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JPH08507147A - 全血試料を高速溶解するための多目的試薬系 - Google Patents

全血試料を高速溶解するための多目的試薬系

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JPH08507147A JP6519006A JP51900694A JPH08507147A JP H08507147 A JPH08507147 A JP H08507147A JP 6519006 A JP6519006 A JP 6519006A JP 51900694 A JP51900694 A JP 51900694A JP H08507147 A JPH08507147 A JP H08507147A
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Abstract

(57)【要約】 自動血液分析装置で、少なくとも５種類の末梢白血球、有核赤血球及びリンパ球免疫表現型の決定を行うことを可能にする、全血試料を高速分析するための多目的試薬系。該多目的試薬系は赤血球を高速で溶解すると同時に白血球を固定し且つリンパ球の表面抗原を保持させる。該多目的試薬系は、約３〜７ｇ／ｌの非第四アンモニウム塩と、約０．０４〜約０．１０容量％の炭素数１〜４の脂肪族アルデヒドと、脂肪族アルデヒドに対して不活性の約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの非リン酸塩緩衝液と、ｐＨを約５．５〜７．５にし且つ浸透圧濃度を約１６０〜約３１０ｍＯｓｍ／ｌにするのに十分な量の水とを含む

Description

【発明の詳細な説明】 全血試料を高速溶解するための多目的試薬系背景 本発明は、全血試料を高速分析するための多目的試薬系及び方法に関する。よ り特定的には、本発明は、白血球分別分析及び有核赤血球定量分析、又はリンパ 球サブクラス分析（ｓｕｂｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を、免疫表現型決定 法（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いて自動 臨床血液分析器（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｈｅｍａｔｏｌｏｇ ｙ ａｎａｌｙｚｅｒ）又はフローサイトメーターで実施するのに有用な、赤血 球を高速で溶解すると同時に白血球を固定することができる多目的試薬系に関す る。 正常被験者の末梢血は、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ又はｅｒｙｔ ｈｒｏｃｙｔｅ）と、５種類の主要成熟白血球（ｗｈｉｔｅ ｃｅｌｌ又はｌｅ ｕｋｏｃｙｔｅ）とを含んでいる。白血球は少なくとも５種類に分けられ、これ らは好中球、好酸球、単球、リンパ球及び好塩基球として知られている。成熟血 液細胞は各種類毎に、宿主 の恒常性維持に必要な特定機能を果たす。各種の末梢血液細胞の濃度は、骨髄の 微環境内に存在する種々の因子が関与する動的プロセスによって厳密に調節され モニターされる。骨髄は、ある疾患条件下では、特定種類の白血球をより多く又 はより少なく放出し得る。別の条件下では、骨髄から放出される末梢血液細胞の 数の調節が妨害され、非調節数の未熟な白血球又は赤血球が末梢血に放出される 。 従って、末梢血中の正常な５種類の白血球の濃度のモニター、及び未熟な赤血 球及び白血球の存在の確認は、医師にとって重要な診断手段である。典型的には 、これらの操作は、白血球の分別計数を行って、正常な５種類の白血球と何らか の異常細胞との相対的比率を顕微鏡的に調べることにより実施されてきた。この ような手動操作は時間が著しくかかり、主観的であり、労働集約的である。 最近になって、白血球の分別分析の労力を軽減するために、自動プロセス及び 自動フローシステム装置が開発された。これらのシステムの幾つかは、米国特許 第４，０９９，９１７号、第４，６１７，２７５号、第４，５２１，５１８号及 び第４，８０１，５４９号に記載されている。あるシステムは、細胞化学的操作 に基づいて個々の細胞の種類 を特異的に同定する。あるシステムは、細胞体積の電子インピーダンス測定によ り３種類の白血球を弁別する。別のシステムは、光学インピーダンス測定と電子 インピーダンス測定とを組合わせて使用して、５種類の末梢白血球を弁別する。 細胞免疫学及びフローサイトメトリーの近年の発展は、ヘルパーＴ細胞のよう なリンパ球サブクラスの同定及び定量に利用されている。リンパ球サブクラスの 分析は、特にエイズの流行の進行に鑑み、重要な診断手段となった。従来のリン パ球サブクラス分析は下記のステップを含む：（１）密度勾配遠心分離によって リンパ球を他の末梢血液細胞から分離する；（２）リンパ球を、特定のリンパ球 表面抗原に対するフルオロクロム標識モノクローナル抗体と反応させる；（３） フローサイトメトリーを用いてリンパ球−抗体反応産物を分析する。現在では、 密度勾配遠心分離の必要を回避する全血法の開発に多大な努力が払われている。 最近開発されたリンパ球サブクラス分析のための全血法は、赤血球を溶解し、赤 血球ゴースト及び細胞残渣を遠心分離で除去し、残った白血球を適当な固定剤を 含む等張生理食塩水に懸濁して形態を保持させることからなる。 これらの方法は密度勾配遠心分離の必要はないが、遠心分離ステップは依然とし て必要であるため、既存の自動臨床血液分析器にはやはり適合しない。 一般的には、有核赤血球（ＮＲＢＣ）の分析に使用できる既存の試薬系は、赤 血球の基質又は大きな血小板からのＮＲＢＣシグナルの弁別及び計数を可能にす ることはできず、機器に可能なＮＲＢＣシグナルをつけることができるだけであ る。 白血球分析では、総ての赤血球を完全に溶解することが重要である。赤血球の 数は白血球の数を約７００対１で上回るため、１％の非溶解赤血球でも白血球の 計数に誤差を与える。赤血球の溶解に使用される試薬の中には、必要なインキュ ベーション時間が長すぎるため自動臨床分析器で実際に使用することができない ものがある。例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．４６８，ｐｐ．１１３−１２７（１９８６）でＫ ．Ａ．Ｍｕｒｉｈｅａｄが推奨しているトリス緩衝塩化アンモニウム溶液は赤血 球を溶解するのに５〜１０分を要するが、これは自動化の場合には非実用的すぎ る。 また、ある種の溶解試薬による不完全な溶血は、自動臨床電子光学システムで 大きなバックグラウンド計数を発生させるのに十分なヘモグロビンを保持する赤 血球基質を発生させる。従って、分析すべき白血球を最初に遠心分離で赤血球基 質から除去しなければならない。これは、試薬系を自動化に適応させにくくする 操作である。 