JPH08319298A - 抗ヒト老化マーカータンパク質モノクローナル抗体及びそれを用いる測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト老化マーカータンパク質（ヒトＳＭＰ）
を認識するモノクローナル抗体を製造し、さらにこの抗
体を用いて検体中のヒトＳＭＰを測定することができ
る。 【効果】 この抗体を用いた測定方法により、ヒト組織
中又は体液中に存在するヒトＳＭＰを検出及び定量する
ことができるようになった。この測定結果から、肝細胞
障害や腎尿細管の破壊のモニターに使用できる他、新生
児の肝臓及び腎臓の発達の程度を観察すること、対年齢
の老化率の観察を行い、健康状態をモニターすることが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトの臓器、組織、血
液、尿、髄液等に存在するヒト老化マーカータンパク質
（以下ヒトＳＭＰ（senescence marker protein ）とい
う）を認識するモノクローナル抗体（以下抗ヒトＳＭＰ
モノクローナル抗体という）及びこのモノクローナル抗
体を用いるヒトＳＭＰの測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ラット肝臓中には加齢とともにその量が
変化するタンパク質としてＳＭＰが見出された。このＳ
ＭＰには、例えばアンドロゲン非依存的に加令とともに
その値が低下し、その週令と相関する分子量３０ｋＤａ
のＳＭＰ３０が知られている（Biochimica Biophisica
Acta 1116: 297-305(1992)）。又ヒトのＳＭＰ３０につ
いては、ラットｃＤＮＡをプローブにしてそのｃＤＮＡ
が単離され塩基配列が決定されたが（生化学，第６６
巻，第４号，３５９頁（１９９４））、そのモノクロー
ナル抗体の製造法は確立されておらず、抗体を用いる測
定も知られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ヒトＳＭＰ又はＳＭＰ
３０は、肝障害や腎障害により血中濃度が増大する。従
って、血中のヒトＳＭＰ又はＳＭＰ３０を測定すること
により、肝細胞障害のモニタリングとして利用すること
や腎尿細管の破壊のモニターに使用される。又これを測
定するこにより、新生児の肝臓及び腎臓の発達の程度を
観察することができる。さらに、ヒトＳＭＰ又はＳＭＰ
３０は老化するほどその濃度が低下するので、これを測
定することにより対年齢の老化率の観察を行い、老化の
指標や健康状態をモニターすることもできる。本発明の
目的は、ヒトＳＭＰを認識するモノクローナル抗体を作
成し、この抗体を用い免疫学的手段によりヒトＳＭＰを
測定する方法を提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は鋭意研究し
た結果、ヒトＳＭＰと反応する抗ヒトＳＭＰモノクロー
ナル抗体及びヒトＳＭＰ３０と反応する抗ヒトＳＭＰ３
０モノクローナル抗体を見い出し、さらにこれら抗体を
用いた免疫測定法を開発し本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明はヒトＳＭＰ又はヒトＳ
ＭＰ３０と特異的に反応する抗体を提供し、この抗体を
用いてヒトＳＭＰ又はヒトＳＭＰ３０を測定することに
より肝障害、腎障害及び健康状態をモニターすることが
できる。

【０００６】以下本発明をヒトＳＭＰ３０により更に説
明する。本発明の抗ヒトＳＭＰ３０モノクローナル抗体
は、ポリペプチドであるヒトＳＭＰ３０を免疫原として
用いることにより製造することができる。この免疫原に
用いるヒトＳＭＰ３０は例えばヒト肝臓から等電点電気
泳動、ゲル濾過等を組み合わせて分子量３０ＫＤａのポ
リペプチドとして単離することにより取得することがで
きる（下記参考例号参照）。さらに大量にヒトＳＭＰ３
０を得る方法としてこのヒトＳＭＰ３０のｃＤＮＡのク
ローニングを行い、プラスミドベクターに組み込み培養
することによりヒトＳＭＰ３０を得た。

