JPH08127594A - Ｆａｓ抗原に結合する新規蛋白質およびそれをコードするＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】医薬の分野において有用な新規な蛋白質、それ
をコードする新規なＤＮＡ、当該新規蛋白質を検出する
ために使用できる抗体、当該ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ
分子、形質転換体、当該新規蛋白質の精製方法、および
当該新規蛋白質の製造方法を、提供することを目的とす
る。 【構成】Ｆａｓ抗原に結合することを特徴とする新規蛋
白質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な蛋白質およびそ
れをコードする新規なＤＮＡを医薬の分野に提供する。
本発明は、また、当該新規蛋白質を検出するために使用
できる抗体を試薬の分野に提供する。さらに、本発明
は、当該ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子、形質転換体、
当該新規蛋白質の精製方法、および当該新規蛋白質の製
造方法をも提供する。

【０００２】

【従来の技術】多数の細胞で構成される生体の恒常性
は、細胞の増殖と分化およびその死によって巧妙に制御
されている。細胞の死は、死につつある細胞の形態か
ら、ネクローシス（壊死）とアポトーシス（自死）に大
別される。このうち、ネクローシスとは、一つ以上の細
胞あるいは組織や器官の一部分のアクシデンタルな死の
ことである。ネクローシスを起こした細胞では、細胞膜
の破壊、および細胞内容物の細胞外への放出が観察され
る。一方、アポトーシスとは、生体の恒常性を維持する
ための細胞死のことである。アポトーシスを起こした細
胞では、染色体ＤＮＡの断片化、核の濃縮が観察される
が、ネクローシスの場合とは異なり、細胞膜の破壊や細
胞内容物の放出は認められない。アポトーシスはプログ
ラム細胞死（programed cell death）の１つの形態であ
るとも考えられており、例えば、個体発生において不必
要な細胞や器官が欠落していく現象は細胞のアポトーシ
スによるものと考えられている。また、細胞障害性Ｔ細
胞（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｔ
ＮＦ−αやＴＮＦ−βなどによってウイルス感染細胞や
腫瘍細胞が攻撃除去され際の細胞死もアポトーシスであ
ると考えられており、アポトーシスの機能を解明し、生
理現象との関係を明らかにするための研究が、多くの研
究者によって進められている。

【０００３】ところで、細胞にアポトーシスを生じさせ
る物質としてはＦａｓ抗体が知られている。Ｆａｓ抗体
は、ヒト線維芽細胞でマウスを免疫して得られたモノク
ローナル抗体である（ヨネハラ S.(Yonehara S.)等、J.
Exp. Med. 169巻、1747-1756 頁、1989年）。Ｆａｓ抗
体によって認識され、アポトーシスのシグナルを細胞に
伝達する細胞表面抗原（Ｆａｓ抗原）がいかなるもので
あるかは長年不明であったが、最近、イトウ N.(Itoh
N.)等によって、Ｆａｓ抗原遺伝子がクローニングさ
れ、Ｆａｓ抗原が約４５ｋＤの細胞膜上の蛋白質であ
り、そのアミノ酸配列からＴＮＦレセプターファミリー
に属する事が判明した（Cell、66巻、233-243頁、1991
年）。また、マウスＦａｓ抗原遺伝子もクローニングさ
れ（ワタナベ−フクナガ(Watanabe-Fukunaga R.)等、J.
Immunol., 148巻、1274-1279 頁、1992年）、Ｆａｓ抗
原ｍＲＮＡが、マウスの胸腺、肝、肺、心臓、卵巣で発
現していることが確認された。

【０００４】Ｆａｓ抗原遺伝子のクローニング以後、Ｆ
ａｓ抗原を介したアポトーシスと疾患との関係について
の研究が進み、種々の報告がされるようになった。コバ
ヤシ N.(Kobayashi N.) 等は、エイズウイルス感染によ
りＴ細胞膜上にＦａｓ抗原の発現が誘導されることを報
告し、エイズで見られるＴ細胞のアポトーシスが、Ｆａ
ｓ抗原を介した現象である可能性を示唆している（日経
サイエンス、6 巻、34-41 頁、1993年）。ワタナベ−フ
クナガ(Watanabe-Fukunaga R.)等は、自己免疫疾患のモ
デル動物の１つであるｌｐｒマウスではＦａｓ抗原遺伝
子に変異が生じていること、このような変異の生じたＦ
ａｓ抗原遺伝子を発現している細胞ではアポトーシスが
起きないことを証明している。そして、自己免疫疾患で
は、Ｆａｓ抗原もしくはＦａｓ抗原に作用してアポトー
シスを起こさせる生体内物質に異常があり、そのため、
本来アポトーシスを起こして生体内から除去されるべき
自己反応性のＴ細胞が残存し、自己免疫疾患様の症状が
生じるのであろうと予想している（Nature,356 巻、314
-317 頁、1993年）。

【０００５】このように、Ｆａｓ抗原が単離され、生体
内でＦａｓ抗原が発現し、アポトーシスが惹起されるこ
とが確認されたことから、Ｆａｓ抗原に結合して細胞に
アポトーシスを起こすような物質（以下、Ｆａｓリガン
ドという）が生体内に存在し、Ｆａｓ抗原特異的なアポ
トーシスが起きていることが予想された。最近、ルービ
エ E.(Rouvier E.) らは、免疫系においてＦａｓ抗原特
異的なアポトーシスが生じていることをより具体的に示
した（J. Exp. Med., 177 巻、195-200 頁、1993年）。
すなわち、彼らは、マウス末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、
および、マウスＣＴＬとラットＴリンパ種細胞のハイブ
リドーマであるＰＣ６０−ｄ１０Ｓ細胞を使用し、これ
らの細胞によるＣａ²⁺非依存的な細胞障害作用が、Ｆａ
ｓ抗原を発現する細胞に対してのみ認められる事を示し
た。そして、彼等は、これらのリンパ球細胞、とりわけ
Ｔ細胞がＦａｓ抗原もしくはＦａｓ抗原に関連する何ら
かの分子を認識しているであろうこと、およびこれらの
細胞がＦａｓリガンドを発現しているかもしれないこと
を指摘している。

【０００６】Ｆａｓ抗原を介したアポトーシスの機構を
解明するには、Ｆａｓリガンドを単離することが重要で
ある。上記ルービエ(Rouvier E.)等により、Ｆａｓリガ
ンドの存在の可能性が指摘されたが、その実体は何ら明
らかにされていない。前述のように、Ｆａｓ抗原と様々
な疾患、生理現象との関連が示唆されていることから、
Ｆａｓリガンドの存在を明らかにし、その実体を把握す
ることは、医療をはじめ、多くの分野で渇望されてい
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする問題点】本発明の目的は、Ｆ
ａｓ抗原に結合する新規な蛋白質およびそれをコードす
る遺伝子を単離し、提供することにある。Ｆａｓ抗原に
結合する物質が単離されれば、それを使用して、人為的
に生体内で生じるアポトーシスを調節し、疾患の治療
や、診断に使用する事ができる。Ｆａｓ抗原に結合して
細胞にアポトーシスを誘導するような物質（Ｆａｓリガ
ンド）は、生体にとって不必要な細胞を除去するために
使用することが可能である。たとえば、先述したよう
に、エイズウイルス感染細胞ではＦａｓ抗原が発現され
ているので、エイズウイルス感染初期においては、Ｆａ
ｓリガンドを使用してアポトーシスを人工的に誘導し、
感染細胞を早期に除去する事により、エイズを治療する
事が可能であろう。また、ある種の自己免疫疾患では、
人為的にＦａｓ抗原を介したアポトーシスを生じさせる
事により、自己抗原反応性のＴ細胞の除去が可能になる
であろう。モリモト H.(Morimoto H.)等は、癌細胞にＦ
ａｓ抗原を介したアポトーシスを誘導する事によって、
アドリアマイシンやシスプラチンによる制癌効果が相乗
的に増強されることを報告している（Cancer Res., 53
巻、2591-2596 頁、1993年）ので、Ｆａｓリガンドは癌
治療にも使用することができるであろう。

【０００８】一方、エイズウイルス感染後期の免疫能の
低下や、劇症肝炎における肝機能低下は、免疫担当細胞
あるいは肝細胞のアポトーシスにより組織の機能が著し
く低下した結果と考えられる。このような状態において
は、Ｆａｓリガンドの作用を抑制し、細胞のアポトーシ
スを防ぐことが必要になる。したがって、このような病
態には、Ｆａｓリガンドの発現を抑制する物質やＦａｓ
リガンドと拮抗的に作用する物質を使用した治療が必要
である。このように、生体内で生じているアポトーシス
を人為的に調節するという原理に基づいた治療方法は、
Ｆａｓ抗原に結合する物質が同定されて初めて可能にな
る方法である。

【０００９】Ｆａｓ抗原と結合する蛋白質を、治療や研
究に使用するためには、当該蛋白質を高純度で、大量に
生産することが必要になる。当該蛋白質をコードする遺
伝子をクローニングすれば、当該蛋白質を遺伝子工学的
に生産することが可能になり、当該蛋白質を治療薬の主
成分として使用したり、抗体の作製に使用することが可
能になる。また、遺伝子そのものは、遺伝子治療やアン
チセンス医薬の開発に使用したり、トランスジェニック
マウス等、アポトーシスが関与する疾患のモデル動物の
作製に使用することができる。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｆａｓリ
ガンドを単離すべく鋭意研究を重ねてきた。そして、上
述したＰＣ６０−ｄ１０Ｓ細胞に着目した。ＰＣ６０−
ｄ１０ＳはマウスＣＴＬとラットＴリンパ腫とのハイブ
リドーマで、ＰＭＡ（ホルボールミリステートアセテー
ト）とイオノマイシンで刺激するとＦａｓ抗原発現細胞
に対してのみアポトーシスを誘導する細胞である。本発
明者らは、鋭意研究を重ねた結果、無刺激でも、より高
い細胞障害作用を示す、Ｆａｓリガンド遺伝子をクロー
ニングするのに適した細胞集団、ＰＣ６０−ｄ１０Ｓ−
２を得る事に成功した。そして、この細胞集団より、ラ
ットＦａｓリガンド遺伝子をクローニングした。また、
医薬品等に使用するのに適したヒト由来のＦａｓリガン
ドを単離することを目的として研究を重ね、ヒトＦａｓ
リガンドをコードする遺伝子を得ることにも成功した。
さらに、マウスＦａｓリガンドをコードする遺伝子を得
る事にも成功し、これらの配列が互いに類似すること、
部分的に共通の配列を有することを確認し、本発明を完
成させたものである。

【００１１】すなわち、本発明第１の態様は、Ｆａｓ抗
原と結合することを特徴とする新規な蛋白質である。本
発明第２の態様は、本発明第１の態様の新規蛋白質をコ
ードする塩基配列を有する事を特徴とする新規ＤＮＡで
ある。本発明第３の態様は、本発明第２の態様のＤＮＡ
を含む事を特徴とする組み換えＤＮＡ分子である。本発
明第４の態様は、本発明第２の態様の新規ＤＮＡで形質
転換されたことを特徴とする形質転換体である。本発明
第５の態様は、本発明第３の態様の組み換えＤＮＡ分子
で形質転換された事を特徴とする形質転換体である。本
発明第６の態様は、本発明第４または第５の態様の形質
転換体を用いる事を特徴とする本発明第１の態様の新規
蛋白質の製造方法である。本発明第７の態様は、本発明
第１の態様の蛋白質の精製方法である。

【００１２】本発明第８の態様は、本発明第１の態様の
新規蛋白質を認識することを特徴とする新規抗体であ
る。本発明第９の態様は、Ｆａｓリガンド遺伝子または
Ｆａｓリガンドに対するｍＲＮＡの一部に相補的な塩基
配列を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチド誘導体である。本発明第１０の態様
は、ＦａｓリガンドもしくはＦａｓリガンドを発現する
形質転換体を使用することを特徴とするＦａｓリガンド
に関連する物質のスクリーニング方法である。

【００１３】以下に詳細に本発明を説明する。

【００１４】まず、本発明第１の態様の新規蛋白質につ
いて説明する。当該蛋白質の説明において、「アミノ酸
配列を有する蛋白質」とは、その蛋白質が、そのアミノ
酸配列で規定されるものであってもよいし、そのアミノ
酸配列に加え、そのＮ末端、Ｃ末端のいずれか一方、も
しくはその両方に、任意の１つ以上のアミノ酸が付加し
てなるアミノ酸配列で規定されるものであってもよいこ
とを意味する。また、「アミノ酸配列の少なくとも一部
を有する蛋白質」とは、そのアミノ酸配列の全体を有す
る蛋白質、および、そのアミノ酸配列の任意の長さから
なる任意の一部分を有する蛋白質を意味する。もちろ
ん、そのアミノ酸配列の任意の一部に加え、そのＮ末
端、Ｃ末端のいずれか一方、もしくはその両方に、任意
の１つ以上のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列で規
定される蛋白質もこれに含まれる。

【００１５】本発明第１の態様の新規蛋白質は、Ｆａｓ
抗原と結合することを特徴とする。当該蛋白質は、Ｆａ
ｓ抗原と結合するものであれば、Ｆａｓ抗原を発現する
細胞に対してアポトーシスを誘導するものであっても、
誘導しないものであってもよい。しかしながら、好まし
くは、当該蛋白質は、Ｆａｓ抗原と結合して、Ｆａｓ抗
原を発現している細胞に対してアポトーシスを誘導する
活性を有するもの（Ｆａｓリガンド）、およびその一部
を含む蛋白質である。本発明の新規蛋白質は、いかなる
動物種由来のＦａｓ抗原と結合するものであってもよい
が、好ましくは、ヒトＦａｓ抗原、ラットＦａｓ抗原、
マウスＦａｓ抗原より選ばれるいずれかのＦａｓ抗原と
結合するものである。なお、ヒトＦａｓ抗原、マウスＦ
ａｓ抗原およびラットＦａｓ抗原は、それぞれイトウ
等、ワタナベ−フクナガ等およびキムラ等により、その
遺伝子がクローニングされている（イトウ N.(Itoh
N.) 等、Cell, 66巻、233-243 頁、1991年、ワタナベ−
フクナガ R.(Watanabe-Fukunaga R.) 等、J. Immunol.,
148巻、1274-1279 頁、1992年、キムラ K.(Kimura
K.) 等、Biochem. Biophys. Res.Commun., 198巻、666-
674 頁、1994年）。

