JPH08196282A - サイトメガロウイルスの読み枠UL57およびテグメント蛋白質pp150のC端領域に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび融合蛋白質、これらを含む診断検査キット、サイトメガロウイルスおよびDNAオリゴヌクレオチドに対する抗体の検出法 - Google Patents
サイトメガロウイルスの読み枠UL57およびテグメント蛋白質pp150のC端領域に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび融合蛋白質、これらを含む診断検査キット、サイトメガロウイルスおよびDNAオリゴヌクレオチドに対する抗体の検出法Info
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- JPH08196282A JPH08196282A JP7189080A JP18908095A JPH08196282A JP H08196282 A JPH08196282 A JP H08196282A JP 7189080 A JP7189080 A JP 7189080A JP 18908095 A JP18908095 A JP 18908095A JP H08196282 A JPH08196282 A JP H08196282A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 サイトメガロウイルスに由来するアミノ酸配
列を提供する。 【解決手段】 サイトメガロウイルスに由来し、主DN
A結合蛋白質の領域またはサイトメガロウイルスの抗原
性蛋白質からの他の断片少なくとも一つと融合したテグ
メント蛋白質pp150のC端領域に対応するアミノ酸
配列を含むポリペプチドおよび融合蛋白質を開示する。
この主DNA結合蛋白質には読み枠UL57がコードさ
れている。この発明のポリペプチドおよび融合蛋白質は
サイトメガロウイルスに対するIgM抗体を検出するた
めの診断検査およびその方法において有利に使用するこ
とができる。
列を提供する。 【解決手段】 サイトメガロウイルスに由来し、主DN
A結合蛋白質の領域またはサイトメガロウイルスの抗原
性蛋白質からの他の断片少なくとも一つと融合したテグ
メント蛋白質pp150のC端領域に対応するアミノ酸
配列を含むポリペプチドおよび融合蛋白質を開示する。
この主DNA結合蛋白質には読み枠UL57がコードさ
れている。この発明のポリペプチドおよび融合蛋白質は
サイトメガロウイルスに対するIgM抗体を検出するた
めの診断検査およびその方法において有利に使用するこ
とができる。
Description
【0001】ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)に
よるヒトの感染症は広く分布し、一般に小児期の間は症
状なしに進行する。HCMV特異的IgG抗体は発症し
たまたは潜伏している感染のためのマーカーとして、母
集団に依存して成人の50〜90%に検出される。移植
患者およびHIV感染症患者のような免疫力低下患者に
おける先天性感染症および急性感染症は致死的疾患を起
こすこともある。早期の効果的な抗ウイルス処置を確保
するためには、急性感染症が存在するかどうか確定する
ことは重要である。急性HCMV感染症の診断のために
種々の方法を用いることができる。殊に定期的な同時診
断法が可能な移植患者では、高感度のためにpp65特
異的抗原血症検査法およびPCRが近年多数採用される
ようになった。臨床検査室では通常、例えばウイルス分
別診断に関してまたは妊娠スクリーニングの間に、細胞
培養物中の病原の検出および、殊にELISA中で特定
の抗体の血清学的検出によって急性感染症が診断され
る。多かれ少なかれ精製した、特定不十分なHCMV感
染細胞培養物のリゼイトを近年特定抗原として抗体検出
のために専ら使用している。このため、特にIgM検出
においては特異性および感度に問題を起こす。種々の組
換え抗原および化学合成ペプチドと診断との相関を扱っ
ている多数の報告が存在する。最近までに得られた結果
はM.P.Landini:「ヒトサイトメガロウイル
ス蛋白質に対する抗体反応(Antibody・Res
ponses・to・Human・Cytomegal
ovirus・Proteins)」、Reviews
・in・Medical・Virology、2巻、6
3〜72頁(1992年)に綜説されている。
よるヒトの感染症は広く分布し、一般に小児期の間は症
状なしに進行する。HCMV特異的IgG抗体は発症し
たまたは潜伏している感染のためのマーカーとして、母
集団に依存して成人の50〜90%に検出される。移植
患者およびHIV感染症患者のような免疫力低下患者に
おける先天性感染症および急性感染症は致死的疾患を起
こすこともある。早期の効果的な抗ウイルス処置を確保
するためには、急性感染症が存在するかどうか確定する
ことは重要である。急性HCMV感染症の診断のために
種々の方法を用いることができる。殊に定期的な同時診
断法が可能な移植患者では、高感度のためにpp65特
異的抗原血症検査法およびPCRが近年多数採用される
ようになった。臨床検査室では通常、例えばウイルス分
別診断に関してまたは妊娠スクリーニングの間に、細胞
培養物中の病原の検出および、殊にELISA中で特定
の抗体の血清学的検出によって急性感染症が診断され
る。多かれ少なかれ精製した、特定不十分なHCMV感
染細胞培養物のリゼイトを近年特定抗原として抗体検出
のために専ら使用している。このため、特にIgM検出
においては特異性および感度に問題を起こす。種々の組
換え抗原および化学合成ペプチドと診断との相関を扱っ
ている多数の報告が存在する。最近までに得られた結果
はM.P.Landini:「ヒトサイトメガロウイル
ス蛋白質に対する抗体反応(Antibody・Res
ponses・to・Human・Cytomegal
ovirus・Proteins)」、Reviews
・in・Medical・Virology、2巻、6
3〜72頁(1992年)に綜説されている。
【0002】
【産業上の利用分野】それ故、本発明の目的は診断のた
めに有益なポリペプチドおよび/または融合蛋白質、な
らびにこれらを含む検査キットおよびHCMV急性感染
症の検出法を提供することである。本出願に関しては、
用語「ポリペプチド」はα−アミノ酸からなり、10個
またはそれ以上のアミノ酸を含む生物分子を意味する。
これらポリペプチドの上限に関して、これらが完全蛋白
質または実質的完全蛋白質ではないことに留意すべきで
ある。本発明のポリペプチドが融合蛋白質の型であるな
ら、アミノ酸100個またはそれ以上を含むことも全く
可能である。それらが融合蛋白質の型であるなら、本発
明のポリペプチドがアミノ酸約300個の長さを持つこ
とも全く可能である。しかしながら、本発明のポリペプ
チドがサイトメガロウイルスからの蛋白質の一定領域の
みを含むことが必須である。
めに有益なポリペプチドおよび/または融合蛋白質、な
らびにこれらを含む検査キットおよびHCMV急性感染
症の検出法を提供することである。本出願に関しては、
用語「ポリペプチド」はα−アミノ酸からなり、10個
またはそれ以上のアミノ酸を含む生物分子を意味する。
これらポリペプチドの上限に関して、これらが完全蛋白
質または実質的完全蛋白質ではないことに留意すべきで
ある。本発明のポリペプチドが融合蛋白質の型であるな
ら、アミノ酸100個またはそれ以上を含むことも全く
可能である。それらが融合蛋白質の型であるなら、本発
明のポリペプチドがアミノ酸約300個の長さを持つこ
とも全く可能である。しかしながら、本発明のポリペプ
チドがサイトメガロウイルスからの蛋白質の一定領域の
みを含むことが必須である。
【0003】
【従来の技術】診断検査には2点が殊に重要である。一
方では抗原は高度に特異的でなければならない、すなわ
ち、診断検査では、病原が求めるものであって、別の病
原ではないことを明瞭に識別しなければならない。他
方、診断検査は高感度でなければならない、すなわち、
分析すべきサンプルに比較的少数の抗体が存在していた
としても、求める病原でのすべての感染症が可能な限り
の信頼性をもって検出されなければならない。可能な限
り、誤陽性の検査結果を起こしてはならない。ヒトサイ
トメガロウイルスによってコードされる各蛋白質は一般
に、それらがコードされている読み枠によって特定され
る。Landini(前出)は、例えばHCMウイルス
について既に知られている種々の蛋白質がゲノム上に占
める位置を報告している。それ故、この蛋白質を特定す
るために読み枠を用いることができる。
方では抗原は高度に特異的でなければならない、すなわ
ち、診断検査では、病原が求めるものであって、別の病
原ではないことを明瞭に識別しなければならない。他
方、診断検査は高感度でなければならない、すなわち、
分析すべきサンプルに比較的少数の抗体が存在していた
としても、求める病原でのすべての感染症が可能な限り
の信頼性をもって検出されなければならない。可能な限
り、誤陽性の検査結果を起こしてはならない。ヒトサイ
トメガロウイルスによってコードされる各蛋白質は一般
に、それらがコードされている読み枠によって特定され
る。Landini(前出)は、例えばHCMウイルス
について既に知られている種々の蛋白質がゲノム上に占
める位置を報告している。それ故、この蛋白質を特定す
るために読み枠を用いることができる。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】ヒトサイトメガロウイ
ルスの読み枠UL57は分子量約130から133kD
を持つ所謂主DNA結合蛋白質をコードする。Ande
rsなどはこの蛋白質とその読み枠を特定して、J.V
irology、62巻:1364〜1372頁(19
88年)に報告した。興味深いことに、読み枠UL57
は他のヘルペスウイルス、殊にHHV−6ウイルスおよ
びやや低いがEBV(エプスタインバーウイルス)、の
対応する読み枠に明確な相同性を持つ。他のウイルスの
読み枠に対する相同性に基づいて、UL57がコードす
る主DNA結合蛋白質は交差反応の危険があるので診断
用には不適当と思われた。
ルスの読み枠UL57は分子量約130から133kD
を持つ所謂主DNA結合蛋白質をコードする。Ande
rsなどはこの蛋白質とその読み枠を特定して、J.V
irology、62巻:1364〜1372頁(19
88年)に報告した。興味深いことに、読み枠UL57
は他のヘルペスウイルス、殊にHHV−6ウイルスおよ
びやや低いがEBV(エプスタインバーウイルス)、の
対応する読み枠に明確な相同性を持つ。他のウイルスの
読み枠に対する相同性に基づいて、UL57がコードす
る主DNA結合蛋白質は交差反応の危険があるので診断
用には不適当と思われた。
【0005】しかしながら、本発明に関して驚くべきこ
とに読み枠UL57からの領域は、このアミノ酸配列を
含むポリペプチドおよび融合蛋白質が診断検査に有益な
結果をもたらすので、診断のために殊に有益に使用でき
るということが見出された。本発明に関し、読み枠UL
57から断片3個が得られ、断片UL57/1およびU
L57/3の2個はポリメラーゼ鎖反応により増幅で
き、断片UL57/2は化学的DNA合成により得られ
た。これらのDNA断片を発現ベクター(pGEX−
3)に再クローンし、これにより融合蛋白質(グルタチ
オンS−トランスフェラーゼ(GST)を持つ)の型で
ウイルス抗原の発現ができる。この融合抗原を精製し、
ELISA実験で選択された血清について検定した。こ
こで、驚くべきことに、57AAからなる抗原断片UL
57/3は急性HCMV感染症におけるIgM抗体の特
異的で高感度な検出のための優れた抗原であることが見
出された。これに対して、他の断片2個は診断には関連
がないことが証明された。UL57/3はそのサイズが
小さいために大腸菌内では非融合蛋白質としては発現さ
れ難いので、他の診断的に関連あるHCMV抗原断片で
あって特異的で高感度のIgM血清学的診断に有意義な
ものとともにオートロガス融合蛋白質として発現を行っ
た。オートロガス融合蛋白質52/3・57/3の場合
には、p52のアミノ酸297〜433についてC端か
ら発現を行った。オートロガス融合蛋白質52/3・5
7/3・150/7の場合には、pp150の54C端
アミノ酸を57/3のC端に付加的に発現した。UL5
7/3はさらにペプチドとして化学的に合成した。
とに読み枠UL57からの領域は、このアミノ酸配列を
含むポリペプチドおよび融合蛋白質が診断検査に有益な
結果をもたらすので、診断のために殊に有益に使用でき
るということが見出された。本発明に関し、読み枠UL
57から断片3個が得られ、断片UL57/1およびU
L57/3の2個はポリメラーゼ鎖反応により増幅で
き、断片UL57/2は化学的DNA合成により得られ
た。これらのDNA断片を発現ベクター(pGEX−
3)に再クローンし、これにより融合蛋白質(グルタチ
オンS−トランスフェラーゼ(GST)を持つ)の型で
ウイルス抗原の発現ができる。この融合抗原を精製し、
ELISA実験で選択された血清について検定した。こ
こで、驚くべきことに、57AAからなる抗原断片UL
57/3は急性HCMV感染症におけるIgM抗体の特
異的で高感度な検出のための優れた抗原であることが見
出された。これに対して、他の断片2個は診断には関連
がないことが証明された。UL57/3はそのサイズが
小さいために大腸菌内では非融合蛋白質としては発現さ
れ難いので、他の診断的に関連あるHCMV抗原断片で
あって特異的で高感度のIgM血清学的診断に有意義な
ものとともにオートロガス融合蛋白質として発現を行っ
た。オートロガス融合蛋白質52/3・57/3の場合
には、p52のアミノ酸297〜433についてC端か
ら発現を行った。オートロガス融合蛋白質52/3・5
7/3・150/7の場合には、pp150の54C端
アミノ酸を57/3のC端に付加的に発現した。UL5
7/3はさらにペプチドとして化学的に合成した。
【0006】
【課題を解決するための手段】それ故、本発明はサイト
メガロウイルス(HCMV)に由来し、主DNA結合蛋
白質をコードするHCMウイルスの読み枠UL57に由
来するアミノ酸配列を含む次のアミノ酸配列:
メガロウイルス(HCMV)に由来し、主DNA結合蛋
白質をコードするHCMウイルスの読み枠UL57に由
来するアミノ酸配列を含む次のアミノ酸配列:
【化2】Gly・Val・Pro・Gly・Gly・G
ly・Ala・Gly・Gly・Gly・Gly・Gl
y・Arg・Asp・Val・Ser・Gly・Gly
・Pro・Ser・Asp・Gly・Leu・Gly・
Gly・Gly・Arg・Gly・Gly・Gly・G
ly・Gly・Gly・Asp・Ser・Gly・Gl
y・Met・Met・Gly・Arg・Gly・Gly
・Arg・Met・Leu・Gly・Ala・Ser・
Val・Asp・Arg・Thr・Tyr・Arg・L
eu・Asn に対して少なくとも60%の相同性を持つポリペプチド
に関する。この発明のポリペプチドは、好ましくは、前
記アミノ酸配列に対して少なくとも80%の相同性を持
つ。殊に好適な態様において、この発明のポリペプチド
は前記アミノ酸配列またはその部分配列を持つ。この発
明のポリペプチドは通常少なくとも10アミノ酸長を持
つが、しかしながら、少なくとも25アミノ酸長を持つ
ポリペプチドは好適であり、少なくとも40アミノ酸長
のポリペプチドは特に好適である。
ly・Ala・Gly・Gly・Gly・Gly・Gl
y・Arg・Asp・Val・Ser・Gly・Gly
・Pro・Ser・Asp・Gly・Leu・Gly・
Gly・Gly・Arg・Gly・Gly・Gly・G
ly・Gly・Gly・Asp・Ser・Gly・Gl
y・Met・Met・Gly・Arg・Gly・Gly
・Arg・Met・Leu・Gly・Ala・Ser・
Val・Asp・Arg・Thr・Tyr・Arg・L
eu・Asn に対して少なくとも60%の相同性を持つポリペプチド
に関する。この発明のポリペプチドは、好ましくは、前
記アミノ酸配列に対して少なくとも80%の相同性を持
つ。殊に好適な態様において、この発明のポリペプチド
は前記アミノ酸配列またはその部分配列を持つ。この発
明のポリペプチドは通常少なくとも10アミノ酸長を持
つが、しかしながら、少なくとも25アミノ酸長を持つ
ポリペプチドは好適であり、少なくとも40アミノ酸長
のポリペプチドは特に好適である。
【0007】この発明のペプチドはそれ自体公知の化学
的方法(例えば固相合成法)により合成することがで
き、あるいは遺伝子工学法により製造することもでき
る。欧州特許出願87.111726.3号には特異的
抗体の検出用に重要であることが証明されているヒトサ
イトメガロウイルスの構造ホスホ蛋白質(pp150)
が記載されている。
的方法(例えば固相合成法)により合成することがで
き、あるいは遺伝子工学法により製造することもでき
る。欧州特許出願87.111726.3号には特異的
抗体の検出用に重要であることが証明されているヒトサ
イトメガロウイルスの構造ホスホ蛋白質(pp150)
が記載されている。
【0008】HCMVに対するIgG抗体はヒトサイト
メガロウイルスによる感染症がいつか起きていたことを
示す。一方、HCMVに対するIgM抗体の力価を測定
することによって、HCMウイルスによる新感染がある
かどうかが確認できる。この質問に対する回答は前記の
危険を持つ患者および妊娠中の女性に対して重要性が大
きい。このような検査については検出が高度に特異的で
高度に感受性であることが殊に重要である。もし陽性に
なる数が多過ぎるが非確認的な結果が得られると、その
検査の決定的とは言い難い。しかしながら、一方で検査
は十分な確実性をもって新しいHCMV感染を示さなけ
ればならないが、結果が誤陽性となる数は可能な限り減
らさなければならない。
メガロウイルスによる感染症がいつか起きていたことを
示す。一方、HCMVに対するIgM抗体の力価を測定
することによって、HCMウイルスによる新感染がある
かどうかが確認できる。この質問に対する回答は前記の
危険を持つ患者および妊娠中の女性に対して重要性が大
きい。このような検査については検出が高度に特異的で
高度に感受性であることが殊に重要である。もし陽性に
なる数が多過ぎるが非確認的な結果が得られると、その
検査の決定的とは言い難い。しかしながら、一方で検査
は十分な確実性をもって新しいHCMV感染を示さなけ
ればならないが、結果が誤陽性となる数は可能な限り減
らさなければならない。
【0009】サイトメガロウイルスのDNA配列は既に
公知である。CheeなどはCurrent・Topi
cs・in・Microbiology・and・Im
munobiology,154巻(1990年)、1
25〜169頁の論文にこのDNA配列の位置およびサ
イトメガロウイルスがコードする配列の分析を記載し
た。この文献は本出願の開示内容に参考として含めるも
のである。
公知である。CheeなどはCurrent・Topi
cs・in・Microbiology・and・Im
munobiology,154巻(1990年)、1
25〜169頁の論文にこのDNA配列の位置およびサ
イトメガロウイルスがコードする配列の分析を記載し
た。この文献は本出願の開示内容に参考として含めるも
のである。
【0010】本発明に関し、テグメント蛋白質pp15
0のC端領域がIgM抗体の検出のためには非常に感受
性の抗原であることが見出されている。本発明に関して
は、これはpp150蛋白質のC端にあるアミノ酸40
個から60個の領域である。pp150蛋白質のアミノ
酸配列は公知であって、これはアミノ酸988から10
48である。pp150テグメント蛋白質のアミノ酸9
94から1048から構成される領域は殊に本発明に関
して好適であって、この領域はここにpp150/7/
2と命名する。
0のC端領域がIgM抗体の検出のためには非常に感受
性の抗原であることが見出されている。本発明に関して
は、これはpp150蛋白質のC端にあるアミノ酸40
個から60個の領域である。pp150蛋白質のアミノ
酸配列は公知であって、これはアミノ酸988から10
48である。pp150テグメント蛋白質のアミノ酸9
94から1048から構成される領域は殊に本発明に関
して好適であって、この領域はここにpp150/7/
2と命名する。
【0011】この発明に従えば、pp150テグメント
蛋白質のこのC端領域はHCMウイルスの別の抗原に由
来するIgM反応性の高い領域に融合する。別の抗原と
は、例えばpp65、pp71、pp28またはgp1
16/58と呼ばれる抗原である。抗原p52、殊に抗
原p52のC端領域は、本発明に関して殊に適当な抗原
であることが証明されている。
蛋白質のこのC端領域はHCMウイルスの別の抗原に由
来するIgM反応性の高い領域に融合する。別の抗原と
は、例えばpp65、pp71、pp28またはgp1
16/58と呼ばれる抗原である。抗原p52、殊に抗
原p52のC端領域は、本発明に関して殊に適当な抗原
であることが証明されている。
【0012】本発明に関し、p52抗原の約100から
150アミノ酸を含むp52のC端からの領域を融合蛋
白質の好ましい別成分として採用される。アミノ酸29
7から433までを含むp52からの領域は、本発明に
関しては特に好適である。
150アミノ酸を含むp52のC端からの領域を融合蛋
白質の好ましい別成分として採用される。アミノ酸29
7から433までを含むp52からの領域は、本発明に
関しては特に好適である。
【0013】本発明に関して、テグメント蛋白質pp1
50と健康血液提供者からの血清とが非常に高いIgM
反応性を示し、ここでは急性感染症の検出用にはこの抗
原の価値は明らかに低いことが見出されている。健康な
血清学的陽性な血液提供者におけるIgM検査での約3
5%に達する陽性の比率は真実性がなく、pp150抗
原全体はIgM抗体の検出には不適当であることを示
す。
50と健康血液提供者からの血清とが非常に高いIgM
反応性を示し、ここでは急性感染症の検出用にはこの抗
原の価値は明らかに低いことが見出されている。健康な
血清学的陽性な血液提供者におけるIgM検査での約3
5%に達する陽性の比率は真実性がなく、pp150抗
原全体はIgM抗体の検出には不適当であることを示
す。
【0014】さらに、p52抗原のC端領域は単に血清
一つとの間の陽性反応を示すことが発見されている。し
かしながら、もしp52のみを抗原として使用するなら
ば、この抗原の感受性は不適切である。本発明はそれ
故、組換えにより製造され、さらにサイトメガロウイル
ス(HCMV)のp150テグメント蛋白質のC端領域
からの断片少なくとも1個を含み、さらにヒトサイトメ
ガロウイルスに由来する別の抗原性蛋白質からの別の断
片少なくとも1個を含む融合蛋白質に関する。
一つとの間の陽性反応を示すことが発見されている。し
かしながら、もしp52のみを抗原として使用するなら
ば、この抗原の感受性は不適切である。本発明はそれ
故、組換えにより製造され、さらにサイトメガロウイル
ス(HCMV)のp150テグメント蛋白質のC端領域
からの断片少なくとも1個を含み、さらにヒトサイトメ
ガロウイルスに由来する別の抗原性蛋白質からの別の断
片少なくとも1個を含む融合蛋白質に関する。
【0015】好適な態様において、融合蛋白質のこの別
の抗原性蛋白質はp52と呼ばれる蛋白質から由来し、
これがp52抗原のC端領域であるものは殊に好適な態
様である。特に好適な態様において、この領域はおよそ
283位のアミノ酸からアミノ酸433位までに及ぶ。
の抗原性蛋白質はp52と呼ばれる蛋白質から由来し、
これがp52抗原のC端領域であるものは殊に好適な態
様である。特に好適な態様において、この領域はおよそ
283位のアミノ酸からアミノ酸433位までに及ぶ。
【0016】殊に好適な融合蛋白質のアミノ酸配列を図
2、図3および図4に示す。免疫学的検査のためにはア
ミノ酸は勿論、融合蛋白質の作用を変化させることなし
に、官能的に同じ作用を持つアミノ酸と交換することが
できる。専門家はエピトープの本質的構造を変化しない
限り、アミノ酸の交換は蛋白質の免疫学的性質に影響し
ないことを完全に認識している。それ故、この発明はま
た、図2、図3および図4に示す融合蛋白質に対する相
同性少なくとも80%、また殊に好適な型では少なくと
も90%、を持つ融合蛋白質に関する。相同性80%と
は対応する点におけるアミノ酸100個の中で80個が
同一であるが、一方ではアミノ酸の20%が交換されう
ることを意味する。
2、図3および図4に示す。免疫学的検査のためにはア
ミノ酸は勿論、融合蛋白質の作用を変化させることなし
に、官能的に同じ作用を持つアミノ酸と交換することが
できる。専門家はエピトープの本質的構造を変化しない
限り、アミノ酸の交換は蛋白質の免疫学的性質に影響し
ないことを完全に認識している。それ故、この発明はま
た、図2、図3および図4に示す融合蛋白質に対する相
同性少なくとも80%、また殊に好適な型では少なくと
も90%、を持つ融合蛋白質に関する。相同性80%と
は対応する点におけるアミノ酸100個の中で80個が
同一であるが、一方ではアミノ酸の20%が交換されう
ることを意味する。
【0017】この発明に従って使用される前記融合蛋白
質は、一方ではpp150のC端部分および他方では別
のサイトメガロウイルス抗原の高IgM反応性領域を含
む。さらに、この発明によるこの融合蛋白質は、この融
合蛋白質の組換えによる製造のための短い成分を含むこ
とができる。しかしながら、この発明に従う好適な態様
においては、この成分は殊に発現ベクターから由来し、
25個を超えないアミノ酸を含む。
質は、一方ではpp150のC端部分および他方では別
のサイトメガロウイルス抗原の高IgM反応性領域を含
む。さらに、この発明によるこの融合蛋白質は、この融
合蛋白質の組換えによる製造のための短い成分を含むこ
とができる。しかしながら、この発明に従う好適な態様
においては、この成分は殊に発現ベクターから由来し、
25個を超えないアミノ酸を含む。
【0018】このようにして製造することのできる融合
蛋白質は請求項1〜15の中の一つに従うポリペプチド
または融合蛋白質のアミノ酸配列を持つ。融合蛋白質の
あるものは好ましくはグルタチオンS−トランスフェラ
ーゼから由来する。この発明に従う融合蛋白質はHCM
ウイルスの読み枠UL57からのポリペプチドまたはヒ
トサイトメガロウイルスの別の抗原性蛋白質の一つの少
なくとも一部分を含むことができる。殊に好適な態様に
おいて、ヒトサイトメガロウイルスのこの別の抗原性蛋
白質はpp150テグメント蛋白質またはp52蛋白質
である。前記蛋白質類の部分的配列の結合は殊に好適で
ある。
蛋白質は請求項1〜15の中の一つに従うポリペプチド
または融合蛋白質のアミノ酸配列を持つ。融合蛋白質の
あるものは好ましくはグルタチオンS−トランスフェラ
ーゼから由来する。この発明に従う融合蛋白質はHCM
ウイルスの読み枠UL57からのポリペプチドまたはヒ
トサイトメガロウイルスの別の抗原性蛋白質の一つの少
なくとも一部分を含むことができる。殊に好適な態様に
おいて、ヒトサイトメガロウイルスのこの別の抗原性蛋
白質はpp150テグメント蛋白質またはp52蛋白質
である。前記蛋白質類の部分的配列の結合は殊に好適で
ある。
【0019】本発明はまた、本発明に従うポリペプチド
少なくとも1個および/または本発明に従う融合蛋白質
1個を含むサイトメガロウイルスに対する抗体、殊にI
gM抗体、の検出用検査キットに関する。これらは好ま
しくはELISA検定を行うための検査キットである。
少なくとも1個および/または本発明に従う融合蛋白質