【０００７】そのクローニングは次のように行うことが
できる。肝組織中よりＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴセル
ロースカラムによりＰｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡよりＤＮＡ
を合成し、ＰＣＲ法により増幅する。これを制限酵素 E
coRIで切断したｃＤＮＡライブラリーを得る。更にＴ４
リガーゼで処理し、EcoRI-Not Ｉアダプターにリゲート
する。過剰のアダプターをゲル濾過で除去し、λZap II
ベクターにリゲートする。次にヒトＳＭＰ３０のｃＤＮ
Ａフラグメントを得るため、既に単離したヒトＳＭＰ３
０の一部のアミノ酸配列よりオリゴヌクレオチドプライ
マーを合成する。ＤＮＡ増幅キットによりＰＣＲ法で増
幅したＳＭＰ３０の一部をプローブとして肝ｃＤＮＡラ
イブラリーよりＳＭＰ３０をクローニングした。

【０００８】ＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅後、制
限酵素ＢａｍＨ１・Ｓａｃ１でクローニングベクターよ
りＳＭＰ３０の一部を切断し遺伝子組み換えにより発現
ベクターに導入し、該ベクターを用いて宿主を形質転換
させた。ＰＣＲ法は市販のＰＣＲ増幅キット（ＰＣＲ
Amplification Kit タカラ社製）を、遺伝子組み換えに
はベクターとして市販品、例えばｐＥＴ−２２ｂ（＋）
（Ｎｏｖａｇｅｎ社）等を、宿主として例えば大腸菌、
枯草菌、酵母等を用い、公知の方法により容易に行うこ
とができる。

【０００９】宿主が産生したポリペプチドは、塩処理、
超音波処理等により菌体を破砕後、公知の分離精製手
段、例えばゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー等の手段を用いて精製をすることができ
る。

【００１０】このような操作により得られるヒトＳＭＰ
３０遺伝子によりコードされるポリペプチドを免疫原と
して、抗ヒトＳＭＰ３０モノクローナル抗体を作製し
た。本発明における抗ヒトＳＭＰ３０モノクローナル抗
体は、ヒトＳＭＰ３０のいかなる部分を認識するモノク
ローナル抗体であってもよい。

【００１１】本発明のモノクローナル抗体は、例えば以
下に示す方法に従い製造することができる。このモノク
ローナル抗体を製造するにあったては、まず上記方法に
より製造されたヒトＳＭＰ３０遺伝子がコードするポリ
ペプチド又はその部分を抗原とし動物、例えばマウス、
ラット等に免疫する。このポリペプチドは単独又はアジ
ュバンドと共に動物に免疫することもできるが、必要に
応じて適当な担体、例えばＫＬＨ（キーホール・リンペ
ット・ヘモシアニン）、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）等
に結合させた後、投与することによっても行うことがで
きる。

【００１２】次いで、免疫された動物の抗体産生細胞、
例えば脾細胞と、ミエローマ細胞のような腫瘍細胞株と
をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のような融合剤
で融合してハイブリドーマを作製する。その後ハイブリ
ドーマをＨＡＴ培地のような選択培地を用いて選択し、
限界希釈法等の適当な方法でモノクローナル化して培養
する。その培養上清を適当な免疫測定法、例えば酵素免
疫測定法で分析し、目的とする抗ヒトＳＭＰ３０抗体を
産生しているか否かを調べ、抗ヒトＳＭＰ３０抗体を産
生しているクローンを選択する。これらの工程は、公知
の方法例えばケーラーとミルシュタイン、Ｎａｔｕｒｅ
２５６巻，４９５頁，（１９７５）、シェーラー、Ｎ
ａｔｕｒｅ ２８５巻，４４６頁，（１９８０）等に記
載された方法により行うことができる。

【００１３】本発明のモノクローナル抗体は、その培養
上清より常法に基づき、例えば塩析、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の分離、
精製手段により回収することができる。また、大量に取
得する場合には、前記ハイブリドーマを組織適合性動物
又は胸腺欠損ヌードマウス等の腹腔内に移植して増殖さ
せ、産生された腹水中に含まれる該モノクローナル抗体
を分離精製回収すればよい。

