JPH08509499A

JPH08509499A - ラパマイシン結合体及び抗体

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Publication number: JPH08509499A
Application number: JP6524408A
Authority: JP
Inventors: ゴンザレス，エドウアルド; ラツセル，ジヨン・シー; モルナー−キンバー，キヤサリン・エル
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-04-23
Filing date: 1994-04-22
Publication date: 1996-10-08
Also published as: ES2176245T3; EP0710110B1; DE69435044D1; US20010010920A1; EP1181938A2; JP2004168782A; DE69435044T2; EP1181938A3; ES2295093T3; AU6772094A; EP1181938B1; WO1994025022A1; EP0710110A1; JP2004149542A; US6328970B1; EP0710110A4; CA2161101A1; US6541612B2; AU686629B2; DE69430060D1

Abstract

(57)【要約】ラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体の産生、ラパマイシン又はその誘導体の量の測定、ラパマイシン結合タンパク質の単離及びラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体の検出のための免疫原性分子として有用なラパマイシン結合体を提供する。この発明はさらに、ラパマイシン又はラパマイシンの開環誘導体に特異的なモノクローナル抗体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ラパマイシン結合体及び抗体発明の背景本発明は、ラパマイシン（rapamycin）又はその開環誘導体に特異的な抗体の産生、ラパマイシン又はその誘導体の量の測定、ラパマイシン結合タンパク質の単離及びラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体の検出のための免疫原性分子として有用なラパマイシン誘導体に関する。ラパマイシンは、Streptomyces hygroscopicusによって産生されるマクロサイクリックトリエン抗生物質であり、特にin vitro及びin vivoのいずれにおいてもCandida albicansに対して抗真菌活性を有することが見いだされた〔C．Vezin aら，J．Antibiot．28，721（1975）；S.N．Sehgalら，J．Antibiot．28，727（ 1975）；H.A．Bakerら，J．Antibiot．31，539（1978）；米国特許第3,929,992 号；及び米国特許第3,993,749号〕。ラパマイシン単独（米国特許第4,885,171号）又はピシバニールと組み合わせたラパマイシン（米国特許第4,401,653号）は抗腫瘍作用を有することが示されている。R.Martelら〔Can．J．Physiol．Pharmacol．55，48（1977）〕は、ラパマイシンが多発性硬化症用のモデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎モデル、リューマチ性関節炎モデルであるアジュバント関節炎モデルに有効であり、且つＩｇＥ様抗体の形成を有効に阻害し得ることを開示した。ラパマイシンの免疫抑制作用は、FASEB 3，3411（1989）に開示されている。他のマクロサイクリック分子であるシクロスポリンＡ及びＦＫ−５０６も免疫抑制剤として有効であり、従って移植片拒否反応の予防に有用であることが示されている〔FASEB 3，3411（1989）；FASEB 3、5256（1989）；R.Y．Calneら，Lanc et 1183（1978）；及び米国特許第5,100,899号〕。ラパマイシンはまた、全身性エリテマトーデス〔米国特許第5,078,999号〕、肺の炎症〔米国特許第5,080,899号〕、インシュリン依存性真性糖尿病〔Fifth I n．Conf．Inflamm．Res．Assoc．121（Abstract），（1990）〕、成人のＴ細胞白血病／リンパ腫〔欧州特許出願公開第525,960号〕、並びに平滑筋細胞増殖及び脈管損傷後の血管内膜厚化〔Morris，R.J．Heart Lung Transplant 11（第２部）：197（1992）〕の予防及び治療にも有用であることが示されている。ラパマイシンのモノ及びジアシル化誘導体（２８位及び４３位でエステル化された）は、抗真菌剤（米国特許第4,316,885号）として有用であることが示されており、ラパマイシンの水溶性プロドラッグ（米国特許第 4,650,803号）の製造に用いられている。最近、ラパマイシンのナンバリング規約が変わった。従って、ケミカルアブストラクト命名法によれば、上記のエステルは３１位及び４２位に存在する。米国特許第5,100,883号はラパマイシンのフッ素化エステルを開示している。米国特許第5,118,677号はラパマイシンのアミドエステルを開示している。米国特許第5,118,678号はラパマイシンのカルバメートを開示している。米国特許第5,130,307号はラパマイシンのアミノエステルを開示している。米国特許第5,177,203号はラパマイシンのスルホネート及びスルファメートを開示している。米国特許第5,194,447号はラパマイシンのスルホニルカルバメートを開示している。ＰＣＴ出願公開W092/05179号はラパマイシンのカルボン酸エステルを開示している。 Yatscoffは、ＨＰＬＣ法を用いてラパマイシンの量を１ng/mlの感度で定量し得ると報告している〔Ther．Drug Monitoring 14：138（1992）〕。この方法は時間がかかり、各試料は個別に検定しなければならない。多くのタンパク質並びにシクロスポリンＡ〔Morris，R.G.，Ther．Drug Monit oring 14：226-（1992）〕及びＦＫ506〔Tamura，Transplant Proc．19：23（19 87）；Cadoff，Transplant Proc．22：50（1990）〕を含む種々の薬剤用のイムノアッセイが開発されている。タンパク質又は化合物の測定に開発された多種のイムノアッセイは、拮抗阻害、二重抗体、受容体−抗体相互作用、抗原の捕獲、ディップスティック、抗体又は受容体の捕捉、又はアフィニティークロマトグラフィーに基づいている。ラパマイシン類縁体がマトリックスに共有結合しているラパマイシンを有するアフィニティーカラムが報告されている〔Fretz J．Am．C hem．Soc．113：1409（1991）〕。これらのカラムはラパマイシン結合タンパク質の単離に用いられている。本発明の説明本発明は、構造〔式中、Ｒ¹及びＲ²はそれぞれ独立に、水素又は−（Ｒ³−Ｌ−Ｒ⁴）_a−であり；Ｌは結合基であり；Ｒ³は、カルボニル、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）₂−、−Ｐ（Ｏ）₂−、−Ｐ（Ｏ）（ＣＨ₃）−、−Ｃ（Ｓ）−及び−ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；Ｒ⁴は、カルボニル、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＨ₂−及び−Ｏ−からなる群から選択され；ａ＝１〜５であり；ｘ＝０〜１であり；ｙ＝０〜１であり；ｚは約１〜約120であり；担体は、免疫原性担体材料、ディテクター担体材料若しくは固体マトリックス又はその塩であり、但し、Ｒ¹及びＲ²は共に水素ではなく、ａが１より大きい場合には各Ｌ基は同一でも異なっていてもよく、さらに、Ｒ¹が水素の場合ｘは０であり、Ｒ²が水素の場合ｙは０であり、ｘ及びｙが共に１の場合、担体部分はどちらの場合も同一である〕を有する式Ｉのラパマイシン結合体を提供する。結合基Ｌは、一方の末端に基Ｒ³を、他方の末端にＲ⁴を含み、従って、結合基が一方の末端ではラパマイシンの４２−及び／又は３１−ヒドロキシル基に結合し、他方の末端では別の結合基又は免疫原性担体材料、ディテクター材料又はマトリックスに結合し得る任意の部分である。ａが１より大きい場合、各Ｌ基は同一でも異なっていてもよい。そのような場合、第１のＬ基はＬ¹、第２のＬ基はＬ²というように称される。本発明のラパマイシン結合体は多岐にわたる結合基（Ｌ）及び末端官能基Ｒ⁴を含むように製造し得る。例えば、Ｌは、１〜15個までの範囲、より一般的には10個未満、通常６個未満の炭素原子を含む直鎖又は分枝鎖アルキレン（即ち、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、ｉｓｏ−プロピレン、ｎ−ブチレンなど）であってよい。さらに、そのようなアルキレンは、シアノ、アミノ（置換アミノを含む）、アシルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシル、カルボニル基、カルボキシル（置換カルボキシル、例えば、エステル、アミド及び置換アミドを含む）のような他の置換基を含んでいてよい。結合基Ｌは、置換若しくは非置換アリール、アラルキル又はヘテロアリール基（例えば、フェニレン、フェネチレンなど）も含んでいてよい。さらに、そのような結合基は、エーテル、エステル、アミド、アミノ、チオエーテル、アミジノ、スルホン又はスルホキシドの形態の、窒素、硫黄及び酸素から選択される１個以上のヘテロ原子を含んでいてよい。またそのような結合基は、オレフィン又はアセチレン結合、ジスルフィド、イミノ又はオキシイミノ基のような不飽和基を含んでいてよい。Ｌが、水素を除く１〜約20個の原子、より一般的には１〜10個の原子、そのうち０〜５個は好ましくは窒素、酸素及び硫黄から選択される原子を含む一般に脂肪族の鎖であるのが好ましい。従って、結合基Ｌの選択は、本発明にあっては重要ではなく、安定な化合物を確実に生成させるための通常の予防処置を講じて当業者が選択し得る。