【００１６】当該新規蛋白質は、前記特徴を有するもの
であれば、そのアミノ酸配列は特に限定されない。しか
しながら、Ｆａｓリガンドは、好ましくは、配列表の配
列番号１（式１）のアミノ酸配列有するものとして特徴
づけられるので、本発明第１の新規蛋白質は、好ましく
は、前記式１のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する
蛋白質と定義される。前記式１において、x-1 ないしx-
76で示される位置のアミノ酸は、それぞれＦａｓリガン
ドの生物活性に与える影響が少ないアミノ酸と考えられ
る。従って、x-1 ないしx-76は、特に、x-15、x-27、x-
28においては、アミノ酸は存在してもしなくてもよい。
x-1 ないしx-76で示した位置にアミノ酸が存在する場合
には、そのアミノ酸は、Ala, Asp, Arg, Asn, Cys, Gl
y, Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Phe, Se
r, Tyr, Thr, Trp, Valより選ばれるいずれかの１アミ
ノ酸である。x-1 ないしx-76のアミノ酸は種々の組み合
わせが考えられので、本発明の新規蛋白質のアミノ酸配
列は１種類には限定されない。しかしながら、本発明の
第１の態様の新規蛋白質は、好ましくは、配列表の配列
番号２ないし４（前記式２ないし４）のいずれかのアミ
ノ酸配列の少なくとも一部を有するものである。このう
ち、前記式３は、前記式１のx-15、x-27、x-28の位置に
アミノ酸が存在しない場合に相当し、前記式４は、前記
式１のx-15、x-28の位置にアミノ酸が存在しない場合に
相当する。

【００１７】本発明の新規蛋白質は、より好ましくは、
配列表の配列番号２ないし４いずれかのアミノ酸配列の
全体を有するものである。前記式２のアミノ酸配列は、
少なくともヒトＦａｓ抗原に結合し、ヒトＦａｓ抗原を
発現する細胞に対してアポトーシスを誘導するＦａｓリ
ガンドのアミノ酸配列であり、前記式３のアミノ酸配列
は、少なくともラットＦａｓ抗原に結合し、アポトーシ
スを誘導するＦａｓリガンドのアミノ酸配列である。ま
た、前記式４のアミノ酸配列は、少なくともマウスＦａ
ｓ抗原に結合してアポトーシスを誘導するＦａｓリガン
ドのアミノ酸配列である。前記式１のアミノ酸配列は、
種差を考慮して相同性を有する部分を具体的にアミノ酸
配列で表わし、種によって変位するであろうと考えられ
る部分をｘで示した式である。

【００１８】前記式１ないし４で示されるＦａｓリガン
ドは、いずれも、細胞内領域、膜貫通領域、細胞外領域
とを有し、生体においては細胞表面蛋白質として存在し
ている。従って、アポトーシスを誘導するこれらの蛋白
質を得るためには、これらを発現している細胞や組織の
ライセートから精製する必要がある。ところで、このよ
うな細胞表面上に存在する蛋白質の細胞外領域は、細胞
膜から切断、遊離され、それを生産する細胞の培養上清
中や、尿や血液等の体液中に存在することが多い。一般
的に蛋白質の精製は、細胞や組織のライセートから精製
する場合と、培養上清や尿から精製する場合とがあり、
後者の方が効率的であり収量も多い。Ｆａｓリガンドの
細胞外領域は、上述のように培養上清中等に存在するた
め生産上の有用性が高い。従って、本発明では、このよ
うなＦａｓリガンドの細胞外領域の少なくとも一部を有
する蛋白質を本発明の蛋白質の好ましい一例として提供
する。

【００１９】細胞外領域が細胞膜から切断される部位
は、それを生産する細胞の培養条件や細胞内外のプロテ
アーゼの影響により、多様性が生じることもあるが、本
発明の新規蛋白質の好ましい例は、配列表の配列番号５
ないし８（式５ないし８）のアミノ酸配列の少なくとも
一部を有する蛋白質である。前記式５の配列は前記式１
の配列のアミノ酸番号１０３から２８１に相当する。前
記式５において、y-1 ないしy-41は、アミノ酸が存在し
てもしなくてもよいことを示す。しかしながら、y-1 な
いしy-41には、Ala, Asp, Arg, Asn, Cys, Gly, Glu, G
ln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Phe, Ser, Tyr, T
hr, Trp, Valより選ばれるいずれかの１アミノ酸が存在
することが好ましい。前記式６の配列は前記式２のアミ
ノ酸番号１０３から２８１に相当し、前記式７の配列は
前記式３のアミノ酸番号１００から２７８に相当し、前
記式８の配列は前記式４の配列のアミノ酸番号１０１か
ら２７９に相当する。前記式５ないし８のいずれかのア
ミノ酸配列の少なくとも一部を有する蛋白質の中でも、
Ｆａｓ抗原に結合し、アポトーシスを誘導するものがよ
り好ましい。Ｆａｓ抗原に結合し、アポトーシスを誘導
する蛋白質の例としては、前記式５ないし８のいずれか
のアミノ酸配列を有する蛋白質がある。このうち、前記
式６のアミノ酸配列を有する蛋白質は少なくともヒトＦ
ａｓ抗原に、前記式７のアミノ酸配列を有する蛋白質は
少なくともラットＦａｓ抗原に、前記式８のアミノ酸配
列を有する蛋白質は少なくともマウスＦａｓ抗原に結合
して、アポトーシスを誘導する。本発明者らは、また、
前記式６のＮ末端より数えて３５番目のPro （すなわち
前記式２のＮ末端より数えて１３７番目のPro ）以降の
アミノ酸配列を有するように形質転換体で発現させた蛋
白質がアポトーシスを誘導する活性を有していることを
確認している。これらは、いずれもＦａｓリガンドを発
現する細胞の培養上清中から回収することが可能であ
り、生産が容易であるという点で利用価値が高い。

【００２０】一般に蛋白質は、種の違い、個体の違いに
よって、その基本的な機能が保持されたまま、アミノ酸
配列に変異が生じる場合がある。ここでいうアミノ酸の
変異とは、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が欠失
したり、他のアミノ酸へ置換すること、および、アミノ
酸配列中の任意の位置に１つ以上のアミノ酸が挿入もし
くは付加することである。このような変異は、遺伝子工
学的な技術を使用して、人工的に生じさせることも可能
である。本発明者らは、このようなアミノ酸配列の多様
性を考慮して、本発明の新規蛋白質を、「前記式１の少
なくとも一部を有するもの」と特徴づけた。しかしなが
ら、前記式１以外のアミノ酸配列の少なくとも一部を有
するもの、例えば、前記式２ないし４のいずれかに記載
のアミノ酸配列の任意の１以上の位置においてアミノ酸
の変異が生じたアミノ酸配列を有するものであっても、
この蛋白質が、少なくともヒトＦａｓ抗原、ラットＦａ
ｓ抗原、マウスＦａｓ抗原のいずれかに結合するもので
ある限り、本発明の新規蛋白質に含まれる。

【００２１】一般に、同一の機能を有する蛋白質に対す
るＤＮＡは、動物種や個体が異なっていても互いに相同
性があり、互いにハイブリダイズすることが多い。アミ
ノ酸の多様性も、それらをコードするＤＮＡが互いにハ
イブリダイズする範囲で生じることが多い。例えば実施
例で示すように、前記式２および４のアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡは、前記式３のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡとハイブリダイズする。さらに、前記式２のア
ミノ酸配列を有するＦａｓリガンドは、ヒトＦａｓ抗原
のみでなく、マウスＦａｓ抗原にも結合する。また、前
記式４のアミノ酸配列を有するＦａｓリガンドは、マウ
スＦａｓ抗原に加えヒトＦａｓ抗原にも結合する。この
ように、互いにハイブリダイズするＤＮＡによってコー
ドされるアミノ酸配列を有する蛋白質は、実質的に同一
の機能を有すると考えられる。従って、本発明には、前
記式２ないし４をコードするいずれかの塩基配列とハイ
ブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸
配列の少なくとも一部を有する蛋白質が包含される。

【００２２】本発明の新規蛋白質には、糖鎖を有するも
の、有さないものいずれもが含まれる。前記式２および
３で示したアミノ酸配列には、それぞれ４ヶ所の糖鎖付
加可能部位（Ｎ−グリコシレーションサイト）がある。
すなわち、前記式２においては、アミノ酸番号７６〜７
８、１８４〜１８６、２５０〜２５２、２６０〜２６２
が、前記式３においてはアミノ酸番号１１６〜１１８、
１３０〜１３２、２４７〜２４９、２５７〜２５９が糖
鎖付加可能部位に相当する。また、前記式４のアミノ酸
配列には５ヶ所のＮ−グリコシレーションサイトがある
（アミノ酸番号１１７〜１１９、１３１〜１３３、１８
２〜１８４、２４８〜２５０および２５８〜２６０）。
従って、当該蛋白質が動物細胞によって生産されたもの
であったり、遺伝子工学的に酵母や動物細胞等の真核細
胞を宿主として生産させたものであったりした場合に
は、糖鎖が付加される可能性がある。一方、大腸菌等の
原核細胞を宿主として遺伝子工学的に蛋白質を生産させ
た場合には、当該新規蛋白質は糖鎖を持たない。

【００２３】本発明第１の態様の新規蛋白質はいかなる
方法で生産されたものであってもよい。例えば、ペプチ
ド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３０Ａ
型、パーキンエルマージャパン（株）製）を使用して化
学合成したものでも、ヒトおよびヒト以外のいかなる生
物の組織や細胞、体液から精製されたものであってもよ
い。ヒトや動物の体液としては、血液や尿があげられ
る。細胞としては、本発明の新規蛋白質を産生する細胞
を適宜選択して用いることができる。例えば、胸腺細胞
やリンパ球系細胞、および、それらの株化細胞などを、
ノーザンブロットあるいはウエスタンブロット等で解析
し、本発明の新規蛋白質の発現量の高いものを選択す
る。必要があれば、細胞をＰＭＡ（ホルボールミリステ
ートアセテート）やイオノマイシン、ＰＨＡ（フィトヘ
ムアグルチニン）、ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）、Ｉ
Ｌ−２（インターロイキン−２）等適切な刺激剤で刺激
して産生誘導する。そして、細胞のライセートもしくは
培養上清から、当該蛋白質を精製する。精製は、濃縮
や、各種クロマトグラフィー、塩析など一般的に行われ
ている蛋白質の精製方法を適宜組み合わせ、Ｆａｓ抗原
への結合性、もしくは、Ｆａｓ抗原を発現している細胞
への細胞障害活性等を指標として行うことができる。精
製方法の好ましい例は、第７の態様で説明する。

【００２４】しかしながら、当該新規蛋白質は、その純
度の面から、遺伝子工学的に生産されたもの、すなわ
ち、組換え型蛋白質であることが好ましい。当該蛋白質
を遺伝子工学的に生産するには、後述する本発明第２の
態様の新規ＤＮＡ、もしくは第３の態様の組換えＤＮＡ
分子を用いて、適当な宿主細胞を形質転換し、得られた
形質転換体を培養して培養混合物を回収し、当該蛋白質
を精製する。また、該ＤＮＡや組換えＤＮＡ分子を利用
して無細胞系の合成方法（サムブルック J.(Sambrook,
J.)et al.: Molecular Cloning 2nd ed.( 1989 年) ）
で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つであ
る。遺伝子工学的に本発明の新規蛋白質を製造する好ま
しい方法については本発明第６の態様で説明している。

【００２５】近年の技術により、蛋白質をポリエチレン
グリコールや、スチレン−マレイン酸コポリマー、デキ
ストラン、ピランコポリマー、ポリリジン等の高分子に
結合させたり、多糖類や蛋白質などの天然高分子、ホル
モンなどの生理活性物質、マグネタイトなどの無機物質
に結合させたりすることが可能になった（例えば、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 84巻, 1487-1491 頁（1981
年）、Biochemistry 28巻, 6619-6624頁 (1989年)
）。蛋白質にポリエチレングリコールを結合させる方
法の一例を簡単に説明する。まず、蛋白質をそれが活性
を失わないような範囲の塩基性ｐＨを有する緩衝液に溶
解する。その溶液に、メトキシポリエチレングリコール
スクシンイミジルサクシネートのような活性化ポリエチ
レングリコールを混合し、室温で一定時間反応させる。
その後、ゲルろ過等によって、活性を有するフラクショ
ンを分取する。本発明の新規蛋白質も公知方法の組み合
わせにより、このような修飾が可能である。従って、本
発明の新規蛋白質には、上述のような修飾を受けたもの
も包含される。

