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JPH08308597A - 新規に単離された乳頭腫ウイルスの分類方法 - Google Patents

新規に単離された乳頭腫ウイルスの分類方法

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JPH08308597A
JPH08308597A JP8109988A JP10998896A JPH08308597A JP H08308597 A JPH08308597 A JP H08308597A JP 8109988 A JP8109988 A JP 8109988A JP 10998896 A JP10998896 A JP 10998896A JP H08308597 A JPH08308597 A JP H08308597A
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hpv
gene
genome
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Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規に単離された乳頭腫ウイルスを分類す
る。 【解決手段】 新規に単離された乳頭腫ウイルスと既知
の乳頭腫ウイルスのゲノムのＬ２領域のハイブリダイゼ
ーションを行ない、またＬ２の発現生成物とそれに対す
る抗体との間の抗原抗体交差反応を行なう。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は乳頭腫ウイルスのDNA 、より特定
的にはこれらの乳頭腫ウイルスから誘導されたプロー
ブ、並びに乳頭腫ウイルスの感染をインビトロで診断す
るために該プローブを使用する方法に係る。
【０００２】「乳頭腫ウイルス」なる用語は、一般に比
較的良性の皮膚又は粘膜のいぼから、上皮内新形成及び
皮膚癌に変質し得る過形成までの各段階に存在する数種
類の形態のウイルス性感染の原因であると共通に認識さ
れている多数のウイルスを包含する。乳頭腫ウイルス感
染のうち、より特定的にはいぼ状表皮異形成が特筆さ
れ、これを以下の文中ではしばしばEVとして表す。
【０００３】所定数の型の乳頭腫ウイルスが文献中に既
に記載されている。本特許出願の範囲では、いぼ又は散
在斑性病変から単離され、多数の罹患患者で皮膚癌を早
発させ得る多数の型及び亜型の新規乳頭腫ウイルスにつ
いて記載する。
【０００４】最近の研究の結果、各種の型のヒト乳頭腫
ウイルス(HPV) について多数の免疫因子及び主要な機能
が明らかになっており、これらの因子は、乳頭腫ウイル
ス感染病原体における各種の遺伝的因子及び放射線の機
能として文献中に既に記載されているものに加えられ
る。
【０００５】本発明は、以下に規定するような本質的ゲ
ノム特徴を有する新規に単離された多数の乳頭腫ウイル
スの相対的挙動に関して為し得た研究に基づいている。
【０００６】少数のEVの例については既に研究されてお
り、ゲノムの分子クローニングにより既に6 種類の型の
HPV が特徴付けられている(KREMSDORF, D.他、1982, J.
Virol. 43 :436-447及びKREMSDORF 他、1983, J.Virol.
48 :340-351）。これらのHPV は、異なる群に属するゲ
ノム間に交差ハイブリダイゼーションが形成されないか
あるいは非常に弱い交差ハイブリダイゼーションが形成
されるかに従って3 群に分類されている。第１の群は、
所定数のEV罹患患者及び一般集団に観察される扁平いぼ
に関連するHPV3a 及び10から成り、HPV3a のDNA 配列に
属するDNA 配列はEV罹患患者の癌に見出だされた。第２
の群は、HPV5、8 及び12を含んでおり、HPV5 及び8 のゲ
ノムはEV罹患患者の癌に検出された。第３の群は、今日
までの処ではただ一種類のウイルスHPV9から構成されて
いる。免疫抑制した腎同種移植片を移植されており、HP
V5に感染していることが明白であった者を除き、第２及
び第３群のウイルスはEV罹患患者にしか検出されておら
ず、これらの患者の大部分は数種類のウイルスに感染し
ていた。ここで留意すべき点として、文献（追って示す
参考文献1-5,8,9,13,14,16,18-20）に実際に挙げられて
いる14種類の型のHPV のうち4 種類の型は、稀な症例で
あるEVに特異的に関連付けられることが分かった。
【０００７】本発明に至る研究により、多数の新規型及
び亜型の乳頭腫ウイルスを単離することができたので、
より高度なインビトロ診断法が予想できる。より特定的
には本発明は、例えば病変部又は生検切片から得られた
乳頭腫の改良された同定方法を提供するものであり、よ
り正確な診断を実現することができ、従って、該当病変
に予想される進行に関して改良された予後診断を下すこ
とができる。
【０００８】一般に、乳頭腫ウイルスは非常に多くの種
類があるが、7000〜8000のオーダの塩基対の寸法を有し
ていることが注目される。一方、該ウイルスのゲノムは
ある程度の相同性を有し得る。以下の記載では、種々の
型及び亜型の乳頭腫ウイルス間の相同百分率を数的に表
現するが、この相同百分率は所謂非厳酷もしくは非過酷
条件下、又は厳酷もしくは過酷条件下で実施されたハイ
ブリダイゼーション試験の結果として得られた値であ
る。
【０００９】乳頭腫ウイルスのうち、過酷もしくは厳酷
条件下で測定された相同百分率により特徴付けられる数
種類の型の乳頭腫ウイルスについて考察しよう。このよ
うな条件下で50％未満の相同百分率を有するす乳頭腫ウ
イルスは、異なる型に属するといえよう。このため、異
なる型のウイルス間の相同百分率は過酷もしくは厳酷条
件下ではゼロとさえなることが銘記されよう。この過酷
もしくは厳酷条件で50％を越える相同百分率が観察され
るようなウイルスは、同一型に属すると見なされ、この
同一型のうちで異なる亜型を形成すると見なされる。
【００１０】非過酷もしくは非厳酷条件のハイブリダイ
ゼーション試験では、HEILMAN C.A.他、1980, J. Viro
l., 36 ,395-407及びCROISSANT 他、1982, C.R.Acad. S
c. Paris, 294,581-586に記載されている条件下でウイ
ルスの2 つの単離体から得られたDNA(ヘテロ二重鎖分
子) を相互に接触させる。
【００１１】過酷もしくは厳酷条件のハイブリダイゼー
ション試験では、KREMSDORF,D.他((1982), J. Virol. 4
3 :436-447及び1983, J. Virol. 48:340-351) 及びDAVI
S R.W.他、1971, Methods Enzymol., 21, 413-428 によ
り記載されている条件下でウイルスの2 つの単離体しか
ら得られた DNA（ヘテロ二重鎖分子）を相互に接触させ
る。
【００１２】概して、同一型に属する乳頭腫ウイルスは
夫々の長さの全体の80〜100 ％にわたってほぼ等しいヌ
クレオチド配列を有するハイブリダイズ可能な配列を有
しており、これらの相同配列は異なる型の乳頭腫ウイル
スでは60％、即ち同一型の場合よりも少なくなることが
注目されよう。非過酷もしくは非厳酷条件下で相互にハ
イブリッド形成する異なる型の乳頭腫ウイルスの配列の
同一もしくは相同度は、同一型に属する乳頭腫ウイルス
の場合よりも明らかに小さい。
【００１３】発明者らが研究を進めた結果、各種の型の
乳頭腫ウイルス間の遺伝子異質度は従来予想されていた
よりも大きいこと、同時に各種の型は所定の特異度を有
する感染形又は感染変異体にしばしば関連していること
がわかった。
【００１４】従って本発明は、予め単離された各種の新
規乳頭腫ウイルスから単離され得るDNA 及びこれらのDN
A の全部又は一部から構成され得るプローブに係るのみ
ならず、種々の種類の感染、即ち所定の乳頭腫ウイルス
を発見された患者の危険の程度を診断するためにより効
果的に使用され得る型の乳頭腫ウイルスの混合物即ち、
「カクテル」にも係る。本明細書に記載されている乳頭
腫ウイルスプローブの個数、場合によっては予め既に単
離されている乳頭腫ウイルスのゲノムDNA から単離され
たプローブ及び所定の混合物に含まれるその配合物を加
えた数は、より高度な診断を可能にし、特に、各種の型
の乳頭腫ウイルスに起因するか又はこれらの型の影響下
で発生し得る各種の種類の感染をより十分に識別でき、
所定のある種の感染では、これらの感染が憂慮すべき病
気に変質する危険度をより十分に予後診断することが可
能である。例えば本発明の目的は、いぼ状表皮異形成に
より現わる感染の場合、これらの感染が皮膚癌に進行す
る危険度をより十分に予想することが可能な手段を提供
することにある。
【００１５】一般に、以下の説明を簡単にするために、
乳頭腫ウイルスの完ゲノムは略称HPV-DNA で表す。
【００１６】同様に解り易くするために、以下の説明は
既知の乳頭腫HPV-DNA を含むHPV-DNA の物理的制限地図
から成る添付図面を参考にしている。
【００１７】物理的地図は、各種の制限エンドヌクレア
ーゼによる切断部位の位置を示している。地図の原点は
一般に単一の切断部位から構成されている。原点までの
距離は、ゲノムの長さの百分率で表してある。地図の1
単位はゲノムの長さの 1％を表す。
【００１８】本発明はまず第一に、より特定的には7000
〜8000塩基対の間の寸法を有しており、図面に示したよ
うな制限地図により特徴付けられるDNA の集合から選択
されたHPV-DNA の各々に係り、これらの図面はより特定
的には、乳頭腫ウイルスから得られ、指称HPV-2d、HPV-
10b 、HPV-14a 、HPV-14b 、HPV-15、HPV-17a 、HPV-17
b 、HPV-19、HPV-20、HPV-21、HPV-22、HPV-23、HPV-2
4、HPV-28、HPV-29、HPV-31及びHPV-32、HPV-IP2 及びH
PV-IP4 に相当するHPV-DNA に関するものである。
【００１９】当然のことながら、本発明は上記に列挙し
たと同一型に属するとみなされ得るHPV-DNA に対する効
果にも及ぶ。
【００２０】新規に特徴付けられたウイルスのHPV-DNA
に対応する物理的地図は、黒円で示してある。
【００２１】本発明はまた、上記HPV-DNA のフラグメン
ト又は特に過酷条件下でこれらのHPV-DNA とハイブリダ
イズ可能なフラグメントにも係る。更に本発明は、上記
HPV-DNA の各々の全部又は一部を含む組換え体DNA 、よ
り特定的には夫々遺伝子E1、E6-E7、L1及びL2に対応す
るフラグメントあるいは上記HPV-DNA の遺伝子間領域に
対応する配列を含むDNA に係る。更に本発明は、これら
のHPV-DNA から又は対応するフラグメントから構成され
得るプローブ及び該プローブをインビトロで使用する診
断法に係る。
【００２２】ウイルスDNA 調製物は、EVに罹患した6 人
のヨーロッパ人患者とEVに罹患した2人の南米人患者の
良性病変の掻去物から選択的に抽出した（LUTZNER,M.A.