赤血球の溶解に使用される別の試薬系、例えば米国特許第４，９０２，６１３ 号及び第４，６５４，３１２号に記載の試薬系は、屈折率の高い溶剤を含む。屈 折率の高い細胞懸濁媒質には二つの欠点がある。即ち、（１）屈折率が高すぎて 一般的なフローセルサリーンシース（ｆｌｏｗｃｅｌｌ ｓａｌｉｎｅ ｓｈｅ ａｔｈ）には使用し得ない、（２）懸濁媒質の高い屈折率が、小リンパ球及び細 胞質溶解有核赤血球のような小細胞成分からのシグナルを妨害し得る。従って、 細胞を遠心分離で高屈折率媒質から除去し、等張溶液に再懸濁した後でなければ 、細胞をフローセルで分析することはできない。このような手動操作は望ましい ものではなく、又は完全に自動化された臨床分析器での使用に適応できない。 また、米国特許第５，１５５，０４４号に記載されてい るような溶解試薬は過度に低張であり及び／又は酸性である。この種の溶解試薬 は、分析を行うべく白血球の形態を保持するために、高塩溶液（ｈｉｇｈ ｓａ ｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）及び／又はアルカリ塩溶液の迅速な「後追い（ｆｏｌ ｌｏｗ−ｕｐ）」添加を必要とする。また、米国特許第４，７５１，１７９号に 記載のような溶解試薬は、別個の固定剤を適当な時点及び濃度で添加して白血球 の溶解を防止しない限り、赤血球を溶解するだけでなく白血球も溶解する。これ らの試薬は、特に（慢性リンパ性白血病［ＣＣＬ］患者に由来する血液試料のよ うに）脆弱な白血球を含む異常血液試料の場合に、白血球損傷の可能性を導入す る。 また、米国特許第４，０９９，９１７号、第４，８０１，５４９号及び第４， ９７８，６２４号に記載のような試薬系は、赤血球を完全に溶解するために、例 えば５０℃を超える高温でのインキュベーションを必要とする。温度が４５℃を 超えると通常は大部分の細胞表面抗原が変質し始め、その過程でヘモグロビンが 凝集する。これらの系は白血球示差分析を実施するために使用し得るが、リンパ 球副次集団を弁別する手段を破壊し、免疫表現型リンパ球分類（ｉ ｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ）には使用できない。 現在使用されている試薬系の多くは、固定した白血球を分別分析にかける前に 、これら白血球の細胞化学的染色を必要とする。これらの系は、複数の試薬の所 定時点での添加と、所定のインキュベーション時間とを必要とし、通常は有核赤 血球の定量又は免疫表現型リンパ球分類には適応できない。また、試薬添加又は 他の血液試料操作の各ステップが、当該試料から得られる最終計数の正確さを低 下させる。 以上の理由から、白血球の形態とリンパ球表面抗原とを保持させながら、赤血 球を高速で完全に溶解することができる多目的試薬系の必要が起こってきた。概要 前述の問題は本発明で解決された。 従って本発明は、末梢全血細胞の自動電気光学分析のために、赤血球を高速か つ完全に溶解すると同時に、白血球の形態とリンパ球表面抗原とを保持させる多 目的試薬系を提供することを目的とする。 本発明の別の目的は、自動臨床血液分析器での白血球の 高速弁別を可能にする多目的試薬系を提供することにある。 本発明の更に別の目的は、自動臨床血液分析器での有核赤血球（ＮＲＢＣ）の 同定及び定量を可能にする多目的試薬系を提供することにある。 本発明の更に別の目的は、自動臨床フローサイトメーターでフルオロクロム複 合抗体が結合したリンパ球サブクラスを計数する前にリンパ球−抗体反応産物を 遠心分離する必要を回避させる多目的試薬系を提供することにある。 本発明の多目的試薬系は、非第四アンモニウム塩と、炭素数１〜４の脂肪族ア ルデヒドと、脂肪族アルデヒドに対して実質的に不活性の非リン酸塩緩衝液と、 約５．５〜約７．５の実効ｐＨを与え且つモル浸透圧濃度を約１６０〜約３１０ ｍＯｓｍ／ｌ（ミリオズモル／リットル）にするための水とを含む。本発明で使 用する種々の任意的試薬としては、サポニンのような界面活性剤、凝固防止剤、 重炭酸アルカリ金属塩、核染料、又は特定の細胞表面抗原に対する抗体が挙げら れる。 本発明の方法の一つは、多目的試薬系を調製し、該多目的試薬系を全血試料と 混合し、試料系−血液混合物を１０ 秒以上インキュベートし、自動血液分析器で血液試料を分析することからなる。 本発明の特徴及び技術的利点の一つは、開示する多目的試薬系が赤血球を高速 かつ完全に溶解することができ、それと同時に、第二の試薬又は固定剤の添加の 必要なしに、白血球の形態を保持させることにある。本明細書で開示する赤血球 溶解プロセスは、２０秒以内で実施できる。 本発明の別の特徴及び技術的利点は、開示する多目的試薬系が白血球を適当に 固定し、ＣＬＬリンパ球のような脆弱なリンパ球をも溶解しないことにある。本 発明の多目的試薬系は更に、該試薬に暴露された白血球を長時間にわたり安定さ せることが判明した。 本発明の更に別の特徴及び技術的利点は、開示する多目的試薬系が、別の血液 学的測定で使用される等張生理食塩水と類似の屈折率を有することにある。 本発明の別の特徴及び技術的利点は、開示する多目的試薬系の溶解力が、１６ 倍もの薄さに希釈した全血試料中の赤血球を完全にかつ高速で溶解するのに十分 なほど大きく、従って正確且つ高速の細胞分析の実施に十分な白血球密度が維持 されることにある。これは、マルチパラメーター臨 床器具での自動分析を可能にするものである。 本発明の更に別の特徴及び技術的利点は、開示する多目的試薬系が、リンパ球 表面抗原、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ１９を保持させることにある 。 本発明の更に別の特徴及び技術的利点は、開示する方法が赤血球を極めて徹底 的に溶解するため、赤血球基質を洗浄するか又は除去しなくても、赤血球ゴース トからのシグナルがリンパ球からのシグナルと明確に区別できるほど小さく、し かも副次集団分離がより良く実施されることにある。 本発明の更に別の特徴及び技術的利点は、開示する末梢血分析方法が、従来の ステップ、又は密度勾配遠心分離ステップを必要としないことにある。 本発明の更に別の特徴及び技術的利点は、開示する方法が、臨床フローサイト メーターでの有核赤血球の定量を可能にすることにある。 本発明の更に別の特徴及び技術的利点は、開示する多目的試薬系が、末梢白血 球の高速、単一試薬、単一管、自動示差分析を可能にすることにある。 本発明の更に別の特徴及び技術的利点は、開示する方法 が、自動フローサイトメーターでのリンパ球サブクラスの高速分別分析を可能に することにある。 本発明のこれらの及び他の特徴及び利点は、以下の好ましい実施態様の説明に よって明らかにされよう。図面の簡単な説明 本発明及びその利点がより良く理解されるように、ここで添付図面を参照しな がら説明を行う。 添付図面中、第１図は、実施例１に記載のように処理した正常血液試料の白血 球分布を示している。