JPH08287A - 腎臓atp−依存性ナトリウムチャンネルをコードするヒトdna配列 - Google Patents
腎臓atp−依存性ナトリウムチャンネルをコードするヒトdna配列Info
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- JPH08287A JPH08287A JP6130249A JP13024994A JPH08287A JP H08287 A JPH08287 A JP H08287A JP 6130249 A JP6130249 A JP 6130249A JP 13024994 A JP13024994 A JP 13024994A JP H08287 A JPH08287 A JP H08287A
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- cells
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 機能性カリウムATPチャンネルタンパク質
をコードするヒトDNAのクローニングおよび単離。 【構成】 膜またはレシピエント細胞系に対しカリウム
チャンネル活性を与えるタンパク質をコードするヒトD
NA構築物の構築ならびにそれを用いたカリウムチャン
ネル調節活性化合物のスクリーニング方法。 【効果】 本発明により、ヒトカリウムATP開閉チャ
ンネルタンパク質をコードする機能性DNAクローンお
よびその誘導体が初めて単離され、また哺乳動物細胞お
よび該クローンを用いるヒト腎臓カリウムチャンネル活
性調節化合物をスクリーニングする方法が開発された。
をコードするヒトDNAのクローニングおよび単離。 【構成】 膜またはレシピエント細胞系に対しカリウム
チャンネル活性を与えるタンパク質をコードするヒトD
NA構築物の構築ならびにそれを用いたカリウムチャン
ネル調節活性化合物のスクリーニング方法。 【効果】 本発明により、ヒトカリウムATP開閉チャ
ンネルタンパク質をコードする機能性DNAクローンお
よびその誘導体が初めて単離され、また哺乳動物細胞お
よび該クローンを用いるヒト腎臓カリウムチャンネル活
性調節化合物をスクリーニングする方法が開発された。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、膜またはレシピエント
細胞系に対しカリウムチャンネル活性を与えるタンパク
質をコードするヒトDNA組成物に関する。該DNA組
成物は、カリウムチャンネルタンパク質をコードする構
造遺伝子、該構造遺伝子を含有する発現および複製のプ
ラスミドまたはベクターならびにそれらの遺伝子を発現
する宿主細胞を包含する。また、カリウムチャンネル調
節活性につき化合物をスクリーニングする方法も記載す
る。
細胞系に対しカリウムチャンネル活性を与えるタンパク
質をコードするヒトDNA組成物に関する。該DNA組
成物は、カリウムチャンネルタンパク質をコードする構
造遺伝子、該構造遺伝子を含有する発現および複製のプ
ラスミドまたはベクターならびにそれらの遺伝子を発現
する宿主細胞を包含する。また、カリウムチャンネル調
節活性につき化合物をスクリーニングする方法も記載す
る。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ホ
ー,ケイ(Ho,K)らによる「クローニング・アンド・
エクスプレッション・オブ・アン・インワードリー・レ
クティファイイング・エイティピイ・レギュレイティッ
ド・ポタシウム・チャンネル(Cloning and expression
of an inwardly rectifying ATP-regulated potass
ium channel)」、ネイチャー(Nature)(1993年3月
4日)、第362巻、31−38頁。そこでは、ラット
腎臓の外部髄質の内部ストライプ(inner stripe)由来の
ATP調節カリウムチャンネルタンパク質をコードする
遺伝子について記載されている。
ー,ケイ(Ho,K)らによる「クローニング・アンド・
エクスプレッション・オブ・アン・インワードリー・レ
クティファイイング・エイティピイ・レギュレイティッ
ド・ポタシウム・チャンネル(Cloning and expression
of an inwardly rectifying ATP-regulated potass
ium channel)」、ネイチャー(Nature)(1993年3月
4日)、第362巻、31−38頁。そこでは、ラット
腎臓の外部髄質の内部ストライプ(inner stripe)由来の
ATP調節カリウムチャンネルタンパク質をコードする
遺伝子について記載されている。
【0003】チャンディー,ケイ(Chandy,K)らによ
る1992年2月20日公開のWO92/02634、
PCT/US91/05168。そこでは、MK3として
公知の遺伝子産物、Tリンパ球中に存在する電位依存性
でn型のカリウムチャンネルタンパク質について記載さ
れている。
る1992年2月20日公開のWO92/02634、
PCT/US91/05168。そこでは、MK3として
公知の遺伝子産物、Tリンパ球中に存在する電位依存性
でn型のカリウムチャンネルタンパク質について記載さ
れている。
【0004】ハーポルド,エム(Harpold,M)らによる
1992年2月20日公開のWO92/02639、P
CT/US91/05625。そこでは、細胞表面タンパ
ク質の活性を調節する化合物を同定する転写アッセイに
ついて記載されている。またレポーター遺伝子、転写調
節エレメント、およびカリウムイオンチャンネルとなり
うる外来性の細胞表面タンパク質をコードするDNAを
含有する細胞についても記載されている。
1992年2月20日公開のWO92/02639、P
CT/US91/05625。そこでは、細胞表面タンパ
ク質の活性を調節する化合物を同定する転写アッセイに
ついて記載されている。またレポーター遺伝子、転写調
節エレメント、およびカリウムイオンチャンネルとなり
うる外来性の細胞表面タンパク質をコードするDNAを
含有する細胞についても記載されている。
【0005】ルツンスキー,エム(Luzdunski,M)によ
る「カリウムチャンネル:構造−機能の相関、多様性お
よび薬理学(Potassium Channels:Structure-Functi
onRelationships,Diversity,and Pharmacology)」、
カーディオバスキュラー・ドラッグズ・アンド・セラピ
ー(Cardiovascular Drugs and Therapy)、(199
2)、第6巻、312−319頁。ここでは、カリウム
チャンネルに関する一般的な記載および情報が記載され
ている。
る「カリウムチャンネル:構造−機能の相関、多様性お
よび薬理学(Potassium Channels:Structure-Functi
onRelationships,Diversity,and Pharmacology)」、
カーディオバスキュラー・ドラッグズ・アンド・セラピ
ー(Cardiovascular Drugs and Therapy)、(199
2)、第6巻、312−319頁。ここでは、カリウム
チャンネルに関する一般的な記載および情報が記載され
ている。
【0006】細胞膜のイオンチャンネルは、イオン流動
が起こる基本的な部位である。現代における薬物−チャ
ンネル相互作用の研究は、プロカインおよびコカインに
より引き起こされるイカ軸索のナトリウム(Na+)、お
よびカリウム(K+)チャンネルの遮断を証明するために
電位差クランプ技術(voltage clamp technique)が用い
られた時に開始された(ナカハシ(Nakahashi)、アナル
ス・オブ・ノイロロジー(Ann Neurology)、(198
4);16(suppl):S39−S51頁)。
が起こる基本的な部位である。現代における薬物−チャ
ンネル相互作用の研究は、プロカインおよびコカインに
より引き起こされるイカ軸索のナトリウム(Na+)、お
よびカリウム(K+)チャンネルの遮断を証明するために
電位差クランプ技術(voltage clamp technique)が用い
られた時に開始された(ナカハシ(Nakahashi)、アナル
ス・オブ・ノイロロジー(Ann Neurology)、(198
4);16(suppl):S39−S51頁)。
【0007】本発明はカリウムチャンネルに関する。薬
理学的および物理化学的な研究により、数多くの哺乳動
物細胞の形質膜においてカリウム選択性の孔を形成する
複数サブタイプの膜イオンチャンネルが存在することが
明らかとなった。これらカリウムチャンネルの薬理学的
および電気生理学的な性質の比較からそれらの開閉特性
におおいに基づく種々のサブタイプのグループ分けの操
作上の定義が明らかにされてきた。
理学的および物理化学的な研究により、数多くの哺乳動
物細胞の形質膜においてカリウム選択性の孔を形成する
複数サブタイプの膜イオンチャンネルが存在することが
明らかとなった。これらカリウムチャンネルの薬理学的
および電気生理学的な性質の比較からそれらの開閉特性
におおいに基づく種々のサブタイプのグループ分けの操
作上の定義が明らかにされてきた。
【0008】電位差で開閉するカリウムチャンネルは膜
ポテンシャルの変化を検知し、この細胞膜ポテンシャル
の変化に反応してカリウムイオンを通過させる。リガン
ドにより開閉するカリウムチャンネルは、カルシウム、
ナトリウム、ATPまたは脂肪酸(特にアラキドン酸)を
包含する低分子量エフェクターによって調節される(ラ
ツンスキー(Lazdunski)によるカーディオバスキュラー
・ドラッグズ・アンド・セラピー(Cardiovascular Dr
ugs and Therapy)、(1992)、第6巻、313−3
19頁)。これらのチャンネルタンパク質がカリウムイ
オンを選択的に移動させるという共通の性質を有するに
もかかわらず、それらが異なった生物物理学的、生物化
学的および薬理学的な性質を有することは、それらが異
なった遺伝子によってコードされる異なった遺伝子産物
であることを示唆している。
ポテンシャルの変化を検知し、この細胞膜ポテンシャル
の変化に反応してカリウムイオンを通過させる。リガン
ドにより開閉するカリウムチャンネルは、カルシウム、
ナトリウム、ATPまたは脂肪酸(特にアラキドン酸)を
包含する低分子量エフェクターによって調節される(ラ
ツンスキー(Lazdunski)によるカーディオバスキュラー
・ドラッグズ・アンド・セラピー(Cardiovascular Dr
ugs and Therapy)、(1992)、第6巻、313−3
19頁)。これらのチャンネルタンパク質がカリウムイ
オンを選択的に移動させるという共通の性質を有するに
もかかわらず、それらが異なった生物物理学的、生物化
学的および薬理学的な性質を有することは、それらが異
なった遺伝子によってコードされる異なった遺伝子産物
であることを示唆している。
【0009】ATP−感受性、またはATPにより開閉
するカリウムチャンネルは、細胞のその電気的な興奮に
細胞の生物エネルギー状態がリンクしている重要なクラ
スのチャンネルである。該チャンネルは高い細胞内AT
P濃度によって遮断され、ATPが減少すると開孔する
(ラツンスキー(Lazdunski)(1992))。元来ATPに
より開閉するカリウムチャンネルは心臓組織に存在する
と記載されていた(ノマ,エイ(Noma,A)、ネイチャー
(Nature)、第305巻、147−148頁)が、その後
これらが膵臓β−細胞(クック(Cook)ら、ネイチャー
(Nature)、(1984)、第311巻、271−273
頁);血管平滑筋(vascular smooth muscle)(ネルソン,
エム・ティー(Nelson,M.T.)ら、アメリカン・ジャ
ーナル・オブ・フィジオロジー(Am.J.Physiol.)、
(1990)、第259巻、C3−C18頁)および腎臓
の肥大上行性肢(thick ascending limb)(ワン,ダブリ
ュー(Wang,W)ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・
フィジオロジー(Am.J.Physiol.)、(1990)、第2
58巻、F244−F253頁))に存在することが記載
されている。
するカリウムチャンネルは、細胞のその電気的な興奮に
細胞の生物エネルギー状態がリンクしている重要なクラ
スのチャンネルである。該チャンネルは高い細胞内AT
P濃度によって遮断され、ATPが減少すると開孔する
(ラツンスキー(Lazdunski)(1992))。元来ATPに
より開閉するカリウムチャンネルは心臓組織に存在する
と記載されていた(ノマ,エイ(Noma,A)、ネイチャー
(Nature)、第305巻、147−148頁)が、その後
これらが膵臓β−細胞(クック(Cook)ら、ネイチャー
(Nature)、(1984)、第311巻、271−273
頁);血管平滑筋(vascular smooth muscle)(ネルソン,
エム・ティー(Nelson,M.T.)ら、アメリカン・ジャ
ーナル・オブ・フィジオロジー(Am.J.Physiol.)、
(1990)、第259巻、C3−C18頁)および腎臓
の肥大上行性肢(thick ascending limb)(ワン,ダブリ
ュー(Wang,W)ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・
フィジオロジー(Am.J.Physiol.)、(1990)、第2
58巻、F244−F253頁))に存在することが記載
されている。
【0010】カリウムチャンネルタンパク質についての
モレキュラークローニングの研究からいくつかの知見が
得られているが、電位差により開閉するファミリーのカ
リウムチャンネルのメンバーに関してだけである。これ
らの電位差により開閉すファミリーのカリウムチャンネ
ルタンパク質をコードする種々の遺伝子は、Shaker、
ShawおよびShab遺伝子座の全てから由来のショウジョ
ウバエ遺伝子を用いてクローン化されている(ウェイ,
エイ(Wei,A)ら、サイエンス(Science)、(199
0)、第248巻、599−603頁)。
モレキュラークローニングの研究からいくつかの知見が
得られているが、電位差により開閉するファミリーのカ
リウムチャンネルのメンバーに関してだけである。これ
らの電位差により開閉すファミリーのカリウムチャンネ
ルタンパク質をコードする種々の遺伝子は、Shaker、
ShawおよびShab遺伝子座の全てから由来のショウジョ
ウバエ遺伝子を用いてクローン化されている(ウェイ,
エイ(Wei,A)ら、サイエンス(Science)、(199
0)、第248巻、599−603頁)。
【0011】リガンドにより開閉するファミリーのカリ
ウムチャンネルタンパク質のメンバーを、電位差により
開閉するカリウムチャンネルの公知の配列に基づくプロ
ーブを用いてクローン化する全ての公知の試みは失敗し
ている。これらのカリウムチャンネルの電気生理学的お
よび薬理学的な特性を一緒にすると、これらの結果によ
り、ATPにより開閉するカリウムチャンネルタンパク
質が電位差により開閉するカリウムチャンネルをコード
する遺伝子とは異なる遺伝子によってコードされること
がさらに確認される。これらの結果は、電位差感受性の
カリウムチャンネルと、ATPにより開閉するカリウム
チャンネルをコードするそれぞれの遺伝子間で相同性が
ほとんどまたは全くないことを示している。
ウムチャンネルタンパク質のメンバーを、電位差により
開閉するカリウムチャンネルの公知の配列に基づくプロ
ーブを用いてクローン化する全ての公知の試みは失敗し
ている。これらのカリウムチャンネルの電気生理学的お
よび薬理学的な特性を一緒にすると、これらの結果によ
り、ATPにより開閉するカリウムチャンネルタンパク
質が電位差により開閉するカリウムチャンネルをコード
する遺伝子とは異なる遺伝子によってコードされること
がさらに確認される。これらの結果は、電位差感受性の
カリウムチャンネルと、ATPにより開閉するカリウム
チャンネルをコードするそれぞれの遺伝子間で相同性が
ほとんどまたは全くないことを示している。
【0012】ラット腎臓カリウムチャンネルをコードす
るcDNAが、ラット腎臓の肥大上行性肢からサイズ−
分画したmRNAを用いた発現クローニングにより単離
されている。卵母細胞で発現させると、この遺伝子によ
りコードされるタンパク質が、ATPにより開閉するカ
リウムチャンネルの顕著な特徴を全てではないが多く示
す(ホー,ケイ(Ho,K)ら、ネイチャー(Nature)、第3
62巻、31−38頁(1993年3月4日))。
るcDNAが、ラット腎臓の肥大上行性肢からサイズ−
分画したmRNAを用いた発現クローニングにより単離
されている。卵母細胞で発現させると、この遺伝子によ
りコードされるタンパク質が、ATPにより開閉するカ
リウムチャンネルの顕著な特徴を全てではないが多く示
す(ホー,ケイ(Ho,K)ら、ネイチャー(Nature)、第3
62巻、31−38頁(1993年3月4日))。
【0013】
【課題を解決するための手段】本発明は、初めて成功し
たヒト腎臓ATP開閉カリウムチャンネル遺伝子および
関連するカリウムチャンネル遺伝子のクローン化を記載
する。これらの重要な遺伝子のクローニングは、潜在的
な薬物ターゲットの同定、特徴付けおよびクローニング
を可能にする系への重要なチャンネルタンパク質の生産
を可能とするであろう。本発明は、大容量の機械スクリ
ーニングの開発を包含し、それにより生化学研究用の物
質生産の適当な系を作ることが可能となるであろう。
たヒト腎臓ATP開閉カリウムチャンネル遺伝子および
関連するカリウムチャンネル遺伝子のクローン化を記載
する。これらの重要な遺伝子のクローニングは、潜在的
な薬物ターゲットの同定、特徴付けおよびクローニング
を可能にする系への重要なチャンネルタンパク質の生産
を可能とするであろう。本発明は、大容量の機械スクリ
ーニングの開発を包含し、それにより生化学研究用の物
質生産の適当な系を作ることが可能となるであろう。
【0014】テトロドトキシンの高選択性およびナトリ
ウムチャンネル遮断作用の発見により、イオンチャンネ
ルの研究に、特定の化学物質をプローブとして用いる広
範な興味が涌き起こされた(ナラハシ(Narahashi)(19
84))。本発明は、他の重要な生理学的物質を発見させ
うる重要なカリウムチャンネルを提供する。
ウムチャンネル遮断作用の発見により、イオンチャンネ
ルの研究に、特定の化学物質をプローブとして用いる広
範な興味が涌き起こされた(ナラハシ(Narahashi)(19
84))。本発明は、他の重要な生理学的物質を発見させ
うる重要なカリウムチャンネルを提供する。
【0015】本発明は、ヒトカリウムATP開閉チャン
ネルタンパク質をコードする機能性cDNAクローンお
よびその誘導体の最初の単離を特徴とする。本発明は、
以下のことを記載している。図1〜3、4〜6、7〜
9、10〜12、13〜15に示される配列を有するヒ
ト腎臓ATP開閉カリウムチャンネルおよび関連するカ
リウムチャンネルをコードする単離DNAおよびその選
択された誘導体。図1〜3、4〜6、7〜9、10〜1
2、13〜15のDNA分子からなる種々のベクターお
よびその選択された誘導体。図1〜3、4〜6、7〜
9、10〜12、13〜15のDNA分子からなる種々
のプラスミドおよびその選択された誘導体。細菌細胞、
酵母細胞または哺乳動物細胞の中での発現に適応するベ
クターおよびプラスミド。図1〜3、4〜6、7〜9、
10〜12、13〜15のベクターおよびプラスミドま
たはそれらの選択された誘導体を含有する細菌、酵母ま
たは哺乳動物細胞を用いて、ヒト腎臓ATP開閉カリウ
ムチャンネル活性および関連するカリウムチャンネル活
性を調節する化合物をスクリーニングする方法。
ネルタンパク質をコードする機能性cDNAクローンお
よびその誘導体の最初の単離を特徴とする。本発明は、
以下のことを記載している。図1〜3、4〜6、7〜
9、10〜12、13〜15に示される配列を有するヒ
ト腎臓ATP開閉カリウムチャンネルおよび関連するカ
リウムチャンネルをコードする単離DNAおよびその選
択された誘導体。図1〜3、4〜6、7〜9、10〜1
2、13〜15のDNA分子からなる種々のベクターお
よびその選択された誘導体。図1〜3、4〜6、7〜
9、10〜12、13〜15のDNA分子からなる種々
のプラスミドおよびその選択された誘導体。細菌細胞、
酵母細胞または哺乳動物細胞の中での発現に適応するベ
クターおよびプラスミド。図1〜3、4〜6、7〜9、
10〜12、13〜15のベクターおよびプラスミドま
たはそれらの選択された誘導体を含有する細菌、酵母ま
たは哺乳動物細胞を用いて、ヒト腎臓ATP開閉カリウ
ムチャンネル活性および関連するカリウムチャンネル活
性を調節する化合物をスクリーニングする方法。
【0016】また本発明は、 K−8、K−11もしく
はK−12と命名されたクローンからの、またはその自
明な変形から選択された誘導体からの図1〜3、4〜
6、7〜9、10〜12、または13〜15で示した配
列を有するか、あるいはK−2、K−6、K−8、K−
11もしくはK−26と命名されたクローンからの: K11 (欠損)−MFKHLR..... K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K26 MPTVYLCSEQ−IRVLTES−MF
KLHR..... K−8 MNASSRNVFDTL−IRVLTES−
MFKLHR..... および K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... よりなる群から選択されるN−末端タンパク質配列およ
び K11 (欠損)−MFKHLR..... K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K26 MPTVYLCSEQ−IRVLTES−MF
KLHR..... K−8 MNASSRNVFDTL−IRVLTES−
MFKLHR..... および K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... には示されていないが図1〜3、4〜6、7〜9、10
〜12、または13〜15に示されている残りのDNA
を有するか、あるいは図1〜3、4〜6、7〜9、10
〜12、または13〜15に示したDNAによってコー
ドされたタンパク質、または図16または K11 (欠損)−MFKHLR..... K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K26 MPTVYLCSEQ−IRVLTES−MF
KLHR..... K−8 MNASSRNVFDTL−IRVLTES−
MFKLHR..... および K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... に示されているタンパク質のいずれかの欠損を含めた約
最初の26個のN末端アミノ酸のいずれかをコードする
DNAを有するヒト腎臓カリウムチャンネルタンパク質
をコードする単離されたDNA分子、またはその前記D
NA分子のいずれかに90%相同のDNA分子を提供す
る。
はK−12と命名されたクローンからの、またはその自
明な変形から選択された誘導体からの図1〜3、4〜
6、7〜9、10〜12、または13〜15で示した配