他、1983, LancetII:422-424）。HPV のDNA は、塩化セ
シウム勾配中で平衡遠心分離により、及び／又は従来記
載されている操作方法( 前出のKREMSDORF, D. 他の論文
及びORTH, G.他、1980, Cold Spring Harbor Conf. Cel
l Proliferation 7 :259-282) に従って臭化エチジウム
の存在下でショ糖勾配中で沈降させることにより精製し
た。DNA 調製物を制限エンドヌクレアーゼで処理し、消
化物をアガロースゲルで電気泳動により分離した（前出
のKREMSDORF 他の論文）。患者の1 人の尋常性いぼには
HPV5、8 及び12（前出のKREMSDORF 他の論文）及びHPV2
(HEILMAN, C.A.他、1980,J.Virol 36 :395-407及びORT
H,G．他、1980,Cold Spring Harbor Conf. Cell Pro- l
iferation 7: 259-282)が検出されたが、これ以外にDNA
制限酵素による主要切断モデルを提供する菌株とし
て、従来特徴付けられている型とは異なる11個の菌株が
同定された。同定の年代順（COGGIN, J.R.他、Cancer R
es. 39:545-546）に従って新規HPV 型に番号を付け、亜
型には番号と文字とを付した。11種の新規HPV のゲノム
を、大腸菌K12 株C600でクローニングした（前出ののKR
EMSDORF, D. 他の論文(1983)）。エンドヌクレアーゼBa
mHI により形成されたHPV24 のDNA の2 つのフラグメン
トを除き、DNA を単位長さの分子として挿入した。DNA
は、AvaI、BamHI 及びHindIII の単一切断部位を使用す
ることによりプラスミドpBR322(SUT- CLIFFE, J.G., 19
78, Nucleic Acids Res. 5:2721-2728) に挿入するか、
又はHPV5のDNA のフラグメントHindIIIBを組み込んでお
り、単一SacI部位を含む組換え体プラスミドに挿入し
た。より特定的には、HPV のDNA とHPV5のDNA のフラグ
メントHindIIIBを含む組換え体プラスミドpBR322とをた
だ一箇所でしか切断しない酵素(SacI)で切断後、単位長
さのDNA 分子としてHPV17b及び22を挿入した。HPV14aの
DNA は、ゲノムの長さの96.1及び 3.9％の2 つのフラグ
メントを形成する酵素であるHindIII でウイルスDNA 調
製物を不完全に消化後、単位長さのDNA 分子としてプラ
スミドpBR322に挿入した。（ゲノムの長さの夫々83.1及
び16.9％に対応する寸法を有する）HPV24 のフラグメン
トBamHIA及びB は、プラスミドpBR322に別々に挿入し
た。
【００２３】単離したクローン及び対応するHPV のソー
スを下記第Ｉ表に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】組換え体プラスミドを認識するために、プ
ラスミドにウイルス配列を挿入するために使用したエン
ドヌクレアーゼを含む2 種の制限エンドヌクレアーゼの
混合物で処理後、組換え体DNA と非クローン化HPV のDN
A との消化物について電気泳動による移動度を比較し
た。単離されたフラグメントの個数及び寸法を検討した
処、いずれの場合もこれらの完全なウイルスゲノムが組
み込まれていることがわかった。プラスミド配列からク
ローニングされないもしくは切り出されないHPVのDNA
をアガロースゲルで電気泳動により分析した処、DNA の
寸法は異なっていることが観察された（データは示さ
ず）。HPV14b、19、20及び21のDNA は、HPV3a 、5 、8
及び12の寸法（約7700ヌクレオチド対）（前出のKREMSD
ORF,D.の論文）に類似する寸法を有しており、HPV15 、
17a 、17b 、22及び23のDNA の寸法はHPV9の寸法（約72
00ヌクレオチド対）（前出のKREMSDORF,D.,1982 及びOR
TH, G., 1980の論文）とそれ程は類似していなかった。
【００２６】14種の制限エンドヌクレアーゼに対するク
ローン化ウイルスゲノムの反応性を分析し、物理的地図
（第１図〜第10図）を作成した。後述するモチーフに関
する所定の図面では、所定のHPV-DNA の制限地図を反復
した。従来記載されている方法(9) に従って22〜33の切
断部位を位置付けした。HPV14a及び14b(第4a図及び4b
図) 並びにHPV17a及び 17b（第５図）を除いて、これら
の地図の間に明白な相同性は検出されなかった。HPV14a
のDNA の2 つのBamHI 切断部位の一方がHPV14bのDNA の
単一BamHＩ切断部位と整合している場合、夫々HPV14a及
び14b,15に位置付けされた21〜31の部位は共通であるこ
とが判明した。同様に、単一BamHＩ切断部位が相互に整
合している場合、HPV17aのDNA に配置された29の切断部
位のうち21の部位はHPV17bのDNA にも（26部位と共に）
見出だされた。
【００２７】これらの地図と、EVに関連するHPV(HPV3a,
5,8,9,10及び12)(8,9,16,18,20) 、皮膚いぼに関連する
HPV(HPV1,2,4及び7)、及び粘膜皮膚又は粘膜の病変に関
するHPV(HPV6b,11a,13及び16)(1,33,19)に関して従来作
成されている地図との間に、何ら明白な類似は見出ださ
れなかった。但しHPV14aの地図は、EVに罹患した1 人の
日本人患者から単離されたHPV の地図に非常によく似て
いる(24)。この患者から単離した単離体はBamHI 部位及
び付加的HindII部位がHPV14aと異なっており、部位Ava
Ｉ、BamHＩ、Bgl Ｉ、EcoRＩ、HindII及びHindIII の位
置は2 種のウイルス間で類似している。交差ハイブリダ
イゼーション実験により、これらの2 種のウイルスが非
常によく似ていることを確認した。
【００２８】所定の部位（矢印で示した部位）は位置付
けされていないことが認められる。位置付けによるゲノ
ムの長さの差が2 ％未満の切断部位は保存されていると
見なされる(*) 。ニックを形成しない酵素はHPV14a及び
23のDNA ではPvu Ｉ、Sal Ｉ及びSma Ｉ、HPV14bのDNA
ではPvu Ｉ、Sac Ｉ、Sal Ｉ及びSma Ｉ、HPV15 、17a
及び17b のDNA ではBgl Ｉ、PvulＩ、Sal Ｉ及びSma
Ｉ、HPV19 のDNA ではBgl Ｉ、Sac Ｉ、Sal Ｉ及びSma
Ｉ、HPV20 のDNA ではEcoRＩ、Pvu Ｉ、Sac Ｉ及びSma
Ｉ、HPV21 のDNA ではSacI及びSma Ｉ、HPV22 のDNA で
はBamHＩ、Bgl Ｉ、PvuI、Pvu II及びSal Ｉ、HPV24 の
DNA ではBgl Ｉ、EcoRＩ、PvuI、Sac Ｉ、Sal Ｉ及びSm
a Ｉであった。
【００２９】新規に特徴付けられたHPV のDNA のDNA 間
相互の配列の相同性の存在、更にこれらのDNA と、EVに
関連するHPV(HPV3a,5,8,9,10及び12) 、皮膚いぼに関連
するHPV(HPV1,2,4及び7)及び粘膜病変に関連するHPV(HP
V6b,11a,13及び16) のDNA との間の配列の相同性の存在
について検討した。濾紙固定によるハイブリダイゼーシ
ョン及び飽和液相DNA-DNA ハイブリダイゼーション後、
ヌクレアーゼS1により消化させる実験を、上記過酷もし
くは厳酷条件下で実施した(8,9) 。特に、HPVのDNA を
ニックトランスレーションにより標識し、従来記載され
ているように(13)、アルカリショ糖勾配(5〜20％) 中で
沈降により断片化した。標識したHPV のDNA(4000cpm)
を、従来記載されているように(8,9) ウシ胸腺DNA(20μ
g)又は非標識HPV のDNA(0.20μg)の存在下でNaCl 0.48M
- EDTA 1mM(pH6.8) 中で68℃でインキュベートした。HP
V のDNA のプローブの特異活性は 5.3×107 〜2 ×108
cpm/μg であった。ヌクレアーゼS1耐性フラクションを
測定することにより、ハイブリダイゼーション率を決定
した。数値は、プローブの自発的自然再生を表す修正値
(4〜15％) 及び相同ハイブリダイゼーションを表す100
％に標準化した値 (75〜95％) を表している。略記NDは
測定せずという意味である。上記条件下におけるHPV-DN
A 間の交差ハイブリダイゼーションの相対的な大きさ
は、標識したHPV-DNA と非標識HPV DNA との間のハイブ
リダイゼーション（％）で表す。
【００３０】
【表２】
【００３１】HPV1,2,4,6b,7 及び11a のゲノムと新規に
クローニングされ32P で標識したEVのHPV のDNA との
間、又は非標識EVのHPV のDNA とHPV13,16及び18の特異
的プローブとの間には交差ハイブリダイゼーションが不
在又はほぼ不在であることが認められる。同様に、HPV1