調製した細胞懸濁液は直接ＣＤ３５００（登録商標）分析 器光学システムにかけ、システムの液圧装置は使用しなかった。 第２図は、実施例１２に記載のように処理した正常血液試料の白血球分布を示 している。処理した細胞懸濁液は直接ＣＤ３５００（登録商標）分析器光学シス テムにかけ、システムの液圧装置は使用しなかった。各クラスターは白血球副次 集団を標識されたものとして表している。 第３ａ図は、ニワトリ赤血球核（ＣＥＮ）を用いずに核染料を用いて実施例５ に記載のように処理した正常血液試料のＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）表示プリン トアウトを示している。 第３ｂ図は、核染料を用いて実施例５に記載のように処理した、ニワトリ赤血 球核を加えた正常血液試料のＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）表示プリントアウトを 示している。ＦＬ３染色ＣＥＮ集団が左上方の隅に見える。 第４ａ図、第４ｂ図、第４ｃ図及び第４ｄ図は、実施例２、３及び４に記載の ように処理した正常血液試料のＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）表示プリントアウト を示している。 第５ｂ図、第５ｄ図、第５ｆ図及び第５ｈ図は、免疫表現型決定のために実施 例２、３及び４に記載のように処理した正常血液試料のＦＡＣＳｃａｎ（登録商 標）表示プリントアウトを示し、第５ａ図、第５ｃ図、第５ｅ図及び第５ｇ図は 、同じ方法で調製した、但しＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社のＦａｃｓＬ ｙｓｅ（登録商標）で溶解した同じ試料のＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）表示プリ ントアウトを示している。詳細な説明 本発明は、広義には、有核末梢血液細胞の高速分析に適した多目的試薬系又は 血液希釈剤に関する。本発明の多目的試薬系は、赤血球を完全かつ速く溶解する ことができ、 それと同時に白血球の形態とリンパ球表面抗原の抗原性とを保持させる。 本発明の一面は、約３〜約７ｇ／ｌの非第四アンモニウム塩と、約０．０４〜 約０．１％ｗ／ｖ（即ち１００ｍｌ当たりのグラム数）の炭素数１〜４の脂肪族 アルデヒドと、約１０〜約２０ｍＭの、脂肪族アルデヒドに対して実質的に不活 性の非リン酸塩緩衝液と、水とを含む多目的試薬系からなる。該試薬系のｐＨは 約５．５〜約７．５のｐＨ範囲にあり、該試薬系の浸透圧濃度は約１６０〜３１ ０ｍＯｓｍ／Ｌである。該試薬系の屈折率は生理食塩水と類似しており、約１． ３３３〜約１．３３６の範囲である。第一アミノ基を含まない非リン酸塩緩衝液 は脂肪族アルデヒドに対して不活性である。従って、非リン酸塩緩衝液は通常、 第一アミノ基を含まないのがよい。 本発明の好ましい実施態様は、約９５ｍＭの塩化アンモニウム（５ｇ／ｌ）と 、約０．０７５容量％のホルムアルデヒドと、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの酢酸塩 緩衝液と、約１０ｍＭの重炭酸カリウムと、約０．０１％ｗ／ｖ（即ち１００ｍ ｌ当たりのグラム数）のサポニンとを含む多目的試薬系を使用する。該試薬系の ｐＨは約６．２〜約６．５ の範囲に調節し、該試薬系の浸透圧濃度は約２１５〜約２７０ｍＯｓｍ／ｌであ る。 浸透圧濃度（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）は、単位容量の水溶液中に溶解している 粒子の数であると定義される。浸透圧濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）は、単位重 量の水溶液中に溶解している粒子の数であると定義される。実際には、両者は、 本発明で使用する範囲で極めて接近した数値を有する。１ｋｇ当たりの溶解オス モルが１／１０００である溶液は、１ミリオスモス（ｍＯｓ）／ｋｇの濃度を有 する。オスモルは、１ｇ分子の非解離溶質中の粒子数である。張度は、血液の浸 透圧との関連における溶液の浸透圧の尺度である。低張溶液は、張度浸透圧が血 液より低い溶液である。低張溶液の浸透圧濃度は通常、約８０〜２５０ｍＯｓ／ ｌである。等張溶液は血液と同じ張度を有する。ここでは、浸透圧濃度は通常約 ２８０〜約３１０ｍＯｓ／ｌである。高張溶液は、約３１０〜４４０ｍＯｓ／ｌ の浸透圧濃度を有するのが普通である血液よりも、さらに大きい張度の溶液であ る。水は約１０〜２０ｍＯｓ／ｌの浸透圧濃度を有する。 本発明は、白血球の分別計数、有核赤血球及びリンパ球 の免疫表現型決定の自動測定における多目的試薬系の使用にも関する。有核末梢 全血細胞の高速分析方法は下記のステップを含む：本発明の多目的試薬系を凝固 防止処理した全血試料と混合し（その結果血液は１６〜１００倍に希釈される） 、該希釈剤−血液混合物を約２５℃〜４６℃の温度で１０秒以上インキュベート し、有核末梢血液細胞を自動血液分析装置で分析する。 末梢白血球の分別分析で本発明の多目的試薬系を使用する方法は、赤血球の溶 解と白血球の固定とを同時に行う高速単一試薬法であり、白血球は光散乱特性を 維持する。実施例１は、本発明の多目的試薬系の好ましい具体例を、白血球分別 分析の高速プロセスに適用した場合の説明である。第１図は、光散乱による（実 施例１のように処理した）正常血液試料中の白血球の分別分析を示している。一 般的には、細胞は光学観測チャンバを通って流れ、該チャンバ内で光電測定プロ セスにより、選択された角度で各細胞に吸収された光又は散乱された光が記録さ れる。種々の角度で集められた散乱光からの電子シグナルを、第１図に示すよう に二次元ドットプロットとして記録する。第１ｃ図に示すように顆粒球と白血球 集団の残りとの間に閾線を引くこ とにより、１０度対９０度の散乱プロットであるサイトグラム（ｃｙｔｏｇｒａ ｍ）で、まず顆粒球が同定される。次いで、第１ｂ図に示すように、直交（ＯＲ ＴＨＯＧＯＮＡＬ）対非偏光（ＤＥＰＯＬ）サイトグラムで好酸球が同定される 。その後、単球及びリンパ球が、サイズ対複雑度（ＣＯＭＰＬＥＸＩＴＹ）サイ トグラム（第１ａ図）でＹ軸に沿って同定される。なぜなら単球がリンパ球より 大きいからである。Ｘ軸（複雑度）に沿ってリンパ球と顆粒球との間に位置し、 既に同定された集団（好中球及び好酸球）のいずれにも属さないＹ軸沿いの単球 のシグナルより弱いシグナルは、標識された状態の好塩基球である（第１ａ図） 。 本発明の多目的試薬系の第一の成分は、非第四アンモニウム塩である。好まし くは、ジアンモニウム塩もトリアンモニウム塩も使用しない。種々のモノアンモ ニウム塩、特にハロゲン化塩を、約３〜約７ｇ／ｌ、好ましくは５ｇ／ｌ使用し 得る。この種の非第四アンモニウム塩の具体例としては、ＮＨ4Ｘ［式中、Ｘは ハロゲンである］が挙げられる。この種の非第四アンモニウム塩は、好ましくは ＮＨ4Ｃｌである。 