【００２６】本発明の新規蛋白質は、生体内で生じるア
ポトーシスを調節するために使用することができる。例
えば、Ｆａｓ抗原に結合し、アポトーシスを誘導する、
前記式１ないし４のいずれかのアミノ酸配列、もしくは
前記式５ないし８のいずれかのアミノ酸配列を有する蛋
白質に代表される本発明の新規蛋白質は、薬剤耐性とな
った癌を治療するために使用することができる。また、
これらは、ＨＩＶウイルスが感染した細胞に対し、アポ
トーシスを人為的に誘導し、ＡＩＤＳの感染初期の治療
薬となり、新しい治療方法を医療の分野に提供する事が
できる。一方、本発明の新規蛋白質のうち、前記式１な
いし８のいずれかのアミノ酸配列の一部分であって、Ｆ
ａｓ抗原に結合するがアポトーシスを誘導しない蛋白質
は、肝炎等の重篤な感染症となった時に感染細胞がアポ
トーシスを起こすのを防ぎ、肝臓等の主要組織の細胞の
急激な減少を防止することによって、組織機能の低下を
予防することができる。

【００２７】本発明の新規蛋白質を医薬品として使用す
る場合には、蛋白質を有効成分として含む通常の医薬組
成物の製造方法に準じて医薬組成物を製造する。例え
ば、注射剤であれば当該新規蛋白質を含む溶液を無菌状
態で調製し、必要があれば、アルブミンやゼラチン等の
安定化剤を加えてアンプルに充填し、凍結乾燥すること
により、当該新規蛋白質を有効成分とする医薬組成物を
製造することができる。このようにして得られた医薬組
成物は、使用時に、注射用蒸留水等に溶解して静脈内や
局所へ投与することができる。医薬組成物の有効成分と
しては、本発明の新規蛋白質の中でもヒトに対する抗原
性が最も低い、前記式２または６のアミノ酸配列、もし
くは、少なくともその一部を有する蛋白質を使用するこ
とが好ましい。本発明の新規蛋白質は、また、抗体を得
るための材料として使用することもできる。すなわち、
本発明の新規蛋白質をウサギなどの動物に投与して、本
発明の蛋白質に対する抗体を作成する。抗体の作製法に
ついては、第８の態様で説明する。得られた抗体は、組
織や細胞の染色に使用したり、当該新規蛋白質を精製す
るためアフィニティーカラムの作製に使用することがで
きる。

【００２８】次に本発明の第２の態様の新規ＤＮＡを説
明する。本明細書のＤＮＡおよび組換えＤＮＡ分子の説
明において「塩基配列を有するＤＮＡ」および「塩基配
列の少なくとも一部を有するＤＮＡ」とは、ＤＮＡが、
その塩基配列もしくは、その任意の一部分からなるＤＮ
Ａであっても、その塩基配列もしくは、その任意の一部
分の５’末端、３’末端のいずれか一方、もしくはその
両方に任意の１つ以上の塩基が付加した配列からなるも
のであってもよいことを意味する。ここで、付加される
塩基は、コーディングフレームにずれを生じさせない限
りいかなるものであってもよく、例えば、リンカー配
列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他の蛋白
質をコードする塩基配列、もしくはＤＮＡプローブ等を
作製する際にその検出感度の増加を目的として付加され
る配列等が例として挙げられる。

【００２９】本発明第２の態様の新規ＤＮＡは、本発明
第１の態様の新規蛋白質をコードする塩基配列を有する
ことを特徴とするＤＮＡである。すなわち、Ｆａｓ抗原
に結合することを特徴とする新規蛋白質もしくは一部を
有する蛋白質をコードする塩基配列を有することを特徴
としている。本発明の新規ＤＮＡは、好ましくは、前記
式１ないし８のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも一
部をコードする塩基配列を有するものである。一般に、
アミノ酸をコードするＤＮＡのトリプレットは、アミノ
酸の種類ごとに１〜６種類迄存在することが知られてい
るので、前記配列番号１ないし８のいずれかのアミノ酸
配列をコードする塩基配列は１種類には限定されない。
したがって、ＤＮＡが、前記１ないし８のいずれかのア
ミノ酸配列の少なくとも一部をコードする塩基配列を有
する限り、いかなる配列からなるＤＮＡであっても、全
て本発明の新規ＤＮＡに包含される。

【００３０】しかしながら、好ましくは、本発明の新規
ＤＮＡは、配列表の配列番号９ないし１１（前記式９な
いし１１）のいずれかの塩基配列の少なくとも一部を有
するＤＮＡである。また、他の好ましい例は、配列表の
配列番号１２ないし１４（式１２ないし１４）のいずれ
かの塩基配列の少なくとも一部を有するＤＮＡである。
これらは、それぞれ前記式２ないし４および６ないし８
のアミノ酸配列をコードする塩基配列の好ましい例であ
る。当該好ましい例は、それが前記式９ないし１４のい
ずれかの塩基配列の少なくとも一部を有する限り、ｃＤ
ＮＡであっても染色体ＤＮＡであってもよい。染色体Ｄ
ＮＡの一例としては、前記式９もしくは１２の塩基配列
の一部を有する染色体ＤＮＡの塩基配列をヒトＦａｓリ
ガンドについて図１６〜１８に示してある。しかしなが
ら、形質転換体への導入の容易さ等、遺伝子工学的手法
における扱い易さから、本発明の新規ＤＮＡはｃＤＮＡ
であることが好ましい。

【００３１】本発明のＤＮＡは、特に好ましくは、前記
式９ないし１１、もしく前記式１２ないし１４のいずれ
かの塩基配列の全体を有するものである。前記式１２は
前記式９の塩基番号３０７から８４３に相当し、前記式
１３は前記式１０の塩基番号２９８から８３４に相当
し、前記式１４は前記式１１の塩基番号３０１から８３
７に相当する。これらの配列は、Ｆａｓ抗原に結合し、
アポトーシスを誘導する活性を有する蛋白質を、生産す
るために使用することができる。特に、前記式１２ない
し１４の塩基配列を有するＤＮＡを適当なシグナル配列
の下流に接続させた組換えＤＮＡ分子を作製し、これを
用いて宿主細胞を形質転換させると、得られた形質転換
体の培養上清中に、前記式５ないし８いずれかのアミノ
酸配列（すなわち、Ｆａｓリガンドの細胞外領域）を有
する蛋白質を分泌させることができる。既に説明したよ
うに、蛋白質の精製においては、細胞のライセートから
精製するよりも、培養上清から精製する方が効率的であ
る。従って、前記式１２ないし１４いずれかの塩基配列
を有するＤＮＡは、蛋白質を生産する上での利用価値が
高い。

【００３２】先述したように、同一の機能を有する蛋白
質であっても、種差や個体差によってアミノ酸配列や、
それをコードするＤＮＡの塩基配列に多様性が生じる事
がある。従って、本発明の第２の態様の新規ＤＮＡが有
する塩基配列には、それが本発明第１の態様の新規蛋白
質もしくはその一部をコードするＤＮＡである限り、前
記式９ないし１４いずれかの塩基配列中の任意の一つ以
上の塩基に変異が生じた塩基配列が含まれる。ここで、
「任意の１つ以上の塩基に変異が生じた」とは、塩基配
列中の任意の１箇所以上の塩基の置換、欠失、付加が生
じていることを意味する。もちろん、複数の位置で、塩
基の置換、欠失、付加が同時に生じていても良い。

【００３３】通常、同一の機能を有する蛋白質をコード
するＤＮＡの塩基配列は、動物種や個体が違っても、互
いにホモロジーを有していることが多い。従って、上記
「配列番号９ないし１４いずれかの塩基配列中の任意の
一つ以上の塩基に変異が生じた塩基配列」とは、前記式
９ないし１４より選択されるいずれかの塩基配列の少な
くとも一部とホモロジーのある配列、すなわち、前記式
９ないし１４より選択されるいずれかの塩基配列に相補
的な配列の少なくとも一部とハイブリダイズする塩基配
列を有するＤＮＡであることが好ましい。ここで「ハイ
ブリダイズする」とは、前記式９ないし１４のいずれか
の塩基配列に相補的な配列の一部をプローブとして、公
知の方法（例えば、サムブルック J.(Sambrook J.)等、
Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., 1
989 年、 Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨー
ク(New York)、参照）でハイブリダイゼーションを行っ
た場合にハイブリダイズすることをいう。

【００３４】本発明の第２の態様の新規ＤＮＡは、いか
なる方法で得られたＤＮＡであってもよい。すなわち、
前記式９ないし１４を参考にして化学合成されたもので
あってもよく、適当なＤＮＡライブラリーからクローニ
ングされたものであってもよい。配列表の配列番号１
５、１７および１８にヒト、ラット、マウスのＦａｓリ
ガンドに結合する蛋白質のｃＤＮＡ配列を示す。本発明
の新規ＤＮＡを化学合成するには、たとえば、次のよう
に行えばよい。すなわち、まず、前記式９ないし１４を
参考にして、所望の塩基配列を有するＤＮＡを約２０塩
基からなる断片に分けてＤＮＡ化学合成機（例えば、３
９４型、パーキンエルマージャパン（株）製）を用いて
合成し、その後、必要に応じて５’末端のリン酸化を行
い、各断片をアニーリングし、ライゲーションして目的
とするＤＮＡを得る。

【００３５】本発明の新規ＤＮＡをＤＮＡライブラリー
から得る例としては、適当なゲノムＤＮＡライブラリー
やｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションに
よるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリー
ニング法等でスクリーニングし、目的のＤＮＡを有する
クローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り
出す方法がある。ハイブリダイゼーション法によるスク
リーニングは、前記式９ないし１４のいずれかの塩基配
列もしくはその一部を有するＤＮＡを³²Ｐ等でラベルし
てプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーに対し
て、公知の方法で（例えば、マニアティス T.(Maniatis
T.)等，Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Co
ld Spring harbor Laboratory, ニューヨーク(New Yor
k), 1982年）行うことができる。イムノスクリーニング
法で用いる抗体は、後述する本発明第８の態様の抗体を
使用することができる。

【００３６】本発明の新規ＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡ
ライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とす
るＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction)によっても得る
事ができる。ＰＣＲは、前記式９ないし１４いずれかの
配列をもとに、センスプライマー、アンチセンスプライ
マーを作成し、任意のＤＮＡライブラリーに対し、公知
の方法（例えば、ミカエル A. I. (Michael A. I.)等，
PCR Protocols, a Guide toMethods and Applications,
アカデミック出版(Academic Press)、1990年参照）等
を行って、本発明の新規ＤＮＡを得る事もできる。

【００３７】上記各種方法で使用するＤＮＡライブラリ
ーは、本発明のＤＮＡを有するライブラリーであれば、
いかなるものも使用可能であり、市販のＤＮＡライブラ
リーを使用したり、適当な細胞から公知の方法（サムブ
ルック J.(Sambrook J.)等、Molecular Cloning, a Lab
oratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laborat
ory, ニューヨーク(New York), 1989年参照）に従っ
て、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、利用することがで
きる。ｃＤＮＡライブラリーを得るための細胞として
は、ヒト、ラット、マウスの末梢血や脾細胞から得たリ
ンパ球やＴ細胞系の株化細胞、ハイブリドーマ等が適し
ている。これらの細胞を、必要があれば、適当な活性化
剤で活性化させた後、上記の公知の方法でｃＤＮＡライ
ブラリーを作成すればよい。

【００３８】ＤＮＡの塩基配列が提供されれば、それに
相補的なＤＮＡの配列およびＲＮＡの配列が一義的に決
定されるので、本発明の開示により、本発明の第２の態
様のＤＮＡに対応するＲＮＡや、本発明の第２の態様の
ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡもまた提供され
る。本発明の第２の態様のＤＮＡは、１本鎖であって
も、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡと結合
して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該
ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲ
ＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物
質等で標識されていてもよい。

【００３９】本発明の新規ＤＮＡは、本発明第１の態様
の新規蛋白質を大量に生産するために使用することがで
きる。当該ＤＮＡを使用して本発明第１の態様の新規蛋
白質を生産させる方法の例は、本発明第６の態様で説明
する。当該ＤＮＡはまた、上述のように酵素等で標識し
て、組織における本発明第１の態様の新規蛋白質の発現
状況を検査するために使用することも可能である。当該
ＤＮＡを使用して細胞における本発明の第１の態様の新
規蛋白質の発現量を確認することにより、本発明第１の
態様の新規蛋白質の製造に適した細胞や細胞の培養条件
を決定することができる。また、本発明の新規ＤＮＡを
生体内の細胞に導入し、例えば、自己免疫疾患等の遺伝
的にアポトーシスの機構が欠損している疾患の遺伝子治
療にも使用する事ができる。さらに、本発明のＤＮＡが
有する塩基配列をもとにアンチセンス医薬品を開発し、
生体内におけるＦａｓリガンド発現を調節することもで
きる。すなわち、本発明のＤＮＡの一部や、その誘導体
を公知の方法で合成し、それらを使用してＦａｓリガン
ドの発現を調節したり、本発明のＤＮＡに相補的な配列
を含むオリゴヌクレオチドやその誘導体を使用して、Ｆ
ａｓリガンドの発現を調節することが可能である。アン
チセンス医薬品の技術については、本発明の第９の態様
の説明で詳述する。

【００４０】次に、本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ
分子について説明する。本発明の第３の態様の組換えＤ
ＮＡ分子は、上述した本発明の第２の態様の新規ＤＮＡ
を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子である。本発
明の組み換えＤＮＡ分子は、環状、直鎖状等いかなる形
態のものであってもよい。また、本発明の組換えＤＮＡ
分子は、いかなる用途に使用されるものであってもよ
い。例えば、本発明の第１の態様の新規蛋白質を産生さ
せる際に用いるものであってもよいし、本発明の第２の
態様のＤＮＡを増幅させ大量に得るために用いるもので
あってもよい。