4a,14b,15,17a,17b,19,20,21, 22,23 及び24のDNA とHP
V1a 及び11a のDNA との間には、飽和再結合による交差
ハイブリダイゼーションは全く又はほぼ認められなかっ
た（第II表）。新規にクローニングされたHPV のDNA は
交差ハイブリダイゼーションを全く又はほぼ示さず、あ
るいは相互間及びEVに関連する他のHPV(HPV3a,5,8,9,10
及び12) のゲノムとの間に50％未満の交差ハイブリダイ
ゼーションを示した。但しHPV14a及び14b とHPV17a及び
17b は強い交差ハイブリダイゼーションを示した。以上
の結果から、新規ウイルスは9 種類の新規型（HPV14,1
5,17,19,20,21,22,23及び24）と、型14（HPV14a及びb
）及び17（HPV17a及びb ）の2 種類の亜型に分類され
ることが確認される。
【００３２】同様に、過酷な分子ハイブリダイゼーショ
ン条件下における配列の相同性（又は相同性の不在）に
基づいて各HPV を群に分類した。これらの群は A〜H の
文字で示し、下記第III 表にリストした。この表は、こ
れらの HPV（単離体又は単離体の組み合わせ）の保菌者
で診断された疾患、及び該保菌者に認識された腫瘍遺伝
子の潜在力を示している。
【００３３】
【表３】
【００３４】
【表４】
【００３５】HPV5,8,12,14,19,20,21,22及び23のDNA は
相互間の交差ハイブリダイゼーション率（群の相同性）
が 5〜38％であり、HPV5,8及び12のDNA との間のみに顕
著な交差ハイブリダイゼーション(4〜13％) を示す。従
って、これらのウイルスは従来規定されているEVのHPV
の群(9) の一部をなす。
【００３６】同様に、相互間の交差ハイブリダイゼーシ
ョンが約20％でありHPV9のDNA との間の交差ハイブリダ
イゼーションが約6 ％であるHPV9,15 及び17のDNA は、
同様に既に記載されているEVのHPV の群(9) に属する。
型13及び31のHPV は、同一の群に属すると考えられる。
最後に、他のHPV のゲノムとの間に相同性をほとんど示
さない型1,2,4,24及び32のHPV は、相互に異なる他の群
及び上記群の第１員を形成すると見なされる。
【００３７】本発明は更に、より特定的には上記HPV-DN
A に由来するDNA フラグメント、及びより特定的には夫
々遺伝子E6-E7,E1,L1,L2及びそれらの遺伝子間領域に対
応するDNA フラグメントに係る。原点とみなされる部位
（第１図〜第９図）に対するこれらの各種のフラグメン
トの位置及び相対長さを、下記の第IV表に示した。
【００３８】
【表５】
【００３９】HPV1のゲノムにおける遺伝子の位置付けは
このゲノムのヌクレオチド配列から導いた（O.Danos,
M.Kaninka及びM. Yanivの特許）。過酷（Tm−29℃）又
は非過酷（Tm−40℃）条件で形成されたヘテロ二重鎖分
子の電子顕微鏡分析後、HPV3,5,8,9,10a,12,14,15,17及
び24のゲノムの物理的地図を、HPV1の物理的地図及び遺
伝子地図に対して整合させ、HPV31のゲノムの物理的地図
を、HPV6b の物理的地図及び遺伝子地図に対して整合さ
せた（E.Schwarz 他、EMBO.J., 1983,2,2341-2348 ）。
【００４０】第IV表に示した座標の値は、第１図〜第９
図の物理的地図における遺伝子E6及びE7,E1,L2及びL1の
相同ゲノムのセグメントの5'及び3'末端、及びHPV1a の
ゲノムに対する遺伝子間領域、又はHPV31 の場合にはHP
V6b のゲノムに対する遺伝子間領域の位置を示してい
る。
【００４１】非過酷ハイブリダイゼーション条件下で異
なる群に属する型のHPV のゲノム間、又は過酷ハイブリ
ダイゼーション条件下で同一群に属する型のHPV の大部
分のゲノム間に形成されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微
鏡分析にした場合、（調節成分を含む）遺伝子間領域及
び隣接遺伝子E6及びE7（腫瘍中に発現される主要トラン
スフォーメーション遺伝子に対応すると思われる）は、
検出可能な配列相同性を示さない。非過酷ハイブリダイ
ゼーション条件下で異なる群に属する型のHPVのゲノム
間、又は過酷ハイブリダイゼーション条件下で同一群に
属するHPV のゲノム間に形成されたヘテロ二重鎖を分析
した場合、遺伝子E1（主にウイルスDNAの複製に関与す
る）及び遺伝子L1（ビリオンの主要抗原決定基を有する
ウイルスキャプシドの主要タンパクをコードする）は、
検出可能な配列の相同性を示す。
【００４２】領域E1及びL1を含む組換え体プラスミドか
ら作製されたプローブは、場合によっては過酷又は非過
酷条件下で実施される分子ハイブリダイゼーションの実
験により最大数のHPV 型を検出することが理論的に可能
である。遺伝子間領域及び遺伝子E6及びE7を含む組換え
体プラスミドから作製されたプローブは、所定のHPV型
又は同種のHPV 型を特異的に検出することが可能であ
る。
【００４３】領域L2（ウイルスキャプシドの微量構成成
分をコードする）は、異なる型のHPV 間で可変のヌクレ
オチド配列保存率を有する。
【００４４】以下、ウイルスHPV-IP2 及びHPV-IP4 を単
離した条件、次いでこれらのウイルスからHPV-DNA を得
た条件についてより明確に説明する。
【００４５】生殖器新形成及び癌に関連する新規型のHP
V(HPV IP2)の分子クローニング及び特徴付け 非過酷条件下でHPV16 型の特異的放射性プローブを使用
するハイブリダイゼーションにより、子宮頸部の癌から
抽出したDNA には新規型のHPV が露呈された。過酷ハイ
ブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーションを実
施した場合には交差ハイブリダイゼーションは検出でき
なかった。数種類の制限酵素に対するこのHPV のDNA の
反応性を調べた処、酵素Bgl IIはウイルスDNA を一箇所
で切断していることがわかった。腫瘍から抽出したDNA
をエンドヌクレチーゼBgl IIで消化後、8kb(乳頭腫ウイ
ルスのゲノムの寸法) のDNA 分子を含んでいるフラクシ
ョンを、ショ糖勾配中で遠心分離により精製した。8kb
の分子をBgl II部位でプラスミドPL15.5から成るベクタ
ー(BglII及びBamHI による単一切断部位を含む) に挿入
し、該ベクターはBamHI 部位でλバクテリオファージL4
7,1 のDNA に挿入した。組換え体DNA のキャプシド形成
及び宿主細菌 (大腸菌、菌株LA101)への感染後、非過酷
条件下で放射性HPV16 のDNA で感染細菌培養物のレプリ
カハイブリダイゼーションを実施した処、組換え体ファ
ージに対応する溶菌プラークが検出された。ウイルス配
列全体を含んでいる数個の組換え体バクテリオファージ
が単離され、挿入酵素Bgl IIによるファージDNA の切断
は非過酷条件でHPV16 プローブとハイブリダイズする8k
b のフラグメントを形成し、酵素Bgl II及びPst Ｉの混
合物による組換え体ファージのDNA と元の腫瘍のDNA と
の切断は、乳頭腫ウイルスのゲノムの寸法に等しい総分
子量を有する同一の5 つのフラグメントを形成する。新
規HPV のDNA を組換え体バクテリオファージのDNA から
切出し、電気溶離により精製し、プラスミドPL15.5内で
再クローニングした。18個の制限エンドヌクレアーゼに
対するこのDNA の反応性に基づいて、ウイルスDNA の制
限地図を作成し、21個の切断部位を位置付けすることが
できた（第９図）。こうして作成した地図は今日までに
同定されているHPV のゲノムの地図とは異なっている。
新規HPV のDNA と従来同定されているHPV のDNA との間
の配列の相同性を、過酷条件で実施したレプリカ分子ハ
イブリダイゼーション実験により分析した。検出された
相同性は常に5 ％未満であり、最大の相同性はHPV16 の
ゲノムで検出された。子宮頸部の癌から特徴付けられた
新規ウイルスは、従って新規型のHPV を構成しており、
これをHPVIP2と仮称する。
【００４６】種々の条件下でHPVIP2のDNA とHPV1のDNA
との間に形成されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡で分
析した処、これらの2 種のゲノムの物理的地図を整合さ
せることができ、HPVIP2のDNA がもっている異なる遺伝
子の理論的位置を決定することができた。
【００４７】 精製されたHPVIP2のDNA から作製した放射性プローブを
使用することにより、これらのウイルスの病原性を決定
することができた。HPVIP2のDNA が認識されたのは、14
件の調査対象のうち外部生殖器官の退形成丘疹の1 例、
51件の調査対象のうち2 件の子宮頸部の侵入性癌、及び
28件の調査対象のうちの子宮頸部の上皮内新形成の1 例
であった。従って、HPVIP2は頻度がHPV18 よりもやや低
く且つHPV16 よりも著しく低い腫瘍形成潜在力を有する
生殖器向性HPV 型である。生殖器新形成、特に子宮頸部