本発明の多目的試薬系の第二の成分は、短鎖脂肪族アルデヒドである。この種 の脂肪族アルデヒドは、１〜４個の炭素を有するのが好ましい。アルデヒドの具 体例としては、ホルムアルデヒド及びそのポリマー、即ちパラホルムアルデヒド が挙げられる。アルデヒドは適当な比率及び濃度で使用すると、非第四アンモニ ウム塩及び緩衝液と協働して、赤血球を短時間でかつ完全に溶解する。また、ア ルデヒドは白血球を固定し、その膜の完全な状態を保持させる。本発明では、ホ ルムアルデヒド又は類似のアルデヒドを、約０．０４容量％〜約０．１０容量％ 、好ましくは約０．０８容量％〜約０．１容量％の量で使用する。 本発明の多目的試薬系の第三の成分は、該試薬系のアルデヒド成分に対して実 質的に不活性の非リン酸塩緩衝液である。従って、該緩衝液は第一アミノ基を含 んでいてはならない。該緩衝液はまた、約５．５〜約７．５のｐＨの実効緩衝能 力を示すものでなければならない。効果的な有機緩衝液の具体例としては、酢酸 塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、マレイン酸塩緩衝液及びクエン酸塩緩衝液が挙げ られる。効果的な生理緩衝液の具体例としては、２−（Ｎ−モルホリノ）エタン スルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、３−（Ｎ −モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、及びＮ−（２−ヒドロ キシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）緩衝 液が挙げられる。本発明では、酢酸塩又は他の適当な緩衝液を約１０ｍＭ〜約２ ０ｍＭの濃度、好ましくは約２０ｍＭの濃度で使用する。ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰ Ｓ緩衝液及びＨＥＰＥＳ緩衝液を使用する本発明の実施態様は、それぞれ実施例 ６、７及び８で記述する。 本発明の多目的血液希釈剤の任意的成分は、界面活性試薬である。好ましい界 面活性剤は、サポニン、即ちキラヤ樹皮及び他の供給源から分離した商業グレー ド粉末形態で入手できる植物抽出物である。市販のサポニンの化学的純度はロッ ト毎に異なるが、赤血球に対する選択性が第四アンモニウム塩より大きい。本発 明では、サポニン又は他の界面活性剤を約１０〜約２００ｍｇ／ｌ、好ましくは 約１００ｍｇ／ｌの量で使用する。サポニンは、多目的試薬系の他の成分と協働 して、全血中に存在する赤血球を完全に溶解する。正常血液試料の赤血球フラク ション、即ち赤血球細胞は、室温で約２０秒以内に溶解する。しかしながら、溶 解しにくい血液試料（例えば乳児、腎透析患者、多発性 骨髄腫患者、糖尿病又は尿毒症患者に由来する血液試料）の場合は、赤血球を完 全に溶解するために、血液を試薬系と共に約３８℃〜約４３℃の温度で２０秒ま でインキュベートする必要がある。血液試料を多目的試薬系と共にインキュベー トすると、上記のように多少昇温しても、白血球の膜の完全な状態が効果的に保 持され、リンパ球表面抗原の抗原性が維持される。これに対し、赤血球を溶解す るためにサポニンを単独で使用する場合は、本発明で使用する濃度の１０〜２０ 倍の濃度にしなければならない。このような濃度は白血球の一体性を著しく損な い、白血球の形態を保持するためには試薬の溶解活性の急速停止を必要とする。 本発明の利点は、多目的試薬系の成分が協働して白血球を穏やかに固定し、それ と同時に赤血球を溶解することにある。従って、比較的長いインキュベーション 時間でも白血球の完全な状態が保持される。実際、慢性リンパ性白血病に見られ るような脆弱な白血球でも、本発明の多目的試薬系中では２０分までのインキュ ベーション時間にわたって安定している。 第２図は、実施例１２に記載のように処理し、ＣＤ３５００（登録商標）分析 器（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓ ｔｉｃ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）システムに、システムの液圧装置 は使用せずに光学システムを介して直接かけた正常血液試料中の白血球の分布を 示している。第２ｃ図に示すように閾線を設定することにより、１０度対９０度 散乱プロットから、まず顆粒球が標識された状態で白血球集団の残りから同定さ れる。次いで、第１ｂ図のように好酸球と好中球との間の閾線を設定することに より、直交対非偏光散乱プロット（第２ｂ図）で好酸球が標識された状態で同定 される。その後、単球及びリンパ球が複雑度対サイズ散乱プロットで、標識され た状態で同定される（第２ａ図）。Ｘ軸（複雑度）に沿ってリンパ球と顆粒球と の間に位置し、既に同定された集団（好中球及び好酸球）のいずれにも属さない Ｙ軸沿いの単球のシグナルより弱いシグナルは、標識された状態の好塩基球であ る（第２ａ図）。 本発明の多目的試薬系の、好ましい、但し任意的な成分は、アルカリ塩、好ま しくは一価の重炭酸アルカリ塩である。一価の重炭酸アルカリ塩は本発明の希釈 剤に必須の成分ではないが、試薬系の赤血球溶解能力を低下させずに浸透圧濃度 を増加させるために該希釈剤に添加し得る。他の 多くの化合物、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム又はリン酸塩緩衝液は、試 薬系の浸透圧濃度を上げるために使用すると、試薬系の溶解能力を低下させる。 一価の重炭酸アルカリ塩の具体例としては、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム 又は重炭酸リチウムが挙げられる。本発明では、重炭酸カリウム又は他のアルカ リ金属重炭酸塩を約０．００５〜約０．０１５％ｗ／ｖ（即ち１００ｍｌ当たり のミリグラム数）、好ましくは約０．０１％ｗ／ｖの量で使用し得る。 本発明の多目的試薬系の別の任意的成分は血小板凝集防止剤（ａｎｔｉ−ｃｌ ｕｍｐｉｎｇ ａｇｅｎｔ）である。例えば、試料／試薬混合物中の血小板の凝 集を防止するために、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）塩を試薬系に添加し 得る。本発明では、テトラナトリウムＥＤＴＡ又は他のＥＤＴＡ塩を約２０〜約 ２００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００ｍｇ／ｌの量で使用する。 本発明の別の実施態様は、自動血液分析器での有核赤血球の定量分析を可能に する。全血試料中に存在する有核赤血球の比率を分析するために、核染料、例え ばエチジウムホモダイマーを、血液試料に加える前の多目的試薬系に加 える。この実施態様では、核染料を約０．０５ｍｇ％〜約０．１５ｍｇ％ｗ／ｖ （即ち１００ｍｌ当たりのミリグラム数）、好ましくは０．