【００４１】本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子
は、本発明の第２の態様の新規ＤＮＡに加え、必要なら
ば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列と
は、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、リボゾ
ーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される
塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他
のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配
列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーと
なる遺伝子の塩基配列等のことである。これらの塩基配
列の必要性は、組換えＤＮＡ分子の使用目的によって決
定されるが、本発明の組換えＤＮＡ分子は、本発明第２
の態様のＤＮＡに加えて、少なくとも、複製開始点およ
びマーカー遺伝子を有していることが好ましい。マーカ
ー遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキ
ナーゼ遺伝子等があげられる。

【００４２】当該組換えＤＮＡ分子は好ましい例は、例
えば、配列表の配列番号１６に示すように本発明第１の
態様の新規蛋白質であるヒトＦａｓリガンドを発現する
ように大腸菌を形質転換させうるものである。すなわ
ち、当該組換えＤＮＡ分子の好適な例は、少なくとも、
大腸菌複製開始点、マーカー遺伝子に加えて大腸菌内で
機能するプロモーター配列を有していることが好まし
い。また、これらに加え、少なくともシグナルペプチド
をコードする配列を有していることが好ましい。大腸菌
で機能するプロモーター配列の好適な例はｔｒｐプロモ
ーター、ｌａｃプロモーターであり、大腸菌で機能しう
るシグナルペプチドの好適な例は、大腸菌アルカリフォ
スファターゼのシグナルペプチドである。図１５に上記
配列番号１６に示す塩基配列によってコードされるアミ
ノ酸配列を示した。なお、図１５中でヒトＦａｓリガン
ドと異なるラットＦａｓリガンドのアミノ酸配列および
塩基配列を下線を付して示した。

【００４３】また、当該組換えＤＮＡ分子は、本発明の
新規蛋白質を発現するように酵母や昆虫細胞、動物細胞
等の真核細胞を形質転換させうるものであってもよい。
すなわち、当該組換えＤＮＡ分子は、少なくとも、マー
カー遺伝子に加えて、ポリＡ付加配列を有していること
が好ましい。これらに加えて、少なくとも、酵母で機能
するアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）１のプロモータ
ー、もしくは昆虫細胞で機能するポリヘドリンプロモー
ター、もしくは動物細胞で機能するＳＶ４０のプロモー
ターやＳＲαのプロモーター、ヒトエロンゲーションフ
ァクター１α（ FE1α）のプロモーター、もしくは大腸
菌での複製開始点を有するものも当該組換えＤＮＡ分子
の好適な例として挙げられる。

【００４４】本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子
は、本発明の第２の態様の新規ＤＮＡを任意の塩基配列
を有する他のＤＮＡ断片とライゲーションしたり、任意
のベクターに導入して得ることができる。ＤＮＡをベク
ターに導入する方法は公知である（サムブルック J.(Sa
mbrook J.)等、 Molecular Cloning, a Laboratory Man
ual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory，ニュー
ヨーク(New York)，1989年、参照）。すなわち、ＤＮＡ
とベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られ
たそれぞれの断片をＤＮＡリガーゼを用いてライゲーシ
ョンさせればよい。ベクターは、プラスミドベクター、
ファージベクター、ウイルスベクター等いかなるもので
もよい。たとえば、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２、ｐＳ
Ｖ２−ｄｈｆｒ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ＰＨＩ
Ｌ−Ｓ１、λＺａｐＩＩ、λｇｔ１０、ｐＡｃ７００、
ＹＲＰ１７、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＦＮ−ＩＩ等から適
宜選択して使用することができる。

【００４５】次に、本発明の第４の態様の形質転換体に
ついて説明する。本発明の第４の態様の形質転換体は、
本発明の第２の態様の新規ＤＮＡで形質転換されたこと
を特徴とする。すなわち、本発明第４の態様の形質転換
体は、宿主となる適当な細胞や微生物に、本発明第２の
態様の新規ＤＮＡを直接導入する事によって形質転換さ
れたことを特徴とする。本発明の第４の態様の新規ＤＮ
Ａを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレ
ーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン
酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイク
ロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の
公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック
1991年3月20日発行、羊土社、参照）があるがいずれの
方法を用いても構わない。本発明の形質転換体は、本発
明の第２の態様のＤＮＡ分子を大量に製造する目的でも
使用することができる。また、本発明の第２の態様のＤ
ＮＡが、宿主細胞の適当なプロモーターの下流に組み込
まれた場合には、当該形質転換体は、本発明第１の態様
の新規蛋白質を生産する。従って、このような形質転換
体は、本発明の第１の態様のＤＮＡがコードするアミノ
酸配列を有する蛋白質を製造する目的等に使用できる。

【００４６】次に、本発明の第５の態様の形質転換体に
ついて説明する。本発明第５の態様の形質転換体は、本
発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子を宿主となる細胞
や微生物に導入する事によって、形質転換されたことを
特徴とする。ただし、該組換えＤＮＡ分子の作成に使用
するベクターは、宿主細胞に適した種類のものである必
要がある。同様に、組換えＤＮＡ分子内に含まれるプロ
モター、シグナルペプチドをコードする塩基配列、マー
カー遺伝子等は、宿主細胞に適したものである必要があ
る。例えば、組換えＤＮＡ分子の作製に使用したベクタ
ーと宿主の好ましい組み合わせの例としては、ｐＵＣ１
１８と大腸菌、ｐＥＦ−ＢＯＳとＣＯＳ細胞あるいはＣ
ＨＯ細胞、Ｙａｃと酵母、ＡｃＮＰＶとＳｆ細胞等（実
験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック1991年 3月20
日発行、羊土社、参照）が挙げられる。ここで用いる組
換えＤＮＡ分子は、宿主細胞にあったものを使用する必
要がある。

【００４７】本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子を
宿主細胞に導入する方法としては、上記第４の態様の形
質転換体の作成方法と同様に、エレクトロポレーション
法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシ
ウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジ
ェクション法、ウイルス粒子を用いてインフェクション
させる方法、その他の公知方法（実験医学臨時増刊、遺
伝子工学ハンドブック1991年3 月20日発行、羊土社、参
照）が挙げられる。

【００４８】本発明の形質転換体は、原核細胞、真核細
胞のいずれであってもよい。原核細胞の代表的な例とし
ては、大腸菌と枯草菌があげられる。真核性物の代表的
な例としてはＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、
Ｎａｍａｌｗａ細胞等の哺乳動物細胞の他、Ｓｆ細胞等
の昆虫細胞や酵母等があげられる。しかしながら、本発
明の形質転換体は、好ましくは、大腸菌もしくは哺乳動
物細胞もしくは酵母を形質転換させたものである。動物
細胞の中では、遺伝子のコピー数を増加させることが可
能な、ＣＨＯ細胞のｄｈｆｒ欠損株が好ましい。また、
酵母については、外来蛋白質の分泌発現量が多いという
点で、ピヒア(Pichia)属の酵母が好ましい。

【００４９】本発明の形質転換体は、本発明第２の態様
の新規ＤＮＡを大量に得る目的や、本発明第１の態様の
新規蛋白質を生産するために使用することができる。当
該形質転換体は、いかなる目的で使用されるものであっ
てもよいが、好ましくは、当該形質転換体は、本発明の
新規蛋白質を産生するものがよく、より好ましくは、本
発明の新規蛋白質を培地中に分泌するものがよい。

【００５０】本発明の第１の態様の新規蛋白質を産生す
る形質転換体を得るためには、宿主細胞に導入する本発
明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子中には、少なくと
も、その宿主細胞で機能しうるプロモーター配列が含ま
れていることが必要である。そして、宿主細胞が大腸菌
等の原核生物細胞である場合には、組換えＤＮＡ分子に
はプロモーター配列に加え、複製開始点が含まれている
必要がある。また、宿主細胞が動物細胞等の真核細胞で
ある場合には、組換えＤＮＡ分子中には、プロモーター
配列に加え、ポリＡ付加サイト、複製開始点が含まれて
いることが必要である。なお、いずれの場合にも使用す
る組換えＤＮＡ分子には上述したマーカー遺伝子が含ま
れていることが好ましい。また、当該形質転換体が本発
明の第１の態様の新規蛋白質を発現し分泌するために
は、形質転換に使用する組換えＤＮＡ分子中には、上記
の産生に必要な配列に加えて、本発明の第２の態様のＤ
ＮＡの５’末端に、シグナルペプチドをコードする塩基
配列を有している必要がある。

【００５１】本発明の形質転換体のより好ましい例の一
つは、ベクターとして機能するＤＮＡ中に少なくとも、
複製開始点、大腸菌で機能するプロモーター、マーカー
遺伝子、大腸菌アルカリフォスファターゼ等のシグナル
ペプチドをコードする塩基配列、及び本発明第２の態様
の新規ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子で形質転換された
大腸菌である。他の好ましい例は、ベクターとして機能
するＤＮＡ中に少なくとも、マーカー遺伝子、ポリＡ付
加配列、哺乳動物細胞で機能するプロモーター、及び本
発明第２の態様のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子で形質
転換された哺乳動物細胞である。また、ベクターとして
機能するＤＮＡ中に少なくとも、ＡＯＸ１のプロモータ
ー、マーカー遺伝子、及び本発明の第２の態様のＤＮＡ
を含む組換えＤＮＡ分子で形質転換されたピチア(Pichi
a)属の酵母も本発明の形質転換体の好ましい例である。

【００５２】本発明第６の態様の製造方法は、それぞれ
本発明第４、第５の態様の形質転換体を使用することを
特徴とする本発明第１の態様の新規蛋白質の製造方法で
ある。形質転換体の作製方法については既に説明した通
りである。当該製造方法では、まず、本発明第４もしく
は第５の態様の形質転換体を培養し、必要に応じて、遺
伝子の増幅や発現誘導を行う。次に、培養混合物を回収
し、それらを材料として、必要に応じて濃縮、可溶化、
透析、各種クロマトグラフィー等の操作を行い、本発明
の第１の態様の新規蛋白質を精製する。当該製造方法で
使用する形質転換体は、いかなる細胞を形質転換したも
のであってもよい。しかしながら、好ましくは、ＣＨＯ
細胞等の哺乳動物細胞もしくは酵母、もしくは大腸菌の
いずれかより選択される細胞を宿主とした形質転換体で
あることが好ましい。

【００５３】形質転換体の培養は、一般的な方法で行う
ことができる。形質転換体の培養については各種の成書
（たとえば、「微生物実験法」社団法人日本生化学会
編、株式会社東京化学同人、1992年、参照）があるの
で、それらを参考にして行うことができる。また、遺伝
子の増幅や発現誘導の方法および必要性は、宿主となる
細胞の種類や、使用するプロモーターによって異なる。
例えば、プロモーターがｔｒｐプロモーターである時に
は３β−インドールアクリル酸で、ＭＭＴＶプロモータ
ーである場合にはデキサメサゾンで、ＡＯＸ１プロモー
ターであればメタノールで誘導することが可能である。
一方、遺伝子の増幅方法の例としては、宿主としてｄｈ
ｆｒ欠損のＣＨＯ細胞、ベクターとしてｄｈｆｒを有す
るベクターを使用した際のメソトレキセートを使用した
遺伝子の増幅方法がある。

【００５４】以下に、形質転換体として大腸菌、ＣＨＯ
細胞、ピチア（Pichia) 属酵母を使用した場合の培養お
よび発現誘導の例を示す。ｔｒｐプロモーターを有する
組換えＤＮＡ分子で形質転換された大腸菌では、Ｌ−ブ
ロース（L-Broth ）で菌体を前培養し、それをＭ９−Ｃ
Ａの培地に対して１／５０量となるように植え込み、３
７℃で培養を行う。培養開始数時間後に培地のＯＤ₅₅₀
値が１〜４（すなわち対数増殖期）に達した時点で３β
−インドールアクリル酸を終濃度１０μｇ／ｍｌとなる
ように添加し発現誘導を行う。さらに約１〜２日の培養
を行うことにより、目的蛋白質を含む培養混合物を得る
ことができる。ＡＯＸ１プロモーターを有する組換えＤ
ＮＡ分子で形質転換されたピヒア(Pichia)属の酵母を用
いる場合には、ＢＭＧＹ培地で約２日間前培養し、培地
交換後、メタノールを加えて発現誘導する。さらに、３
０℃で約２日間の培養を行い、目的蛋白質を含む培養混
合物を得ることができる。

【００５５】一方、エロンゲーションファクターのプロ
モーターを有する発現プラスミドが導入されたＣＨＯ細
胞等の哺乳動物細胞の形質転換体では、１０％ウシ胎児
血清を含有するＤＭＥＭ培地で培養する。細胞は、約５
×１０⁴ 細胞／ｍｌの濃度で植え込み、３７℃、５％炭
酸ガス／９５％空気の条件で培養を行う。通常、２〜３
日後にコンフルエントな状態になるので、その時点で培
地を、血清不含のＤＭＥＭに交換する。さらに引き続
き、２〜３日間の培養を行うことにより目的蛋白質を含
む培養混合物を得ることができる。なお、目的蛋白質の
産生量が少ない場合には前述したようにｄｈｆｒ遺伝子
欠損ＣＨＯ細胞を使用し、メソトレキセートにより遺伝
子を増幅し、産生量を増加させることも可能である。

【００５６】本発明第６の態様において、培養混合物と
は、培養上清もしくは細胞のライセートのことである。
すなわち、形質転換体が、当該蛋白質を細胞外に分泌す
る場合にはその培養上清を材料として、本発明の第１の
態様の新規蛋白質を回収、精製する。一方、当該新規蛋
白質が宿主細胞内に蓄積される場合には、リゾチーム、
界面活性剤、凍結融解、加圧等の手段を用いて細胞を破
砕した後、遠心分離して上清を回収し、濾過等により不
要な細胞断片等を取り除いた後に、それを材料として本
発明第１の態様の新規蛋白質を精製する。使用する形質
転換体が大腸菌であり、産生された当該新規蛋白質がペ
リプラズムに蓄積される場合は、ウィルスキー(Willsk
y) 等の方法（J. Bacteriol., 127巻、595-609 頁、197
6年）等が使用できる。