癌の発生の危険を孕むHPV 型を診断又は早期発見するた
めには、分子プローブの作製に使用されるHPV のDNA の
あらゆる混合物にHPVIP2を混入させる必要がある。
【００４８】皮膚の前癌性病変に関連する新規HPV 型(H
PVIP4)の分子クローニング及び特徴付け 過酷条件下でHPV5,8及び14型の特異的放射性プローブを
用いて混合物で分子ハイブリダイゼーションを実施する
と、皮膚前癌性病変である紫外線角化症の生検から抽出
したDNA に新規型のHPV が露呈された。1,2,3,7,10,13,
16,18,28,IP1（前出の HPV31），IP2 及びIP3(前出のHP
V32)型の特異的プローブでハイブリダイゼーションを実
施した場合、交差ハイブリダイゼーションは何も見出だ
されなかった。
【００４９】数種類の制限酵素に対するこのHPV のDNA
の反応性を調べた処、酵素EcoRI はウイルスDNA を一箇
所切断することがわかった。生検から抽出されたDNA を
エンドヌクレアーゼEcoRI により消化後、8kb(乳頭腫ウ
イルスのゲノムの寸法) のDNA 分子を含むフラクション
を、ショ糖勾配中で遠心分離により精製した。8kb の分
子をEcoRＩ部位でバクテリオファージλgt wes. λB の
DNA に挿入した。組換え体DNA のキャプシド形成及び宿
主細菌（大腸菌、菌株LA101 ）への感染後、非過酷条件
下でHPV8及び14のDNA の放射性混合物で感染細菌培養物
のレプリカハイブリダイゼーションを実施した処、組換
え体ファージに対応する溶菌プラークが検出された。ウ
イルス配列全体を含む数種類の組換え体バクテリオファ
ージが単離され、挿入酵素EcoRI によるファージDNA の
切断は、非過酷条件でHPV5,8及び14の特異的プローブと
ハイブリダイズする8kb のフラグメントを形成し、酵素
EcoRＩ及びPst Ｉの混合物による組換え体ファージのDN
A と元の病変部のDNA との切断は、乳頭腫ウイルスのゲ
ノムの寸法に等しい総分子量を有する同一の6 個のフラ
グメントを形成する。新規HPV のDNA を組換え体バクテ
リオファージのDNAから切り出し、電気溶出により精製
し、プラスミドpSP65 内で再クローニングした。15個の
制限エンドヌクレアーゼに対するこのDNA の反応性に基
づいて、ウイルスDNA の制限地図を作成し、こうして23
の切断部位を位置付けすることができた（第10図）。こ
うして作成した地図は今日までに同定されているHPV の
ゲノムの地図とは異なっている。過酷条件下で実施され
たレプリカ分子ハイブリダイゼーション実験により、新
規HPV のDNA と今日まで同定されているHPV のDNA との
間の配列の相同性を分析した。新規HPV のDNA といぼ状
表皮異形成病変中に従来同定されている所定の型の HPV
（HPV5,8,12,14,19,20,21 及び25）のDNA との間には50
％未満の相同性が検出されたが、その他の型のHPV との
間には相同性は何も検出されなかった。従って、紫外線
角化症から特徴付けられる新規ウイルスは、HPV-IP4 と
仮称される新規型のHPV を構成する。
【００５０】精製したHPVIP4のDNA から作製された放射
性プローブを使用した処、調査したいぼ状表皮異形成に
罹患した17人の患者の42％、及び分析した紫外線角化症
生検のx/y にHPVIP4を露呈させることができた。HPVIP4
は、皮膚癌の頻発により特徴付けられる疾患であるいぼ
状表皮異形成に罹患した患者に頻度が高く、皮膚の有し
細胞癌の前駆体とみなされる紫外線角化症の病変のフラ
クションに関連付けられるので、腫瘍形成潜在力を有す
る皮膚向性HPV 型であると判断できる。皮膚の前癌又は
癌の病変の発生の危険を孕むHPV 型を診断又は早期発見
するためには、分子プローブの作製に使用されるHPV の
DNA の全混合物にHPVIP4型を混入することが必要であ
る。
【００５１】本発明はより特定的には、乳頭腫ウイルス
の感染の各種の形態の総合的診断を実施するため、特に
感染の可能な進行を予後診断するために組み合わせて使
用し得る各種のHPV-DNA の混合物即ち、カクテル（又は
これらのHPV-DNA 又はこれらのDNA 配列を含むプロー
ブ）にも係る。本発明の好適な混合物を下記第Ｖ表に示
した。
【００５２】
【表６】
【００５３】この表は、より特定的には表の左側に示し
た混合物を使用することにより診断され得る疾患の性質
も示している。第１図〜第９図の制限地図の区分は第Ｖ
表の「構成」の欄に示した区分と一致していることが銘
記されよう。また、このために所定のプローブは各添付
図面で数回繰り返している。
【００５４】これらの混合物の各々は、本発明の新規プ
ローブの少なくとも1 つを含むものと規定できる。換言
するなら、本発明の診断用組成物は、 1) 少なくともHPV2d のDNA 、 2) HPV10b,28 及び29のDNA の少なくとも1 種、 3) HPV17,24のDNA の少なくとも1 種、 4) HPV14,15,17,19,20,21,22 及び23のDNA の少なくと
も1 種、 5) HPV15 及び17のDNA の少なくとも1 種、 6) HPV24 のDNA 、 7) HPV14,32のDNA 、 8) HPV31 のDNA 、 9) HPV32 のDNA を含むものと規定できる。尚、上記9 群のDNA は相互に
異なる全状況で選択される。
【００５５】種々のいぼ形態又は他の皮膚もしくは粘膜
病変部から単離され得るHPV は非常に多種に及ぶことを
考慮すると、他のHPV-DNA も同一型の疾患の発生に関与
し得ると認められるので、表に示した各型の疾患を診断
するためには、1 種又は2 種より多くのHPV-DNA を含む
混合物を使用することが好ましい。感染の性質及び可能
な進行の診断は、使用されるプローブの数が多いほど有
効である。更に、プローブの各混合物を使用してハイブ
リダイゼーション試験を実施すると、患者が罹患してい
る病気の性質をより高い確率で鑑別する鑑別診断が可能
になる。
【００５６】第Ｖ表では、発明者の実験室で単離したHP
V-DNA から形成したプローブしか示していない。上記に
述べた理由により、他の実験室で得られたHPV に由来す
るDNA も同一型に感染した患者に繰り返して認められる
ので、各混合物にこれらのDNA を追加できることは言う
までもない。例えば混合物7 には、上皮内新形成及び皮
膚癌に変質する危険を孕むいぼ状表皮異形成に認識され
る他の全HPV-DNA を追加することができる。第Ｖ表中、
所定の混合物は診断すべき同一疾患の特徴を有するもの
として示されていることが認められよう。一方、各混合
物は癌化の危険の低い感染と癌化の危険の高い感染とを
識別する。例えば、混合物7 で診断した患者からのウイ
ルス調製物のハイブリダイゼーションは、混合物3 でハ
イブリダイゼーションを形成する場合よりも皮膚癌化の
危険が大きいことが立証されよう。
【００５７】同様に、混合物5 により検出されるEVは混
合物6 により検出されるEVより癌化の危険が大きいこと
がわかる。混合物4 は、混合物5 により検出されるより
も危険度の高いEVを検出する。
【００５８】以下、乳頭腫ウイルスの各感染形態の総合
診断を実施するために、場合によっては感染の可能な進
行を予後診断するために組み合わせて使用され得る種々
のHPV-DNA から成る他の混合物即ち、カクテル（又はこ
れらのHPV-DNA を又は該DNAの配列を含むプローブ）に
ついて更に説明する。
【００５９】本発明の好適な混合物は、上記第Ｖ表に示
した。
【００６０】この表は、より特定的には表の左側に示し
た混合物を使用することにより診断され得る疾患の性質
も示している。もう一度ことわっておくが、この表に示
される他のHPV-DNA の制限地図は第１図〜第９図に含ま
れている。
【００６１】HPV-IP2 は生殖器新形成、特に子宮頸部癌
の発生の危険を検出するために使用可能なプローブを特
定的に表すとみなされ得ることに留意されたい。
【００６２】従って、本発明はより特定的には表中「混
合物の指称」の欄に 1〜10の番号を付けた少なくとも10
群を含む診断用箱又は「キット」にも係る。
【００６３】以上の説明ではクローニングした完全なHP
V-DNA をプローブとして使用する場合について特に考察
した。もっとも、該DNA の代わりにこれらの各DNA のク
ローン化フラグメント、特に遺伝子E1又はL1及び遺伝子
E6-E7 を使用してもよい。
【００６４】HPV-DNA をインビトロで検出する基本原理
は、当然過酷又は非過酷条件で操作されるハイブリダイ
ゼーションを使用するものである。例えば以下に述べる
ように操作すればよいが、記載されている診断試験は当
然本発明のプローブ又はプローブ混合物の使用条件を限
定するものと見なすことはできない。
【００６５】クローン化HPV のDNA の混合物から作製し
たプローブを使用する試験の目的は、生検中、病変部の
掻去により得られた細胞中、又はCarnoy混合物（エタノ
ール、クロロホルム、酢酸 6:3:1）により形成され且つ
パラフィンに含有される生検の切片中でHPV を露呈させ