【００１４】さらに本発明のモノクローナル抗体は、ヒ
トＳＭＰ３０を検出するために、免疫測定法に広く利用
することができる。このモノクローナル抗体は、その製
造された抗体のまま、さらにペプシン等の蛋白質分解酵
素で分解されたフラグメントであるＦａｂ、Ｆａｂ’、
Ｆ（ａｂ’）₂ 等であってもよい。これらの抗体を用い
る免疫測定法はこの分野において周知であり、いずれの
免疫測定法に用いられるものであってもよい。即ち、こ
の免疫測定法として、例えばラジオイムノアッセイ法
（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、凝集免疫測定
法、免疫比濁測定法、ウエスタンブロット法等を挙げる
ことができ、これらのいずれの測定法を採用してもヒト
ＳＭＰ３０の測定を充分行うことできる。

【００１５】本発明で測定されるヒトＳＭＰ３０は、標
識を用いるサンドイッチ法、競合法等により測定を行う
ことができる。この方法は、マイクロタイタープレー
ト、ポリスチレンビーズ等の固相に本発明で得られたモ
ノクローナル抗体を０．００１〜０．１ｍｇ／ｍｌの濃
度で４℃一夜放置し固定化した後、生理食塩水溶液で洗
浄し、２％ＢＳＡでポストコートして固定化抗体を得る
ものである。

【００１６】この固定化抗体を用いた競合法による酵素
免疫測定法は、該固定化抗体とは異なる抗原決定基を認
識する抗体と酵素とを結合させた酵素標識抗体とヒトＳ
ＭＰ３０を含む検体とを反応させ、同時あるいは１０分
〜３時間後に該固定化抗体をさらに反応させることがで
きる。実施の際の反応温度は、４℃〜４０℃であり、好
ましくは２５℃〜３８℃である。反応終了後、固相を洗
浄し、固相に結合した酵素の量を酵素基質を加えその活
性を測定することにより検体中のヒトＳＭＰ３０を定量
することができる。本発明において用いることのできる
酵素は、例えばパーオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ
等である。この際、基質は酵素に対応したものを用いる
ことができ、例えばＡＢＴＳ、ルミノール−Ｈ₂ Ｏ
₂ （パーオキシダーゼ用）、３−（２’−スピロアダマ
ンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスフォリルオ
キシ）フェニル−１，２−ジオキセタン二ナトリウム塩
（ＡＭＰＰＤ）、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、メ
チルウンベリフェリルホスフェート（アルカリホスファ
ターゼ用）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトー
ス、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトース、
３−（２’−スピロアダマンタン）−４−（３−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタ
ン（ＡＭＧＰＤ）（β−Ｄ−ガラクトシダーゼ用）等を
挙げることができる。酵素反応させ、測定は４℃から４
０℃で加温しながらレート法あるいは１分〜１８時間反
応させ、生じた発色、蛍光あるいは発光の測定を行うこ
とができる。

【００１７】また放射免疫測定法の場合には、上記酵素
標識のかわりに ¹²⁵Ｉ等の放射性同位元素を標識し行う
ものである。本方法を実施の際の測定操作は、前記酵素
免疫測定法の場合と同じである。一般には１／４インチ
のポリスチレンビーズや直径約１ｃｍのポリスチレンチ
ューブ、あるいは０．２〜１０μｍのフェライト粒子に
前記モノクローナル抗体を結合させた固相を調製し、使
用することができる。例えばこの固相が、カルボキシル
化された固相の場合、０．１〜１ｍｇの抗体溶液（ｐＨ
３．５〜７）に水溶性カルボジイミドを加え１〜５時間
反応させることにより調製される。また抗体の放射標識
は既に市販されているボルトンハンター試薬により容易
に調製することができる。この標識には、例えば０．１
Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に溶かした抗体溶液にこのボ
ルトンハンター試薬を加え１〜２時間後にＧ−２５の脱
塩カラム等を用いて未反応のボルトンハンター試薬を除
去するのみで調製することができる。この他、クロラミ
ンＴ法やヨードジェン法等を採用することにより容易に
¹²⁵Ｉの放射標識を行うことができる。免疫反応を行う
にあたっては先に述べた抗体固定固相に検体を加え、４
℃〜４０℃であり、好ましくは２５℃〜３８℃で１〜１
８時間反応させるものである。この後、生理食塩水ある
いは蒸留水で洗浄を行い、放射標識抗体をこの固相に加
え、さらに４℃〜４０℃であり、好ましくは２５℃〜３
８℃で１〜１８時間反応させ、生理食塩水あるいは蒸留
水で洗浄を行い、その放射能活性を測定するものであ
る。測定にはシンチレーションカウンターを使用するも
のである。