【００５７】培養混合物から本発明第１の態様の新規蛋
白質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用
されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行う
ことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点
沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマト
グラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマト
グラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィ
ー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィ
ーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る
方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰ
ＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良
い。

【００５８】当該製造方法において、本発明第１の態様
の新規蛋白質は、他の蛋白質との融合蛋白として形質転
換体に生産させてもよい。たとえば、大腸菌のβ−ガラ
クトシダーゼをコードするＤＮＡの下流に目的の蛋白質
をコードするＤＮＡを接続し、目的の蛋白質をβ−ガラ
クトシダーゼとの融合蛋白として発現させる方法は、高
い生産量が期待できることから一般に行われている方法
である。当該蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白として発
現させた場合には、精製工程のいずれかのステップにお
いて、融合蛋白質をブロムシアン等の化学物質やプロテ
アーゼ等の酵素で処理して当該蛋白質を切り出す操作が
必要になる。

【００５９】また、使用する形質転換体が大腸菌であっ
た場合に、当該蛋白質を不溶化蛋白であるインクルージ
ョンボディーとして産生させた場合には、精製の際に、
インクルージョンボディーを可溶化し、デネイチャー
し、リフォールディングするという操作を精製の適当な
ステップで行えばよい（トマス E. 及びクライトン J.
(Thomas E. and Creighton J.), Molecular Biology, 8
7巻, 563-577 頁, 1974年）。具体的には、まず、菌体
を破砕し、遠心分離してペレットを回収する。次に、尿
素もしくはグアニジン塩酸、界面活性剤、還元型グルタ
チオン、酸化型グルタチオンを適量含む可溶化バッファ
ー（たとえば、5Mグアニジン塩酸、0.005 ％Tween80 、
50mMトリス塩酸(pH8.0）、5mM EDTA、2mM 還元型グルタ
チオン、0.02mM酸化型グルタチオンを含む緩衝液）をペ
レットに加え、２−メルカプトエタノールを加えてデネ
イチャーし、上記可溶化バッファーからグアニジン塩酸
を取り除いた溶液に対して透析してリフォールディング
する。融合蛋白質として発現させている場合には、これ
らの操作の後で、ブロムシアン等の化学物質もしくはプ
ロテアーゼ等の酵素で不要な蛋白質部分を切断し、その
後、適当なクロマトグラフィーを行う。

【００６０】次に、本発明の第７の態様の精製方法を説
明する。本発明の第７の態様は、本発明第１の態様の新
規蛋白質を含有する試料中から本発明第１の態様の新規
蛋白質を精製する方法であって、少なくとも下記より選
ばれるいずれか１つ以上の工程を行う事を特徴とする。 （１）Ｆａｓ抗原を使用したアフィニティークロマトグ
ラフィー （２）本発明第１の態様の新規蛋白質を認識する抗体を
使用したアフィニティークロマトグラフィー

【００６１】当該精製方法は、上記（１）もしくは
（２）のいずれかのみを行うものであってもよく、
（１）および（２）の両方を行うものであってもよい。
また、他の精製方法と上記（１）もしくは（２）の少な
くとも１つを組合わせて行うものであってもよい。しか
しながら、好ましくは、蛋白質の精製方法として通常行
われている方法の前もしくは後に、上記（１）もしくは
（２）のいずれか一方、もしくは（１）および（２）の
両方の工程を任意の順序で行うものである。例えば、上
記（１）もしくは（２）の工程のいずれかに加え、レク
チンを吸着させた担体を使用したクロマトグラフィーを
行うだけで、本発明第１の態様の蛋白質を高純度で得る
ことができる。

【００６２】本発明第１の態様の新規蛋白質を含有する
試料とは、当該新規蛋白質を含有するものであれば、い
かなるものであってもよい。例えば、細胞の培養上清で
あっても、細胞のライセートであってもよく、尿や血液
等の体液であってもよい。上記（１）のアフィニティー
クロマトグラフィーを行うためには、Ｆａｓ抗原蛋白質
を適当な担体に吸着させる事が必要である。使用するＦ
ａｓ抗原はいかなる動物由来の物であってもよい。しか
しながら、精製しようとする目的の蛋白質が、前記式２
もしくは式６のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する
ものである場合にはヒトＦａｓ抗原を、前記式３もしく
は式７のアミノ酸配列の少なくとも一部を有するもので
ある場合にはラットＦａｓ抗原もしくはマウスＦａｓ抗
原を、前記式第４もしくは式８のアミノ酸配列の少なく
とも一部を有するものである場合にはマウスＦａｓ抗原
を、それぞれ使用する事が好ましい。

【００６３】Ｆａｓ抗原を吸着させる担体の種類は特に
限定されない。Ｆａｓ抗原を担体に結合させる場合に
は、Ｆａｓ抗原蛋白質を直接担体に結合させるか、スペ
ーサーを介して結合させる。また、Ｆａｓ抗原を他の蛋
白質との融合蛋白質として作製し、融合蛋白質中のＦａ
ｓ抗原以外の部分をそれと結合可能な担体に結合させ、
間接的に、Ｆａｓ抗原蛋白質を担体に結合させてもよ
い。例えば、Ｆａｓ抗原と免疫グロブリンの定常領域と
の融合蛋白質であれば、免疫グロブリンとプロテインＡ
が吸着する性質を利用して、プロテインＡが吸着したカ
ラムに該融合蛋白質を吸着させ、結果としてＦａｓ抗原
吸着担体を容易に得る事が可能になる。また、上記
（２）のアフィニティークロマトグラフィーを行うため
には、本発明第８の態様の新規抗体を使用することがで
きる。すなわち当該新規抗体をアガロース等の適当な担
体に直接、もしくはスペーサーを介して結合させ、これ
を、アフィニティークロマトグラフィー用カラムとして
使用する。なお、上述したレクチンを吸着させた担体の
好ましいものとしては、ＣｏｎＡを吸着させた担体があ
げられる。例えば、ＣｏｎＡをアガロース担体に吸着さ
せたものなどが市販されているのでそれらを適宜選択し
使用することが簡便である。

【００６４】上記（１）および（２）のアフィニティー
クロマトグラフィー及び、レクチンを吸着させた担体を
使用するアフィニティークロマトグラフィーは、蛋白質
の精製に使用される溶液を適宜選択して溶出液とし、溶
出された各画分中の本発明の第１の態様の新規蛋白質の
存在を確認しながら行えばよい。本発明第１の態様の新
規蛋白質の存在を確認するには、Ｆａｓ抗原を発現する
細胞に対する細胞障害活性を測定したり、本発明の第１
の態様の蛋白質を認識する抗体を使用したＥＩＡ等で確
認することができる。本発明の第１の態様の蛋白質を認
識する抗体については本発明第８の態様で説明する。

【００６５】次に、本発明の第８の態様の新規抗体につ
いて説明する。本発明の第８の態様の新規抗体は、本発
明の第１の態様の新規蛋白質に結合することを特徴とす
る。本発明の第８の態様の新規抗体は、本発明の第１の
態様の新規蛋白質と結合する限り、モノクローナル抗体
であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。

【００６６】抗体、すなわち、免疫グロブリンの構造は
Ｈ鎖とＬ鎖とからなり、物理化学的性質や免疫学的性質
は、５つのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，
ＩｇＥ）に分けられる。このうち、ＩｇＧ、ＩｇＡはさ
らにＨ鎖のタイプによって、サブクラスに分けられる。
本発明の新規抗体は、これらのいずれのクラス、サブク
ラスに属するものであってもよい。さらに、免疫グロブ
リンは例えばペプシンで分解すると、Ｆ（ａｂ’）₂ と
Ｆｃ’に別れ、パパインで分解するとＦａｂとＦｃの２
つのフラグメントに分かれる。本発明の抗体は、抗原と
結合するものであれば、完全な抗体分子でもその一部の
フラグメントでもよい。また、本発明の抗体はキメラ抗
体であってもよい。

【００６７】本発明の新規抗体は、それがポリクローナ
ル抗体であっても、モノクローナル抗体であっても、公
知方法を参考にして得ることができる（例えば、免疫実
験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参
照）。以下に簡単に説明する。当該新規抗体を得るに
は、まず動物に、免疫抗原として本発明の第１の態様の
新規蛋白質を必要に応じてフロイントの完全アジュバン
ト（ＦＣＡ）や不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の適切
なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週
間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い抗血
清を得る。抗原として用いる本発明の新規蛋白質が、そ
れが抗体の精製用に使用しうる精製度のものであればい
かなる方法で得られたものであってもよい。

【００６８】また、免疫抗原として、本発明の蛋白質全
体ではなく、その一部の１０〜２０アミノ酸からなるペ
プチドを合成し、当該ペプチドを、キーホールリンペッ
トヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結合させて使
用し、本発明の蛋白質と結合する抗体を選別してもよ
い。当該新規蛋白質で免疫する動物もいかなるものであ
っても良いが、好ましくは通常当業者で免疫学的な実験
に使用されるラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、
ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生
しうる動物種を選択して使用することが好ましい。ポリ
クローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによ
って得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の
公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。

【００６９】モノクローナル抗体を得るには以下のよう
に行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリ
ンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコ
ール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方
法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリド
ーマを作製する。その後、本発明の第１の態様の新規蛋
白質に結合する抗体を産生しているクローンを選択して
培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製する
ことによって得れば良い。精製は、塩析、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等の公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。

【００７０】また、遺伝子工学的な方法を用いても当該
新規抗体が得られる。すなわち、本発明第１の態様の新
規蛋白質で免疫した動物の脾細胞、リンパ球あるいは、
本発明第１の態様の新規蛋白質に対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、
これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作成する。抗原と
反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニング
し、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的と
する抗体を公知方法を組み合わせて精製することができ
る。

【００７１】本発明の新規抗体は、体液中や組織中に存
在する本発明の新規蛋白質を検出するために使用するこ
とができる。また、本発明の新規蛋白質を精製するため
に使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発
明の新規蛋白質を検出するために使用することができ
る。本発明の新規抗体は、細胞に対するＦａｓリガンド
の作用を修飾するものであってもよい。細胞に対するＦ
ａｓリガンドの作用を修飾する抗体の中で、特に好まし
くは、Ｆａｓリガンドが誘導するアポトーシスを抑制す
る効果を有するものである。当該抗体は、Ｆａｓリガン
ドが誘導するアポトーシスを完全に抑制するものであっ
てもよく、また、部分的に抑制するものであっても良
い。

【００７２】Ｆａｓリガンドが誘導するアポトーシスを
抑制する効果を有する抗体を得るには、前記ポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体を製造する過程で得
られる血清や、ハイブリドーマの培養上清を、例えば、
次のようなアッセイ系にかけてスクリーニングする。す
なわち、ＦａｓリガンドもしくはＦａｓリガンドを発現
する細胞と、Ｆａｓ抗原を発現する細胞とを使用したin
vitroのアッセイ系等である。スクリーニングの結果、
選別された血清や培養上清から公知方法を組み合わせて
目的の抗体を精製する。なお、Ｆａｓリガンドもしくは
Ｆａｓリガンドを発現する細胞とＦａｓ抗原を発現する
細胞を利用したスクリーニング方法の好ましい例は、本
発明第１０の態様で説明する。Ｆａｓリガンドが誘導す
るアポトーシスを、完全に、又は、部分的に抑制するこ
とができる抗体は、生体におけるアポトーシスを調節す
るために使用することができる。たとえば、当該抗体は
リウマチにおける関節組織の破壊、全身性エリテマトー
デス（ＳＬＥ）における自己組織の破壊、あるいは糖尿
病、インフルエンザ、エイズ、肝炎等の組織や細胞のア
ポトーシスが関与する疾患の治療薬として使用すること
ができる。

【００７３】次に本発明第９の態様を説明する。本発明
第９の態様は、Ｆａｓリガンド遺伝子の一部もしくはＦ
ａｓリガンドに対するｍＲＮＡの一部に相補的な塩基配
列を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドまたはオ
リゴヌクレオチド誘導体である。当該オリゴヌクレオチ
ドおよびオリゴヌクレオチド誘導体には、その塩基配列
として、前記相補的な塩基配列のみを有する物、前記相
補的な塩基配列に加えて、リボザイム配列等、他の塩基
や塩基配列を有する物のいずれもが含まれる。ここで、
「Ｆａｓリガンド遺伝子」とは、Ｆａｓリガンドをコー
ドするＤＮＡを含む遺伝子のことであり、Ｆａｓリガン
ドをコードする領域に加え、その制御領域を含むもので
ある。制御領域は、Ｆａｓリガンドをコードする領域の
上流に存在するもの、下流に存在するものいずれをも意
味する。「Ｆａｓリガンドに対するｍＲＮＡ」とは、Ｆ
ａｓリガンドをコードする塩基配列を含むｍＲＮＡであ
る。当該ｍＲＮＡには、Ｆａｓリガンドをコードする塩
基配列に加え、その上流および下流のノンコーディング
領域を含むものも含まれる。

【００７４】Ｆａｓリガンドをコードする染色体ＤＮＡ
は、図１６〜１８に示したように、イントロン部位とエ
クソン部位とからなることがわかっている。イントロン
とエクソンからなるＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際に
は、まず、イントロンとエクソンとがそのまま転写され
てｐｒｅ−ｍＲＮＡとなり、その後スプライシングを受
けて、イントロンに対応する部分が削除され、エクソン
部分のみが転写された成熟ｍＲＮＡとなる。ここでいう
「Ｆａｓリガンドに対するｍＲＮＡ」には、ｐｒｅ−ｍ
ＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡのいずれもが含まれる。また、
「Ｆａｓリガンド遺伝子の一部もしくはＦａｓリガンド
に対するｍＲＮＡの一部」とは、それらがコーディング
領域であるか否かに関わらず、また、イントロン部位、
エクソン部位に関わらず、Ｆａｓリガンド遺伝子もしく
はＦａｓリガンドに対するｍＲＮＡに含まれるいかなる
部分をも意味する。