列を有するか、あるいはK−2、K−6、K−8、K−
11もしくはK−26と命名されたクローンからの: K11 (欠損)−MFKHLR..... K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K26 MPTVYLCSEQ−IRVLTES−MF
KLHR..... K−8 MNASSRNVFDTL−IRVLTES−
MFKLHR..... および K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... よりなる群から選択されるN−末端タンパク質配列およ
び K11 (欠損)−MFKHLR..... K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K26 MPTVYLCSEQ−IRVLTES−MF
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MFKLHR..... および K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... には示されていないが図1〜3、4〜6、7〜9、10
〜12、または13〜15に示されている残りのDNA
を有するか、あるいは図1〜3、4〜6、7〜9、10
〜12、または13〜15に示したDNAによってコー
ドされたタンパク質、または図16または K11 (欠損)−MFKHLR..... K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K26 MPTVYLCSEQ−IRVLTES−MF
KLHR..... K−8 MNASSRNVFDTL−IRVLTES−
MFKLHR..... および K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... に示されているタンパク質のいずれかの欠損を含めた約
最初の26個のN末端アミノ酸のいずれかをコードする
DNAを有するヒト腎臓カリウムチャンネルタンパク質
をコードする単離されたDNA分子、またはその前記D
NA分子のいずれかに90%相同のDNA分子を提供す
る。
【0017】また、本発明は、前記のごとき哺乳動物細
胞を用いて、ヒト腎臓カリウムチャンネル活性を調節す
る化合物をスクリーニングする方法を提供する。該方法
は以下の:a)クローン化K+チャンネルを発現する細
胞を密集するまで増殖させ、b)a)の細胞を平衡塩溶
液で平衡化し、c)平衡化細胞のベースライン測定を行
い、d)一のテスト化合物またはテスト化合物のカクテ
ルを該細胞に添加して、膜ポテンシャルの変化を記録
し、e)野生型上にまたは偽トランスフェクトした対照
株上にK+を発現する細胞を脱分極化させる化合物をテ
ストして選択性を確立し、f)選択的なK+遮断を示す
化合物を選択する工程からなる。
胞を用いて、ヒト腎臓カリウムチャンネル活性を調節す
る化合物をスクリーニングする方法を提供する。該方法
は以下の:a)クローン化K+チャンネルを発現する細
胞を密集するまで増殖させ、b)a)の細胞を平衡塩溶
液で平衡化し、c)平衡化細胞のベースライン測定を行
い、d)一のテスト化合物またはテスト化合物のカクテ
ルを該細胞に添加して、膜ポテンシャルの変化を記録
し、e)野生型上にまたは偽トランスフェクトした対照
株上にK+を発現する細胞を脱分極化させる化合物をテ
ストして選択性を確立し、f)選択的なK+遮断を示す
化合物を選択する工程からなる。
【0018】本発明は、機能性カリウムATP開閉チャ
ンネルタンパク質をコードするヒトDNAのクローニン
グおよび単離に関する。一の具体例において、本発明
は、イオンチャンネル研究用の発現系としてのアフリカ
ツメガエル(Xenopus laevis)卵細胞を用いることによ
り立証されるごとくヒトカリウムATP開閉チャンネル
タンパク質をコードする機能性cDNAクローンをまず
単離することよりなる。細胞表面に機能性ヒトカリウム
ATP開閉チャンネルを発現する哺乳動物および細菌細
胞系を、薬理学的および生理学的な方法を用いることに
よって決定し記載する。かくして、このATP開閉チャ
ンネルタンパク質ファミリーの特殊なメンバーを研究す
る初めての明確な細胞系を確立した。もう1つの具体例
において、これらのヒトカリウムATP開閉チャンネル
は、大容量スクリーニング操作するのを示す。
ンネルタンパク質をコードするヒトDNAのクローニン
グおよび単離に関する。一の具体例において、本発明
は、イオンチャンネル研究用の発現系としてのアフリカ
ツメガエル(Xenopus laevis)卵細胞を用いることによ
り立証されるごとくヒトカリウムATP開閉チャンネル
タンパク質をコードする機能性cDNAクローンをまず
単離することよりなる。細胞表面に機能性ヒトカリウム
ATP開閉チャンネルを発現する哺乳動物および細菌細
胞系を、薬理学的および生理学的な方法を用いることに
よって決定し記載する。かくして、このATP開閉チャ
ンネルタンパク質ファミリーの特殊なメンバーを研究す
る初めての明確な細胞系を確立した。もう1つの具体例
において、これらのヒトカリウムATP開閉チャンネル
は、大容量スクリーニング操作するのを示す。
【0019】定義.本明細書で用いる略語および語句は
当業者によく知られたものであろう。いくつかの語句に
ついては、以下の節でさらに十分に記載する。
当業者によく知られたものであろう。いくつかの語句に
ついては、以下の節でさらに十分に記載する。
【0020】I.機能性ヒトカリウムチャンネルDNA
クローンの単離
クローンの単離
【0021】1.ラット腎臓cDNA PvuII/BamHI
断片の単離 、(出典明示して本明細書の一部とみなす)ホー,ケイ
(Ho,K)らの方法(「クローニング・アンド・エクスプ
レッション・オブ・アン・インワードリー・レクティフ
ァイング・エイティーピー−レギュレーティッド・ポタ
シウム・チャンネル(Cloning and expression of an i
nwardly rectifying ATP-regulated potassium chan
nel)」、ネイチャー(Nature)、第362巻、31−38
頁(1993年3月4日))を用いて、プラスミドpSP
ORTに組み込んだROM−K1と命名したラット腎臓
ATP−カリウムチャネルcDNAを得る。プラスミド
pSPORT由来のこのラット腎臓ATP−カリウムチ
ャンネルcDNAを制限エンドヌクレアーゼPvuIIおよ
びBamHIで完全に消化する。ROM−K1の完全なオ
ープン・リーディング・フレームを含有する得られた
1.3キロベースのインサートDNAを、分取用アガロ
ースゲル電気泳動により精製する。
断片の単離 、(出典明示して本明細書の一部とみなす)ホー,ケイ
(Ho,K)らの方法(「クローニング・アンド・エクスプ
レッション・オブ・アン・インワードリー・レクティフ
ァイング・エイティーピー−レギュレーティッド・ポタ
シウム・チャンネル(Cloning and expression of an i
nwardly rectifying ATP-regulated potassium chan
nel)」、ネイチャー(Nature)、第362巻、31−38
頁(1993年3月4日))を用いて、プラスミドpSP
ORTに組み込んだROM−K1と命名したラット腎臓
ATP−カリウムチャネルcDNAを得る。プラスミド
pSPORT由来のこのラット腎臓ATP−カリウムチ
ャンネルcDNAを制限エンドヌクレアーゼPvuIIおよ
びBamHIで完全に消化する。ROM−K1の完全なオ
ープン・リーディング・フレームを含有する得られた
1.3キロベースのインサートDNAを、分取用アガロ
ースゲル電気泳動により精製する。
【0022】2.ラット断片の放射性同 位元素標識 単離したラット腎臓cDNA PvuII/BamHI断片を、
DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントの存在下
にα−32P−dATPおよびランダムヘキサマーを用い
て放射性同位元素標識する。
DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントの存在下
にα−32P−dATPおよびランダムヘキサマーを用い
て放射性同位元素標識する。
【0023】3.ヒトK−チャンネルc DNAを含有す
る組換えバクテリオファージの単離 バクテリオファージ・ベクター ラムダgt10中のヒ
ト腎臓cDNAライブラリーをイー・コリ(E.coli)C
600 hfl-株に感染させ、400,000の独立し
た組換え体を寒天板にプレートする。寒天板のレプリカ
をナイロン膜に調製し、変性ファージDNAを焼付けに
よりフィルター上に固定化させる。該レプリカナイロン
を緩衝液中でプレハイブリダイズさせて非特異的な結合
サイトをブロックし、次いで、ROM−K1の32Pラン
ダムプライマー標識PvuII/BamHI断片とハイブリダイ
ズさせる。次いで、65℃にて該フィルターを0.3M
NaCl/0.1% SDSで洗浄する。フィルター上の
放射活性を、増感紙と一緒に−70℃でオートラジオグ
ラフィーに付して測定する。レプリカ上の陽性バクテリ
オファージを寒天板から単離し、前記のホー(Ho)によ
るネイチャー(Nature)の文献に記載のごとく希釈平板
および再スクリーニングによりクローン化する。
る組換えバクテリオファージの単離 バクテリオファージ・ベクター ラムダgt10中のヒ
ト腎臓cDNAライブラリーをイー・コリ(E.coli)C
600 hfl-株に感染させ、400,000の独立し
た組換え体を寒天板にプレートする。寒天板のレプリカ
をナイロン膜に調製し、変性ファージDNAを焼付けに
よりフィルター上に固定化させる。該レプリカナイロン
を緩衝液中でプレハイブリダイズさせて非特異的な結合
サイトをブロックし、次いで、ROM−K1の32Pラン
ダムプライマー標識PvuII/BamHI断片とハイブリダイ
ズさせる。次いで、65℃にて該フィルターを0.3M
NaCl/0.1% SDSで洗浄する。フィルター上の
放射活性を、増感紙と一緒に−70℃でオートラジオグ
ラフィーに付して測定する。レプリカ上の陽性バクテリ
オファージを寒天板から単離し、前記のホー(Ho)によ
るネイチャー(Nature)の文献に記載のごとく希釈平板
および再スクリーニングによりクローン化する。
【0024】4.クローン化ファージ保 存株からのバク
テリオファージDNAの調製 前記の工程3.からのハイブリダイゼーション陽性クロ
ーンのクローン化バクテリオファージ保存株を用いて、
イー・コリ(E.coli)に感染させ、次いでDNAを単離
することによって、バクテリオファージDNAを調製す
る。イー・コリ(E.coli)培養をクローン化ファージで
感染させ、バクテリオファージ粒子のポリエチレングリ
コール沈澱、続いてのバクテリオファージ外皮タンパク
質の破壊を組み合わせて感染培養からバクテリオファー
ジDNAを単離する。この方法で調製したバクテリオフ
ァージDNAをEcoRIで消化してcDNAインサート
を得る。遊離したインサートcDNAの大きさは、アガ
ロースゲルでサイズ分画して測定する。次いで、分画し
たcDNAを毛管現象によってナイロン膜に移し、前記
のごとき、ROM−K1の32P−PvuII/BamHI断片へ
のハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィ
ーにより相同配列を検出する。
テリオファージDNAの調製 前記の工程3.からのハイブリダイゼーション陽性クロ
ーンのクローン化バクテリオファージ保存株を用いて、
イー・コリ(E.coli)に感染させ、次いでDNAを単離
することによって、バクテリオファージDNAを調製す
る。イー・コリ(E.coli)培養をクローン化ファージで
感染させ、バクテリオファージ粒子のポリエチレングリ
コール沈澱、続いてのバクテリオファージ外皮タンパク
質の破壊を組み合わせて感染培養からバクテリオファー
ジDNAを単離する。この方法で調製したバクテリオフ
ァージDNAをEcoRIで消化してcDNAインサート
を得る。遊離したインサートcDNAの大きさは、アガ
ロースゲルでサイズ分画して測定する。次いで、分画し
たcDNAを毛管現象によってナイロン膜に移し、前記
のごとき、ROM−K1の32P−PvuII/BamHI断片へ
のハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィ
ーにより相同配列を検出する。
【0025】5.選択したバクテリオフ ァージDNAの
配列決定 異なったEcoRI制限酵素切断パターンを有するクロー
ンから調製したバクテリオファージDNAを選抜し、次
いで、サイクル・ジデオキシ鎖停止反応により塩基配列
を決定する。該ジデオキシ鎖停止法では、ユナイテッド
・ステイツ・バイオケミカルズ社(United States Bi
ochemicals)(オハイオ州、クリーブランド(Clevelan
d,OH))から入手可能なシークエナーゼ(SEQUEN
ASE(TM))法および製品を用いることができる。その
後に、反応生成物を変性ゲルで分離し、分画されたDN
Aバンドをオートラジオグラフィーで検出し、ゲルをマ
ニュアルで判読する。
配列決定 異なったEcoRI制限酵素切断パターンを有するクロー
ンから調製したバクテリオファージDNAを選抜し、次
いで、サイクル・ジデオキシ鎖停止反応により塩基配列
を決定する。該ジデオキシ鎖停止法では、ユナイテッド
・ステイツ・バイオケミカルズ社(United States Bi
ochemicals)(オハイオ州、クリーブランド(Clevelan
d,OH))から入手可能なシークエナーゼ(SEQUEN
ASE(TM))法および製品を用いることができる。その
後に、反応生成物を変性ゲルで分離し、分画されたDN
Aバンドをオートラジオグラフィーで検出し、ゲルをマ
ニュアルで判読する。
【0026】6.代替ヒトK−ATPチ ャンネルDNA
のクローニング DNA配列分析により、全cDNA中に含有され、代替
5’配列に挟まれた共通のコア−エキソンが明らかにさ
れた。さらに、これらの代替5’配列を、逆転写酵素/
ポリメラーゼ鎖反応の(RT/PCR)増幅およびcDN
A末端の5’迅速増幅(RACE)分析の組み合わせを用
いて各々の転写産物につき転写開始部位をマッピングす
ることによって特徴付けた。コア・エキソン配列(HR
OM4)に相補的な合成オリゴヌクレオチド・プライマ
ーならびにMMLV逆転写酵素を用いてヒト腎臓全RN
Aを逆転写させた。次いで、cDNA産物を、アンカー
・プライマー(5’RACE)またはK26 cDNAの
5’非翻訳配列に特異的なプライマー(HROM−10)
の一方を用いてPCR増幅させた。これによりK−8、
K11、K11+、K26およびK26+という5つの異
なったcDNAを単離した。該PCR産物をプラスミド
ベクターにサブクローニングし、前記のごとく両鎖の完
全な塩基配列を決定した。バクテリオファージcDNA
配列ならびにRT−PCRおよび5’RACE産物の両
配列の組合せを用いてK−8、K11、K11+、K2
6およびK26+cDNAの完全な塩基配列を割り当て
た(図1〜3、4〜6、7〜9、10〜12、13〜1
5)。
のクローニング DNA配列分析により、全cDNA中に含有され、代替
5’配列に挟まれた共通のコア−エキソンが明らかにさ
れた。さらに、これらの代替5’配列を、逆転写酵素/
ポリメラーゼ鎖反応の(RT/PCR)増幅およびcDN
A末端の5’迅速増幅(RACE)分析の組み合わせを用
いて各々の転写産物につき転写開始部位をマッピングす
ることによって特徴付けた。コア・エキソン配列(HR
OM4)に相補的な合成オリゴヌクレオチド・プライマ
ーならびにMMLV逆転写酵素を用いてヒト腎臓全RN
Aを逆転写させた。次いで、cDNA産物を、アンカー
・プライマー(5’RACE)またはK26 cDNAの
5’非翻訳配列に特異的なプライマー(HROM−10)
の一方を用いてPCR増幅させた。これによりK−8、
K11、K11+、K26およびK26+という5つの異
なったcDNAを単離した。該PCR産物をプラスミド
ベクターにサブクローニングし、前記のごとく両鎖の完
全な塩基配列を決定した。バクテリオファージcDNA
配列ならびにRT−PCRおよび5’RACE産物の両
配列の組合せを用いてK−8、K11、K11+、K2
6およびK26+cDNAの完全な塩基配列を割り当て
た(図1〜3、4〜6、7〜9、10〜12、13〜1
5)。
【0027】7.クローンおよび該クロ ーンの選択した
誘導体の選択 該K26クローンのDNA配列は、389アミノ酸残基
のタンパク質をコードする一本鎖オープン・リーディン
グ・フレームを含有し、これは1つの重要な相違を有し
てラット腎臓ROM−K1カリウムチャンネルに対しか
なりの配列同一性を示す。N−末端ドメインに見い出さ
れる実際のアミノ酸残基、最初の26アミノ酸、特に最
初の10アミノ酸は、ラット配列の分析から通常予測さ
れるようなものとは驚くべきかつ予期せぬ相違を示す。
タンパク質の形質膜への挿入の前に細胞内の空間に存在
するN−末端アミノ酸残基は、ラットの配列から予想さ
れるよりも大きな発散、すなわち、同一および同様なチ
ャンネルタンパク質で見い出される高い相同性を前提と
すると、予想されていたよりもさらに高い発散を示す。
誘導体の選択 該K26クローンのDNA配列は、389アミノ酸残基
のタンパク質をコードする一本鎖オープン・リーディン
グ・フレームを含有し、これは1つの重要な相違を有し
てラット腎臓ROM−K1カリウムチャンネルに対しか
なりの配列同一性を示す。N−末端ドメインに見い出さ
れる実際のアミノ酸残基、最初の26アミノ酸、特に最
初の10アミノ酸は、ラット配列の分析から通常予測さ
れるようなものとは驚くべきかつ予期せぬ相違を示す。
タンパク質の形質膜への挿入の前に細胞内の空間に存在
するN−末端アミノ酸残基は、ラットの配列から予想さ
れるよりも大きな発散、すなわち、同一および同様なチ
ャンネルタンパク質で見い出される高い相同性を前提と
すると、予想されていたよりもさらに高い発散を示す。
【0028】K−8cDNAが、ラット腎臓ROM−K
1チャンネルと同じ長さであるヒト種の相同物をコード
していることに注意されたい。ROM−K1をK−8と
比較した場合、重要なアミノ酸の相違があり、それに相
当するDNAは異なるが、ラットおよびヒトの双方は同
様な異なったアミノ酸末端を有する。意義深いことに
は、K11、K−11+、K26、K26+、および本発
明者らがK2およびK−6と呼ぶ他の2つのK+チャン
ネルタンパク質は、この重要な領域に異なった長さなら
びに異なった型のアミノ酸を有する。この相違は、ラッ
トの配列のみを前提としても、予期されなかったもので
ある。
1チャンネルと同じ長さであるヒト種の相同物をコード
していることに注意されたい。ROM−K1をK−8と
比較した場合、重要なアミノ酸の相違があり、それに相
当するDNAは異なるが、ラットおよびヒトの双方は同
様な異なったアミノ酸末端を有する。意義深いことに
は、K11、K−11+、K26、K26+、および本発
明者らがK2およびK−6と呼ぶ他の2つのK+チャン
ネルタンパク質は、この重要な領域に異なった長さなら
びに異なった型のアミノ酸を有する。この相違は、ラッ
トの配列のみを前提としても、予期されなかったもので
ある。
【0029】異なったヒトアミノ酸末端の配列を以下の
表1に示す。
表1に示す。
【0030】
【表1】K11 (欠損)−MFKHLR..... K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K26 MPTVYLCSEQ−IRVLTES−MF
KLHR..... K−8 MNASSRNVFDTL−IRVLTES−
MFKLHR..... K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... 特許請求の範囲に記載された5種のDNA配列を含有す
るエシェリキア・コリ(Escherichia coli)の培養は、
ブダペスト条約下、1994年4月28日にアメリカ合
衆国、イリノイ州、ペオリアのアグリカルチュラル・リ
サーチ・サービス・カルチャー・コレクション(NRR
L)(Agricultural Research Culture Collectio
n)に寄託している。当該受託番号は、各々、NRRL
B 21244、NRRL B 21245、NRRL B
21246、NRRL B 21247、NRRL B
21248である。
R..... K26 MPTVYLCSEQ−IRVLTES−MF
KLHR..... K−8 MNASSRNVFDTL−IRVLTES−
MFKLHR..... K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... 特許請求の範囲に記載された5種のDNA配列を含有す
るエシェリキア・コリ(Escherichia coli)の培養は、
ブダペスト条約下、1994年4月28日にアメリカ合
衆国、イリノイ州、ペオリアのアグリカルチュラル・リ
サーチ・サービス・カルチャー・コレクション(NRR
L)(Agricultural Research Culture Collectio
n)に寄託している。当該受託番号は、各々、NRRL
B 21244、NRRL B 21245、NRRL B
21246、NRRL B 21247、NRRL B
21248である。
【0031】かくして、K2は、ROM−K1より8残
基少ない配列を有し、一方K−6は、ROM−K1より
7残基多い配列を有する。これらの最初の26または同
様なN−末端アミノ酸は、タンパク質の最も重要な多様
性領域であり、該タンパク質の残りの部分は高い相同性
を有している。このN−末端領域における相違は、タン
パク質の機能的な相違となりうることが研究から示され
ている。本明細書で開示したラットROM−K1および
K8は、ほとんどもしくは全くATP阻害を示さない。
内因性のK+チャンネルは、ATPによって阻害され
る。従って、他の変異物のうちの1つがATP阻害を示
すということはありうる。K11は腎臓の肥大上行性肢
の中で最も豊富に存在するタンパク質のようである。腎
臓では、機能的なK+チャンネルがATPにより阻害さ
れ、よってタンパク質変異物をATPによる阻害のテス
トにかけ、ATPにより阻害されるタンパク質をK+遮
断剤のスクリーニングに用いることは論理的であろう。
他の機能的な相違は、他のN−末端配列と関連しうる。
基少ない配列を有し、一方K−6は、ROM−K1より
7残基多い配列を有する。これらの最初の26または同
様なN−末端アミノ酸は、タンパク質の最も重要な多様
性領域であり、該タンパク質の残りの部分は高い相同性
を有している。このN−末端領域における相違は、タン
パク質の機能的な相違となりうることが研究から示され
ている。本明細書で開示したラットROM−K1および
K8は、ほとんどもしくは全くATP阻害を示さない。
内因性のK+チャンネルは、ATPによって阻害され
る。従って、他の変異物のうちの1つがATP阻害を示
すということはありうる。K11は腎臓の肥大上行性肢
の中で最も豊富に存在するタンパク質のようである。腎
臓では、機能的なK+チャンネルがATPにより阻害さ
れ、よってタンパク質変異物をATPによる阻害のテス
トにかけ、ATPにより阻害されるタンパク質をK+遮
断剤のスクリーニングに用いることは論理的であろう。
他の機能的な相違は、他のN−末端配列と関連しうる。