【００１８】また、この他本発明の標識を用いる測定法
は、例えばイソルミノール、アクリジンエステル等をラ
ベルした化学発光測定法、フルオレセイン、ローダミン
等をラベルした蛍光免疫測定法であってもよい。この
際、標識には活性エステル法、イソチアネート法等を採
用することにより容易に行うことができる（「酵素免疫
測定法」医学書院、１９８７年参照）。

【００１９】この他競合法は、前記抗体結合固相と標識
したヒトＳＭＰ３０を用いて検体に含まれるヒトＳＭＰ
３０の測定を行うことができる。ヒトＳＭＰ３０の標識
は前記抗体の標識と同様に反応を行い製造することがで
きる。この測定は、当業者が周知の競合法により実施す
ることができる。

【００２０】さらに、抗ヒトＳＭＰ３０抗体は、凝集免
疫測定法に用いることができる。この測定に用いられる
試薬は、１種類又は２種類以上の前記モノクローナル抗
体を担体に結合させて製造することができる。この担体
としては、例えばニワトリ、羊、山羊、牛、馬等の動物
赤血球、ゼラチンを主成分とし水溶性多糖類とメタリン
酸塩を含み不溶化されたゼラチン粒子（特公昭６３−２
９２２３号）、このゼラチン粒子に磁性体を含むゼラチ
ン磁性粒子（特公平３−１７１０３号）等を挙げること
できる。抗体を血球や粒子に結合結合させるには、タン
ニン酸処理法やグルタールアルデヒド法により行うこと
ができる（「免疫学実験入門」学会出版センター、１９
８１年参照）。測定は、凝集免疫測定用の試薬とヒトＳ
ＭＰ３０を含む検体とを反応させ、生じた凝集像により
行うことができる。その反応は、室温で１〜５時間放置
することにより生じた凝集像をパターンアナライザーや
目視で判定することにより行うことできる。

【００２１】さらに、本発明のモノクローナル抗体は免
疫比濁法に用いることできる。この測定に用いられる試
薬は、前記凝集免疫測定法と同様にモノクローナル抗体
を担体に結合させて製造することができる。この担体と
しては、例えば粒径が０．０５〜５μｍ、好ましくは
０．１〜０．５μｍのポリスチレン等のラテックス粒子
を挙げることができる。この抗体結合粒子を製造するに
は、通常抗体を粒子に物理吸着させて製造することがで
きる。免疫比濁法による測定は、例えば波長を５５０ｎ
ｍにセットした分光光度計に抗体結合粒子とヒトＳＭＰ
３０を含む検体とを加え混和し直ちにその吸光度変化を
測定することにより行うことができる。

【００２２】またさらに本発明の抗ヒトＳＭＰ３０抗体
は、ウエスタンブロット法にも用いることができる。こ
の方法は、ヒトＳＭＰ３０を含む検体をゲル電気泳動で
分画した後、電気泳動パターンを維持したまま分画され
蛋白質をニトロセルロース膜のような担体上に転写し、
本発明の抗体を反応させて担体上のヒトＳＭＰ３０と結
合した抗体を検出することにより行うことができる。抗
体の検出には、担体と反応させる抗体に標識抗体を用い
る方法、さらに結合した抗体と反応する抗ヒトＳＭＰ３
０抗体に対する標識した抗体を反応させる方法等により
行うことができる。測定を行うに当たっては、標識物と
して前記した酵素、放射性同位元素、発光物質、蛍光物
質等を用い同じ操作により行うことができる。