【００７５】なお、本発明の第９の態様において「Ｆａ
ｓリガンド」はいかなる動物種由来のＦａｓリガンドで
あってもよいが、好ましくは、ヒト、ラット、マウスい
ずれかに由来するＦａｓリガンドである。診断薬や医薬
品への応用を考えると、特に好ましくは、ヒトＦａｓリ
ガンドである。ヒトＦａｓリガンド遺伝子のコーディン
グ領域付近の塩基配列は図１６〜１８に示してある。ま
た、ヒトＦａｓリガンド、ラットＦａｓリガンド、マウ
スＦａｓリガンドをコードするＤＮＡの塩基配列はそれ
ぞれ配列番号１７、１５、１８に示してある。上記各Ｆ
ａｓリガンドに対する各成熟ｍＲＮＡの塩基配列は、配
列番号１７、１５、１８に示された塩基配列中のＴをＵ
に読み変えた配列である。

【００７６】「相補的な塩基配列」とは、ＤＮＡやｍＲ
ＮＡの塩基配列に対して塩基特異的に相補的塩基対を形
成するような塩基配列をいう。一般的には、Ｃ（シトシ
ン）とＧ（グアニン）の間、Ｔ（チミン）とＡ（アデニ
ン）の間、およびＵ（ウラシル）とＡ（アデニン）との
間で相補的塩基対が形成されることが知られている。し
たがって、ヒトＦａｓリガンド遺伝子に相補的な塩基配
列、およびヒトＦａｓリガンド、ラットＦａｓリガン
ド、マウスＦａｓリガンドに対する各成熟ｍＲＮＡに相
補的な塩基配列は、それぞれ、図１６〜１８、配列番号
１７、１５、１８に示した塩基配列中のＡに対してＴ、
Ｃに対してＧ、Ｇに対してＣ、Ｔに対してＡを対応させ
た配列、もしくはＡに対してＵ、Ｃに対してＧ、Ｇに対
してＣ、Ｔに対してＡを対応させた配列を含むものであ
る。なお、「相補的な塩基配列」にはＣ、Ｇ、Ａ、Ｔ、
Ｕからなる塩基配列のみならず、これら塩基の誘導体を
含む塩基配列も含まれる。

【００７７】本発明のオリゴヌクレオチドには、塩基、
リン酸、糖からなるヌクレオチドが複数結合したもの全
てが含まれる。その代表的な物はＤＮＡとＲＮＡであ
る。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体には、その立体
構造や機能がオリゴヌクレオチドと類似するものすべて
が含まれる。たとえば、オリゴヌクレオチドの３’末端
もしくは５’末端に他の物質が結合した物や、オリゴヌ
クレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか１
つにおいて、置換や、修飾が生じた物質、天然には存在
しないような、塩基、糖、リン酸を有する物や、糖−リ
ン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有するもの等で
ある。

【００７８】本発明第９の態様のオリゴヌクレオチドお
よびオリゴヌクレオチド誘導体は、Ｆａｓリガンド遺伝
子の一部もしくはＦａｓリガンドに対するｍＲＮＡの一
部に相補的な塩基配列を有し、これらの遺伝子やｍＲＮ
Ａにハイブリダイズするものが好ましい。特に好ましく
は、少なくともヒトＦａｓリガンド遺伝子もしくはヒト
Ｆａｓリガンドに対するｍＲＮＡにハイブリダイズする
ものである。Ｆａｓリガンド遺伝子もしくはＦａｓリガ
ンドに対するｍＲＮＡにハイブリダイズするようなオリ
ゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体は、組
織や細胞におけるＦａｓリガンド遺伝子の存在やその発
現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロー
ブとして使用することができる。さらに、これらのオリ
ゴヌクレオチドおよびその誘導体は、Ｆａｓリガンド遺
伝子もしくはｍＲＮＡにハイブリダイズして、Ｆａｓリ
ガンドの発現を促進もしくは抑制することが期待される
ので、Ｆａｓリガンドの発現を調節し、Ｆａｓリガンド
によって誘導されるアポトーシスが関与する疾患の治療
薬として使用することができる。

【００７９】本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチド誘導体は、Ｆａｓリガンド遺伝子もしくは
Ｆａｓリガンドに対するｍＲＮＡにハイブリダイズし、
Ｆａｓリガンドの発現を調節する活性を有するものが好
ましく、特に好ましくは、Ｆａｓリガンドの発現を抑制
するものである。すでに述べたように、エイズや肝炎に
おける細胞死はＦａｓ抗原を介したアポトーシスである
と考えられている。したがって、Ｆａｓリガンドの発現
を抑制するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ド誘導体は、エイズ、肝炎をはじめ、リウマチにおける
関節組織の破壊、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に
おける自己組織の破壊、糖尿病、インフルエンザ等のＦ
ａｓリガンドを介したアポトーシスが関与する疾患の治
療薬として使用することができる。一方、Ｆａｓリガン
ドの発現を促進するものは、エイズ感染初期の治療や、
リウマチにおける滑膜細胞の異常増殖や自己免疫疾患に
おける自己抗原反応性Ｔ細胞の増殖を抑制するため等、
生体にとって不要な細胞を除去するために使用できる。

【００８０】蛋白質をコードするＤＮＡやｍＲＮＡに相
補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを使用して、
その蛋白質の発現を調節する方法は、アンチセンス法と
呼ばれており、現在多くの研究者によって研究が進めら
れている技術である。相補的な配列を有するオリゴヌク
レオチドは、遺伝子からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段
階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッ
シング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段階のい
ずれかで、遺伝子情報を担うＤＮＡもしくはｍＲＮＡに
結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋
白質の発現を調節すると考えられている。

【００８１】本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチド誘導体は、Ｆａｓリガンド遺伝子もしくは
ｍＲＮＡのいかなる部分にハイブリダイズする物であっ
てもよい。ハイブリダイズのし易さの点では、一般的に
は、ステム・ループを形成しているｍＲＮＡのループ部
分を狙うとよいとされている（東海林洋子、臨床免疫、
25巻、1200−1206頁、1993年）。また、翻訳開始コドン
付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプラ
イス部位に結合するようなオリゴヌクレオチド、すなわ
ち、これらの部位の配列に相補的な配列を有するオリゴ
ヌクレオチドは、一般に高い発現抑制効果が期待できる
ものと考えられているので（癌と化学療法、20巻、13
号、1899−1907頁）、本発明のオリゴヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチド誘導体が、Ｆａｓリガンド遺伝子
もしくはｍＲＮＡの翻訳開始コドン付近、リボソーム結
合部位、キャッピング部位、スプライス部位に結合する
もの、すなわち、これらの部位に相補的な配列を含むも
のであれば、高い発現抑制効果が期待される。

【００８２】本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチド誘導体は、診断や医薬用途として使用する
ことを考慮すると、Ｆａｓリガンド遺伝子もしくはｍＲ
ＮＡと、特異的にハイブリダイズするものが好ましい。
一般的には、１５塩基以上の塩基を含む塩基配列であれ
ば、特異性のある配列であると考えられている（横山一
成、蛋白質 核酸 酵素、38巻、754 〜765 頁、1994
年）。したがって、当該オリゴヌクレオチドおよびオリ
ゴヌクレオチド誘導体も、Ｆａｓリガンド遺伝子もしく
はＦａｓリガンドに対するｍＲＮＡに相補的な塩基配列
であって１５塩基以上からなる塩基配列を含むものであ
れば、Ｆａｓリガンド遺伝子もしくはＦａｓリガンドに
対するｍＲＮＡに特異的に結合することが期待される。

【００８３】一方、オリゴヌクレオチドを細胞内に取り
込ませるには、その長さはあまり長すぎても不適当であ
る。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドおよびオ
リゴヌクレオチド誘導体を細胞内に取り込ませ、Ｆａｓ
リガンドの発現を調節させる場合には、当該オリゴヌク
レオチドおよびこれらオリゴヌクレオチドの誘導体はＦ
ａｓリガンド遺伝子もしくはＦａｓリガンドに対するｍ
ＲＮＡに相補的な１５塩基以上３０塩基以下の相補的な
塩基配列を有するものが好ましい。

【００８４】アンチセンス技術の進歩とともに、オリゴ
ヌクレオチドの医薬品としての効果を高めることを目的
として様々な誘導体が見いだされてきた。現在、目的の
ＤＮＡやｍＲＮＡとの結合力、組織選択性、細胞透過
性、ヌクレアーゼ耐性、細胞内安定性の高い様々なオリ
ゴヌクレオチド誘導体が得られている。前述のように、
本発明の「オリゴヌクレオチド誘導体」には、天然には
存在しないような、塩基、糖、リン酸、バックボーン構
造からなるものも含めて、あらゆる種類の誘導体が含ま
れる。

【００８５】現在一般に知られている誘導体の例として
は、バックボーン構造として、その全部または一部にフ
ォスフォジエステル（phosphodiester）結合、フォスフ
ォロチオエート（phosphorothioate）結合、フォスフォ
トリエステル（phosphotriester ）結合、メチルフォス
フォネート（methylphosphonate ）結合、フォスフォロ
アミデート（phosphoroamidate）結合、フォスフォロジ
チオエート(phosphorodithioate)結合、モルホリノ基を
有する物等（東海林 洋子等、癌と化学療法、20巻、18
99−1907頁、1993年）があげられる。また、ポリアミド
−核酸（ＰＮＡ）（P.E.ニールセン（P.E.Nielsen ）
等、Science 、254 巻、1497−1500頁、1991年）や、糖
の２’位が、他の原子あるいは置換基に置換されたも
の、α−リボース等、糖部分を修飾したものも誘導体の
例として挙げられる（ミカエル J. ゲート(Michael J.
Gait), 290-299頁; in Antisense Research and Applic
ations, CRC 出版、フロリダ、1993年）。

【００８６】さらに、糖部分が他の物質に置換されたも
の、一部の塩基がイノシン（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇのいずれに
でも結合するユニバーサル塩基と呼ばれる）に置換され
た物、オリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端
もしくは内部にコレステロールやアクリジン、ポリ−Ｌ
−リジン、ソラレン、長鎖アルキル等が結合したもの等
も、オリゴヌクレオチド誘導体の例として知られている
（マコト マツクラ(Makoto Matsukura),506-519頁およ
びポール S. ミラー(Paul S. Miller)等、190-202 頁;
in Antisense Research and Applications, CRC 出版、
フロリダ、1993年）。本発明のオリゴヌクレオチド誘導
体は、上に例示した誘導体をはじめとしていかなる誘導
体であってもよい。しかしながら、当該誘導体は、ヌク
レアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少な
くとも１つが高められた誘導体であることが好ましい。
特に好ましくは、当該オリゴヌクレオチド誘導体は、フ
ォスフォロチオエート結合をバックボーン構造として有
する誘導体である。

【００８７】以下に、本発明のオリゴヌクレオチドおよ
びオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法を説明する。オ
リゴヌクレオチドやその誘導体は、公知方法で製造する
ことができる（例えば、スタンレー Ｔ．クルーク(Sta
nley T. Crooke) およびベルナルド レブロー(Bernald
Lebleu)編、in Antisense Research and Application
s, CRC 出版、フロリダ、1993年）。天然のＤＮＡやＲ
ＮＡであれば、目的とする本発明のオリゴヌクレオチド
配列の５’末端、３’末端に相補的な配列をもつセンス
プライマー、アンチセンスプライマーを化学合成し、Ｆ
ａｓリガンド遺伝子もしくはＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ
法により本発明のオリゴヌクレオチドを得ることができ
る。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチ
オエート型等、誘導体の中には、化学合成機（たとえば
パーキンエルマージャパン（株）製、３９４型）を使用
して合成できるものもある。この場合には、化学合成機
に添付されたマニュアルに従って操作を行い、得られた
合成産物を逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ
法により精製することによっても、目的のオリゴヌクレ
オチドもしくはオリゴヌクレオチド誘導体を得ることが
できる。最近では、注文に応じてオリゴヌクレオチドの
合成を請け負う企業も増えており、それらの企業に委託
してもよい。

【００８８】次に、本発明のオリゴヌクレオチドおよび
オリゴヌクレオチド誘導体の利用方法について説明す
る。本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオ
チド誘導体を診断用のプローブとして使用する場合に
は、それらを、公知の方法に従い、ラジオアイソトープ
や、酵素、蛍光物質、発光物質等で標識する。次に、Ｆ
ａｓリガンドの発現を調べたい患者の細胞からＤＮＡも
しくはｍＲＮＡを公知方法で調製し、これを被検物質と
して、前記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄し
て未反応の前記標識プローブを除去する。被検物質中
に、Ｆａｓリガンド遺伝子もしくはＲＮＡが含まれてい
れば、当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ド誘導体はそれらと結合する。結合形成の有無は、標識
した酵素、蛍光物質、発光物質、あるいは放射性同位元
素等を指標として知ることができる。