【0032】これらの全ヒトタンパク質配列、それらを
コードするDNA、それらの自明な変異物、少なくとも
90%の相同性が期待される以外は保存的置換が可能な
それらの相同配列は、本明細書に記載した発明として包
含される。最初の26または同様なN−末端配列、もし
くはそれらの不存在または欠損は非常に重要であるが、
配列中のいずれの位置にも保存性の置換が予想され、こ
れらの全ては本発明に包含される。
コードするDNA、それらの自明な変異物、少なくとも
90%の相同性が期待される以外は保存的置換が可能な
それらの相同配列は、本明細書に記載した発明として包
含される。最初の26または同様なN−末端配列、もし
くはそれらの不存在または欠損は非常に重要であるが、
配列中のいずれの位置にも保存性の置換が予想され、こ
れらの全ては本発明に包含される。
【0033】II.ヒトカリウムチャンネルDNAを組み
込む適当なベクターの調製
込む適当なベクターの調製
【0034】1.pGEM7ベクター a.クローン・コーディング配列の調製 ラムダDNAをKpnI/AccI、Xho/AccIまたはMunIで
各々制限酵素消化してK−8、K11およびK26クロ
ーンのオープン・リーディング・フレームを得る。該D
NA断片を分取用アガロースゲル電気泳動で精製する。 b.クローンのプラスミドベクターへの導入 該K−8、K11およびK26 cDNA断片をpSP
64−ポリA(K−8およびK11)またはpGEM7
(K26)のどちらか一方のマルチ・クローニング・サイ
トにサブクローニングして、K−8/pSP64、K1
1/pSP64またはpGEM7/K26をそれぞれ得
る。
各々制限酵素消化してK−8、K11およびK26クロ
ーンのオープン・リーディング・フレームを得る。該D
NA断片を分取用アガロースゲル電気泳動で精製する。 b.クローンのプラスミドベクターへの導入 該K−8、K11およびK26 cDNA断片をpSP
64−ポリA(K−8およびK11)またはpGEM7
(K26)のどちらか一方のマルチ・クローニング・サイ
トにサブクローニングして、K−8/pSP64、K1
1/pSP64またはpGEM7/K26をそれぞれ得
る。
【0035】2.pSVL/K26ベクター a.pGEM7/K26プラスミドを制限エンドヌクレ
アーゼXhoIおよびBamHIで二重消化し、得られた断片
を分取用アガロースゲル電気泳動で精製する。 b.単離したK26のXhoI/BamHI断片を一時的な発
現ベクター(transientexpression vector)pSVLにサ
ブクローニングして発現プラスミドpSVL/K26を
得る。
アーゼXhoIおよびBamHIで二重消化し、得られた断片
を分取用アガロースゲル電気泳動で精製する。 b.単離したK26のXhoI/BamHI断片を一時的な発
現ベクター(transientexpression vector)pSVLにサ
ブクローニングして発現プラスミドpSVL/K26を
得る。
【0036】3.pCEP4ベクター a.K26の全コーディング配列を含有するXhoI/Bam
HI断片を、発現ベクターpCEP4にサブクローニン
グして発現ベクターpCEP/K26を得る。
HI断片を、発現ベクターpCEP4にサブクローニン
グして発現ベクターpCEP/K26を得る。
【0037】4.pMEPベクター a.K26の全コーディング配列を含有するXhoI/Bam
HI断片を、発現ベクターpMEPにサブクローニング
して発現ベクターpMEP/K26を得る。
HI断片を、発現ベクターpMEPにサブクローニング
して発現ベクターpMEP/K26を得る。
【0038】5.pMAL2c/K26ベクター a.K26の全コーディング配列を、適当な制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位を含有するプライマーを用いてポ
リメラーゼ鎖反応(PCR)に付し、発現に適用させる。 b.構築したPvuII/BamHI PCR断片を細菌発現ベ
クターpMAL2cにサブクローニングする。 c.該PCR産物の一体化を、ジデオキシ鎖停止法を用
いたDNA塩基配列決定により確認する。
ヌクレアーゼ認識部位を含有するプライマーを用いてポ
リメラーゼ鎖反応(PCR)に付し、発現に適用させる。 b.構築したPvuII/BamHI PCR断片を細菌発現ベ
クターpMAL2cにサブクローニングする。 c.該PCR産物の一体化を、ジデオキシ鎖停止法を用
いたDNA塩基配列決定により確認する。
【0039】6.pYESIベクター a.K26の全コーディング配列を、適当な制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位を含有するプライマーを用いてポ
リメラーゼ鎖反応(PCR)に付し、発現に適用させる。 b.構築したNOTI PCR断片を細菌発現ベクターp
YESIにサブクローニングする。 c.該PCR産物の一体化を、ジデオキシ鎖停止法を用
いたDNA塩基配列決定により確認する。
ヌクレアーゼ認識部位を含有するプライマーを用いてポ
リメラーゼ鎖反応(PCR)に付し、発現に適用させる。 b.構築したNOTI PCR断片を細菌発現ベクターp
YESIにサブクローニングする。 c.該PCR産物の一体化を、ジデオキシ鎖停止法を用
いたDNA塩基配列決定により確認する。
【0040】III.ヒトカリウムチャンネルDNAクロ
ーンによりコードされるタンパク質の発現
ーンによりコードされるタンパク質の発現
【0041】1.COS7細胞におけるK26クローン
の一時的な 発現 a.pSVL/K26発現プラスミドおよびカチオン性
リポソームDOTAPを用いてCOS7細胞をトランス
フェクトする。このカチオン性リポソームは、ベーリン
ガー・マンハイム社(Boehlinger Mannheim)(インディ
アナ州、インディアナポリス(Indianapolis,Indian
a))から入手可能である。機能的な発現は、転写分析に
より確認し、機能的な発現は、トランスフェクトした細
胞の静止状態の膜ポテンシャルに対するBa2+の効果を
測定することにより光学的にモニターする。以下の「実
施例」を参照せよ。
の一時的な 発現 a.pSVL/K26発現プラスミドおよびカチオン性
リポソームDOTAPを用いてCOS7細胞をトランス
フェクトする。このカチオン性リポソームは、ベーリン
ガー・マンハイム社(Boehlinger Mannheim)(インディ
アナ州、インディアナポリス(Indianapolis,Indian
a))から入手可能である。機能的な発現は、転写分析に
より確認し、機能的な発現は、トランスフェクトした細
胞の静止状態の膜ポテンシャルに対するBa2+の効果を
測定することにより光学的にモニターする。以下の「実
施例」を参照せよ。
【0042】2.卵母細胞におけるK2 6クローンの一
時的な発現 a.K−8、K11およびK26クローンの卵母細胞発
現 i.卵母細胞におけるpSP64ポリA系 1.pSP64ポリAベクターをEcoRIで完全に消化
し、その産物をクレノー・ポリメラーゼを用いて満た
す。満たすための反応による平滑末端産物をNotIリン
カーと連結し、NotIで消化してNotIサイトを生成させ
る。 2.K−8、K11およびK26 pSP64ポリAプラ
スミドDNAをNotIで消化して直鎖化し、分取用ゲル
電気泳動により精製する。 3.BamHI−消化pGEM7/K26鋳型から、SP6
RNAポリメラーゼを用いてセンスcRNAを合成
し、同反応において5’末端をキャップ化する。 4.キャップ化cRNAをアフリカツメガエルの卵母細
胞にマイクロインジェクションし、72時間発現させ
る。 5.全細胞および脱着パッチ記録モード(detached patc
h recording mode)での電気生理学的な測定によるマイ
クロインジェクション72時間後にカリウムチャンネル
活性をモニターする。以下の「実施例」を参照せよ。
時的な発現 a.K−8、K11およびK26クローンの卵母細胞発
現 i.卵母細胞におけるpSP64ポリA系 1.pSP64ポリAベクターをEcoRIで完全に消化
し、その産物をクレノー・ポリメラーゼを用いて満た
す。満たすための反応による平滑末端産物をNotIリン
カーと連結し、NotIで消化してNotIサイトを生成させ
る。 2.K−8、K11およびK26 pSP64ポリAプラ
スミドDNAをNotIで消化して直鎖化し、分取用ゲル
電気泳動により精製する。 3.BamHI−消化pGEM7/K26鋳型から、SP6
RNAポリメラーゼを用いてセンスcRNAを合成
し、同反応において5’末端をキャップ化する。 4.キャップ化cRNAをアフリカツメガエルの卵母細
胞にマイクロインジェクションし、72時間発現させ
る。 5.全細胞および脱着パッチ記録モード(detached patc
h recording mode)での電気生理学的な測定によるマイ
クロインジェクション72時間後にカリウムチャンネル
活性をモニターする。以下の「実施例」を参照せよ。
【0043】3.哺乳動物細胞における K26DNAの
安定した発現 a.K26の、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、
アフリカミドリザル腎臓細胞(COS)、ヒト胎児腎臓細
胞およびマウスL−細胞での発現 i.pCEP/K26およびpMEP/K26ベクター発
現系 1.pMEP/K26およびpCEP/K26発現プラス
ミドならびにカチオン性リポソームDOTAPを用いて
チャイニーズハムスター卵巣、COS、ヒト胚性腎臓細
胞およびマウスL−細胞をトランスフェクトする。 2.ハイグロマイシンBの存在下に該細胞を培養して安
定したトランスフェクタントを選抜する。安定したクロ
ーン化細胞系を数回サブクローニングしてクローンの継
代性を確実とする。トランスフェクトした細胞における
K26の発現は、K26転写産物の分析(ノーザンブロ
ッティング分析およびRT−PCR)および機能アッセ
イを用いて確認する。後者のアッセイは、Ba2+添加後
にレポーター染色剤DiBACを用いて膜ポテンシャル
の変化を光学的に測定して行う。また、K26の発現も
電気生理学的な方法により測定する。以下の「実施例」
を参照せよ。
安定した発現 a.K26の、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、
アフリカミドリザル腎臓細胞(COS)、ヒト胎児腎臓細
胞およびマウスL−細胞での発現 i.pCEP/K26およびpMEP/K26ベクター発
現系 1.pMEP/K26およびpCEP/K26発現プラス
ミドならびにカチオン性リポソームDOTAPを用いて
チャイニーズハムスター卵巣、COS、ヒト胚性腎臓細
胞およびマウスL−細胞をトランスフェクトする。 2.ハイグロマイシンBの存在下に該細胞を培養して安
定したトランスフェクタントを選抜する。安定したクロ
ーン化細胞系を数回サブクローニングしてクローンの継
代性を確実とする。トランスフェクトした細胞における
K26の発現は、K26転写産物の分析(ノーザンブロ
ッティング分析およびRT−PCR)および機能アッセ
イを用いて確認する。後者のアッセイは、Ba2+添加後
にレポーター染色剤DiBACを用いて膜ポテンシャル
の変化を光学的に測定して行う。また、K26の発現も
電気生理学的な方法により測定する。以下の「実施例」
を参照せよ。
【0044】4.細菌細胞におけるK2 6DNAクロー
ンの安定した発現 a.pMAL2c/K26系 i.DH5αを含有するpMAL2c/K26プラスミド
の発現の誘導は、対数増殖期の培養にIPTGを添加す
ることにより誘導する。 ii.所望のタンパク質生成物の発現は、誘導した培養か
ら単離した細菌細胞のSDS−PAGE分析により確認
する。
ンの安定した発現 a.pMAL2c/K26系 i.DH5αを含有するpMAL2c/K26プラスミド
の発現の誘導は、対数増殖期の培養にIPTGを添加す
ることにより誘導する。 ii.所望のタンパク質生成物の発現は、誘導した培養か
ら単離した細菌細胞のSDS−PAGE分析により確認
する。
【0045】IV.ヒトカリウムチャンネルDNAクロー
ンによりコードされるタンパク質に基づく発現系を用い
たバイオアッセイ
ンによりコードされるタンパク質に基づく発現系を用い
たバイオアッセイ
【0046】この節では、ヒト腎臓ATP開閉カリウム
チャンネルおよび関連のカリウムチャンネルを発現する
細菌細胞、酵母細胞および/または哺乳動物細胞を用い
て、ヒト腎臓ATPカリウムチャンネル活性を調節する
化合物をスクリーニングする方法ならびに操作について
記載する。
チャンネルおよび関連のカリウムチャンネルを発現する
細菌細胞、酵母細胞および/または哺乳動物細胞を用い
て、ヒト腎臓ATPカリウムチャンネル活性を調節する
化合物をスクリーニングする方法ならびに操作について
記載する。
【0047】K26で安定してトランスフェクトした哺
乳動物細胞をマルチウェル組織培養皿の中で増殖させ
る。選択する組織培養皿は、96ウェルのものを包含す
る。他の培養皿を用いることもできる。K26を発現す
る哺乳動物細胞の膜ポテンシャルは、電位差感受性の蛍
光色素を用いて光学的に測定する。選択する色素は、ビ
ス(1,3-ジブチルバルビツール酸)トリメチンオキソノ
ール(DiBAC4(3))である。また、他の電位差感受
性の色素を用いることもできる。膜ポテンシャルの変化
は、高いバックグラウンドの非細胞性蛍光に対する細胞
性蛍光の変化を測定することにより検知する。全ウェル
蛍光ではなく、細胞に関連する蛍光を測定する。一時に
全96ウェルにおいて、高いバックグラウンドの非細胞
性蛍光に対する細胞性蛍光の変化を測定することが可能
な96ウェルプレート・リーダーを用いるのがさらによ
い膜ポテンシャルの変化を測定する系である。ノベルテ
ック社(NovelTech)(ミシガン州、アン・アーバー(An
n Arbor,Michigan))で製造され、販売されているレー
ザーシステムFLIPRもかかる系の一つである。スク
リーニングは、K26を発現する細胞に剤を添加するこ
とから構成される。K26を遮断する剤は細胞を脱分極
化させる。K26を活性化させる剤は細胞を過分極化さ
せる。特異性はいくつかの方法により決定する。特異性
の最初のテストは、目的の剤が偽トランスフェクトした
細胞の膜ポテンシャルを調節するか否かを確認すること
である。これらの細胞として、K26をクローン化して
いるがK26遺伝子産物を発現しないベクターが含有さ
れる。特異性の他のテストとして、目的の剤が他のK+
チャンネル活性を調節するか否かを確認することが含ま
れる。
乳動物細胞をマルチウェル組織培養皿の中で増殖させ
る。選択する組織培養皿は、96ウェルのものを包含す
る。他の培養皿を用いることもできる。K26を発現す
る哺乳動物細胞の膜ポテンシャルは、電位差感受性の蛍
光色素を用いて光学的に測定する。選択する色素は、ビ
ス(1,3-ジブチルバルビツール酸)トリメチンオキソノ
ール(DiBAC4(3))である。また、他の電位差感受
性の色素を用いることもできる。膜ポテンシャルの変化
は、高いバックグラウンドの非細胞性蛍光に対する細胞
性蛍光の変化を測定することにより検知する。全ウェル
蛍光ではなく、細胞に関連する蛍光を測定する。一時に
全96ウェルにおいて、高いバックグラウンドの非細胞
性蛍光に対する細胞性蛍光の変化を測定することが可能
な96ウェルプレート・リーダーを用いるのがさらによ
い膜ポテンシャルの変化を測定する系である。ノベルテ
ック社(NovelTech)(ミシガン州、アン・アーバー(An
n Arbor,Michigan))で製造され、販売されているレー
ザーシステムFLIPRもかかる系の一つである。スク
リーニングは、K26を発現する細胞に剤を添加するこ
とから構成される。K26を遮断する剤は細胞を脱分極
化させる。K26を活性化させる剤は細胞を過分極化さ
せる。特異性はいくつかの方法により決定する。特異性
の最初のテストは、目的の剤が偽トランスフェクトした
細胞の膜ポテンシャルを調節するか否かを確認すること
である。これらの細胞として、K26をクローン化して
いるがK26遺伝子産物を発現しないベクターが含有さ
れる。特異性の他のテストとして、目的の剤が他のK+
チャンネル活性を調節するか否かを確認することが含ま
れる。
【0048】本発明は、前記の記載から当業者に容易に
評価され理解されよう。以下の「実施例」では、本発明
実施の最良条件の詳細を提供し、さらに十分に完成発明
を説明する。それらは、本発明を限定するものではな
い。
評価され理解されよう。以下の「実施例」では、本発明
実施の最良条件の詳細を提供し、さらに十分に完成発明
を説明する。それらは、本発明を限定するものではな
い。
【0049】
I.機能性ヒトカリウムチャンネルDNAクローンの単
離 1.ラット腎臓cDNA PvuII/BamHI断 片の単離 ホー,ケイ(Ho,K)らにより記載されている方法(「ク
ローニング・アンド・エクスプレッション・オブ・アン
・インワードリー・レクチファイイング・エイティーピ
ー・レギュレイティド・ポタシウム・チャンネル(Clon
ing and expression of an inwardly rectifying AT
P-regulated potassium channel)」、ネイチャー(Nat
ure)、第362巻、31−38頁(1993年3月4
日))を用いて、ROM−K1と命名したラット腎臓AT
P−カリウムチャンネルcDNAを得る。プラスミドベ
クターpSPORT中のROM−K1 cDNAを、ア
ンピシリン選抜下にイー・コリ(E.coli) DH5α株に
て継代する(マニアティス(Maniatis)ら、モレキュラー
・クローニング(Molecular Cloning)、コールド・ス
プリング・ハーバー研究所(Cold Spring Harbor La
boratory)、1982)。精製したプラスミドDNAを、
制限エンドヌクレアーゼPvuIIおよびBamHIで二重消
化し、得られたROM−K1の全オープン・リーディン
グ・フレームを含有する1.3キロベースの断片を、分
取用アガロースゲル電気泳動およびその後の単離断片の
電気溶出により精製した。
離 1.ラット腎臓cDNA PvuII/BamHI断 片の単離 ホー,ケイ(Ho,K)らにより記載されている方法(「ク
ローニング・アンド・エクスプレッション・オブ・アン
・インワードリー・レクチファイイング・エイティーピ
ー・レギュレイティド・ポタシウム・チャンネル(Clon
ing and expression of an inwardly rectifying AT
P-regulated potassium channel)」、ネイチャー(Nat
ure)、第362巻、31−38頁(1993年3月4
日))を用いて、ROM−K1と命名したラット腎臓AT
P−カリウムチャンネルcDNAを得る。プラスミドベ
クターpSPORT中のROM−K1 cDNAを、ア
ンピシリン選抜下にイー・コリ(E.coli) DH5α株に
て継代する(マニアティス(Maniatis)ら、モレキュラー
・クローニング(Molecular Cloning)、コールド・ス
プリング・ハーバー研究所(Cold Spring Harbor La
boratory)、1982)。精製したプラスミドDNAを、
制限エンドヌクレアーゼPvuIIおよびBamHIで二重消
化し、得られたROM−K1の全オープン・リーディン
グ・フレームを含有する1.3キロベースの断片を、分
取用アガロースゲル電気泳動およびその後の単離断片の
電気溶出により精製した。
【0050】2.ラット断片の放射性同 位元素標識 1.3キロベースの制限断片である、単離したラット腎
臓cDNA PvuII/BamHIを、DNAポリメラーゼIの
クレノーフラグメントの存在下にα−32P−dATPお
よびランダムヘキサマーを用いて放射性同位元素で標識
した(エイ・ピー、ファインバーグ(A.P.Feinberg))
およびビー、フォーゲルシュタイン(B.Vogelstein)、
アナリティカル・バイオケミストリー(Anal.Bioche
m.)、第137巻、266頁(1984))。
臓cDNA PvuII/BamHIを、DNAポリメラーゼIの
クレノーフラグメントの存在下にα−32P−dATPお
よびランダムヘキサマーを用いて放射性同位元素で標識
した(エイ・ピー、ファインバーグ(A.P.Feinberg))
およびビー、フォーゲルシュタイン(B.Vogelstein)、
アナリティカル・バイオケミストリー(Anal.Bioche
m.)、第137巻、266頁(1984))。
【0051】3.ヒト陽性バクテリオフ ァージの調製 クローンテック社(Clonetech)(カリフォルニア州、パ
ロ・アルト(Palo Alto,California))から購入した
バクテリオファージベクター ラムダgt10の中のヒ
ト腎臓cDNAライブラリーをイー・コリ(E.coli)C
600hfl-株に感染させ、400,000の独立した
組換え体を寒天板にプレートする。寒天板のレプリカを
ナイロン膜に調製し、焼付けによってファージDNAを
フィルター上に固定化させる。レプリカナイロンを緩衝
液中でプレハイブリダイドさせて、非特異的な結合サイ
トをブロックし、次いで前記のごとく標識した32P−標
識PvuII/BamHI断片とハイブリダイズさせる。次い
で、該フィルターを65℃にて0.3M NaCl/0.1
% SDSで洗浄する。フィルター上の放射活性の座標
は、増感紙を用いた−70℃におけるオートラジオグラ
フィーにより検出する。一次スクリーニングから62個
のレプリカ陽性(replicate positive)を同定し、これら
各々のレプリカ陽性を限界希釈、次いで寒天培地上での
反復プレートならびに前記のごとき32P−標識ROM−
K1プローブでの再スクリーニングおよびオートラジオ
グラフィーによりクローン化する。
ロ・アルト(Palo Alto,California))から購入した
バクテリオファージベクター ラムダgt10の中のヒ
ト腎臓cDNAライブラリーをイー・コリ(E.coli)C
600hfl-株に感染させ、400,000の独立した
組換え体を寒天板にプレートする。寒天板のレプリカを
ナイロン膜に調製し、焼付けによってファージDNAを
フィルター上に固定化させる。レプリカナイロンを緩衝
液中でプレハイブリダイドさせて、非特異的な結合サイ
トをブロックし、次いで前記のごとく標識した32P−標
識PvuII/BamHI断片とハイブリダイズさせる。次い
で、該フィルターを65℃にて0.3M NaCl/0.1
% SDSで洗浄する。フィルター上の放射活性の座標
は、増感紙を用いた−70℃におけるオートラジオグラ
フィーにより検出する。一次スクリーニングから62個
のレプリカ陽性(replicate positive)を同定し、これら
各々のレプリカ陽性を限界希釈、次いで寒天培地上での
反復プレートならびに前記のごとき32P−標識ROM−
K1プローブでの再スクリーニングおよびオートラジオ
グラフィーによりクローン化する。
【0052】4.クローン化ファージ保 存株からのバク
テリオファージDNAの調製 バクテリオファージDNAは、イー・コリ(E.coli)に
感染させ、次いでDNAを単離することによって、前記
工程3.からの陽性クローンのクローン化ファージ保存
株から調製する。クローン化保存株からのバクテリオフ
ァージで感染したイー・コリ(E.coli)培養を用い、溶
菌させ、次いでポリエチレングリコールで沈澱させ、バ
