅の結果生じたＤＮＡ断片の配列解析から、Ｇタンパクと結 合した他の公知の受容体に共通する２つのＤＮＡ断片を同定した。神経芽腫ｃＤ ＮＡを、制限されたオリゴヌクレオチド３７７及び３０５とともにＰＣＲ法にて 増幅させてｃＤＮＡ断片を得、これを配列３．１とした。また、ヒト海馬ｃＤＮ Ａを、制限されたオリゴヌクレオチド３７７及び３０６とともにＰＣＲ法にて増 幅させて、配列３．１とヌクレオチドにして７６％の相同性を有するｃＤＮＡ断 片を得、これを配列３．２とした。GenBankやEMBL等のデータベース上で、これ らのＤＮＡ配列と公知の配列とを比較したところ、これら新規な配列は、イヌＡ １及びＡ２アデノシン受容体と高い相同性を有していた。完全なｃＤＮＡクローンの単離 配列３．１及び３．２に相当する受容体の配列と同様にして、Ａ１受容体をエ ンコードする完全なｃＤＮＡクローンを、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリ（ストラ タジーン製）から単離した。Ａ１アデノシン受容体ｃＤＮＡの単離 ２番目の細胞外ループ（６７９）及び３番目の細胞内ループ（６７８）に相当 する、特異的に一致するオリゴヌクレオチドを、アプライド バイオシステム製 自動ＤＮＡ合成装置により合成した。そのオリゴヌクレオチド配列を以下に示す 。 約５×１０⁵個のプラークを、C600Hf1A細菌細胞上で培養した後、ハイボンド −Ｎ⁺ナイロンフィルター（アメルシャム製、０．４５μＭ、１３７ｍｍ）上に 移動 させた。ＤＮＡは、フィルター上にて、０．５ＭのＮａＯＨ及び１．５ＭのＮａ Ｃｌによる３分間の処理により変性させ、０．５Ｍのトリス（ｐＨ７．２）、１ ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ＭのＮａＣｌ中に５分間保持することにより中和した。 次いで、０．４ＭのＮａＯＨ中に２０分間保持してＤＮＡをフィルター上に固定 した後、フィルターを２×ＳＳＣ（３ＭのＮａＣｌ＋０．３Ｍのクエン酸ナトリ ウム）ですすぎ、更に乾燥させてから、４０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５ ×デンハルド溶液（Denhardt's solution）、５０ｍＭのＮａＰＯ₄、０．５％の ＳＤＳ、及び０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精液ＤＮＡとともに、室温で３０分間プレ ハイブリダイズした。一方、６７８及び６７９オリゴヌクレオチドを合わせ、総 量５０ピコモルを、γ³²Ｐ−ＡＴＰ及びＤＮＡ５′末端ラベリングシステム（プ ロメガ製）を用いて放射線ラベルし、フィルターを、この放射線ラベルされたプ ローブと４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした。続けて、室温で、２×ＳＳ Ｃにより１回簡単に洗浄した後、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳにより、室温で１ ０分間ずつそれぞれ２回洗浄し、最後に、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに より、５０℃で１５分間洗浄した。このフィルターに、Ｘ線フィルム（コダック 製Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ５）を−７０℃で一晩感光させ、放射線ラベルされた６７ ８及び６７９オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされた、１２以上の純粋なフ ァージを得た。また、これらにはそれぞれ異なるｃＤＮＡが配列されていた。こ うしたｃＤＮＡのうちのひとつの配列（及びそれから推察されるアミノ酸配列） は、図１に示した、ヒトＡ１アデノシン受容体をエンコードする配列である。Ａ２ａ及びＡ２ｂアデノシン受容体ｃＤＮＡの単離 約１×１０⁶個のプラークを、C600Hf1A細菌細胞上で培養した後、ハイボンド −Ｎ⁺ナイロンフィルター（アメルシャム製、０．４５μＭ、１３７ｍｍ）上に 移動させた。ＤＮＡは、フィルター上にて、０．５ＭのＮａＯＨ及び１．５Ｍの ＮａＣｌによる３分間の処理により変性させ、０．５Ｍのトリス（ｐＨ７．２） 、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ＭのＮａＣｌ中に７分間保持することにより中和し た。次いで、フィルターを２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、３ＭのＮａＣｌ＋０． ３Ｍのクエン酸ナトリウム）ですすぎ、紫外線灯（３１２ｎｍ）に５分間曝して ＤＮ Ａをフィルター上に固定した後、５×ＳＳＰＥ（５×ＳＳＰＥは、０．５ＭのＮ ａＣｌ＋０．０５ＭのＮａ₂ＰＯ₄＋０．０００５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．９）、 ５×デンハルド溶液（０．１％(W/V)のウシ血清アルブミン、０．１％(W/V)のフ ィコール、０．１％(W/V)のポリビニルピロリドン）、０．５％のＳＤＳＮ及び ０．２ｍｇ／ｍｌのサケ精液ＤＮＡとともに６５℃で１７時間処理し、プレハイ ブリダイズした。このフィルターを、ＰＣＲ法により増幅された（ランダムプラ イマーＤＮＡラベリングシステム（ベデスタ リサーチ ラボラトリー製）を用 い、（α−³²Ｐ）−ｄＣＴＰでラベルした）配列３．１のうち３００塩基対をエ ンコードするＤＮＡ断片に相当する放射線ラベルされたプローブとハイブリダイ ズした。