1個を含むサイトメガロウイルスに対する抗体、殊にI
gM抗体、の検出用検査キットに関する。これらは好ま
しくはELISA検定を行うための検査キットである。
【0020】ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッ
セイなどのような数種の異なる検査方法が診断用に知ら
れている。本発明に関して殊に好適な検査キットはEL
ISA検定(酵素免疫吸着測定法)を行うために適す
る。この検定では固相への結合が起こす。この場合は融
合蛋白質である抗原を固相、殊にマイクロタイター板、
に結合して非特異的な結合を飽和する。通常は血清であ
るが、分析すべき標本を次にこれらのマイクロタイター
板に入れ、インキュベートし、洗浄する。固相に結合し
た抗体を次に検出すべき抗原に接触させる。これらの抗
体は一般に標識成分を結合した抗−ヒト抗体で検出す
る。呈色反応を触媒し、これによって検定結果を読み取
ることのできるホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ
はここでは殊に適当であることが証明されている。
セイなどのような数種の異なる検査方法が診断用に知ら
れている。本発明に関して殊に好適な検査キットはEL
ISA検定(酵素免疫吸着測定法)を行うために適す
る。この検定では固相への結合が起こす。この場合は融
合蛋白質である抗原を固相、殊にマイクロタイター板、
に結合して非特異的な結合を飽和する。通常は血清であ
るが、分析すべき標本を次にこれらのマイクロタイター
板に入れ、インキュベートし、洗浄する。固相に結合し
た抗体を次に検出すべき抗原に接触させる。これらの抗
体は一般に標識成分を結合した抗−ヒト抗体で検出す
る。呈色反応を触媒し、これによって検定結果を読み取
ることのできるホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ
はここでは殊に適当であることが証明されている。
【0021】特定的なIgM抗体の検出のための他の方
法は、μ−捕捉ELISAである。この方法において、
担体の固相、例えばELISA板、をヒトIgM分子の
μ鎖に対するポリクロナールまたはモノクロナール抗体
で被覆する。続いてヒト血清とインキュベートすると、
IgM抗体は選択的に固相に結合する一方、他の抗体は
すべて洗浄により除去される。CMV−特異的IgM抗
体はこの抗原に対するIgM分子が結合した酵素標識C
MV抗原によって、多数の結合IgM分子から測定され
る。形成した抗体−抗原複合体は−前記の通りに−酵素
仲介呈色反応により検出することができる。
法は、μ−捕捉ELISAである。この方法において、
担体の固相、例えばELISA板、をヒトIgM分子の
μ鎖に対するポリクロナールまたはモノクロナール抗体
で被覆する。続いてヒト血清とインキュベートすると、
IgM抗体は選択的に固相に結合する一方、他の抗体は
すべて洗浄により除去される。CMV−特異的IgM抗
体はこの抗原に対するIgM分子が結合した酵素標識C
MV抗原によって、多数の結合IgM分子から測定され
る。形成した抗体−抗原複合体は−前記の通りに−酵素
仲介呈色反応により検出することができる。
【0022】本発明はまた分析されるべき標本を融合蛋
白質と混合することによるHCMVに対する抗体の検出
法にも関する。次にこの抗体−ポリペプチドまたは融合
蛋白質複合体を検出用成分で検出する。pp150の
「付加的感受性」のいくらかを示すが、同時に高い特異
性を示す抗原もこの発明のポリペプチドおよび融合蛋白
質により提供される。それ故、この発明に従うポリペプ
チドおよび融合蛋白質では健康な血液提供者の血清では
低いIgM反応性しか示さないものが得られる。この発
明に従うポリペプチドおよび融合蛋白質を用いて、急性
の感染症が存在するかどうか、および同時に誤陽性の結
果の発生を完全には除けないとしてもかなり減らして適
当な感度で検出するIgM抗体用の検定を行うことが可
能になる。
白質と混合することによるHCMVに対する抗体の検出
法にも関する。次にこの抗体−ポリペプチドまたは融合
蛋白質複合体を検出用成分で検出する。pp150の
「付加的感受性」のいくらかを示すが、同時に高い特異
性を示す抗原もこの発明のポリペプチドおよび融合蛋白
質により提供される。それ故、この発明に従うポリペプ
チドおよび融合蛋白質では健康な血液提供者の血清では
低いIgM反応性しか示さないものが得られる。この発
明に従うポリペプチドおよび融合蛋白質を用いて、急性
の感染症が存在するかどうか、および同時に誤陽性の結
果の発生を完全には除けないとしてもかなり減らして適
当な感度で検出するIgM抗体用の検定を行うことが可
能になる。
【0023】高い感度を持つが、同時に高い特異性を持
つ抗原がこの発明の融合蛋白質およびペプチドにより提
供される。健康な血液提供者の血清とはIgM反応性が
低いものがこの発明に従うペプチドおよび融合蛋白質で
得られる。この発明に従うペプチドおよび融合蛋白質を
用いれば、適当な感度で急性感染症が存在するかどうか
および同時に臨床的には無関係であるかまたは誤陽性で
ある結果の発生を除けないにしてもかなり減少するIg
M抗体の検査を行うことが可能である。
つ抗原がこの発明の融合蛋白質およびペプチドにより提
供される。健康な血液提供者の血清とはIgM反応性が
低いものがこの発明に従うペプチドおよび融合蛋白質で
得られる。この発明に従うペプチドおよび融合蛋白質を
用いれば、適当な感度で急性感染症が存在するかどうか
および同時に臨床的には無関係であるかまたは誤陽性で
ある結果の発生を除けないにしてもかなり減少するIg
M抗体の検査を行うことが可能である。
【0024】検出成分は、好ましくは標識分子、殊にホ
ースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、に結合した抗−
ヒト抗体である。
ースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、に結合した抗−
ヒト抗体である。
【0025】本発明の原理で専門家にはまた、請求項1
に提示されるアミノ酸配列の少なくとも一部に対応する
アミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドの配列を
含むオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。このオリ
ゴヌクレオチドは好ましくは12〜30塩基長である。
これらは通常、ポリメラーゼ鎖反応または核酸を増幅す
る他の工法に使用できるDNAオリゴヌクレオチドであ
る。
に提示されるアミノ酸配列の少なくとも一部に対応する
アミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドの配列を
含むオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。このオリ
ゴヌクレオチドは好ましくは12〜30塩基長である。
これらは通常、ポリメラーゼ鎖反応または核酸を増幅す
る他の工法に使用できるDNAオリゴヌクレオチドであ
る。
【0026】本発明はまた、この発明によるポリペプチ
ドUL57/3の少なくともいくらかをコードするヌク
レオチド配列を含むオリゴヌクレオチドに関する。この
ようなオリゴヌクレオチドはポリメラーゼ鎖反応におけ
るプライマーとして有利に採用される。ポリメラーゼ鎖
反応を用いれば、サイトメガロウイルスの感度の高い検
出が可能である。この一般的に公知の方法により、殊に
ウイルスの遺伝子的情報が極く少ないコピー数のみしか
ない場合にも検出が可能になる。
ドUL57/3の少なくともいくらかをコードするヌク
レオチド配列を含むオリゴヌクレオチドに関する。この
ようなオリゴヌクレオチドはポリメラーゼ鎖反応におけ
るプライマーとして有利に採用される。ポリメラーゼ鎖
反応を用いれば、サイトメガロウイルスの感度の高い検
出が可能である。この一般的に公知の方法により、殊に
ウイルスの遺伝子的情報が極く少ないコピー数のみしか
ない場合にも検出が可能になる。
【0027】用語「相同性」はDNAまたはアミノ酸配
列2個の一致の程度を意味するものと理解される。例え
ば相同性60%は配列内アミノ酸100個の位置の中、
60個が一致することを意味する。蛋白質の相同性は配
列分析により決定される。
列2個の一致の程度を意味するものと理解される。例え
ば相同性60%は配列内アミノ酸100個の位置の中、
60個が一致することを意味する。蛋白質の相同性は配
列分析により決定される。
【0028】ヒトサイトメガロウイルスは既にかなり完
全に研究されているので、その配列とこの発明に従うペ
プチドを含む読み枠はCheeなどによる報告、Cur
rent・Topics・in・Microbiolo
gy・and・Immunology、154巻、Sp
ringer・Verlag(1990年)、126〜
169頁、を用いて決定することができる。
全に研究されているので、その配列とこの発明に従うペ
プチドを含む読み枠はCheeなどによる報告、Cur
rent・Topics・in・Microbiolo
gy・and・Immunology、154巻、Sp
ringer・Verlag(1990年)、126〜
169頁、を用いて決定することができる。
【0029】この発明に従えば好適な融合蛋白質は、一
方ではこの発明に従うポリペプチドUL57/3のアミ
ノ酸配列を持ち、他方ではヒトサイトメガロウイルスの
別の蛋白質、殊に抗原性蛋白質、の断片および/または
発現ベクターから由来する断片を持つ。これらの融合蛋
白質の付加的成分は、殊に好ましくはテグメント蛋白質
pp150からおよび/またはサイトメガロウイルスの
蛋白質p52から由来する。殊に好適な形は、この出願
の実施例に記載されている断片である。
方ではこの発明に従うポリペプチドUL57/3のアミ
ノ酸配列を持ち、他方ではヒトサイトメガロウイルスの
別の蛋白質、殊に抗原性蛋白質、の断片および/または
発現ベクターから由来する断片を持つ。これらの融合蛋
白質の付加的成分は、殊に好ましくはテグメント蛋白質
pp150からおよび/またはサイトメガロウイルスの
蛋白質p52から由来する。殊に好適な形は、この出願
の実施例に記載されている断片である。
【0030】本発明に関し、グルタチオン・S−トラン
スフェラーゼ(GST)の少なくとも一部を含む融合蛋
白質は大腸菌内で容易に発現されることが見出されてい
る。このような融合蛋白質を提供することのできるベク
ターは、中でもVornhagenなど、Journa
l・of・Clinical・Microbiolog
y、32巻、981〜986頁(1994年)に記載さ
れている。
スフェラーゼ(GST)の少なくとも一部を含む融合蛋
白質は大腸菌内で容易に発現されることが見出されてい
る。このような融合蛋白質を提供することのできるベク
ターは、中でもVornhagenなど、Journa
l・of・Clinical・Microbiolog
y、32巻、981〜986頁(1994年)に記載さ
れている。
【0031】本発明においては、抗原を次のように検定
する: イ)急性HCMV感染症の兆候がない健康な血液提供者
の非選択的血清。ポール・エールリッヒ研究所が承認し
た抗CMV・IgG・ELISA(Biotest)を
用いてこれらの血清をHCM−陽性/陰性に分類する。
表5参照。 ロ)ウイルス分離および/またはIgGセロコンバージ
ョンで陽性の結果が記録されている急性HCMV感染症
を持つ免疫応答性(機能している免疫系)個体の選択さ
れた血清(表3参照)。 ハ)急性HCMV原発性感染症を持つ移植患者の選択さ
れた血清。表4参照。この急性感染症はpp65特異的
抗原血症検査を用いて検出した。
する: イ)急性HCMV感染症の兆候がない健康な血液提供者
の非選択的血清。ポール・エールリッヒ研究所が承認し
た抗CMV・IgG・ELISA(Biotest)を
用いてこれらの血清をHCM−陽性/陰性に分類する。
表5参照。 ロ)ウイルス分離および/またはIgGセロコンバージ
ョンで陽性の結果が記録されている急性HCMV感染症
を持つ免疫応答性(機能している免疫系)個体の選択さ
れた血清(表3参照)。 ハ)急性HCMV原発性感染症を持つ移植患者の選択さ
れた血清。表4参照。この急性感染症はpp65特異的
抗原血症検査を用いて検出した。
【0032】データは検査したUL57断片、UL57
/3は殊に診断に有意義であることを明らかに示す。こ
の抗原断片は、急性HCMV感染症を持つ者の血清には
極端に高いIgM特異的反応性を示した。反応性サンプ
ルの数は免疫応答性患者(表3)および移植患者(表
4)で組換え抗原150/7および52/3と同等また
はより多かった。これらの抗原は殊に従前の評価による
急性HCMV感染症の検出のために適することが証明さ
れた。これと比べて、健康な血液提供者からの血清につ
いては非常に低いIgM反応性が見出された。オートロ
ガス融合蛋白質を検査する時、急性感染患者の両群にお
いて同数の陽性の結果が得られた。個体差は反応性の程
度にのみ見出された。化学的に合成されたペプチド57
/3−Pにはやや低いIgM特異性が見出された。要約
すると、UL57/3と命名された抗原断片は急性HC
MV感染症のIgM特異的血液学的診断剤のために極め
て適していると言うことができる。
/3は殊に診断に有意義であることを明らかに示す。こ
の抗原断片は、急性HCMV感染症を持つ者の血清には
極端に高いIgM特異的反応性を示した。反応性サンプ
ルの数は免疫応答性患者(表3)および移植患者(表
4)で組換え抗原150/7および52/3と同等また
はより多かった。これらの抗原は殊に従前の評価による
急性HCMV感染症の検出のために適することが証明さ
れた。これと比べて、健康な血液提供者からの血清につ
いては非常に低いIgM反応性が見出された。オートロ
ガス融合蛋白質を検査する時、急性感染患者の両群にお
いて同数の陽性の結果が得られた。個体差は反応性の程
度にのみ見出された。化学的に合成されたペプチド57
/3−Pにはやや低いIgM特異性が見出された。要約
すると、UL57/3と命名された抗原断片は急性HC
MV感染症のIgM特異的血液学的診断剤のために極め
て適していると言うことができる。
【0033】
【実施例】実施例1 オートロガス融合蛋白質52/3|150/
7/2のクローニング これは52/3の完全な領域および150/7の54C
端アミノ酸が結合するオートロガス融合蛋白質である。
7/2のクローニング これは52/3の完全な領域および150/7の54C
端アミノ酸が結合するオートロガス融合蛋白質である。
【0034】1. AA862〜1048をコードする
pp150の部分配列を含むクローンpuc8/PCC
150/7から出発して、部分的断片PCC150/7
/2のPCR増幅をプライマーPCC15012.se
qおよびPCC15013.seq(図1)を用いて実
施した。両プライマーは、pp150と相補的な領域に
加えて、いくらかの独特な制限切断部位、すなわちPC
C15012.seq:EcoRIおよびPCC150
13.seq:BamHIを含むオーバーハングを持
つ。これらの切断部位は増幅生成物の指向的クローニン
グを可能にする。
pp150の部分配列を含むクローンpuc8/PCC
150/7から出発して、部分的断片PCC150/7
/2のPCR増幅をプライマーPCC15012.se
qおよびPCC15013.seq(図1)を用いて実
施した。両プライマーは、pp150と相補的な領域に
加えて、いくらかの独特な制限切断部位、すなわちPC
C15012.seq:EcoRIおよびPCC150
13.seq:BamHIを含むオーバーハングを持
つ。これらの切断部位は増幅生成物の指向的クローニン
グを可能にする。
【0035】PCR増幅は、反応緩衝液(Perkin
−Elmer・Cetus)10μL、200μM−デ
オキシヌクレオチド4個、0.5μM−PCRプライマ
ー2個、出発DNA50〜100ngおよびAmpli
Taq・DNAポリメラーゼ(Perkin−Elme
r・Cetus)2.5単位を含む全容積100μL中
で実施した。増幅はPerkin−Elmer・Cet
us・DNAサーマルサイクラー中で次の条件下に25
サイクルで実施した:1分−55℃、1分−72℃、1
分−94℃。PCR反応混合物をサブマリンアガロース
ゲル室内で、0.5μg/mL臭化エチジウムを含む
1.2%アガロースゲル(Ultra・Pure・Ag
arose、BRL)中で、TBEランニング緩衝液
(0.089M−トリス/ホウ酸塩、0.002M−E
DTA)を用いて電気泳動的に分別した。その後、増幅
したDNA断片を364nmのUVランプで可視化し、
対応するバンドを含むゲルの領域をメスで切り出した。
メーカーの指示書に従って、バイオトラップチャンバー
(Schleicher・&・Schull)を用いて
ゲル断片からDNAを溶出した。これに続いてメーカー
の使用指示書に従って、エルチップDカラム(Schl
eicher・&・Schull)を用いてDNAをさ
らに精製した。
−Elmer・Cetus)10μL、200μM−デ
オキシヌクレオチド4個、0.5μM−PCRプライマ
ー2個、出発DNA50〜100ngおよびAmpli
Taq・DNAポリメラーゼ(Perkin−Elme
r・Cetus)2.5単位を含む全容積100μL中
で実施した。増幅はPerkin−Elmer・Cet
us・DNAサーマルサイクラー中で次の条件下に25
サイクルで実施した:1分−55℃、1分−72℃、1
分−94℃。PCR反応混合物をサブマリンアガロース
ゲル室内で、0.5μg/mL臭化エチジウムを含む
1.2%アガロースゲル(Ultra・Pure・Ag
arose、BRL)中で、TBEランニング緩衝液
(0.089M−トリス/ホウ酸塩、0.002M−E
DTA)を用いて電気泳動的に分別した。その後、増幅
したDNA断片を364nmのUVランプで可視化し、
対応するバンドを含むゲルの領域をメスで切り出した。
メーカーの指示書に従って、バイオトラップチャンバー
(Schleicher・&・Schull)を用いて
ゲル断片からDNAを溶出した。これに続いてメーカー
の使用指示書に従って、エルチップDカラム(Schl
eicher・&・Schull)を用いてDNAをさ
らに精製した。
【0036】このようにして精製し、乾燥したDNA断
片を蒸留水80μLに溶解した。NEバッファ4(Ne
w・England・Biolabs)10μLを添加
後、BamHI/EcoRI消化を各々の場合に両酵素
100Uの添加によって行った。2時間後、フェノール
抽出、続いてエタノール沈殿を行った。このようにして
製造したDNA断片100ngを標準ベクターpuc8
のBamHI/EcoRI処理DNA200ngと4℃
で16時間結合させ、次にこれで大腸菌JM109を形
質転換した。形質転換混合物をアンピシリン(50μg
/mL)およびX−ガル(30μg/mL)を加えた寒
天平板で培養した。白色のコロニーをアンピシリン添加
LB培地3mLに移し、37℃でふりまぜながら12〜
16時間インキュベートした。プラスミドDNAを単離
した後、EcoRI/BamHI制限消化およびアガロ
ースゲル中の電気泳動を実施した。所期サイズの付加D
NA断片が見出されたクローンをpuc8/PCC15
0/7/2と命名し、これを以下のクローニングに用い
た。
片を蒸留水80μLに溶解した。NEバッファ4(Ne
w・England・Biolabs)10μLを添加
後、BamHI/EcoRI消化を各々の場合に両酵素
100Uの添加によって行った。2時間後、フェノール
抽出、続いてエタノール沈殿を行った。このようにして
製造したDNA断片100ngを標準ベクターpuc8
のBamHI/EcoRI処理DNA200ngと4℃
で16時間結合させ、次にこれで大腸菌JM109を形
質転換した。形質転換混合物をアンピシリン(50μg
/mL)およびX−ガル(30μg/mL)を加えた寒
天平板で培養した。白色のコロニーをアンピシリン添加
LB培地3mLに移し、37℃でふりまぜながら12〜
16時間インキュベートした。プラスミドDNAを単離
した後、EcoRI/BamHI制限消化およびアガロ
ースゲル中の電気泳動を実施した。所期サイズの付加D
NA断片が見出されたクローンをpuc8/PCC15
0/7/2と命名し、これを以下のクローニングに用い
た。
【0037】2. クローンpuc8/PCC52/3
−p52のAA297〜433のためのクローン化断片
コード−から出発し、PCR増幅をプライマーPCC5
25.seqおよびPCC526.seqを用いて実施
し、増幅した断片を後に前記のようにしてクローンし
た。ここで用いたプライマー2種のオーバーハングに基
づいて、増幅された断片は5’−端にBamHI切断部
位を持ち、BglIIおよびEcoRIの両切断部位を
3’−端に持っている。対応するクローンをpuc8/
PCC52/3Fと命名した。
−p52のAA297〜433のためのクローン化断片
コード−から出発し、PCR増幅をプライマーPCC5
25.seqおよびPCC526.seqを用いて実施
し、増幅した断片を後に前記のようにしてクローンし
た。ここで用いたプライマー2種のオーバーハングに基
づいて、増幅された断片は5’−端にBamHI切断部
位を持ち、BglIIおよびEcoRIの両切断部位を
3’−端に持っている。対応するクローンをpuc8/
PCC52/3Fと命名した。
【0038】3. クローンpuc8/PCC150/
7/2のDNAについて、BamHIおよびEcoRI
による制限消化を実施した。その際に遊離される約16
0bpの断片をアガロース電気泳動を用いて分離し、前
記のようにしてゲル切片から溶出した。このDNA断片
約50ngを次にBglIIおよびEcoRIで開環し
たベクターpuc8/PCC52/3Fの200ngに
結合させ、同様にして電気泳動を使用して精製した。こ
れに続いて大腸菌JM109を形質転換し、アンピシリ
ン添加寒天で平板培養した。単離したコロニーをアンピ
シリン添加LB培地3mLに移し、37℃でふりまぜな
がら12〜16時間インキュベートした。プラスミドD
NAの分離後、BamHI/EcoRIで制限消化と、
続けてアガロースゲル中で電気泳動を実施した。所期サ
イズの挿入部を持つクローンをpuc8/52/3・1
50/7/2と命名し、以下の実験に使用した。Bam
HIおよびBglIIの認識配列が結合可能な同一のオ
ーバーハングを持つという事実をこの操作に用いた。し
かしながら、結合実施後、両切断部位は失われる。同じ
読み枠内の翻訳を可能とするために52/3Fから15
0/7/2へのオーバーハングを選択した。図2、図3
および図4は前記の構造の全DNA配列および得られる
オートロガス融合蛋白質の対応するAA配列を示す。
7/2のDNAについて、BamHIおよびEcoRI
による制限消化を実施した。その際に遊離される約16
0bpの断片をアガロース電気泳動を用いて分離し、前
記のようにしてゲル切片から溶出した。このDNA断片
約50ngを次にBglIIおよびEcoRIで開環し
たベクターpuc8/PCC52/3Fの200ngに
結合させ、同様にして電気泳動を使用して精製した。こ
れに続いて大腸菌JM109を形質転換し、アンピシリ
ン添加寒天で平板培養した。単離したコロニーをアンピ
シリン添加LB培地3mLに移し、37℃でふりまぜな
がら12〜16時間インキュベートした。プラスミドD
NAの分離後、BamHI/EcoRIで制限消化と、
続けてアガロースゲル中で電気泳動を実施した。所期サ
イズの挿入部を持つクローンをpuc8/52/3・1
50/7/2と命名し、以下の実験に使用した。Bam
HIおよびBglIIの認識配列が結合可能な同一のオ
ーバーハングを持つという事実をこの操作に用いた。し
かしながら、結合実施後、両切断部位は失われる。同じ
読み枠内の翻訳を可能とするために52/3Fから15
0/7/2へのオーバーハングを選択した。図2、図3
および図4は前記の構造の全DNA配列および得られる
オートロガス融合蛋白質の対応するAA配列を示す。
【0039】4. オートロガス融合蛋白質の発現を確
実にするために、バクテリオファージT7遺伝子10の
強力なT7プロモーターを持つベクターpET5cへの
対応するDNA断片の再クローニングを実施した。この
背景として、このベクターはリボソーム結合部位および
適当な距離に出発コドンを持っている。この出発コドン
の後にバクテリオファージT7遺伝子10の11アミノ
酸読み枠およびBamHIとEcoRI切断部位があ
る。BamHI切断部位の読み枠は前記したオートロガ
ス融合蛋白質のそれと一致する。EcoRIとBamH
I制限消化によってpuc8/52/3|150/7/
2から遊離したDNA断片100ngを同じ制限酵素で
開裂したこのベクター200ngに4℃で16時間結合
させた。大腸菌JM109の形質転換およびアンピシリ
ン添加板での平板培養を続けた。単離したコロニーをア
ンピシリン添加LB培地3mLに移し、37℃でふりま
ぜながら16時間インキュベートした。プラスミドDN
Aの単離後、BamHI/EcoRI制限消化を実施し
た。所期サイズの挿入部を持つクローンをpET5c/
52/3|150/7/2と命名した。組換え蛋白質の
発現を確実にするため、発現ベクターのDNAをクロラ
ムフェニコール耐性発現株BL21(DE3)pLys
Sに形質転換した。得られたクローンの一つを以下の実
験に用いた。
実にするために、バクテリオファージT7遺伝子10の
強力なT7プロモーターを持つベクターpET5cへの
対応するDNA断片の再クローニングを実施した。この
背景として、このベクターはリボソーム結合部位および
適当な距離に出発コドンを持っている。この出発コドン
の後にバクテリオファージT7遺伝子10の11アミノ
酸読み枠およびBamHIとEcoRI切断部位があ
る。BamHI切断部位の読み枠は前記したオートロガ
ス融合蛋白質のそれと一致する。EcoRIとBamH
I制限消化によってpuc8/52/3|150/7/
2から遊離したDNA断片100ngを同じ制限酵素で
開裂したこのベクター200ngに4℃で16時間結合
させた。大腸菌JM109の形質転換およびアンピシリ
ン添加板での平板培養を続けた。単離したコロニーをア
ンピシリン添加LB培地3mLに移し、37℃でふりま
ぜながら16時間インキュベートした。プラスミドDN
Aの単離後、BamHI/EcoRI制限消化を実施し
た。所期サイズの挿入部を持つクローンをpET5c/
52/3|150/7/2と命名した。組換え蛋白質の
発現を確実にするため、発現ベクターのDNAをクロラ
ムフェニコール耐性発現株BL21(DE3)pLys
Sに形質転換した。得られたクローンの一つを以下の実
験に用いた。
【0040】実施例2 組換え融合蛋白質52/3|1
50/7/2の発現 1. クローンpET5c/52/3|150/7/2
のBL21(DE3)pLysS菌の培地板上コロニー
から出発し、15mLの液体培地−アンピシリン(Am
p)とクロラムフェニコール(CA)とを含むLB培地
−中で回転ふりまぜ機内で吸光度(600nm)が1.
8〜2.0になるまで37℃で培養した。次にグリセリ
ン(87%)を培養物に加えて最終濃度15%(v/
v)とし、混合物を0.1mL分割に分け、これを−6
0から−80℃で使用するまで保存した。
50/7/2の発現 1. クローンpET5c/52/3|150/7/2
のBL21(DE3)pLysS菌の培地板上コロニー
から出発し、15mLの液体培地−アンピシリン(Am
p)とクロラムフェニコール(CA)とを含むLB培地
−中で回転ふりまぜ機内で吸光度(600nm)が1.