クテリオファージ外皮蛋白を破壊させることによりバク
テリオファージDNAを調製する(マニアティス(Mania
tis)ら、モレキュラー・クローニング(Molecular Clo
ning)、コールド・スプリング・ハーバー研究所(Cold
Spring Harbor Laboratory)、1982)。精製した
バクテリオファージラムダDNAをEcoRIで分解して
分画化cDNAを得る。アガロースゲル上でサイズ分画
して、遊離したインサートcDNAの大きさを測定す
る。次いで、分画化cDNAを毛管作用によりナイロン
膜に移して、前記のごとき32P−PvuII/BamHI断片へ
のハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィ
ーにより相同性配列を検出する(サザン,イー(Souther
n,E)、モレキュラー・バイオロジー(Mol.Biol.)、
第98巻、503頁(1975))。相同性DNA配列
は、ROM−K1コーディング配列の種々の部分由来の
32P−標識DNA断片とハイブリダイズさせ、次いで前
記のごとく軽く洗浄することにより検出する。次いで、
単一のハイブリダイゼーションパターンを示すファージ
DNAをDNA配列分析に付す。
テリオファージDNAの調製 バクテリオファージDNAは、イー・コリ(E.coli)に
感染させ、次いでDNAを単離することによって、前記
工程3.からの陽性クローンのクローン化ファージ保存
株から調製する。クローン化保存株からのバクテリオフ
ァージで感染したイー・コリ(E.coli)培養を用い、溶
菌させ、次いでポリエチレングリコールで沈澱させ、バ
クテリオファージ外皮蛋白を破壊させることによりバク
テリオファージDNAを調製する(マニアティス(Mania
tis)ら、モレキュラー・クローニング(Molecular Clo
ning)、コールド・スプリング・ハーバー研究所(Cold
Spring Harbor Laboratory)、1982)。精製した
バクテリオファージラムダDNAをEcoRIで分解して
分画化cDNAを得る。アガロースゲル上でサイズ分画
して、遊離したインサートcDNAの大きさを測定す
る。次いで、分画化cDNAを毛管作用によりナイロン
膜に移して、前記のごとき32P−PvuII/BamHI断片へ
のハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィ
ーにより相同性配列を検出する(サザン,イー(Souther
n,E)、モレキュラー・バイオロジー(Mol.Biol.)、
第98巻、503頁(1975))。相同性DNA配列
は、ROM−K1コーディング配列の種々の部分由来の
32P−標識DNA断片とハイブリダイズさせ、次いで前
記のごとく軽く洗浄することにより検出する。次いで、
単一のハイブリダイゼーションパターンを示すファージ
DNAをDNA配列分析に付す。
【0053】5.選抜したバクテリオフ ァージDNAの
塩基配列決定 異なったEcoRI制限酵素パターン(restriction patter
n)を示すクローンからのバクテリオファージDNAを選
抜し、次いでサイクル・シークエンシングジデオキシ−
鎖停止反応(パーキン・エルマー−セータス社(Perkin
Elmer-Cetus)(コネチカット州、ノーウォーク(Norwa
lk,Connecticut))製、アンプリタック・キット(Ampli
Taq kit))を用いてバクテリオファージDNAから直接
各々のバクテリオファージのDNA配列を決定する。反
応生成物を1メーターのポリアクリルアミドゲル上で解
像し、次いで分画化DNAをオートラジオグラフィーに
より検出する。次いで、DNA配列をマニュアルで判読
する。
塩基配列決定 異なったEcoRI制限酵素パターン(restriction patter
n)を示すクローンからのバクテリオファージDNAを選
抜し、次いでサイクル・シークエンシングジデオキシ−
鎖停止反応(パーキン・エルマー−セータス社(Perkin
Elmer-Cetus)(コネチカット州、ノーウォーク(Norwa
lk,Connecticut))製、アンプリタック・キット(Ampli
Taq kit))を用いてバクテリオファージDNAから直接
各々のバクテリオファージのDNA配列を決定する。反
応生成物を1メーターのポリアクリルアミドゲル上で解
像し、次いで分画化DNAをオートラジオグラフィーに
より検出する。次いで、DNA配列をマニュアルで判読
する。
【0054】6.ヒト腎臓転写物5’末 端のマッピング ヒトの腎臓のライブラリーから単離されたバクテリオフ
ァージのcDNAの塩基配列の分析により、種々の5’
末端配列に融合した共通のコア エキソンが明らかにさ
れた。これらのcDNAを生じさせる転写物を、さらに
K−チャンネルの転写物のポリメラーゼ鎖反応(RT−
PCR)と結び付けた逆転写酵素によるcDNA合成に
よって解析した。第一鎖のcDNA合成は、オリゴdT
とMMLV逆転写酵素(ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ,ガイセルバーグ、メリーランド(Bethesda Res
earch Laboratories,Gaitherburg,Maryland ))を用
いて起点としヒト腎臓全RNA鋳型を用いてなされた。
第一鎖cDNA産物の一部を、K−8またはK11/K
26のcDNAのいずれかに特異的な5’末端のオリゴ
ヌクレオチド・プライマーと組み合わせ、コア−エキソ
ン(HROM−4)に特異的な、共通の3’末端オリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて、PCRにより増幅し
た。これらのPCR増幅の反応物を、アガロースゲル電
気泳動で、大きさにより分別し、電気溶出により回収し
た。おのおのの個々の断片を、DNAポリメラーゼIの
クレノ−フラグメントを用いて平滑末端化し、T4ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、SmaI消
化したpUC19にサブクローン化した。おのおののサ
ブクローン化したPCR産物の塩基配列を、シーケナー
ゼTM(SEQUENASETM)、(ユナイテッド・ステ
イツ・バイオケミカルズ、クリーブランド、オハイオ
(United States Biochemicals,Cleveland,Ohio))を
用いてジデオキシ鎖停止法により決定した。合成cDN
A配列をこのcDNA配列とRT−PCR産物から得ら
れた配列の組み合わせにより構築し、これは図4〜6に
示される。本発明者らの分析によりヒトの腎臓中の5個
の別個の転写物が明らかとされた。
ァージのcDNAの塩基配列の分析により、種々の5’
末端配列に融合した共通のコア エキソンが明らかにさ
れた。これらのcDNAを生じさせる転写物を、さらに
K−チャンネルの転写物のポリメラーゼ鎖反応(RT−
PCR)と結び付けた逆転写酵素によるcDNA合成に
よって解析した。第一鎖のcDNA合成は、オリゴdT
とMMLV逆転写酵素(ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ,ガイセルバーグ、メリーランド(Bethesda Res
earch Laboratories,Gaitherburg,Maryland ))を用
いて起点としヒト腎臓全RNA鋳型を用いてなされた。
第一鎖cDNA産物の一部を、K−8またはK11/K
26のcDNAのいずれかに特異的な5’末端のオリゴ
ヌクレオチド・プライマーと組み合わせ、コア−エキソ
ン(HROM−4)に特異的な、共通の3’末端オリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて、PCRにより増幅し
た。これらのPCR増幅の反応物を、アガロースゲル電
気泳動で、大きさにより分別し、電気溶出により回収し
た。おのおのの個々の断片を、DNAポリメラーゼIの
クレノ−フラグメントを用いて平滑末端化し、T4ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、SmaI消
化したpUC19にサブクローン化した。おのおののサ
ブクローン化したPCR産物の塩基配列を、シーケナー
ゼTM(SEQUENASETM)、(ユナイテッド・ステ
イツ・バイオケミカルズ、クリーブランド、オハイオ
(United States Biochemicals,Cleveland,Ohio))を
用いてジデオキシ鎖停止法により決定した。合成cDN
A配列をこのcDNA配列とRT−PCR産物から得ら
れた配列の組み合わせにより構築し、これは図4〜6に
示される。本発明者らの分析によりヒトの腎臓中の5個
の別個の転写物が明らかとされた。
【0055】7.クローンの選択.ヒト腎臓RNAから
単離した5個の別個の転写物によってコードされるオー
プン・リーディング・フレームの翻訳により、これらは
潜在的にヒト腎臓KATPチャンネルタンパク質の、三種
のアミノ末端の変種をコードすることが示された。おの
おのの転写物は二つの前述した膜貫通ドメイン、すなわ
ちシェイカーK−チャンネルH5ドメイン(Shaker K-
channel H5 domain)と、予測される一つのATP結合
部位に対し、注目すべき相同性を示す領域、の存在を含
む、全てのKATPチャンネルタンパク質であることの証
明を備えた蛋白質をコードしていた。
単離した5個の別個の転写物によってコードされるオー
プン・リーディング・フレームの翻訳により、これらは
潜在的にヒト腎臓KATPチャンネルタンパク質の、三種
のアミノ末端の変種をコードすることが示された。おの
おのの転写物は二つの前述した膜貫通ドメイン、すなわ
ちシェイカーK−チャンネルH5ドメイン(Shaker K-
channel H5 domain)と、予測される一つのATP結合
部位に対し、注目すべき相同性を示す領域、の存在を含
む、全てのKATPチャンネルタンパク質であることの証
明を備えた蛋白質をコードしていた。
【0056】クローンK−8は、92%以上がラット腎
臓ROM−K1に同一である391アミノ酸タンパク質
をコードする1173塩基対のオープン・リーディング
・フレームを含んでいた。クローンK26は、アミノ末
端(10アミノ酸残基)が完全に別個である以外は、K
−8に同一である389アミノ酸残基の蛋白質をコード
する単一のオープン−リーディング・フレーム(116
7塩基対)を含んでいた。最終的に、クローンK11、
K11+およびK26+のすべてが同じ372残基のチャ
ンネルタンパク質をコードしており、これはそれぞれK
−8およびK26からの、アミノ末端の19または17
残基を欠失したK−8またはK26のアミノ末端の不完
全な形であった。
臓ROM−K1に同一である391アミノ酸タンパク質
をコードする1173塩基対のオープン・リーディング
・フレームを含んでいた。クローンK26は、アミノ末
端(10アミノ酸残基)が完全に別個である以外は、K
−8に同一である389アミノ酸残基の蛋白質をコード
する単一のオープン−リーディング・フレーム(116
7塩基対)を含んでいた。最終的に、クローンK11、
K11+およびK26+のすべてが同じ372残基のチャ
ンネルタンパク質をコードしており、これはそれぞれK
−8およびK26からの、アミノ末端の19または17
残基を欠失したK−8またはK26のアミノ末端の不完
全な形であった。
【0057】それぞれのDNA配列を哺乳動物細胞での
発現(pCEPまたはpMEP)、卵母細胞での発現
(pSP64−ポリA)、細菌での発現(pMAL2
c)または酵母での発現(pYES)のためのベクター
で発現させるために開発し、それぞれの構築物を適当な
宿主で、種々のヒト腎臓KATPチャンネルを発現するた
めに用いた。
発現(pCEPまたはpMEP)、卵母細胞での発現
(pSP64−ポリA)、細菌での発現(pMAL2
c)または酵母での発現(pYES)のためのベクター
で発現させるために開発し、それぞれの構築物を適当な
宿主で、種々のヒト腎臓KATPチャンネルを発現するた
めに用いた。
【0058】8.クローンの精製.K26ラムダDNA
を制限エンドヌクレアーゼMunIで消化し、1.3キ
ロベースの断片を分取用アガロースゲル電気泳動で精製
した。
を制限エンドヌクレアーゼMunIで消化し、1.3キ
ロベースの断片を分取用アガロースゲル電気泳動で精製
した。
【0059】II.ヒトのカリウムチャンネルDNAを組
み込んだ適当なベクターの調製 1.pGEM7ベクター. 1.3キロベースのMunI制限酵素断片を、プラスミ
ドベクターpGEM7のEcoRIサイトにサブクロー
ンした。cRNAキャッピング .pGEM7/K26プラスミド
をBamHIで線状にした。線状にしたプラズミドを次
いで転写し、T7RNAポリメラーゼを用いて、7Me
Gppp5’Gでキャップした。 2.pSVL/K26ベクター. pGEM7/K26
プラスミドをXhoIおよびBamHIで二重消化し、
得られた断片をpSVLにサブクローンしてpSVL/
K26を得た。 3.pCEP4ベクター.K26のXhoI/BamH
I断片をプラスミドベクターpCEPにサブクローンし
て、pCEP/K26を得る。 4.pMEPベクター.K26のXhoI/BamHI
断片をプラスミドベクターpMEPにサブクローンし
て、pMEP/K26を得る。
み込んだ適当なベクターの調製 1.pGEM7ベクター. 1.3キロベースのMunI制限酵素断片を、プラスミ
ドベクターpGEM7のEcoRIサイトにサブクロー
ンした。cRNAキャッピング .pGEM7/K26プラスミド
をBamHIで線状にした。線状にしたプラズミドを次
いで転写し、T7RNAポリメラーゼを用いて、7Me
Gppp5’Gでキャップした。 2.pSVL/K26ベクター. pGEM7/K26
プラスミドをXhoIおよびBamHIで二重消化し、
得られた断片をpSVLにサブクローンしてpSVL/
K26を得た。 3.pCEP4ベクター.K26のXhoI/BamH
I断片をプラスミドベクターpCEPにサブクローンし
て、pCEP/K26を得る。 4.pMEPベクター.K26のXhoI/BamHI
断片をプラスミドベクターpMEPにサブクローンし
て、pMEP/K26を得る。
【0060】II.ヒトのカリウムチャンネルDNAクロ
ーンによりコードされる蛋白質の発現. 1.COS 7細胞におけるK 26クローンの一時的な
発現.pGEM7/K26プラスミドを、制限エンドヌ
クレアーゼXhoIおよびBamHIで完全に消化し、
K26のコーディング配列を含む1.3kbの断片を分
取用アガロースゲル電気泳動で単離した。この断片をプ
ラスミドベクターpSVLに連結し、連結による生成物
をコンピテントなイー・コリ(E.coli)DH5α
の細胞を形質転換するのに用いた。pSVL/K26発
現プラスミドを適当なクローンから調製し、精製したp
SVL/K26プラスミドDNAを、カチオン性リポソ
ーム・DOTAP(ベーリンガー・マンハイム、インデ
ィアナポリス、インディアナ(Boehringer Mannheim,I
ndianapolis,Indiana))を用いて、COS 7細胞を
形質転換するのに用いた。チャンネル活性をトランスフ
ェクション後、48〜72時間検出した。 2.哺乳動物細胞におけるK2 6 DNAクローンの安
定な発現. a.K26のチャイニーズ ハムスター卵巣(CH
O)、アフリカミドリザルの腎臓の細胞(COS)、ヒ
ト胚性腎臓およびマウスL−細胞での発現。 i.pCEP/K26またはpMEP/K26の発現プ
ラスミドを、カチオン性リポソーム・DOTAPを用い
て、COS 7細胞あるいはヒト胚性腎臓細胞(239
細胞)をトランスフェクトするのに用いた。トランスフ
ェクト後20時間で、細胞を、トランスフェクトされて
いない細胞を殺すために0.15〜0.5mgのハイグ
ロマイシンBで処理した。おのおののセルラインはシン
グル・セル・クローニングによって単離した。
ーンによりコードされる蛋白質の発現. 1.COS 7細胞におけるK 26クローンの一時的な
発現.pGEM7/K26プラスミドを、制限エンドヌ
クレアーゼXhoIおよびBamHIで完全に消化し、
K26のコーディング配列を含む1.3kbの断片を分
取用アガロースゲル電気泳動で単離した。この断片をプ
ラスミドベクターpSVLに連結し、連結による生成物
をコンピテントなイー・コリ(E.coli)DH5α
の細胞を形質転換するのに用いた。pSVL/K26発
現プラスミドを適当なクローンから調製し、精製したp
SVL/K26プラスミドDNAを、カチオン性リポソ
ーム・DOTAP(ベーリンガー・マンハイム、インデ
ィアナポリス、インディアナ(Boehringer Mannheim,I
ndianapolis,Indiana))を用いて、COS 7細胞を
形質転換するのに用いた。チャンネル活性をトランスフ
ェクション後、48〜72時間検出した。 2.哺乳動物細胞におけるK2 6 DNAクローンの安
定な発現. a.K26のチャイニーズ ハムスター卵巣(CH
O)、アフリカミドリザルの腎臓の細胞(COS)、ヒ
ト胚性腎臓およびマウスL−細胞での発現。 i.pCEP/K26またはpMEP/K26の発現プ
ラスミドを、カチオン性リポソーム・DOTAPを用い
て、COS 7細胞あるいはヒト胚性腎臓細胞(239
細胞)をトランスフェクトするのに用いた。トランスフ
ェクト後20時間で、細胞を、トランスフェクトされて
いない細胞を殺すために0.15〜0.5mgのハイグ
ロマイシンBで処理した。おのおののセルラインはシン
グル・セル・クローニングによって単離した。
【0061】3.K−8、K11および K26cRNA
の、アフリカツメガエル卵母細胞における機能的発現.
われわれは、アフリカツメガエルの卵母細胞における発
現によって、K−8,K11およびK26ポリペプチド
の電気生理学的特性を実験した。ポリアデニル化したc
RNA(100ng/μl溶液の45nl)を卵母細胞
に注入し、48〜72時間発現させた。K−8、K1
1、またはK26に注入後48時間後に、卵母細胞はそ
れぞれ、−90.08±1.90mV(n=9)、−9
7.2±0mV(n=1)、および−88.75±0.4
5mV(n=2)の静止膜電位を示し、これは比較的変
化せず第三日には87.89±1.57mV(n=7)お
よび−93±0.79mV(n=7)および−88.4±
2.11mV(n=4)であった。水を注入した対照の
卵母細胞は、約−40mVの平均静止膜電位を示した。
ROM−K cRNAを注入した卵母細胞の、かなりさ
らに負の電位は、これらのチャンネルの機能的発現によ
っており、これらの値は推量されるKのグラジエント
(2mM細胞外/100mM細胞内)から計算したK平
衡電位に近い。
の、アフリカツメガエル卵母細胞における機能的発現.
われわれは、アフリカツメガエルの卵母細胞における発
現によって、K−8,K11およびK26ポリペプチド
の電気生理学的特性を実験した。ポリアデニル化したc
RNA(100ng/μl溶液の45nl)を卵母細胞
に注入し、48〜72時間発現させた。K−8、K1
1、またはK26に注入後48時間後に、卵母細胞はそ
れぞれ、−90.08±1.90mV(n=9)、−9
7.2±0mV(n=1)、および−88.75±0.4
5mV(n=2)の静止膜電位を示し、これは比較的変
化せず第三日には87.89±1.57mV(n=7)お
よび−93±0.79mV(n=7)および−88.4±
2.11mV(n=4)であった。水を注入した対照の
卵母細胞は、約−40mVの平均静止膜電位を示した。
ROM−K cRNAを注入した卵母細胞の、かなりさ
らに負の電位は、これらのチャンネルの機能的発現によ
っており、これらの値は推量されるKのグラジエント
(2mM細胞外/100mM細胞内)から計算したK平
衡電位に近い。
【0062】電流を、発現しているK−8,K11およ
びK26のcRNAを発現している卵母細胞を用いて、
二つの微小電極による電気固定法の方法により記録し、
結果を図17〜22に示す。図17,18および19に
は、それぞれK−8,K11およびK26を注入した卵
母細胞からの50mM外部K+中で記録した典型的な電
流の記録を示す。図20,21および22において、Y
軸はマイクロアンペアでの電流であり、X軸はミリボル
トでの膜電位である。この対応するI−Vの関係を、図
20,21および22において中抜き丸で示す。全ての
場合において、保持電位−20より正の電位での電流は
外部へ向かっており、−20mVより負の電位での電流
は内部に向かっていた。内部へ向かう電流の振幅は常に
外部へ向かう電流の振幅より大きく、これは内方への整
流を起こしていた。
びK26のcRNAを発現している卵母細胞を用いて、
二つの微小電極による電気固定法の方法により記録し、
結果を図17〜22に示す。図17,18および19に
は、それぞれK−8,K11およびK26を注入した卵
母細胞からの50mM外部K+中で記録した典型的な電
流の記録を示す。図20,21および22において、Y
軸はマイクロアンペアでの電流であり、X軸はミリボル
トでの膜電位である。この対応するI−Vの関係を、図
20,21および22において中抜き丸で示す。全ての
場合において、保持電位−20より正の電位での電流は
外部へ向かっており、−20mVより負の電位での電流
は内部に向かっていた。内部へ向かう電流の振幅は常に
外部へ向かう電流の振幅より大きく、これは内方への整
流を起こしていた。
【0063】これらのクローン化したチャンネルの電流
の活動のタイムコースは、二つの異なったフェーズで似
ている:急速な、ほとんど瞬間的なフェーズと、それに
続くゆっくりした、時間に依存したフェーズである。一
度活性化されると、電流はどちらの方向でも衰退したり
不活性化させたりしない。1mMのBa2+は、選択的
に、K−8で最も顕著な、時間と電圧に依存した方法
で、内部電流を妨げる(図20,21,および22、黒
丸)。Ba2+による阻害は、流出に次いで逆転する(図
20,21および22、中抜き四角)。外方電流に対す
るBa2+の効果の欠失は、外部に移動する、競合するK
+イオンによって、そのチャンネル結合部位からのBa
2+の”ノック−オフ”効果を示唆するであろう。
の活動のタイムコースは、二つの異なったフェーズで似
ている:急速な、ほとんど瞬間的なフェーズと、それに
続くゆっくりした、時間に依存したフェーズである。一
度活性化されると、電流はどちらの方向でも衰退したり
不活性化させたりしない。1mMのBa2+は、選択的
に、K−8で最も顕著な、時間と電圧に依存した方法
で、内部電流を妨げる(図20,21,および22、黒
丸)。Ba2+による阻害は、流出に次いで逆転する(図
20,21および22、中抜き四角)。外方電流に対す
るBa2+の効果の欠失は、外部に移動する、競合するK
+イオンによって、そのチャンネル結合部位からのBa
2+の”ノック−オフ”効果を示唆するであろう。
【0064】チャンネルのK+選択性を考察するため
に、外部のKCl濃度を5mMから100mMに増加さ
せ、コリン Clを、重量オスモル濃度を維持するため
に置換した。図23〜28に示される結果は、K−8,
K11およびK26についての逆転電位(Erev)と、
外部K+濃度の間の関係を説明する(それぞれ図23,
24および25)。図23〜25において、Y軸はミリ
ボルトでの逆転電位(Erev)であり、X軸はミリモー
ラーでのカリウム濃度である。このデータはネルンスト
の関係に適合し、K−8に対しては57.87mV、K
11に対しては57.45mV,K26に対しては53.