１ｍｇ％ｗ／ｖの量 で加える。該試薬系は、赤血球を完全に溶解すると同時に白血球の膜の完全な状 態を保持させる。該多目的試薬系では、添加した核染料が未熟赤血球の露出核と 反応するが、無傷の白血球には侵入できない。核染料と相互作用し得る唯一の核 物質は有核赤血球に由来するものであるため、染色核物質は血液試料の有核赤血 球フラクションに比例し、自動電気光学分析器で定量できる。この本発明の単一 試薬プロセスは、種々の白血球集団を有核赤血球から高速で弁別し、ある種の獣 医学的用途で特に有用である。 第３ａ図及び第３ｂ図は、実施例５に記載のように処理した、ニワトリ赤血球 核（ＣＥＮ）を含む正常血液試料のＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）表示を示してい る。第３ａ図に示す試料は、ＣＥＮを使用せずに核染料で処理し、第３ｂ図に示 す試料は核染料及びＣＥＮ両方の存在下で処理したものである。左側の二次元ド ットプロットは、側方散乱（ＳＳＣ）を前方散乱（ＦＳＣ）に対してプロットし ている。右側の二次元ドットプロットは、ＳＳＣシグナルを、 試料中の総ての細胞からの赤色蛍光（ＦＬ３）に対してプロットしている。第３ ｂ図の上方左の隅に、ＦＬ３染色ＣＥＮ集団が見えることに留意されたい。 本発明の別の実施態様は、リンパ球副次集団の定量分析を可能にする。リンパ 球サブクラス分析は、特定のリンパ球表面抗原に対するフルオロクロム複合モノ クローナル抗体を、多目的試薬系又は血液希釈剤を添加する前の全血と混合する ことにより実施する。血液試料に加える標識抗体フラクションの濃度は個々の抗 体調製物に依存するが、市販の抗体調製物の場合は通常、血液の量の約１／２〜 １／１０である。試薬系を加え、赤血球を溶解した後、リンパ球−抗体反応産物 を自動フローサイトメーターシステムで分析し得る。開示する試薬系は、フルオ ロクロム標識抗体に頻繁に使用されるフルオレセンイソチオシアネート（ＦＩＴ Ｃ）又はフィコエリテリン（ＰＥ）のような蛍光マーカーを「停止」しない。リ ンパ球サブクラスの分析は、エイズの流行に伴い、診断手段としての重要性を増 している。血液細胞集団の表面マーカーを同定する能力は、リンパ球及び他の白 血球フラクション、例えば単球及び好中球の副次集団の表面成分及び特徴に関す る科学者の知識が増加し ているため、年々重要になってきていると思われる。 第４ａ図、第４ｂ図、第４ｃ図及び第４ｄ図は、実施例２、３及び４に記載の ように処理した正常血液試料のＦＡＳＣｃａｎ（登録商標）表示を示している。 第４ａ図は、ドナー試料の陰性対照として抗体を加えずに処理したものである。 第４ｂ図は、ｐａｎ Ｂ細胞（ＣＤ１９＋リンパ球）及びｐａｎ Ｔ細胞（ＣＤ ３＋リンパ球）を同定するために実施例４に記載のように処理したものである。 リンパ球集団はまず前方散乱（ＦＳＣ）対側方散乱（ＳＳＣ）プロットで区分し 、緑色蛍光（ＦＬ１）対橙色蛍光（ＦＬ２）チャネルで再分析した。第４ａ図、 第４ｂ図、第４ｃ図及び第４ｄ図から明らかなように、非標識リンパ球は総て下 方左部分にあり、ＣＤ３−ＦＩＴＣ抗体標識Ｐａｎ Ｔ細胞は下方右部分に移動 し、ＣＤ１９−ＰＥ標識Ｐａｎ Ｂ細胞は上方左部分に移動している。第４ｃ図 の試料は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋リンパ球）を同定するために実施例２に記 載のように処理した。ヘルパーＴ細胞はＴリンパ球の副次集団であり、細胞表面 にＣＤ３抗原及びＣＤ４抗原の両方を有し、従って抗ＣＤ３抗体のＦＩＴＣ標識 に起因して右に移動し、抗体ＣＤ４抗体のＰＥ標識に起因し て上方右部分に移動している。第４ｄ図の試料は、サプレッサーＴ細胞（ＣＤ８ ＋リンパ球）を同定するために実施例３に記載のように処理した。サプレッサー Ｔ細胞もＴリンパ球の副次集団であり、ＣＤ３抗原及びＣＤ８抗原の両方を有す る。従って、該細胞は両方の抗体で標識され、上方右部分に位置した。 第５ｂ図、第５ｄ図、第５ｆ図及び第５ｈ図は、実施例２、３及び４に記載の ように処理した正常血液試料のＦＡＳＣｃａｎ（登録商標）表示プリントアウト を示している。第５ａ図、第５ｃ図、第５ｅ図及び第５ｇ図は、前述と同じ実施 例に記載のように処理した、但し赤血球を実施例１１に記載のように市販の溶解 溶液であるＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社のＦａｃｓＬｙｓｅ（登録商標 ）で溶解した、前述と同じ試料を示している。カラム１及び３はＦＳＣ対ＳＳＣ サイトグラムであり、カラム２及び４は区分したリンパ球のＦＬ１対ＦＬ２二次 元ドットプロットである。比較のために、両方の試料の分析で、同一のＦＳＣ、 ＳＳＣ、ＦＬ１及びＦＬ２ゲインを使用した。 ＦＳＣ対ＳＳＣサイトグラムから明らかなように、右側カラムのサイトグラム は、好中球、好酸球、単球及びリン パ球の明確に規定されたクラスターを示している。これらのクラスターはいずれ も、ノイズ（主に赤血球基質からのシグナル）から明確に分離されている。これ は、白血球が本発明の多目的血液希釈剤中で良好に保存されたことを示すもので ある。これは、より正確なリンパ球区分を可能にする。これと比較して、左側カ ラムのサイトグラムの細胞クラスターはそれほど明確に規定されていない。各細 胞クラスターの分別がそれほど明確ではなく、顆粒球のシグナルが右側カラムの シグナルより遥かに弱い。これは、ある種のタンパク質成分の漏洩に起因し得る これらの細胞の屈折率の変化を示唆するものである。最後のカラムの区分したリ ンパ球のＦＬ１対ＦＬ２二次元ドットプロットの質は、赤血球をＦａｃｓＬｙｓ ｅ（登録商標）で溶解した第二のカラムの対応するドットプロットの質と本質的 に同等である。 第５ａ図は、実施例２の記載のように処理した、但し抗体と反応させずに、Ｆ ａｃｓＬｙｓｅ（登録商標）で溶解した正常血液の陰性対照を示している。第５ ｂ図も同じ試料の陰性対照であるが、赤血球は本発明のある実施態様の多目的希 釈剤で溶解した。第５ｃ図、第５ｅ図及び第５ｇ 図は、実施例２、３及び４に記載のように処理した、但し赤血球を実施例１１の ようにＦａｃｓＬｙｓｅ（登録商標）で溶解した、同じ試料を表している。第５ ｄ図、第５ｆ図及び第５ｈ図は、赤血球を本発明のある実施態様の多目的希釈剤 で溶解して、実施例２、３及び４に記載のように処理した同じ試料に関するもの である。 以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。尚、これらの実施例は本 発明を説明するためのものであってこれを限定するためのものではない。 実施例１ 白血球分別分析 ５０μｌのＥＤＴＡ凝集防止処理正常血液試料を、予め４０℃に暖めた多目的 試薬系１ｍｌと混合し、室温で１６秒間インキュベートした。試薬系は、０．５ ％ｗ／ｖの塩化アンモニウムと、０．０８％ｗ／ｖのホルムアルデヒドと、０． ０１％ｗ／ｖのサポニンと、０．