【００２３】上記免疫測定法に供される検体としては、
ヒトの臓器、組織、血液、尿、髄液等を挙げることがで
きるがこれらに限定されるものではない。

【実施例】以下、本発明を参考例及び実施例により本発
明を更に詳細に説明する。もっとも、本発明は、下記実
施例に限定されるものでない。

【００２４】参考例１ ヒトＳＭＰ３０の精製 ヒト肝臓１００ｇを１０００ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ／１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭフェニルメチルスルフ
ォニルフルオライド、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭＮａＦ溶
液（ｐＨ＝８．０）でホモジェナイズし、６０分間遠心
（３５０００ｘｇ）した。この上清を５０〜７０％硫安
で塩析しタンパク質を沈殿させた。２０分間遠心（３５
０００ｘｇ）して沈殿したタンパク質を回収し、これを
前述の抽出液１００ｍｌで再溶解させ同液で３回透析し
た。この液をシュークロース濃度勾配等電点電気泳動
し、ｐＩ＝４．９（４．５−５．５）の分画を回収し透
析した。さらに濃縮し、セファデックスＧ−７５（トリ
ス−塩酸，１ｍＭ ＤＴＴ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐ
Ｈ＝８．０）でゲル濾過して分子量３０ｋＤａの分画を
回収し、目的のヒトＳＭＰ３０を１．０ｍｇ得た。な
お、このようにして精製された物質が、ヒトＳＭＰ３０
であることは抗ラットＳＭＰ３０ウサギ抗体の交叉性を
利用したウエスタンブッロト法で分子量３０ｋＤａのバ
ンドにより確認した。

【００２５】参考例２ ヒトＳＭＰ３０のｃＤＮＡのク
ローニング ヒトＳＭＰ３０のｃＤＮＡのクローニングを行い、プラ
スミドベクターに組み込み培養により大量にヒトＳＭＰ
３０を得た。これは次のように行った。

【００２６】肝組織中よりＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴ
セルロースカラム（ファルマシア社）によりｐｏｌｙ
（Ａ）⁺ ＲＮＡとした。このｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡよ
りＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ法
に用いたプライマーの配列は、5'-GGGAGGCCCCTTTTTTTTT
TTT-3'及び5'-AAGGAATTCCCCCCCCCCCCC-3' であった。こ
れを制限酵素 EcoRIで切断したｃＤＮＡライブラリーを
得る。更にＴ４リガーゼで処理し、EcoRI-NotIアダプタ
ー（Invitrogene 社）にリゲートした。過剰のアダプタ
ーをゲル濾過で除去し、λZapII ベクター（Strategen
社）にリゲートした。

【００２７】次にヒトＳＭＰ３０のｃＤＮＡフラグメン
トを得るため、既に単離したヒトＳＭＰ３０の一部のア
ミノ酸配列よりオリゴヌクレオチドプライマーを合成し
た。合成したプライマーの配列は、5'-AGGCTATGTTGCCAC
CATTGGAA-3' 及び5'-TTCCTCAGCCATGGTACCAGCAAA-3'であ
った。これらのプライマーを用い、先に作製したｃＤＮ
Ａライブラリーを用い鋳型にして、ＤＮＡ増幅キットに
よりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡは電気泳動で精
製し回収した。この回収ＤＮＡをプラスミドのＳｍａＩ
部位にインサートした。

【００２８】このようにして得られたプロダクトのＤＮ
Ａ配列を確認し、スクリーニングのプローブとして使用
するため³²Ｐで標識した。さきに作製したλZapII のバ
クテリオファージのプラーク（１ｘ１０⁵ ）をこのプロ
ーブでスクリーニングする。このプラークをHybond-Nで
固定しプレハイブリダイゼーション後この³²Ｐで標識し
たプローブでハイブリダイゼーションした。オートラジ
オグラフィーはＸ線フィルムに感光させて行った。これ
で陽性と確認された、プラスミドを E.coli XL1-BLUEで
増幅した。これによりヒトＳＭＰ３０をコードするＤＮ
Ａを含むプラスミドを得た。これを数種類の制限酵素で
切断し配列を分析した。このデータを基にコンピュター
解析し全核酸配列及びアミノ酸配列を決定した。アミノ
酸配列の結果を配列表の配列番号１に示す。