53mVの、K+濃度の10の位当たりの変化の傾きを
生じ、この全てが室温におけるK+選択的電極に対する
理論的な値である58mVの中にあった。
に、外部のKCl濃度を5mMから100mMに増加さ
せ、コリン Clを、重量オスモル濃度を維持するため
に置換した。図23〜28に示される結果は、K−8,
K11およびK26についての逆転電位(Erev)と、
外部K+濃度の間の関係を説明する(それぞれ図23,
24および25)。図23〜25において、Y軸はミリ
ボルトでの逆転電位(Erev)であり、X軸はミリモー
ラーでのカリウム濃度である。このデータはネルンスト
の関係に適合し、K−8に対しては57.87mV、K
11に対しては57.45mV,K26に対しては53.
53mVの、K+濃度の10の位当たりの変化の傾きを
生じ、この全てが室温におけるK+選択的電極に対する
理論的な値である58mVの中にあった。
【0065】内方に整流したカリウムチャンネル中の膜
コンダクタンス、gkは、[K+]0が上昇するにつれて
増加する。膜コンダクタンス、gkと、[K+]0との間
の関係は、 gk=C[K+]0 Z で表され、ここでCは比例定数であり、[K+]0はmM
で表される外部のK+の濃度であり、Zはべき指数因子
である。本発明者らは、これらのチャンネルの傾きのコ
ンダクタンスを、5、10、25、50および100K
Cl(mMで)を含む溶液中で測定し、その結果を図2
6,27,および28に、それぞれK−8,K11,K
26について示した。図26,27,および28におい
て、Y軸はg/gmaxであり、X軸は[K+]0である。
チャンネルコンダクタンスと外部[K+]との関係は、
非線形であり、高[K+]では減少する。K−8,K1
1,K26のそれぞれに対するZの値の平均値は、0.
396±0.05(n=5)、0.383±0.097
(n=5)、および0.488±0.11(n=4)であ
る。これらの結果は、内方へ整流するチャンネルを通っ
てのK+イオンの浸透は、独立の法則から外れており、
これはチャンネル内でのイオン−イオン相互作用が起こ
っていることを意味するという結論をさらに支持する。
コンダクタンス、gkは、[K+]0が上昇するにつれて
増加する。膜コンダクタンス、gkと、[K+]0との間
の関係は、 gk=C[K+]0 Z で表され、ここでCは比例定数であり、[K+]0はmM
で表される外部のK+の濃度であり、Zはべき指数因子
である。本発明者らは、これらのチャンネルの傾きのコ
ンダクタンスを、5、10、25、50および100K
Cl(mMで)を含む溶液中で測定し、その結果を図2
6,27,および28に、それぞれK−8,K11,K
26について示した。図26,27,および28におい
て、Y軸はg/gmaxであり、X軸は[K+]0である。
チャンネルコンダクタンスと外部[K+]との関係は、
非線形であり、高[K+]では減少する。K−8,K1
1,K26のそれぞれに対するZの値の平均値は、0.
396±0.05(n=5)、0.383±0.097
(n=5)、および0.488±0.11(n=4)であ
る。これらの結果は、内方へ整流するチャンネルを通っ
てのK+イオンの浸透は、独立の法則から外れており、
これはチャンネル内でのイオン−イオン相互作用が起こ
っていることを意味するという結論をさらに支持する。
【0066】4.哺乳動物細胞における 、チャンネル活
性の光学上の測定.本発明者らは、また哺乳動物細胞に
おける瞬間的な、また安定なトランスフェクションの双
方におけるK26の機能的発現を実験した。最初に、K
26のK+チャンネルの発現の機能的発現を、電圧に感
受性の染料と、細胞内の蛍光での変化を記録するための
器械を用いて決定した。選択した染料はビス(1,3−
ジブチルバルビツール酸)トリメンチン オキソノー
ル)DiBAC4(3)である。他の、電圧に感受性の
染料を用いることもできた。膜電位の変化を光学的に測
定するために、細胞をカバーグラスのチャンバー上で継
代培養し、密集するまで増殖させた。分析の直前に、細
胞を20mM Hepes(EBSS−H)でpH7.
4に緩衝化したアールの平衡塩類溶液で数回洗浄し、次
いで5μM Dibac4(3)を含む同緩衝液に入れ
た。膜電位の蛍光イメージングを、細胞を5μMのDi
bac4(3)で37℃において15分間平衡化し、次
いでレーザーを基礎とする、イメージング・サイトメー
ター(ACAS570,メリディアン インスツルメン
ツ(Meridian Instruments))の台に据え付けた35℃
に温度を制御したミニ−インキュベーターに入れた後に
行った。ACAS 570は、細胞をアルゴンイオンレ
ーザーを用いて488nmで励起するよう作られてい
る。蛍光の放射を、535nmにおいて、495nmの
LPジクロイック ミラーと、525nmを中心とする
10nmのバンドを通すフィルターを用いて集めた。全
ての場合において、データをACASソフトウェアの内
部にある動的プログラム(Kinetic program)を用いて
少なくとも25分間、毎60秒ごとに集めた。蛍光の変
化をアップジョン・ラボラトリーズ(Upjohn Laborato
ries)で開発した記号論理学のモデルを用いて計算し
た。対照の実験によって、ジメチルスルホキシドやエタ
ノールのごとき溶媒の添加は0.8%(v/v)までの
濃度では効果がないことが確認された。エップスら(Ep
ps et. al.)による以前の研究(ケミストリー・アン
ド・フィジックス・オブ・リピッズ(Chemistry andPh
ysics of Lipids)、出版中 1944年)によっ
て、光学的膜電位の分析が定量的であることを示してい
る蛍光の変化と膜電位の変化の間の線形の関係を確認し
た。他のイメージング機器および/またはスペクトロフ
ルオロメーターもまた、膜電位における変化を光学的に
測定するのに使用できる。
性の光学上の測定.本発明者らは、また哺乳動物細胞に
おける瞬間的な、また安定なトランスフェクションの双
方におけるK26の機能的発現を実験した。最初に、K
26のK+チャンネルの発現の機能的発現を、電圧に感
受性の染料と、細胞内の蛍光での変化を記録するための
器械を用いて決定した。選択した染料はビス(1,3−
ジブチルバルビツール酸)トリメンチン オキソノー
ル)DiBAC4(3)である。他の、電圧に感受性の
染料を用いることもできた。膜電位の変化を光学的に測
定するために、細胞をカバーグラスのチャンバー上で継
代培養し、密集するまで増殖させた。分析の直前に、細
胞を20mM Hepes(EBSS−H)でpH7.
4に緩衝化したアールの平衡塩類溶液で数回洗浄し、次
いで5μM Dibac4(3)を含む同緩衝液に入れ
た。膜電位の蛍光イメージングを、細胞を5μMのDi
bac4(3)で37℃において15分間平衡化し、次
いでレーザーを基礎とする、イメージング・サイトメー
ター(ACAS570,メリディアン インスツルメン
ツ(Meridian Instruments))の台に据え付けた35℃
に温度を制御したミニ−インキュベーターに入れた後に
行った。ACAS 570は、細胞をアルゴンイオンレ
ーザーを用いて488nmで励起するよう作られてい
る。蛍光の放射を、535nmにおいて、495nmの
LPジクロイック ミラーと、525nmを中心とする
10nmのバンドを通すフィルターを用いて集めた。全
ての場合において、データをACASソフトウェアの内
部にある動的プログラム(Kinetic program)を用いて
少なくとも25分間、毎60秒ごとに集めた。蛍光の変
化をアップジョン・ラボラトリーズ(Upjohn Laborato
ries)で開発した記号論理学のモデルを用いて計算し
た。対照の実験によって、ジメチルスルホキシドやエタ
ノールのごとき溶媒の添加は0.8%(v/v)までの
濃度では効果がないことが確認された。エップスら(Ep
ps et. al.)による以前の研究(ケミストリー・アン
ド・フィジックス・オブ・リピッズ(Chemistry andPh
ysics of Lipids)、出版中 1944年)によっ
て、光学的膜電位の分析が定量的であることを示してい
る蛍光の変化と膜電位の変化の間の線形の関係を確認し
た。他のイメージング機器および/またはスペクトロフ
ルオロメーターもまた、膜電位における変化を光学的に
測定するのに使用できる。
【0067】K26の場合について、第三章(3)のデ
ータは、異種発現させたK26のK+チャンネルは、開
く確率が非常に高いことを示す。これらのデータによ
り、もしK26のK+チャンネルを発現する細胞にもし
K+チャンネル阻害剤を添加すると、チャンネルを発現
する細胞の膜電位は、脱分極することが予測される。図
29のデータによりこの予測が確認される。図29〜3
3において、RFと示されるY軸は、相対蛍光であり、
Tと示されるX軸は、分(min)での時間である。グ
リブリドやグリピジド等の化合物(例えば図32や3
3)を細胞の溶液に添加する場合、当該添加は7分に等
しい時間で行った。
ータは、異種発現させたK26のK+チャンネルは、開
く確率が非常に高いことを示す。これらのデータによ
り、もしK26のK+チャンネルを発現する細胞にもし
K+チャンネル阻害剤を添加すると、チャンネルを発現
する細胞の膜電位は、脱分極することが予測される。図
29のデータによりこの予測が確認される。図29〜3
3において、RFと示されるY軸は、相対蛍光であり、
Tと示されるX軸は、分(min)での時間である。グ
リブリドやグリピジド等の化合物(例えば図32や3
3)を細胞の溶液に添加する場合、当該添加は7分に等
しい時間で行った。
【0068】図29のデータは、1mMのBa++を、一
時的にK26K+チャンネルを発現している(中抜き三
角;図29)COS 7細胞に添加した時(矢印;図2
9)、膜電位は脱分極することを確実にした。ホー(H
o)らの以前の研究によって、内方に整流するK+チャン
ネルの、K26クラスをBa++が阻害することが確立さ
れている。1mMのBaCl2を野生型のCOS 7細
胞に添加したとき(矢印;図29)、膜電位に対しほと
んど効果がない(黒丸;図29)。これらのデータによ
って、野生型COS 7細胞は、Ba++感受性のイオン
チャンネルを発現せず、かくして、それらをK+チャン
ネル発現の研究のための優れた感受性のある細胞にする
ことが示される。K26 K+チャンネルはまた哺乳動
物細胞でも安定に発現され得る。図30でのデータに示
されるように、3mM BaCl2(矢印;図30)を
K26 cDNAでトランスフェクトしたHEK 29
3細胞に添加したとき(中抜き三角;図30)、膜電位
は脱分極した。この実験で、K26を発現しているHE
K 293細胞は、16回継代し、これはK26が安定
に発現したことを示す。3mMのBaCl2(矢印;図
30)を野生型HEK細胞に添加したとき(黒丸;図3
0)、膜電位に対し効果がなかった。電気生理学的研究
により、光学的膜電位の分析からの結論が確認される。
これらを一緒にすると、これらのデータは、哺乳動物細
胞においてこのチャンネルを発現した時に、K26 K
+チャンネル活性を阻害する新しい化学的実在を見い出
すのに、光学的膜電位分析を用いることができることを
示す。
時的にK26K+チャンネルを発現している(中抜き三
角;図29)COS 7細胞に添加した時(矢印;図2
9)、膜電位は脱分極することを確実にした。ホー(H
o)らの以前の研究によって、内方に整流するK+チャン
ネルの、K26クラスをBa++が阻害することが確立さ
れている。1mMのBaCl2を野生型のCOS 7細
胞に添加したとき(矢印;図29)、膜電位に対しほと
んど効果がない(黒丸;図29)。これらのデータによ
って、野生型COS 7細胞は、Ba++感受性のイオン
チャンネルを発現せず、かくして、それらをK+チャン
ネル発現の研究のための優れた感受性のある細胞にする
ことが示される。K26 K+チャンネルはまた哺乳動
物細胞でも安定に発現され得る。図30でのデータに示
されるように、3mM BaCl2(矢印;図30)を
K26 cDNAでトランスフェクトしたHEK 29
3細胞に添加したとき(中抜き三角;図30)、膜電位
は脱分極した。この実験で、K26を発現しているHE
K 293細胞は、16回継代し、これはK26が安定
に発現したことを示す。3mMのBaCl2(矢印;図
30)を野生型HEK細胞に添加したとき(黒丸;図3
0)、膜電位に対し効果がなかった。電気生理学的研究
により、光学的膜電位の分析からの結論が確認される。
これらを一緒にすると、これらのデータは、哺乳動物細
胞においてこのチャンネルを発現した時に、K26 K
+チャンネル活性を阻害する新しい化学的実在を見い出
すのに、光学的膜電位分析を用いることができることを
示す。
【0069】5.K26 K +チャンネル活性を阻害す
る薬剤に ついての、大量スクリーニングの開発 本発明者らは、K26 K+チャンネル活性を阻害する
新しい化学的実在を見い出すために、大量スクリーニン
グを開発してきた。このスクリーニングの鍵となる特徴
は、K26または関連したカリウムチャンネルタンパク
質を発現しているCOS 7またはHEK 293細胞
を脱分極する、新しい化学的実在を見い出すために、第
三章(4)で述べた光学的膜電位の分析を用いることで
ある。スクリーニングで用いる最も良いK+チャンネル
タンパク質は、そのATPに対する感受性のために、K
11タンパク質であるであろうことに注意するべきであ
る、[第一章、第七部の、実験の詳細の、クローンの選
択と選択した誘導体を参照]。この開示されたクローン
の全てと最初のほぼ30あるいはアミノ酸の自明な変種
とは、K+チャンネル阻害剤をスクリーニングするため
に用いられるであろうということが予想される。選択的
にするためには、K26(またはK11等)K+チャン
ネルを発現している細胞を脱分極する薬剤は、野生型の
細胞あるいは偽トランスフェクトした対照細胞に対して
ほとんどないしは全く効果を示してはならない。逆に、
もし、K26(またはK11等)K+チャンネルを発現
するか否かにかかわらず、COS 7およびHEK29
3の両細胞を脱分極する新しい化学的実在が見い出され
れば、この新しい化学的実在はK26(あるいはK11
等)につき選択性を持たないと結論されるであろう。か
くして、K+の阻害の選択性は、K26(またはK11
等)を発現しているか、あるいはしていない同一細胞タ
イプの対の比較により判定されるであろう。この方法で
は、膜電位の変化の非特異的測定を用いて、選択的にK
26(またはK11等)K+活性を阻害する新しい化学
的実在を見い出すことができる。
る薬剤に ついての、大量スクリーニングの開発 本発明者らは、K26 K+チャンネル活性を阻害する
新しい化学的実在を見い出すために、大量スクリーニン
グを開発してきた。このスクリーニングの鍵となる特徴
は、K26または関連したカリウムチャンネルタンパク
質を発現しているCOS 7またはHEK 293細胞
を脱分極する、新しい化学的実在を見い出すために、第
三章(4)で述べた光学的膜電位の分析を用いることで
ある。スクリーニングで用いる最も良いK+チャンネル
タンパク質は、そのATPに対する感受性のために、K
11タンパク質であるであろうことに注意するべきであ
る、[第一章、第七部の、実験の詳細の、クローンの選
択と選択した誘導体を参照]。この開示されたクローン
の全てと最初のほぼ30あるいはアミノ酸の自明な変種
とは、K+チャンネル阻害剤をスクリーニングするため
に用いられるであろうということが予想される。選択的
にするためには、K26(またはK11等)K+チャン
ネルを発現している細胞を脱分極する薬剤は、野生型の
細胞あるいは偽トランスフェクトした対照細胞に対して
ほとんどないしは全く効果を示してはならない。逆に、
もし、K26(またはK11等)K+チャンネルを発現
するか否かにかかわらず、COS 7およびHEK29
3の両細胞を脱分極する新しい化学的実在が見い出され
れば、この新しい化学的実在はK26(あるいはK11
等)につき選択性を持たないと結論されるであろう。か
くして、K+の阻害の選択性は、K26(またはK11
等)を発現しているか、あるいはしていない同一細胞タ
イプの対の比較により判定されるであろう。この方法で
は、膜電位の変化の非特異的測定を用いて、選択的にK
26(またはK11等)K+活性を阻害する新しい化学
的実在を見い出すことができる。
【0070】選択の操作。図31に示されるデータは、
ROMK1 K+チャンネルを、一時的にCOS細胞で
発現させた時(黒丸;図31)、2mMのBaCl2の
添加(矢印;図31)は、膜電位の脱分極を引き起こす
ことを示す。2mMのBaCl2の添加(矢印;図3
1)は、野生型COS細胞にほとんど効果を示さなかっ
た(中抜き丸;図31)。これらのデータは、ROMK
1およびK26の両K+チャンネルが、Ba++に感受性
であることを示す。さらに、本発明者らは、KATPチャ
ンネルを阻害することが知られているスルホニル尿素で
ある100μMのグリブリドの添加(矢印;図32)
が、ROMK1 K+(中抜き三角;図32)を安定に
発現しているCOS 7細胞の脱分極を引き起こすこと
を見い出した。100μMのグリブリドの野生型COS
7への添加(黒丸;図32)は、過分極を起こした。
これらのデータは、グリブリドがCOS 7細胞で発現
しているROMK1チャンネルを阻害していることを示
す。薬理学的選択性を決定するために、本発明者らはグ
リブリドに密に関連する他のスルホニル尿素の効果も実
験した。図33のデータは、100μMのグリピジドの
添加(矢印;図33)は、ROMK1 K+チャンネル
を発現しているCOS 7細胞の膜電位に対して全く効
果も持たないことを示す(黒丸;図33)。それに加
え、100μMのグリピジドの添加(矢印;図33)
は、野生型COS 7細胞の膜電位に全く効果も持たな
かった(中抜き三角;図33)。これらのデータを合わ
ると、光学的膜電位分析は、異種発現されたK+チャン
ネルと特異的に相互作用する化学的系列の中の化合物を
見い出すことができることを例証している。
ROMK1 K+チャンネルを、一時的にCOS細胞で
発現させた時(黒丸;図31)、2mMのBaCl2の
添加(矢印;図31)は、膜電位の脱分極を引き起こす
ことを示す。2mMのBaCl2の添加(矢印;図3
1)は、野生型COS細胞にほとんど効果を示さなかっ
た(中抜き丸;図31)。これらのデータは、ROMK
1およびK26の両K+チャンネルが、Ba++に感受性
であることを示す。さらに、本発明者らは、KATPチャ
ンネルを阻害することが知られているスルホニル尿素で
ある100μMのグリブリドの添加(矢印;図32)
が、ROMK1 K+(中抜き三角;図32)を安定に
発現しているCOS 7細胞の脱分極を引き起こすこと
を見い出した。100μMのグリブリドの野生型COS
7への添加(黒丸;図32)は、過分極を起こした。
これらのデータは、グリブリドがCOS 7細胞で発現
しているROMK1チャンネルを阻害していることを示
す。薬理学的選択性を決定するために、本発明者らはグ
リブリドに密に関連する他のスルホニル尿素の効果も実
験した。図33のデータは、100μMのグリピジドの
添加(矢印;図33)は、ROMK1 K+チャンネル
を発現しているCOS 7細胞の膜電位に対して全く効
果も持たないことを示す(黒丸;図33)。それに加
え、100μMのグリピジドの添加(矢印;図33)
は、野生型COS 7細胞の膜電位に全く効果も持たな
かった(中抜き三角;図33)。これらのデータを合わ
ると、光学的膜電位分析は、異種発現されたK+チャン
ネルと特異的に相互作用する化学的系列の中の化合物を
見い出すことができることを例証している。
【0071】K26または(K11)K+活性を選択的
に阻害する新しい化学的実在を迅速にスクリーニングす
るために、本発明者らはFLIPR(ノーベルテック、
アン・アーバー、エムアイ(NovelTech,Ann Arbor,M
I))と呼ばれる、新しく開発された96ウェルの蛍光
イメージング・プレート・リーダーを用いた。この機器
は、おのおのの96ウェルのマイクロテストプレートの
各ウェル中の膜電位の変化を、同時に、光学的に測定で
きる[図34参照]。溶媒の対照をA10 平滑筋細胞に
添加したとき(7分;図34)、膜電位にはほとんど効
果を持たない(図34の全ての線)(A10 平滑筋細
胞はジ・アメリカン・タイプ・ティッシュー・コレクシ
ョン(The American Type Tissue Collection)、
ATCC番号 CRL−1476)から入手可能であ
る)。図では示されていないが、図34、35および3
6のY軸は、最大の反応のパーセントを示し、X軸は時
間(分)で表わされる時間(T)を示す。3mMのKCl
を5mM KCl中で増殖しているA10 平滑筋細胞
に添加したとき(7分;図35)、膜電位での小さい
が、統計上有意な変化があった(図35の全ての線)。
30mMのKClをA10 平滑筋細胞に添加したとき
(7分;図36),膜電位に大きな変化があった(図3
6の全ての線)。
に阻害する新しい化学的実在を迅速にスクリーニングす
るために、本発明者らはFLIPR(ノーベルテック、
アン・アーバー、エムアイ(NovelTech,Ann Arbor,M
I))と呼ばれる、新しく開発された96ウェルの蛍光
イメージング・プレート・リーダーを用いた。この機器
は、おのおのの96ウェルのマイクロテストプレートの
各ウェル中の膜電位の変化を、同時に、光学的に測定で
きる[図34参照]。溶媒の対照をA10 平滑筋細胞に
添加したとき(7分;図34)、膜電位にはほとんど効
果を持たない(図34の全ての線)(A10 平滑筋細
胞はジ・アメリカン・タイプ・ティッシュー・コレクシ
ョン(The American Type Tissue Collection)、
ATCC番号 CRL−1476)から入手可能であ
る)。図では示されていないが、図34、35および3
6のY軸は、最大の反応のパーセントを示し、X軸は時
間(分)で表わされる時間(T)を示す。3mMのKCl
を5mM KCl中で増殖しているA10 平滑筋細胞
に添加したとき(7分;図35)、膜電位での小さい
が、統計上有意な変化があった(図35の全ての線)。
30mMのKClをA10 平滑筋細胞に添加したとき
(7分;図36),膜電位に大きな変化があった(図3
6の全ての線)。
【0072】このデータは、光学的膜電位の分析が、細
胞の膜電位を変える薬剤を検出するのに使用できること
をはっきりと示している。光学的スクリーニングの方法
は、光学的膜電位の分析とFLIPRとを、COSおよ
びHEK 293で発現されたK26(またはK11)
K+チャンネルの活性を阻害する新しい化学的実在を見
い出すために用いることである。要約すると、このスク
リーニングは以下の工程に従って操作できる: 1)クローン化されたK26(またはK11)K+チャ
ンネルを発現している細胞を、整流するまで96ウェル
のマイクロテストプレートで増殖させる。2)細胞を、
20mM HEPESを含むアールの平衡塩類溶液中の
5μM DiBAC4(3)で平衡化する。3)それぞ
れのウェルのベースラインの測定を記録する。4)一つ
の試験化合物あるいは試験化合物の混合物をそれぞれの
ウェルに添加し、膜電位の変化を記録する。5)次い
で、K26を発現している細胞を脱分極する化合物を、
野生型あるいは偽トランスフェクトした対照に対し試験
して選択性を確立する。6)K26を選択的に阻害する
ことが示された化合物を動物モデルで利尿効果を試験す
ることになる。このスクリーニングの方法で、1カ月あ
たり5000以上の化合物を分析できる。
胞の膜電位を変える薬剤を検出するのに使用できること
をはっきりと示している。光学的スクリーニングの方法
は、光学的膜電位の分析とFLIPRとを、COSおよ
びHEK 293で発現されたK26(またはK11)
K+チャンネルの活性を阻害する新しい化学的実在を見
い出すために用いることである。要約すると、このスク
リーニングは以下の工程に従って操作できる: 1)クローン化されたK26(またはK11)K+チャ
ンネルを発現している細胞を、整流するまで96ウェル
のマイクロテストプレートで増殖させる。2)細胞を、
20mM HEPESを含むアールの平衡塩類溶液中の
5μM DiBAC4(3)で平衡化する。3)それぞ
れのウェルのベースラインの測定を記録する。4)一つ
の試験化合物あるいは試験化合物の混合物をそれぞれの
ウェルに添加し、膜電位の変化を記録する。5)次い
で、K26を発現している細胞を脱分極する化合物を、
野生型あるいは偽トランスフェクトした対照に対し試験
して選択性を確立する。6)K26を選択的に阻害する
ことが示された化合物を動物モデルで利尿効果を試験す
ることになる。このスクリーニングの方法で、1カ月あ
たり5000以上の化合物を分析できる。
【0073】
【発明の効果】本発明により、ヒトカリウムATP開閉
チャンネルタンパク質をコードする機能性DNAクロー
ンおよびその誘導体が初めて単離され、また哺乳動物細
胞および該クローンを用いるヒト腎臓カリウムチャンネ
ル活性調節化合物をスクリーニングする方法が開発され