8〜2.0になるまで37℃で培養した。次にグリセリ
ン(87%)を培養物に加えて最終濃度15%(v/
v)とし、混合物を0.1mL分割に分け、これを−6
0から−80℃で使用するまで保存した。
【0041】2. グリセリン培養物凍結品を迅速解凍
し、LB/CA、AMP培地150mL中にピペットで
入れた。一夜培養物を1L−コニカルフラスコ(CF)
中、毎分100回転の回転ふりまぜ機中、28℃で16
時間培養した。
し、LB/CA、AMP培地150mL中にピペットで
入れた。一夜培養物を1L−コニカルフラスコ(CF)
中、毎分100回転の回転ふりまぜ機中、28℃で16
時間培養した。
【0042】3. 調整板付2L・CF内で各0.5L
の並行バッチ12回によって主培養物6Lを培養した。
培地(LB/CA、AMP)を37℃に予熱した。フラ
スコに前培養物(1:51)10mLづつを植菌した
後、インキュベーションを毎分160回転の回転ふりま
ぜ機中、37℃で実施した。生育は600nmでのOD
を連続的に測定して監視した。OD0.6で組換え抗原
の発現を最終濃度1mMまでIPTGを添加して減速さ
せた。
の並行バッチ12回によって主培養物6Lを培養した。
培地(LB/CA、AMP)を37℃に予熱した。フラ
スコに前培養物(1:51)10mLづつを植菌した
後、インキュベーションを毎分160回転の回転ふりま
ぜ機中、37℃で実施した。生育は600nmでのOD
を連続的に測定して監視した。OD0.6で組換え抗原
の発現を最終濃度1mMまでIPTGを添加して減速さ
せた。
【0043】4. 誘導の3時間後、遠心分離(6×1
Lビーカー、4000g、0〜4℃、30分)によって
収集を実施した。排水の良い細菌ペレットを氷冷PBS
200mLに再懸濁し、再び遠心分離(2×250mL
ビーカー、5000g、0〜4℃、10分間)した。再
び排水の良いペレットを凍結し、さらに処理するまで−
20から−30℃で保存した。
Lビーカー、4000g、0〜4℃、30分)によって
収集を実施した。排水の良い細菌ペレットを氷冷PBS
200mLに再懸濁し、再び遠心分離(2×250mL
ビーカー、5000g、0〜4℃、10分間)した。再
び排水の良いペレットを凍結し、さらに処理するまで−
20から−30℃で保存した。
【0044】5. バクテリア誘導前と収集前に、選択
したフラスコからバクテリアの懸濁液1.5mLづつを
取出し、エッペンドルフ管に移し、バクテリアを遠心分
離によってペレット化した。バクテリアを次にSDS電
気泳動緩衝液で処理し、適当量を17.5%ポリアクリ
ルアミドゲルを用いるSDS電気泳動により分析した。
収集前に取出したサンプルは誘導前に取出したサンプル
と比較して高度に強力な付加的蛋白質の二重バンドを2
5kの領域に示した。
したフラスコからバクテリアの懸濁液1.5mLづつを
取出し、エッペンドルフ管に移し、バクテリアを遠心分
離によってペレット化した。バクテリアを次にSDS電
気泳動緩衝液で処理し、適当量を17.5%ポリアクリ
ルアミドゲルを用いるSDS電気泳動により分析した。
収集前に取出したサンプルは誘導前に取出したサンプル
と比較して高度に強力な付加的蛋白質の二重バンドを2
5kの領域に示した。
【0045】実施例3 バクテリアの消化 凍結した細菌ペレットを解凍し、基本緩衝液(トリス−
塩酸/20mM/pH7.5)160mLに再懸濁し、
次にテフロン/硝子ポッターホモゲナイザーでホモゲナ
イズした。続いて撹拌しつつ次の添加物を加えた:NP
−40(0.05%)、PMSF(0.2mM)、ペフ
ァブロック(0.2mM)、EDTA(50mM)、リ
ゾチーム(50mg)を加え、総容積200mL。この
混合物を激しく撹拌しつつ室温で60分間インキュベー
トし、次に直ちに氷冷した。この後の工程は氷上または
冷却下に実施した。インキュベーション後、グリセリン
(10%)と2−メルカプトエタノール(14mM)を
加え、基本緩衝液で容積を280mLに調整した。溶菌
混合物を次に超音波処理した(20kHz、パルス、5
分間、3/4”チタンプローブ)。非溶解性物質を遠心
分離(2×250mLビーカー、27000g、30分
間、0〜4℃)で除去した。ペレットは廃棄した。
塩酸/20mM/pH7.5)160mLに再懸濁し、
次にテフロン/硝子ポッターホモゲナイザーでホモゲナ
イズした。続いて撹拌しつつ次の添加物を加えた:NP
−40(0.05%)、PMSF(0.2mM)、ペフ
ァブロック(0.2mM)、EDTA(50mM)、リ
ゾチーム(50mg)を加え、総容積200mL。この
混合物を激しく撹拌しつつ室温で60分間インキュベー
トし、次に直ちに氷冷した。この後の工程は氷上または
冷却下に実施した。インキュベーション後、グリセリン
(10%)と2−メルカプトエタノール(14mM)を
加え、基本緩衝液で容積を280mLに調整した。溶菌
混合物を次に超音波処理した(20kHz、パルス、5
分間、3/4”チタンプローブ)。非溶解性物質を遠心
分離(2×250mLビーカー、27000g、30分
間、0〜4℃)で除去した。ペレットは廃棄した。
【0046】実施例4 組換え蛋白質52/3|150
/7/2の精製 1. 固体硫酸アンモニウムの微粉末を実施例3からの
上清液中に氷浴上で撹拌しつつ、25%飽和になるまで
徐々に添加した。続けて撹拌しつつ15分間インキュベ
ートした。遠心分離(2×250mLビーカー、270
00g、30分、0〜4℃)後、ペレットは廃棄した。
上清液に再び硫酸アンモニウムを加えて45%飽和濃度
とし、混合物を前記のように遠心分離した。上清液は廃
棄した。ペレットを2−メルカプトエタノール(14m
M)とペファブロック(0.1mM)とを含む基本緩衝
液25mLに再懸濁し、凍結し、−20から−30℃で
一夜保存した。
/7/2の精製 1. 固体硫酸アンモニウムの微粉末を実施例3からの
上清液中に氷浴上で撹拌しつつ、25%飽和になるまで
徐々に添加した。続けて撹拌しつつ15分間インキュベ
ートした。遠心分離(2×250mLビーカー、270
00g、30分、0〜4℃)後、ペレットは廃棄した。
上清液に再び硫酸アンモニウムを加えて45%飽和濃度
とし、混合物を前記のように遠心分離した。上清液は廃
棄した。ペレットを2−メルカプトエタノール(14m
M)とペファブロック(0.1mM)とを含む基本緩衝
液25mLに再懸濁し、凍結し、−20から−30℃で
一夜保存した。
【0047】2. 硫酸アンモニウム(25〜45%)
で分画した蛋白質溶液を解凍し、沈殿した蛋白質を遠心
分離(1×50mLビーカー、40000g、30分
間、0〜4℃)により除去した。上清液をセファデック
スG−25(粗)カラム(容積は少なくとも200m
L)上でA(280nm)および流出液の電導度を用い
てクロマトグラフした。2−メルカプトエタノール
(1.4mM)およびPrefabloc(0.02m
M)を含む基本緩衝液をカラム緩衝液として用いた。流
出液中の蛋白質を全部集めて直ちにSP−セファロース
上で(急速)クロマトグラフした。これには、2.6×
12cm(60mL)の大きさのカラムを用いた。A
(280nm)と電導度とを連続的に記録した。流速は
5mL/分で、2−メルカプトエタノール(1.4m
M)およびPrefabloc(0.02mM)を含む
基本緩衝液をカラム緩衝液として用いた。サンプルに続
いてカラム緩衝液100mLを入れた後、カラム緩衝液
中の直線状NaCl勾配(dC/dV=1mM/mL、
300mMまで)を採用した。流出液を10mLづつの
分画として集め、冷凍した。
で分画した蛋白質溶液を解凍し、沈殿した蛋白質を遠心
分離(1×50mLビーカー、40000g、30分
間、0〜4℃)により除去した。上清液をセファデック
スG−25(粗)カラム(容積は少なくとも200m
L)上でA(280nm)および流出液の電導度を用い
てクロマトグラフした。2−メルカプトエタノール
(1.4mM)およびPrefabloc(0.02m
M)を含む基本緩衝液をカラム緩衝液として用いた。流
出液中の蛋白質を全部集めて直ちにSP−セファロース
上で(急速)クロマトグラフした。これには、2.6×
12cm(60mL)の大きさのカラムを用いた。A
(280nm)と電導度とを連続的に記録した。流速は
5mL/分で、2−メルカプトエタノール(1.4m
M)およびPrefabloc(0.02mM)を含む
基本緩衝液をカラム緩衝液として用いた。サンプルに続
いてカラム緩衝液100mLを入れた後、カラム緩衝液
中の直線状NaCl勾配(dC/dV=1mM/mL、
300mMまで)を採用した。流出液を10mLづつの
分画として集め、冷凍した。
【0048】抗原を含む分画は、100mMと200m
M−NaClとの間の範囲内にあった。検出はSDS−
PAディスク電気泳動および後続クーマシー・染色によ
る。
M−NaClとの間の範囲内にあった。検出はSDS−
PAディスク電気泳動および後続クーマシー・染色によ
る。
【0049】3. 純抗原を含むと証明された分画(ク
ーマシー・ゲル)を解凍し、集めて、グリセリン(20
%)で処理し、限外濾過(撹拌セル、氷浴、膜=オメガ
30)によって濃縮して最終濃度少なくとも2mg/m
Lとした。セルの付着物を除き、凍結し、適量に分割
し、−60から−80℃で保存した。精製の経過を図5
に示す。
ーマシー・ゲル)を解凍し、集めて、グリセリン(20
%)で処理し、限外濾過(撹拌セル、氷浴、膜=オメガ
30)によって濃縮して最終濃度少なくとも2mg/m
Lとした。セルの付着物を除き、凍結し、適量に分割
し、−60から−80℃で保存した。精製の経過を図5
に示す。
【0050】実施例5 精製組換え抗原52/3|15
0/7/2のELISAでの反応性 1. 検査操作法 精製組換え抗原100ng部分をpH9.5の0.01
M−炭酸緩衝液100μLに溶解し、マイクロタイター
板(Nunc)の穴に入れ、アースした湿潤室内で16
時間インキュベートした。子牛血清を含む第2の被覆溶
液100μLの添加後、インキュベーションをさらに2
時間継続した。次に板を空にして、注意して内容物を抜
き取った。板を次に実施の検定操作に用いるか、または
真空箱内で乾燥し、管状フィルムに封入して−20℃で
後に使用するまで保存した。実際の検査の操作には、E
LISA板のテスト穴を1:21に希釈した血清100
μLで満たし、プラスチックフィルムに密封し、水浴に
浮かせて40℃で1時間インキュベートした。バイオテ
ストELISA洗浄液IIで3回洗浄後、ヒトIgMに
対するペルオキシダーゼ標識モノクロナールマウス抗体
(Janssen)100μLと40℃で30分間イン
キュベーションを実施した。改めて洗浄後、結合した抗
体を発色剤としての1,2−フェニレンジアミンとの呈
色反応で可視化した。個々のサンプルの吸光度はアンソ
スHTII・ELISA測定器を用いて495nm(対
照:620nm)で測定した。0.3より大きい全OD
値を陽性の成績と評価した。
0/7/2のELISAでの反応性 1. 検査操作法 精製組換え抗原100ng部分をpH9.5の0.01
M−炭酸緩衝液100μLに溶解し、マイクロタイター
板(Nunc)の穴に入れ、アースした湿潤室内で16
時間インキュベートした。子牛血清を含む第2の被覆溶
液100μLの添加後、インキュベーションをさらに2
時間継続した。次に板を空にして、注意して内容物を抜
き取った。板を次に実施の検定操作に用いるか、または
真空箱内で乾燥し、管状フィルムに封入して−20℃で
後に使用するまで保存した。実際の検査の操作には、E
LISA板のテスト穴を1:21に希釈した血清100
μLで満たし、プラスチックフィルムに密封し、水浴に
浮かせて40℃で1時間インキュベートした。バイオテ
ストELISA洗浄液IIで3回洗浄後、ヒトIgMに
対するペルオキシダーゼ標識モノクロナールマウス抗体
(Janssen)100μLと40℃で30分間イン
キュベーションを実施した。改めて洗浄後、結合した抗
体を発色剤としての1,2−フェニレンジアミンとの呈
色反応で可視化した。個々のサンプルの吸光度はアンソ
スHTII・ELISA測定器を用いて495nm(対
照:620nm)で測定した。0.3より大きい全OD
値を陽性の成績と評価した。
【0051】2. 結果 反応性を次により研究した: −急性HCMV感染症の兆候がない健康な血液提供者の
非選択的血清。これらの血清は公認の抗CMV・IgG
・ELISA(Biotest)によりHCMV陽性/
陰性に分類した。 −急性HCMV感染症を持つ免疫応答性個体の選択的血
清。 −急性HCMV感染症を持つ腎移植患者の選択的コー
ス。
非選択的血清。これらの血清は公認の抗CMV・IgG
・ELISA(Biotest)によりHCMV陽性/
陰性に分類した。 −急性HCMV感染症を持つ免疫応答性個体の選択的血
清。 −急性HCMV感染症を持つ腎移植患者の選択的コー
ス。
【0052】図7の中の表1はオートロガス融合蛋白質
52/3|150/7/2とHCMV免疫学的陽性(n
=54)または免疫学的陰性の健康な血液提供者の血清
とのIgM反応性をpET5c内に同様に発現し、均質
になるまで精製した組換え抗原52/3および150/
7との比較で示す。150/7はこの疾患とは明らかに
関連のないHCMV陽性血清と高いIgM反応性(>3
2%)を示すが、このオートロガス融合蛋白質は52/
3と同様に低い反応性を示すので、150/7よりも明
確に良い特異性を示す。
52/3|150/7/2とHCMV免疫学的陽性(n
=54)または免疫学的陰性の健康な血液提供者の血清
とのIgM反応性をpET5c内に同様に発現し、均質
になるまで精製した組換え抗原52/3および150/
7との比較で示す。150/7はこの疾患とは明らかに
関連のないHCMV陽性血清と高いIgM反応性(>3
2%)を示すが、このオートロガス融合蛋白質は52/
3と同様に低い反応性を示すので、150/7よりも明
確に良い特異性を示す。
【0053】図8の中の表2は急性HCMV感染症を持
つ免疫応答性個体の血清15個について前記IgM・E
LISAでのOD値を示す。全血清は通常のIgM・E
LISAでは陽性であった。組換え抗原52/3と比較
して、オートロガス融合蛋白質52/3|150/7/
2は顕著に改良された感度、すなわち、52/3陰性の
血清の幾つかが前記オートロガス融合蛋白質の基準値と
しての0.3を超えるOD値を与えた。
つ免疫応答性個体の血清15個について前記IgM・E
LISAでのOD値を示す。全血清は通常のIgM・E
LISAでは陽性であった。組換え抗原52/3と比較
して、オートロガス融合蛋白質52/3|150/7/
2は顕著に改良された感度、すなわち、52/3陰性の
血清の幾つかが前記オートロガス融合蛋白質の基準値と
しての0.3を超えるOD値を与えた。
【0054】図6は急性HCMV感染症を持つ移植患者
2名の血清について、組換え蛋白質52/3|150/
7/2、52/3および150/7の前記IgM・EL
ISAでの結果を示す。両患者は移植前はHCMV血清
学的陰性であり、血清学的陽性提供者からの器官(腎
臓)を与えられた。急性感染症の経過はpp65特異性
抗原血症検査とPCRで監視した。52/3はIgM反
応性を示さず、また、痕跡的IgM反応性は両経過で示
されるが、一方150/7は強い反応性を示す。この疾
患の急性経過に関連するIgM特異的血清学的反応性の
高さは両患者にオートロガス融合蛋白質52/3|15
0/7/2をもたらした。
2名の血清について、組換え蛋白質52/3|150/
7/2、52/3および150/7の前記IgM・EL
ISAでの結果を示す。両患者は移植前はHCMV血清
学的陰性であり、血清学的陽性提供者からの器官(腎
臓)を与えられた。急性感染症の経過はpp65特異性
抗原血症検査とPCRで監視した。52/3はIgM反
応性を示さず、また、痕跡的IgM反応性は両経過で示
されるが、一方150/7は強い反応性を示す。この疾
患の急性経過に関連するIgM特異的血清学的反応性の
高さは両患者にオートロガス融合蛋白質52/3|15
0/7/2をもたらした。
【0055】実施例6 断片UL57/3のPCR増幅
およびクローニング UL57の全配列を含むコスミドクローンPCM102
9(Fleckenstein,B.、I.Muell
erとJ.Collins、1982年、Clonin
g・of・the・complete・human・c
ytomegalovirus・in・cosmids
「コスミド中の完全なヒトサイトメガロウイルスのクロ
ーニング」、Gene、18巻、39〜46頁)から出
発して、読み枠UL57のアミノ酸545〜601をコ
ードする部分断片UL57/3のPCR増幅をプライマ
ーPCCUL577.seqとPCCUL578.se
qとを用いて行った(図9および図10)。両プライマ
ーはUL57と相補的な領域に加えて独特な制限開裂部
位を含むオーバーハング、すなわちPCCUL578.
seq:EcoRI、PCCUL577.seq:Ba
mHI、を持つ。これら開裂部位は増幅生成物の指向的
クローニングを可能にする。PCR増幅は反応緩衝液
(Perkin−Elmer・Cetus)10μL、
200μM−デオキシヌクレオチド4種、0.5μM−
PCRプライマー2種、出発DNA50〜100ngお
よびAmpliTaq・DNAポリメラーゼ(Perk
in−Elmer・Cetus)2.5単位を含む全容
積100μL中で実施した。増幅はPerkin−El
mer・CetusのDNAサーマルサイクラー中、次
の条件下に25サイクルで実施した:1分間−55℃、
1分間−72℃、1分間−94℃。PCR反応混合物を
サブマリンアガロースゲルチャンバー内で、臭化エチジ
ウム0.5μg/mLを含む1.2%アガロースゲル中
(Ultra・Pure・Agarose、BRL)、
TBEランニング緩衝液(0.089M−トリス/ホウ
酸塩、0.002M−EDTA)を用いて、電気泳動的
に分離した。その後、増幅したDNA断片を364nm
でUVランプにより可視化し、対応するバンドを含むゲ
ル領域をメスで切出した。DNAを製造者の指示書に従
ってBiotrapチャンバー(Schleicher
・&・Schuell)によって溶出した。これに続い
てDNAを製造者の使用指示書に従ってElutip・
Dカラム(Schleicher・&・Schuel
l)によって精製した。
およびクローニング UL57の全配列を含むコスミドクローンPCM102
9(Fleckenstein,B.、I.Muell
erとJ.Collins、1982年、Clonin
g・of・the・complete・human・c
ytomegalovirus・in・cosmids
「コスミド中の完全なヒトサイトメガロウイルスのクロ
ーニング」、Gene、18巻、39〜46頁)から出
発して、読み枠UL57のアミノ酸545〜601をコ
ードする部分断片UL57/3のPCR増幅をプライマ
ーPCCUL577.seqとPCCUL578.se
qとを用いて行った(図9および図10)。両プライマ
ーはUL57と相補的な領域に加えて独特な制限開裂部
位を含むオーバーハング、すなわちPCCUL578.
seq:EcoRI、PCCUL577.seq:Ba
mHI、を持つ。これら開裂部位は増幅生成物の指向的
クローニングを可能にする。PCR増幅は反応緩衝液
(Perkin−Elmer・Cetus)10μL、
200μM−デオキシヌクレオチド4種、0.5μM−
PCRプライマー2種、出発DNA50〜100ngお
よびAmpliTaq・DNAポリメラーゼ(Perk
in−Elmer・Cetus)2.5単位を含む全容
積100μL中で実施した。増幅はPerkin−El
mer・CetusのDNAサーマルサイクラー中、次
の条件下に25サイクルで実施した:1分間−55℃、
1分間−72℃、1分間−94℃。PCR反応混合物を
サブマリンアガロースゲルチャンバー内で、臭化エチジ
ウム0.5μg/mLを含む1.2%アガロースゲル中
(Ultra・Pure・Agarose、BRL)、
TBEランニング緩衝液(0.089M−トリス/ホウ
酸塩、0.002M−EDTA)を用いて、電気泳動的
に分離した。その後、増幅したDNA断片を364nm
でUVランプにより可視化し、対応するバンドを含むゲ
ル領域をメスで切出した。DNAを製造者の指示書に従
ってBiotrapチャンバー(Schleicher
・&・Schuell)によって溶出した。これに続い
てDNAを製造者の使用指示書に従ってElutip・
Dカラム(Schleicher・&・Schuel
l)によって精製した。
【0056】このように精製し、乾燥したDNA断片を
蒸留水80μLに溶解した。NEBuffer・4(N
ew・England・Biolabs)10μLを添
加した後、BamHI/EcoRI消化を酵素2種各1
00Uの添加によって実施した。2時間後、フェノール
抽出し、続いてエタノール沈殿をした。このようにして
製造したDNA断片100ngを標準的ベクターpUC
8のBamHI/EcoRI−処理DNA200ngと
4℃で16時間結合させ、次に大腸菌JM109をこれ
で形質転換した。形質転換混合物はアンピシリン(50
μg/mL)およびXーガル(30μg/mL)添加寒
天で平板培養した。白色のコロニーをアンピシリン添加
LB培地3mLに移し、ふりまぜながら37℃で12〜
16時間インキュベートした。プラスミドDNAの単離
後、EcoRI/BamHI制限消化およびアガロース
ゲル電気泳動を実施した。所期の大きさの付加DNA断
片が見出されたクローンをpUC8/PCCUL57/
3と命名し、以下のクローニングに使用した。
蒸留水80μLに溶解した。NEBuffer・4(N
ew・England・Biolabs)10μLを添
加した後、BamHI/EcoRI消化を酵素2種各1
00Uの添加によって実施した。2時間後、フェノール
抽出し、続いてエタノール沈殿をした。このようにして
製造したDNA断片100ngを標準的ベクターpUC
8のBamHI/EcoRI−処理DNA200ngと
4℃で16時間結合させ、次に大腸菌JM109をこれ
で形質転換した。形質転換混合物はアンピシリン(50
μg/mL)およびXーガル(30μg/mL)添加寒
天で平板培養した。白色のコロニーをアンピシリン添加
LB培地3mLに移し、ふりまぜながら37℃で12〜
16時間インキュベートした。プラスミドDNAの単離
後、EcoRI/BamHI制限消化およびアガロース
ゲル電気泳動を実施した。所期の大きさの付加DNA断
片が見出されたクローンをpUC8/PCCUL57/
3と命名し、以下のクローニングに使用した。
【0057】実施例7 部分断片UL57/1のPCR
増幅およびクローニング クローンPCM1029(実施例6参照)から出発し
て、読み枠UL57のアミノ酸755〜1000をコー
ドする断片UL57/1をプライマーPCCUL57
1.seqおよびPCCUL572.seqを用い、前
記のように増幅した断片をクローニングしてPCR増幅
を実施した。対応するクローンをpuc8/PCCUL
571と命名した。
増幅およびクローニング クローンPCM1029(実施例6参照)から出発し
て、読み枠UL57のアミノ酸755〜1000をコー
ドする断片UL57/1をプライマーPCCUL57
1.seqおよびPCCUL572.seqを用い、前
記のように増幅した断片をクローニングしてPCR増幅
を実施した。対応するクローンをpuc8/PCCUL
571と命名した。
【0058】実施例8 部分断片UL57/2のクロー
ニング この部分断片ではプライマーに数種の修飾を施したにも
かかわらず、PCR増幅はできなかった。この理由か
ら、クローンすべき出発DNAは化学的に合成した。そ
のために、断片のアミノ酸配列をDNASTARからの
コンピュータプログラムによって、用いられる大腸菌遺
伝子を強く発現するコドンのみをDNA中に翻訳した。
AA配列を変更せずにDNA配列に若干の修飾をして、
独特の制限開裂部位を導入して化学的に合成したオリゴ
ヌクレオチド対のクローニングが可能になった。
ニング この部分断片ではプライマーに数種の修飾を施したにも
かかわらず、PCR増幅はできなかった。この理由か
ら、クローンすべき出発DNAは化学的に合成した。そ
のために、断片のアミノ酸配列をDNASTARからの
コンピュータプログラムによって、用いられる大腸菌遺
伝子を強く発現するコドンのみをDNA中に翻訳した。
AA配列を変更せずにDNA配列に若干の修飾をして、
独特の制限開裂部位を導入して化学的に合成したオリゴ
ヌクレオチド対のクローニングが可能になった。
【0059】オリゴヌクレオチドはApplied・B
iosystemsのDNA合成器381Aで合成し、
続いてオリゴヌクレオチドを製造者の指示書に従ってO
PCカートリッジ(Applied・Biosyste
ms)を用いて精製した。
iosystemsのDNA合成器381Aで合成し、
続いてオリゴヌクレオチドを製造者の指示書に従ってO
PCカートリッジ(Applied・Biosyste
ms)を用いて精製した。
【0060】ヌクレオチドHC572SY1.SEQお
よびHC572SY2.SEQ各々10ngを制限酵素
EcoRIおよびHindIIIで4℃で16時間開裂
したベクターpUC8約200gに結合させ、次にこれ
で大腸菌JM109を形質転換した。Xーガル/アンピ
シリン含有寒天平板培養およびコロニーの培養を前記の
ようにして実施した。プラスミドDNAの単離後、Ps
tIで制限消化を行ったが、この開裂部位は最初のオリ
ゴヌクレオチド対により新規に導入されたものである。
リニアリゼーションを示したクローンを以下の実験に使
用した。このクローンのDNAを制限酵素PstIおよ
びEcoRIで処理し、オリゴヌクレオチドHC572
SY1.SEQおよびHC572.SY4SEQ各10
ngと結合させた。形質転換、平板培養および分離は前
記のようにして行った。BsgIで制限消化後、リニア
化したクローンを第3のクローニング工程に用いた。B
sgIとEcoRIで制限消化後、これをオリゴヌクレ
オチドHC572SY5.SEQおよびHC572SY
6.SEQで前記のように処理した。AvaIを用いて
リニア化したクローンをpUC8/UL57/2と命名
し、以下の実験に用いた。
よびHC572SY2.SEQ各々10ngを制限酵素
EcoRIおよびHindIIIで4℃で16時間開裂
したベクターpUC8約200gに結合させ、次にこれ
で大腸菌JM109を形質転換した。Xーガル/アンピ
シリン含有寒天平板培養およびコロニーの培養を前記の
ようにして実施した。プラスミドDNAの単離後、Ps
tIで制限消化を行ったが、この開裂部位は最初のオリ
ゴヌクレオチド対により新規に導入されたものである。
リニアリゼーションを示したクローンを以下の実験に使
用した。このクローンのDNAを制限酵素PstIおよ
びEcoRIで処理し、オリゴヌクレオチドHC572
SY1.SEQおよびHC572.SY4SEQ各10
ngと結合させた。形質転換、平板培養および分離は前
記のようにして行った。BsgIで制限消化後、リニア
化したクローンを第3のクローニング工程に用いた。B
sgIとEcoRIで制限消化後、これをオリゴヌクレ
オチドHC572SY5.SEQおよびHC572SY
6.SEQで前記のように処理した。AvaIを用いて
リニア化したクローンをpUC8/UL57/2と命名
し、以下の実験に用いた。
【0061】実施例9 発現ベクターpGEX−3Xへ
の断片UL57/1〜3のクローニング ヘテロロガス蛋白質グルタチオン・S−トランスフェラ
ーゼ(GST)と融合の抗原断片UL57/1〜3の発
現を確実にするために、発現ベクターpGEX−3X
(Smith,D.B.およびK.S.Johonso
n、1988年、Single−step・purif
ication・of・polypeptides・e
xpressed・in・Escherichia・c
oli・as・fusions・with・gluta
thione・S−transferase「グルタチ
オンSートランスフェラーゼとの融合として大腸菌内に
発現されたポリペプチドの単一工程精製法」、Gen
e、67巻:31〜40頁)で再クローニングを実施し
た。このベクターはBamHI切断部位をGSTをコー
ドする遺伝子の3’端に持つ。BamHI切断部位の読
み枠はクローンpUC8/UL57/1〜3をコードす
る断片のものと一致する。EcoRIおよびBamHI
制限消化によってpUC8/UL57/1、pUC8/
UL57/2およびpUC8/UL57/3から分離し
たDNA断片100mgを同じ制限酵素で開裂したベク
ターpGEX−3X200ngと4℃で16時間結合さ
せた。続いて大腸菌JM109の形質転換およびアンピ
シリン添加平板培養を行った。分離されたコロニーをア
ンピシリン添加LB培地3mLに移し、37℃でふりま
ぜながら16時間インキュベートした。プラスミドDN
Aの分離後、BamHI/EcoRI制限消化を実施し
た。所期サイズの挿入部分を持つクローンをpGEX−
3/UL57/1、pGEX−3/UL57/2および
pGEX−3/UL57/3と命名し、GST融合蛋白
質としてUL57断片の発現に用いた。
の断片UL57/1〜3のクローニング ヘテロロガス蛋白質グルタチオン・S−トランスフェラ
ーゼ(GST)と融合の抗原断片UL57/1〜3の発
現を確実にするために、発現ベクターpGEX−3X
(Smith,D.B.およびK.S.Johonso
n、1988年、Single−step・purif
ication・of・polypeptides・e
xpressed・in・Escherichia・c
oli・as・fusions・with・gluta
thione・S−transferase「グルタチ
オンSートランスフェラーゼとの融合として大腸菌内に
発現されたポリペプチドの単一工程精製法」、Gen
e、67巻:31〜40頁)で再クローニングを実施し
た。このベクターはBamHI切断部位をGSTをコー
ドする遺伝子の3’端に持つ。BamHI切断部位の読
み枠はクローンpUC8/UL57/1〜3をコードす
る断片のものと一致する。EcoRIおよびBamHI
制限消化によってpUC8/UL57/1、pUC8/
UL57/2およびpUC8/UL57/3から分離し
たDNA断片100mgを同じ制限酵素で開裂したベク
ターpGEX−3X200ngと4℃で16時間結合さ
せた。続いて大腸菌JM109の形質転換およびアンピ
シリン添加平板培養を行った。分離されたコロニーをア
ンピシリン添加LB培地3mLに移し、37℃でふりま
ぜながら16時間インキュベートした。プラスミドDN
Aの分離後、BamHI/EcoRI制限消化を実施し
た。所期サイズの挿入部分を持つクローンをpGEX−
3/UL57/1、pGEX−3/UL57/2および
pGEX−3/UL57/3と命名し、GST融合蛋白
質としてUL57断片の発現に用いた。
【0062】実施例10 オートロガス融合蛋白質52
/3・57/3および52/3・57/3 ・150/7
/2のクローニング イ) クローンpUC8/PCC52/3−p52のA
A297〜433をコードするクローン化された断片−
から出発して、プライマーPCC525.seqおよび
PCC526.seqを用いるPCR増幅および後に、
増幅された断片のクローニングを実施した。ここに用い
たプライマー2種のオーバーハングのために、増幅され
た断片は5’端にBamHI切断部位、3’端にBgl
IIおよびEcoRI切断部位を持つ。対応するクロー
ンをpUC8/PCC52/3Fと命名した。
/3・57/3および52/3・57/3 ・150/7
/2のクローニング イ) クローンpUC8/PCC52/3−p52のA
A297〜433をコードするクローン化された断片−
から出発して、プライマーPCC525.seqおよび
PCC526.seqを用いるPCR増幅および後に、
増幅された断片のクローニングを実施した。ここに用い
たプライマー2種のオーバーハングのために、増幅され
た断片は5’端にBamHI切断部位、3’端にBgl
IIおよびEcoRI切断部位を持つ。対応するクロー
ンをpUC8/PCC52/3Fと命名した。
【0063】ロ) クローンpUC8/UL57/3の
DNAについて、制限酵素XbaIおよびEcoRIを
用いる制限消化を実施した。こうして開裂したベクター
200ngを2種のオリゴヌクレオチドUL57F3.