１％ｗ／ｖの重炭酸カリウムと、２０ｍＭの酢 酸塩緩衝液とを含んでいた。該試薬系は、ｐＨが約６．２、浸透圧濃度が２６７ ｍＯｓｍ／ｌであった。この混合物を３８±２℃で１６秒間インキュベートし、 システムの液圧装置を使用せずに光学シス テムを介してＣＤ３５００（登録商標）システムに直接かけた。該試料のサイト グラムは第１図に示す通りである。 実施例２ リンパ球免疫表現型決定 試験管で、５０μｌのＥＤＴＡ凝集防止処理全血を、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ及び 抗ＣＤ４−ＰＥを含むモノクローナル抗体溶液１０μｌと混合した。 該混合物を室温で１５分間インキュベートした後、０．５％ｗ／ｖの塩化アン モニウムと、０．０２％ｗ／ｖのテトラナトリウムＥＤＴＡと、０．１容量％の ホルムアルデヒドと、０．００７５％ｗ／ｖのサポニンと、０．０１％ｗ／ｖの 重炭酸カリウムと、２０ｍＭの酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多目的試薬系を１ ．０ｍｌ加えた。試薬系は、ｐＨが約６．２、浸透圧濃度が２７０ｍＯｓｍ／ｌ であり、試薬系−血液溶液はｐＨが約７．０であった。 試薬系−血液溶液を室温で２０秒〜１０分間インキュベートした。このように インキュベーション時間を許容し得る範囲内で変化させることにより、複数の試 料分析が可能になる。 ＣＤ３＋及びＣＤ４＋リンパ球副次集団の比率を、第４ ａ図に示すようにＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターで測定した 。 実施例３ リンパ球免疫表現型決定 試験管で、５０μｌのＥＤＴＡ凝集防止処理全血を、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ及び 抗ＣＤ８−ＰＥを含むモノクローナル抗体溶液１０μｌと混合した。 該混合物を室温で１５分間インキュベートした後、０．５％ｗ／ｖの塩化アン モニウムと、０．０２％ｗ／ｖのテトラナトリウムＥＤＴＡと、０．１容量％の ホルムアルデヒドと、０．００７５％ｗ／ｖのサポニンと、０．０１％ｗ／ｖの 重炭酸カリウムと、２０ｍＭの酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多目的試薬系を１ ．０ｍｌ加えた。実施例１に記載のように、試薬系はｐＨが約６．２、浸透圧濃 度が２７０ｍＯｓｍ／ｌであった。 全血−試薬系溶液は室温で２０秒〜１０分間の範囲の任意の時間にわたってイ ンキュベートし得、それによって複数の試料分析が可能となる。 ＣＤ３＋及びＣＤ８＋リンパ球副次集団の比率を、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標 ）フローサイトメーターを用いて測 定した。 実施例４ リンパ球免疫表現型決定 試験管で、５０μｌのＥＤＴＡ凝集防止処理全血を、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ及び 抗ＣＤ１９−ＰＥを含むモノクローナル抗体溶液１０μｌと混合した。 該混合物を室温で１５分間インキュベートした後、０．５％ｗ／ｖの塩化アン モニウムと、０．０２％ｗ／ｖのテトラナトリウムＥＤＴＡと、０．１容量％の ホルムアルデヒドと、０．００７５％ｗ／ｖのサポニンと、０．０１％ｗ／ｖの 重炭酸カリウムと、２０ｍＭの酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多目的試薬系を１ ．０ｍｌ加えた。多目的試薬系は、実施例１に記載のように、ｐＨが約６．２、 浸透圧濃度が２７０ｍＯｓｍ／ｌであった。 全血−試薬系溶液は室温で２０秒〜１０分間インキュベートし得た。インキュ ベーション時間をこのように変化させると、複数の試料分析が可能になる。 ＣＤ３＋及びＣＤ１９＋リンパ球副次集団の比率を、第４ｂ図に示すように、 ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターを用いて測定した。 実施例５ 有核赤血球の決定 ニワトリ核を含む又は含まないＥＤＴＡ凝集防止処理全血試料５０μｌを、０ ．１ｍｇ％ｗ／ｖの核染料と、０．５％ｗ／ｖの塩化アンモニウムと、０．０７ ５容量％のホルムアルデヒドと、０．０１％ｗ／ｖのサポニンと、０．０１％ｗ ／ｖの重炭酸カリウムと、２０ｍＭの酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多目的試薬 系９５０μｌと混合した。多目的試薬系は、ｐＨが約６．０、浸透圧濃度が２７ ０ｍＯｓｍ／ｌであった。 全血−試薬系溶液を３８±２℃で２０秒間インキュベートした。 全血試料中の有核赤血球の比率を、第３ａ図及び第３ｂ図に示すように、ＦＡ ＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターで測定した。 実施例６ 白血球分別分析 ＥＤＴＡ凝集防止処理全血５０μｌを、２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液と、０．５％ ｗ／ｖのフッ化アンモニウムと、０．０８容量％のホルムアルデヒドと、０．０ １％ｗ／ｖのサ ポニンとを含む本発明の多目的試薬系９５０μｌと混合した。試薬系は、ｐＨが 約６．２、浸透圧濃度が２８０ｍＯｓｍ／ｌであった。 全血−試薬系溶液を４０℃で２０秒間インキュベートした。 白血球の分別分析を、実験用臨床フローサイトメーターで実施した。 実施例７ 白血球分別分析 ＥＤＴＡ凝集防止処理全血５０μｌを、２０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液と、０．５ ％ｗ／ｖの塩化アンモニウムと、０．１容量％のホルムアルデヒドと、０．０１ ２％ｗ／ｖのサポニンと、０．０１％ｗ／ｖのテトラナトリウムＥＤＴＡとを含 む本発明の多目的試薬系１．０ｍｌと混合した。多目的試薬系はｐＨが約７．０ 、浸透圧濃度が２８０ｍＯｓｍ／ｌであった。 全血−試薬系溶液を４２℃で２０秒間インキュベートした。 白血球の分別分析を、実験用臨床フローサイトメーターで実施した。 実施例８ 白血球分別分析 ＥＤＴＡ凝集防止処理全血５０μｌを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液と、０． ４％ｗ／ｖのフッ化アンモニウムと、０．０８容量％のホルムアルデヒドと、０ ．０１％ｗ／ｖのサポニンと、０．１％ｗ／ｖの重炭酸カリウムとを含む本発明 の多目的試薬系１．０ｍｌと混合した。試薬系はｐＨが約７．０、浸透圧濃度が ２７０ｍＯｓｍ／ｌであった。 全血−試薬系溶液を４０℃で約２０秒間混合した。 白血球の分別分析を、実験用臨床フローサイトメーターで実施した。 実施例９ 白血球を決定するための分別インキュベーション時間 ＥＤＴＡ凝集防止処理全血５０μｌを、本発明の多目的試薬系９５０μｌと３ ８±２℃で混合した。