本発明の好ましい実施態様は、構造〔式中、Ｒ¹及びＲ²はそれぞれ独立に水素又は−Ｒ³−Ｌ−Ｒ⁴−であり；Ｌは−Ａ−（ＣＲ⁵Ｒ⁶）_b〔Ｂ−（ＣＲ⁷Ｒ⁸）_d〕_e−であり、Ａは−ＣＨ₂−又は−ＮＲ⁹−であり；Ｂは−Ｏ−、−ＮＲ⁹−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−又は−Ｓ（Ｏ）₂−であり；Ｒ³は、カルボニル、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）₂、−Ｐ（Ｏ）₂−、−Ｐ（Ｏ）（ＣＨ₃）−、−Ｃ（Ｓ）−及び−ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；Ｒ⁴は、カルボニル、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＨ₂−及び−Ｏ−からなる群から選択され；Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷及びＲ⁸はそれぞれ独立に、水素、１〜６個の炭素原子を含むアルキル、２〜７個の炭素原子を含むアルケニル、２〜７個の炭素原子を含むアルキニル、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、７〜10個の炭素原子を含むアリールアルキル、１〜６個の炭素原子を含むアミノアルキル、１〜４個の炭素原子を含むヒドロキシアルキル、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、２〜７個の炭素原子を含むカルボアルコキシ、シアノ、アミノ、ＣＯ₂Ｈ、又は１〜６個の炭素原子を含むアルキル、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、ハロ、ニトロ、２〜７個の炭素原子を含むカルボアルコキシ、トリフルオロメチル、アミノ又は−ＣＯ₂Ｈから選択される置換基で任意にモノ、ジー又はトリ置換されるフェニルであり；Ｒ⁹は、水素、１〜６個の炭素原子を含むアルキル又は７〜10個の炭素原子を含むアラルキルであり；ｂ＝０〜10であり；ｄ＝０〜10であり；ｅ＝０〜２であり；ｘ＝０〜１であり；ｙ＝０〜１であり；ｚは約１〜約120であり；担体は、免疫原性担体材料、ディテクター担体材料若しくは固体マトリックス、又はその塩であり、但し、Ｒ¹及びＲ²は共に水素ではなく、ｂが１より大きい場合ＣＲ⁵Ｒ⁶基は同一でも異なっていてもよく、ｄが１より大きい場合、各ＣＲ⁷ Ｒ⁸はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、さらにＲ¹が水素の場合ｘは０であり、Ｒ²が水素の場合ｙは０であり、ｘ及びｙは共に１の場合担体部分はどちらの場合も同一である〕を有する式IIの結合体を提供する。本発明の第２の好ましい実施態様は、構造〔式中、Ｒ¹及びＲ²はそれぞれ独立に、水素又は−（Ｒ³−Ｌ¹−Ｒ⁴）_f−（Ｒ¹⁰ −Ｌ²−Ｒ¹¹）_g−担体であり；Ｌ¹は−（ＣＨ₂）_h−ＣＨＲ¹²−（ＣＨ₂）_j−であり；Ｌ²は−（ＣＨ₂）_k−Ｄ−（ＣＨ₂）_m−Ｅ−であり；Ｄは−ＣＨ₂−、−Ｓ−Ｓ−又はであり；であり；Ｒ³及びＲ¹⁰はそれぞれ独立に、カルボニル、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）₂、− Ｐ（Ｏ）₂−、−Ｐ（Ｏ）（ＣＨ₃）−、−Ｃ（Ｓ）−及び−ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；Ｒ⁴及びＲ¹¹はそれぞれ独立に、カルボニル、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＨ₂−及び−Ｏ−からなる群から選択され；Ｒ¹²は、水素、１〜６個の炭素原子を含むアルキル、７〜10個の炭素原子を含むアリールアルキル、２〜７個の炭素原子を含むアルケニル、２〜７個の炭素原子を含むアルキニル、−（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ¹³、−（ＣＨ₂）_pＮＲ¹⁴Ｒ¹⁵、２〜３個の炭素原子を含むカルバミルアルキル、１〜４個の炭素原子を含むアミノアルキル、１〜４個の炭素原子を含むヒドロキシアルキル、２〜４個の炭素原子を含むグアニルアルキル、１〜４個の炭素原子を含むメルカプトアルキル、２〜６個の炭素原子を含むアルキルチオアルキル、インドリルメチル、ヒドロキシフェニルメチル、イミダゾイルメチル、ハロ、トリフルオロメチル、又は１〜６個の炭素原子を含むアルキル、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、ハロ、ニトロ、２〜７個の炭素原子を含むカルボアルコキシ、トリフルオロメチル、アミノ又は−ＣＯ₂ Ｈから選択される置換基で任意にモノ−、ジ−又はトリ置換されるフェニルであり；Ｒ¹⁴及びＲ¹⁵はそれぞれ独立に、水素、１〜６個の炭素原子を含むアルキル又は７〜10個の炭素原子を含むアリールアルキルであり；Ｒ¹³は、水素、１〜６個の炭素原子を含むアルキル、７〜10個の炭素原子を含むアリールアルキル、２〜７個の炭素原子を含むアルケニル、２〜７個の炭素原子を含むアルキニル、又は１〜６個の炭素原子を含むアルキル、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、ハロ、ニトロ、２〜７個の炭素原子を含むカルボアルコキシ、トリフルオロメチル、アミノ又は−ＣＯ₂Ｈから選択される置換基で任意にモノ−、ジ−又はトリ置換されるフェニルであり；ｆ＝０〜３であり；ｇ＝０〜１であり；ｈ＝０〜10であり；ｊ＝０〜10であり；ｋ＝０〜10であり；ｍ＝０〜10であり；ｎ＝０〜６であり；ｐ＝０〜６であり；ｘ＝０〜１であり；ｙ＝０〜１であり；ｚは約１〜約120であり；担体は、免疫原性担体材料、ディテクター担体材料若しくは固体マトリックス、又はその塩であり、但し、Ｒ¹及びＲ²は共に水素ではなく、ｆ及びｇは共に０ではなく、ｆが１より大きい場合、各−（Ｒ³−Ｌ¹−Ｒ⁴）一部分は同一でも異なっていてもよく、さらにＲ¹が水素の場合ｘは０であり、Ｒ²が水素の場合ｙは０であり、ｘ及びｙが共に１の場合、担体部分はどちらの場合も同一である〕を有する式IIIの結合体を提供する。本発明はさらに、構造〔式中、Ｒ¹は−ＯＣＨ₂（ＣＨ₂）_qＲ⁴−であり；Ｒ⁴は、カルボニル、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＨ₂−及び−Ｏ−からなる群から選択され；ｑ＝０〜６であり；ｚは約１〜約120であり；担体は、免疫原性担体材料、ディテクター担体材料若しくは固体マトリックス又はその塩である〕を有する式IVの結合体を提供する。免疫原性担体材料は、慣用的に用いられている公知の任意の材料から選択してよい。大抵の場合、担体はタンパク質又はポリペプチドであろうが、十分なサイズと免疫原性を有する炭水化物、多糖類、リポ多糖、核酸などのような他の材料を用いてもよい。大抵の場合、免疫原性タンパク質及びポリペプチドは、5,000〜10,000,000の範囲、好ましくは15,000より大きく、より一般的には40, 000より大きい分子量を有している。一般に、１つの動物種から採取したタンパク質は、他の種の血流中に導入されると免疫原性になる。特に有用なタンパク質は、アルブミン、グロブリン、酵素、ヘモシアニン、グルテリン又は有意な非タンパク性成分、例えば、糖タンパク質などを有するタンパク質のようなタンパク質である。慣用の免疫原性担体材料及び該担体材料にハプテンを結合させる方法に関する最新技術は以下の文献を参照されたい：Parker，Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds，Prentice-Hall（Englewood cliffs，N.J.，US A，1976），Butler，J．Immunol．Meth．7:1-24（1975）及びPharmacol．Rev．2 9(2)；103-163（1978）；Weinryb及びShroff，Drug Metab．Rev．10:271-283ページ（1975）；Broughton及びStrong，Clin．Chem．22:726-732（1976）；並びにPlayfairら，Br．Med．Bull．30:24-31（1974）。本発明に用いるのに好ましい免疫原性担体材料は、オボアルブミン及びＫＬＨである。本発明に用いるのに特に好ましい担体材料はオボアルブミンである。ディテクター担体材料は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼのような酵素、フルオレセインセン又はフルオレセイン誘導体、テキサスレッド又はローダミンのような蛍光部分、化学発光部分などに結合したラパマイシン結合部分であってよい。固体マトリックス担体材料は、樹脂ビーズ、ＥＬＩＳＡプレート、ラジオイムノアッセイに慣用的に用いられているガラス板、プラスチックビーズ、一般にディップスティックタイプのアッセイに用いられる固体マトリックス材料であってよい。ラパマイシンが固体マトリックスに結合すると、得られた結合体は、本発明に開示されているように、抗体の親和性精製用又はラパマイシン結合タンパク質単離用のディップスティックアッセイに用いることができる。上記の特異的ラパマイシン結合体を表す式に用いられている場合、ｚは担体材料に結合したラパマイシンの数を表す。値ｚは、免疫原、ディテクター又は固体マトリックスのエピトープ密度と称されることもあり、通常、平均して約１〜約 120の範囲、より一般的には１〜50の範囲である。しかし該密度は用いられる特定の担体材料に応じて大きく変化し得る。本発明の化合物がどれでも、アリール又はアリールアルキル部分を含む場合、該アリール部分は、１〜６個の炭素原子を含むアルキル、７〜10個の炭素原子を含むアリールアルキル、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、シアノ、ハロ、ニトロ、２〜７個の炭素原子を含むカルボアルコキシ、トリフルオロメチル、アミノ、アルキル基１個当たり１〜６個の炭素原子を含むジアルキルアミノ、１〜６個の炭素原子を含むアルキルチオ、−ＳＯ₃Ｈ及び−ＣＯ₂Ｈから選択される基で任意にモノ−、ジ−又はトリ置換されるよい、フェニル、ナフチル、ピリジル、キノリル、イソキノリル、キノオキサリル、チエニル、チオナフチル、フリリル、ベンゾフリル、ベンゾジオキシル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル又はベンゾジオキソリル基であるのが好ましい。アリール部分が、１〜６個の炭素原子を含むアルキル、７〜10個の炭素原子を含むアリールアルキル、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、シアノ、ハロ、ニトロ、２〜７個の炭素原子を含むカルボアルコキシ、トリフルオロメチル、アミノ、アルキル基１個当たり１〜６個の炭素原子を含むジアルキルアミノ、１〜６個の炭素原子を含むアルキルチオ、−ＳＯ₃Ｈ及び−ＣＯ₂Ｈから選択される基で任意にモノ−、ジ−又はトリ置換されるフェニル基であるのがより好ましい。