【００８９】近年、Ｆａｓリガンドの発現と自己免疫疾
患の関係等が報告されているので、本発明のオリゴヌク
レオチドを使用した診断プローブは、たとえば、リウマ
チやＳＬＥ等の自己免疫疾患等の診断に利用することが
できる。また、炎症時のＴ細胞による細胞障害にもＦａ
ｓリガンドが関係していると考えられるので、炎症の程
度や治療方法を決定するための診断にも使用することが
できる。本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチド誘導体を医薬用途に使用する場合には、医薬品
として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許
容されうる使用方法で使用することが好ましい。本発明
第９の態様のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ
チド誘導体は、それらを直接適当な溶媒に溶解もしくは
懸濁して使用してもよいし、リポソーム中に封入した
り、適当なベクターに組み込んだ形にして使用してもよ
い。また、必要に応じて、本発明のオリゴヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチド誘導体に薬理学的に許容され
得る補助成分を添加し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点
眼剤、クリーム剤、座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤
型にして使用してもよい。薬理学的に許容され得る補助
成分とは、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦
形剤、緩衝剤等のことである。

【００９０】本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチド誘導体は、患者の年齢や、性別、疾患の種
類、程度に応じて、その投与方法、その投与量を設定し
て使用することができる。すなわち、アポトーシスを調
節し、病態を改善するのに適した量を、経口的に、ある
いは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、
直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投
与、腹腔内投与等、非経口的に、適当な方法を選んで投
与すればよい。

【００９１】以下に、本発明第１０の態様のスクリーニ
ング方法について説明する。本発明の第１０の態様のス
クリーニング方法は、ＦａｓリガンドもしくはＦａｓリ
ガンドを発現するように形質転換した形質転換体を使用
することを特徴とする。本発明のスクリーニング方法で
使用するＦａｓリガンドは、いかなる動物種に由来する
物であってもよいが、好ましくは、ヒト、ラット、マウ
スより選ばれるいずれかの動物種のＦａｓリガンド、す
なわち、前記式２ないし４もしくは６ないし８のいずれ
かのアミノ酸配列を有するＦａｓリガンドである。より
好ましくは、ヒトＦａｓリガンドである。ところで、Ｆ
ａｓリガンドは細胞表面上に存在する膜型蛋白質である
ため、Ｆａｓ抗原等の他分子と結合する領域は細胞外領
域であると考えられる。したがって本発明のスクリーニ
ング方法においては、上記Ｆａｓリガンドの細胞外領域
部分が好適に使用できる。当該スクリーニング方法で使
用するＦａｓリガンドは、本発明第６の態様の説明に示
した方法で得ることができる。また、Ｆａｓリガンドを
発現する形質転換体は本発明第５の態様で説明した方法
で得ることができる。

【００９２】本発明第１０の態様のスクリーニング方法
を使用すれば、Ｆａｓリガンドに結合する物質やＦａｓ
リガンドの発現を調節する物質をスクリーニングするこ
とができる。ここでいう物質には、化合物、ペプチド、
蛋白質、抗体、核酸などすべての物質が含まれる。ま
た、これらのスクリーニング方法を使用して、Ｆａｓリ
ガンドが関与する疾患の診断を行うことも可能である。
例えば、自己免疫疾患の患者より血球細胞や組織由来の
細胞を分離し、ＦａｓリガンドもしくはＦａｓリガンド
を発現する形質転換体と反応させ、患者から分離した細
胞に生じるアポトーシスの程度を観察することにより、
その患者のＦａｓ抗原の機能もしくは発現に異常がある
かないかを診断することができる。そして、その診断結
果を参考に、原因に応じた治療を選択することができ
る。

【００９３】本発明のスクリーニング方法では、好まし
くは、ＦａｓリガンドまたはＦａｓリガンドを発現する
形質転換体に加え、Ｆａｓ抗原を発現する細胞を使用す
ることが好ましい。この方法を使用すれば、Ｆａｓリガ
ンドに結合する物質、Ｆａｓリガンドの発現を促進もし
くは抑制する物質に加え、Ｆａｓ抗原の発現を促進もし
くは抑制する物質等、Ｆａｓリガンドの細胞への作用に
影響を与える物質をスクリーニングすることができる。
Ｆａｓリガンドの細胞に対する作用の代表的なものはア
ポトーシスの誘導であるが、当該スクリーニング方法
は、アポトーシスを促進したり抑制したりする物質の他
にも、Ｆａｓリガンド存在下でＦａｓ抗原発現細胞に生
じる何らかの変化を促進したり抑制したりする物質のス
クリーニングにも適している。

【００９４】当該スクリーニング方法は、好ましくは、
下記（１）ないし（３）より選ばれるいずれかの工程を
含むものである。すなわち、 （１）ａ．ＦａｓリガンドもしくはＦａｓリガンドを発
現する形質転換体とＦａｓ抗原を発現する細胞とを共培
養する。 ｂ．ａに被験物質もしくは被験物質を含む試料を添加す
る。 ｃ．Ｆａｓ抗原を発現する細胞の生死、形態的変化もし
くは生化学的変化のうち少なくともいずれか１つを測定
する。 （２）ａ．被験物質もしくは被験物質を含む試料をＦａ
ｓリガンドもしくはＦａｓリガンドを発現する形質転換
体とインキュベートする。 ｂ．ａにＦａｓ抗原を発現する細胞を加えて、培養す
る。 ｃ．Ｆａｓ抗原を発現する細胞の生死、形態的変化もし
くは生化学的変化のうち少なくともいずれか１つを測定
する。 （３）ａ．被験物質もしくは被験物質を含む試料をＦａ
ｓ抗原を発現する細胞とインキュベートする。 ｂ．ａに、ＦａｓリガンドもしくはＦａｓリガンドを発
現する形質転換体を加えて培養する。 ｃ．Ｆａｓ抗原を発現する細胞の生死、形態的変化もし
くは生化学的変化のうち少なくともいずれか１つを測定
する。

【００９５】Ｆａｓ抗原を発現する細胞の形態的変化も
しくは生化学的変化を測定する方法は、その変化を検出
できる方法であれば特に限定されない。Ｆａｓ抗原を発
現する細胞のアポトーシスの有無やその程度を測定する
のであれば、Ｆａｓ抗原を発現する細胞にあらかじめ取
り込ませた⁵¹Ｃｒの放出量から測定することができる。
また、トリパンブルーを用いた染色や、ホルマザンの生
成を指標としたアッセイ（ＭＴＴアッセイ、アルマール
ブルーアッセイ等）を行って、Ｆａｓ抗原を発現する細
胞のうち生き残った細胞数を測定してもよい。

【００９６】なお、Ｆａｓ抗原を発現する細胞はいかな
る細胞であってもよい。たとえば、エイズウイルス感染
細胞のようにウイルスや薬物によってＦａｓ抗原の発現
が誘導された細胞でもよいし、Ｆａｓ抗原を発現する株
化細胞やハイブリドーマ、形質転換体であってもよい。
好ましくは、ヒトＦａｓ抗原を発現する細胞であり、特
に、ヒトＦａｓ抗原を発現する形質転換体、たとえば、
ＷＣ８細胞（イトウ N. (Itoh N.) 等、J. Immunol., 1
51巻、621-627 頁、1993年）を使用するのが好ましい。

【００９７】

【実施例】以下に、実施例をもって本発明を一層具体的
に説明するが、これらは一例として示すものであり、本
発明はこれらにより何等限定されるものではない。ま
た、以下の記載において用いる略号は、当該分野におけ
る慣用略号に基づくものである。なお、以下に示す実施
例中の諸操作は、主にサムブルック等編〔モレキュラー
クローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版〕
コールドスプリングハーバーラボラトリー，1989年；今
本文男等編〔組換え遺伝子の細胞への導入と発現〕蛋白
質核酸酵素臨時増刊28（14）1983年；岡田善雄監修〔細
胞工学的技術総集編〕実験医学臨時増刊７（13）1989年
等を参考として実施した。

【００９８】（実施例１）キメラ蛋白質の調製 （１）発現プラスミドｐＦａｓ−ＦｃIIの調製 実施例２で使用する、マウスＦａｓ（ｍＦａｓ）抗原の
細胞外領域とヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）のＦｃ領域と
を結合させたキメラ蛋白質（以下ｍＦａｓ−Ｆｃと称す
る）の発現プラスミドを以下の方法で作製した。まず、
配列表の配列番号１９〜２０に示すマウスＦａｓ抗原染
色体遺伝子のイントロン４のセンス配列（ＧＡＴＴＴＴ
ＣＡＡＣＣＡＣＴＣＡＧＴＣＧ）を含むオリゴヌクレオ
チドプライマー１と、イントロン５のアンチセンス配列
（ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＴＧＴＡＴ
ＧＡＡＡＴＴＧＡＧＴＡＡＴ）を含むオリゴヌクレオチ
ドプライマー２を化学合成した。後者のオリゴヌクレオ
チドプライマーには配列表の配列番号２１に示すＢａｍ
ＨＩサイトを付加してある。これらのオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いて、マウスＦａｓ抗原染色体遺伝子
を含むプラスミド（ｐＭＦ３ＥＳ，1992年度、分子生物
学会）を鋳型にしてＰＣＲを行った。その結果、エクソ
ン５の５’末端および３’末端にフランキングリージョ
ンを有する、３８３ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。

【００９９】得られた増幅産物をＰｓｔＩとＢａｍＨＩ
で消化し、エクソン５の３’末端とイントロン５の一部
を含む１２８ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。得られ
たＤＮＡフラグメントでプラスミドｐＭＦ１（ワタナベ
−フクナガ(Watanabe-Fukunaga R.)等、J. Immunol. 14
8 巻、1274-1279 頁、1992年）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ
ＤＮＡフラグメント部分を置き換え、プラスミドｐＭＦ
Ｘを作製した。一方、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に対す
るエクソンを有するプラスミドｐＭＨ４（ニシムラＹ．
(Nishimura Y.)等、Cancer Res., 47巻、999-1005頁、
1987年）をＨａｅIIで消化し、得られた１．７ｋｂｐの
ＤＮＡフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ
（＋）のＸｂａＩサイトにサブクローニングした。

【０１００】これをＨｉｎｃIIおよびＡｐａＩで消化
し、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードする
エクソンを含む１．４ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを得
た。このフラグメントを前述のプラスミドｐＭＦＸのＸ
ｂａＩサイトに挿入し、プラスミドｐＦＡＳ−Ｆｃを作
製した。プラスミドｐＦＡＳ−ＦｃをＫｐｎＩで切断
後、平滑化しＮｏｔＩで消化し、得られた２．３ｋｂｐ
のＤＮＡフラグメントを、哺乳動物発現ベクターｐＥＦ
ＢＯＳ（ミズシマ S.(Mizushima S.) およびナガタS.(N
agata S.)、Nucleic Acids Res., 18巻、5332頁、1990
年）にライゲートして、目的とする発現プラスミドｐＦ
ＡＳ−ＦｃIIを得た。

【０１０１】（２）発現プラスミドｈＴＮＦＲβ−Ｆｃ
の作製 実施例２で使用する、ＴＮＦレセプターβとヒトＩｇＧ
１のＦｃ領域キメラ蛋白質（以下、ｈＴＮＦＲβ−Ｆｃ
と称する）の発現プラスミドｐｈＴＮＦＲβ−Ｆｃを以
下のように構築した。まず、プラスミドｐ５５ＴＮＦｒ
−ＨＧ１（レオスツシャー H.(Leostscher H.)等、J. B
iol. Chem., 266 巻、18324-18329 頁、1991年）をＫｐ
ｎＩとＨｉｎｄIII で消化し、６５０ｂｐのＤＮＡフラ
グメントを調製した。プラスミドｐ５５ＴＮＦｒ−ＨＧ
１は、人工的スプライスドナー配列（artificial splic
e donor sequence）に続くヒトＴＮＦレセプター（ｐ５
５）の細胞外領域をコードするｃＤＮＡ配列を含むプラ
スミドである。

【０１０２】一方、プラスミドｐＦＡＳ−ＦｃIIをＨｉ
ｎｃIIおよびＨｉｎｄIII で消化した。マウスＦａｓ抗
原の細胞外領域をコードする配列を含む約７００ｂｐの
ＤＮＡフラグメントを、前述の６５０ｂｐのＫｐｎＩ−
ＨｉｎｄIII フラグメントと入れ換え、目的とするプラ
スミドｐｈＴＮＦＲβ−Ｆｃを得た。

【０１０３】（３）発現プラスミドｐＢＦ−Ｆｃ１の調
製 実施例１０で使用する、ヒトＦａｓ抗原の細胞外領域と
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域キメラ蛋白質（以下、ｈＦａｓ
−Ｆｃと称する）の発現プラスミドｐＢＦ−Ｆｃ１を以
下のように構築した。まず、ヒトＦａｓ抗原をコードす
るＤＮＡ（イトウ N.(Itoh N.)等、Cell, 66巻、233-24
3 頁、1991年）を含むプラスミドｐＢＬＦ５８−１をＸ
ｈｏＩとＢａｍＨＩで消化し、７００ｂｐの断片を得
た。次にキメラ蛋白質ｍＦａｓ−Ｆｃの発現ベクター構
築に用いたｐＦａｓ−ＦｃをＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで消
化し、先述の７００ｂｐの断片を挿入した（ｐＢＨＦ−
Ｃ１）。

【０１０４】一方、ｐＢＬＦ５８−１を鋳型とし、配列
表の配列番号２２に示すセンスプライマー１（ＡＴＧＣ
ＣＣＡＡＧＴＧＡＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴ）と配列表
の配列番号２３に示すアンチセンスプライマー１（ＧＣ
ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴ
ＴＡＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＡＣＴＴＧＧＴＧ）を
使用してＰＣＲを行い、ヒトＦａｓ抗原の細胞外領域
に、マウスＦａｓ抗原染色体遺伝子のイントロン５の配
列、ＢａｍＨＩサイトを付加した断片を調製した。この
ＰＣＲ産物をＭｓｃＩとＢａｍＨＩで消化し、得られた
３６０ｂｐのＤＮＡ断片をＭｓｃＩとＢａｍＨＩで消化
したｐＢＨＦ−Ｃ１に挿入した。ついで、形成されたプ
ラスミドをＫｐｎＩで切断後、平滑化し、ＮｏｔＩで消
化し、ヒトＦａｓ、ヒトＩｇをコードするＤＮＡ断片を
得た。この断片を、ＢｓｔＸＩで切断後平滑化し、かつ
ＮｏｔＩで切断したｐＥＦ−ＢＯＳに挿入し、ヒトＦａ
ｓ−Ｆｃ発現ベクターｐＢＦ−Ｆｃ１を得た。