た。
チャンネルタンパク質をコードする機能性DNAクロー
ンおよびその誘導体が初めて単離され、また哺乳動物細
胞および該クローンを用いるヒト腎臓カリウムチャンネ
ル活性調節化合物をスクリーニングする方法が開発され
た。
【0074】
【0075】配列番号:1 配列の長さ:1740塩基対 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:No フラグメント型:N−末端フラグメント 起源: 生物名:ホモ・サピエンス(Homo sapiens) 直接の起源: ライブラリー名:ヒト腎臓cDNA クローン名:K26 配列 CGGGGGCCTC GGGTACCCTC ACCCAGCATA TCCAAACTCT TGCATCAAAG GTGCAGGGAC 60 TTGCTCACAT CGAGAATCTG GTTGCTTTCT TGGAGACCAA GAAAATGAGT TTTTGTTTCT 120 ACATTTACTC CAGCAATCCA TGAGGACTTT ATAGGAATTT TGCACCATTC TGAATGGATA 180 CATTTGGATT TCTCAACATT TGTTCAGCTT CCTAATGACT GTTGTGACAA TTGCTCTATA 240 CCAGTGA ATG CCA ACT GTT TAT CTC TGC TCT GAA CAG ATC AGG GTG TTG 289 Met Pro Thr Val Tyr Leu Cys Ser Glu Gln Ile Arg Val Leu 1 5 10 ACA GAA AGT ATG TTC AAA CAT CTT CGG AAA TGG GTC GTC ACT CGC TTT 337 Thr Glu Ser Met Phe Lys His Leu Arg Lys Trp Val Val Thr Arg Phe 15 20 25 30 TTT GGG CAT TCT CGG CAA AGA GCA AGG CTA GTC TCC AAA GAT GGA AGG 385 Phe Gly His Ser Arg Gln Arg Ala Arg Leu Val Ser Lys Asp Gly Arg 35 40 45 TGC AAC ATA GAA TTT GGC AAT GTG GAG GCA CAG TCA AGG TTT ATA TTC 433 Cys Asn Ile Glu Phe Gly Asn Val Glu Ala Gln Ser Arg Phe Ile Phe 50 55 60 TTT GTG GAC ATC TGG ACA ACG GTA CTT GAC CTC AAG TGG AGA TAC AAA 481 Phe Val Asp Ile Trp Thr Thr Val Leu Asp Leu Lys Trp Arg Tyr Lys 65 70 75 ATG ACC ATT TTC ATC ACA GCC TTC TTG GGG AGT TGG TTT TTC TTT GGT 529 Met Thr Ile Phe Ile Thr Ala Phe Leu Gly Ser Trp Phe Phe Phe Gly 80 85 90 CTC CTG TGG TAT GCA GTA GCG TAC ATT CAC AAA GAC CTC CCG GAA TTC 577 Leu Leu Trp Tyr Ala Val Ala Tyr Ile His Lys Asp Leu Pro Glu Phe 95 100 105 110 CAT CCT TCT GCC AAT CAC ACT CCC TGT GTG GAG AAT ATT AAT GGC TTG 625 His Pro Ser Ala Asn His Thr Pro Cys Val Glu Asn Ile Asn Gly Leu 115 120 125 ACC TCA GCT TTT CTG TTT TCT CTG GAG ACT CAA GTG ACC ATT GGA TAT 673 Thr Ser Ala Phe Leu Phe Ser Leu Glu Thr Gln Val Thr Ile Gly Tyr 130 135 140 GGA TTC AGG TGT GTG ACA GAA CAG TGT GCC ACT GCC ATT TTT CTG CTT 721 Gly Phe Arg Cys Val Thr Glu Gln Cys Ala Thr Ala Ile Phe Leu Leu 145 150 155 ATC TTT CAG TCT ATA CTT GGA GTT ATA ATC AAT TCT TTC ATG TGT GGG 769 Ile Phe Gln Ser Ile Leu Gly Val Ile Ile Asn Ser Phe Met Cys Gly 160 165 170 GCC ATC TTA GCC AAG ATC TCC AGG CCC AAA AAA CGA GCC AAG ACC ATT 817 Ala Ile Leu Ala Lys Ile Ser Arg Pro Lys Lys Arg Ala Lys Thr Ile 175 180 185 190 ACG TTC AGC AAG AAC GCA GTG ATC AGC AAA CGG GGA GGG AAG CTT TGC 865 Thr Phe Ser Lys Asn Ala Val Ile Ser Lys Arg Gly Gly Lys Leu Cys 195 200 205 CTC CTA ATC CGA GTG GCT AAT CTC AGG AAG AGC CTT CTT ATT GGC AGT 913 Leu Leu Ile Arg Val Ala Asn Leu Arg Lys Ser Leu Leu Ile Gly Ser 210 215 220 CAC ATT TAT GGA AAG CTT CTG AAG ACC ACA GTC ACT CCT GAA GGA GAG 961 His Ile Tyr Gly Lys Leu Leu Lys Thr Thr Val Thr Pro Glu Gly Glu 225 230 235 ACC ATT ATT TTG GAC CAG ATC AAT ATC AAC TTT GTA GTT GAC GCT GGG 1009 Thr Ile Ile Lys Asp Gln Ile Asn Ile Asn Phe Val Val Asp Ala Gly 240 245 250 ATT GAA AAT TTA TTC TTC ATC TCC CCA TTG ACA ATT TAC CAT GTC ATT 1057 Asn Glu Asn Leu Phe Phe Ile Ser Pro Leu Thr Ile Tyr His Val Ile 255 260 270 275 GAT CAC AAC AGC CCT TTC TTC CAC ATG GCA GCG GAG ACC CTT CTC CAG 1105 Asp His Asn Ser Pro Phe Phe His Met Ala Ala Glu Thr Leu Leu Gln 280 285 290 CAG GAC TTT GAA TTA GTG GTG TTT TTA GAT GGC ACA GTG GAG TCC ACC 1153 Gln Asp Phe Glu Leu Val Val Phe Leu Asp Gly Thr Val Glu Ser Thr 295 300 305 AGT GCT ACC TGC CAA GTC CGG ACA TCC TAT GTC CCA GAG GAG GTG CTT 1201 Ser Ala Thr Cys Gln Val Arg Thr Ser Tyr Val Pro Glu Glu Val Leu 310 315 320 TGG GGC TAC CGT TTT GCT CCC ATA GTA TCC AAG ACA AAG GAA GGG AAA 1249 Trp Gly Tyr Arg Phe Ala Pro Ile Val Ser Lys Thr Lys Glu Gly Lys 325 330 335 TAC CGA GTG GAT TTC CAT AAC TTT AGC AAG ACA GTG GAA GTG GAG ACC 1297 Tyr Arg Val Asp Phe His Asn Phe Ser Lys Thr Val Glu Val Glu Thr 340 345 350 355 CCT CAC TGT GCC ATG TGC CTT TAT AAT GAG AAA GAT GTT AGA GCC AGG 1345 Pro His Cys Ala Met Cys Leu Tyr Asn Glu Lys Asp Val Arg Ala Arg 360 365 370 ATG AAG AGA GGC TAT GAC AAC CCC AAC TTC ATC TTG TCA GAA GTC AAT 1393 Met Lys Arg Gly Tyr Asp Asn Pro Asn Phe Ile Leu Ser Glu Val Asn 375 380 385 GAA ACA GAT GAC ACC AAA ATG TAA CAGTGGCTTT TCAACAGGAG TAAAGAAAGT 1447 Glu Thr Asp Asp Thr Lys Met * 390 CTCTAAAGCT CCTAGTACCT AGAAGCATTA TGAAGCAGTC AACAATTTAG GGGTACGAAA 1507 GTAGGATGAG AGCCTTCAAA GTCTACCAGC ACAAAGACCC CTGAGCCCCG CAATTGTGAT 1567 CCCACAAGAC ATGCATCTCC ACAAGGCTAC TGTATTAGAA CGTGCAATGC ATTTATATGA 1627 AACTGGTGTA TGGAAGACAT AGGTGCTCTC TTGAAATCTT AAATATGATT ATTTGAGCTC 1687 ATATAAGGTG GATTGGAGCA GATAAAATTA CCAAAAGTTT CATGAACAGG CCG 1740
【0076】配列番号:2 配列の長さ:1832塩基対 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:No フラグメント型:N−末端フラグメント 起源: 生物名:ホモ・サピエンス(Homo sapiens) 直接の起源: ライブラリー名:ヒト腎臓cDNA クローン名:K26P 配列 TGGTTGCTTT CTTGGAGACC AAGAAAATGA GTTTTTGTTT CTACATTTAC TCCAGCAATC 60 CATGAGGACT TTATAGGAAT TTTGCACCAT TCTGAATGGA TACATTTGGA TTTCTCAACA 120 TTTGTTCAGC TTCCTAATGA CTGTTGTGAC AATTGCTCTA TACCAGTGAA TGCCAACTGT 180 TTATCCCTGC TCTGAACAGG TTTCTTCTCT ACTGTGCCTT CATCCCCATC CTGGGCCCTG 240 ACAAAGACAG TGTGACAAGT TCTGAGCCCC ACAGGTGGAA TCCCAAACCA AGCAGCTCTT 300 GCTGGTCACC CCAAGATCTA CTTATACATG AAGTTTTGAA AATCATCTCC TGAACCTCTT 360 CTGACAGAGA TCAGGGTGTT GACAGAAAGT ATG TTC AAA CAT CTT CGG AAA TGG 414 Met Phe Lys His Leu Arg Lys Trp 1 5 GTC GTC ACT CGC TTT TTT GGG CAT TCT CGG CAA AGA GCA AGG CTA GTC 462 Val Val Thr Arg Phe Phe Gly His Ser Arg Gln Arg Ala Arg Leu Val 10 15 20 TCC AAA GAT GGA AGG TGC AAC ATA GAA TTT GGC AAT GTG GAG GCA CAG 510 Ser Lys Asp Gly Arg Cys Asn Ile Glu Phe Gly Asn Val Glu Ala Gln 25 30 35 40 TCA AGG TTT ATA TTC TTT GTG GAC ATC TGG ACA ACG GTA CTT GAC CTC 558 Ser Arg Phe Ile Phe Phe Val Asp Ile Trp Thr Thr Val Leu Asp Leu 45 50 55 AAG TGG AGA TAC AAA ATG ACC ATT TTC ATC ACA GCC TTC TTG GGG AGT 606 Lys Trp Arg Tyr Lys Met Thr Ile Phe Ile Thr Ala Phe Leu Gly Ser 60 65 70 TGG TTT TTC TTT GGT CTC CTG TGG TAT GCA GTA GCG TAC ATT CAC AAA 654 Trp Phe Phe Phe Gly Leu Leu Trp Tyr Ala Val Ala Tyr Ile His Lys 75 80 85 GAC CTC CCG GAA TTC CAT CCT TCT GCC AAT CAC ACT CCC TGT GTG GAG 702 Asp Leu Pro Glu Phe His Pro Ser Ala Asn His Thr Pro Cys Val Glu 90 95 100 AAT ATT AAT GGC TTG ACC TCA GCT TTT CTG TTT TCT CTG GAG ACT CAA 750 Asn Ile Asn Gly Leu Thr Ser Ala Phe Leu Phe Ser Leu Glu Thr Gln 105 110 115 120 GTG ACC ATT GGA TAT GGA TTC AGG TGT GTG ACA GAA CAG TGT GCC ACT 798 Val Thr Ile Gly Tyr Gly Phe Arg Cys Val Thr Glu Gln Cys Ala Thr 125 130 135 GCC ATT TTT CTG CTT ATC TTT CAG TCT ATA CTT GGA GTT ATA ATC AAT 846 Ala Ile Phe Leu Leu Ile Phe Gln Ser Ile Leu Gly Val Ile Ile Asn 140 145 150 TCT TTC ATG TGT GGG GCC ATC TTA GCC AAG ATC TCC AGG CCC AAA AAA 894 Ser Phe Met Cys Gly Ala Ile Leu Ala Lys Ile Ser Arg Pro Lys Lys 155 160 165 CGA GCC AAG ACC ATT ACG TTC AGC AAG AAC GCA GTG ATC AGC AAA CGG 942 Arg Ala Lys Thr Ile Thr Phe Ser Lys Asn Ala Val Ile Ser Lys Arg 170 175 180 GGA GGG AAG CTT TGC CTC CTA ATC CGA GTG GCT AAT CTC AGG AAG AGC 990 Gly Gly Lys Leu Cys Leu Leu Ile Arg Val Ala Asn Leu Arg Lys Ser 185 190 200 205 CTT CTT ATT GGC AGT CAC ATT TAT GGA AAG CTT CTG AAG ACC ACA GTC 1038 Leu Leu Ile Gly Ser His Ile Tyr Gly Lys Leu Leu Lys Thr Thr Val 210 215 220 ACT CCT GAA GGA GAG ACC ATT ATT TTG GAC CAG ATC AAT ATC AAC TTT 1086 Thr Pro Glu Gly Glu Thr Ile Ile Leu Asp Gln Ile Asn Ile Asn Phe 225 230 235 GTA GTT GAC GCT GGG AAT GAA AAT TTA TTC TTC ATC TCC CCA TTG ACA 1134 Val Val Asp Ala Gly Asn Glu Asn Leu Phe Phe Ile Ser Phe Leu Thr 240 245 250 ATT TAC CAT GTC ATT GAT CAC AAC AGC CCT TTC TTC CAC ATG GCA GCG 1182 Ile Tyr His Val Ile Asp His Asn Ser Pro Phe Phe His Met Ala Ala 255 260 265 GAG ACC CTT CTC CAG CAG GAC TTT GAA TTA GTG GTG TTT TTA GAT GGC 1230 Glu Thr Leu Leu Gln Gln Asp Phe Glu Leu Val Val Phe Leu Asp Gly 270 275 280 285 ACA GTG GAG TCC ACC AGT GCT ACC TGC CAA GTC CGG ACA TCC TAT GTC 1278 Thr Val Glu Ser Thr Ser Ala Thr Cys Gln Val Arg Thr Ser Tyr Val 290 295 300 CCA GAG GAG GTG CTT TGG GGC TAC CGT TTT GCT CCC ATA GTA TCC AAG 1326 Pro Glu Glu Val Leu Trp Gly Tyr Arg Phe Ala Pro Ile Val Ser Lys 305 310 315 ACA AAG GAA GGG AAA TAC CGA GTG GAT TTC CAT AAC TTT AGC AAG ACA 1374 Thr Lys Glu Gly Lys Tyr Arg Val Asp Phe His Asn Phe Ser Lys Thr 320 325 330 GTG GAA GTG GAG ACC CCT CAC TGT GCC ATG TGC CTT TAT AAT GAG AAA 1422 Val Glu Val Glu Thr Pro His Cys Ala Met Cys Leu Tyr Asn Glu Lys 335 340 345 GAT GTT AGA GCC AGG ATG AAG AGA GGC TAT GAC AAC CCC AAC TTC ATC 1470 Asp Val Arg Ala Arg Met Lys Arg Gly Tyr Asp Asn Pro Asn Phe Ile 350 355 360 365 TTG TCA GAA GTC AAT GAA ACA GAT GAC ACC AAA ATG TAA CAGTGGCTTT 1519 Leu Ser Glu Val Asn Glu Thr Asp Asp Thr Lys Met * 370 375 TCAACAGGAG TAAAGAAAGT CTCTAAAGCT CCTAGTACCT AGAAGCATTA TGAAGCAGTC 1579 AACAATTTAG GGGTACGAAA GTAGGATGAG AGCCTTCAAA GTCTACCAGC ACAAAGACCC 1639 CTGAGCCCCG CAATTGTGAT CCCACAAGAC ATGCATCTCC ACAAGGCTAC TGTATTAGAA 1699 CGTGCAATGC ATTTATATGA AACTGGTGTA TGGAAGACAT AGGTGCTCTC TTGAAATCTT 1759 AAATATGATT ATTTGAGCTC ATATAAGGTG GATTGGAGCA GATAAAATTA CCAAAAGTTT 1819 CATGAACAGG CCG 1832
【0077】配列番号:3 配列の長さ:1671塩基対 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:No フラグメント型:N−末端フラグメント 起源: 生物名:ホモ・サピエンス(Homo sapiens) 直接の起源: ライブラリー名:ヒト腎臓cDNA クローン名:K11 配列 CGGGTTGCAT ACAGATGAGT TGGCAGCCGG TCTGAGCTGG CCCACAGACT CATAAAATCA 60 ACAGGGCCTC GGGTACCCTC ACCCAGCATA TCCAAACTCT TGCATCAAAG GTGCAGGGAC 120 TTGCTCACAT CGAGAATCTG GTTGCTTTCT TGGAGACCAA GAAAATGAGT TTTTGTTTCT 180 ACATTTACTC CAGCAATCCA TGAGATCAGG GTGTTGACAG AAAGT ATG TTC AAA 233 Met Phe Lys 1 CAT CTT CGG AAA TGG GTC GTC ACT CGC TTT TTT GGG CAT TCT CGG CAA 281 His Leu Arg Lys Trp Val Val Thr Arg Phe Phe Gly His Ser Arg Gln 5 10 15 AGA GCA AGG CTA GTC TCC AAA GAT GGA AGG TGC AAC ATA GAA TTT GGC 329 Arg Ala Arg Leu Val Ser Lys Asp Gly Arg Cys Asn Ile Glu Phe Gly 20 25 30 35 AAT GTG GAG GCA CAG TCA AGG TTT ATA TTC TTT GTG GAC ATC TGG ACA 377 Asn Val Glu Ala Gln Ser Arg Phe Ile Phe Phe Val Asp Ile Trp Thr 40 45 50 ACG GTA CTT GAC CTC AAG TGG AGA TAC AAA ATG ACC ATT TTC ATC ACA 425 Thr Val Leu Asp Leu Lys Trp Arg Tyr Lys Met Thr Ile Phe Ile Thr 55 60 65 GCC TTC TTG GGG AGT TGG TTT TTC TTT GGT CTC CTG TGG TAT GCA GTA 473 Ala Phe Leu Gly Ser Trp Phe Phe Phe Gly Leu Leu Trp Tyr Ala Val 70 75 80 GCG TAC ATT CAC AAA GAC CTC CCG GAA TTC CAT CCT TCT GCC AAT CAC 521 Ala Tyr Ile His Lys Asp Leu Pro Glu Phe His Pro Ser Ala Asn His 85 90 95 ACT CCC TGT GTG GAG AAT ATT AAT GGC TTG ACC TCA GCT TTT CTG TTT 569 Thr Pro Cys Val Glu Asn Ile Asn Gly Leu Thr Ser Arg Phe Leu Phe 100 105 110 115 TCT CTG GAG ACT CAA GTG ACC ATT GGA TAT GGA TTC AGG TGT GTG ACA 617 Ser Leu Glu Thr Gln Val Thr Ile Gly Tyr Gly Phe Arg Cys Val Thr 120 125 130 GAA CAG TGT GCC ACT GCC ATT TTT CTG CTT ATC TTT CAG TCT ATA CTT 665 Glu Gln Cys Ala Thr Ala Ile Phe Leu Leu Ile Phe Gln Ser Ile Leu 135 140 145 GGA GTT ATA ATC AAT TCT TTC ATG TGT GGG GCC ATC TTA GCC AAG ATC 713 Gly Val Ile Ile Asn Ser Phe Met Cys Gly Ala Ile Leu Ala Lys Ile 150 155 160 TCC AGG CCC AAA AAA CGT GCC AAG ACC ATT ACG TTC AGC AAG AAC GCA 761 Ser Arg Pro Lys Lys Arg Ala Lys Thr Ile Thr Phe Ser Lys Asn Ala 165 170 175 GTG ATC AGC AAA CGG GGA GGG AAG CTT TGC CTC CTA ATC CGA GTG GCT 809 Val Ile Ser Lys Arg Gly Gly Lys Leu Cys Leu Leu Ile Arg Val Ala 180 185 190 195 AAT CTC AGG AAG AGC CTT CTT ATT GGC AGT CAC ATT TAT GGA AAG CTT 857 Asn Leu Arg Lys Ser Leu Leu