塩は、ナトリウム、カリウムなどのような無機カチオン、アルキル基１個につき１〜６個の炭素原子を含むモノ−、ジ−及びトリアルキルアミン及びアルキル基１個につき１〜６個の炭素原子を含むモノ−、ジ−、トリヒドロキシアルキルアミンなどのような有機塩基、並びに有機酸及び無機酸、例えば、酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、マロン酸、グルコン酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸及び同様な公知の許容し得る酸から誘導されたものである。本発明の化合物は、ラパマイシンの４２及び／又は３１−ヒドロキシル基とリンカー基部分としての役割を果たす適当な求電子試薬とを反応させて製造し得る。以下の特許明細書は、本発明の化合物を製造するための結合基として使用し得るラパマイシンの４２及び／又は３１−誘導体の製造を示している。ラパマイシンのフッ素化エステルの製造は、米国特許第5,100,883号明細書に記載されている。アミドエステルの製造は米国特許第5,118,677号明細書に開示されている。ラパマイシンのカルバメートの製造は米国特許第5,118,678号明細書に開示されている。ラパマイシンのアミノエステルの製造は米国特許第5,130,307号明細書に記載されている。ラパマイシンのスルホネート及びスルファメートの製造は米国特許第5,177,203号明細書に記載されている。ラパマイシンのスルホニルカルバメートの製造は米国特許第5,194,447 号明細書に記載されている。上記に引用した米国特許の開示は本明細書に参考として組み込むものとする。これらの特許から、カルバメートの製造に用いられるイソシアナート又はスルホネートの製造に用いられるスルホニルクロリドのような反応性求電子剤は活性化剤を用いる必要なしに、ラパマイシンのヒドロキシル基と反応し得ることがわかる。カルボン酸を用いてラパマイシンのヒドロキシル基をエステル化するために、通常ＤＣＣ又はその水溶性類縁体、例えばジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＤＡＥＣ）のような結合試薬を用いた活性化が必要とされる。ラパマイシン結合基部分の製造の代表的な例を以下に実施例として示す。ラパマイシンの他の誘導体は実施例１８に開示されている方法を用いて達成し得る。リンカー基が４２−ヒドロキシル基又は３１，４２−ヒドロキシル基に結合している本発明の化合物の場合は、求電子剤（又は活性化求電子剤）をラパマイシンと反応させて、典型的にはクロマトグラフィーによって分離可能な４２−及び３１，４２−誘導体化ラパマイシン混合物を得る。リンカー基がラパマイシンの３１−ヒドロキシルに結合している本発明の化合物の場合は、４２−ヒドロキシル基を適当な保護基、例えばｔ−ブチルジメチルシリル基で保護しなければならない。次いで３１−ヒドロキシルを適当な求電子剤と反応させて、誘導体化ラパマイシンを得、その後で４２−ヒドロキシル基の脱保護をする。ラパマイシンの４２−Ｏ−シリルエーテルの製造及びその後の脱保護は、米国特許第5,120,842号明細書に記載されており、該明細書は本明細書に参考として組み込むものとする。種々のリンカーを３１位及び４２位に含む化合物は、先ず４２−誘導体化化合物を製造し、次いで種々のリンカーを用いて３１位を誘導体化することにより製造し得る。２７−オキシム結合基は、米国特許第5,023, 264号明細書に開示されている方法を用い、実施例２１に記載のようにして製造することが可能である。該特許明細書は、本明細書に参考として組み込むものとする。ラパマイシンに結合したリンカー基は、ペプチド文献に記載されている標準的な方法を用い、典型的にはＤＣＣタイプの結合試薬若しくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて又は活性化エステル若しくは無水物として求電子部分を活性化することにより、第２のリンカー基に結合させることができる。次いで一方の結合部分の活性化求電子末端が他方のリンカー部分の求核末端と反応させることが可能である。ラパマイシン結合基部分と免疫原性担体との結合は、標準的な文献記載条件下に行うことが可能である。一般に、免疫原性担体材料上の求核基との反応の場合は、結合基上のカルボン酸のような求電子部分をＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような適当な活性化剤で活性化し、次いで免疫原性担体材料上の求核部分と反応させる。実施例２及び３は特にこの方法を示すものである。同様な方法が結合基上の求核部分と免疫原性担体材料上の求電子部分との結合に用いられる。そのような場合、免疫原性担体材料上の求電子部分を上記のように活性化し、次いで結合基の求核性末端と反応させる。本発明の化合物の製造に用いられる試薬は、市販のものでもよいし、当該文献に開示されている方法により製造してもよい。本発明はさらに、２９−デメトキシラパマイシン〔米国特許第4,375,464号明細書、Ｃ．Ａ．命名法下では３２−デメトキシラパマイシン〕；１−、３−及び／又は５位の二重結合が還元されているラパマイシン誘導体〔米国特許第5,023, 262号明細書〕；４２−オキソラパマイシン〔米国特許第5,023,262号明細書〕；ラパマイシンの２７−オキシム〔米国特許第5,023,264号明細書〕；ラパマイシンの２７−ヒドラゾン〔米国特許第5,120,726号明細書〕；２９−デスメチルラパマイシン〔米国特許第5,093,339号明細書、Ｃ．Ａ．命名法下では３２−デスメチルラパマイシン〕；７，２９−ビスデスメチルラパマイシン〔米国特許第5, 093,338号明細書、Ｃ．Ａ．命名法下では７，３２−デスメチルラパマイシン〕；並びに１５−ヒドロキシ−ラパマイシン及び１５，２７−ビスヒドロキシ−ラパマイシン〔米国特許第5,102,876号明細書〕のような他のラパマイシンの同類の結合体も包含し得るが、それらには限定されない。上記に引用した米国特許明細書に開示されている内容は本明細書に参考として組み込むものとする。ジエチルアジドジカルボキシレートが付加されたラパマイシン１，３−ディールスーアルダー付加化合物及びフェニルトリアゾリンジオンが付加されたラパマイシン１，３−ディールスーアルダー付加化合物の結合体も包含される。これらの化合物の製造は実施例１４及び１５に記載されている。本発明の化合物は、ラパマイシン及びその誘導体に特異的な抗体の産生及び検出、生物学的又は実験用流体におけるラパマイシン若しくはその誘導体の量の測定及びラパマイシン結合タンパク質の単離のために有用なラパマイシンの免疫原、ディテクター及びマトリックスが結合した結合体である。本明細書に定義されているラパマイシン誘導体は、ラパマイシン核、ラパマイシン代謝物又は開環ラパマイシン（例えば、本明細書に参考として組み込まれる米国特許第5,252,579 号に記載のセコラパマイシン）を含む化合物である。該化合物においては、１つ以上のヒドロキシル基がカルボン酸エステル、カルバメート、スルホン酸エステル、アミドなどにエステル化されているか、あるいは１つ以上のケトンがヒドロキシル基に還元されているか、あるいは１つ以上の二重結合が還元されているか、あるいは１つのケトンがオキシム又はヒドラゾンに変換されている。本発明の化合物を抗体量の測定又は抗体の産生に用い得る他のラパマイシン誘導体は、本発明の開示を基にすれば当業者には明らかであろう。本発明のラパマイシン免疫原結合体を用いたラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体は、当該技術において公知の標準法により産生し得る。一般的には、宿主動物の１カ所以上の部位に免疫原結合体を単独又はアジュバントと組み合わせて接種する。典型的な宿主啼乳類には、マウス、ヤギ、ウサギ、モルモット、ヒツジ又はウマが含まれるが、それらには限定されない。十分なタイターを有する抗体が産生されるまで引き続き注射を行ってよい。本発明のラパマイシン免疫原結合体から産生した抗体は、ラパマイシン量の測定、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ及び蛍光イムノアッセイなど多くのイムノアッセイに用いることが可能である。多くの異種イムノアッセイ（抗原捕獲、抗体捕獲、拮抗阻害又は２抗体イムノアッセイ）を用いることが可能ではあるが、以下のような基本的な拮抗阻害イムノアッセイを行うことが可能である：リガンド特異抗体は通常マトリックスに結合する。溶液を加えて、リガンドとマトリックスの非特異的結合を弱める。場合によって、過剰物をリンスした後で抗体結合マトリックスを貯蔵し得るように処理する。拮抗阻害アッセイでは、リガンド標準曲線を作成し、ラパマイシンディテクター結合体を加えて、ラパマイシン特異抗体に結合するために競合させる。必要に応じて過剰物を除去する。当業者により用いられている標準法によりディテクター分子を検出する。ディップスティックアッセイ、ＦＰＩＡ、ＥＭＩＴ、ＥＬＩＳＡ、ＶＩＳＴＡ、ＲＩＡ及びＭＥＩＡを含む種々のフォーマットを用いてよいがそれらには限定されない。本発明のディテクター結合体を製造して上記のアッセイに用いることが可能である。例えば、ディテクター結合体は標識蛍光部分、化学発光部分又は酵素部分を含む担体材料であってよい。本発明はさらに、市販し得る試験キットにおけるラパマイシン免疫原結合体又はラパマイシン若しくはその誘導体に特異的な抗体の使用を提供する。該試験キットは、生物学的又は実験用流体におけるラパマイシン量の測定に用い得る。試験キットの成分は、ラパマイシン若しくはその誘導体に対する抗体、抗血清又はラパマイシン担体結合体を含んでいてよい。結合体又は抗体は固体マトリックスに結合し得、ラパマイシン誘導体又は抗体はアッセイに必要な場合には放射標識し得る。標準濃度曲線を生成し得るようにラパマイシンの標準濃縮物を含んでいてよい。適当な容器、マイクロタイタープレート、固体支持体、試験管、トレイもそのようなキットに含まれていてよい。用いられるアッセイのタイプに応じてキット中に多様な試薬を含んでいてよい。以下に、ラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体を産生するための及びＥＬＩＳＡフォーマットイムノアッセイを用いて該抗体を検出するための本発明のラパマイシン免疫原結合体の使用を示す。完全フロイントアジュバント中のグルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルとＫＬＨとの結合体50μgで５匹のマウスに脾臓内免疫感作し、約１カ月後、完全フロイントアジュバント中のグルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルとＫＬＨとの結合体50μg でフットパッド中に追加免疫した。マイクロタイタープレート（Immunolon I）を一晩100μlのヤギ抗マウス抗体〔10mMのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.2）中1 0μg/ml）を用いて４℃でコーティングした。プレートを軽く振り、リン酸緩衝塩水中100μlの１％ウシ血清アルブミンを用いて４℃で一晩ブロックした。