SEQおよびUL57F4.SEQ各々10ngで結合
させ、次に大腸菌JM109をこれで前記のようにして
形質転換した。分離されたコロニーをLB培地に接種
し、前記のようにしてインキュベートした。プラスミド
DNAの分離後、BglIIで制限消化を実施し、続い
てアガロースゲル電気泳動を行った。オリゴヌクレオチ
ド2種の導入の証拠としてリニアリゼーションが証明さ
れたクローンをpUC8/UL57/3Fと命名し、以
下のクローニング実験に用いた。
DNAについて、制限酵素XbaIおよびEcoRIを
用いる制限消化を実施した。こうして開裂したベクター
200ngを2種のオリゴヌクレオチドUL57F3.
SEQおよびUL57F4.SEQ各々10ngで結合
させ、次に大腸菌JM109をこれで前記のようにして
形質転換した。分離されたコロニーをLB培地に接種
し、前記のようにしてインキュベートした。プラスミド
DNAの分離後、BglIIで制限消化を実施し、続い
てアガロースゲル電気泳動を行った。オリゴヌクレオチ
ド2種の導入の証拠としてリニアリゼーションが証明さ
れたクローンをpUC8/UL57/3Fと命名し、以
下のクローニング実験に用いた。
【0064】ハ) BamHIおよびEcoRIを用い
てクローンpUC8/UL57/3FのDNAについて
制限消化を実施した。ここで発生する約200bpの断
片はアガロース電気泳動を用いて単離し、前記のように
してゲル切片から溶出した。このDNA断片約50ng
を次にベクターpUC8/PCC52/3F200ng
と結合させ、これをBglIIおよびEcoRIで開裂
し、電気泳動を用いて同様に精製した。続いてこれで大
腸菌JM109を形質転換し、アンピシリン添加寒天平
板で培養した。分離したコロニーをアンピシリン添加L
B培地3mLに移し、ふりまぜながら37℃で12〜1
6時間インキュベートした。プラスミドDNAの分離
後、BamHI/EcoRI制限消化を実施し、続いて
アガロースゲル中で電気泳動を実施した。所期の大きさ
の挿入部を持つクローンをpUC8/52/3・UL5
7/3と命名し、以下の実験に用いた。BamHIおよ
びBglIIの認識配列が結合を可能にする同じオーバ
ーハングを持つという事実をこの操作に利用する。しか
しながら、開裂部位2個は結合が実施された後には失わ
れる。52/3FからUL57/3へのオーバーハング
は、同じ読み枠内で翻訳が可能であるように選択したも
のである。
てクローンpUC8/UL57/3FのDNAについて
制限消化を実施した。ここで発生する約200bpの断
片はアガロース電気泳動を用いて単離し、前記のように
してゲル切片から溶出した。このDNA断片約50ng
を次にベクターpUC8/PCC52/3F200ng
と結合させ、これをBglIIおよびEcoRIで開裂
し、電気泳動を用いて同様に精製した。続いてこれで大
腸菌JM109を形質転換し、アンピシリン添加寒天平
板で培養した。分離したコロニーをアンピシリン添加L
B培地3mLに移し、ふりまぜながら37℃で12〜1
6時間インキュベートした。プラスミドDNAの分離
後、BamHI/EcoRI制限消化を実施し、続いて
アガロースゲル中で電気泳動を実施した。所期の大きさ
の挿入部を持つクローンをpUC8/52/3・UL5
7/3と命名し、以下の実験に用いた。BamHIおよ
びBglIIの認識配列が結合を可能にする同じオーバ
ーハングを持つという事実をこの操作に利用する。しか
しながら、開裂部位2個は結合が実施された後には失わ
れる。52/3FからUL57/3へのオーバーハング
は、同じ読み枠内で翻訳が可能であるように選択したも
のである。
【0065】ニ) クローンpUC8/PCC150/
7/2−このクローンはHCMV抗原pp150のアミ
ノ酸994〜1048をコードしている部分断片を含む
−のDNAについてBamHIおよびEcoRIを用い
て制限消化を実施した。このようにして遊離された約1
70bpの断片を前記のように電気泳動的に精製した。
精製断片50ngを200ngのベクターpUC8/5
2/3・57/3と結合させ、4℃で16時間BglI
IおよびEcoRIで処理し、これで大腸菌JM109
を形質転換した。アンピシリン添加寒天平板培養を行っ
た。分離したコロニーをアンピシリン添加LB培地3m
Lに移し、ふりまぜながら37℃で12〜16時間イン
キュベートした。プラスミドDNAの分離後、BamH
I/EcoRI制限消化を実施し、続いてアガロースゲ
ル中での電気泳動を実施した。所期の大きさの挿入部を
持つクローンをpUC8/52/3・57/3・150
/7/2と命名し、以下の研究に用いた。
7/2−このクローンはHCMV抗原pp150のアミ
ノ酸994〜1048をコードしている部分断片を含む
−のDNAについてBamHIおよびEcoRIを用い
て制限消化を実施した。このようにして遊離された約1
70bpの断片を前記のように電気泳動的に精製した。
精製断片50ngを200ngのベクターpUC8/5
2/3・57/3と結合させ、4℃で16時間BglI
IおよびEcoRIで処理し、これで大腸菌JM109
を形質転換した。アンピシリン添加寒天平板培養を行っ
た。分離したコロニーをアンピシリン添加LB培地3m
Lに移し、ふりまぜながら37℃で12〜16時間イン
キュベートした。プラスミドDNAの分離後、BamH
I/EcoRI制限消化を実施し、続いてアガロースゲ
ル中での電気泳動を実施した。所期の大きさの挿入部を
持つクローンをpUC8/52/3・57/3・150
/7/2と命名し、以下の研究に用いた。
【0066】ホ) オートロガス融合蛋白質の発現を確
実にするために、対応するDNA断片のバクテリオファ
ージT7の遺伝子10にある強力なT7プロモータを持
っているベクターpET5cへの再クローニングを実施
した。この背景として、このベクターはリボソーム結合
部位および適当な距離に出発コドンを持っている。出発
コドンの後にバクテリオファージT7の遺伝子10の1
1アミノ酸の読み枠およびBamHIおよびEcoRI
開裂部位が存在する。BamHI開裂部位の読み枠は前
記のオートロガス融合蛋白質のそれと一致する。Eco
RIおよびBamHI制限消化によりpUC8/52/
3・UL57/3およびpUC8/52/3・57/3
・150/7/2から分離したDNA断片100ngを
同じ制限酵素で開裂したベクター200ngと4℃で1
6時間結合した。大腸菌JM109を形質転換し、続い
てアンピシリン添加平板で培養を行った。分離したコロ
ニーをアンピシリン添加LB培地3mLに移し、ふりま
ぜながら37℃で16時間インキュベートした。プラス
ミドDNAの分離後、BamHI/EcoRI制限消化
を実施した。所期の大きさの挿入部を持つクローンをp
ET5a/52/3・UL57/3およびpET5c/
52/3・57/3・150/7/2と命名した。組み
換え蛋白質の発現を確実にするため、発現クローンのD
NAでクロラムフェニコール耐性発現株BL21(DE
3)pLysSを形質転換した。各々の得られたクロー
ンの一つを以下の研究に用いた。
実にするために、対応するDNA断片のバクテリオファ
ージT7の遺伝子10にある強力なT7プロモータを持
っているベクターpET5cへの再クローニングを実施
した。この背景として、このベクターはリボソーム結合
部位および適当な距離に出発コドンを持っている。出発
コドンの後にバクテリオファージT7の遺伝子10の1
1アミノ酸の読み枠およびBamHIおよびEcoRI
開裂部位が存在する。BamHI開裂部位の読み枠は前
記のオートロガス融合蛋白質のそれと一致する。Eco
RIおよびBamHI制限消化によりpUC8/52/
3・UL57/3およびpUC8/52/3・57/3
・150/7/2から分離したDNA断片100ngを
同じ制限酵素で開裂したベクター200ngと4℃で1
6時間結合した。大腸菌JM109を形質転換し、続い
てアンピシリン添加平板で培養を行った。分離したコロ
ニーをアンピシリン添加LB培地3mLに移し、ふりま
ぜながら37℃で16時間インキュベートした。プラス
ミドDNAの分離後、BamHI/EcoRI制限消化
を実施した。所期の大きさの挿入部を持つクローンをp
ET5a/52/3・UL57/3およびpET5c/
52/3・57/3・150/7/2と命名した。組み
換え蛋白質の発現を確実にするため、発現クローンのD
NAでクロラムフェニコール耐性発現株BL21(DE
3)pLysSを形質転換した。各々の得られたクロー
ンの一つを以下の研究に用いた。
【0067】実施例11 ペプチドUL57/3Pの化
学合成およびその精製 ペプチドUL57/3Pは図11に示すアミノ酸配列に
従い、ミリポア9050連続流ペプチド合成器(Mil
lipore・Corp.、Milford、MA、U
SA)を用いて、9ーフルオレニルメトキシカルボニル
(Fmoc)試薬を用いて合成した。合成は担体物質
(PEG−PS樹脂)1000mgおよび特殊活性化ア
ミノ酸エステル0.8ミリモルで実施した。担体物質か
らの脱離および保護基の除去は88%トリフルオロ酢
酸、5%フェノール(液体)、2%トリイソプロピルシ
ランおよび5%蒸留水の混合物中で12時間インキュベ
ーションして行った。遊離のペプチドは氷冷エーテルで
数回沈殿させて、次に真空乾燥した。精製はC4カラム
(25×100mm、15μm、300A、Delta
−Pak、Waters、Millipore・Cor
p)上で0.1%TFA中の0〜60%アセトニトリル
勾配を用いる分取逆相HPLCにより実施した。採集し
た分画を凍結乾燥し、逆相HPLCおよびSDS−PA
G電気泳動により分析した。純粋なペプチドを含む分画
はELISAでの評価のために用いた。
学合成およびその精製 ペプチドUL57/3Pは図11に示すアミノ酸配列に
従い、ミリポア9050連続流ペプチド合成器(Mil
lipore・Corp.、Milford、MA、U
SA)を用いて、9ーフルオレニルメトキシカルボニル
(Fmoc)試薬を用いて合成した。合成は担体物質
(PEG−PS樹脂)1000mgおよび特殊活性化ア
ミノ酸エステル0.8ミリモルで実施した。担体物質か
らの脱離および保護基の除去は88%トリフルオロ酢
酸、5%フェノール(液体)、2%トリイソプロピルシ
ランおよび5%蒸留水の混合物中で12時間インキュベ
ーションして行った。遊離のペプチドは氷冷エーテルで
数回沈殿させて、次に真空乾燥した。精製はC4カラム
(25×100mm、15μm、300A、Delta
−Pak、Waters、Millipore・Cor
p)上で0.1%TFA中の0〜60%アセトニトリル
勾配を用いる分取逆相HPLCにより実施した。採集し
た分画を凍結乾燥し、逆相HPLCおよびSDS−PA
G電気泳動により分析した。純粋なペプチドを含む分画
はELISAでの評価のために用いた。
【0068】実施例12 UL57/1−GST、UL
57/2−GSTおよびUL57/3−G STの培養、
発現および精製 LB/AMP培地150mLにクローンpGEX−3/
UL57/1〜3(LB/AMP培地)の寒天平板から
分離したコロニーを植菌した。培養は1LのCF内で毎
分160回転のロータリーシェーカー上で37℃で16
時間行った。
57/2−GSTおよびUL57/3−G STの培養、
発現および精製 LB/AMP培地150mLにクローンpGEX−3/
UL57/1〜3(LB/AMP培地)の寒天平板から
分離したコロニーを植菌した。培養は1LのCF内で毎
分160回転のロータリーシェーカー上で37℃で16
時間行った。
【0069】培養物3Lを各0.5Lの並列した6個の
バッチを2Lの調整板付CF内で培養した。培地(LB
/CA、AMP)は37℃に予熱した。フラスコに前培
養(1:26)の20mL分割を植菌し、バッチを毎分
160回転のロータリーシェーカー中、37℃でインキ
ュベートした。生長を600nmの吸収Aを連続的に測
定して監視した。A(600nm)が0.7になった
時、IPTG(最終濃度1mM)の添加により、誘導を
行った。
バッチを2Lの調整板付CF内で培養した。培地(LB
/CA、AMP)は37℃に予熱した。フラスコに前培
養(1:26)の20mL分割を植菌し、バッチを毎分
160回転のロータリーシェーカー中、37℃でインキ
ュベートした。生長を600nmの吸収Aを連続的に測
定して監視した。A(600nm)が0.7になった
時、IPTG(最終濃度1mM)の添加により、誘導を
行った。
【0070】誘導の4時間後、収集を遠心分離(6×1
Lビーカー、4000g、0〜4℃、30分間)によっ
て行った。排水のよい細菌ペレットを氷冷PBS200
mLに再懸濁し、再び遠心分離(2×250mLビーカ
ー、5000g、0〜4℃、10分間)した。排水のよ
いペレットを凍結、−20から−30℃で保存した。
Lビーカー、4000g、0〜4℃、30分間)によっ
て行った。排水のよい細菌ペレットを氷冷PBS200
mLに再懸濁し、再び遠心分離(2×250mLビーカ
ー、5000g、0〜4℃、10分間)した。排水のよ
いペレットを凍結、−20から−30℃で保存した。
【0071】細菌ペレットを解凍した後、これを基本緩
衝液(トリス−塩酸/20mM/pH7.5)80mL
に再懸濁し、ホモゲナイズ(テフロン/ガラスポッター
ホモゲナイザー)した。室温で撹拌しつつ次の添加物を
加えた:NP−40(0.1%)、PMSF(0.1m
M)、ペファブロック(0.1mM)、EDTA(50
mM)およびリゾチーム(100mg)。全容積は10
0mLであった。混合物を室温で激しく撹拌し、60分
後に氷上に置いた。以後の全工程は氷上または冷却下に
実施した。インキュベーション後、グリセリン(10
%)および2ーメルカプトエタノール(14mM)を添
加し、各成分を混合した。基本緩衝液で容積を140m
Lとした。溶菌混合物を次に超音波処理(20kHz、
パルス、5分間、3/4”チタンプローブ)し、続いて
機械的ポッター処理(テフロン/ガラスポッターホモゲ
ナイザー、毎分1000回転、6ストローク)した。ク
ローンpGEX−3/UL57/1およびpGEX/U
L57/2の場合、溶解した物質を遠心分離(1×25
0mLビーカー、10000g、10分間、0〜4℃)
により分離し、廃棄した。
衝液(トリス−塩酸/20mM/pH7.5)80mL
に再懸濁し、ホモゲナイズ(テフロン/ガラスポッター
ホモゲナイザー)した。室温で撹拌しつつ次の添加物を
加えた:NP−40(0.1%)、PMSF(0.1m
M)、ペファブロック(0.1mM)、EDTA(50
mM)およびリゾチーム(100mg)。全容積は10
0mLであった。混合物を室温で激しく撹拌し、60分
後に氷上に置いた。以後の全工程は氷上または冷却下に
実施した。インキュベーション後、グリセリン(10
%)および2ーメルカプトエタノール(14mM)を添
加し、各成分を混合した。基本緩衝液で容積を140m
Lとした。溶菌混合物を次に超音波処理(20kHz、
パルス、5分間、3/4”チタンプローブ)し、続いて
機械的ポッター処理(テフロン/ガラスポッターホモゲ
ナイザー、毎分1000回転、6ストローク)した。ク
ローンpGEX−3/UL57/1およびpGEX/U
L57/2の場合、溶解した物質を遠心分離(1×25
0mLビーカー、10000g、10分間、0〜4℃)
により分離し、廃棄した。
【0072】クローンpGEX−3/UL57/3の場
合、非溶解物質を遠心分離(4×50mLビーカー、4
0000g、30分間、0〜4℃)で分離し、廃棄し
た。
合、非溶解物質を遠心分離(4×50mLビーカー、4
0000g、30分間、0〜4℃)で分離し、廃棄し
た。
【0073】溶菌後に溶解しなかったクローンpGEX
−3/UL57/1の物質(ペレット)は洗浄緩衝液1
(トリス−塩酸/100mM/pH9/10%グリセリ
ン/0.5%NP−40/14mM−2−メルカプトエ
タノール)50mL中で前ホモゲナイズ(テフロン/ガ
ラスポッターホモゲナイザー)し、超音波処理(20k
Hz、パルス、5分間、3/4”チタンプローブ)し
た。溶解した物質を遠心分離(2×50mLビーカー、
33000g、20分間、0〜4℃)で分離し、廃棄し
た。
−3/UL57/1の物質(ペレット)は洗浄緩衝液1
(トリス−塩酸/100mM/pH9/10%グリセリ
ン/0.5%NP−40/14mM−2−メルカプトエ
タノール)50mL中で前ホモゲナイズ(テフロン/ガ
ラスポッターホモゲナイザー)し、超音波処理(20k
Hz、パルス、5分間、3/4”チタンプローブ)し
た。溶解した物質を遠心分離(2×50mLビーカー、
33000g、20分間、0〜4℃)で分離し、廃棄し
た。
【0074】非溶解物質(ペレット)を洗浄緩衝液2
(グリセリン−塩酸/100mM/pH3/14mM−
2−メルカプトエタノール)30mLで前ホモゲナイズ
(テフロン/ガラスポッターホモゲナイザー)し、超音
波処理(20kHz、パルス、5分間、3/4”チタン
プローブ)を行った。溶解した物質を遠心分離(1×5
0mLビーカー、40000g、20分間、0〜4℃)
で分離し、廃棄した。
(グリセリン−塩酸/100mM/pH3/14mM−
2−メルカプトエタノール)30mLで前ホモゲナイズ
(テフロン/ガラスポッターホモゲナイザー)し、超音
波処理(20kHz、パルス、5分間、3/4”チタン
プローブ)を行った。溶解した物質を遠心分離(1×5
0mLビーカー、40000g、20分間、0〜4℃)
で分離し、廃棄した。
【0075】非溶解物質(ペレット)を洗浄緩衝液3
(トリス−塩酸/20mM/pH9/4M−尿素/14
mM−2−メルカプトエタノール)30mL中で前ホモ
ゲナイズ(テフロン/ガラスポッターホモゲナイザー)
し、超音波処理(20kHz、パルス、5分間、3/
4”チタンプローブ)を実施した。溶解した物質を遠心
分離(1×50mLビーカー、40000g、30分
間、0〜4℃)で分離し、廃棄した。
(トリス−塩酸/20mM/pH9/4M−尿素/14
mM−2−メルカプトエタノール)30mL中で前ホモ
ゲナイズ(テフロン/ガラスポッターホモゲナイザー)
し、超音波処理(20kHz、パルス、5分間、3/
4”チタンプローブ)を実施した。溶解した物質を遠心
分離(1×50mLビーカー、40000g、30分
間、0〜4℃)で分離し、廃棄した。
【0076】3回目の洗浄工程後の非溶解物質(ペレッ
ト)を溶解緩衝液(トリス−塩酸/20mM/pH9/
8mM−尿素/14mM−2−メルカプトエタノール)
30mL中で前ホモゲナイズ(テフロン/ガラスポッタ
ーホモゲナイザー)し、超音波処理(20kHz、パル
ス、5分間、3/4”チタンプローブ)した。不溶であ
り続けた物質を遠心分離(1×50mLビーカー、40
000g、30分間、8〜10℃)で分離し、廃棄し
た。
ト)を溶解緩衝液(トリス−塩酸/20mM/pH9/
8mM−尿素/14mM−2−メルカプトエタノール)
30mL中で前ホモゲナイズ(テフロン/ガラスポッタ
ーホモゲナイザー)し、超音波処理(20kHz、パル
ス、5分間、3/4”チタンプローブ)した。不溶であ
り続けた物質を遠心分離(1×50mLビーカー、40
000g、30分間、8〜10℃)で分離し、廃棄し
た。
【0077】溶解した蛋白質をSQ−セファロース(H
iLoad)上でクロマトグラフした。このためには
1.6×10cm(20mL)の大きさのカラムを用い
た。A(280nm)と電導度を連続的に記録した。流
速は5mL/分、カラム緩衝液=溶解緩衝液。サンプ
ル、続いてカラム緩衝液50mLを入れた後、カラム緩
衝液中で、最初は緩い直線状NaCl勾配(dC/dV
=2.5mM/mL、500mMまで)、続いて急な直
線状NaCl勾配(dC/dV=10mM/mL、10
00mMまで)を適用した。溶出液を10mLづつの分
画に分け、凍結した。抗原含有分画は緩い勾配の領域に
見出された。検出はSDS−PAディスク電気泳動、続
いてクーマシー染色によった。
iLoad)上でクロマトグラフした。このためには
1.6×10cm(20mL)の大きさのカラムを用い
た。A(280nm)と電導度を連続的に記録した。流
速は5mL/分、カラム緩衝液=溶解緩衝液。サンプ
ル、続いてカラム緩衝液50mLを入れた後、カラム緩
衝液中で、最初は緩い直線状NaCl勾配(dC/dV
=2.5mM/mL、500mMまで)、続いて急な直
線状NaCl勾配(dC/dV=10mM/mL、10
00mMまで)を適用した。溶出液を10mLづつの分
画に分け、凍結した。抗原含有分画は緩い勾配の領域に
見出された。検出はSDS−PAディスク電気泳動、続
いてクーマシー染色によった。
【0078】純粋な抗原を含むことが証明された(クー
マシーゲル)分画を解凍し、集め、同量の復元緩衝液
(トリス−塩酸/100mM/pH9/10%グリセリ
ン/14M−2−メルカプトエタノール)で希釈(尿素
濃度は4Mまで低下)した。以後の工程は全て限外濾過
セル(膜=オメガ50)中撹拌しつつ、窒素気中で氷冷
下に実施した。該蛋白質溶液を最初に約30mLまで濃
縮し、徐々に復元緩衝液で2倍容まで希釈した。各々の
場合に、出発容積の半分までの濃縮と復元緩衝液での容
積比1:1までの希釈を実施した。尿素濃度は次の段階
を経て低下した:4M−2M−1M−0.5M−0.2
5M。
マシーゲル)分画を解凍し、集め、同量の復元緩衝液
(トリス−塩酸/100mM/pH9/10%グリセリ
ン/14M−2−メルカプトエタノール)で希釈(尿素
濃度は4Mまで低下)した。以後の工程は全て限外濾過
セル(膜=オメガ50)中撹拌しつつ、窒素気中で氷冷
下に実施した。該蛋白質溶液を最初に約30mLまで濃
縮し、徐々に復元緩衝液で2倍容まで希釈した。各々の
場合に、出発容積の半分までの濃縮と復元緩衝液での容
積比1:1までの希釈を実施した。尿素濃度は次の段階
を経て低下した:4M−2M−1M−0.5M−0.2
5M。
【0079】尿素の最終濃度は0.25Mを超えなかっ
た。付着物は室から除き、凍結し、分割して−60℃か
ら−80℃で保存した。溶菌後に溶解しなかったクロー
ンpGEX−3/UL57/2の物質(ペレット)を洗
浄緩衝液1(トリス−塩酸/100mM/pH9/10
%グリセリン/0.5%NP−40/14mM−2−メ
ルカプトエタノール)50mLで前ホモゲナイズ(テフ
ロン/ガラスポッターホモゲナイザー)し、超音波処理
(20kHz、パルス、5分間、3/4”チタンプロー
ブ)した。溶解した物質を遠心分離(2×50mLビー
カー、33000g、20分間、0〜4℃)で分離し、
廃棄した。
た。付着物は室から除き、凍結し、分割して−60℃か
ら−80℃で保存した。溶菌後に溶解しなかったクロー
ンpGEX−3/UL57/2の物質(ペレット)を洗
浄緩衝液1(トリス−塩酸/100mM/pH9/10
%グリセリン/0.5%NP−40/14mM−2−メ
ルカプトエタノール)50mLで前ホモゲナイズ(テフ
ロン/ガラスポッターホモゲナイザー)し、超音波処理
(20kHz、パルス、5分間、3/4”チタンプロー
ブ)した。溶解した物質を遠心分離(2×50mLビー
カー、33000g、20分間、0〜4℃)で分離し、
廃棄した。
【0080】非溶解物質(ペレット)を洗浄緩衝液2
(グリセリン−塩酸/100mM/pH3/14mM−
2−メルカプトエタノール)30mLで前ホモゲナイズ
(テフロン/ガラスポッターホモゲナイザー)し、超音
波処理(20kHz、パルス、5分間、3/4”チタン
プローブ)した。溶解した物質を遠心分離(1×50m
Lビーカー、40000g、20分間、0〜4℃)で分
離し、廃棄した。
(グリセリン−塩酸/100mM/pH3/14mM−
2−メルカプトエタノール)30mLで前ホモゲナイズ
(テフロン/ガラスポッターホモゲナイザー)し、超音
波処理(20kHz、パルス、5分間、3/4”チタン
プローブ)した。溶解した物質を遠心分離(1×50m
Lビーカー、40000g、20分間、0〜4℃)で分
離し、廃棄した。