【００２９】実施例１ 抗ヒトＳＭＰ３０モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマの作製 参考例２の方法により製造された５０μｇの組換え体ヒ
トＳＭＰ３０をフロインド・コンプリートアジュバンド
を用いてエマルジョンにし、８〜１０週令ＢＡＬＢ／Ｃ
雄マウスの腹腔内に投与した。２週間の間隔をおいて、
フロインド・コンプリートアジュバンドとともに更に２
回投与を繰り返した。最終免疫は、生理食塩水で希釈し
た２０μｇの組換え体ヒトＳＭＰ３０を尾静脈より注射
し、３日後に脾臓を摘出した。単離した脾細胞とマウス
ミエローマ細胞Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１とを３：１
の細胞数で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５
００を用いて細胞融合を行った。細胞は、ＨＡＴ（ヒポ
キサチン，アミノプテリン，チミジン）及び、１０％牛
胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁
し、９６ウエルマイクロカルチャープレートに分注し、
培養した。１０日後、ハイブリドーマが増殖した培養上
清を以下の方法により調べ、特異的なモノクローナル抗
体を産生するクローンを含むウエルを選択した。すなわ
ち、ヒト組換え体ＳＭＰ３０抗原１μｇ／ｍｌをＰＢＳ
にて調製し、マイクロアッセイプレートに分注、室温１
時間放置し吸着させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含
むＰＢＳにより洗浄後、ハイブリドーマ培養上清を各ウ
エルに加え、室温で１時間反応させた。洗浄後、パーオ
キシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン（ＤＡＫＯ
社）を１０００倍に希釈し分注後、室温にて１時間反応
し、洗浄して基質（０．１％ＡＢＴＳ，０．０３１％過
酸化水素含有０．１％クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０））
を加えた。１％シュウ酸を添加して反応を停止させ、４
０５ｎｍの吸収を測定した。陽性ウエルの細胞を選択
し、限界希釈法によりクローニングを行った。単一コロ
ニーを含むウエルの培養上清の抗体活性を上記の方法で
調べ選択した。ヒトＳＭＰ３０に特異的な抗体を産生す
るハイブリドーマＳＭＰ３．１及びＳＭＰ１０．１を樹
立した。この２種類のハイブリドーマＳＭＰ３．１及び
ＳＭＰ１０．１は生命工学工業技術研究所に寄託され、
その寄託番号はそれぞれＦＥＲＭＰ−１４８４５及びＦ
ＥＲＭ Ｐ−１４８４６である。

【００３０】実施例２ 抗体のサブクラスの決定 これらの抗体のサブクラスをオクタロニー法により決定
した。すなわち、ハイブリドーマの培養上清をアガロー
スゲル平板上にあけた穴に加え、隣接した穴に配置した
マウスサブクラスに特異的な各種ウサギ抗血清（Ｃａｐ
ｐｌ社）と反応させて沈降線を調べたところいずれもＩ
ｇＧ １（κ）であった。

【００３１】実施例３ 抗ヒトＳＭＰ３０モノクローナ
ル抗体の調製 ハイブリドーマＳＭＰ３．１及びＳＭＰ１０．１細胞１
ｘ１０⁷ 個をプリスタン０．５ｍｌ投与後２週間たった
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔にそれぞれ接種した。１週間
後、抗体を高濃度に含む腹水を採取した。この腹水を２
５ｍＭモルフォリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液
（ｐＨ４．０）で４倍以上に希釈し、２０ｍＭ ＭＥＳ
（ｐＨ５．６）で平衡化したベーカーボンドＡＢｘカラ
ムに吸着させ、５００ｍＭ硫酸アンモニウムを含む２０
ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）によるグラジェント
で溶出し、それぞれ抗ＳＭＰ３０モノクローナル抗体
３．１及び１０．１を得た。