プレートを軽く振り、10mMのリン酸緩衝液（ｐＨ7.05）、30mMのＮａＣｌ、0.02％のTriton Ｘ−100及び0.004％のチメロサール洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ウエルにリン酸緩衝溶液で希釈した各マウス血清100μlを加え、室温で一晩インキュベートした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、グルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体〔実施例１０の化合物（100μl、0. 5ng/ml）〕を加え、室温で１時間暗所でインキュベートした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、Ｈ₂Ｏ₂と共にテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を加え、プレートを室温で30分間暗所でインキュベートした。450nmの分光光度計で光学密度を読み取った。表１に示されているように、５匹のマウス全部がグルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体（実施例１０の化合物）に反応性の抗体を有していた。表１の結果は、マウス6904が実施例１０の化合物に対して最高量の抗体を産生したことを示している。標準法を用いてハイブリドーマを産生した。実施例４の化合物を用いて免疫感作し、３回追加免疫したマウスの脾摘の後で、脾臓細胞をＳＰ２０と融合させてハイブリドーマを産生した。以下に簡単に説明するＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体の産生についてハイブリドーマを評価した。 100μlのヤギ抗マウス抗体〔10mMのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.2）中10μg /ml）を用いてマイクロタイタープレート（Immunolon I）を一晩４℃でコーティングした。プレートを軽く振り、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中100μlの１％ウシ血清アルブミンを用いて一晩４℃でブロックした。プレートを軽く振り、0.02％Triton Ｘ−100及び0.004％チメロサールを含む0.2 ×ＰＢＳで３回洗浄した後、ウエルに各ハイブリドーマ上清100μlを加え、室温で一晩インキュベートした。プレートを軽く振り、0.02％Triton Ｘ−100及び0. 004％チメロサールを含む0.2×ＰＢＳで３回洗浄した後、実施例２２の化合物（ 100μl、0.17μM）を加え、４℃で１時間インキュベートした。プレートを軽く振り、0.02％Triton Ｘ−100及び0.004％チメロサールを含む0.2×ＰＢＳで３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（100μl、0.2μg/ml）に結合したストレプトアビジン又はアビジンを加え、室温で１時間暗所でインキュベートした。プレートを軽く振り、0.02％Triton Ｘ−100及び0.004％チメロサールを含む0 .2×ＰＢＳで３回洗浄した後、ＴＭＢ基質及びＨ₂Ｏ₂を加え、プレートを被覆して室温で30分間暗所でインキュベートした。450nmの分光光度計で光学密度を読み取った。読み取られた光学密度が0.25〜３の範囲であったことは、特異的抗体結合を示している。表２の結果は、ウエルＰ４Ｇ１由来のハイブリドーマが実施例２２の化合物に正の結合をしており、従ってラパマイシン又はその誘導体に特異的であることを示している。Ｐ４Ｇ１のハイブリドーマ細胞系を限界希釈によりクローン化し、ハイブリドーマ細胞系ＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ₂＃１ｈｃ−と称する。蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）において、コハク酸とのラパマイシン４２−エステルと５−グリシニルフルオレセインアミンとの結合体（実施例２３ａ）を10nMの濃度でトレーサーとして用い、100nMのリン酸ナトリウム（ｐＨ7.5）中、77mPの偏光を示した。過剰なＦＫＢＰ１２を添加した後では、測定された偏光は195mPであり、過剰なＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ₂＃１ＭｏＡｂを添加した後では、偏光は84mPであった。上記トレーサーの開環非酵素的転換産物（コハク酸とのセコラパマイシン４２−エステルと５−グリシニルフルオレセインアミンとの結合体、実施例２４）をＴＬＣプレート上で単離した（50クロロホルム：４メタノール：0.5酢酸；３種の化合物の中最も遅く移動した）。実施例２３及び２４のラパマイシン−及びセコラパマイシン−フルオレセイン誘導体は、ＦＫＢＰ１２及びＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ₂＃１ＭｏＡｂに結合することを特徴としていた。10nMのラパマイシン−フルオレセイン1.00mLに0.01μg のＦＫＢＰ１２を添加すると、蛍光偏光が57mPから148mPに増大したが、セコラパマイシン−フルオレセイン誘導体の蛍光偏光は49mPから58mPに増大したにすぎず、これは、セコ誘導体がはるかに弱くしか結合しないことを示している。ラパマイシン誘導体に５μg/mlのＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ₂＃１ＭｏＡｂを添加すると、蛍光偏光は58mPで変わらないが、セコラパマイシン誘導体の蛍光偏光は44mP から136mPに増大した。ＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ₂＃１ＭｏＡｂがセコラパマイシン−フルオレセイン誘導体に特異的に結合するが、そのラパマイシン−フルオレセイン前駆体には結合しないことを示している。これら２つの系の特異性はアッセイフォーマットでも示された。500μlの10μ g/mlＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ₂＃１に、ラパマイシン又はセコラパマイシンを加えて、０〜100nMの範囲の最終濃度にした。500μLの20nMセコラパマイシン −フルオレセインを添加すると、分析物の不在下では蛍光偏光は124mPであり、1 00nMのラパマイシンの存在下での蛍光偏光は120mPであり、100nMのセコラパマイシンの存在下では74mPであった。従って、セコラパマイシンはＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ₂＃１に対するセコラパマイシンフルオレセイン誘導体の結合を阻害したが、ラパマイシンは何の作用もしなかった。逆の実験では、0.02μg/mlのＦＫＢＰ１２に、ラパマイシン又はセコラパマイシンを加えて、０〜100mMの最終濃度にした。20nMのラパマイシン−フルオレセイン500μlを加えると、分析物の存在下での蛍光偏光は128mPであり、100nMのラパマイシンの存在下では61mPであり、 100nMのセコラパマイシンの存在下では122mPであった。この場合、ラパマイシンは結合を阻害したが、セコラパマイシンは何の作用もしなかった。ラパマイシンに特異的な３４−２９４−１６３ＭｏＡｂと称される第２の抗体を以下のようにして製造した。６〜８週齢のメスＰＢＦ／ＤｎＪマウス（Jackso n Laboratories，Bar Harbor，Maine）を、フロイントアジュバント（Difco，De troit，Michigan）中で乳化したヘミスクシネートリンカーを含むウシ血清アルブミンに４２位で結合したラパマイシン（ＲＡＰＡ−４２−ＨＳ−ＢＳＡと称する）を用いて免疫感作した。フロイント完全アジュバントを用いて一次免疫感作し、次いでフロイント不完全アジュバントを用いて免疫追加した。この長期免疫感作動物用の動物の追加免疫間隔は、１、３、９及び19週であり、動物１匹当たりそれぞれ50、25、25及び 100μgの用量レベルで、その都度２カ所の皮下位置で行った。動物に14週の休養期間を与え、その後で融合の３日前に脾臓に５μgの融合前追加免疫を投与した。融合当日に、素早く頚管を脱きゅうさせてマウスを安楽死させ、脾臓を取り出した。脾臓細胞をIscove's Modified Dulbecco's Medium（ＩＭＤＭ）（GIBC0， Grand Island，New York）中で１度洗浄し、1000rpmで10分間遠心した。ペレット化した脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞（Dr．Milstein，Cambridge，United Kingdom）と１：１の割合で合わせ、ＩＭＤＭ中で洗浄、遠心した。上清を除去し、ペレットに１mlの50％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（American Type Culture Collection，Rockville，Maryland）を１分間で加え、その間、ペレットがゆっくり分散するように軽くたたいたりかき回したりした。混合物にＩＭＤＭ30mlを加え、上記のように遠心した。上清をデカントし、ペレットをヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ）（GIBCO）及び10％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Hyclone Laboratories，Logan，Utah）と共にＩＭＤＭに最懸濁した。融合頻度を高めるために、96ウエルの組織培養プレートに入った融合細胞懸濁液に、0.5％のSalmonella typhimuriumマイトジェンｖ／ｖ（STM；RIBI I mmunochem Research，Inc.，Hamilton，Montana）及び１％ｖ／ｖＯＲＩＧＥＮ（Igen，Rockville，Maryland）を加えた。融合の一次スクリーニングは１０日目の集密期培養時に行った。ＥＩＡを用いて、上清試料中の抗ラパマイシンの反応性を検出した。マイクロタイターウエルを、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中２μg/mlの４２−ＨＳ−ＢＳＡ溶液100μlでコーティングし、室温で２時間インキュベートした。プレートを１ウエル当たり20 0μlのＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロックした。プレートを蒸留水で３回洗浄した後、１ウエル当たり100μlの培養上清を加え、30分間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、30分間のインキュベート時間中に、プレートに、ブロック溶液に希釈した１ウエル当たり100μlのヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍ−ＨＲＰＯ結合体（Kirkegaard Perry Laboratories，Gaithersbur g，Maryland）を加えた。最後のプレート洗浄を行い、発色に、ｏ−フェニレンジアミン：２ＨＣｌ（ＯＰＤ）（Abbott Laboratories，Abbott Park，Illinois ）を用いる。光学密度読み取りの相対強度から、陰性対照である正常なマウス血清（ＮＭＳ）（Organon Teknika-Cappel，Malvern，Pennsylvania）の少なくとも５倍のハイブリッド３４−２９４を同定し、該ハイブリッドをクローニング及びその後の評価用の候補として選択した。１−100〜１−100、000の範囲の限界希釈によりハイブリッド＃３４−２９４をクローン化した。用いたクローニング培地は、10％ｖ／ｖＦＢＳ及び１％ｖ／ｖ HT Supplement（GIBCO）を含むＩＭＤＭであった。組織培養プレート中の各96 ウエルに200μｌの細胞懸濁液を加えた。集密期培養のクローン上清の追加のＥＩＡスクリーニングに基づいてさらに評価するために、クローン＃３４−２９４−１６３（３４−２９４−１６３ｈｃと称する）を選択した。用いたＥＩＡスクリーニングプロトコルは上記のものであった。マウスモノクローナル抗体イソタイプ化キット、ＲＰＮ２９（Amersham Life Science，Arlington Heights，11）で、３４−２９４−１６３（３４−２９４−１６３ＭｏＡｂと称する）として識別される細胞系から分泌されたモノクローナル抗体のイソタイプを決定した。販売業者の推薦に従って検定を行ったが、その結果は、ＩｇＧＩ、κＬ鎖のイソタイプを示している。実施例１２及び１３の化合物は、以下に記載するラパマイシン又はその誘導体に特異的なポリクローナル及びモノクローナル抗体の検出用アッセイに用いることが可能である。マイクロタイタープレート（Immunolon I）を100μlのヤギ抗マウス抗体〔10m Mのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.2）中10μg/ml）を用い、一晩４℃でコーティングした。プレートを軽く振り、リン酸緩衝塩水中100μlの１％ウシ血清アルブミンで一晩４℃でブロックした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ウエルにリン酸緩衝塩水中１：５に希釈したウサギ血清100μlを加え、室温で一晩インキュベートした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、３−〔３−（４−イミノブチルチオ）スクシンイミジル〕フェナシルグリシンとのラパマイシン４２−エステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体（実施例１２の化合物）（100μl，0.5ng/ml）又は（Ｎ−（３−カルボキシフェニル）−３−チオスクシンイミジル）グリシンとのラパマイシン４２−エステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体（実施例１３の化合物）（100μl，0.5ng/ml）を加え、室温で１時間暗所でインキュべートした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、Ｈ₂Ｏ₂と共にＴＭＢ基質を加え、プレートを被覆して室温で30分間暗所でインキュベートした。450nmの分光光度計で光学密度を読み取った。結果を表３に示す。表３に示されているデータは、ウサギ番号81に見られるように、実施例１２及び１３の化合物を用いて、哺乳類におけるラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体を検出し得ることを示している。下記は、ラパマイシンに特異的な抗体を用い、ＥＬＩＳＡフォーマットにより、ラパマイシンに対する拮抗阻害アッセイを用いたラパマイシン濃度の測定の例である。マイクロタイタープレート（Immunolon I）を100μlのヤギ抗マウス抗体〔10mMのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.2）中10μg/ml）を用いて一晩４℃でコーティングした。プレートを軽く振り、リン酸緩衝塩水中100μlの１％ウシ血清アルブミンを用いて４℃で一晩ブロックした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、各ウエルに上記のラパマイシン特異抗体（１μg/ml、100 μl）加え、室温で１〜４時間インキュベートした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼとのラパマイシン３１，４２−ビス（ヘミグルタレート）結合体（100μl、0.5ng/ml）を加え、室温で１時間暗所でインキュベートした。プレートを軽く振り、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ＴＭＢ基質を加え、プレートを被覆して室温で５分間暗所でインキュベートした。450nmの分光光度計で光学密度を読み取った。マウス血清に結合する、ラパマイシンと、グルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体との競合の結果を表４に示す。これらの結果から、標準曲線の構築及び試料中のラパマイシンの濃度の測定が可能である。実施例１１の化合物（Ｎ−〔９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル〕グリシンとのラパマイシン４２−エステル）は、実施例１２に用いた手順により脱保護し、固体マトリックスに結合させることが可能である。該化合物は、いくつかのディップスティックイムノアッセイ法又はラパマイシン結合タンパク質の単離に用いられるラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体に結合し得る。以下の実施例は、実施例１１の化合物の803共鳴単位（ＲＵ）がＢＩＡｃｏｒｅに用いられるＥＤＣ及びＮＨＳに基づいたＢＩＡｃｏｒｅ標準プロトコルを用いて固体マトリックス上に固定化し得ることを示している。このマトリックスはラパマイシン特異抗体の1401ＲＵ単位に結合した。試験した各濃度の抗体（0.625、1.25、2.5、5.0、10.0μg/ml）について会合及び解離動力学を測定した。これらのデータは、実施例１１の化合物が、マトリックスに結合している場合でさえ、開環ラパマイシン特異抗体による結合にアクセスし得、相互作用の特性決定も可能であることを示している。同様な手順を用いて、ラパマイシン結合タンパク質を、脱保護されたＮ−〔９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル〕グリシンとのラパマイシン４２−エステル結合マトリックスに結合させることが可能である。このマトリックスは、当業者により実践されているように新規な結合タンパク質の単離にも用いることができる。脱保護されたＮ−〔９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル〕グリシンとのラパマイシン４２−エステルを用いて、以下の方法の中のいずれかによりラパマイシン−ＦＫＢＰ結合体の結合タンパク質を単離することが可能である。一つの方法において、適切なプロテアーゼインヒビターを含む組織又は細胞溶解物と、脱保護されたＮ−〔９Ｈ −フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル〕グリシンとのラパマイシン４２ −エステル結合マトリックスでインキュベートしてあるＦＫＢＰとを結合に十分な時間インキュべートする。種々の緩衝液を用いて非特異的結合しているタンパク質を洗浄する。ラパマイシン核−ＦＫＢＰと結合タンパク質との間の結合を壊わす追加の緩衝液を添加するとタンパク質が遊離する。ハイブリドーマ細胞系、ＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ₂＃１ｈｃを、ブタペスト条約の下に、1994年３月10日、米国メリーランド州、ロックビル、パークローンドライブ12301に所在のAmerican Type Culture Collection（ATCC）に寄託し、受託番号ＨＢ11568で寄託された。ハリブリドーマ細胞系３４−２９３−１６３ｈｃも、1994年４月６日、ブタペスト条約の下にＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＨＢ11606で寄託された。以下の実施例は本発明の代表的な化合物の製造を表す。実施例１コハク酸とのラパマイシン４２−エステル 15mlの塩化メチレン中５ｇ（5.5mmol）のラパマイシン及び880μlのピリジンの撹拌溶液に、無水コハク酸1.1g（11mmol）及びジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）400mgを加えた。反応混合物を２日間室温で撹拌し、塩化メチレンで希釈、1NのＨＣｌ50mlずつで３回洗浄した。次いで有機層をＮａ₂ＳＯ₄上で脱水、真空下に濃縮して、粗生成物を得た。溶離剤として55％アセトニトリル／水を用いる逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより純粋物質を得、標記化合物１ｇ（18％）を得た。スペクトルデータは以下の通り：¹H NMR（CDCl₃，300MHz）4.650（m ，1H，H₂COC=O），4.168（d，1H，H₂COH），2.795（s，4H，OC=OCH₂CH₂C=O）。実施例２（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ヘミスクシネート））とのラパマイシン４２ −エステル３mlの酢酸エチル中コハク酸とのラパマイシン４２−エステル100mgの撹拌溶液にＤＣＣ21mg（0.098mmol）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド12mg（0.098mm ol）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、濾過、真空下に濃縮して粗生成物を得た。溶離剤として80％アセトニトリル／水を用いる逆相ＨＰＬＣにより純粋物質を得、標記化合物75mg（69％）を得た。