且つHPV 型を同定することである。試験は、既知の原則
の方法に従って採取物のDNA を予め抽出する必要があ
り、HPV のDNA の混合物から作製した（32P 又は35S で
標識した）放射性プローブを使用して、過酷又は非過酷
条件下で実施した分子ハイブリダイゼーション実験によ
りこのDNA の分析を行う。各試験では、一般にプローブ
の数種類の混合物を使用する必要がある。
【００６６】数種類のハイブリダイゼーション法を使用
することができる。例えばブロットハイブリダイゼーシ
ョン法を使用することができる。この方法は、DNA の変
性後、膜（ニトロセルロース又はGenescreenplus）にア
リコート量のDNA を堆積させ、通常条件で各膜をプロー
ブの混合物でハイブリダイゼーションし、膜をX 線写真
フィルムと接触させることにより放射性ハイブリッドを
検出することから成る。レプリカハイブリダイゼーショ
ン法を使用してもよい。この方法は、制限酵素によるDN
A の処理後に形成されたDNA のフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動で分離し、アルカリ変性後、膜（ニトロ
セルロース、Genescreenplus）にフラグメントを移し、
これらのフラグメントを通常条件でプローブの各混合物
でハイブリダイゼーションすることから成る。放射性ハ
イブリッドの形成は、膜をX 線写真フィルムと接触後に
検出される。
【００６７】放射性プローブは、「ニックトランスレー
ション」法により標識したHPV のDNA から構成される
か、例えばSP6 型のベクターに挿入されたウイルスDNA
の転写により作成されたRNA から構成される。放射性プ
ローブを使用すると感度が大きいという利点があるが、
相互に標識された抗体又はそれ自体酵素、蛍光等のマー
カーを有する抗体により認識された抗体により認識され
得る例えばビオチニル化した非放射性プローブを使用す
る場合はこのような利点は得られない。
【００６８】プローブの選択は、採取物の性質に依存す
る。例えばEVに罹患している疑いのある患者の場合、混
合物1,2,3,4,5,6 及び7 が使用される。混合物1 及び2
は、EVと皮膚いぼとの間の鑑別診断が可能である。病気
に関連する3 群のHPV の各々の最も高頻度で検出された
群を含むプローブ3 、及びEVの癌に関連する型のHPVのD
NA を含むプローブ7 は、EVの殆どの症例を診断するこ
とができ、特に、癌の発生の危険のあるHPV 型に感染し
た患者を認識することができる。混合物4,5 及び6 を使
用すると、同一患者に感染するHPV 型を確定することが
できる。
【００６９】従って、更に本発明は上記に示したような
複数のプローブ、即ち −上記19種の型及び亜型のHPV-DNA の各々の典型、又は −プローブ混合物、好ましくは先に規定した各種の群又
はプローブ混合物を含む容器もしくは「キット」に係
り、これらの「キット」は、患者から得られたウイルス
調製物と各種の群又は混合物との間のハイブリダイゼー
ションにより「インビトロ」診断調査に使用される。
【００７０】当然のことながら既に示したように、本発
明は特定的に述べた適用例及び実施例に限定されず、あ
らゆる変形例を包含し、特に図面に示した制限地図のHP
V-DNA が対応するように請求の範囲の項で所定の数字と
共にDNA-HPV に付した参照符号は、これらの請求の範囲
が上述の規定に従って同一型に分類され得るこの特定の
HPV-DNA と共通の全HPV-DNA 、更に同一亜型に属するHP
V-DNA に及ぶことを意味するものと見なされる。
【００７１】より特定的には、図面に示したHPV-32から
誘導したDNA は、AvaI,BalI,BamHI,ClaI,EcoRI,HindII
I,NdeI,NruI,PvuI,PvuII,SacI,SalI,SmaI,TthIII,XmaI
により切断されていないことも注目される。
【００７２】以下に示す組換え体DNA は、1984年11月30
日付けでC.N.C.M.(Collection Nationale des Cultures
de Micro-Orga- nismes de l'INSTITUT PASTEUR de Pa
ris)に下記の番号で寄託されている。
【００７３】 pBR322/HPV2d……………… No.I-379 pBR322/HPV10bA…………… No.I-380 pBR322/HPV10bB…………… No.I-381 pBR322/HPV14a …………… No.I-382 pBR322/HPV14b …………… No.I-383 pBR322/HPV15……………… No.I-384 pBR322/HPV17a …………… No.I-385 pHPV5HindIIIB/HPV17b…… No.I-386 pBR322/HPV19……………… No.I-387 pBR322/HPV20……………… No.I-388 pBR322/HPV21……………… No.I-389 pHV5 HindIIIB/HPV22 …… No.I-390 pBR322/HPV23……………… No.I-391 pBR322/HPV24a …………… No.I-392 pBR322/HPV24b …………… No.I-393 pBR322/HPV28……………… No.I-394 pBR322/HPV29……………… No.I-395 pBR322/HPV31……………… No.I-396 pSP64/HPV32 ……………… No.I-397 pLI55/IP2 ………………… No.I-450 pSP65/IP4 ………………… No.I-449 。
【００７４】本発明はより特定的には、上記に言及した
異なる乳頭腫ウイルスの遺伝子E6、E7及び特にL2の発現
生成物に係る。
【００７５】これらの発現生成物は、所定の生物採取物
中の乳頭腫ウイルス又は該ウイルスの発現生成物を検出
するため、及び乳頭腫ウイルスが属する型又は亜型に従
って乳頭腫ウイルスを同定するためにそれ自体使用され
得る。これらの発現生成物が得られる条件については、
特に乳頭腫ウイルスHPV の配列L2の発現に関して以下の
記載中に説明するが、同様の方法を利用して他の型の乳
頭腫ウイルスに由来する遺伝子配列L2（又はE6,E7 又は
L1）の発現を誘導してもよい。以下の説明は例外を除
き、配列又は遺伝子L2についてより特定的に述べている
が、場合によっては遺伝子L2の発現生成物に関する教示
を他の該当遺伝子の発現生成物に置き換えてもよい。配
列L2の発現生成物は、異なる型の乳頭腫ウイルスではな
く対応する乳頭腫ウイルスにより侵された生物採取物中
で遺伝子L2の発現生成物を認識し得る抗体をインビボで
産生させるために使用できるという点で特に有利であ
り、より特定的には、該当する類の調製物が予め固定さ
れている場合に特に有利である。以下に述べる本発明の
新規実施例は、重度を推定し且つ採用すべき治療を選択
するために、調査された病変物中に存在している乳頭腫
ウイルスの型を決定することの可能な別個の手段を提供
するものである。遺伝子L2の各種の型の発現生成物に対
して産生される抗体は、ハイブリダイゼーションプロー
ブに関して先に記載した混合物に対応する混合物に分類
され得る。
【００７６】従って本発明は、複数の異なる抗体を含ん
でおり且つ新規に単離された乳頭腫ウイルスの検出、場
合によっては同定又は分類の連続試験を実施することが
可能な容器もしくは「キット」も提供する。例えば、本
発明の容器もしくはキットは、抗体又は異なる抗体の混
合物から構成される複数の試薬、例えば以下のように分
類される乳頭腫ウイルスの遺伝子L2の発現生成物に対し
て形成された抗体を夫々含む試薬から構成される。
【００７７】1) 少なくともHPV2d 、 2) HPV10b,28 及び29の少なくとも1 種、 3) HPV17,24の少なくとも1 種、 4) HPV14,15,17,19,20,21,22,23及びIP24の少なくとも1
種、 5) HPV15 及び17の少なくとも1 種、 6) HPV24 、 7) HPV14,32及びIP4 の少なくとも1 種、 8) HPV31 、 9) HPV32 、 10) HPV16,18 及びIP2 の少なくとも1 種。
【００７８】尚、以上10群の抗体は、10群の各々が該群
を構成している抗体のただ1 種に限定される限り、相互
に異なる全状況にあるように選択される。
【００７９】遺伝子L2の発現生成物（又は遺伝子L2の発
現生成物の免疫特性を変化させない追加ポリペプチド、
特に安定化ポリペプチドと融合されたこれらの発現生成
物を含む組換え体タンパク）に対して形成された抗体
は、罹患した被験者の体内の乳頭腫ウイルスにより誘導
された病変部に由来する組織病理切片中でウイルスを直
接検出するために使用可能である。有利には、検出は例
えば前出のCARNOY溶媒もしくは混合物（L.LISON の著
書"Histochimie et cytochimieanimales" にも記載され
ている）を使用して、解離条件下で予め固定された調製
物に対して実施される。
【００８０】場合によっては固定された抗L2抗体は、こ