試薬系は、０．５％ｗ／ｖの塩化アンモニウムと、０．０ ８容量％のホルムアルデヒドと、０．０１％ｗ／ｖのサポニンと、０．１％ｗ／ ｖの重炭酸カリウムと、２０ｍＭの酢酸塩緩衝液とを含んでいた。試薬系はｐＨ が約６．２、浸透圧濃度が２ ６７ｍＯｓｍ／ｌであった。 前記混合物を３８±２℃でインキュベートし、該混合物のアリコートを１４秒 、２分、４分、６分、８分及び１０分の時点で逐次採取した。 アルゴン−イオンレーザーを備えた実験用臨床フローサイトメーターで、白血 球の５種分別分析を各アリコート毎に実施した。 実施例１０ 白血球を決定するためのインキュベーション時間及び温度の変化 ＥＤＴＡ凝集防止処理全血５０μｌを、０．５％ｗ／ｖの塩化アンモニウムと 、０．０８容量％のホルムアルデヒドと、０．０１％ｗ／ｖのサポニンと、０． ０１％ｗ／ｖの重炭酸カリウムと、２０ｍＭの酢酸塩緩衝液とを含む本発明の多 目的試薬系９５０μｌと混合した。試薬系はｐＨが約６．２、浸透圧濃度が２６ ７ｍＯｓｍ／ｌであった。 得られた混合物のアリコートを、１０分までの種々の時間間隔で、それぞれ３ ６℃、３８℃、４０℃、４２℃、４５℃及び４６℃でインキュベートした。 自動光電システムを用いて、白血球の５種分別分析を各 アリコートの試料について実施した。 実施例１１ 市販の溶解溶液及び本発明の多目的試薬系の比較検査 免疫表現型決定実験で、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社の市販溶解溶液 （ＦａｃｓＬｙｓｅ（登録商標））を、本発明の多目的試薬系（多目的希釈剤） の一つと比較した。試料は実施例２、３及び４と同様に処理した。結果は表１に 示す。 市販のＦａｃｓＬｙｓｅ（登録商標）の場合は、検査試料とＦａｃｓＬｙｓｅ （登録商標）との混合物をまず室温暗所で１０分間インキュベートした。その後 、得られた混合物を３０００ｇで５分間遠心分離した。上清を分離し、細胞ペレ ット（ｂｕｔｔｏｎ）を１ｍｌのリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した。該細胞懸 濁液を再び３０００ｇで５分間遠心分離した。その後、細胞ペレットを、１重量 ％のパラホルムアルデヒドを含むリン酸塩緩衝生理食塩水に再懸濁した。次いで 、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）でアッセイを行った。 前述のような手のかかる長時間の赤血球溶解操作と対照的に、本発明の多目的 試薬系（多目的希釈剤）の一つを使 用した場合は、アッセイ操作全体が約２０秒で完了した。洗浄ステップは必要な かった。 比較データを表１にまとめて示す。この表から明らかなように、市販の溶解溶 液を用いた操作で得られた結果、及び本発明の多目的試薬系を用いた操作で得ら れた結果は、本質的に同等である。 実施例１２ 白血球分別分析 ＥＤＴＡ凝集防止処理全血試料５０μｌを、予め４０℃に暖めた本発明の多目 的試薬系１ｍｌと混合し、室温で１６秒間インキュベートした。試薬系は、０． ５％ｗ／ｖの塩化アンモニウムと、０．０８容量％のホルムアルデヒドと、０． ０１％ｗ／ｖのサポニンと、０．１％ｗ／ｖの重炭酸カリウムと、１０ｍＭの酢 酸塩緩衝液とを含んでいた。試薬系はｐＨが約６．２、浸透圧濃度が２２５ｍＯ ｓｍ／ｌであった。この混合物を３８±２℃で１６秒間インキュベートし、シス テムの液圧装置を使用せずに光学システムを介してＣＤ３５００（登録商標）分 析器システムに直接かけた。試料のサイトグラムは第２図に示す通りである。 以上、本発明及びその利点を詳細に説明してきたが、本 明細書に開示する概念及び特定実施態様を、本発明と同じ目的を達成するための 別の系又は試薬の改質又は設計のベースとして使用し得ることは当業者には明ら かであろう。また、このような均等の構成が「請求の範囲」に記載の本発明の精 神及び範囲から逸脱するものではないことも当業者によって認識されよう。
【手続補正書】 【提出日】１９９５年１２月２０日 【補正内容】 請求の範囲 １． 有核血液細胞を決定するために、全血試料の赤血球を溶解すると同時に白 血球を固定するのに適した多目的試薬系であって、約３〜約７ｇ／ｌの非第四ア ンモニウム塩と、約０．０４〜約０．１０容量％の短鎖脂肪族アルデヒドと、前 記脂肪族アルデヒドに対して実質的に不活性であるという特徴を有し且つ第一ア ミノ基を含まない約１０〜約２０ｍＭの非リン酸塩緩衝液と、約１０〜約２００ ｍｇ／ｌの界面活性剤と、前記多目的試薬系を約５．５〜約７．５のｐＨ及び約 １６０〜約３１０ｍＯｓｍ／ｌの浸透圧濃度に維持するような水とを含む前記多 目的試薬系。 ２． 前記非第四アンモニウム塩が、塩化アンモニウム及びフッ化アンモニウム の中から選択したモノアンモニウム塩からなる請求項１に記載の多目的試薬系。 ３． 前記短鎖脂肪族アルデヒドが炭素数１〜４の脂肪族アルデヒドからなる請 求項１に記載の多目的試薬系。 ４． 前記短鎖脂肪族アルデヒドが、ホルムアルデヒド及びパラホルムアルデヒ ドの中から選択したものである請求項３に記載の多目的試薬系。 ５． 前記界面活性剤がサポニンからなる請求項１に記載の多目的試薬系。 ６． 更に、約０．０５ｍｇ％〜約０．１５ｍｇ％ｗ／ｖの核染料も含む請求項 １に記載の多目的試薬系。 ７． 有核血液細胞を決定するために、全血試料の赤血球を溶解すると同時に白 血球を固定するのに適した多目的試薬系であって、約５ｇ／ｌの非第四アンモニ ウム塩と、約０．０７５容量％の短鎖脂肪族アルデヒドと、約１０ｍＭ〜約２０ ｍＭの酢酸塩緩衝液と、約１００ｍｇ／ｌのサポニンと、約１０ｍＭの重炭酸カ リウムと、前記多目的試薬系を約６．２〜約６．５のｐＨ範囲及び約２１５〜約 ２７０ｍＯｓｍ／ｌの浸透圧濃度に維持するような水とを含む前記多目的試薬系 。 ８． 免疫表現型リンパ球副次集団の決定に有用な診断試薬キットであって、約 １０ｍＭ〜約２０ｍＭの酢酸塩緩衝液と約０．０７５容量％のホルムアルデヒド とを含むｐＨ約５．５〜約７．５の溶液と、前記緩衝溶液１００ｍｌ当たり約０ ．５ｇの塩化アンモニウムと約０．１ｇの重炭酸カリウムと約１０ｍｇのサポニ ンとを含む組成物とからなる前記診断試薬キット。 ９． 有核赤血球の決定に有用な診断キットであって、請求項１に記載の多目的 試薬系と核染料溶液とからなる前記診断キット。 １０． 全血から有核末梢血液細胞を高速で分析するための方法であって、 全血と多目的試薬系とを約１部に対して約１６〜約１００部の範囲までの比 率で混合することにより混合物を調製し、但し前記試薬系は、約３〜約７ｇ／ｌ の非第四アンモニウム塩と、約０．０４〜約０．１容量％の短鎖脂肪族アルデヒ ドと、前記脂肪族アルデヒドに対して実質的に不活性であることを特徴とする約 １０〜約２０ｍＭの非リン酸塩緩衝液と、前記多目的試薬系を約５．