スペクトルデータは以下の通り：¹H NMR（CDCl₃，300MHz）4.650（m，¹H，H₂COC=O），4.168（d，1H，H₂ COH），2.951（m，2H，OC=OCH₂），2.795（m，4H，OC=OCH₂CH₂C=O），2.705（m ，2H，OC=OCH₂）；MS（負イオンFAB）1110（M^-），1056，1012，913，148（100 ）。実施例３コハク酸とのラパマイシン４２−エステルとＫＬＨとの結合体１，４−ジオキサン３ml中（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ヘミスクシネート））とのラパマイシン４２−エステル37mgの撹拌溶液に、0.05Mのリン酸緩衝液6ml中197mgのＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin）を加え、反応材料を３日間４℃で撹拌した。次いで反応混合物を４℃で24時間0.05Mのリン酸緩衝液1500m lで透析し、さらに精製することなく使用可能な標記化合物を得た。ＫＬＨ当たりのコハク酸とのラパマイシン４２−エステル部分の数は約42：１であった。実施例４コハク酸とのラパマイシン４２−エステルとオボアルブミンとの結合体１，４ジオキサン３ml中（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−（ヘミスクシネート））とのラパマイシン４２−エステル37mgに、0.05Mのリン酸緩衝液6ml中197m gのオボアルブミンを加え、反応材料を３日間４℃で撹拌した。次いで反応混合物を24時間４℃で0.05Mのリン酸緩衝液1500ml中で透析して、さらに精製することなく使用可能な標記化合物を得た。実施例５コハク酸とのラパマイシン４２−エステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体１，４−ジオキサン40μl中（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ヘミスクシネート））とのラパマイシン４２−エステル１mgに、１，４ジオキサン0.4ml及び0 .5％重炭酸ナトリウム0.4ml溶液中16mgの西洋ワサビペルオキシダーゼを加え、反応材料を４℃で2.5時間撹拌した。次いで反応混合物を24時間４℃で0.05Mのリン酸緩衝液1500ml中で透析して、さらに精製することなく使用可能な標記化合物を得た。実施例６グルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステル実施例１に用いた方法に従って標記化合物を調製した。実施例７（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ヘミグルタレート））とのラパマイシン３１，４２−ジエステルジメチルホルムアミド160μl中グルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステル15.9mgの溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルエチルカルボジイミド 3.65mg及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド1.8mgを加えた。反応が完結するまで反応混合物を撹拌し、水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウム上で脱水、濾過、真空下に濃縮して、標記化合物を得、0.1Nのリン酸ナトリウム緩衝液中４℃で貯蔵し、さらに精製することなく使用した。実施例８グルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルとＫＬＨとの結合体 0.1MのＮａＨＣＯ₃２ml中のＫＬＨ20mgに、（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ヘミグルタレート））とのラパマイシン３１，４２−ジエステル55μlを10μlずつ０℃で30分かけて加えた。反応が完結するまで溶液をゆっくりふりまぜ、6000rpmで20分間遠心し、結合していない出発物質をリン酸緩衝溶液を用いるＧ−２５カラム上で標記化合物から分離した。結合体をグリセロールと50％混合し、-70℃で貯蔵した。ＫＬＨ当たりのグルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステル部分の数は17〜45：１の範囲であった。実施例９グルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルとオボアルブミンとの結合体 0.1MのＮａＨＣＯ₃２ml中20mgのオボアルブミンに、（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−（ヘミグルタレート））とのラパマイシン３１，４２−ジエステル55 μlを10μlずつ０℃で30分かけて加えた。反応が完結するまで、溶液をゆっくりふりまぜ、600rpmで20分間遠心し、結合していない出発物質をリン酸緩衝溶液を用いるＧ−２５カラム上で標記化合物から分離した。結合体をグリセロールと50 ％混合して、-70℃で貯蔵した。実施例１０グルタル酸とのラパマイシン３１，４２−ジエステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体 0.1MのＮａＨＣＯ₃1ml中10mgの西洋ワサビペルオキシダーゼに、（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ヘミグルタレート））とのラパマイシン３１，４２−ジエステル105μlを10μlずつ30分かけて加えた。反応が完結するまで溶液をゆっくりふりまぜ、6000rpmで20分間遠心し、リン酸緩衝溶液を用いたＧ−２５カラムから標記化合物を溶離した。結合体をグリセロールと50％混合し、-20℃で貯蔵した。実施例１１Ｎ−〔９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニルグリシンとのラパマイシン４２−エステル塩化メチレン（５ml）中のラパマイシン（0.73g，0.08mmol）の冷凍（０℃）溶液に、Ｎ−〔（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル〕グリシンペンタフルオロフェニルエステル0.6g（1.19mmol）、次いでピリジン（0.85ml， 10.5mmol）及びジメチルアミノピリジン（18mg，0.14mmol）を加え、不均一溶液を形成し、室温に温めて均質にした。反応混合物を室温で一晩撹拌した。大過剰のＥｔＯＡｃを加えた。有機層を0.5NのＨＣｌ（２×）及び塩水で洗浄し、脱水（ＭｇＳＯ₄）、濃縮して、オフホワイトの泡状物を得た。フラッシュクロマトグラフィー（30〜50％ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）にかけて、収率71％で標記化合物（ 0.679g，0.57mmol）を得た。質量スペクトル（負イオンFAB）Ｍ^-：ｍ／ｚ1192。実施例１２３−〔３−（４−イミノブチルチオ）スクシンイミジル〕フェナシルグリシンとのラパマイシン４２−エステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体アセトニトリル（84μl）中のＮ−〔（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル〕グリシンとのラパマイシン４２−エステル（10mg，8.4μmol）の溶液に、ジエチルアミン10μl（0.84M）アセトニトリル中）を加えた。反応混合物を室温で60分間撹拌し、窒素流により溶媒を除去した。残渣をアセトニトリル（100μl）に溶解し、ヘキサン（５回、200μl）で洗浄し、次いで窒素流により溶媒を濃縮した。得られたグリシンとのラパマイシン４２−エステルを、ＤＭＦ（200μl）中のｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＢＳ）（２mg）に入れ、４℃で２時間インキュベートし、次いで50mMのトリスＨＣｌ（ｐＨ8.0）中の50nMエタノールアミン（20μl）を加えた。西洋ワサビペルオキシダーゼ（５mg）及びウサギＩｇＧ（10mg）を２−イミノチオレーンで処理し、Sephadex Ｇ−25で精製し、次いでＭＢＳ−ラパマイシングリシンエステル付加化合物を加えた。混合物を４℃で一晩インキュベートし、Sephadex Ｇ−25上でゲル濾過して精製し、標記化合物を得た。実施例１３（Ｎ−（３−カルボキシフェニル）−３−チオスクシンイミジル）−グリシンとのラパマイシン４２−エステルと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体アセトニトリル（84μl）中のＮ−〔（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル〕グリシンとのラパマイシン４２−エステル（10mg，8.4μmol）の溶液に、ジエチルアミン10μl（0.84M）アセトニトリル中）を加えた。反応混合物を室温で60分間撹拌し、窒素流により溶媒を除去した。残渣をアセトニトリル（100μl）に溶解し、ヘキサン（５回、200μl）で洗浄し、次いで窒素流により溶媒を濃縮した。得られたグリシンとのラパマイシン４２−エステルを、ＤＭＦ（200μl）中のＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（２mg）に入れた。反応混合物を室温で15分間、次いで４℃で一晩撹拌した。ラパマイシン反応混合物溶液に、ヒドロキシルアミンＨＣｌ（50μlのＤＭＦ中７mg）溶液を加えて１時間インキュベートし、次いでＭＢＳ−西洋ワサビペルオキシダーゼ付加化合物及びＭＢＳ−ウサギＩｇＧを加えて、標記化合物を得、Sephadex Ｇ−25ゲル濾過により精製した。実施例１４ジエチルアジドジカルボキシレートとのラパマイシン１，３−ディールスアルダー付加化合物ラパマイシン（１g，1.093mmol）及びジエチルアゾジカルボキシレート（0.38 1g，2.187mmol）をジクロロメタン（10ml）に溶解し、65℃で一晩加熱した。ＴＬＣにより、反応が完結したことが示された。混合物を溶離剤として酢酸エチルを用いるシリカゲルカラム上で精製して、白色固体（0.750g）を得、ヘキサンですり砕き、風乾して、粉末として標記化合物（0.666g）を得た。Ｃ₅₇Ｈ₈₉Ｎ₃Ｏ₁₇の元素分析：計算値：Ｃ，62.91；Ｈ，8.24；Ｎ，3.86；実測値：Ｃ，62.81;Ｈ，8.12；Ｎ，3.91。 IR（KBr，cm^-1）3450，1720。 NMR（CDCl₃）δ6.15（m，1H)，5.20（d，1H)，3.40（s，3H），3.30（s，3H）， 3.15（s，3H），0.9（t，3H），0.72（q，1H）。 