の抗体に対して形成された別の抗体により認識され得、
これらの別の抗体は好ましくは非放射性の適当なマーカ
ーを含んでいる。これらのマーカーは例えば酵素又は蛍
光性質を有する。
【００８１】本発明は当然のことながら、乳頭腫ウイル
スの遺伝子L2を発現させるポリペプチド自体にも係る。
これらの発現生成物は上記記載で既にL2タンパクと呼称
している。本発明は更に、このL2タンパクがL2タンパク
の免疫特性を本質的に変化させないような他のポリペプ
チド配列と融合されているポリペプチドにも係る。これ
らの他のポリペプチドフラグメントの存在は、殊に遺伝
子工学技術を使用する操作によりこれらのハイブリッド
ポリペプチドを得る場合、使用される該ハイブリッドポ
リペプチドの製造方法に特に起因し得る。有利には、本
発明はβ- ガラクトシダーゼから誘導された配列を含む
ハイブリッドポリペプチドに係る。このような生成物
は、特にラクトースオペロンの全部又は一部により修飾
され且つ、所定の型の乳頭腫ウイルスに由来する遺伝子
L2から誘導されたヌクレオチド配列をラクトースオペロ
ンのプロモータ（又は例えばλファージのような適当な
他の全プロモータ）の下流に挿入させた適当なベクター
（ファージ又はプラスミド）で大腸菌を形質転換するこ
とにより得られる。有利には、ラクトースオペロンのβ
- ガラクトシダーゼの遺伝子の少なくとも一部を含むこ
の型のプラスミド又はファージを使用する。
【００８２】本発明は異なるポリペプチドの群にも係
り、該ポリペプチドは常に上述のL2タンパクの一部のみ
に夫々対応するが、これらの各群のポリペプチドは該当
する類のL2タンパクの特徴的抗原部位を常に含んでい
る。
【００８３】本発明のポリペプチドは、精製した場合、
該ポリペプチドに対応する抗体、特にこれらのポリペプ
チドにより感作された動物の血清から得られた抗体の精
製技術で使用することができる。特に、これらのポリペ
プチドはアフィニティカラムに固定することができる。
抗体の精製操作は、該ポリペプチドを含んでいるアフィ
ニティカラムに抗体を含んでいる血清を接触させること
から成る。これらのカラムに選択的に固定された抗体
は、次に適当なイオン強度を有する適当な緩衝液、例え
ば酢酸アンモニウムのような塩溶液を使用する抗原- 抗
体複合体解離により回収され得る。また酸性溶液を使用
してもよい。
【００８４】最後に、本発明はこれらの抗原（又は抗原
群）及び抗体（又は抗体群）を使用する組成物に係る。
【００８５】特に、本発明は所与の型の疾患にしばしば
存在すると見なされる乳頭腫ウイルスの集合から誘導さ
れた抗体の1 種又は好ましくは「カクテル」を含む群に
係る。該当患者からの組織又は細胞採取物のインビトロ
診断試験後に所与の疾患は臨床診断されている筈である
し、あるいはインビトロ診断の結果、感染乳頭腫ウイル
スは上記集合の乳頭腫ウイルスの1 種に類似する型に属
することが判明している筈であるから、これらのカクテ
ル（適当な薬学的賦形剤と共にこれらの抗体又は抗体
群、即ち血清混合物又は精製抗体組成物を含む）はこの
場合、この疾患の治療にあたり、患者に特に非経口経路
で投与することにより使用できる。従って、これらの血
清は対応する型又は亜型の乳頭腫ウイルスにより誘導さ
れる感染を退行させ得る。
【００８６】最後に本発明は、選択された投与方法、特
に対応する疾患に罹患している危険の高い人を保護する
ために使用可能な非経口経路の投与方法に適合する薬学
的に許容可能な賦形剤と共に、1 又は好ましくは数種の
L2タンパクを含む対応するワクチン組成物に係る。
【００８７】最後に、読者が明細書を十分に理解するの
に有益と思われる限りにおいて、従来技術の状態の説明
を必要の範囲内で補う参考文献の論文を参照されたい。
従って、これらの論文の内容は明細書の一部を形成する
ものとみなされるべきである。
【００８８】さて、所与の乳頭腫ウイルスの遺伝子L2の
読み取り相のフラグメントを利用するタンパクL2（又は
このタンパク質のフラグメント）を産生させるために好
適な方法を、まず読み取り相のこれらのフラグメントを
含むベクター構造に関して、次に大腸菌中のL2タンパク
又はこのポリペプチドの発現を誘導し得る条件に関して
説明しよう。また、タンパク又はこのポリペプチドの精
製方法、及びこれらのタンパク又はこのポリペプチドに
対する抗体を含む血清の製造における該精製方法の使用
例についても記載する。
【００８９】当業者にとっては自明のことであるが、L2
の読み取り相の使用されるフラグメントは、使用される
ベクターで常に同相で融合させるべきであり、場合によ
っては安定性を確保し且つこうして形成されるハイブリ
ッドタンパク質のその後の精製を容易にするタンパク質
のコード化遺伝子が使用される。
【００９０】製造順序は添付した第11図に示してある。
【００９１】材料及び方法 1) DNA の処理 DNA の組換え、プラスミドとDNA フラグメントとの形
成、新しい末端の形成、酵素Bal31 による消化及び細胞
のトランスフェクションに関しては、Cold Spring Harb
or Labo-ratory, Cold Spring Harbor, NEW-YORK, U.S.
A.の著書"A Laboratory Manuel" の"Molecular clonin
g" の章に記載されているManiatis, T.他(1982)の方法
を援用した。
【００９２】2) 細菌、プラスミド及びウイルス プラスミドDNA は、大腸菌（細胞C600）に含まれる pHP
VI.a（Danos 他、1982及び1982年4 月5 日付仏国特許出
願第82 05887号）、細胞RRI(queen, 1983)に含有されて
いたpCQV2 及び細胞MC1000(Casadaban,1983)に含有され
ていたpMC1403から得た。
【００９３】構成した遺伝子間プラスミド及びプラスミ
ドpHPL2 を、大腸菌MM294 の細胞に数回通し、プラスミ
ドpHPL2-β- ガラクトシダーゼはβ- ガラクトシダーゼ
を欠失する細胞MC1000に通した。ラクトースを含むMc C
onkey の寒天培地（Silhavy他、1984,"Experiments wit
h gene fusions": Cold Spring Harbor Laboratory,Col
d Spring Harbor,NEW-YORK）で、菌株 Lac- を赤いコロ
ニーの形態で検出した。
【００９４】次に、プロテアーゼを欠失する菌株 lo
n- 、CAG1139(Gro-ssman 他、1983,Cell 32, 151-159)
に、プラスミドpHPL2 及びpHPL2-β-galをトランスフェ
クトした。
【００９５】3) 細菌溶解質の生成及び該溶解質のドデ
シル硫酸ナトリウム- ポリアクリルアミドゲル分析(SDS
-PAGE) 一晩培養後、pHPL2 又はpHPL2-β-gal116 を含む細胞CA
G 1139をLB溶媒で 5〜20倍に希釈した。次に光学密度OD
600 が 0.5〜0.9 に達するまで細胞を30℃で培養した。
【００９６】次に、細胞を90分間で41℃にすることによ
りλ-PR プロモータを抑制解除した。培養物を再び遠心
分離し、沈降物を収集し、SDS2％、グリセロール26％、
2Mの2-メルカプトエタノール、及びブロモフェノールブ
ルー0.03％を含有する溶媒62mM Tris, pH6.8に懸濁させ
た。プラスミドを含んでいない細胞CAG1139 の溶解質を
対照として使用した。
【００９７】100℃で10分間処理後、Laemli(1970), Nat
ure, 227 , 680-684 の技術に従って、試料に対して10
％のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。
既知の分子量を有する予め着色したBRL タンパクに対し
て同様に電気泳動を実施した。
【００９８】「アミドブラック」の呼称で知られている
着色剤で着色することにより、タンパク質のバンドを可
視化させ、ニトロセルロース膜に移して所謂「ウェスタ
ンブロット」（ウェスタン転写）により分析した。
【００９９】4) 分析 乳頭腫ウイルスのポリクローナル抗体(Orth 他(1978),
Virology91, 243-255及び前出のRosetto 他) と、Raifo
rt のペルオキシダーゼに結合された抗ラット及び抗ウ
サギ免疫グロブリンIgG とを使用することにより、Rose
tto 他(1984)J.Gen. Virol. 65, 1319-1324 に記載され
ているように、「ウエスタンブロット」による分析を実
施した。
【０１００】5) 抗体の分析 精製されたHPVl.aのウイルス粒子又は異なる型の乳頭腫
ウイルスにより誘導された病変の切片を使用することに
より、従来記載されている免疫拡散、免疫蛍光及び免疫
ペルオキシダーゼ法(Orth 他、1984及びRosetto 他、19
84) を使用した。
【０１０１】6) 融合タンパクL2- β- ガラクトシダー
ゼの精製 pHPL2-β- ガラクトシダーゼ116 を含有するCAG1139 の
培養物をLB溶媒で200倍に希釈し、D.O.600 が0.32に達
するまで培養した。次に培養物を急速に41℃にし、高温