【0081】非溶解物質(ペレット)を洗浄緩衝液3
(トリス−塩酸/20mM/pH9/4M−尿素/14
mM−2−メルカプトエタノール)30mLで前ホモゲ
ナイズ(テフロン/ガラスポッターホモゲナイザー)
し、超音波処理(20kHz、パルス、5分間、3/
4”チタンプローブ)した。溶解した物質を遠心分離
(1×50mLビーカー、40000g、30分間、0
〜4℃)で分離し、廃棄した。
(トリス−塩酸/20mM/pH9/4M−尿素/14
mM−2−メルカプトエタノール)30mLで前ホモゲ
ナイズ(テフロン/ガラスポッターホモゲナイザー)
し、超音波処理(20kHz、パルス、5分間、3/
4”チタンプローブ)した。溶解した物質を遠心分離
(1×50mLビーカー、40000g、30分間、0
〜4℃)で分離し、廃棄した。
【0082】3回目の洗浄工程後の非溶解物質(ペレッ
ト)を溶解緩衝液(トリス−塩酸/20mM/pH9/
8mM−尿素/14mM−2−メルカプトエタノール)
30mLで前ホモゲナイズ(テフロン/ガラスポッター
ホモゲナイザー)し、超音波処理(20kHz、パル
ス、5分間、3/4”チタンプローブ)した。不溶であ
り続けた物質を遠心分離(1×50mLビーカー、40
000g、30分間、8〜10℃)で分離し、廃棄し
た。
ト)を溶解緩衝液(トリス−塩酸/20mM/pH9/
8mM−尿素/14mM−2−メルカプトエタノール)
30mLで前ホモゲナイズ(テフロン/ガラスポッター
ホモゲナイザー)し、超音波処理(20kHz、パル
ス、5分間、3/4”チタンプローブ)した。不溶であ
り続けた物質を遠心分離(1×50mLビーカー、40
000g、30分間、8〜10℃)で分離し、廃棄し
た。
【0083】溶解した融合蛋白質を復元緩衝液の同容で
希釈(尿素濃度は4Mまで低下)した。以後の工程は全
て限外濾過セル(膜=オメガ50)中で、窒素気下に、
氷冷、撹拌しつつ実施した。蛋白質溶液を各々最初は出
発容積の半分まで濃縮し、徐々に復元緩衝液で希釈し
た。尿素濃度は次の段階を経て低下した:4M−2M−
2M−0.5M−0.25M。尿素の最終濃度は0.2
5Mを超えなかった。付着物は室から除き、凍結し、−
60℃から−80℃で分割保存した。
希釈(尿素濃度は4Mまで低下)した。以後の工程は全
て限外濾過セル(膜=オメガ50)中で、窒素気下に、
氷冷、撹拌しつつ実施した。蛋白質溶液を各々最初は出
発容積の半分まで濃縮し、徐々に復元緩衝液で希釈し
た。尿素濃度は次の段階を経て低下した:4M−2M−
2M−0.5M−0.25M。尿素の最終濃度は0.2
5Mを超えなかった。付着物は室から除き、凍結し、−
60℃から−80℃で分割保存した。
【0084】クローンpGEX−3/UL57/3の溶
解性蛋白質をGSHーセファロース−4B(Pharm
acia)上でクロマトグラフした。このため2.6×
10cm(50mL)の大きさのカラムを用いた。A
(280nm)を連続的に記録した。
解性蛋白質をGSHーセファロース−4B(Pharm
acia)上でクロマトグラフした。このため2.6×
10cm(50mL)の大きさのカラムを用いた。A
(280nm)を連続的に記録した。
【0085】流速は2mL/分であった。カラム緩衝液
=トリス−塩酸/20mM/pH7.5/1.4mMー
メルカプトエタノール。サンプルを入れた後、記録計が
ベースラインに落着くまでカラムをカラム緩衝液で洗浄
した。GST蛋白質は5mMーグルタチオン(GSHr
ed)のカラム緩衝液の溶液で溶出した。GSHは使用
直前に溶解した。GSH溶出液(吸収極大を記録計に記
録)を集め、凍結し、−60〜−80℃で分割保存し
た。
=トリス−塩酸/20mM/pH7.5/1.4mMー
メルカプトエタノール。サンプルを入れた後、記録計が
ベースラインに落着くまでカラムをカラム緩衝液で洗浄
した。GST蛋白質は5mMーグルタチオン(GSHr
ed)のカラム緩衝液の溶液で溶出した。GSHは使用
直前に溶解した。GSH溶出液(吸収極大を記録計に記
録)を集め、凍結し、−60〜−80℃で分割保存し
た。
【0086】実施例13 オートロガス融合蛋白質52
/3・57/3の培養、発現と精製 クローンpET5c・52/3・57/3の平板培養コ
ロニー(LB/CA、AMP)から出発して、培養物
(LB/CA、AMP)15mLをロータリーシェーカ
ー内でA(600nm)が1.8〜2.0になるまで3
7℃で培養した。培養物を次にグリセリン(87%)と
混合して最終濃度を15%(v/v)とした。培養物を
0.1mL分割として凍結し、−60から−80℃で保
存した。
/3・57/3の培養、発現と精製 クローンpET5c・52/3・57/3の平板培養コ
ロニー(LB/CA、AMP)から出発して、培養物
(LB/CA、AMP)15mLをロータリーシェーカ
ー内でA(600nm)が1.8〜2.0になるまで3
7℃で培養した。培養物を次にグリセリン(87%)と
混合して最終濃度を15%(v/v)とした。培養物を
0.1mL分割として凍結し、−60から−80℃で保
存した。
【0087】凍結前培養物1分割を急速解凍し、LB/
CA、AMP培地150mLに注入した。培養は1L・
CF内で毎分100回転のロータリーシェーカー上、2
8℃で16時間行った。
CA、AMP培地150mLに注入した。培養は1L・
CF内で毎分100回転のロータリーシェーカー上、2
8℃で16時間行った。
【0088】調整板付2LのCF内で並行する各0.5
Lのバッチ12回から培養物6Lを得た。培地(LB/
CA、AMP)は37℃に予熱した。フラスコに前培養
物10mLづつを植菌し、毎分160回転のロータリー
シェーカー上、37℃でインキュベートした。生育はA
(600nm)の測定で連続的に監視した。A(600
nm)が0.6になった時、IPTG(最終濃度1m
M)の添加によって誘導を実施した。
Lのバッチ12回から培養物6Lを得た。培地(LB/
CA、AMP)は37℃に予熱した。フラスコに前培養
物10mLづつを植菌し、毎分160回転のロータリー
シェーカー上、37℃でインキュベートした。生育はA
(600nm)の測定で連続的に監視した。A(600
nm)が0.6になった時、IPTG(最終濃度1m
M)の添加によって誘導を実施した。
【0089】収集は誘導の3時間後に遠心分離(6×1
Lビーカー、4000g、30分、0〜4℃)により実
施した。排水のよい細菌ペレットを氷冷PBS200m
Lに再懸濁し、再び遠心分離(2×250mLビーカ
ー、5000g、0〜4℃、10分間)した。排水のよ
い細菌ペレットを凍結し、−20℃から−30℃で保存
した。
Lビーカー、4000g、30分、0〜4℃)により実
施した。排水のよい細菌ペレットを氷冷PBS200m
Lに再懸濁し、再び遠心分離(2×250mLビーカ
ー、5000g、0〜4℃、10分間)した。排水のよ
い細菌ペレットを凍結し、−20℃から−30℃で保存
した。
【0090】凍結した細菌ペレットを解凍し、基本緩衝
液(トリス−塩酸/20mM/pH7.5)160mL
に再懸濁し、次にテフロン/ガラス/ポッターホモゲナ
イザーでホモゲナイズした。室温で撹拌しながら、次の
添加物を加えた:NP−40(0.05%)、PMSF
(0.2mM)、ペファブロック(0.2mM)、ED
TA(50mM)およびリゾチーム(50mg)。全容
は200mLであった。リゾチーム添加後、混合物を直
ちに氷上に置いた。以下の工程は全て氷上または冷却下
に実施した。インキュベーション後、グリセリン(10
%)と2−メルカプトエタノール(14mM)とを加
え、各成分を混合した。基本緩衝液を加えて容積を28
0mLとした。溶菌混合物を次に超音波処理(20kH
z、パルス、5分間、3/4”チタンプローブ)した。
非溶解物質は遠心分離(2×250mLビーカー、27
000g、30分間、0〜4℃)した。ペレットは廃棄
した。
液(トリス−塩酸/20mM/pH7.5)160mL
に再懸濁し、次にテフロン/ガラス/ポッターホモゲナ
イザーでホモゲナイズした。室温で撹拌しながら、次の
添加物を加えた:NP−40(0.05%)、PMSF
(0.2mM)、ペファブロック(0.2mM)、ED
TA(50mM)およびリゾチーム(50mg)。全容
は200mLであった。リゾチーム添加後、混合物を直
ちに氷上に置いた。以下の工程は全て氷上または冷却下
に実施した。インキュベーション後、グリセリン(10
%)と2−メルカプトエタノール(14mM)とを加
え、各成分を混合した。基本緩衝液を加えて容積を28
0mLとした。溶菌混合物を次に超音波処理(20kH
z、パルス、5分間、3/4”チタンプローブ)した。
非溶解物質は遠心分離(2×250mLビーカー、27
000g、30分間、0〜4℃)した。ペレットは廃棄
した。
【0091】上清液を氷浴中で撹拌しながら、これに固
体硫酸アンモニウム微粉末を濃度が30%飽和になるま
で徐々に添加(15分間かけて)した。撹拌をさらに1
5分間継続した。混合物を次に遠心分離(2×250m
Lビーカー、27000g、30分間、0〜4℃)し
た。ペレットは廃棄した。上清液に再び硫酸アンモニウ
ムを添加して43%飽和の濃度とし、混合物を前記のよ
うにして遠心分離した。上清液は廃棄した。ペレットを
2−メルカプトエタノール(14mM)、ペファブロッ
ク(0.1mM)およびグリセリン(10%)を添加し
たトリス−塩酸/20mM/pH8.5に再懸濁し、−
20℃から−30℃で一夜保存した。
体硫酸アンモニウム微粉末を濃度が30%飽和になるま
で徐々に添加(15分間かけて)した。撹拌をさらに1
5分間継続した。混合物を次に遠心分離(2×250m
Lビーカー、27000g、30分間、0〜4℃)し
た。ペレットは廃棄した。上清液に再び硫酸アンモニウ
ムを添加して43%飽和の濃度とし、混合物を前記のよ
うにして遠心分離した。上清液は廃棄した。ペレットを
2−メルカプトエタノール(14mM)、ペファブロッ
ク(0.1mM)およびグリセリン(10%)を添加し
たトリス−塩酸/20mM/pH8.5に再懸濁し、−
20℃から−30℃で一夜保存した。
【0092】硫酸アンモニウム(30〜43%)で分画
した蛋白質溶液を解凍し、沈殿した蛋白質を遠心分離
(1×50mLビーカー、40000g、30分、0〜
4℃)で除去した。上清液をセファデックスG−25
(粗)カラム(容積は少なくとも200mL)上で、溶
出液のA(280nm)と電導度を測定しながらクロマ
トグラフした。カラム緩衝液=2−メルカプトエタノー
ル(1.4mM)、ペファブロック(0.02mM)お
よびグリセリン(10%)を添加したトリス−塩酸/2
0mM/pH8.5。溶出液内の蛋白質を全部を集め、
さらに直接にクロマトグラフした。
した蛋白質溶液を解凍し、沈殿した蛋白質を遠心分離
(1×50mLビーカー、40000g、30分、0〜
4℃)で除去した。上清液をセファデックスG−25
(粗)カラム(容積は少なくとも200mL)上で、溶
出液のA(280nm)と電導度を測定しながらクロマ
トグラフした。カラム緩衝液=2−メルカプトエタノー
ル(1.4mM)、ペファブロック(0.02mM)お
よびグリセリン(10%)を添加したトリス−塩酸/2
0mM/pH8.5。溶出液内の蛋白質を全部を集め、
さらに直接にクロマトグラフした。
【0093】セファデックスG−25の溶出物をSP−
セファロース(急速)クロマトグラフした。これには
2.6×12cm(60mL)の大きさのカラムを用い
た。A(280nm)および電導度を連続的に記録し
た。流速は5mL/分であった。カラム緩衝液=2−メ
ルカプトエタノール(1.4mM)、ペファブロック
(0.02mM)およびグリセリン(10%)を添加し
たトリス−塩酸/20mM/pH8.5。サンプルの添
加に続いてカラム緩衝液100mLおよびカラム緩衝液
中の直線状NaCl勾配(dC/dV=1.2mM/m
L、500mMまで)を適用した。溶出液を10mL分
画に分割し、凍結した。抗原含有分画は200mM−と
300mM−NaClの間の範囲にあった。検出はSD
S−PAディスク電気泳動とそれに続くクーマシー染色
で行った。
セファロース(急速)クロマトグラフした。これには
2.6×12cm(60mL)の大きさのカラムを用い
た。A(280nm)および電導度を連続的に記録し
た。流速は5mL/分であった。カラム緩衝液=2−メ
ルカプトエタノール(1.4mM)、ペファブロック
(0.02mM)およびグリセリン(10%)を添加し
たトリス−塩酸/20mM/pH8.5。サンプルの添
加に続いてカラム緩衝液100mLおよびカラム緩衝液
中の直線状NaCl勾配(dC/dV=1.2mM/m
L、500mMまで)を適用した。溶出液を10mL分
画に分割し、凍結した。抗原含有分画は200mM−と
300mM−NaClの間の範囲にあった。検出はSD
S−PAディスク電気泳動とそれに続くクーマシー染色
で行った。
【0094】無傷の抗原を含むと証明された分画(2
8.8/27.5KDバンド)(クーマシーゲル)を解
凍し、集め、グリセリンを添加し(20%)、限外濾過
(撹拌セル、氷浴、膜=オメガ30)により濃縮して最
終容積約5mLとした。付着物は室から除き、次にクロ
マトグラフした。
8.8/27.5KDバンド)(クーマシーゲル)を解
凍し、集め、グリセリンを添加し(20%)、限外濾過
(撹拌セル、氷浴、膜=オメガ30)により濃縮して最
終容積約5mLとした。付着物は室から除き、次にクロ
マトグラフした。
【0095】濃縮したSP−セファロースのプールをス
ーパーデックス75(製造級)上でクロマトグラフし
た。ここでは2.6×60cm(300mL)の大きさ
のハイロードカラムを使用した。A(280nm)およ
び電導度を連続的に記録した。流速は2mL/分であっ
た。カラム緩衝液=NaCl(0.5M)、グリセリン
(20%)、2−メルカプトエタノール(1.4m
M)、EDTA(1mM)、PMSF(0.1mM)お
よびペファブロック(0.02mM)を添加した基本緩
衝液。溶出液を5mL分画に分割し、冷凍した。抗原含
有分画は2番目の吸収極大にあった。検出はSDS−P
Aディスク電気泳動と後続するクーマシー染色で行っ
た。
ーパーデックス75(製造級)上でクロマトグラフし
た。ここでは2.6×60cm(300mL)の大きさ
のハイロードカラムを使用した。A(280nm)およ
び電導度を連続的に記録した。流速は2mL/分であっ
た。カラム緩衝液=NaCl(0.5M)、グリセリン
(20%)、2−メルカプトエタノール(1.4m
M)、EDTA(1mM)、PMSF(0.1mM)お
よびペファブロック(0.02mM)を添加した基本緩
衝液。溶出液を5mL分画に分割し、冷凍した。抗原含
有分画は2番目の吸収極大にあった。検出はSDS−P
Aディスク電気泳動と後続するクーマシー染色で行っ
た。
【0096】無傷で純粋な抗原を含むことが証明された
(クーマシーゲル)分画を解凍し、集め、限外濾過(撹
拌セル、氷浴、膜=オメガ30)により濃縮し、最終濃
度少なくとも2mg/mLとした。付着物は室から除
き、凍結し、−60℃から−80℃で適量づつに分割保
存した。
(クーマシーゲル)分画を解凍し、集め、限外濾過(撹
拌セル、氷浴、膜=オメガ30)により濃縮し、最終濃
度少なくとも2mg/mLとした。付着物は室から除
き、凍結し、−60℃から−80℃で適量づつに分割保
存した。
【0097】実施例14 オートロガス融合蛋白質52
/3・57/3・150/7/2の培養、 発現および精
製 培養と溶菌はオートロガス融合蛋白質52/3・57/
3について記載したものと同様にして実施した。
/3・57/3・150/7/2の培養、 発現および精
製 培養と溶菌はオートロガス融合蛋白質52/3・57/
3について記載したものと同様にして実施した。
【0098】溶菌で得た上清液に氷浴中で撹拌しなが
ら、固体の硫酸アンモニウム微粉末を30%飽和濃度に
なるまで徐々に添加した(15分間)。撹拌はさらに1
5分間継続した。混合物を次に遠心分離(2×250m
Lビーカー、27000g、30分間、0〜4℃)し
た。ペレットは廃棄した。再び硫酸アンモニウムを38
%飽和濃度になるまで添加し、混合物を前記のようにし
て遠心分離した。上清液は廃棄した。ペレットを2−メ
ルカプトエタノール(14mM)、ペファブロック
(0.1mM)およびグリセリン(10%)を添加した
トリス−塩酸/20mM/pH9緩衝液25mLに再懸
濁し、凍結し、一夜−20℃から−30℃で保存した。
ら、固体の硫酸アンモニウム微粉末を30%飽和濃度に
なるまで徐々に添加した(15分間)。撹拌はさらに1
5分間継続した。混合物を次に遠心分離(2×250m
Lビーカー、27000g、30分間、0〜4℃)し
た。ペレットは廃棄した。再び硫酸アンモニウムを38
%飽和濃度になるまで添加し、混合物を前記のようにし
て遠心分離した。上清液は廃棄した。ペレットを2−メ
ルカプトエタノール(14mM)、ペファブロック
(0.1mM)およびグリセリン(10%)を添加した
トリス−塩酸/20mM/pH9緩衝液25mLに再懸
濁し、凍結し、一夜−20℃から−30℃で保存した。
【0099】硫酸アンモニウム(30〜38%)で分画
した蛋白質溶液を解凍し、沈殿した蛋白質を遠心分離
(1×50mLビーカー、40000g、30分間、0
〜4℃)した。上清液はセファデックスG−25(粗)
カラム(容積少なくとも200mL)でクロマトグラフ
し、溶出液のA(280nm)と電導度とを測定した。
カラム緩衝液=2−メルカプトエタノール(1.4m
M)、ペファブロック(0.02mM)およびグリセリ
ン(10%)を添加したトリス−塩酸/20mM/pH
9。溶出液中の全蛋白質を集め、さらに直接クロマトグ
ラフした。
した蛋白質溶液を解凍し、沈殿した蛋白質を遠心分離
(1×50mLビーカー、40000g、30分間、0
〜4℃)した。上清液はセファデックスG−25(粗)
カラム(容積少なくとも200mL)でクロマトグラフ
し、溶出液のA(280nm)と電導度とを測定した。
カラム緩衝液=2−メルカプトエタノール(1.4m
M)、ペファブロック(0.02mM)およびグリセリ
ン(10%)を添加したトリス−塩酸/20mM/pH
9。溶出液中の全蛋白質を集め、さらに直接クロマトグ
ラフした。
【0100】セファデックスG−25溶出液をSP−セ
ファロース(急速)上でクロマトグラフした。これには
2.6×12cm(60mL)の大きさのカラムを用い
た。A(280nm)と電導度とを連続的に記録した。
流速は5mL/分であった。カラム緩衝液=2−メルカ
プトエタノール(1.4mM)、ペファブロック(0.
02mM)およびグリセリン(10%)を添加したトリ
ス−塩酸/20mM/pH9。サンプル、続いてカラム
緩衝液100mLの注入後、カラム緩衝液中の直線状N
aCl勾配(dC/dV=1.7mM/mL、500m
Mまで)を適用した。溶出液を10mL分割に分け、凍
結した。抗原含有分画は150mM−と300mM−N
aClとの間の範囲にあった。SDS−PAディスク電
気泳動に続くクーマシー染色により検出した。
ファロース(急速)上でクロマトグラフした。これには
2.6×12cm(60mL)の大きさのカラムを用い
た。A(280nm)と電導度とを連続的に記録した。
流速は5mL/分であった。カラム緩衝液=2−メルカ
プトエタノール(1.4mM)、ペファブロック(0.
02mM)およびグリセリン(10%)を添加したトリ
ス−塩酸/20mM/pH9。サンプル、続いてカラム
緩衝液100mLの注入後、カラム緩衝液中の直線状N
aCl勾配(dC/dV=1.7mM/mL、500m
Mまで)を適用した。溶出液を10mL分割に分け、凍
結した。抗原含有分画は150mM−と300mM−N
aClとの間の範囲にあった。SDS−PAディスク電
気泳動に続くクーマシー染色により検出した。
【0101】無傷の抗原(33kDバンド)(クーマシ
ーゲル)の含有が証明された分画を解凍し、集め、グリ
セリンを添加し(20%)、限外濾過(撹拌セル、氷
浴、膜=オメガ30)で濃縮して最終容積を約5mLと
した。付着物は室から除き、次にクロマトグラフした。
ーゲル)の含有が証明された分画を解凍し、集め、グリ
セリンを添加し(20%)、限外濾過(撹拌セル、氷
浴、膜=オメガ30)で濃縮して最終容積を約5mLと
した。付着物は室から除き、次にクロマトグラフした。
【0102】濃縮したセファロースプールをスーパーデ
ックス75(製造級)上でクロマトグラフした。2.6
×60cm(300mL)の大きさのハイロードカラム
をここでは使用した。A(280nm)と電導度とを連
続的に記録した。流速は2mL/分とした。カラム緩衝
液=NaCl(0.5M)、グリセリン(20%)、2
−メルカプトエタノール(1.4mM)、EDTA(1
mM)、PMSF(0.1mM)およびペファブロック
(0.02mM)を添加した基本緩衝液。溶出液を5m
L分画に分けて凍結した。抗原含有分画は最初の吸収ピ
ーク(=最大ピーク)中にあった。SDS−PAディス
ク電気泳動に続くクーマシー染色で検出した。
ックス75(製造級)上でクロマトグラフした。2.6
×60cm(300mL)の大きさのハイロードカラム
をここでは使用した。A(280nm)と電導度とを連
続的に記録した。流速は2mL/分とした。カラム緩衝
液=NaCl(0.5M)、グリセリン(20%)、2
−メルカプトエタノール(1.4mM)、EDTA(1
mM)、PMSF(0.1mM)およびペファブロック
(0.02mM)を添加した基本緩衝液。溶出液を5m
L分画に分けて凍結した。抗原含有分画は最初の吸収ピ
ーク(=最大ピーク)中にあった。SDS−PAディス
ク電気泳動に続くクーマシー染色で検出した。
【0103】無傷で純粋の抗原を含むことが証明された
(クーマシーゲル)分画を解凍し、集め、限外濾過(撹
拌セル、氷浴、膜=オメガ30)して最終濃度少なくと
も2mg/mLまで濃縮した。付着物は室から除き、凍
結し、−60℃から−80℃で分割保存した。
(クーマシーゲル)分画を解凍し、集め、限外濾過(撹
拌セル、氷浴、膜=オメガ30)して最終濃度少なくと
も2mg/mLまで濃縮した。付着物は室から除き、凍
結し、−60℃から−80℃で分割保存した。
【0104】実施例15 組換え抗原のELISA評価 精製組み換え抗原UL57/1、UL57/3、および
52/3・UL57/3の100ngづつおよび抗原U
L57/2および52/3・57/3・150/7/2
の200ngづつを各々0.01M炭酸緩衝液pH9.
5の100μLづつに溶かし、溶液をマイクロタイター
板(Polycorb、Nunc)の穴に入れ、アース
した湿潤室内で16時間インキュベートした。子牛血清
を含む第2の被覆溶液100μLを添加後、インキュベ
ーションをさらに2時間継続した。プレートを次に空に
し、注意して取出した。プレートを次に実際の検査操作
に使用するか、または真空室で乾燥し、続いて管状フィ
ルムに封入した後、あとで使用するまで−20℃で保存
した。化学合成ペプチドの被覆は2μg/100μLで
前記のようにしてMaxisorb・ELISA板(N
unc)を用いて実施した。実際の検査操作のために
は、ELISA板の検査穴を1:21に希釈した血清1
00μLで満たし、プラスチックフィルムに密封し、水
浴に浮かべて40℃で1時間インキュベートした。バイ
オテストELISA洗浄液IIで3回洗浄後、ヒトIg
Mに対するペルオキシダーゼ標識モノクロナールマウス
抗体(Janssen)と40℃で30分間インキュベ
ーションした。改めて洗浄後に、結合した抗体をクロモ
ーゲンとしての1,2−フェニレンジアミンとの呈色反
応により可視化した。各サンプルの吸光度を495nm
(対照:620nm)でのアンソスHTII・ELIS
A測定器上で測定した。0.3またはそれ以上のOD値
全部を陽性の成績と評価した。
52/3・UL57/3の100ngづつおよび抗原U
L57/2および52/3・57/3・150/7/2
の200ngづつを各々0.01M炭酸緩衝液pH9.