【００３２】実施例４ イムノブロティングによる特異
性の確認 ヒト肝ホモジネートを６０分間１０５，０００ｘｇで遠
心し、上清画分を６０℃１０分間熱処理した。さらに１
０，０００ｘｇの上清をＳＭＰ３０の試料とした。ヒト
肝ＳＭＰ３０試料を当量の試料希釈液（４０％グリセリ
ン，２％ＳＤＳ，２％２−メルカプトエタノール，２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液）と混合し、沸騰水中で加熱した
後、１５％ＳＤＳＰＡＧＥで泳動後、ニトロセルロース
膜に転写した。この転写膜３％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッ
キングし、抗ＳＭＰ３０モノクローナル抗体３．１及び
１０．１を室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ２０−
ＰＢＳで洗浄後、ＰＯＤ標識抗マウス免疫グロブリンを
室温で１時間反応させ、洗浄後ＰＯＤ不溶性基質（４−
クロロナフトール−過酸化水素系）を加えて発色させ
た。その結果、分子量３０ｋＤａ付近にバンドを生じ、
これは同時に行ったクマシーブリリアントブルーによる
蛋白質のバンドと一致し、このモノクローナル抗体がヒ
トＳＭＰ３０を特異的に認識することを確認した。

【００３３】実施例５ 至適抗体感作量の決定 ９６ウエルプレートへ抗体の感作量の決定は、以下の方
法で行った。すなわち、抗ＳＭＰ３０モノクローナル抗
体３．１を０．１Ｍリン酸緩衝液で２０μｇ／ｍｌから
２ⁿ 希釈し、９６ウエルプレートに５０μｌ／ウエルの
割合で加えた。４℃で一晩放置後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
で３回洗浄した。この後３％ＢＳＡを２００μｌ／ウエ
ル加え４℃で一晩放置しブロッキングを行い、ＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し測定に用いた。組換え体ヒトＳ
ＭＰ３０を緩衝液で５０ｎｇ／ｍｌの濃度になるように
希釈し、５０μｌ／ウエルの割合で加え、室温で２時間
反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄後、抗マウ
スイムノグロブリン−ＰＯＤ標識抗体（ＤＡＫＯ社）を
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ緩衝液で１０００倍に希釈し、５０
μｌ／ウエルの割合で加え室温で２時間反応さた。ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄後、基質溶液（ＡＢＴＳ）を
５０μｌ／ウエル加えて１５分後の吸光度（波長４０５
／４９２ｎｍ）を測定した。その結果を図１に示す。結
果は図１に示すように、抗体の固相への感作量は５μｇ
／ｍｌ以上の濃度であればヒトＳＭＰ３０を効率よく測
定することができる。

【００３４】実施例６ 酵素標識抗体の作成 抗ヒトＳＭＰ３０モノクローナル抗体１０．１はナカネ
法を用いて、西洋ワサビ由来パーオキシダーゼで標識し
た。標識した抗ヒトＳＭＰ３０モノクローナル抗体の濃
度は、３６０．９μｇ／ｍｌと決定した。該抗体１分子
当たりに導入された酵素分子は１分子であった。

【００３５】実施例７ ヒトＳＭＰ３０の測定 組み換え体ヒトＳＭＰ３０を１％ＢＳＡ−０．１％リン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して、それぞれ０．７
８、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、５０ｎ
ｇ／ｍｌの標準組換え体ヒトＳＭＰ３０溶液を調製し
た。これを試料として用い以下の方法で測定した。抗ヒ
トＳＭＰ３０モノクローナル抗体３．１を感作したプレ
ートに標準組換え体ヒトＳＭＰ３０ ５０μｌ／ウエル
を加え、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩
衝液で３回洗浄後、実施例６で作成し１％ＢＳＡ−０．
１ＭＰＢＳ緩衝液で希釈した酵素標識抗ヒトＳＭＰ３０
モノクローナル抗体１０．１を５０μｌ／ウエル加え、
２時間室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で
４回洗浄後、基質溶液（ＡＢＴＳ）を５０μｌ／ウエル
加え、１５分発色させた。シュウ酸を１００μｌ／ウエ
ルさらに加えて反応を停止させ、吸光度（波長４０５／
４９２ｎｍ）を測定した。このようにして得られた検量
線を図２に示す。この図からわかるように５０ｎｇ／ｍ
ｌまで直線性を示した。なお、組み換え体ヒトＳＭＰ３
０の最低検出濃度は０．７８ｎｇ／ｍｌであった。