MS（-FAB）1087（Ｍ^-）。実施例１５フェニルトリアゾリンジオンとのラパマイシン１，３−ディールスアルダー付加化合物ラパマイシン（0.66g，721mmol）をジクロロメタン（10ml）に溶解し、０℃に冷却した。これに、ジクロロメタン（10ml）中のフェニルトリアゾリンジオン（ 0.133g，758mmol）溶液を滴下した。溶液を一晩撹拌した。ＴＬＣにより、反応がまだ完結していないことが示された。追加のフェニルトリアゼンジオン（0.02 5g，27mmol）を加えた。溶離剤として酢酸エチルを用いるＨＰＬＣ（4.1×31cm ，ＳｉＯ₂）を用いて反応材料を精製して、固体として標記化合物を得た。固体をヘキサン30ml及び酢酸エチル１mlですり砕き、濾過、風乾して、粉末として標記化合物（0.383g）を得た。Ｃ₅₉Ｈ₈₄Ｎ₄Ｏ₁₅の元素分析：計算値：Ｃ，65.05；Ｈ，7. 77；Ｎ，5.14；実測値：Ｃ，65.39；Ｈ，7.98；Ｎ，4.92。 IR（KBr，cm^-1）3450，1715。 NMR（DMSO）δ7.50（m，3H），7.40（m，2H），3.11（s，3H），3.00（s，3H），2.95（s，3H），0.8（q，1H）。 MS（-FAB）1088（Ｍ^-）。以下の化合物は、ラパマイシンの３１位でリンカーを介して結合し得る蛍光ラパマイシン誘導体の代表的な例である。実施例１６４２−ダンシルラパマイシン乾燥ピリジン（２ml）中のラパマイシン（200mg，0.22mmol）を０℃に冷却し、ダンシルクロリド（840mg，3.1mmol）で処理した。反応材料を室温に温め、24 時間撹拌した。反応混合物を冷却した２ＮのＨＣｌ（30ml）に注ぎ、酢酸エチル（４×25ml）で抽出した。酢酸エチルをプールし、塩水で洗浄、ＭｇＳＯ₄上で脱水、濾過、真空下に濃縮した。残渣をベンゼン中25％の酢酸エチルを用いるシリカクロマトグラフィーにかけ、黄色粉末として標記化合物150mgを得た（融点：101-104℃）。実施例１７ピレン酪酸とのラパマイシン４２−エステルラパマイシン（459mg，0.5mmol）及びピレン酪酸（216mg，0.75mmol）をＴＨＦ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（10ml，１：１）に溶解した。該溶液に、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（146mg，0.67mmol）及び４ −ジメチルアミノピリジン（15mg）を加えた。15時間かけて反応材料を室温に温めた。反応材料をＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈し、５％ＨＣｌ、次いで塩水で洗浄した。溶液をＭｇＳＯ₄上で脱水、濾過、蒸発させて、固体を得た。固体を３ｍｍシリカゲルクロマトロンプレートにかけ、ヘキサン中50％の酢酸エチルで溶離して、泡状物として標記化合物180mgを得た。この反応によりさらに、３１、４２−ジエステル化ラパマイシン100mgも得られた。 IR（KBr，cm^-1）3420，1740。 NMR（CDCl₃）δ8.3（d，1H），8.14（dd，2H），8.10（d，2H），7.85（d，1H），3.34（s，3H），3.30（s，3H），3.11（ｓ，3H）。 MS（-FAB）1183（Ｍ^-）。下記の化合物は、上記の手順によっり免疫原性担体に結合するか又は別のリンカーに結合してから該担体に結合し得るラパマイシン誘導体の代表的な例である。実施例１８ラパマイシン４２−カルボメトキシメチルエーテル及びラパマイシン４２−ビス（カルボメトキシメチルエーテル）ラパマイシン（2.0g，2.187mmol）及び酢酸ロジウム（II）（0.37g，0.08mmol ）をベンゼン中で加熱還流し、ベンゼン（10ml）中のエチルジアゾアセテート溶液（500ml）で10分かけて処理した。溶液を室温に冷却し、一晩撹拌した。ＴＬＣにより、反応が完結していないことが示された。追加のエチルジアゾアセテート（3mlずつ）を２回に分けて24時間間隔で加えた。混合物を濃縮し、酢酸エチルを用いるシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにかけて精製して、油状物として４２−モノエーテル（１ｇ）及び３１，４２−ジエーテル（0.850g）を得た。４２−モノエーテルをヘキサン、酢酸エチル及びジクロロメタン混合物中で週末にかけてすり砕き、粉末として生成物を得た。溶離剤として酢酸エチルを用いるシリカゲルカラム上のＨＰＬＣにかけてジエーテルを精製し、固体として生成物を得た。モノエーテルについての分析データ：Ｃ₅₅Ｈ₈₅ＮＯ₁₅の元素分析：計算値：Ｃ，66.04；Ｈ，8.5 7；Ｎ，1.40：実測値：Ｃ，65.29；Ｈ，8.64；Ｎ，1.60。 IR（KBr，cm^-1）3420，1715。 NMR（CDCl₃）δ4.82（s，1H），3.41（s，3H），3.33（s，3H），3.13（s，3H），1.28（t，3H），0.70（q，1H）。 MS（-FAB）999（Ｍ^-）。ジエーテルについての分析データ：Ｃ₅₉Ｈ₉₁ＮＯ₁₇の元素分析：計算値：Ｃ，65.23；Ｈ，8.44；Ｎ，1.29：実測値：Ｃ，63.29；Ｈ，8.40；Ｎ，1.44。 IR（KBr，cm^-1）1740。 NMR（CDCl₃）δ6.36（q，2H），5.24（s，1H），3.39（s，3H），3.32（s，3H），3.12（s，3H），0.65（q，1H）。 MS（-FAB）1085（Ｍ^-）。実施例１９ラパマイシン４２−（４−ニトロフェニル）カーボネート及びラパマイシン３１，４２−ビス（４−ニトロフェニル）カーボネートラパマイシン（0.450g，0.49mmol）を乾燥ジクロロメタン（10ml）に溶解し、０℃に冷却した。この溶液に、ピリジン（0.4ml，5.7mmol）及び４−ジメチルアミノピリジンの結晶を加えた。ジクロロメタン（３ml）中の４−ニトロフェニルクロロホルメート（0.3g，1.49mmol）溶液を加えた。該溶液を一晩かけて室温に温め、室温で24時間撹拌した。0.1ＮのＨＣｌ（５ml）に加えて反応を停止し、水層をジクロロメタンで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ₄上で脱水、濾過、真空下に蒸発させて、黄色固体を得た。ヘキサン中の75％酢酸エチルを用いるシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、黄色固体として４２−モノカーボネート 180mg及び３１，４２−ジカーボネート47mgを得た。実施例２０４２−Ｏ−（フェノキシチオカルボニル）−ラパマイシンラパマイシン（1.030g，1.12mmoｌ）を乾燥ジクロロメタン（100ml）に溶解し、０℃に冷却した。この溶液に、ピリジン（0.27ml，3.33mmol）及び４−ジメチルアミノピリジンの結晶を加えた。反応混合物に、ジクロロメタン（５ml）中のチオフェニルクロロホルメート（0.47ml，1.49mmol）溶液を加えた。該溶液を一晩かけて室温に温め、室温で24時間撹拌した。0.1NのＨＣｌ（５ml）に加えて反応を停止し、水層をジクロロメタンで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ₄上で脱水、濾過、真空下に蒸発させて、黄色固体を得た。ヘキサン中40％〜70％の酢酸エチルの勾配溶離を用いる４ｍｍシリカゲルクロマトロンプレート上のクロマトグラフィーにかけて、黄色泡状物として標記化合物520mgを得た。Ｃ₅₈Ｈ₈₃ＮＯＳ₁₄の元素分析：計算値：Ｃ，66.32；Ｈ，7.97；Ｎ，1.33：実測値：Ｃ，66.48；Ｈ，8.05；Ｎ，1.12。 IR（KBr，cm^-1）3420，1715。 NMR（CDCl₃）δ7.41（t，1H），7.25（t，2H），7.12（d，1H），3.45（s，3H），3.33（s，3H），3.13（s，3H）。 MS（-FAB）1049（Ｍ^-）。実施例２１ラパマイシン−Ｏ−カルボキシメチル−２７−オキシムメタノール（６ml）中のラパマイシン600mg（650μM）の溶液に、無水酢酸ナトリウム100mg（1.2mmol）及びカルボキシメトキシルアミンヘミヒドロクロリド 140mg（660μM）を室温で加えた。室温で一晩撹拌した後で、反応が完結した。反応混合物を真空下に濃縮し、残渣を水ですり砕いた。固体を濾過し、水で完全に洗浄した。生成物を高真空下に乾燥して、白色固体575mg（89.78％）を得た。¹³ Ｃ及び¹ＨＮＭＲにより、２７位にオキシム誘導体としてＥ異性体及びＺ異性体の混合物が示された。¹ H NMR（CDCl₃，400MHz）：3.43及び3.41（2s，3H，CH₃O），3.30（s，3H，CH₃O ），3.18及び3.12（2s，3H，CH₃O），1.82（s，3H，CH₃C=C），1.695及び1.633 （2s，3H，CH3C=C）；¹³ C NMR（CDCl₃，MHz）：215.8（C=O），211.5（C=O），194.5（C=O），191.0（ C=O），172.5（C=O），169.0（C=O），168.5（C=O），167.0（C=O），161.5（C= NOC），160.0（C=NOC），140.0；MS（負イオンFAB：985（Ｍ−Ｈ）^-，590，167 ，128，97，75（100％）。Ｃ₅₃Ｈ₈₂Ｎ₂Ｏ₁₅・0.15Ｈ₂Ｏの元素分析：計算値：Ｃ，63.90；Ｈ，8.40；Ｎ，2 .81；実測値：Ｃ，63.81;Ｈ，8.41；Ｎ，2.85。以下の化合物をラパマイシン又はその誘導体に特異的な抗体の産生に用いた。実施例２２グリシルビオチンとのラパマイシン４２−エステルＤＭＦ60ml中のビオチン（0.83g，3.4mmol）溶液に、グリシン−ｔ−ブチルエステル塩酸塩（0.57g，3.4mmol）、Ｎ−メチルモルホリン（0.92ml，8.36mmol）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.61g，3.99mmol）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボ−ジイミド塩酸塩（0.65g，3.4mmol）を加えた。反応混合物を室温で７日間撹拌した。ＤＭＦを濃縮し、酢酸エチルを加え、有機層を水、0.5NのＨＣｌ、飽和重炭酸ナトリウム及び塩水で洗浄した。酢酸エチル層を脱水（ＭｇＳＯ₄）、濃縮して、ＴＬＣ上実質的に一つのスポットを示す白色固体状のｔ−ブチルグリシルビオチン（0.611g，1.71mmol,50％）を得た。質量スペクトルm/z358（〔Ｍ＋Ｈ）⁺）。ＣＨ₂Ｃｌ₂（0.5ml）中のｔ−ブチルグリシルビオチン（0.271g，0.758mmol）溶液に、トリフルオロ酢酸0.5mlを加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し、濃縮して、無水ジエチルエーテルですり砕いた。