5の100μLづつに溶かし、溶液をマイクロタイター
板(Polycorb、Nunc)の穴に入れ、アース
した湿潤室内で16時間インキュベートした。子牛血清
を含む第2の被覆溶液100μLを添加後、インキュベ
ーションをさらに2時間継続した。プレートを次に空に
し、注意して取出した。プレートを次に実際の検査操作
に使用するか、または真空室で乾燥し、続いて管状フィ
ルムに封入した後、あとで使用するまで−20℃で保存
した。化学合成ペプチドの被覆は2μg/100μLで
前記のようにしてMaxisorb・ELISA板(N
unc)を用いて実施した。実際の検査操作のために
は、ELISA板の検査穴を1:21に希釈した血清1
00μLで満たし、プラスチックフィルムに密封し、水
浴に浮かべて40℃で1時間インキュベートした。バイ
オテストELISA洗浄液IIで3回洗浄後、ヒトIg
Mに対するペルオキシダーゼ標識モノクロナールマウス
抗体(Janssen)と40℃で30分間インキュベ
ーションした。改めて洗浄後に、結合した抗体をクロモ
ーゲンとしての1,2−フェニレンジアミンとの呈色反
応により可視化した。各サンプルの吸光度を495nm
(対照:620nm)でのアンソスHTII・ELIS
A測定器上で測定した。0.3またはそれ以上のOD値
全部を陽性の成績と評価した。
【0105】このようにして得られた評価の結果を表3
〜5に示す。
〜5に示す。
【0106】
【0107】配列番号:1 配列の長さ:42 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 GATCCCCTCT AGAGACGCTC AGCGTCTTAC TGA
CGCTGCA GG 42
CGCTGCA GG 42
【0108】配列番号:2 配列の長さ:42 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 AATCTCTGCA GCGTCAGTAA GACGCTGAGC GTCTCTAGAG GG 42
【0109】配列番号:3 配列の長さ:72 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 GGTGGTGAAG TTCATGACCT TTCTGCTCTT TTCGCTCCGT CTGGTGTTGG TGCAGCTTCT 60 GGTGTTGGTG GG 72
【0110】配列番号:4 配列の長さ:80 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 AATCTCCACC AACACCAGAA GCTGCACCAA CACCAGACGG AGCGAAAAGA GCAGAAAGGT 60 CATGAACTTC ACCACCTGCA 80
【0111】配列番号:5 配列の長さ:61 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 TGGTGGTCTG CTTCTTGGTG AATCTGTTGC TGGTAACTCT ATCTGCTTCG GTGTCCCGGG 60 G 61
【0112】配列番号:6 配列の長さ:67 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 AATTCCCCGG GACACCGAAG CAGATAGAGT TACCAGCAAC AGATTCACCA AGAAGCAGAC 60 CACCACC 67
【0113】配列番号:7 配列の長さ:37 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 CCGGGTGAAA CTGGTGGTGG TTGCTTCCTT GTTAACG 37
【0114】配列番号:8 配列の長さ:37 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 AATCTGTTAA CAAGGAAGCA ACCACCACCA GTTTCAC 37
【0115】配列番号:9 配列の長さ:93 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 AACGCTGGTG AGGACGAAGC TGGTGGTGTT GGTGGTTCTT CTGGTGGTGG TGGTGGTTCT 60 GGTCTTCTTC CGGCTAAACG TTCTCGTCTT TAG 93
【0116】配列番号:10 配列の長さ:33 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 GGATCCGCAT GCATCACGAC CGCCTGCTGG ACT 33
【0117】配列番号:11 配列の長さ:29 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 GAATTCTTAG TTGTTGATAC CCGCATATT 29
【0118】配列番号:12 配列の長さ:35 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 GGATCCGCAT GCATAGCAAG GAGATCTATC AGT
TT 35
TT 35
【0119】配列番号:13 配列の長さ:27 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 GAATTCTTAC AACCGGCTGC GTTTGGC
27
27
【0120】配列番号:14 配列の長さ:32 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 GGATCCGCAT GCATGCGGGT ATCAACAACA GC 32
【0121】配列番号:15 配列の長さ:26 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 GAATTCGCTG GCGGTTACAA CCGGCT 26
【0122】配列番号:16 配列の長さ:34 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 GGATCCGCAT GCATGGGGTT CCGGGCGGCG GTGC 34
【0123】配列番号:17 配列の長さ:31 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 GAATTCTCTA GAATTGAGCC GATAGGTACG G 31
【0124】配列番号:18 配列の長さ:34 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 GGATCCAATC TAGAGACGCC CAGCGATTAA CGGA 34
【0125】配列番号:19 配列の長さ:27 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 GAATTCTATT CCTCCGTGTT CTTAATC 27
【0126】配列番号:20 配列の長さ:26 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 CGGATCCTGA AGAGCACGAC GGGCAT 26
【0127】配列番号:21 配列の長さ:35 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 GGATCCGCAT GCGTGGCAGC CTCTCTTCGC TGGCC 35
【0128】配列番号:22 配列の長さ:30 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノム−DNA 配列 GAATTCAGAT CTTGCCGCAC TTTTGCTTCT 30
【0129】配列番号:23 配列の長さ:607 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:タンパク フラグメント型:内部 配列 Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Ala Thr Gly Cys Gly Thr Gly Gly 1 5 10 15 Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Thr Thr Cys Gly Cys Thr Gly 20 25 30 Gly Cys Cys Ala Ala Thr Gly Cys Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Cys 35 40 45 Thr Gly Cys Ala Thr Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys Cys 50 55 60 Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Ala Ala Cys Gly Ala Thr 65 70 75 80 Cys Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala 85 90 95 Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Cys Thr 100 105 110 Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys 115 120 125 Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys 130 135 140 Ala Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly 145 150 155 160 Cys Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Gly 165 170 175 Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly Thr Ala Gly Cys Gly 180 185 190 Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Ala 195 200 205 Thr Cys Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Gly Gly Thr Cys Thr Thr 210 215 220 Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Thr 225 230 235 240 Ala Cys Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Ala Thr 245 250 255 Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Ala Cys Cys Thr Gly Ala Cys Gly 260 265 270 Thr Cys Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Gly Gly 275 280 285 Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly 290 295 300 Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Thr Gly 305 310 315 320 Gly Ala Thr Cys Gly Cys Ala Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala 325 330 335 Ala Thr Thr Ala Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys Gly Ala Cys Gly Cys 340 345 350 Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys Gly Ala Cys 355 360 365 Ala Gly Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Thr Ala Ala 370 375 380 Cys Gly Thr Thr Cys Gly Ala Gly Thr Thr Cys Gly Thr Cys Cys Cys 385 390 395 400 Thr Ala Ala Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys Ala Ala 405 410 415 Ala Ala Gly Thr Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Ala Thr Cys Cys 420 425 430 Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly 435 440 445 Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr 450 455 460 Thr Thr Cys Gly Ala Cys Cys Thr Ala Thr Cys Gly Thr Cys Gly Cys 465 470 475 480 Cys Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Thr Ala Cys 485 490 495 Gly Gly Gly Gly Cys Cys Gly Cys Ala Ala Cys Cys Gly Gly Gly Thr 500 505 510 Thr Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Cys Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly 515 520 525 Gly Cys Gly Cys Cys Ala Ala Ala Ala Cys Gly Cys Cys Gly Thr Cys 530 535 540 Gly Gly Ala Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Cys 545 550 555 560 Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Thr Cys Gly 565 570 575 Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys 580 585 590 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Ala Thr Thr Cys 595 600 605
【0130】配列番号:24 配列の長さ:607 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:タンパク フラグメント型:内部 配列 Cys Cys Thr Ala Gly Gly Cys Gly Thr
Ala Cys Gly Cys Ala Cys Cys 1 5
10 15 Gly Thr Cys Gly Gly Ala Gly Ala Gly
Ala Ala Gly Cys Gly Ala Cys 20 25
30 Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Gly Gly
Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly 35 40
45 Ala Cys Gly Thr Ala Cys Thr Gly Cys
Thr Gly Cys Cys Gly Gly Gly 50 55
60 Cys Cys Cys Ala Gly Ala Cys Cys Thr
Ala Thr Thr Gly Cys Thr Ala 65 70
75 80 Gly Ala Gly Thr Ala Cys Thr Thr Gly
Cys Thr Cys Gly Gly Gly Thr 85
90 95 Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys
Cys Gly Cys Cys Ala Gly Ala 100 105
110 Cys Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys
Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly 115 120
125 Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly
Thr Thr Cys Thr Thr Cys Gly 130 135
140 Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys
Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys 145 150
155 160 Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly
Gly Cys Cys Ala Thr Gly Cys 165
170 175 Gly Cys Cys Thr Thr Thr Thr Ala Cys
Thr Cys Ala Thr Cys Gly Cys 180 185
190 Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys
Cys Gly Cys Cys Ala Cys Thr 195 200
205 Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly Gly Thr
Gly Cys Cys Ala Gly Ala Ala 210 215
220 Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr Thr Cys
Cys Thr Thr Thr Thr Thr Ala 225 230
235 240 Thr Gly Cys Thr Cys Gly Thr Cys Gly
Thr Gly Thr Thr Cys Thr Ala 245
250 255 Gly Thr Gly Gly Thr Cys Gly Ala Thr
Gly Gly Ala Cys Thr Gly Cys 260 265
270 Ala Gly Gly Thr Thr Thr Cys Cys Ala
Cys Cys Thr Ala Gly Cys Cys 275 280
285 Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys
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605
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605
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【0132】配列番号:26 配列の長さ:831 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:タンパク フラグメント型:内部 配列 Ala Thr Gly Gly Cys Thr Ala Gly Cys Ala Thr Gly Ala Cys Thr Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Gly Gly 20 25 30 Thr Cys Gly Cys Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Ala Thr Gly 35 40 45 Cys Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Thr Thr 50 55 60 Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Ala Thr Gly Cys Cys Gly Gly 65 70 75 80 Cys Gly Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr Gly Ala Cys Gly Ala Cys 85 90 95 Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Ala 100 105 110 Ala Cys Gly Ala Thr Cys Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Cys Gly Ala 115 120 125 Gly Cys Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr Cys Gly Gly Cys 130 135 140 Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly 145 150 155 160 Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala 165 170 175 Gly Ala Ala Gly Cys Ala Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys Gly Gly Thr 180 185 190 Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly 195 200 205 Gly Thr Ala Cys Gly Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly 210 215 220 Thr Ala Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys 225 230 235 240 Gly Gly Thr Gly Ala Thr Cys Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Gly 245 250 255 Gly Thr Cys Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Thr Ala Cys Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Cys 275 280 285 Ala Ala Gly Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Ala Cys Cys 290 295 300 Thr Gly Ala Cys Gly Thr Cys Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly 305 310 315 320 Ala Thr Cys Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala 325 330 335 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly 340 345 350 Gly Thr Thr Thr Gly Gly Ala Thr Cys Gly Cys Ala Ala Cys Thr Cys 355 360 365 Cys Gly Gly Cys Ala Ala Thr Thr Ala Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys 370 375 380 Gly Ala Cys Gly Cys Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala 385 390 395 400 Gly Cys Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr Thr Cys 405 410 415 Thr Gly Thr Ala Ala Cys Gly Thr Thr Cys Gly Ala Gly Thr Thr Cys 420 425 430 Gly Thr Cys Cys Cys Thr Ala Ala Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala 435 440 445 Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala 450 455 460 Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Ala Thr Gly Cys Ala Thr Gly Gly Gly 465 470 475 480 Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly 485 490 495 Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly 500 505 510 Ala Cys Gly Ala Gly Ala Cys Gly Thr Gly Ala Gly Cys Gly Gly Gly 515 520 525 Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Thr Cys 530 535 540 Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr Cys Gly Thr Gly Gly 545 550 555 560 Thr Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Gly 565 570 575 Gly Ala Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Thr Gly Ala 580 585 590 Thr Gly Gly Gly Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Cys Gly 595 600 605 Cys Ala Thr Gly Thr Thr Gly Gly Gly Cys Gly Cys Thr Ala Gly Cys 610 615 620 Gly Thr Gly Gly Ala Cys Cys Gly Thr Ala Cys Cys Thr Ala Thr Cys 625 630 635 640 Gly Gly Cys Thr Cys Ala Ala Thr Thr Cys Thr Ala Gly Ala Ala Ala 645 650 655 Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Cys Gly 660 665 670 Ala Cys Gly Gly Gly Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Cys Gly Gly 675 680 685 Thr Gly Gly Cys Thr Thr Thr Cys Gly Ala Cys Cys Thr Ala Thr Cys 690 695 700 Gly Thr Cys Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys 705 710 715 720 Gly Gly Thr Ala Cys Gly Gly Gly Gly Cys Cys Gly Cys Ala Ala Cys 725 730 735 Cys Gly Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Cys Ala Thr 740 745 750 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Cys Cys Ala Ala Ala Ala Cys Gly 755 760 765 Cys Cys Gly Thr Cys Gly Gly Ala Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Cys 770 775 780 Ala Gly Ala Ala Cys Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Ala 785 790 795 800 Gly Ala Thr Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ala Gly 805 810 815 Ala Ala Cys Ala Cys Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly 820 825 830
【0133】配列番号:27 配列の長さ:831 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:タンパク フラグメント型:内部 配列 Thr Ala Cys Cys Gly Ala Thr Cys Gly
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Ala Gly Ala Gly Cys Cys Gly 130 135
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Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys 145 150
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Cys Gly Cys Cys Gly Thr Thr 165
170 175 Cys Thr Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr
Gly Gly Cys Gly Cys Cys Ala 180 185
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Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys 195 200
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Thr Thr Thr Ala Cys Thr Cys 210 215
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Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys 245
250 255 Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ala
Gly Gly Thr Thr Cys Cys Thr 260 265
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Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr 325
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Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys 340 345
350 Cys Ala Ala Ala Cys Cys Thr Ala Gly
Cys Gly Thr Thr Gly Ala Gly 355 360
365 Gly Cys Cys Gly Thr Thr Ala Ala Thr
Gly Ala Ala Gly Thr Thr Gly 370 375
380 Cys Thr Gly Cys Gly Cys Thr Thr Thr
Cys Thr Cys Cys Thr Cys Thr 385 390
395 400 Cys Gly Cys Thr Gly Thr Cys Gly Cys
Thr Cys Cys Thr Ala Ala Gly 405
410 415 Ala Cys Ala Thr Thr Gly Cys Ala Ala
Gly Cys Thr Cys Ala Ala Gly 420 425
430 Cys Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr Gly
Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr 435 440
445 Thr Cys Gly Thr Thr Thr Thr Cys Ala
Cys Gly Cys Cys Gly Thr Thr 450 455
460 Cys Thr Ala Gly Gly Cys Gly Thr Ala
Cys Gly Thr Ala Cys Cys Cys 465 470
475 480 Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Cys Gly
Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys 485
490 495 Gly Ala Cys Cys Gly Cys Cys Cys Cys
Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys 500 505
510 Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala
Cys Thr Cys Gly Cys Cys Cys 515 520
525 Cys Cys Gly Gly Gly Cys Thr Cys Gly
Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly 530 535
540 Ala Cys Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys
Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys 545 550
555 560 Ala Cys Cys Ala Cys Cys Cys Cys Cys
Ala Cys Cys Ala Cys Cys Cys 565
570 575 Cys Thr Ala Ala Gly Gly Cys Cys Cys
Cys Cys Thr Thr Ala Cys Thr 580 585
590 Ala Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Cys
Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys 595 600
605 Gly Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Cys
Gly Cys Gly Ala Thr Cys Gly 610 615
620 Cys Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala
Thr Gly Gly Ala Thr Ala Gly 625 630
635 640 Cys Cys Gly Ala Gly Thr Thr Ala Ala
Gly Ala Thr Cys Thr Thr Thr 645
650 655 Cys Thr Ala Gly Gly Ala Cys Thr Thr
Cys Thr Cys Gly Thr Gly Cys 660 665
670 Thr Gly Cys Cys Cys Gly Thr Ala Cys
Thr Thr Thr Thr Gly Cys Cys 675 680
685 Ala Cys Cys Gly Ala Ala Ala Gly Cys
Thr Gly Gly Ala Thr Ala Gly 690 695
700 Cys Ala Gly Cys Gly Gly Gly Gly Thr
Cys Thr Thr Cys Thr Cys Gly 705 710
715 720 Cys Cys Ala Thr Gly Cys Cys Cys Cys
Gly Gly Cys Gly Thr Thr Gly 725
730 735 Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys
Gly Gly Cys Cys Gly Thr Ala 740 745
750 Cys Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly
Gly Thr Thr Thr Thr Gly Cys 755 760
765 Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly
Cys Gly Gly Cys Ala Cys Gly 770 775
780 Thr Cys Thr Thr Gly Thr Ala Gly Gly
Ala Gly Gly Thr Thr Thr Thr 785 790
795 800 Cys Thr Ala Gly Cys Thr Cys Thr Thr
Cys Thr Ala Ala Thr Thr Cys 805
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Cys Thr Thr Ala Thr Cys 820 825
830
【0134】配列番号:28 配列の長さ:276 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:タンパク フラグメント型:内部 配列 Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln
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220 Thr Gly Met Lys Thr Val Ala Phe Asp
Leu Ser Ser Pro Gln Lys Ser 225 230
235 240 Gly Thr Gly Pro Gln Pro Gly Ser Ala
Gly Met Gly Gly Ala Lys Thr 245
250 255 Pro Ser Asp Ala Val Gln Asn Ile Leu
Gln Lys Ile Glu Lys Ile Lys 260 265
270 Asn Thr Glu Glu 275
Met Gly Arg Arg Ile Arg Met 1 5
10 15 Arg Gly Ser Leu Ser Ser Leu Ala Asn
Ala Gly Gly Leu His Asp Asp 20 25
30 Gly Pro Gly Leu Asp Asn Asp Leu Met
Asn Glu Pro Met Gly Leu Gly 35 40
45 Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
Gly Lys Lys His Asp Arg Gly 50 55
60 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Arg Lys
Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly 65 70
75 80 Gly Asp His Asp His Gly Leu Ser Ser
Lys Glu Lys Tyr Glu Gln His 85
90 95 Lys Ile Thr Ser Tyr Leu Thr Ser Lys
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 100 105
110 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asp Arg
Asn Ser Gly Asn Tyr Phe Asn 115 120
125 Asp Ala Lys Glu Glu Ser Asp Ser Glu
Asp Ser Val Thr Phe Glu Phe 130 135
140 Val Pro Asn Thr Lys Lys Gln Lys Cys
Gly Lys Ile Arg Met His Gly 145 150
155 160 Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly
Gly Gly Arg Asp Val Ser Gly 165
170 175 Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly
Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly 180 185
190 Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly
Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser 195 200
205 Val Asp Arg Thr Tyr Arg Leu Asn Ser
Arg Lys Ile Leu Lys Ser Thr 210 215
220 Thr Gly Met Lys Thr Val Ala Phe Asp
Leu Ser Ser Pro Gln Lys Ser 225 230
235 240 Gly Thr Gly Pro Gln Pro Gly Ser Ala
Gly Met Gly Gly Ala Lys Thr 245
250 255 Pro Ser Asp Ala Val Gln Asn Ile Leu
Gln Lys Ile Glu Lys Ile Lys 260 265
270 Asn Thr Glu Glu 275
【0135】配列番号:29 配列の長さ:651 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:タンパク フラグメント型:内部 配列 Ala Thr Gly Gly Cys Thr Ala Gly Cys Ala Thr Gly Ala Cys Thr Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Gly Gly 20 25 30 Thr Cys Gly Cys Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Ala Thr Gly 35 40 45 Cys Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Thr Thr 50 55 60 Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Ala Thr Gly Cys Cys Gly Gly 65 70 75 80 Cys Gly Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr Gly Ala Cys Gly Ala Cys 85 90 95 Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Ala 100 105 110 Ala Cys Gly Ala Thr Cys Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Cys Gly Ala 115 120 125 Gly Cys Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr Cys Gly Gly Cys 130 135 140 Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly 145 150 155 160 Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala 165 170 175 Gly Ala Ala Gly Cys Ala Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys Gly Gly Thr 180 185 190 Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly 195 200 205 Gly Thr Ala Cys Gly Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly 210 215 220 Thr Ala Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys 225 230 235 240 Gly Gly Thr Gly Ala Thr Cys Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Gly 245 250 255 Gly Thr Cys Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Thr Ala Cys Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Cys 275 280 285 Ala Ala Gly Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Ala Cys Cys 290 295 300 Thr Gly Ala Cys Gly Thr Cys Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly 305 310 315 320 Ala Thr Cys Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala 325 330 335 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly 340 345 350 Gly Thr Thr Thr Gly Gly Ala Thr Cys Gly Cys Ala Ala Cys Thr Cys 355 360 365 Cys Gly Gly Cys Ala Ala Thr Thr Ala Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys 370 375 380 Gly Ala Cys Gly Cys Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala 385 390 395 400 Gly Cys Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr Thr Cys 405 410 415 Thr Gly Thr Ala Ala Cys Gly Thr Thr Cys Gly Ala Gly Thr Thr Cys 420 425 430 Gly Thr Cys Cys Cys Thr Ala Ala Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala 435 440 445 Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala 450 455 460 Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Ala Thr Gly Cys Ala Thr Gly Gly Gly 465 470 475 480 Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly 485 490 495 Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly 500 505 510 Ala Cys Gly Ala Gly Ala Cys Gly Thr Gly Ala Gly Cys Gly Gly Gly 515 520 525 Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Thr Cys 530 535 540 Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr Cys Gly Thr Gly Gly 545 550 555 560 Thr Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Gly 565 570 575 Gly Ala Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Thr Gly Ala 580 585 590 Thr Gly Gly Gly Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Cys Gly 595 600 605 Cys Ala Thr Gly Thr Thr Gly Gly Gly Cys Gly Cys Thr Ala Gly Cys 610 615 620 Gly Thr Gly Gly Ala Cys Cys Gly Thr Ala Cys Cys Thr Ala Thr Cys 625 630 635 640 Gly Gly Cys Thr Cys Ala Ala Thr Thr Ala Gly 645 650