【００３６】

【発明の効果】本発明は、ヒトＳＭＰと特異的に反応す
る抗ヒトＳＭＰモノクローナル抗体を提供する。この抗
体を用いる測定により、ヒト組織中又は体液中に存在す
るヒトＳＭＰを検出及び定量することができるようにな
った。従って、本発明の方法は、肝細胞障害や腎尿細管
の破壊のモニターに使用できる他、新生児の肝臓及び腎
臓の発達の程度を観察すること、対年齢の老化率の観察
を行い、健康状態をモニターすること等に寄与するもの
と考えられる。

【００３７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２９９ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列 Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu Cys Val Leu Pro Glu Asn Cys Arg Cys 1 5 10 15 Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Val Ser Asn Ser Leu Leu Phe Val 20 25 30 Asp Ile Pro Ala Lys lys Val Cys Arg Trp Asp Ser Phe Thr Lys Gln 35 40 45 Val Gln Arg Val Thr Met Asp Ala Pro Val Ser Ser Val Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Ser Gly Gly Tyr Val Ala Thr Ile Gly Thr Lys Phe Cys Ala Leu 65 70 75 80 Asn Trp Lys Glu Gln Ser Ala Val Val Leu Ala Thr Val Asp Asn Asp 85 90 95 Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn Asp Gly Lys Val Asp Pro Ala Gly Arg 100 105 110 Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala Glu Glu Thr Ala Pro Ala Val Leu Glu 115 120 125 Arg His Gln Gly Ala Leu Tyr Ser Leu Phe Pro Asp His His Val Lys 130 135 140 Lys Tyr Phe Asp Gln Val Asp Ile Ser Asn Gly Leu Asp Trp Ser Leu 145 150 155 160 Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr Ile Asp Ser Leu Ser Tyr Ser Val Asp 165 170 175 Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Gln Thr Gly Gln Ile Ser Asn Arg Arg Ser 180 185 190 Val Tyr Lys Leu Glu Lys Glu Glu Gln Ile Pro Asp Gly Met Cys Ile 195 200 205 Asp Ala Glu Gly Lys Leu Trp Val Ala Cys Tyr Asn Gly Gly Arg Val 210 215 220 Ile Arg Leu Asp Pro Val Thr Gly Lys Arg Leu Gln Thr Val Lys Leu 225 230 235 240 Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser Cys Cys Phe Gly Gly Lys Asn Tyr Ser 245 250 255 Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala Arg Asp Gly Met Asp Pro Glu Gly Leu 260 265 270 Leu Arg Gln Pro Glu Ala Gly Gly Ile Phe Lys Ile Thr Gly Leu Gly 275 280 285 Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Tyr Ala Gly 290 295

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のモノクローナル抗体を９６ウエルプレ
ートに結合させて、抗体の結合量を検討した時のヒトＳ
ＭＰ３０測定結果を示す図である。

【図２】本発明のモノクローナル抗体を用いて、ヒトＳ
ＭＰ３０標準液を測定した時の検量線の結果を示す図で
ある。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/02 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 岡田 政久 東京都新宿区西新宿２丁目７番１号 富士 レビオ株式会社内 (72)発明者 丸山 直記 東京都板橋区栄町18−５−501 (72)発明者 藤田 敬子 東京都練馬区東大泉７−４−７

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト老化マーカータンパク質（ヒトＳＭ
   Ｐ）を認識するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ヒトＳＭＰがヒトＳＭＰ３０である請求
   項１記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 ヒトＳＭＰ３０が配列表の配列番号１で
   示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求
   項２記載のモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 抗体がＦＥＲＭ Ｐ−１４８４５である
   ハイブリドーマから得られる請求項３記載のモノクロー
   ナル抗体。
5. 【請求項５】 抗体がＦＥＲＭ Ｐ−１４８４６である
   ハイブリドーマから得られる請求項３記載のモノクロー
   ナル抗体。
6. 【請求項６】 請求項１ないし５記載のいずれか１項に
   記載されたモノクローナル抗体を用いるヒトＳＭＰの測
   定方法。