放射線ラベルされたプローブとの６５℃、２０時間にわたるハイブリダ イゼーション後、フィルターを、２×ＳＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳにより室温で １０分間洗浄し、更に、１×ＳＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳにより室温で１０分間 洗浄した。このフィルターに、コダック製Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ５フィルムを、− ７０℃で７日間感光させたところ、放射線ラベルされた配列３．１のＤＮＡ断片 とハイブリダイズされた、２つの純粋なファージを得た。これら２つのＤＮＡ挿 入部分は、EcoRIを用いた消化によりファージベクタより切り出し、シークエン シングのため、M13mp19内にサブクローンした。シークエンスの分析の結果、約 ２．６キロベースのｃＤＮＡ挿入部分のひとつが、受容体３．２の全クローンを エンコードしていた。また、このｃＤＮＡ挿入部分の配列（及びそれから推察さ れるアミノ酸配列）は、図２に示した、３．１受容体（ヒトＡ２ａアデノシン受 容体）をエンコードする配列（及びそれから推察されるアミノ酸配列）である。 一方、３．２受容体（ヒトＡ２ｂアデノシン受容体）をエンコードする配列（及 びそれから推察されるアミノ酸配列）を図３に示す。クローンされたＡ１ Ａ２ａ及びＡ２ｂアデノシン受容体の哺乳類における発現 クローンされたそれぞれの完全なｃＤＮＡを、エンコードされた受容体相当部 位が直接発現するような方法で、哺乳類細胞に対する発現ベクタ（Ａ２ａ及びＡ ２ｂではpcDNA1neo、Ａ１ではpRc/CMV（インビトローゲン製））にサブクローン し た。 哺乳類細胞系（中国産ハムスター卵巣−ＣＨＯ Ｋ１またはヒト胎児腎臓ＨＥ Ｋ２９３）に、それぞれ独自に組換え発現ベクタをトランスフェクションした。 また、確立された細胞系は、完全にクローンされた受容体ＤＮＡを安定的に保持 していた。そして、安定してトランスフェクションされた細胞系について、図４ に示すように、一定範囲のアデノシン類似体との結合活性を調査し、更に、図５ に示すように、アデノシン作動薬による、受容体活性へのサイクリックＡＭＰ（ ｃＡＭＰ）の影響を調査した。 上記の研究は、ｃＤＮＡのクローン３．１がアデノシンＡ２ａ受容体をエンコ ードし、ｃＤＮＡのクローン３．２がアデノシンＡ２ｂ受容体をエンコードし、 かつＡ１ ｃＤＮＡがアデノシンＡ１受容体をエンコードすることを示している 。本発明により、純粋な受容体が相当量生産可能であることは、個々の受容体の 亜型に対する特異性の高い作動薬及び拮抗薬の設計及び化学合成を促進するため の手段として使用できる。また、本発明によって決定された関連する受容体の亜 型の間における一次配列の差異に対する知識は、受容体の亜型に特異的な作動薬 及び拮抗薬の設計に重要な情報を提供する。 当業者は、上記した各実施例で示すような本発明に対し、広範にわたり記載さ れた本発明の意図または目的を逸脱しない範囲で、多くの変形及び／または改良 が可能であることを認めるであろう。すなわち、本発明の実施例は、記載された あらゆる点で、本発明を制限するものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 タウンゼンドーニコルソン，コンスタンス アンドレア オーストラリア国 2173 ニュー サウス ウェールズ ワットル グローブ グラ ナラ コート 15 (72)発明者 シャイン，ジョン オーストラリア国 2110 ニュー サウス ウェールズ ウールウィッチ メイフィ ールド アベニュ ２ (72)発明者 ファーロング，ティモシィ オーストラリア国 2047 ニュー サウス ウェールズ ドラムモイン カレッジ ストリート ６／２‐４ (72)発明者 セルビー，リサ オーストラリア国 2060 ニュー サウス ウェールズ マクマホンズ ポイント マンロウ ストリート ２／８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトＡ１アデノシン受容体をエンコードするＤＮＡであって、基本的に図１ に示す配列、または機能的に同様な配列を有するＤＮＡ分子。 ２．ヒトＡ２ａアデノシン受容体をエンコードするＤＮＡであって、基本的に図 ２に示す配列、または機能的に同様な配列を有するＤＮＡ分子。 ３．ヒトＡ２ｂアデノシン受容体をエンコードするＤＮＡであって、基本的に図 ３に示す配列、または機能的に同様な配列を有するＤＮＡ分子。 ４．特許請求の範囲第１項のＤＮＡ分子が形質転換された細胞の、ＤＮＡ配列の 発現によりヒトＡ１アデノシン受容体が細胞表面に発現され、かつ必要に応じて ヒトＡ１アデノシン受容体が取り出されるような環境下での培養を含む、ヒトＡ １アデノシン受容体の生産方法。 ５．特許請求の範囲第２項のＤＮＡ分子が形質転換された細胞の、ＤＮＡ配列の 発現によりヒトＡ２ａアデノシン受容体が細胞表面に発現され、かつ必要に応じ てヒトＡ２ａアデノシン受容体が取り出されるような環境下での培養を含む、ヒ トＡ２ａアデノシン受容体の生産方法。 ６．特許請求の範囲第３項のＤＮＡ分子が形質転換された細胞の、ＤＮＡ配列の 発現によりヒトＡ２ｂアデノシン受容体が細胞表面に発現され、かつ必要に応じ てヒトＡ２ｂアデノシン受容体が取り出されるような環境下での培養を含む、ヒ トＡ２ｂアデノシン受容体の生産方法。 ７．特許請求の範囲第３項〜第６項に示す方法のうちの１つにより生産されたヒ トＡ１，Ａ２ａ及びＡ２ｂアデノシン受容体と分子との接触を含む、アデノシン に対し作動または拮抗活性を有する分子のスクリーニング方法。