で90分間培養した。
【０１０２】細胞沈降物を溶媒Tris20mM,pH7.5, MgCl2
10mMに再懸濁させ、超音波で細胞破壊処理した。
【０１０３】Ullmann(1984). Gene 29, 27-31 により記
載されているように、調製物に可溶性の融合タンパク
を、p-アミノフェニル- β-D- チオガラクトシド(TPEG)
-SEPHAROSEカラムでアフィニティクロマトグラフィによ
り精製した。
【０１０４】上記のように精製した融合タンパクを使用
してHarley雌ラットに免疫感作した。動物には、完全フ
ロイントアジュバント(DIFCO) の存在下で 2〜3 週間の
間隔で異なる部位に約150 μg のタンパク質を3 回皮下
注射した。3 回目の注射から1 週間後に血清を採取し
た。
【０１０５】結 果 大腸菌内でL2読み取り枠を発現することの可能なプラス
ミドの構造 構造は第１図に示した。L2読み取り枠をクローニングし
て大腸菌内で発現させた。プラスミドpHPVl.a は、Dano
s 他(EMBO J.l,p.231-236,1982) によりプラスミドpBR3
22のBamHＩ部位でクローニングされたHPVl.aの完全なゲ
ノムを含んでいる。ウイルスゲノムの後期領域から読み
取り枠を単離するために、プラスミドpBR322内でプラス
ミドpHPV 1.aのフラグメントHindIII-HpaII をサブクロ
ーニングした。得られたプラスミドをpHPL9 とした。領
域pBR322における非本質的なフラグメントBamHI-pVuII
を除去することにより、このプラスミドを短縮した。得
られたプラスミドpHPL9.3 から、5'末端の318 対を除く
読み取り枠の1526塩基対(p.b.)を含むフラグメントXho
II-XmnＩを単離した。
【０１０６】L2読み取り枠の終止コドンを保存した。
【０１０７】得られたL2フラグメントを次に、非本質的
なフラグメントBamHI-PvuII の代わりにpCQV2 発現ベク
ター(queen1983) に挿入した。こうして、L2読み取り枠
は、開始ATG コドン及びλファージのcro 遺伝子の配列
SD(Shine及びDargarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
1, p.1342-1346,1974)に直接隣接しており、λPRプロモ
ータの制御下にある。プロモータは温度に敏感な抑制剤
CI857 により調節されるので、L2の発現生成物の産生を
制御することができる。こうしてL2読み取り枠のC 末端
部の1206塩基対がλファージのcro の開始ATG コドンと
同相であるようなプラスミドpHPL2 が得られた。解読相
については、BamHＩ/BglIIの交差点における制限部位Xh
o IIの存在により立証した。
【０１０８】大腸菌内で合成されたL2タンパクを安定化
させ、該タンパクを精製するのに好適な方法を提供する
目的で、大腸菌のβ- ガラクトシダーゼと融合したハイ
ブリッドタンパクと同様に該タンパクを発現させること
に決定した。
【０１０９】このためには、BstEII部位でプラスミドpH
PL2 を直線状にしてから酵素Bal31で消化させ、L2終始
コドンを除去した。
【０１１０】遺伝子L2と転写及び翻訳信号を供給する配
列とを含むこのDNA を、PstIによる消化によって短縮
し、フラグメントPstI-SmaI の代わりにプラスミドpMC1
403(Casadaban,Methods in enzymology 100,p.293-308,
1983)に挿入した。
【０１１１】PMC1403 は、プロモータを含まないlac オ
ペロンと、β- ガラクトシダーゼの遺伝子の読み取り相
の最初の22塩基対とを含んでいる。組換え体を細胞MC10
00,lac- にトランスフェクトした。クローン中で高温で
β- ガラクトシダーゼを産生させると、L2とβ- ガラク
トシダーゼとが同相であるようなプラスミドpHPL2 βga
l を、Mc.Condey ラクトース寒天培地(Silhavez 他、Co
ld.Spring Harbor Laboratory, N.Y.1984)で選択するこ
とができた。
【０１１２】このような方法に従って選択されたクロー
ンpHPL2,βgal116を後で調査した。
【０１１３】DNA の配列（その結果についてはここでは
示さない）を検討した処、L2読み取り枠の最後の2 個の
C 末端アミノ酸のみがBal31 による消化の過程で失われ
ていること、及びL2読み取り枠により発現される生成物
はプロリンを介してβ- ガラクトシダーゼの9 番目のア
ミノ酸に結合されていることがわかった。
【０１１４】pHPL2 及びpHPL2 βgal116でトランスフェ
クトした細胞によるHPVl.aと同種のタンパク質の産生 プラスミドpHPL2 は、約51.2KdのL2タンパクをコード
し、及び約167Kd のハイブリッドタンパク質のpHPL- β
gal の容量を有している。
【０１１５】これらのプラスミドによるタンパク質の産
生を検討するために、まずプロテアーゼを欠失する大腸
菌CAG1139lon- の菌株にこれらのプラスミドをトランス
フェクトした。次に細胞を30℃、次に41℃で培養し、λ
PRプロモータの制御下でタンパク質の産生を誘導した。
得られた細菌溶解質に対して、SDS-ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を実施した。 抗ウイルスHPVl.a抗体を使
用して所謂「ウェスタンブロット」法に従って分析した
処、ウイルスHPVl.aと同種のタンパク質が認識された。
30℃にした培養物の分析結果は、プラスミドを含むか又
は含まない細胞については同様であったが、41℃にした
細胞の場合、トランスフェクトした細胞中にタンパク質
の特異的バンドが示され、組換え体pHPL2-βgal116でト
ランスフェクトした細胞から単離されたタンパク質のう
ち、融合タンパクL2β- ガラクトシダーゼ(L2-βgal)に
対応する約136Kd の期待分子量を有する主要なバンド
と、恐らくタンパク分解の結果であると考えられる約58
Kdの分子量の数個の小さいバンドとが単離された。
【０１１６】構造pHPL2 については、約72Kdのタンパク
質のバンドが見出だされた。この分子量は51.2Kdの予想
分子量よりも大きい。この差の意味については解明の余
地がある。
【０１１７】次に、大腸菌中で産生されたタンパク質の
抗原性を検討するために、熱誘導培養株の細菌溶解質の
生成物L2- βgal をTREG-SEPHAROSEカラム(Ullman, Gen
e 29, p.27-31,1984) でアフィニティクロマトグラフィ
により精製した。カラムから溶離されたタンパク質をSD
S-ポリアクリルアミドゲルで分析した。「アミドブラッ
ク」で着色した処、3 個の主要なタンパク質のバンド、
即ち L2-βgal ハイブリッドタンパクに対応すると思わ
れる高分子量バンドと、精製したβ- ガラクトシダーゼ
と共に移動する第２のバンドと、約60Kdの分子量を有す
る第３のバンドとが認められた。
【０１１８】分子量の小さいこのタンパク質は汚染物に
対応し得る。HPVl.a型の特異抗体を使用する「ウェスタ
ンブロット」法による分析の結果、発現生成物 L2-βga
l に対応する高分子量の主要なバンドと、数個の二次的
なバンドとが認められた（第3b図）。
【０１１９】生成物 L2-βgal の免疫性 融合タンパクの免疫性を試験するために、2 匹のラット
に溶離物を注射した。3 回目の注射後に血清を収集し
た。得られた血清を、夫々プラスミドpHPL2-βgal116又
はプラスミドpHPL2 を含む熱誘導培養株の細菌溶解質中
で「ウェスタンブロット」分析により、融合タンパク L
2-βgal 又は生成物L2と同様に移動するバンドと反応さ
せた。
【０１２０】2 種類の型の細胞溶解質で、血清は対照溶
解質CAG1139 にも見出だされるタンパク質（約60及び55
Kd）を認識した。これらのタンパク質の少なくとも一種
は、融合タンパク L2-βgal 及びβガラクトシダーゼと
同時に生成されたタンパク質に対応するように思われ
る。
【０１２１】血清は、解離されたウイルス調製物HPVl.a
（デタージェント処理）及びHPVl.aにより誘導されたい
ぼの抽出物中で、約80Kdのタンパク質を認識した。
【０１２２】免疫拡散試験において、得られたラット血
清は抗原として使用された未処理のウイルス粒子HPVl.a
を沈降させず、従って、免疫トランスファー法で血清に
より認識されるウイルス抗原はビリオンの表面では得ら
れないこと、及び血清は沈降しないことが更に判明し
た。
【０１２３】ビリオン及びウイルスポリペプチドの天然
高次構造を保存するために知られている凍結いぼ切片HP
Vl.aでは、L2の発現生成物から得た血清は反応しなかっ
た。この結果から、抗体は配座抗原に向けられていない
ことがわかる。
【０１２４】血清は、BOUIN 溶媒に固定されたHPVl.aに
感染したいぼ切片とはほとんど反応しなかった（希釈度
1/50）。この結果から、ウイルスに感染しており且つBO