【0136】配列番号:30 配列の長さ:831 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:タンパク フラグメント型:内部 配列 Thr Ala Cys Cys Gly Ala Thr Cys Gly Thr Ala Cys Thr Gly Ala Cys 1 5 10 15 Cys Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Gly Thr Thr Thr Ala Cys Cys Cys 20 25 30 Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Ala Gly Gly Cys Gly Thr Ala Cys 35 40 45 Gly Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala 50 55 60 Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Gly Gly Cys Cys 65 70 75 80 Gly Cys Cys Ala Gly Ala Cys Gly Thr Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly 85 90 95 Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Thr 100 105 110 Thr Gly Cys Thr Ala Gly Ala Gly Thr Ala Cys Thr Thr Gly Cys Thr 115 120 125 Cys Gly Gly Gly Thr Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Gly 130 135 140 Cys Cys Ala Gly Ala Cys Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys 145 150 155 160 Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly Thr Thr 165 170 175 Cys Thr Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Ala 180 185 190 Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys 195 200 205 Cys Ala Thr Gly Cys Gly Cys Cys Thr Thr Thr Thr Ala Cys Thr Cys 210 215 220 Ala Thr Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly 225 230 235 240 Cys Cys Ala Cys Thr Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys 245 250 255 Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr Thr Cys Cys Thr 260 265 270 Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly Cys Thr Cys Gly Thr Cys Gly Thr Gly 275 280 285 Thr Thr Cys Thr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Cys Gly Ala Thr Gly Gly 290 295 300 Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Thr Thr Thr Cys Cys Ala Cys Cys 305 310 315 320 Thr Ala Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr 325 330 335 Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys 340 345 350 Cys Ala Ala Ala Cys Cys Thr Ala Gly Cys Gly Thr Thr Gly Ala Gly 355 360 365 Gly Cys Cys Gly Thr Thr Ala Ala Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr Gly 370 375 380 Cys Thr Gly Cys Gly Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Thr 385 390 395 400 Cys Gly Cys Thr Gly Thr Cys Gly Cys Thr Cys Cys Thr Ala Ala Gly 405 410 415 Ala Cys Ala Thr Thr Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr Cys Ala Ala Gly 420 425 430 Cys Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr Gly Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr 435 440 445 Thr Cys Gly Thr Thr Thr Thr Cys Ala Cys Gly Cys Cys Gly Thr Thr 450 455 460 Cys Thr Ala Gly Gly Cys Gly Thr Ala Cys Gly Thr Ala Cys Cys Cys 465 470 475 480 Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys 485 490 495 Gly Ala Cys Cys Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys 500 505 510 Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala Cys Thr Cys Gly Cys Cys Cys 515 520 525 Cys Cys Gly Gly Gly Cys Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly 530 535 540 Ala Cys Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys 545 550 555 560 Ala Cys Cys Ala Cys Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Cys 565 570 575 Cys Thr Ala Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Thr Thr Ala Cys Thr 580 585 590 Ala Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys 595 600 605 Gly Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Thr Cys Gly 610 615 620 Cys Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala Thr Gly Gly Ala Thr Ala Gly 625 630 635 640 Cys Cys Gly Ala Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Thr Cys Thr Thr Thr 645 650 655 Cys Thr Ala Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys Thr Cys Gly Thr Gly Cys 660 665 670 Thr Gly Cys Cys Cys Gly Thr Ala Cys Thr Thr Thr Thr Gly Cys Cys 675 680 685 Ala Cys Cys Gly Ala Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Ala Gly 690 695 700 Cys Ala Gly Cys Gly Gly Gly Gly Thr Cys Thr Thr Cys Thr Cys Gly 705 710 715 720 Cys Cys Ala Thr Gly Cys Cys Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Thr Gly 725 730 735 Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys Gly Thr Ala 740 745 750 Cys Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Gly Thr Thr Thr Thr Gly Cys 755 760 765 Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Gly 770 775 780 Thr Cys Thr Thr Gly Thr Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr Thr Thr Thr 785 790 795 800 Cys Thr Ala Gly Cys Thr Cys Thr Thr Cys Thr Ala Ala Thr Thr Cys 805 810 815 Thr Thr Gly Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys Thr Thr Ala Thr Cys 820 825 830
【0137】配列番号:31 配列の長さ:216 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:タンパク フラグメント型:内部 配列 Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Arg Ile Arg Met 1 5 10 15 Arg Gly Ser Leu Ser Ser Leu Ala Asn Ala Gly Gly Leu His Asp Asp 20 25 30 Gly Pro Gly Leu Asp Asn Asp Leu Met Asn Glu Pro Met Gly Leu Gly 35 40 45 Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys His Asp Arg Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Arg Lys Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Asp His Asp His Gly Leu Ser Ser Lys Glu Lys Tyr Glu Gln His 85 90 95 Lys Ile Thr Ser Tyr Leu Thr Ser Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asp Arg Asn Ser Gly Asn Tyr Phe Asn 115 120 125 Asp Ala Lys Glu Glu Ser Asp Ser Glu Asp Ser Val Thr Phe Glu Phe 130 135 140 Val Pro Asn Thr Lys Lys Gln Lys Cys Gly Lys Ile Arg Met His Gly 145 150 155 160 Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg Asp Val Ser Gly 165 170 175 Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly 180 185 190 Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser 195 200 205 Val Asp Arg Thr Tyr Arg Leu Asn 210 215
【0138】配列番号:32 配列の長さ:171 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:タンパク フラグメント型:内部 配列 Gly Gly Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly 20 25 30 Thr Gly Gly Ala Cys Gly Ala Gly Ala Cys Gly Thr Gly Ala Gly Cys 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Gly Ala Cys Gly 50 55 60 Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr Cys Gly 65 70 75 80 Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr 85 90 95 Gly Gly Gly Gly Ala Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala 100 105 110 Thr Gly Ala Thr Gly Gly Gly Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly 115 120 125 Thr Cys Gly Cys Ala Thr Gly Thr Thr Gly Gly Gly Cys Gly Cys Thr 130 135 140 Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Cys Gly Thr Ala Cys Cys Thr 145 150 155 160 Ala Thr Cys Gly Gly Cys Thr Cys Ala Ala Thr 165 170
【0139】配列番号:33 配列の長さ:171 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:タンパク フラグメント型:内部 配列 Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys
Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys 1 5
10 15 Cys Ala Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys
Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys 20 25
30 Ala Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr
Gly Cys Ala Cys Thr Cys Gly 35 40
45 Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys
Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys 50 55
60 Cys Ala Gly Ala Cys Cys Cys Ala Cys
Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys 65 70
75 80 Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys
Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala 85
90 95 Cys Cys Cys Cys Thr Ala Ala Gly Gly
Cys Cys Cys Cys Cys Thr Thr 100 105
110 Ala Cys Thr Ala Cys Cys Cys Cys Gly
Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys 115 120
125 Ala Gly Cys Gly Thr Ala Cys Ala Ala
Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala 130 135
140 Thr Cys Gly Cys Ala Cys Cys Thr Gly
Gly Cys Ala Thr Gly Gly Ala 145 150
155 160 Thr Ala Gly Cys Cys Gly Ala Gly Thr
Thr Ala 165
170
Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys 1 5
10 15 Cys Ala Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys
Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys 20 25
30 Ala Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr
Gly Cys Ala Cys Thr Cys Gly 35 40
45 Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys
Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys 50 55
60 Cys Ala Gly Ala Cys Cys Cys Ala Cys
Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys 65 70
75 80 Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys
Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala 85
90 95 Cys Cys Cys Cys Thr Ala Ala Gly Gly
Cys Cys Cys Cys Cys Thr Thr 100 105
110 Ala Cys Thr Ala Cys Cys Cys Cys Gly
Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys 115 120
125 Ala Gly Cys Gly Thr Ala Cys Ala Ala
Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala 130 135
140 Thr Cys Gly Cys Ala Cys Cys Thr Gly
Gly Cys Ala Thr Gly Gly Ala 145 150
155 160 Thr Ala Gly Cys Cys Gly Ala Gly Thr
Thr Ala 165
170
【0140】配列番号:34 配列の長さ:57 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:タンパク フラグメント型:内部 配列 Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly
Gly Gly Gly Arg Asp Val Ser 1 5
10 15 Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly
Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly 20 25
30 Gly Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg
Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala 35 40
45 Ser Val Asp Arg Thr Tyr Arg Leu Asn 50 55
Gly Gly Gly Arg Asp Val Ser 1 5
10 15 Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly
Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly 20 25
30 Gly Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg
Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala 35 40
45 Ser Val Asp Arg Thr Tyr Arg Leu Asn 50 55
【図1】 52/3|105/7/2と命名したオート
ロガス融合蛋白質をクローニングするために用いたポリ
メラーゼ鎖反応のためのプライマーを示す。
ロガス融合蛋白質をクローニングするために用いたポリ
メラーゼ鎖反応のためのプライマーを示す。
【図2】 実施例1に記載した構造の全DNA配列およ
びそれから得られた対応する融合蛋白質のアミノ酸配列
を示す。
びそれから得られた対応する融合蛋白質のアミノ酸配列
を示す。
【図3】 実施例1に記載した構造の全DNA配列およ
びそれから得られた対応する融合蛋白質のアミノ酸配列
を示す。
びそれから得られた対応する融合蛋白質のアミノ酸配列
を示す。
【図4】 実施例1に記載した構造の全DNA配列およ
びそれから得られた対応する融合蛋白質のアミノ酸配列
を示す。
びそれから得られた対応する融合蛋白質のアミノ酸配列
を示す。
【図5】 SDSポリアクリルアミドゲルの電気泳動の
写真であり、組換え融合蛋白質52/3|105/7/
2の発現および精製を示す。
写真であり、組換え融合蛋白質52/3|105/7/
2の発現および精製を示す。
【図6】 患者二人(上図および下図)のIgM経過を
示し、一例ではpp150のC端断片(アミノ酸862
〜1048)、他例ではp52のC端断片(アミノ酸2
97〜433)をIgM・ELISAで用いた。さらに
本発明による融合蛋白52/3|105/7/2を用い
た。AGと記す陰付棒グラフは他の方法で見出された抗
原血の値を示す。急性感染症はこの時点で観察される。
図4は、この発明による融合蛋白質を用いれば、例えば
断片52/3単独では不可能な、はっきりとしないIg
Mが検出できることを明らかに示す。
示し、一例ではpp150のC端断片(アミノ酸862
〜1048)、他例ではp52のC端断片(アミノ酸2
97〜433)をIgM・ELISAで用いた。さらに
本発明による融合蛋白52/3|105/7/2を用い
た。AGと記す陰付棒グラフは他の方法で見出された抗
原血の値を示す。急性感染症はこの時点で観察される。
図4は、この発明による融合蛋白質を用いれば、例えば
断片52/3単独では不可能な、はっきりとしないIg
Mが検出できることを明らかに示す。
【図7】 種々の組換え抗原のIgM反応性を、一方で
は血清学的陰性の健康な血液提供者の血清と、他方では
血清学的陽性の健康な血液提供者の血清とを比較した表
1を示す。テグメント蛋白質pp150(アミノ酸86
2〜1048=150/7)に由来する断片部分は高い
IgM反応性を持つが、これは明らかに病気とは無関係
である。この発明に従う融合蛋白質(52/3|105
/7/2)を用いる時には、IgM陽性血清はかなり減
少する。
は血清学的陰性の健康な血液提供者の血清と、他方では
血清学的陽性の健康な血液提供者の血清とを比較した表
1を示す。テグメント蛋白質pp150(アミノ酸86
2〜1048=150/7)に由来する断片部分は高い
IgM反応性を持つが、これは明らかに病気とは無関係
である。この発明に従う融合蛋白質(52/3|105
/7/2)を用いる時には、IgM陽性血清はかなり減
少する。
【図8】 表2における、急性HCMV感染症に罹患し
た種々の免疫応答性患者の血清でのIgM・ELISA
におけるOD値を示す。組換え抗原p52/3と比べ
て、この発明の融合蛋白質は明瞭に改善された感度を示
す。
た種々の免疫応答性患者の血清でのIgM・ELISA
におけるOD値を示す。組換え抗原p52/3と比べ
て、この発明の融合蛋白質は明瞭に改善された感度を示
す。
【図9】 種々の断片をクローニングするために用いた
ポリメラーゼ鎖反応(PCR)のためのプライマーおよ
びオリゴヌクレオチドを示す。
ポリメラーゼ鎖反応(PCR)のためのプライマーおよ
びオリゴヌクレオチドを示す。
【図10】 種々の断片をクローニングするために用い
たポリメラーゼ鎖反応(PCR)のためのプライマーお
よびオリゴヌクレオチドを示す。
たポリメラーゼ鎖反応(PCR)のためのプライマーお
よびオリゴヌクレオチドを示す。
【図11】 UL57/3と命名された読み枠UL57
からのこの発明のDNA配列および得られるペプチドの
アミノ酸配列を示す。
からのこの発明のDNA配列および得られるペプチドの
アミノ酸配列を示す。
【図12】 52/3・57/3と略称されたオートロ
ガス融合蛋白質のDNAおよび得られるアミノ酸配列を
示す。この融合蛋白質の別の部分はヒトサイトメガロウ
イルスの抗原性蛋白質p52に由来する。
ガス融合蛋白質のDNAおよび得られるアミノ酸配列を
示す。この融合蛋白質の別の部分はヒトサイトメガロウ
イルスの抗原性蛋白質p52に由来する。
【図13】 52/3・57/3と略称されたオートロ
ガス融合蛋白質のDNAおよび得られるアミノ酸配列を
示す。この融合蛋白質の別の部分はヒトサイトメガロウ
イルスの抗原性蛋白質p52に由来する。
ガス融合蛋白質のDNAおよび得られるアミノ酸配列を
示す。この融合蛋白質の別の部分はヒトサイトメガロウ
イルスの抗原性蛋白質p52に由来する。
【図14】 52/3・57/3と略称されたオートロ
ガス融合蛋白質のDNAおよび得られるアミノ酸配列を
示す。この融合蛋白質の別の部分はヒトサイトメガロウ
イルスの抗原性蛋白質p52に由来する。
ガス融合蛋白質のDNAおよび得られるアミノ酸配列を
示す。この融合蛋白質の別の部分はヒトサイトメガロウ
イルスの抗原性蛋白質p52に由来する。
【図15】 オートロガス融合蛋白質52/3・57/
3・150/7/2のDNAおよび得られるアミノ酸配
列を示す。この発明に従うペプチドの配列に加え、この
融合蛋白質は各々の場合に抗原性蛋白質p52およびテ
グメント蛋白質pp150の一部を含む。
3・150/7/2のDNAおよび得られるアミノ酸配
列を示す。この発明に従うペプチドの配列に加え、この
融合蛋白質は各々の場合に抗原性蛋白質p52およびテ
グメント蛋白質pp150の一部を含む。
【図16】 オートロガス融合蛋白質52/3・57/
3・150/7/2のDNAおよび得られるアミノ酸配
列を示す。この発明に従うペプチドの配列に加え、この
融合蛋白質は各々の場合に抗原性蛋白質p52およびテ
グメント蛋白質pp150の一部を含む。
3・150/7/2のDNAおよび得られるアミノ酸配
列を示す。この発明に従うペプチドの配列に加え、この
融合蛋白質は各々の場合に抗原性蛋白質p52およびテ
グメント蛋白質pp150の一部を含む。
【図17】 オートロガス融合蛋白質52/3・57/
3・150/7/2のDNAおよび得られるアミノ酸配
列を示す。この発明に従うペプチドの配列に加え、この
融合蛋白質は各々の場合に抗原性蛋白質p52およびテ
グメント蛋白質pp150の一部を含む。
3・150/7/2のDNAおよび得られるアミノ酸配
列を示す。この発明に従うペプチドの配列に加え、この
融合蛋白質は各々の場合に抗原性蛋白質p52およびテ
グメント蛋白質pp150の一部を含む。
【図18】 オートロガス融合蛋白質52/3・57/
3・150/7/2のDNAおよび得られるアミノ酸配
列を示す。この発明に従うペプチドの配列に加え、この
融合蛋白質は各々の場合に抗原性蛋白質p52およびテ
グメント蛋白質pp150の一部を含む。
3・150/7/2のDNAおよび得られるアミノ酸配
列を示す。この発明に従うペプチドの配列に加え、この
融合蛋白質は各々の場合に抗原性蛋白質p52およびテ
グメント蛋白質pp150の一部を含む。
【図19】 表3における急性HCMV感染症を持つ免
疫応答性個体の種々の血清とのIgM反応性を示す。患
者の血清は機能している免疫系および急性HCMV感染
症を持つ患者のものである。
疫応答性個体の種々の血清とのIgM反応性を示す。患
者の血清は機能している免疫系および急性HCMV感染
症を持つ患者のものである。
【図20】 表4における急性HCMV原発性感染症を
持つ移植患者の血清とのIgM反応性を示す。移植患者
では通常、移植に関連して免疫抑制剤を定期的に投与す
るので完全に機能している免疫系は持っていない。
持つ移植患者の血清とのIgM反応性を示す。移植患者
では通常、移植に関連して免疫抑制剤を定期的に投与す
るので完全に機能している免疫系は持っていない。
【図21】 表5において、一方ではCMV血清学的陽
性、および他方ではCMV血清学的陰性に分類された健
康な血液提供者の血清と組換え抗原のIgM反応性を示
す。血清学的陽性と陰性との区別はIgG抗体の測定に
よって行った。この発明に従うペプチドおよび融合蛋白
質によると、実際上誤陽性の結果が得られない点が優れ
ている。
性、および他方ではCMV血清学的陰性に分類された健
康な血液提供者の血清と組換え抗原のIgM反応性を示
す。血清学的陽性と陰性との区別はIgG抗体の測定に
よって行った。この発明に従うペプチドおよび融合蛋白
質によると、実際上誤陽性の結果が得られない点が優れ
ている。
【図22】 表6において、この発明に従う抗原の概略
的特性を示す。ここに略号GSTは融合蛋白質の他の成
分がグルタチオン・Sトランスフェラーゼから由来する
ことを示す。略号Pは化学的に合成されたペプチドであ
ることを意味する。
的特性を示す。ここに略号GSTは融合蛋白質の他の成
分がグルタチオン・Sトランスフェラーゼから由来する
ことを示す。略号Pは化学的に合成されたペプチドであ
ることを意味する。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成7年10月23日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0107
【補正方法】変更
【補正内容】
【0107】配列番号:1 配列の長さ:57 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:タンパク質 フラグメント型:中間部 配列 Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly
Gly Gly Gly Arg Asp Val Ser 1 5
10 15 Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly
Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly 20 25
30 Gly Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg
Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala 35 40
45 Ser Val Asp Arg Thr Tyr Arg Leu Asn 50 55
Gly Gly Gly Arg Asp Val Ser 1 5
10 15 Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly
Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly 20 25
30 Gly Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg
Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala 35 40
45 Ser Val Asp Arg Thr Tyr Arg Leu Asn 50 55
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0108
【補正方法】変更
【補正内容】
【0108】配列番号:2 配列の長さ:27 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:プライマーDNA 配列 GAATTCTATT CCTCCGTGTT CTTAATC
27
27
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0109
【補正方法】変更
【補正内容】
【0109】配列番号:3 配列の長さ:26 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:プライマーDNA 配列 CGGATCCTGA AGAGCACGAC GGGCAT
26
26
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0110
【補正方法】変更
【補正内容】
【0110】配列番号:4 配列の長さ:35 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:プライマーDNA 配列 GGATCCGCAT GCGTGGCAGC CTCTCTTCGC TGG
CC 35
CC 35
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0111
【補正方法】変更
【補正内容】
【0111】配列番号:5 配列の長さ:30 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:プライマーDNA 配列 GAATTCAGAT CTTGCCGCAC TTTTGCTTCT
30
30
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0112
【補正方法】変更
【補正内容】
【0112】配列番号:6 配列の長さ:607 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノムDNA 配列 GGATCCGCAT GCGTGGCAGC CTCTCTTCGC TGG
CCAATGC CGGCGGTCTG CATGACGACG 60 GCCCGGGTCT GGATAACGAT CTCATGAACG AGC
CCATGGG TCTCGGCGGT CTGGGAGGAG 120 GTGGCGGCGG TGGCGGCAAG AAGCACGACC GCG
GTGGCGG CGGTGGTTCC GGTACGCGGA 180 AAATGAGTAG CGGTGGCGGC GGCGGTGATC ATG
ACCACGG TCTTTCCTCC AAGGAAAAAT 240 ACGAGCAGCA CAAGATCACC AGCTACCTGA CGT
CCAAAGG TGGATCGGGC GGCGGCGGAG 300 GAGGAGGAGG CGGCGGTTTG GATCGCAACT CCG
GCAATTA CTTCAACGAC GCGAAAGAGG 360 AGAGCGACAG CGAGGATTCT GTAACGTTCG AGT
TCGTCCC TAACACCAAG AAGCAAAAGT 420 GCGGCAAGAT CCTGAAGAGC ACGACGGGCA TGA
AAACGGT GGCTTTCGAC CTATCGTCGC 480 CCCAGAAGAG CGGTACGGGG CCGCAACCGG GTT
CTGCCGG CATGGGGGGC GCCAAAACGC 540 CGTCGGACGC CGTGCAGAAC ATCCTCCAAA AGA
TCGAGAA GATTAAGAAC ACGGAGGAAT 600 AGAATTC
607
CCAATGC CGGCGGTCTG CATGACGACG 60 GCCCGGGTCT GGATAACGAT CTCATGAACG AGC
CCATGGG TCTCGGCGGT CTGGGAGGAG 120 GTGGCGGCGG TGGCGGCAAG AAGCACGACC GCG
GTGGCGG CGGTGGTTCC GGTACGCGGA 180 AAATGAGTAG CGGTGGCGGC GGCGGTGATC ATG
ACCACGG TCTTTCCTCC AAGGAAAAAT 240 ACGAGCAGCA CAAGATCACC AGCTACCTGA CGT
CCAAAGG TGGATCGGGC GGCGGCGGAG 300 GAGGAGGAGG CGGCGGTTTG GATCGCAACT CCG
GCAATTA CTTCAACGAC GCGAAAGAGG 360 AGAGCGACAG CGAGGATTCT GTAACGTTCG AGT
TCGTCCC TAACACCAAG AAGCAAAAGT 420 GCGGCAAGAT CCTGAAGAGC ACGACGGGCA TGA
AAACGGT GGCTTTCGAC CTATCGTCGC 480 CCCAGAAGAG CGGTACGGGG CCGCAACCGG GTT
CTGCCGG CATGGGGGGC GCCAAAACGC 540 CGTCGGACGC CGTGCAGAAC ATCCTCCAAA AGA
TCGAGAA GATTAAGAAC ACGGAGGAAT 600 AGAATTC
607
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0113
【補正方法】変更
【補正内容】
【0113】配列番号:7 配列の長さ:607 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノムDNA 配列 CCTAGGCGTA CGCACCGTCG GAGAGAAGCG ACC
GGTTACG GCCGCCAGAC GTACTGCTGC 60 CGGGCCCAGA CCTATTGCTA GAGTACTTGC TCG
GGTACCC AGAGCCGCCA GACCCTCCTC 120 CACCGCCGCC ACCGCCGTTC TTCGTGCTGG CGC
CACCGCC GCCACCAAGG CCATGCGCCT 180 TTTACTCATC GCCACCGCCG CCGCCACTAG TAC
TGGTGCC AGAAAGGAGG TTCCTTTTTA 240 TGCTCGTCGT GTTCTAGTGG TCGATGGACT GCA
GGTTTCC ACCTAGCCCG CCGCCGCCTC 300 CTCCTCCTCC GCCGCCAAAC CTAGCGTTGA GGC
CGTTAAT GAAGTTGCTG CGCTTTCTCC 360 TCTCGCTGTC GCTCCTAAGA CATTGCAAGC TCA
AGCAGGG ATTGTGGTTC TTCGTTTTCA 420 CGCCGTTCTA GGACTTCTCG TGCTGCCCGT ACT
TTTGCCA CCGAAAGCTG GATAGCAGCG 480 GGGTCTTCTC GCCATGCCCC GGCGTTGGCC CAA
GACGGCC GTACCCCCCG CGGTTTTGCG 540 GCAGCCTGCG GCACGTCTTG TAGGAGGTTT TCT
AGCTCTT CTAATTCTTG TGCCTCCTTA 600 TCTTAAG
607
GGTTACG GCCGCCAGAC GTACTGCTGC 60 CGGGCCCAGA CCTATTGCTA GAGTACTTGC TCG
GGTACCC AGAGCCGCCA GACCCTCCTC 120 CACCGCCGCC ACCGCCGTTC TTCGTGCTGG CGC
CACCGCC GCCACCAAGG CCATGCGCCT 180 TTTACTCATC GCCACCGCCG CCGCCACTAG TAC
TGGTGCC AGAAAGGAGG TTCCTTTTTA 240 TGCTCGTCGT GTTCTAGTGG TCGATGGACT GCA
GGTTTCC ACCTAGCCCG CCGCCGCCTC 300 CTCCTCCTCC GCCGCCAAAC CTAGCGTTGA GGC
CGTTAAT GAAGTTGCTG CGCTTTCTCC 360 TCTCGCTGTC GCTCCTAAGA CATTGCAAGC TCA
AGCAGGG ATTGTGGTTC TTCGTTTTCA 420 CGCCGTTCTA GGACTTCTCG TGCTGCCCGT ACT
TTTGCCA CCGAAAGCTG GATAGCAGCG 480 GGGTCTTCTC GCCATGCCCC GGCGTTGGCC CAA
GACGGCC GTACCCCCCG CGGTTTTGCG 540 GCAGCCTGCG GCACGTCTTG TAGGAGGTTT TCT
AGCTCTT CTAATTCTTG TGCCTCCTTA 600 TCTTAAG
607
【手続補正8】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0114
【補正方法】変更
【補正内容】
【0114】配列番号:8 配列の長さ:199 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:タンパク質 フラグメント型:中間部 配列 Ile Arg Met Arg Gly Ser Leu Ser Ser
Leu Ala Asn Ala Gly Gly Leu 1 5
10 15 His Asp Asp Gly Pro Gly Leu Asp Asn
Asp Leu Met Asn Glu Pro Met 20 25
30 Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly
Gly Gly Gly Gly Lys Lys His 35 40
45 Asp Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
Thr Arg Lys Met Ser Ser Gly 50 55
60 Gly Gly Gly Gly Asp His Asp His Gly
Leu Ser Ser Lys Glu Lys Tyr 65 70
75 80 Glu Gln His Lys Ile Thr Ser Tyr Leu
Thr Ser Lys Gly Gly Ser Gly 85
90 95 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
Leu Asp Arg Asn Ser Gly Asn 100 105
110 Tyr Phe Asn Asp Ala Lys Glu Glu Ser
Asp Ser Glu Asp Ser Val Thr 115 120
125 Phe Glu Phe Val Pro Asn Thr Lys Lys
Gln Lys Cys Gly Lys Ile Leu 130 135
140 Lys Ser Thr Thr Gly Met Lys Thr Val
Ala Phe Asp Leu Ser Ser Pro 145 150
155 160 Gln Lys Ser Gly Thr Gly Pro Gln Pro
Gly Ser Ala Gly Met Gly Gly 165
170 175 Ala Lys Thr Pro Ser Asp Ala Val Gln
Asn Ile Leu Gln Lys Ile Glu 180 185
190 Lys Ile Lys Asn Thr Glu Glu 195
Leu Ala Asn Ala Gly Gly Leu 1 5
10 15 His Asp Asp Gly Pro Gly Leu Asp Asn
Asp Leu Met Asn Glu Pro Met 20 25
30 Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly
Gly Gly Gly Gly Lys Lys His 35 40
45 Asp Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
Thr Arg Lys Met Ser Ser Gly 50 55
60 Gly Gly Gly Gly Asp His Asp His Gly
Leu Ser Ser Lys Glu Lys Tyr 65 70
75 80 Glu Gln His Lys Ile Thr Ser Tyr Leu
Thr Ser Lys Gly Gly Ser Gly 85
90 95 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
Leu Asp Arg Asn Ser Gly Asn 100 105
110 Tyr Phe Asn Asp Ala Lys Glu Glu Ser
Asp Ser Glu Asp Ser Val Thr 115 120
125 Phe Glu Phe Val Pro Asn Thr Lys Lys
Gln Lys Cys Gly Lys Ile Leu 130 135
140 Lys Ser Thr Thr Gly Met Lys Thr Val
Ala Phe Asp Leu Ser Ser Pro 145 150
155 160 Gln Lys Ser Gly Thr Gly Pro Gln Pro
Gly Ser Ala Gly Met Gly Gly 165
170 175 Ala Lys Thr Pro Ser Asp Ala Val Gln
Asn Ile Leu Gln Lys Ile Glu 180 185
190 Lys Ile Lys Asn Thr Glu Glu 195
【手続補正9】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0115
【補正方法】変更
【補正内容】
【0115】配列番号:9 配列の長さ:33 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:プライマーDNA 配列 GGATCCGCAT GCATCACGAC CGCCTGCTGG ACT
33
33
【手続補正10】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0116
【補正方法】変更
【補正内容】
【0116】配列番号:10 配列の長さ:29 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:プライマーDNA 配列 GAATTCTTAG TTGTTGATAC CCGCATATT
29
29
【手続補正11】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0117
【補正方法】変更
【補正内容】
【0117】配列番号:11 配列の長さ:34 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:プライマーDNA 配列 GGATCCGCAT GCATGGGGTT CCGGGCGGCG GTG
C 34
C 34
【手続補正12】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0118
【補正方法】変更
【補正内容】
【0118】配列番号:12 配列の長さ:31 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:プライマーDNA 配列 GAATTCTCTA GAATTGAGCC GATAGGTACG G
31
31
【手続補正13】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0119
【補正方法】変更
【補正内容】
【0119】配列番号:13 配列の長さ:42 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:プライマーDNA 配列 GATCCCCTCT AGAGACGCTC AGCGTCTTAC TGA
CGCTGCA GG 42
CGCTGCA GG 42
【手続補正14】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0120
【補正方法】変更
【補正内容】
【0120】配列番号:14 配列の長さ:42 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:プライマーDNA 配列 AATCTCTGCA GCGTCAGTAA GACGCTGAGC GTC
TCTAGAG GG 42
TCTAGAG GG 42
【手続補正15】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0121
【補正方法】変更
【補正内容】