オフホワイトの沈殿物を回収して、グリシルビオチン0.209g（0.694mmol，92％）を得た。質量スペクトルm/z30 2（〔Ｍ＋Ｈ〕⁺）。１−メチルピロリジノン（５ml）中のグリシルビオチン（0.65g，2.16mmol）溶液に、６mlのＣＨ₂Ｃｌ₂を加え、沈殿物を形成させて、トリエチルアミン0.33 ml（2.36mmol）を添加した後でさえ沈殿物は残留した。この不均一溶液に、ラパマイシン２ｇ（2.19mmol）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩0.43g（2.24mmol）及びＤＭＡＰ30mg（2.46mmol）を加えた。数時間後、反応混合物は均質になり、さらに４日間撹拌した。大過剰の酢酸エチルを加え、有機層を水、0.5NのＨＣｌ、飽和重炭酸ナトリウム及び塩水で洗浄した。有機層を脱水（ＭｇＳＯ₄）、濃縮した。薄黄色の泡状物を温無水ジエチルエーテルですり砕いて、薄黄色の固体として不純な標記化合物1.2gを得た。該物質中の一部（0.5g）を５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ₃中のフラッシュクロマトグラフイーにかけ、再び温エーテルですり砕いて、少量のラパマイシンで汚染された標記化合物87mgを得た。該物質を再度クロマトグラフィー（０〜５％の勾配のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ₃）にかけ、エーテルで最終的にすり砕いて、白色固体として純粋な標記化合物34mg（0.028mmol）を得た。質量スペクトルm/z1196（−FAB Ｍ^-）。実施例２３ａ）コハク酸とのラパマイシン−４２−エステルと５−グリシニルフルオレセインアミンとの結合体 10μlのトリエチルアミンを含むメタノール200μlに溶解した4.2mgの５−グリシニルフルオレセインアミンに、実施例２の化合物４mgを加えた。２時間後、混合物の一部をシリカ薄層クロマトグラフィープレートにかけ、100部のクロロホルム、10部のメタノール、１部の酢酸で展開した。乾燥後、生成物を含むバンドをプレートから剥がし、メタノールを用いて生成物をシリカから溶離した。生成物は、ＦＫＢＰ１２を添加すると、水溶液の蛍光偏光が変化することを特徴としていた。ｂ）コハク酸とのラパマイシン４２−エステルと５−アミノメチルフルオレセインとの結合体実施例２３ａの方法に従って、2.5mgの５−アミノメチルフルオレンを５−グリシニルフルオレセインの代わりに用いて標記化合物を調製した。ｃ）コハク酸とのラパマイシン４２−エステルと４’−アミノメチルフルオレセインとの結合体実施例２３ａの方法に従って、1.1mgの４′−アミノメチルフルオレセインを５−グリシニルフルオレセインの代わりに用いて標記化合物を調製した。薄層クロマトグラフィー溶媒は、100部のクロロホルム、８部のメタノール及び１部の酢酸であった。実施例２４コハク酸とのセコラパマイシン４２−エステルと５−グリシニルフルオレセインアミンとの結合体実施例２３の生成物の一部をシリカ薄層クロマトグラフィープレートにかけ、 50部のクロロホルム、４部のメタノール及び0.5部の酢酸の混合物で溶離した。３つの移動蛍光バンドが観察され、変化していない出発物質は最も高いｒｆ値を有し、標記化合物は最も低いｒｆ値を有していた。目的生成物を含むシリカをプレートから剥がし、標記化合物をメタノールで溶離した。生成物は、ＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ₂＃１ＭｏＡｂを添加すると水溶液の蛍光偏光が変化することを特徴としていた。実施例２５ａ）アジピン酸とのラパマイシン４２−エステル実施例２の方法の変形によりアジピン酸とのラパマイシン４２−エステルを調製した。ジメチルホルムアミド1.0ml中146mgのアジピン酸を200μlのジシクロヘキシルカルボジイミドと合わせて無水アジピン酸を調製し、室温で２時間インキュベートした。該反応材料の上清300μlを、塩化メチレン200μlに溶解したラパマイシン90mg及びジメチルアミノピリジン45mgに加えた。５分後、混合物を遠心して、沈殿した物質を沈降させた。上清を３mlの水と100μlの酢酸及び２×１ml の塩化メチレンとに分配した。有機層を合わせて、無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を蒸発させた。残渣を1.0mlのメタノール及び0.5mlのエタノールに溶解し、氷中で冷却し、５mlの水を加えて沈殿させた。これを遠心し、上清を廃棄、残渣を減圧デシケーター中で乾燥して、白色粉末78mgを得た。ｂ）アジピン酸とのラパマイシン４２−エステルとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとのエステル実施例２５ａの化合物38mg、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド38mg及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド40mgをジメチルホルムアミド0.4mlと混合した。60分後、追加のカルボジイミド40mgを加えた。さらに60分間してから混合物を氷中で冷却し、水４mlを激しくかき回しながら加えた。遠心して沈殿物を回収し、水５mlに再懸濁し、２回遠心して洗浄し、真空デシケーターで乾燥して、白色粉末38mgを得た。ｃ）アジピン酸とのラパマイシン４２−エステルと５−グリシニルフルオレセインアミンとの結合体トリエチルアミン６μlを添加して、５−グリシニルフルオレセインアミン2.3 mgをメタノール200μlに溶解した。メタノール200μl中10.6mgの実施例２５ｂの化合物の溶液 60μlを加えた。25分後、混合物をシリカ薄層クロマトグラフィープレートにかけ、100部のクロロホルム、12部のメタノール及び１部の酢酸の混合物で展開した。目的生成物を含むシリカをプレートから剥がし、標記化合物をメタノールで溶離した。ｄ）アジピン酸とのラパマイシン４２−エステルと５−アミノメチルフルオレセインとの結合体実施例２５ｃのようにして標記化合物を調製したが、但し、５−アミノメチルフルオレセイン2.6mgを用いた。ｅ）アジピン酸とのラパマイシン４２−エステルと４′−アミノメチルフルオレセインとの結合体実施例２５ｃのようにして標記化合物を調製したが、但し、４′−アミノメチルフルオレセイン2.5mgを用いた。薄層クロマトグラフィー溶媒は、クロロホルム100部、メタノール４部及び酢酸２部であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/577 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ (72)発明者ラツセル，ジヨン・シーアメリカ合衆国、ウイスコンシン・53221、グリーンフイールド、ウエスト・アイオウナ・テラス・3925 (72)発明者モルナー−キンバー，キヤサリン・エルアメリカ合衆国、ペンシルバニア・19038、グレンサイド、ハリソン・アベニユー・ 222

Claims

【特許請求の範囲】１．ジカルボン酸とのラパマイシン４２−エステルとフルオレセイン誘導体との結合体。２．ジカルボン酸がコハク酸である請求項１に記載の結合体。３．フルオレセイン誘導体が５−グリシニルフルオレセインアミン、５−アミノメチルフルオレセン又は４′−アミノメチルフルオレセインである請求項２に記載の結合体。４．ジカルボン酸がアジピン酸である請求項１に記載の結合体。５．フルオレセイン誘導体が５−グリシニルフルオレセインアミン、５−アミノメチルフルオレセイン又は４′−アミノメチルフルオレセインである請求項４に記載の結合体。６．改良がディテクター分子として請求項１の結合体を用いることからなる、ラパマイシン又はその誘導体の量を測定するためのイムノアッセイ法。７．請求項１に記載のラパマイシン結合体とラパマイシン又はその誘導体に特異的に結合し得る抗体とを含むラパマイシン又はその誘導体の量を測定するための試験キット。８．ジカルボン酸とのセコラパマイシン４２−エステルとフルオレセイン誘導体との結合体。９．ジカルボン酸がコハク酸である請求項８に記載の結合体。１０．フルオレセイン誘導体が５−グリシニルフルオレセインアミンである請求項９に記載の結合体。１１．改良がディテクター分子として請求項８に記載の結合体を用いることからなる、ラパマイシン又はその誘導体の量を測定するためのイムノアッセイ法。１２．請求項８に記載のラパマイシン結合体とラパマイシン又はその誘導体に特異的に結合し得る抗体とを含むラパマイシン又はその誘導体の量を測定するための試験キット。１３．ＲＡＰ−４２−ＯＶＡＦ₂＃１ＭａＡｂと称される開環ラパマイシンに特異的に結合するモノクローナル抗体。１４．開環ラパマイシンがセコラパマイシンである請求項１３に記載のモノクローナル抗体。１５．改良が請求項１３に記載の抗体を用いることからなる開環ラパマイシン又はその誘導体の量を測定するための試験キット。１６．開環ラパマイシン又はその誘導体混合物を固体マトリックスに結合した請求項１３に記載の抗体で処理し、結合していないラパマイシンを、結合している開環ラパマイシン−抗体−固体マトリックス複合体から溶離することを含む、開環ラパマイシン又はその誘導体混合物をラパマイシン又はその誘導体から分離する方法。１７．開環ラパマイシン又はその誘導体混合物を請求項１３に記載の抗体で処理し、開環ラパマイシン−抗体複合体を固体支持体を用いて捕獲し、結合していないラパマイシンを開鎖ラパマイシン−抗体−固体マトリックス複合体から溶離することを含む、開環ラパマイシン又はその誘導体混合物をラパマイシン又はその誘導体から分離する方法。１８．開環ラパマイシン又はその誘導体混合物を請求項１３に記載の抗体、次いで抗マウス免疫グロブリンで処理し、沈殿した開環ラパマイシン−抗体−抗マウス免疫グロブリン複合体を取り出すことを含む、開環ラパマイシン又はその誘導体混合物をラパマイシン又はその誘導体から分離する方法。１９．抗マウス免疫グロブリンが、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ又はヤギの抗マウス免疫グロブリンである請求項１８に記載の方法。２０．開環ラパマイシン又はその誘導体混合物を、請求項１３に記載の抗体、次いでタンパク質Ａ又はＧで処理し、沈殿した開環ラパマイシン−抗体−タンパク質Ａ又はＧ複合体を取り出すことを含む、開環ラパマイシン又はその誘導体混合物をラパマイシン又はその誘導体から分離する方法。２１．３４−２９４−１６３ＭｏＡｂと称される、ラパマイシンに特異的に結合するモノクローナル抗体。２２．３４−２９４−１６３ｈｃと称される、ラパマイシンに特異的な抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞系。