UIN溶媒に固定された切片でより強い抗原- 抗体反応を
生じる群の抗原に対して該当型の抗原の特異的特徴が確
認される。
【０１２５】一方、CARNOY溶媒により切片を観察した
処、抗原型及び抗原群のどちらも正の反応が認められ
た。特に、切片が試験で使用された抗体の起源である抗
原を提供したと同一型のウイルスを含んでいた場合、ラ
ットの血清は非常に強い抗原- 抗体反応(1/1000 の希釈
度) をもたらすことが確認された。これに対して、被調
査血清を別の型に属するウイルスを含む切片と接触させ
た場合、交差免疫反応は何も認められなかった。
【０１２６】銘記すべき点として、抗原に予想される型
は、2 種の異なる乳頭腫ウイルスのゲノムの相互ハイブ
リダイゼーション能力に関して上述したような型と常に
一致している必要はない。
【０１２７】乳頭腫ウイルスに存在する抗原として特に
2 種類、即ち、−完全ビリオンの注入後に得られる抗体
を使用することにより、各種の乳頭腫ウイルス間の交差
抗原反応の不在により特徴付けられる型の抗原、及び−
本質的にビリオン中に遮蔽されており、解離されたウイ
ルス粒子の注入後に抗体により露呈される類の抗原、に
区別される。
【０１２８】抗原- 抗体反応試験で異なる型に属する乳
頭腫ウイルスは、好ましくは夫々の相同領域を欠くL2コ
ード配列が夫々の抗体で抗原- 抗体交差反応を生じさせ
ないポリペプチドをコードするような乳頭腫ウイルスで
ある。
【０１２９】好適な型の抗原は、特に該当するL2領域の
長さの1/4 にわたってN 末端領域を欠く遺伝子L2の読み
取り枠によりコードされた抗原である。
【０１３０】最後に本発明は、異なる型に属するウイル
ス中で、交差反応を生じないL2領域によりコードされた
ポリペプチドの型を求めるために実施される試験にも係
る。これらのポリペプチドは、Carnoy溶媒に固定された
組織又は細胞切片に含まれるウイルスと効果的に反応す
る抗体を含むが、Bouin溶媒により固定されている同一切
片とは不十分にしか反応しないかあるいは全く反応しな
いようなポリペプチドとして規定され得る。
【０１３１】本発明は更に、既知の乳頭腫ウイルスに対
して新規乳頭腫ウイルスを分類する方法にも係る。この
方法は、明細書の一部をも構成する請求の範囲第８項に
規定されている。
【０１３２】更に、本発明は場合によっては患者の体内
に存在している感染ウイルスの型の同定を含む診断方法
にも係り、該方法は、異なる型に属するウイルスに対し
て予め得られた抗原を、試験すべき患者からの生物採取
物、特に血清と反応させることから成る。
【０１３３】血清採取物とこの同一型に属する乳頭腫ウ
イルスからの抗原との間に抗原- 抗体反応が観察される
なら、感染ウイルスは所定の型に属するものと見なされ
る。この診断試験は、例えばELISA 法を使用することに
より実施され得る。
【０１３４】より特定的には、本発明は組織又は流体の
ようなヒト生物試料、例えば血清中の感染乳頭腫ウイル
スが所与の型の乳頭腫ウイルスに属するか否かを検出す
る方法に係る。この方法は、この生物試料を、この型に
属するウイルスのゲノムの領域L2の少なくとも一部を含
むDNA の発現生成物に対して予め形成された抗体と接触
させることを特徴とし、この接触は免疫反応を可能にす
る条件下及び時間内で実施される。抗原- 抗体複合体の
形成が検出されると、上記発現生成物の起源である型と
同一又は同種の型を有する乳頭腫ウイルスの存在が証明
される。
【０１３５】好ましくは、L2領域又は対応部分を含むDN
A を、細菌例えば大腸菌のようなコンピテント細胞宿主
内でクローニングした。
【０１３６】有利には、使用されるL2領域部分は型の非
特徴的N 末端領域を欠失している遺伝子L2の読み取り枠
に対応する。好ましくは、このN 末端領域はこの読み取
り枠の4 分の1 に対応する。
【０１３７】より特定的には、本発明は上記L2領域部分
（又はL2領域全体）を含むDNA が選択されたコンピテン
ト細胞宿主内で通常発現可能なタンパク質をコードする
核酸から形成されたハイブリッドDNA であり、上記L2領
域が特にインビトロ再結合により予め取り込まれている
ようなこの型の検出方法に係る。
【０１３８】例えば細胞宿主内で通常発現可能なタンパ
ク質は、この細胞宿主が大腸菌であるとき、β- ガラク
トシダーゼの全部又は一部に対応する。
【０１３９】本発明の検出方法は、好ましくはCarnoy溶
媒中あるいは血清に直接固定されたあらゆる組織切片に
適用可能である。
【０１４０】本発明の方法は生物試料を、同一型又は同
種の型の数個のウイルス、特にDNAプローブに対して上
述の方法で再編成されたウイルスに由来するL2領域の発
現生成物、又は夫々の対応する部分に対して予め形成さ
れた抗体の「カクテル」と、上記条件で接触させること
も含む。
【０１４１】これらの抗体の「カクテル」を使用する
と、DNA プローブに関して使用したと同様の条件下で、
検出された乳頭腫ウイルスの所与の種類への帰属と、患
者が罹患しているか又は潜在的に危険のある病気とを相
関させることができる。
【０１４２】最後に本発明は、上記ハイブリッドポリペ
プチド及び対応する抗体の各々の製造方法にも係る。
【０１４３】この方法は、 −該当する乳頭腫ウイルスのゲノムのL2領域又は適当な
ベクター内の対応する領域部分の、特にインビトロの取
り込み、 −こうして修飾されたベクターで受容可能な細胞宿主、
即ち上記L2領域又は対応する部分を発現し得る宿主の形
質転換、及び −L2領域又は対応部分の発現の結果として形成されるポ
リペプチドの回収、及び好ましくは分離、から成り、こ
のポリペプチドは上記条件下で乳頭腫ウイルスのタンパ
ク質を検出することの可能な抗体をインビボで産生させ
ることが可能である。
【０１４４】本発明は更に、動物、例えばウサギを上記
ポリペプチドで感作し、形成された抗体を回収すること
を特徴とする抗体の産生方法にも係る。
【０１４５】最後に本発明は、各乳頭腫ウイルスが属す
ることが確認され得る各型に従って該乳頭腫ウイルスか
ら得られるハイブリッドペプチド又は抗体の再編成を包
含することもある。
【０１４６】参考文献 (1) Derst, M. 他、1983, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト乳頭腫ウイルスの物理的制限地図を示す。
【図２】ヒト乳頭腫ウイルスの物理的制限地図を示す。
【図３】ヒト乳頭腫ウイルスの物理的制限地図を示す。
【図４ａ】ヒト乳頭腫ウイルスの物理的制限地図を示
す。
【図４ｂ】ヒト乳頭腫ウイルスの物理的制限地図を示
す。
【図５】ヒト乳頭腫ウイルスの物理的制限地図を示す。
【図６】ヒト乳頭腫ウイルスの物理的制限地図を示す。
【図７】ヒト乳頭腫ウイルスの物理的制限地図を示す。
【図８】ヒト乳頭腫ウイルスの物理的制限地図を示す。
【図９】ヒト乳頭腫ウイルスの物理的制限地図を示す。
【図１０】ヒト乳頭腫ウイルスの物理的制限地図を示
す。
【図１１】プラスミドｐＨＰＬ２とｐＨＰＬ２βｇａｌ
の製造図を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年５月３０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/574 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 キヤロル・アン・コムリ フランス国、75015・パリ、リユ・コプロ、 ６ (72)発明者 オデール・クロワツサン フランス国、75013・パリ、リユ・アー・ ランソン、19 (72)発明者 フランソワーズ・ブレブユール フランス国、75016・パリ、リユ・モリト ール、36

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 新規に単離された乳頭腫ウイルスの分類
    方法であって、該乳頭腫ウイルスのゲノムの非過酷条件
    下における既知の乳頭腫ウイルスの1 又は数個のゲノム
    のL2領域とのハイブリダイゼーション、あるいは場合に
    よっては該新規乳頭腫ウイルスのゲノムの配列決定、従
    ってL2遺伝子に対応する読み取り枠の標識後、ゲノムか
    ら予め切り出されたこのL2遺伝子の全部又は一部を構成
    しているフラグメントと適当なベクターとの組換え体を
    形成させ、次に適当な細胞宿主又は微生物、特に大腸菌
    中にフラグメントの発現を誘導し、次に場合によっては
    得られた発現生成物に対する抗体をインビボで生成し、
    新規に単離された乳頭腫ウイルスのL2遺伝子の発現生成
    物もしくは対応する抗体と、既知の型の乳頭腫ウイルス
    に対応する抗体もしくは抗原との間で抗原抗体交差反応
    試験を実施し、抗原抗体交差反応が陰性の結果をもたら
    すか又は陽性の結果をもたらすかに従って、既知の乳頭
    腫ウイルスから新規に単離された乳頭腫ウイルス型を識
    別するか又はしないことによって乳頭腫ウイルスを分類
    することを特徴とする方法。
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