【0121】配列番号:15 配列の長さ:72 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:プライマーDNA 配列 GGTGGTGAAG TTCATGACCT TTCTGCTCTT TTC
GCTCCGT CTGGTGTTGG TGCAGCTTCT 60 GGTGTTGGTG GG
72
GCTCCGT CTGGTGTTGG TGCAGCTTCT 60 GGTGTTGGTG GG
72
【手続補正16】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0122
【補正方法】変更
【補正内容】
【0122】配列番号:16 配列の長さ:80 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:プライマーDNA 配列 AATCTCCACC AACACCAGAA GCTGCACCAA CAC
CAGACGG AGCGAAAAGA GCAGAAAGGT 60 CATGAACTTC ACCACCTGCA
80
CAGACGG AGCGAAAAGA GCAGAAAGGT 60 CATGAACTTC ACCACCTGCA
80
【手続補正17】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0123
【補正方法】変更
【補正内容】
【0123】配列番号:17 配列の長さ:61 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:プライマーDNA 配列 TGGTGGTCTG CTTCTTGGTG AATCTGTTGC TGG
TAACTCT ATCTGCTTCG GTGTCCCGGG 60 G
61
TAACTCT ATCTGCTTCG GTGTCCCGGG 60 G
61
【手続補正18】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0124
【補正方法】変更
【補正内容】
【0124】配列番号:18 配列の長さ:67 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:プライマーDNA 配列 AATTCCCCGG GACACCGAAG CAGATAGAGT TAC
CAGCAAC AGATTCACCA AGAAGCAGAC 60 CACCACC
67
CAGCAAC AGATTCACCA AGAAGCAGAC 60 CACCACC
67
【手続補正19】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0125
【補正方法】変更
【補正内容】
【0125】配列番号:19 配列の長さ:171 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノムDNA 配列 GGGGTTCCGG GCGGCGGTGC TGGCGGGGGT GGT
GGACGAG ACGTGAGCGG GGGCCCGAGC 60 GACGGTCTGG GTGGCGGTCG TGGTGGTGGG GGT
GGTGGGG ATTCCGGGGG AATGATGGGG 120 CGCGGCGGTC GCATGTTGGG CGCTAGCGTG GAC
CGTACCT ATCGGCTCAA T 171
GGACGAG ACGTGAGCGG GGGCCCGAGC 60 GACGGTCTGG GTGGCGGTCG TGGTGGTGGG GGT
GGTGGGG ATTCCGGGGG AATGATGGGG 120 CGCGGCGGTC GCATGTTGGG CGCTAGCGTG GAC
CGTACCT ATCGGCTCAA T 171
【手続補正20】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0126
【補正方法】変更
【補正内容】
【0126】配列番号:20 配列の長さ:171 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノムDNA 配列 CCCCAAGGCC CGCCGCCACG ACCGCCCCCA CCA
CCTGCTC TGCACTCGCC CCCGGGCTCG 60 CTGCCAGACC CACCGCCAGC ACCACCACCC CCA
CCACCCC TAAGGCCCCC TTACTACCCC 120 GCGCCGCCAG CGTACAACCC GCGATCGCAC CTG
GCATGGA TAGCCGAGTT A 171
CCTGCTC TGCACTCGCC CCCGGGCTCG 60 CTGCCAGACC CACCGCCAGC ACCACCACCC CCA
CCACCCC TAAGGCCCCC TTACTACCCC 120 GCGCCGCCAG CGTACAACCC GCGATCGCAC CTG
GCATGGA TAGCCGAGTT A 171
【手続補正21】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0127
【補正方法】変更
【補正内容】
【0127】配列番号:21 配列の長さ:57 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ポリペプチド フラグメント型:中間部 配列 Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly
Gly Gly Gly Arg Asp Val Ser 1 5
10 15 Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly
Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly 20 25
30 Gly Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg
Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala 35 40
45 Ser Val Asp Arg Thr Tyr Arg Leu Asn 50 55
Gly Gly Gly Arg Asp Val Ser 1 5
10 15 Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly
Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly 20 25
30 Gly Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg
Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala 35 40
45 Ser Val Asp Arg Thr Tyr Arg Leu Asn 50 55
【手続補正22】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0128
【補正方法】変更
【補正内容】
【0128】配列番号:22 配列の長さ:651 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノムDNA 配列 ATGGCTAGCA TGACTGGTGG ACAGCAAATG GGT
CGCCGGA TCCGCATGCG TGGCAGCCTC 60 TCTTCGCTGG CCAATGCCGG CGGTCTGCAT GAC
GACGGCC CGGGTCTGGA TAACGATCTC 120 ATGAACGAGC CCATGGGTCT CGGCGGTCTG GGA
GGAGGTG GCGGCGGTGG CGGCAAGAAG 180 CACGACCGCG GTGGCGGCGG TGGTTCCGGT ACG
CGGAAAA TGAGTAGCGG TGGCGGCGGC 240 GGTGATCATG ACCACGGTCT TTCCTCCAAG GAA
AAATACG AGCAGCACAA GATCACCAGC 300 TACCTGACGT CCAAAGGTGG ATCGGGCGGC GGC
GGAGGAG GAGGAGGCGG CGGTTTGGAT 360 CGCAACTCCG GCAATTACTT CAACGACGCG AAA
GAGGAGA GCGACAGCGA GGATTCTGTA 420 ACGTTCGAGT TCGTCCCTAA CACCAAGAAG CAA
AAGTGCG GCAAGATCCG CATGCATGGG 480 GTTCCGGGCG GCGGTGCTGG CGGGGGTGGT GGA
CGAGACG TGAGCGGGGG CCCGAGCGAC 540 GGTCTGGGTG GCGGTCGTGG TGGTGGGGGT GGT
GGGGATT CCGGGGGAAT GATGGGGCGC 600 GGCGGTCGCA TGTTGGGCGC TAGCGTGGAC CGT
ACCTATC GGCTCAATTA G 651
CGCCGGA TCCGCATGCG TGGCAGCCTC 60 TCTTCGCTGG CCAATGCCGG CGGTCTGCAT GAC
GACGGCC CGGGTCTGGA TAACGATCTC 120 ATGAACGAGC CCATGGGTCT CGGCGGTCTG GGA
GGAGGTG GCGGCGGTGG CGGCAAGAAG 180 CACGACCGCG GTGGCGGCGG TGGTTCCGGT ACG
CGGAAAA TGAGTAGCGG TGGCGGCGGC 240 GGTGATCATG ACCACGGTCT TTCCTCCAAG GAA
AAATACG AGCAGCACAA GATCACCAGC 300 TACCTGACGT CCAAAGGTGG ATCGGGCGGC GGC
GGAGGAG GAGGAGGCGG CGGTTTGGAT 360 CGCAACTCCG GCAATTACTT CAACGACGCG AAA
GAGGAGA GCGACAGCGA GGATTCTGTA 420 ACGTTCGAGT TCGTCCCTAA CACCAAGAAG CAA
AAGTGCG GCAAGATCCG CATGCATGGG 480 GTTCCGGGCG GCGGTGCTGG CGGGGGTGGT GGA
CGAGACG TGAGCGGGGG CCCGAGCGAC 540 GGTCTGGGTG GCGGTCGTGG TGGTGGGGGT GGT
GGGGATT CCGGGGGAAT GATGGGGCGC 600 GGCGGTCGCA TGTTGGGCGC TAGCGTGGAC CGT
ACCTATC GGCTCAATTA G 651
【手続補正23】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0129
【補正方法】変更
【補正内容】
【0129】配列番号:23 配列の長さ:651 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノムDNA 配列 TACCGATCGT ACTGACCACC TGTCGTTTAC CCA
GCGGCCT AGGCGTACGC ACCGTCGGAG 60 AGAAGCGACC GGTTACGGCC GCCAGACGTA CTG
CTGCCGG GCCCAGACCT ATTGCTAGAG 120 TACTTGCTCG GGTACCCAGA GCCGCCAGAC CCT
CCTCCAC CGCCGCCACC GCCGTTCTTC 180 GTGCTGGCGC CACCGCCGCC ACCAAGGCCA TGC
GCCTTTT ACTCATCGCC ACCGCCGCCG 240 CCACTAGTAC TGGTGCCAGA AAGGAGGTTC CTT
TTTATGC TCGTCGTGTT CTAGTGGTCG 300 ATGGACTGCA GGTTTCCACC TAGCCCGCCG CCG
CCTCCTC CTCCTCCGCC GCCAAACCTA 360 GCGTTGAGGC CGTTAATGAA GTTGCTGCGC TTT
CTCCTCT CGCTGTCGCT CCTAAGACAT 420 TGCAAGCTCA AGCAGGGATT GTGGTTCTTC GTT
TTCACGC CGTTCTAGGC GTACGTACCC 480 CAAGGCCCGC CGCCACGACC GCCCCCACCA CCT
GCTCTGC ACTCGCCCCC GGGCTCGCTG 540 CCAGACCCAC CGCCAGCACC ACCACCCCCA CCA
CCCCTAA GGCCCCCTTA CTACCCCGCG 600 CCGCCAGCGT ACAACCCGCG ATCGCACCTG GCA
TGGATAG CCGAGTTAAT C 651
GCGGCCT AGGCGTACGC ACCGTCGGAG 60 AGAAGCGACC GGTTACGGCC GCCAGACGTA CTG
CTGCCGG GCCCAGACCT ATTGCTAGAG 120 TACTTGCTCG GGTACCCAGA GCCGCCAGAC CCT
CCTCCAC CGCCGCCACC GCCGTTCTTC 180 GTGCTGGCGC CACCGCCGCC ACCAAGGCCA TGC
GCCTTTT ACTCATCGCC ACCGCCGCCG 240 CCACTAGTAC TGGTGCCAGA AAGGAGGTTC CTT
TTTATGC TCGTCGTGTT CTAGTGGTCG 300 ATGGACTGCA GGTTTCCACC TAGCCCGCCG CCG
CCTCCTC CTCCTCCGCC GCCAAACCTA 360 GCGTTGAGGC CGTTAATGAA GTTGCTGCGC TTT
CTCCTCT CGCTGTCGCT CCTAAGACAT 420 TGCAAGCTCA AGCAGGGATT GTGGTTCTTC GTT
TTCACGC CGTTCTAGGC GTACGTACCC 480 CAAGGCCCGC CGCCACGACC GCCCCCACCA CCT
GCTCTGC ACTCGCCCCC GGGCTCGCTG 540 CCAGACCCAC CGCCAGCACC ACCACCCCCA CCA
CCCCTAA GGCCCCCTTA CTACCCCGCG 600 CCGCCAGCGT ACAACCCGCG ATCGCACCTG GCA
TGGATAG CCGAGTTAAT C 651
【手続補正24】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0130
【補正方法】変更
【補正内容】
【0130】配列番号:24 配列の長さ:216 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ポリペプチド フラグメント型:中間部 配列 Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln
Met Gly Arg Arg Ile Arg Met 1 5
10 15 Arg Gly Ser Leu Ser Ser Leu Ala Asn
Ala Gly Gly Leu His Asp Asp 20 25
30 Gly Pro Gly Leu Asp Asn Asp Leu Met
Asn Glu Pro Met Gly Leu Gly 35 40
45 Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
Gly Lys Lys His Asp Arg Gly 50 55
60 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Arg Lys
Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly 65 70
75 80 Gly Asp His Asp His Gly Leu Ser Ser
Lys Glu Lys Tyr Glu Gln His 85
90 95 Lys Ile Thr Ser Tyr Leu Thr Ser Lys
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 100 105
110 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asp Arg
Asn Ser Gly Asn Tyr Phe Asn 115 120
125 Asp Ala Lys Glu Glu Ser Asp Ser Glu
Asp Ser Val Thr Phe Glu Phe 130 135
140 Val Pro Asn Thr Lys Lys Gln Lys Cys
Gly Lys Ile Arg Met His Gly 145 150
155 160 Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly
Gly Gly Arg Asp Val Ser Gly 165
170 175 Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly
Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly 180 185
190 Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly
Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser 195 200
205 Val Asp Arg Thr Tyr Arg Leu Asn 210 215
Met Gly Arg Arg Ile Arg Met 1 5
10 15 Arg Gly Ser Leu Ser Ser Leu Ala Asn
Ala Gly Gly Leu His Asp Asp 20 25
30 Gly Pro Gly Leu Asp Asn Asp Leu Met
Asn Glu Pro Met Gly Leu Gly 35 40
45 Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
Gly Lys Lys His Asp Arg Gly 50 55
60 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Arg Lys
Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly 65 70
75 80 Gly Asp His Asp His Gly Leu Ser Ser
Lys Glu Lys Tyr Glu Gln His 85
90 95 Lys Ile Thr Ser Tyr Leu Thr Ser Lys
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 100 105
110 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asp Arg
Asn Ser Gly Asn Tyr Phe Asn 115 120
125 Asp Ala Lys Glu Glu Ser Asp Ser Glu
Asp Ser Val Thr Phe Glu Phe 130 135
140 Val Pro Asn Thr Lys Lys Gln Lys Cys
Gly Lys Ile Arg Met His Gly 145 150
155 160 Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly
Gly Gly Arg Asp Val Ser Gly 165
170 175 Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly
Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly 180 185
190 Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly
Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser 195 200
205 Val Asp Arg Thr Tyr Arg Leu Asn 210 215
【手続補正25】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0131
【補正方法】変更
【補正内容】
【0131】配列番号:25 配列の長さ:831 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノムDNA 配列 ATGGCTAGCA TGACTGGTGG ACAGCAAATG GGT
CGCCGGA TCCGCATGCG TGGCAGCCTC 60 TCTTCGCTGG CCAATGCCGG CGGTCTGCAT GAC
GACGGCC CGGGTCTGGA TAACGATCTC 120 ATGAACGAGC CCATGGGTCT CGGCGGTCTG GGA
GGAGGTG GCGGCGGTGG CGGCAAGAAG 180 CACGACCGCG GTGGCGGCGG TGGTTCCGGT ACG
CGGAAAA TGAGTAGCGG TGGCGGCGGC 240 GGTGATCATG ACCACGGTCT TTCCTCCAAG GAA
AAATACG AGCAGCACAA GATCACCAGC 300 TACCTGACGT CCAAAGGTGG ATCGGGCGGC GGC
GGAGGAG GAGGAGGCGG CGGTTTGGAT 360 CGCAACTCCG GCAATTACTT CAACGACGCG AAA
GAGGAGA GCGACAGCGA GGATTCTGTA 420 ACGTTCGAGT TCGTCCCTAA CACCAAGAAG CAA
AAGTGCG GCAAGATCCG CATGCATGGG 480 GTTCCGGGCG GCGGTGCTGG CGGGGGTGGT GGA
CGAGACG TGAGCGGGGG CCCGAGCGAC 540 GGTCTGGGTG GCGGTCGTGG TGGTGGGGGT GGT
GGGGATT CCGGGGGAAT GATGGGGCGC 600 GGCGGTCGCA TGTTGGGCGC TAGCGTGGAC CGT
ACCTATC GGCTCAATTC TAGAAAGATC 660 CTGAAGAGCA CGACGGGCAT GAAAACGGTG GCT
TTCGACC TATCGTCGCC CCAGAAGAGC 720 GGTACGGGGC CGCAACCGGG TTCTGCCGGC ATG
GGGGGCG CCAAAACGCC GTCGGACGCC 780 GTGCAGAACA TCCTCCAAAA GATCGAGAAG ATT
AAGAACA CGGAGGAATA G 831
CGCCGGA TCCGCATGCG TGGCAGCCTC 60 TCTTCGCTGG CCAATGCCGG CGGTCTGCAT GAC
GACGGCC CGGGTCTGGA TAACGATCTC 120 ATGAACGAGC CCATGGGTCT CGGCGGTCTG GGA
GGAGGTG GCGGCGGTGG CGGCAAGAAG 180 CACGACCGCG GTGGCGGCGG TGGTTCCGGT ACG
CGGAAAA TGAGTAGCGG TGGCGGCGGC 240 GGTGATCATG ACCACGGTCT TTCCTCCAAG GAA
AAATACG AGCAGCACAA GATCACCAGC 300 TACCTGACGT CCAAAGGTGG ATCGGGCGGC GGC
GGAGGAG GAGGAGGCGG CGGTTTGGAT 360 CGCAACTCCG GCAATTACTT CAACGACGCG AAA
GAGGAGA GCGACAGCGA GGATTCTGTA 420 ACGTTCGAGT TCGTCCCTAA CACCAAGAAG CAA
AAGTGCG GCAAGATCCG CATGCATGGG 480 GTTCCGGGCG GCGGTGCTGG CGGGGGTGGT GGA
CGAGACG TGAGCGGGGG CCCGAGCGAC 540 GGTCTGGGTG GCGGTCGTGG TGGTGGGGGT GGT
GGGGATT CCGGGGGAAT GATGGGGCGC 600 GGCGGTCGCA TGTTGGGCGC TAGCGTGGAC CGT
ACCTATC GGCTCAATTC TAGAAAGATC 660 CTGAAGAGCA CGACGGGCAT GAAAACGGTG GCT
TTCGACC TATCGTCGCC CCAGAAGAGC 720 GGTACGGGGC CGCAACCGGG TTCTGCCGGC ATG
GGGGGCG CCAAAACGCC GTCGGACGCC 780 GTGCAGAACA TCCTCCAAAA GATCGAGAAG ATT
AAGAACA CGGAGGAATA G 831
【手続補正26】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0132
【補正方法】変更
【補正内容】
【0132】配列番号:26 配列の長さ:831 配列の型:DNA 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ゲノムDNA 配列 TACCGATCGT ACTGACCACC TGTCGTTTAC CCA
GCGGCCT AGGCGTACGC ACCGTCGGAG 60 AGAAGCGACC GGTTACGGCC GCCAGACGTA CTG
CTGCCGG GCCCAGACCT ATTGCTAGAG 120 TACTTGCTCG GGTACCCAGA GCCGCCAGAC CCT
CCTCCAC CGCCGCCACC GCCGTTCTTC 180 GTGCTGGCGC CACCGCCGCC ACCAAGGCCA TGC
GCCTTTT ACTCATCGCC ACCGCCGCCG 240 CCACTAGTAC TGGTGCCAGA AAGGAGGTTC CTT
TTTATGC TCGTCGTGTT CTAGTGGTCG 300 ATGGACTGCA GGTTTCCACC TAGCCCGCCG CCG
CCTCCTC CTCCTCCGCC GCCAAACCTA 360 GCGTTGAGGC CGTTAATGAA GTTGCTGCGC TTT
CTCCTCT CGCTGTCGCT CCTAAGACAT 420 TGCAAGCTCA AGCAGGGATT GTGGTTCTTC GTT
TTCACGC CGTTCTAGGC GTACGTACCC 480 CAAGGCCCGC CGCCACGACC GCCCCCACCA CCT
GCTCTGC ACTCGCCCCC GGGCTCGCTG 540 CCAGACCCAC CGCCAGCACC ACCACCCCCA CCA
CCCCTAA GGCCCCCTTA CTACCCCGCG 600 CCGCCAGCGT ACAACCCGCG ATCGCACCTG GCA
TGGATAG CCGAGTTAAG ATCTTTCTAG 660 GACTTCTCGT GCTGCCCGTA CTTTTGCCAC CGA
AAGCTGG ATAGCAGCGG GGTCTTCTCG 720 CCATGCCCCG GCGTTGGCCC AAGACGGCCG TAC
CCCCCGC GGTTTTGCGG CAGCCTGCGG 780 CACGTCTTGT AGGAGGTTTT CTAGCTCTTC TAA
TTCTTGT GCCTCCTTAT C 831
GCGGCCT AGGCGTACGC ACCGTCGGAG 60 AGAAGCGACC GGTTACGGCC GCCAGACGTA CTG
CTGCCGG GCCCAGACCT ATTGCTAGAG 120 TACTTGCTCG GGTACCCAGA GCCGCCAGAC CCT
CCTCCAC CGCCGCCACC GCCGTTCTTC 180 GTGCTGGCGC CACCGCCGCC ACCAAGGCCA TGC
GCCTTTT ACTCATCGCC ACCGCCGCCG 240 CCACTAGTAC TGGTGCCAGA AAGGAGGTTC CTT
TTTATGC TCGTCGTGTT CTAGTGGTCG 300 ATGGACTGCA GGTTTCCACC TAGCCCGCCG CCG
CCTCCTC CTCCTCCGCC GCCAAACCTA 360 GCGTTGAGGC CGTTAATGAA GTTGCTGCGC TTT
CTCCTCT CGCTGTCGCT CCTAAGACAT 420 TGCAAGCTCA AGCAGGGATT GTGGTTCTTC GTT
TTCACGC CGTTCTAGGC GTACGTACCC 480 CAAGGCCCGC CGCCACGACC GCCCCCACCA CCT
GCTCTGC ACTCGCCCCC GGGCTCGCTG 540 CCAGACCCAC CGCCAGCACC ACCACCCCCA CCA
CCCCTAA GGCCCCCTTA CTACCCCGCG 600 CCGCCAGCGT ACAACCCGCG ATCGCACCTG GCA
TGGATAG CCGAGTTAAG ATCTTTCTAG 660 GACTTCTCGT GCTGCCCGTA CTTTTGCCAC CGA
AAGCTGG ATAGCAGCGG GGTCTTCTCG 720 CCATGCCCCG GCGTTGGCCC AAGACGGCCG TAC
CCCCCGC GGTTTTGCGG CAGCCTGCGG 780 CACGTCTTGT AGGAGGTTTT CTAGCTCTTC TAA
TTCTTGT GCCTCCTTAT C 831
【手続補正27】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0133
【補正方法】変更
【補正内容】
【0133】配列番号:27 配列の長さ:276 配列の型:アミノ酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖 配列の種類:ポリペプチド フラグメント型:中間部 配列 Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln
Met Gly Arg Arg Ile Arg Met 1 5
10 15 Arg Gly Ser Leu Ser Ser Leu Ala Asn
Ala Gly Gly Leu His Asp Asp 20 25
30 Gly Pro Gly Leu Asp Asn Asp Leu Met
Asn Glu Pro Met Gly Leu Gly 35 40
45 Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
Gly Lys Lys His Asp Arg Gly 50 55
60 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Arg Lys
Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly 65 70
75 80 Gly Asp His Asp His Gly Leu Ser Ser
Lys Glu Lys Tyr Glu Gln His 85
90 95 Lys Ile Thr Ser Tyr Leu Thr Ser Lys
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 100 105
110 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asp Arg
Asn Ser Gly Asn Tyr Phe Asn 115 120
125 Asp Ala Lys Glu Glu Ser Asp Ser Glu
Asp Ser Val Thr Phe Glu Phe 130 135
140 Val Pro Asn Thr Lys Lys Gln Lys Cys
Gly Lys Ile Arg Met His Gly 145 150
155 160 Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly
Gly Gly Arg Asp Val Ser Gly 165
170 175 Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly
Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly 180 185
190 Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly
Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser 195 200
205 Val Asp Arg Thr Tyr Arg Leu Asn Ser
Arg Lys Ile Leu Lys Ser Thr 210 215
220 Thr Gly Met Lys Thr Val Ala Phe Asp
Leu Ser Ser Pro Gln Lys Ser 225 230
235 240 Gly Thr Gly Pro Gln Pro Gly Ser Ala
Gly Met Gly Gly Ala Lys Thr 245
250 255 Pro Ser Asp Ala Val Gln Asn Ile Leu
Gln Lys Ile Glu Lys Ile Lys 260 265
270 Asn Thr Glu Glu 275
Met Gly Arg Arg Ile Arg Met 1 5
10 15 Arg Gly Ser Leu Ser Ser Leu Ala Asn
Ala Gly Gly Leu His Asp Asp 20 25
30 Gly Pro Gly Leu Asp Asn Asp Leu Met
Asn Glu Pro Met Gly Leu Gly 35 40
45 Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
Gly Lys Lys His Asp Arg Gly 50 55
60 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Arg Lys
Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly 65 70
75 80 Gly Asp His Asp His Gly Leu Ser Ser
Lys Glu Lys Tyr Glu Gln His 85
90 95 Lys Ile Thr Ser Tyr Leu Thr Ser Lys
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 100 105
110 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asp Arg
Asn Ser Gly Asn Tyr Phe Asn 115 120
125 Asp Ala Lys Glu Glu Ser Asp Ser Glu
Asp Ser Val Thr Phe Glu Phe 130 135
140 Val Pro Asn Thr Lys Lys Gln Lys Cys
Gly Lys Ile Arg Met His Gly 145 150
155 160 Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly
Gly Gly Arg Asp Val Ser Gly 165
170 175 Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly
Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly 180 185
190 Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly
Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser 195 200
205 Val Asp Arg Thr Tyr Arg Leu Asn Ser
Arg Lys Ile Leu Lys Ser Thr 210 215
220 Thr Gly Met Lys Thr Val Ala Phe Asp
Leu Ser Ser Pro Gln Lys Ser 225 230
235 240 Gly Thr Gly Pro Gln Pro Gly Ser Ala
Gly Met Gly Gly Ala Lys Thr 245
250 255 Pro Ser Asp Ala Val Gln Asn Ile Leu
Gln Lys Ile Glu Lys Ile Lys 260 265
270 Asn Thr Glu Glu 275
【手続補正28】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0134
【補正方法】削除
【手続補正29】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0135
【補正方法】削除
【手続補正30】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0136
【補正方法】削除
【手続補正31】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0137
【補正方法】削除
【手続補正32】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0138
【補正方法】削除
【手続補正33】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0139
【補正方法】削除
【手続補正34】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0140
【補正方法】削除
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12P 21/02 C C12Q 1/68 A 9453−4B G01N 33/569 J //(C12N 15/09 ZNA C12R 1:92) C12R 1:92) (72)発明者 ハンス・ハー・ゾンネボルン ドイツ連邦共和国63150ホイゼンシュタン ム、イム・ビルケンエック70番 (72)発明者 ボード・プラハター ドイツ連邦共和国91083バイエルスドルフ、 ゲーテシュトラーセ10番 (72)発明者 ゲルハルト・ヤーン ドイツ連邦共和国72108ロッテンブルク、 ロベルト−コッホ−ヴェーク5番 (54)【発明の名称】 サイトメガロウイルスの読み枠UL57およびテグメント蛋白質pp150のC端領域に由来するア ミノ酸配列を含むポリペプチドおよび融合蛋白質、これらを含む診断検査キット、サイトメガロ ウイルスおよびDNAオリゴヌクレオチドに対する抗体の検出法
Claims (22)
- 【請求項1】 サイトメガロウイルス(HCMV)に由
来するアミノ酸配列少なくとも一つを含むポリペプチド
であって、その配列が次から選択されるもの: イ) HCMウイルスの読み枠UL57、この読み枠は
主DNA結合蛋白質をコードするものであって、次のア
ミノ酸配列: 【化1】Gly・Val・Pro・Gly・Gly・G
ly・Ala・Gly・Gly・Gly・Gly・Gl
y・Arg・Asp・Val・Ser・Gly・Gly
・Pro・Ser・Asp・Gly・Leu・Gly・
Gly・Gly・Arg・Gly・Gly・Gly・G
ly・Gly・Gly・Asp・Ser・Gly・Gl
y・Met・Met・Gly・Arg・Gly・Gly
・Arg・Met・Leu・Gly・Ala・Ser・
Val・Asp・Arg・Thr・Tyr・Arg・L
eu・Asn に対して少なくとも60%の相同性を持つもの、および
/または ロ) サイトメガロウイルスのテグメント蛋白質pp1
50のC端領域およびヒトサイトメガロウイルスに由来
する別の抗原性蛋白質からの他の断片少なくとも一つで
あって、ロ)にしたがうポリペプチドは融合蛋白質とし
て存在する。 - 【請求項2】 選択肢イ)のポリペプチドが請求項1に
示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の相同性を
持つものである請求項1のポリペプチド。 - 【請求項3】 ポリペプチドが請求項1の選択肢イ)の
アミノ酸配列またはその部分配列に対応するものである
請求項1のポリペプチド。 - 【請求項4】 少なくとも10アミノ酸長を持つもので
ある請求項1から3の一つのポリペプチド。 - 【請求項5】 化学的に合成されたものである先行請求
項の一つのポリペプチド。 - 【請求項6】 請求項1から4の一つのポリペプチドの
アミノ酸配列を含む融合蛋白質。 - 【請求項7】 ヒトサイトメガロウイルスに由来する別
の抗原性蛋白質がp52蛋白質である請求項1の選択肢
ロ)の融合蛋白質。 - 【請求項8】 ヒトサイトメガロウイルスに由来する別
の抗原性蛋白質がp52蛋白質のC端領域に由来するも
のである請求項7の融合蛋白質。 - 【請求項9】 融合蛋白質が図2、図3および図4に示
すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の相同性を持
つアミノ酸配列を持つものである請求項7または8の融
合蛋白質。 - 【請求項10】 融合蛋白質が図2、図3および図4に
示すアミノ酸配列を持つものである請求項9の融合蛋白
質。 - 【請求項11】 融合蛋白質が、その融合蛋白質を発現
する細菌の蛋白質またはベクターに由来するアミノ酸2
5個以上を持たないものである請求項6から請求項10
の一つの融合蛋白質。 - 【請求項12】 融合蛋白質の一部がグルタチオン・S
トランスフェラーゼに由来するものである請求項6の融
合蛋白質。 - 【請求項13】 融合蛋白質の一部が請求項1の選択肢
イ)に従うポリペプチドに由来し、他の部分がヒトサイ
トメガロウイルスの他の蛋白質の少なくとも1種、殊に
別の抗原性蛋白質、に由来するものである請求項6から
請求項12の融合蛋白質。 - 【請求項14】 ヒトサイトメガロウイルスの別の抗原
性蛋白質がpp150テグメント蛋白質である請求項1
3の融合蛋白質。 - 【請求項15】 さらにヒトサイトメガロウイルスのp
52蛋白質のアミノ酸配列の一部を含むものである請求
項13または14の融合蛋白質。 - 【請求項16】 請求項1から請求項5までのポリペプ
チド少なくとも1種および/または請求項6から請求項
15のどれかの融合蛋白質少なくとも1種を含むもので
ある抗体、殊にサイトメガロウイルスに対するIgM抗
体、の検出用検査キット。 - 【請求項17】 ELISA検定を実施するための検査
キットである請求項16の検査キット。 - 【請求項18】 分析すべきサンプルを請求項1〜5の
一つのポリペプチドおよび/または請求項6から請求項
15の一つの融合蛋白質と混合し、抗体−ポリペプチド
複合体および/または抗体ー融合蛋白質複合体を検出用
成分で検出することを含むものである抗体、殊にサイト
メガロウイルスに対するIgM抗体、の検出方法。 - 【請求項19】 検出用成分が指標分子、殊にホースラ
ディシュ・ペルオキシダーゼ、に結合した抗−ヒト抗体
である請求項18の方法。 - 【請求項20】 請求項1のポリペプチドの少なくとも
一部に対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列を含むものであるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項21】 12〜30塩基長である請求項20の
オリゴヌクレオチド。 - 【請求項22】 核酸をコピーするための操作を用いて
サイトメガロウイルス感染症を検出するための請求項2
0または請求項22のオリゴヌクレオチドの使用法。
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DE19944426453 DE4426453C1 (de) | 1994-07-26 | 1994-07-26 | Rekombinant hergestellte Fusionsproteine des Cytomegalievirus und diese enthaltende diagnostische Testkits |
DE4435789-3 | 1994-10-06 | ||
DE19944435789 DE4435789C1 (de) | 1994-10-06 | 1994-10-06 | Peptide und Fusionsproteine umfassend eine aus dem Leserahmen UL 57 des Cytomegalievirus stammende Aminosäuresequenz und diese enthaltende diagnostische Testkits |
DE4426453-4 | 1994-10-06 |
Publications (1)
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JPH08196282A true JPH08196282A (ja) | 1996-08-06 |
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---|---|---|---|
JP7189080A Pending JPH08196282A (ja) | 1994-07-26 | 1995-07-25 | サイトメガロウイルスの読み枠UL57およびテグメント蛋白質pp150のC端領域に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび融合蛋白質、これらを含む診断検査キット、サイトメガロウイルスおよびDNAオリゴヌクレオチドに対する抗体の検出法 |
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---|---|
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EP (1) | EP0702083A3 (ja) |
JP (1) | JPH08196282A (ja) |
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FR2757169B1 (fr) * | 1996-12-13 | 1999-03-05 | Inst Nat Sante Rech Med | Proteine de fusion comportant tout ou partie de la proteine pp65 de cmv humain, utile notamment dans la preparation d'un vaccin |
CN1325649C (zh) * | 2005-08-11 | 2007-07-11 | 山东省医药生物技术研究中心 | 一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用 |
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CA3022196A1 (en) | 2008-07-16 | 2010-01-21 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
JP5712513B2 (ja) * | 2010-07-07 | 2015-05-07 | 富士レビオ株式会社 | ヒトサイトメガロウイルス感染の検出方法 |
CN113788880B (zh) * | 2021-09-12 | 2023-11-28 | 南京珀尔泰生物技术有限公司 | 一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法 |
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IT1266740B1 (it) * | 1994-07-01 | 1997-01-14 | Maria Paola Landini | Materiale proteico ricombinante legante anticorpi contro il citomegalovirus umano, reagenti diagnostici derivati da tale |
DE4435789C1 (de) * | 1994-10-06 | 1995-12-21 | Biotest Ag | Peptide und Fusionsproteine umfassend eine aus dem Leserahmen UL 57 des Cytomegalievirus stammende Aminosäuresequenz und diese enthaltende diagnostische Testkits |
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- 1995-07-25 JP JP7189080A patent/JPH08196282A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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