Ile Gly Ser His Ile Tyr Gly Lys Leu 200 205 210 CTG AAG ACC ACA GTC ACT CCT GAA GGA GAG ACC ATT ATT TTG GAC CAG 905 Leu Lys Thr Thr Val Thr Pro Glu Gly Glu Thr Ile Ile Leu Asp Gln 215 220 225 ATC AAT ATC AAC TTT GTA GTT GAC GCT GGG AAT GAA AAT TTA TTC TTC 953 Ile Asn Ile Asn Phe Val Val Asn Ala Gly Asn Glu Asn Leu Phe Phe 230 235 240 ATC TCC CCA TTG ACA ATT TAC CAT GTC ATT GAT CAC AAC AGC CCT TTC 1001 Ile Ser Pro Leu Thr Ile Tyr His Val Ile Asp His Asn Ser Pro Phe 245 250 255 TTC CAC ATG GCA GCG GAG ACC CTT CTC CAG CAG GAC TTT GAA TTA GTG 1049 Phe His Met Ala Ala Glu Thr Leu Leu Gln Gln Asp Phe Glu Leu Val 260 265 270 275 GTG TTT TTA GAT GGC ACA GTG GAG TCC ACC AGT GCT ACC TGC CAA GTC 1097 Val Phe Leu Asp Gly Thr Val Glu Ser Thr Ser Ala Thr Cys Gln Val 280 285 290 CGG ACA TCC TAT GTC CCA GAG GAG GTG CTT TGG GGC TAC CGT TTT GCT 1145 Arg Thr Ser Tyr Val Pro Glu Glu Val Leu Trp Gly Tyr Arg Phe Ala 295 300 305 CCC ATA GTA TCC AAG ACA AAG GAA GGG AAA TAC CGA GTG GAT TTC CAT 1193 Pro Ile Val Ser Lys Thr Lys Glu Gly Lys Tyr Arg Val Asp Phe His 310 315 320 AAC TTT AGC AAG ACA GTG GAA GTG GAG ACC CCT CAC TGT GCC ATG TGC 1241 Asn Phe Ser Lys Thr Val Glu Val Glu Thr Pro His Cys Ala Met Cys 325 330 335 CTT TAT AAT GAG AAA GAT GTT AGA GCC AGG ATG AAG AGA GGC TAT GAC 1289 Lys Tyr Asn Glu Lys Asp Val Arg Ala Arg Met Lys Arg Gly Tyr Asp 340 345 350 355 AAC CCC AAC TTC ATC TTG TCA GAA GTC AAT GAA ACA GAT GAC ACC AAA 1337 Asn Pro Asn Phe Ile Leu Ser Glu Val Asn Glu Thr Asp Asp Thr Lys 360 365 370 ATG TAA CAGTGGCTTT TCAACAGGAG TAAAGCAAAG TCTCTAAAGC TCCTAGTACC 1393 Met * TAGAAGCATT ATGAAGCAGT CAACAATTTA GGGGTACGAA AGTAGGATGA GAGCCTTCAA 1453 AGTCTACCAG CACAAAGACC CCTGAGCCCC GCAATTGTGA TCCCACAAGA CATGCATCTC 1513 CACAAGGCTA CTGTATTAGA ACGTGCAATG CATTTATATG AAACTGGTGT ATGGAAGACA 1573 TAGGTGCTCT CTTGAAATCT TAAATATGAT TATTTGAGCT CATATAAGGT GGATTGGAGC 1633 AGATAAAATT ATCAAAAGTT TCATGAACAG GCCCCCG 1671
【0078】配列番号:4 配列の長さ:1703塩基対 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:No フラグメント型:N−末端フラグメント 起源: 生物名:ホモ・サピエンス(Homo sapiens) 直接の起源: ライブラリー名:ヒト腎臓cDNA クローン名:K11P 配列 TGGTTGCTTT CTTGGAGACC AAGAAAATGA GTTTTTGTTT CTACATTTAC TCCAGCAATC 60 CATGAGGTTT CTTCTCTACT GTGCCTTCAT CCCCATCCTG GGCCCTGACA AAGACAGTGT 120 GACAAGTTCT GAGCCCCACA GGTGGAATCC CAAACCAAGC AGCTCTTGCT GGTCACCCCA 180 AGATCTACTT ATACATGAAG TTTTGAAAAT CATCTCCTGA ACCTCTTCTG ACAGAGATCA 240 GGGTGTTGAC AGAAAGT ATG TTC AAA CAT CTT CAG AAA TGG GTC GTC ACT 290 Met Phe Lys His Leu Gln Lys Trp Val Val Thr 1 5 10 CGC TTT TTT GGG CAT TCT CGG CAA AGA GCA AGG CTA GTC TCC AAA GAT 338 Arg Phe Phe Gly His Ser Arg Gln Arg Ala Arg Leu Val Ser Lys Asp 15 20 25 GGA AGG TGC AAC ATA GAA TTT GGC AAT GTG GAG GCA CAG TCA AGG TTT 386 Gly Arg Cys Asn Ile Glu Phe Gly Asn Val Glu Ala Gln Ser Arg Phe 30 35 40 ATA TTC TTT GTG GAC ATC TGG ACA ACG GTA CTT GAC CTC AAG TGG AGA 434 Ile Phe Phe Val Asp Ile Trp Thr Thr Val Leu Asp Leu Lys Trp Arg 45 50 55 TAC AAA ATG ACC ATT TTC ATC ACA GCC TTC TTG GGG AGT TGG TTT TTC 482 Tyr Lys Met Thr Ile Phe Ile Thr Ala Phe Leu Gly Ser Trp Phe Phe 60 65 70 75 TTT GGT CTC CTG TGG TAT GCA GTA GCG TAC ATT CAC AAA GAC CTC CCG 530 Phe Gly Leu Leu Trp Tyr Ala Val Ala Tyr Ile His Lys Asp Leu Pro 80 85 90 GAA TTC CAT CCT TCT GCC AAT CAC ACT CCC TGT GTG GAG AAT ATT AAT 578 Glu Phe His Pro Ser Ala Asn His Thr Pro Cys Val Glu Asn Ile Asn 95 100 105 GGC TTG ACC TCA GCT TTT CTG TTT TCT CTG GAG ACT CAA GTG ACC ATT 626 Gly Leu Thr Ser Ala Phe Leu Phe Ser Leu Glu Thr Gln Val Thr Ile 110 115 120 GGA TAT GGA TTC AGG TGT GTG ACA GAA CAG TGT GCC ACT GCC ATT TTT 674 Gly Tyr Gly Phe Arg Cys Val Thr Glu Gln Cys Ala Thr Ala Ile Phe 125 130 135 CTG CTT ATC TTT CAG TCT ATA CTT GGA GTT ATA ATC AAT TCT TTC ATG 722 Leu Leu Ile Phe Gln Ser Ile Leu Gly Val Ile Ile Asn Ser Phe Met 140 145 150 155 TGT GGG GCC ATC TTA GCC AAG ATC TCC AGG CCC AAA AAA CGT GCC AAG 770 Cys Gly Ala Ile Leu Ala Lys Ile Ser Arg Pro Lys Lys Arg Ala Lys 160 165 170 ACC ATT ACG TTC AGC AAG AAC GCA GTG ATC AGC AAA CGG GGA GGG AAG 818 Thr Ile Thr Phe Ser Lys Asn Ala Val Ile Ser Lys Arg Gly Gly Lys 175 180 185 CTT TGC CTC CTA ATC CGA GTG GCT AAT CTC AGG AAG AGC CTT CTT ATT 866 Leu Cys Leu Leu Ile Arg Val Ala Asn Leu Arg Lys Ser Leu Leu Ile 190 195 200 GGC AGT CAC ATT TAT GGA AAG CTT CTG AAG ACC ACA GTC ACT CCT GAA 914 Gly Ser His Ile Tyr Gly Lys Leu Leu Lys Thr Thr Val Thr Pro Glu 205 210 215 GGA GAG ACC ATT ATT TTG GAC CAG ATC AAT ATC AAC TTT GTA GTT GAC 962 Gly Glu Thr Ile Ile Leu Asp Gln Ile Asn Ile Asn Phe Val Val Asp 220 225 230 235 GCT GGG AAT GAA AAT TTA TTC TTC ATC TCC CCA TTG ACA ATT TAC CAT 1010 Ala Gly Asn Glu Asn Leu Phe Phe Ile Ser Pro Leu Thr Ile Tyr His 240 245 250 GTC ATT GAT CAC AAC AGC CCT TTC TTC CAC ATG GCA GCG GAG ACC CTT 1058 Val Ile Asp His Asn Ser Pro Phe Phe His Met Ala Ala Glu Thr Leu 255 260 265 CTC CAG CAG GAC TTT GAA TTA GTG GTG TTT TTA GAT GGC ACA GTG GAG 1106 Leu Gln Gln Asp Phe Glu Leu Val Val Phe Leu Asp Gly Thr Val Glu 270 275 280 TCC ACC AGT GCT ACC TGC CAA GTC CGG ACA TCC TAT GTC CCA GAG GAG 1154 Ser Thr Ser Ala Thr Cys Gln Val Arg Thr Ser Tyr Val Pro Glu Glu 285 290 295 GTG CTT TGG GGC TAC CGT TTT GCT CCC ATA GTA TCC AAG ACA AAG GAA 1202 Val Leu Trp Gly Tyr Arg Phe Ala Pro Ile Val Ser Lys Thr Lys Glu 300 305 310 315 GGG AAA TAC CGA GTG GAT TTC CAT AAC TTT AGC AAG ACA GTG GAA GTG 1250 Gly Lys Tyr Arg Val Asp Phe His Asn Phe Ser Lys Thr Val Glu Val 320 325 330 GAG ACC CCT CAC TGT GCC ATG TGC CTT TAT AAT GAG AAA GAT GTT AGA 1298 Glu Thr Pro His Cys Ala Met Cys Leu Tyr Asn Glu Lys Asp Val Arg 335 340 345 GCC AGG ATG AAG AGA GGC TAT GAC AAC CCC AAC TTC ATC TTG TCA GAA 1346 Ala Arg Met Lys Arg Gly Tyr Asp Asn Pro Asn Phe Ile Leu Ser Glu 350 355 360 GTC AAT GAA ACA GAT GAC ACC AAA ATG TAA CAGTGGCTTT TCAACAGGAG 1396 Val Asn Glu Thr Asp Asp Thr Lys Met * 365 370 TAAAGCAAAG TCTCTAAAGC TCCTAGTACC TAGAAGCATT ATGAAGCAGT CAACAATTTA 1456 GGGGTACGAA AGTAGGATGA GAGCCTTCAA AGTCTACCAG CACAAAGACC CCTGAGCCCC 1516 GCAATTGTGA TCCCACAAGA CATGCATCTC CACAAGGCTA CTGTATTAGA ACGTGCAATG 1576 CATTTATATG AAACTGGTGT ATGGAAGACA TAGGTGCTCT CTTGAAATCT TAAATATGAT 1636 TATTTGAGCT CATATAAGGT GGATTGGAGC AGATAAAATT ATCAAAAGTT TCATGAACAG 1696 GCCCCCG 1703
【0079】配列番号:5 配列の長さ:1591塩基対 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:No フラグメント型:N−末端フラグメント 起源: 生物名:ホモ・サピエンス(Homo sapiens) 直接の起源: ライブラリー名:ヒト腎臓cDNA クローン名:K8 配列 ACCAGCACCA CTTCCTTGCT TTTTCCAGCC ATG AAT GCT TCC AGT CGG AAT 51 Met Asn Ala Ser Ser Arg Asn 1 5 GTG TTT GAC ACG TTG ATC AGG GTG TTG ACA GAA AGT ATG TTC AAA CAT 99 Val Phe Asp Thr Leu Ile Arg Val Leu Thr Glu Ser Met Phe Lys His 10 15 20 CTT CGG AAA TGG GTC GTC ACT CGC TTT TTT GGG CAT TCT CGG CAA AGA 147 Leu Arg Lys Trp Val Val Thr Arg Phe Phe Gly His Ser Arg Gln Arg 25 30 35 GCA AGG CTA GTC TCC AAA GAT GGA AGG TGC AAC ATA GAA TTT GGC AAT 195 Ala Arg Leu Val Ser Lys Asp Gly Arg Cys Asn Ile Glu Phe Gly Asn 40 45 50 55 GTG GAG GCA CAG TCA AGG TTT ATA TTC TTT GTG GAC ATC TGG ACA ACG 243 Val Glu Ala Gln Ser Arg Phe Ile Phe Phe Val Asp Ile Trp Thr Thr 60 65 70 GTA CTT GAC CTC AAG TGG AGA TAC AAA ATG ACC ATT TTC ATC ACA GCC 291 Val Leu Asp Leu Lys Trp Arg Tyr Lys Met Thr Ile Phe Ile Thr Ala 75 80 85 TTC TTG GGG AGT TGG TTT TTC TTT GGT CTC CTG TGG TAT GCA GTA GCG 339 Phe Leu Gly Ser Trp Phe Phe Phe Gly Leu Leu Trp Tyr Ala Val Ala 90 95 100 TAC ATT CAC AAA GAC CTC CCG GAA TTC CAT CCT TCT GCC AAT CAC ACT 387 Tyr Ile His Lys Asp Leu Pro Glu Phe His Pro Ser Ala Asn His Thr 105 110 115 CCC TGT GTG GAG AAT ATT AAT GGC TTG ACC TCA GCT TTT CTG TTT TCT 435 Pro Cys Val Glu Asn Ile Asn Gly Leu Thr Ser Ala Phe Leu Phe Ser 120 125 130 135 CTG GAG ACT CAA GTG ACC ATT GGA TAT GGA TTC AGG TGT GTG ACA GAA 483 Leu Glu Thr Gln Val Thr Ile Gly Tyr Gly Phe Arg Cys Val Thr Glu 140 145 150 CAG TGT GCC ACT GCC ATT TTT CTG CTT ATC TTT CAG TCT ATA CTT GGA 531 Gln Cys Ala Thr Ala Ile Phe Leu Leu Ile Phe Gln Ser Ile Leu Gly 155 160 165 GTT ATA ATC AAT TCT TTC ATG TGT GGG GCC ATC TTA GCC AAG ATC TCC 579 Val Ile Ile Asn Ser Phe Met Cys Gly Ala Ile Leu Ala Lys Ile Ser 170 175 180 AGG CCC AAA AAA CGT GCC AAG ACC ATT ACG TTC AGC AAG AAC GCA GTG 627 Arg Pro Lys Lys Arg Ala Lys Thr Ile Thr Phe Ser Lys Asn Ala Val 185 190 195 ATC AGC AAA CGG GGA GGG AAG CTT TGC CTC CTA ATC CGA GTG GCT AAT 675 Ile Ser Lys Arg Gly Gly Lys Leu Cys Leu Leu Ile Arg Val Ala Asn 200 205 210 215 CTC AGG AAG AGC CTT CTT ATT GGC AGT CAC ATT TAT GGA AAG CTT CTG 723 Leu Arg Lys Ser Leu Leu Ile Gly Ser His Ile Tyr Gly Lys Leu Leu 220 225 230 AAG ACC ACA GTC ACT CCT GAA GGA GAG ACC ATT ATT TTG GAC CAG ATC 771 Lys Thr Thr Val Thr Pro Glu Gly Glu Thr Ile Ile Leu Asp Gln Ile 235 240 245 AAT ATC AAC TTT GTA GTT GAC GCT GGG AAT GAA AAT TTA TTC TTC ATC 819 Asn Ile Asn Phe Val Val Asp Ala Gly Asn Glu Asn Leu Phe Phe Ile 250 255 260 TCC CCA TTG ACA ATT TAC CAT GTC ATT GAT CAC AAC AGC CCT TTC TTC 867 Ser Pro Leu Thr Ile Tyr His Val Ile Asp His Asn Ser Pro Phe Phe 265 270 275 CAC ATG GCA GCG GAG ACC CTT CTC CAG CAG GAC TTT GAA TTA GTG GTG 915 His Met Ala Ala Glu Thr Leu Leu Gln Gln Asp Phe Glu Leu Val Val 280 285 290 295 TTT TTA GAT GGC ACA GTG GAG TCC ACC AGT GCT ACC TGC CAA GTC CGG 963 Phe Leu Asp Gly Thr Val Glu Ser Thr Ser Ala Thr Cys Gln Val Arg 300 305 310 ACA TCC TAT GTC CCA GAG GAG GTG CTT TGG GGC TAC CGT TTT GCT CCC 1011 Thr Ser Tyr Val Pro Glu Glu Val Leu Trp Gly Tyr Arg Phe Ala Pro 315 320 325 ATA GTA TCC AAG ACA AAG GAA GGG AAA TAC CGA GTG GAT TTC CAT AAC 1059 Ile Val Ser Lys Thr Lys Glu Gly Lys Tyr Arg Val Asp Phe His Asn 330 335 340 TTT AGC AAG ACA GTG GAA GTG GAG ACC CCT CAC TGT GCC ATG TGC CTT 1107 Phe Ser Lys Thr Val Glu Val Glu Thr Pro His Cys Ala Met Cys Leu 345 350 355 TAT AAT GAG AAA GAT GTT AGA GCC AGG ATG AAG AGA GGC TAT GAC AAC 1155 Tyr Asn Glu Lys Asp Val Arg Ala Arg Met Lys Arg Gly Tyr Asp Asn 360 365 370 375 CCC AAC TTC ATC TTG TCA GAA GTC AAT GAA ACA GAT GAC ACC AAA ATG 1203 Pro Asn Phe Ile Leu Ser Glu Val Asn Glu Thr Asp Asp Thr Lys Met 380 385 390 TAA CAGTGGCTTT TCAACGGGAG TAAAGCAAAG TCTCTAAAGC TCCTAGTACC 1256 * TAGAAGCATT ATGAAGCAGT CAACAATTTA GGGGTACGAA AGTAGGATGA GAGCCTTCAA 1316 AGTCTACCAG CACAAAGACC CCTGAGCCCC GCAATTGTGA TCCCACAAGA CATGCATCTC 1376 CACAAGGCTA CTGTATTAGA ACGTGCAATG CATTTATATG AAACTGGTGT ATGGAAGACA 1436 TAGGTGCTCT CTTGAAATCT TAAATATGAT TATTTGAGCT CATATAAGGT GGATTGGAGC 1496 AGATAAAATT ATCAAAAGTT TCATGAACAG GCCAAACAAA ATATTTTTTA AAGTTTCCTT 1556 AAAGAAGTTA TGAACTTTAG AAAGGATCAG GGCCG 1591
【図1】 cDNAクローンK26によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの最初の塩基配列図
である。
オープン・リーディング・フレームの最初の塩基配列図
である。
【図2】 cDNAクローンK26によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの図1に続く塩基配
列図である。
オープン・リーディング・フレームの図1に続く塩基配
列図である。
【図3】 cDNAクローンK−26によりコードされ
るオープン・リーディング・フレームの図2に続く塩基
配列図である。
るオープン・リーディング・フレームの図2に続く塩基
配列図である。
【図4】 cDNAクローンK26−プラスによりコー
ドされるオープン・リーディング・フレームの最初の塩
基配列図である。
ドされるオープン・リーディング・フレームの最初の塩
基配列図である。
【図5】 cDNAクローンK26−プラスによりコー
ドされるオープン・リーディング・フレームの図4に続
く塩基配列図である。
ドされるオープン・リーディング・フレームの図4に続
く塩基配列図である。
【図6】 cDNAクローンK−26−プラスによりコ
ードされるオープン・リーディング・フレームの図5に
続く塩基配列図である。
ードされるオープン・リーディング・フレームの図5に
続く塩基配列図である。
【図7】 cDNAクローンK11によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの最初の塩基配列図
である。
オープン・リーディング・フレームの最初の塩基配列図
である。
【図8】 cDNAクローンK11によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの図7に続く塩基配