５〜約７． ５のｐＨ及び約１６０〜約３１０ｍＯｓｍ／βの浸透圧濃度に維持するような水 とを含み、 前記混合物を約２５℃〜約４６℃の温度で少なくとも約１０秒間インキュベ ートし、 自動光電血液分析装置で有核末梢血液細胞を決定するステップを含む前記方 法。 １１． 更に、細胞表面マーカーに対する抗体を全血試料に加えるステップも含 む請求項１０に記載の方法。 １２． 有核末梢血液細胞の決定が、少なくとも５種類の白血球の決定からなる 請求項１０に記載の方法。 １３． 有核末梢血液細胞の決定が有核赤血球の決定からなる請求項１０に記載 の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 1/30 8310−2Ｊ 15/14 Ｃ 6928−2Ｊ 33/49 Ａ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 49/00 Ｚ 7431−4Ｃ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． 有核血液細胞を決定するために、全血試料の赤血球を溶解すると同時に白 血球を固定するのに適した多目的試薬系であって、約３〜約７ｇ／ｌの非第四ア ンモニウム塩と、約０．０４〜約０．１０容量％の短鎖脂肪族アルデヒドと、前 記脂肪族アルデヒドに対して実質的に不活性であるという特徴を有する約１０〜 約２０ｍＭの非リン酸塩緩衝液と、前記多目的試薬系を約５．５〜約７．５のｐ Ｈ及び約１６０〜約３１０ｍＯｓｍ／ｌの浸透圧濃度に維持するような水とを含 む前記多目的試薬系。 ２． 更に、約１０〜約２００ｍｇ／ｌの界面活性剤も含む請求項１に記載の多 目的試薬系。 ３． 約１．３３３〜約１．３３６の屈折率を有する請求項１に記載の多目的試 薬系。 ４． 約２００〜約２８０ｍＯｓｍ／ｌの浸透圧濃度を有する請求項１に記載の 多目的試薬系。 ５． 前記非第四アンモニウム塩がモノアンモニウム塩からなる請求項１に記載 の多目的試薬系。 ６． 前記非第四アンモニウム塩が塩化アンモニウムから なる請求項５に記載の多目的試薬系。 ７． 前記非第四アンモニウム塩がフッ化アンモニウムからなる請求項５に記載 の多目的試薬系。 ８． 前記短鎖脂肪族アルデヒドが炭素数１〜４の脂肪族アルデヒドからなる請 求項１に記載の多目的試薬系。 ９． 前記短鎖脂肪族アルデヒドがホルムアルデヒドからなる請求項８に記載の 多目的試薬系。 １０． 前記短鎖脂肪族アルデヒドがパラホルムアルデヒドからなる請求項８に 記載の多目的試薬系。 １１． 前記緩衝液が第一アミノ基を含んでいない請求項１に記載の多目的試薬 系。 １２． 前記界面活性剤がサポニンからなる請求項２に記載の多目的試薬系。 １３． 更にアルカリ塩も含む請求項１に記載の多目的試薬系。 １４． 前記アルカリ塩が一価の重炭酸アルカリ塩からなる請求項１３に記載の 多目的試薬系。 １５． 更に血小板凝集防止剤も含む請求項１に記載の多目的試薬系。 １６． 前記血小板凝集防止剤が約２０〜約２００ｍｇ／ ｌのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）塩からなる請求項１５に記載の多目的 試薬系。 １７． 前記ＥＤＴＡ塩がテトラナトリウムＥＤＴＡからなる請求項１６に記載 の多目的試薬系。 １８． 更に、約０．０５ｍｇ％〜約０．１５ｍｇ％ｗ／ｖの核染料も含む請求 項１に記載の多目的試薬系。 １９． 更に、約０．１ｍｇ％ｗ／ｖの核染料も含む請求項１８に記載の多目的 試薬系。 ２０． 有核血液細胞を決定するために、全血試料の赤血球を溶解すると同時に 白血球を固定するのに適した多目的試薬系であって、約５ｇ／ｌの非第四アンモ ニウム塩と、約０．０７５容量％の短鎖脂肪族アルデヒドと、約１０ｍＭ〜約２ ０ｍＭの酢酸塩緩衝液と、約１００ｍｇ／ｌのサポニンと、約１０ｍＭの重炭酸 カリウムと、前記多目的試薬系を約６．２〜約６．５のｐＨ範囲及び約２１５〜 約２７０ｍＯｓｍ／ｌの浸透圧濃度に維持するような水とを含む前記多目的試薬 系。 ２１． 前記非第四アンモニウム塩が塩化アンモニウムからなる請求項２０に記 載の多目的試薬系。 ２２． 前記非第四アンモニウム塩がフッ化アンモニウム からなる請求項２０に記載の多目的試薬系。 ２３． 前記短鎖脂肪族アルデヒドがパラホルムアルデヒドからなる請求項２０ に記載の多目的試薬系。 ２４． 前記短鎖脂肪族アルデヒドがホルムアルデヒドからなる請求項２０に記 載の多目的試薬系。 ２５． 更に、約０．１ｍｇ％の核染料も含む請求項２０に記載の多目的試薬系 。 ２６． 更に、約１００ｍｇ／ｌのテトラナトリウムＥＤＴＡも含む請求項２０ に記載の多目的試薬系。 ２７． 免疫表現型リンパ球副次集団の決定に有用な診断試薬キットであって、 約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの酢酸塩緩衝液と約０．０７５容量％のホルムアルデヒ ドとを含むｐＨ約５．５〜約７．５の溶液と、前記緩衝溶液１００ｍｌ当たり約 ０．５ｇの塩化アンモニウムと約０．１ｇの重炭酸カリウムと約１０ｍｇのサポ ニンとを含む組成物とからなる前記診断試薬キット。 ２８． 有核赤血球の決定に有用な診断キットであって、請求項２０に記載の多 目的試薬系と核染料溶液とからなる前記診断キット。 ２９． リンパ球免疫表現型決定に有用な診断キットであっ て、請求項２０に記載の多目的試薬系と、リンパ球表面抗原に対するフルオロク ロム複合抗体とからなる前記診断キット。 ３０． 全血から有核末梢血液細胞を高速で分析するための方法であって、 全血と多目的試薬系とを約１部に対し約１６〜約１００部の範囲までの比率 で混合することにより混合物を調製し、但し前記試薬系は、約３〜約７ｇ／ｌの 非第四アンモニウム塩と、約０．０４〜約０．１容量％の短鎖脂肪族アルデヒド と、前記脂肪族アルデヒドに対して実質的に不活性であることを特徴とする約１ ０〜約２０ｍＭの非リン酸塩緩衝液と、前記多目的試薬系を約５．５〜約７．５ のｐＨ及び約１６０〜約３１０ｍＯｓｍ／ｌの浸透圧濃度に維持するような水と を含み、 前記混合物を約２５℃〜約４６℃の温度で少なくとも約１０秒間インキュベ ートし、 自動光電血液分析装置で有核末梢血液細胞を決定するステップを含む前記方 法。 ３１． 更に、細胞表面マーカーに対する抗体を全血試料に加えるステップも含 む請求項３０に記載の方法。 ３２． 前記抗体がフルオロクロム複合したものである請求項３１に記載の方法 。 ３３． 前記抗体がモノクローナル抗体からなる請求項３１に記載の方法。 ３４． 前記抗体がリンパ球表面抗原に対するものである請求項３１に記載の方 法。 ３５． 有核末梢血液細胞の決定がリンパ球表現型決定からなる請求項３０に記 載の方法。 ３６． 有核末梢血液細胞の決定が、少なくとも５種類の白血球の決定からなる 請求項３０に記載の方法。 ３７． 有核末梢血液細胞の決定が有核赤血球の決定からなる請求項３０に記載 の方法。
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