列図である。
オープン・リーディング・フレームの図7に続く塩基配
列図である。
【図9】 cDNAクローンK11によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの図8に続く塩基配
列図である。
オープン・リーディング・フレームの図8に続く塩基配
列図である。
【図10】 cDNAクローンK11−プラスによりコ
ードされるオープン・リーディング・フレームの最初の
塩基配列図である。
ードされるオープン・リーディング・フレームの最初の
塩基配列図である。
【図11】 cDNAクローンK11−プラスによりコ
ードされるオープン・リーディング・フレームの図10
に続く塩基配列図である。
ードされるオープン・リーディング・フレームの図10
に続く塩基配列図である。
【図12】 cDNAクローンK11−プラスによりコ
ードされるオープン・リーディング・フレームの図11
に続く塩基配列図である。
ードされるオープン・リーディング・フレームの図11
に続く塩基配列図である。
【図13】 cDNAクローンK8によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの最初の塩基配列図
である。
オープン・リーディング・フレームの最初の塩基配列図
である。
【図14】 cDNAクローンK8によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの図13に続く塩基
配列図である。
オープン・リーディング・フレームの図13に続く塩基
配列図である。
【図15】 cDNAクローンK8によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの図14に続く塩基
配列図である。
オープン・リーディング・フレームの図14に続く塩基
配列図である。
【図16】 ヒト腎臓K−ATPチャンネルタンパク質
のアミノ酸配列図である。
のアミノ酸配列図である。
【図17】 K−8cRNAを注入したアフリカツメガ
エル卵母細胞からの50mM外部K+中で記録した電流
パターンを示す図である。
エル卵母細胞からの50mM外部K+中で記録した電流
パターンを示す図である。
【図18】 K11cRNAを注入したアフリカツメガ
エル卵母細胞からの50mM外部K+中で記録した電流
パターンを示す図である。
エル卵母細胞からの50mM外部K+中で記録した電流
パターンを示す図である。
【図19】 K26cRNAを注入したアフリカツメガ
エル卵母細胞からの50mM外部K+中で記録した電流
パターンを示す図である。
エル卵母細胞からの50mM外部K+中で記録した電流
パターンを示す図である。
【図20】 K−8cRNAを注入したアフリカツメガ
エル卵母細胞における膜電位(mV)と電流(μA)の関係
を示すグラフである。
エル卵母細胞における膜電位(mV)と電流(μA)の関係
を示すグラフである。
【図21】 K−11cRNAを注入したアフリカツメ
ガエル卵母細胞における膜電位(mV)と電流(μA)の関
係を示すグラフである。
ガエル卵母細胞における膜電位(mV)と電流(μA)の関
係を示すグラフである。
【図22】 K−26cRNAを注入したアフリカツメ
ガエル卵母細胞における膜電位(mV)と電流(μA)の関
係を示すグラフである。
ガエル卵母細胞における膜電位(mV)と電流(μA)の関
係を示すグラフである。
【図23】 K−8についての外部K+濃度(mM)と逆
転電位(mV)との関係を示すグラフである。
転電位(mV)との関係を示すグラフである。
【図24】 K11についての外部K+濃度(mM)と逆
転電位(mV)との関係を示すグラフである。
転電位(mV)との関係を示すグラフである。
【図25】 K26についての外部K+濃度(mM)と逆
転電位(mV)との関係を示すグラフである。
転電位(mV)との関係を示すグラフである。
【図26】 K−8についての外部K+濃度(mM)とカ
リウムチャンネルの膜コンダクタンス(g/gmax)との関
係を示すグラフである。
リウムチャンネルの膜コンダクタンス(g/gmax)との関
係を示すグラフである。
【図27】 K11についての外部K+濃度(mM)とカ
リウムチャンネルの膜コンダクタンス(g/gmax)との関
係を示すグラフである。
リウムチャンネルの膜コンダクタンス(g/gmax)との関
係を示すグラフである。
【図28】 K26についての外部K+濃度(mM)とカ
リウムチャンネルの膜コンダクタンス(g/gmax)との関
係を示すグラフである。
リウムチャンネルの膜コンダクタンス(g/gmax)との関
係を示すグラフである。
【図29】 ACASサイトメーターでの分析結果を示
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。中抜き三角は一時的にK26K+チャンネルを発現
しているCOS 7細胞に1mMのBa++を添加した場
合、黒丸は野生型のCOS 7細胞に1mMのBa++を
添加した場合を示す。
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。中抜き三角は一時的にK26K+チャンネルを発現
しているCOS 7細胞に1mMのBa++を添加した場
合、黒丸は野生型のCOS 7細胞に1mMのBa++を
添加した場合を示す。
【図30】 ACASサイトメーターでの分析結果を示
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。中抜き三角はK26K+cDNAでトランスフェク
トしたHEK293細胞に3mMBa++を添加した場
合、黒丸は野生型のHEK細胞に3mMのBa++を添加
した場合を示す。
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。中抜き三角はK26K+cDNAでトランスフェク
トしたHEK293細胞に3mMBa++を添加した場
合、黒丸は野生型のHEK細胞に3mMのBa++を添加
した場合を示す。
【図31】 ACASサイトメーターでの分析結果を示
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。黒丸はROMK1 K+チャンネルを一時的にCO
S細胞で発現させ、2mMのBa++を添加した場合、中
抜き丸は野生型COS細胞に2mMのBa++を添加した
場合を示す。
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。黒丸はROMK1 K+チャンネルを一時的にCO
S細胞で発現させ、2mMのBa++を添加した場合、中
抜き丸は野生型COS細胞に2mMのBa++を添加した
場合を示す。
【図32】 ACASサイトメーターでの分析結果を示
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。中抜き三角はROMK1 K+チャンネルを安定に
発現しているCOS 7細胞に100μMグリブリドを
添加した場合、黒丸は野生型COS 7細胞に100μ
Mグリブリドを添加した場合を示す。
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。中抜き三角はROMK1 K+チャンネルを安定に
発現しているCOS 7細胞に100μMグリブリドを
添加した場合、黒丸は野生型COS 7細胞に100μ
Mグリブリドを添加した場合を示す。
【図33】 ACASサイトメーターでの分析結果を示
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。中抜き三角はROMK1 K+チャンネルを安定に
発現しているCOS 7細胞に100μMグリピシドを
添加した場合、黒丸は野生型COS 7細胞に100μ
Mグリピシドを添加した場合を示す。
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。中抜き三角はROMK1 K+チャンネルを安定に
発現しているCOS 7細胞に100μMグリピシドを
添加した場合、黒丸は野生型COS 7細胞に100μ
Mグリピシドを添加した場合を示す。
【図34】 FLIPRにより測定した膜電位の変化を
示すグラフであり、対照である溶媒をA10平滑筋細胞
に添加した場合を示す。
示すグラフであり、対照である溶媒をA10平滑筋細胞
に添加した場合を示す。
【図35】 FLIPRにより測定した膜電位の変化を
示すグラフであり、5mM KCl中で増殖しているA
10平滑筋細胞に3mMのKClを添加した場合を示
す。
示すグラフであり、5mM KCl中で増殖しているA
10平滑筋細胞に3mMのKClを添加した場合を示
す。
【図36】 FLIPRにより測定した膜電位の変化を
示すグラフであり、A10平滑筋細胞に30mMのKC
lを添加した場合を示す。
示すグラフであり、A10平滑筋細胞に30mMのKC
lを添加した場合を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 1/21 8828−4B 5/10 15/09 ZNA C12P 21/02 C 9282−4B //(C12Q 1/02 C12R 1:91) (C12N 1/19 C12R 1:865) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12N 5/00 B C12R 1:91)
Claims (28)
- 【請求項1】 K−8、K−11もしくはK−12と命
名されたクローンからの、またはその自明な変形から選
択された誘導体からの図1〜3、4〜6、7〜9、10
〜12、または13〜15で示した配列を有するか、あ
るいはK−2、K−6、K−8、K−11もしくはK−
26と命名されたクローンからの: K11 (欠損)−MFKHLR..... K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K26 MPTVYLCSEQ−IRVLTES−MF
KLHR..... K−8 MNASSRNVFDTL−IRVLTES−
MFKLHR..... および K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... よりなる群から選択されるN−末端タンパク質配列およ
び K11 (欠損)−MFKHLR..... K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K26 MPTVYLCSEQ−IRVLTES−MF
KLHR..... K−8 MNASSRNVFDTL−IRVLTES−
MFKLHR..... および K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... には示されていないが図1〜3、4〜6、7〜9、10
〜12、または13〜15に示されている残りのDNA
を有するか、あるいは図1〜3、4〜6、7〜9、10
〜12、または13〜15に示したDNAによってコー
ドされたタンパク質、または図16または K11 (欠損)−MFKHLR..... K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K26 MPTVYLCSEQ-IRVLTES-MFKLHR..... K−8 MNASSRNVFDTL−IRVLTES−
MFKLHR..... および K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... に示されているタンパク質のいずれかの欠損を含めた約
最初の26個のN末端アミノ酸のいずれかをコードする
DNAを有するヒト腎臓カリウムチャンネルタンパク質
をコードする単離されたDNA分子、またはその前記D
NA分子のいずれかに90%相同のDNA分子。 - 【請求項2】 クローンK26を記載し、図1〜3に示
す配列、または図1〜3とほぼ同一の配列、または図1
〜3からの自明な変形配列を有し、請求項1のヒト腎臓
カリウムチャンネルをコードする請求項1記載の単離し
たDNA分子、またはその90%相同性DNA分子。 - 【請求項3】 クローンK26−プラスを記載し、図4
〜6に示す配列、または図4〜6とほぼ同一の配列、ま
たは図4〜6からの自明な変形配列を有し、請求項1の
ヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする請求項1記載
の単離したDNA分子、またはその90%相同性DNA
分子。 - 【請求項4】 クローンK11を記載し、図7〜9に示
す配列、または図7〜9とほぼ同一の配列、または図7
〜9からの自明な変形配列を有し、請求項1のヒト腎臓
カリウムチャンネルをコードする請求項1記載の単離し
たDNA分子、またはその90%相同性DNA分子。 - 【請求項5】 クローンK11−プラスを記載し、図1
0〜12に示す配列、または図10〜12とほぼ同一の
配列、または図10〜12からの自明な変形配列を有
し、請求項1のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードす
る請求項1記載の単離したDNA分子、またはその90
%相同性DNA分子。 - 【請求項6】 クローンK−8を記載し、図13〜15
に示す配列、または図13〜15とほぼ同一の配列、ま
たは図13〜15からの自明な変形配列を有し、請求項
1のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする請求項1
記載の単離したDNA分子、またはその90%相同性D
NA分子。 - 【請求項7】 クローンK−2を記載し、K2 MCF
Q−IRVLTES−MFKHLR.....のタンパク質
配列、またはK2 MCFQ−IRVLTES−MFK
HLR.....に示される配列とほぼ同一の配列、または
K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHLR.....
に示されるK−2のタンパク質配列につきコードするD
NAの自明な変形、またはその配列に対し90%相同の
DNA分子を有し、かつ図1〜3、図4〜6、7〜9、
10〜12、13〜15で示される配列に90%相同の
残りの配列を有し、かつROM−K1もしくはK8のN
−末端配列からの、すなわちタンパク質配列MFKHL
R等からの20個のアミノ酸で始まる配列で開始する請
求項1記載のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする
請求項1記載の単離されたDNA分子。 - 【請求項8】 クローンK−6を記載し、K−6 MV
SEL SIPSIPTGVAGLSK−IRVLTES
−MFKLHR.....のタンパク質配列、またはK−6
MVSELSIPSIPTGVAGLSK−IRVL
TES−MFKLHR.....に示される配列とほぼ同一
の配列、またはK−6 MVSELSIPSIPTGV
AGLSK−IRVLTES−MFKLHR.....に示
されるK−6のタンパク質配列につきコードするDNA
の自明な変形、またはその配列に対し90%相同のDN
A分子を有し、かつ図1〜3、図4〜6、7〜9、10
〜12、13〜15で示される配列に90%相同の残り
の配列を有し、かつROM−K1もしくはK8のN−末
端配列からの、すなわちタンパク質配列MFKHLR等
からの20個のアミノ酸で始まる配列で開始する請求項
1記載のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする請求
項1記載の単離されたDNA分子。 - 【請求項9】 請求項1記載のDNA分子からなるベク
ター。 - 【請求項10】 請求項1記載のDNA分子からなるプ
ラスミド。 - 【請求項11】 細菌細胞での発現に適合する請求項9
記載のベクター。 - 【請求項12】 哺乳動物細胞での発現に適合する請求
項9記載のベクター。 - 【請求項13】 酵母細胞での発現に適合する請求項9
記載のベクター。 - 【請求項14】 細菌細胞での発現に適合する請求項1
0記載のプラスミド。 - 【請求項15】 哺乳動物細胞での発現に適合する請求
項10記載のプラスミド。 - 【請求項16】 酵母細胞での発現に適合する請求項1
0記載のプラスミド。 - 【請求項17】 請求項14記載のプラスミドからなる
細菌細胞。 - 【請求項18】 請求項15記載のプラスミドからなる
単離哺乳動物細胞。 - 【請求項19】 請求項16記載のプラスミドからなる
酵母細胞。 - 【請求項20】 請求項17記載の細菌細胞を用いて、
ヒト腎臓カリウムチャンネル活性を調節する化合物をス
クリーニングする方法。 - 【請求項21】 請求項18記載の単離哺乳動物細胞を
用いて、ヒト腎臓カリウムチャンネル活性を調節する化
合物をスクリーニングする方法。 - 【請求項22】 以下の工程: a)クローン化K+チャンネルを発現する細胞を密集す
るまで増殖させ、 b)a)の細胞を平衡塩溶液で平衡化し、 c)該平衡化細胞のベースライン測定を行い、 d)一のテスト化合物またはテスト化合物のカクテルを
該細胞に添加し、膜ポテンシャルの変化を記録し、 e)野生型または偽トランスフェクトした対照に対しK
+を発現する細胞を脱分極化させる化合物をテストし
て、選択性を確立し、 f)選択的にK+をブロックすることが示される化合物
を選択することを特徴とする請求項21記載の方法。 - 【請求項23】 以下の工程: a)96穴マイクロプレートでクローン化K8、K1
1、K26または関連するK+チャンネルを発現する細
胞を密集するまで増殖させ、 b)a)の細胞を、20mM HEPESを含有する平
衡塩液中の5μMのDiBAC4のごとき平衡塩溶液で
平衡化し、 c)該平衡化細胞のベースライン測定を行い、 d)一のテスト化合物またはテスト化合物のカクテルを
該細胞に添加し、膜ポテンシャルの変化を記録し、 e)野生型または偽トランスフェクトした対照に対しK
+を発現する細胞を脱分極させる化合物をテストして、
選択性を確立し、 f)選択的にK+をブロックすることが示される化合物
を選択することを特徴とする請求項21記載の方法。 - 【請求項24】 請求項19記載の酵母細胞を用いて、
ヒト腎臓カリウムチャンネル活性を調節する化合物をス
クリーニングする方法。 - 【請求項25】 K−8、K−11、もしくはK−12
と命名されたクローン、またはその自明な変形から選択
された誘導体からの図1〜3、4〜6、7〜9、10〜
12、または13〜15に示された配列を有するか、あ
るいはK−2、K−6、K−8、K−11、またはK−
26と命名されたクローンからの: K11 (欠損)−MFKHLR..... K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K26 MPTVYLCSEQ−IRVLTES−MF
KLHR..... K−8 MNASSRNVFDTL−IRVLTES−
MFKLHR..... および K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... よりなる群から選択されるN−末端タンパク質配列から
のタンパク質を有し、かつ K11 (欠損)−MFKHLR..... K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K26 MPTVYLCSEQ−IRVLTES−MF
KLHR..... K−8 MNASSRNVFDTL−IRVLTES−
MFKLHR..... および K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... には示されていないが、図1〜3、4〜6、7〜9、1
0〜12、13〜15に示されている残りのアミノ酸を
有するか、あるいは図1〜3、4〜6、7〜9、10〜
12、13〜15に示されるDNAによってコードされ
る約最初の26個のN末端アミノ酸のアミノ酸、または
図16または K11 (欠損)−MFKHLR..... K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K26 MPTVYLCSEQ−IRVLTES−MF
KLHR..... K−8 MNASSRNVFDTL−IRVLTES−
MFKLHR..... および K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... に示されたタンパク質、またはその前記DNA分子いず
れかに90%相同のDNA分子からのタンパク質を有す
るヒト腎臓カリウムチャンネルタンパク質として哺乳動
物細胞で機能する単離されたタンパク質。 - 【請求項26】 K−8、K−11もしくはK−12と
命名されたクローン、またはその自明な変形から選択さ
れた誘導体、またはその90%相同配列からの図1〜
3、4〜6、7〜9、10〜12、13〜15に示され
た配列を有するヒト腎臓カリウムチャンネルタンパク質
として哺乳動物細胞で機能する請求項25記載の単離さ
れたタンパク質。 - 【請求項27】 K−2、K−6と命名されたクローン
からの K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... に示されたN-末端タンパク質配列についての該末端タ
ンパク質配列を有し、かつ K2 MCFQ−IRVLTES−MFKHL
R..... K−6 MVSELSIPSIPTGVAGLSK−I
RVLTES−MFKLHR..... み示されているが、図1〜3、図4〜6、7〜9、10
〜12、13〜15に示されている残りのアミノ酸を有
する哺乳動物細胞で機能する請求項25記載の単離され
たタンパク質。 - 【請求項28】 いずれの欠損も含めた、図1〜3、図
4〜6、7〜9、10〜12、13〜15に示されたD
NAによってコードされたタンパク質の約最初の26個
のN末端アミノ酸のいずれかのN−末端タンパク質配列
についての該末端タンパク質、あるいは図16に示した
タンパク質、あるいはその前記DNA分子のいずれかに
90%相同のDNA分子からのタンパク質を有する哺乳
動物細胞で機能する請求項25記載のタンパク質。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6130249A JPH08287A (ja) | 1994-06-13 | 1994-06-13 | 腎臓atp−依存性ナトリウムチャンネルをコードするヒトdna配列 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6130249A JPH08287A (ja) | 1994-06-13 | 1994-06-13 | 腎臓atp−依存性ナトリウムチャンネルをコードするヒトdna配列 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH08287A true JPH08287A (ja) | 1996-01-09 |
Family
ID=15029727
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6130249A Pending JPH08287A (ja) | 1994-06-13 | 1994-06-13 | 腎臓atp−依存性ナトリウムチャンネルをコードするヒトdna配列 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH08287A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4954800A (en) * | 1986-05-20 | 1990-09-04 | Canon Kabushiki Kaisha | Magnet and method of manufacturing the same |
US9624464B2 (en) * | 2007-10-03 | 2017-04-18 | 3M Innovative Properties Company | Microorganism concentration process |
-
1994
- 1994-06-13 JP JP6130249A patent/JPH08287A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4954800A (en) * | 1986-05-20 | 1990-09-04 | Canon Kabushiki Kaisha | Magnet and method of manufacturing the same |
US9624464B2 (en) * | 2007-10-03 | 2017-04-18 | 3M Innovative Properties Company | Microorganism concentration process |
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