【０１０５】（４）キメラ蛋白質の生産と精製 プラスミドｐＦａｓ−ＦｃIIおよびｐｈＴＮＦＲβ−Ｆ
ｃでそれぞれＣＯＳ−７細胞、ＢＴＳ−１細胞を（セデ
ィビー J. M.(Sedivy J. M.), Biol. Technology, 6
巻、1192-1196 頁、1993年）を形質転換させた。また、
プラスミドｐＢＦ−Ｆｃ１でＣＯＳ−７細胞を形質転換
させた。ＣＯＳ−７細胞の形質転換は、フクナガ R. (F
ukunaga R.) らが報告したＤＥＡＥ−デキストラン法で
行った（フクナガ R.(Fukunaga R.)等、Cell, 61巻、34
1-350 頁、1990年）。形質転換の後、ＣＯＳ−７細胞
を、１０％のＦＣＳを含む培地中で２４時間インキュベ
ートし、さらに、血清不含の培地中で４８時間および７
２時間インキュベートした。インキュベート後の培養上
清液を集め、遠心分離操作を行った後、０．４５μｍの
フィルターを通して細胞の破砕物を除き、プロテインＡ
−セファロース４Ｂカラム（ファルマシア社製）クロマ
トグラフィーにより、キメラ蛋白質ｍＦａｓ−Ｆｃ、ｈ
ＴＮＦＲβ−Ｆｃ、ｈＦａｓ−Ｆｃをそれぞれ精製し
た。

【０１０６】一方、ＢＴＳ−１の形質転換は、エレクト
ロポレーション（ポッター H.(Potter H.)等、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 81巻、7161-7165 頁、1984年）に
よって行った。すなわち、プラスミドｐＦａｓ−ＦｃII
をＡｐａＬＩで、プラスミドｐｈＴＮＦＲβ−ＦｃをＳ
ａｃＩで消化した後、各々のプラスミドＤＮＡ５０μｇ
をそれぞれ、ＸｈｏＩで切断したｐＳＴｎｅｏＢ５μｇ
とともに、１×１０⁷個の細胞を形質転換した。１０％
ＦＣＳと３００μｇ／ｍｌのＧ−４１８とを含むＤＭＥ
Ｍで１０日間選択を行った後、Ｇ−４１８耐性クローン
を分離し、３９．５℃で増殖させた。

【０１０７】目的とするキメラ蛋白質を生産するクロー
ンを同定するため、クローンの一部を３３℃で３日間培
養し、培地中に分泌されたキメラ蛋白質を、酵素免疫法
（ＥＬＩＳＡ）で検定した。検定に使用したＥＬＩＳＡ
では、捕獲抗体として抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（カッペ
ル 55071）を、検出抗体として西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（ジャクソン研究所、
109 −035098）を用いた。ｍＦａｓ−ＦｃおよびｈＴＮ
ＦＲβ−Ｆｃを効率的に生産する形質転換体を一つず
つ、３９．５℃で増殖させた後、１５ｃｍプレートに５
０％コンフルエントとなるように植え込んだ。３３℃で
１週間培養したのち、培養上清からｍＦａｓ−Ｆｃとｈ
ＴＮＦＲβ−ＦｃをプロテインＡ−セファロース４Ｂカ
ラム（ファルマシア社製）クロマトグラフィーにより、
精製した。精製後のｍＦａｓ−ＦｃをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で分析したところ、還元下で分子量５５ｋＤの位置にバ
ンドが認められ、非還元下においては、分子量１１０ｋ
Ｄの位置にバンドが認められた。これは、得られたキメ
ラ蛋白ｍＦａｓ−Ｆｃが、Ｓ−Ｓ結合によるホモダイマ
ーとして存在していることを示している。

【０１０８】（実施例２）フローサイトメトリーによる
解析およびｄ１０Ｓ−２細胞株の選択 （１）キメラ蛋白質のビオチン化およびＦＩＴＣ標識 スルホサクシニミジル ６−（ビオチンアミド）ヘキサ
ノエート（NHS −LC−ビオチン、ピアス社製、21335 ）
を用い、その操作手順書に従って、ｍＦａｓ−Ｆｃおよ
びｈＴＮＦＲβ−Ｆｃとをビオチン化した。また、１ｍ
ｇのｈＴＮＦＲβ−Ｆｃと２０μｇのＦＩＴＣとを、１
ｍｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）中
で混合し、室温で４時間反応させた後、未結合のＦＩＴ
ＣをセファデックスＧ−２５Ｍを用いたカラムクロマト
グラフィーで除去し、ＦＩＴＣ標識ｈＴＮＦＲβ−Ｆｃ
を得た。

【０１０９】（２）フローサイトメトリー ＰＣ６０−ｄ１０Ｓ細胞（以下、d10Sと略す。ルービエ
E.(Rouvier E.) 等、J. Exp. Med., 177 巻、195-200
頁、1993年）を染色用溶液（２％FCS と0.02％NaN₃とを
含むリン酸緩衝生理食塩水( 以下、PBS と略す）) を用
いて洗浄した。約１×１０⁶ 細胞を、５μｇ／ｍｌのラ
ット抗マウスＦｃγＲIIブロッキング抗体（ファーミジ
ェン社製）を含む染色用溶液５０μｌに懸濁した。これ
を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、氷上で１０
分間インキュベーションした。５０μｌの２０μｇ／ｍ
ｌビオチン化ｍＦａｓ−Ｆｃを各ウェルに加え、氷上で
さらに３０分間インキュベーションした。染色用溶液で
洗浄の後、フィコエリスリン標識ストレプトアビジン
（２５倍希釈、ベクトン−ディッキンソン社製）を加
え、さらに染色用溶液を加えて１００μｌとし、氷上で
３０分間反応させた。

【０１１０】細胞を染色用溶液で洗浄した後、ＦＡＣＳ
ｃａｎ（ベクトン−ディッキンソン社製）を用いたフロ
ーサイトメリーによって解析を行った。この結果を図１
ａに示す。対照は白抜部分として、またＰＭＡとイオノ
マイシンで４時間処理する前に染色したものを影付され
た部分として、さらに、ＰＭＡとイオノマイシンで４時
間処理した後に染色したものを着色部分で表した。その
結果、蛍光強度のわずかなシフトが認められ、当該細胞
がビオチン化ｍＦａｓ−Ｆｃで染色された事が確認され
た。一方、ｄ１０Ｓ細胞を、ビオチン化ｈＴＮＦβ−Ｆ
ｃで同様に染色し、フローサイトメトリーで分析したと
ころ、染色は認められなかった。これらの結果、実施例
１で調製したｍＦａｓ−Ｆｃは、ｄ１０Ｓ細胞上のＦａ
ｓリガンドに特異的に結合することが確認された。

【０１１１】（３）ｄ１０Ｓ−２細胞株の選択 （２）で、高い蛍光活性が認められたｄ１０Ｓ細胞、１
〜３×１０⁷ 個に、前述の方法でビオチン化ｍＦａｓ−
ＦｃおよびＦＩＴＣ標識ヒトＴＮＦＲβ−Ｆｃを反応さ
せ、次いで、フィコエリスリン標識ストレプトアビジン
で染色し、ＦＡＣＳｔａｒ（ベクトン−ディッキンソン
社製）でソーティングした。フィコエリスリン蛍光を高
いレベル（上位０．３〜０．５％）で発する細胞を集
め、１０％ＦＣＳと５０ｎＭの２−メルカプトエタノー
ルを含むダルベッコ変法イーグルＭＥＭ（Dulbecco's M
odified Eagle Medium，以下Ｄ−ＭＥＭと略す）で増殖
させた。得られた細胞に対し、上記操作を更に繰り返し
た結果、選択された細胞群をｄ１０Ｓ−２と名づけた。
ｄ１０Ｓ−２について、ｄ１０Ｓと同様にフローサイト
メトリーを行った結果を図１ｂに示す。このｄ１０Ｓ−
２は、刺激剤存在下、非存在下両方において、高いＦａ
ｓリガンド発現量を示す細胞が極めて濃縮された細胞群
である。

【０１１２】（実施例３）ｃＤＮＡライブラリーの構築 実施例２で得られたｄ１０Ｓ−２細胞を１０％ＦＣＳを
含むＤ−ＭＥＭ中で２×１０⁵ 細胞／ｍｌまで増殖さ
せ、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡと１μｇ／ｍｌのイオノマ
イシンで３７℃、３時間刺激した。グアニジンイソチオ
シアネート／アシッドフェノール法（コムシンスキー
P.(Chomczynski P.) およびサシー N.(Sacchi N.), Ana
l. Biochem., 162 巻、156-159 頁、1987年）によって
総ＲＮＡを分離した後、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカ
ラムクロマトグラフィーを２回繰り返しポリ（Ａ）ＲＮ
Ａを選択的に分離した。ランダムヘキサマーあるいはオ
リゴ（ｄＴ）プライマーを用い、イトウ N.(Itoh N.)
等、（Cell, 66巻、233-243 頁、1991年）の方法で２本
鎖ｃＤＮＡを合成した。

【０１１３】得られた２本鎖ｃＤＮＡにＢｓｔＸＩアダ
プターを付加し、１％アガロースゲルを用いた電気泳動
で分子量分画を行った。１．５ｋｂｐ以上の大きさのｃ
ＤＮＡを回収し、ＢｓｔＸＩで切断したｐＣＥＶ４ベク
ター（イトウ N. (Itoh N.)等、Cell, 66巻，233-243
頁、1991年）にライゲートした。ライゲートプロダクト
を使用し、エレクトロポレーション（ドワー W.(Dower
W.) 等、Nucleic Acids Res., 16巻、6127-6145 頁、19
88年）により大腸菌 ＤＨ１０Ｂ細胞（ギブコ BRL(Gib
co BRL) 社製）を形質転換した。オリゴ（ｄＴ）でプラ
イムさせたｃＤＮＡライブラリーから得た約１．０×１
０⁶ 個の独立したクローンと、ランダムヘキサマーでプ
ライムさせたｃＤＮＡライブラリーから得た約１．３×
１０⁶ 個のクローンとを混合し、プラスミドＤＮＡを調
製して、ＣＯＳ−７細胞の形質転換に使用した。

【０１１４】（実施例４）パンニング操作によるｃＤＮ
Ａクローンの濃縮 実施例３で得られたプラスミドＤＮＡでエレクトロポレ
ーション法により、ＣＯＳ−７細胞を形質転換した。す
なわち、５×１０⁶ 個のＣＯＳ−７細胞をＫ−ＰＢＳ^-
（30.8mM NaCl, 120.7mM KCl, 8.1mM Na₂HPO₄ および1.
46mM KH₂PO₄ を含む緩衝液）で洗浄し、０．４ｍｌの５
ｍＭ ＭｇＣｌ₂ を添加したＫ−ＰＢＳ（Ｋ−ＰＢ
Ｓ⁺ ）に細胞を懸濁した。次に、０．４ｍｌのＫ−ＰＢ
Ｓ⁺ に４０μｇのプラスミドＤＮＡを溶解し、それを細
胞懸濁液に加え、氷上で１０分間インキュベーションし
た。細胞に９６０μＦのキャパシタンスで２３０Ｖの電
圧かけエレクトロポレーションし、氷上で１０〜１５分
間インキュベーションした後、細胞懸濁液５ｍｌを血清
無添加の冷Ｄ−ＭＥＭで希釈し、さらに室温で３０分間
インキュベーションした。その後、この細胞を２つの１
０ｃｍプレートに植え込み、１０％ＦＣＳを含むＤ−Ｍ
ＥＭ中で３７℃で６０時間培養した。

【０１１５】以上の方法で、総数１．２×１０⁸ 個のＣ
ＯＳ−７細胞を形質転換し、１０ｃｍプレートで培養し
た。１プレートあたり５ｍｌの０．５ｍＭ ＥＤＴＡお
よび０．０２％ＮａＮ₃ を含むＰＢＳ（PBS/EDTA/Na
N₃ ）を加え、３７℃で３０分間インキュベーション
し、プレートよりこれらの細胞を剥した。剥した細胞
を、３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび２．５μｇ／ｍｌの抗
マウスＦｃγIIレセプター抗体とを含むＰＢＳ／ＥＤＴ
Ａ／ＮａＮ₃ に５〜７×１０⁶ 個／ｍｌの細胞濃度で再
度懸濁した。氷上で１０分間インキュベーションした
後、ｍＦａｓ−Ｆｃを終濃度が４μｇ／ｍｌになるよう
に加え、氷上で６０分間インキュベーションした。この
細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、５０ｍＭヘペス緩衝液
（ｐＨ８．３）および０．２ｍＭビス（スルホサクシニ
ミドイル）スベレート（ＢＳ³ 、ピアス社製）とを含む
ＰＢＳ中に５〜７×１０⁶ 個／ｍｌの細胞濃度になるよ
う浮遊した。

【０１１６】氷上で３０分間インキュベーションしたの
ち、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を終濃度が
５０ｍＭとなるよう添加し、さらに氷上で１０分間イン
キュベーションした。ＰＢＳで洗浄したのち、細胞を３
ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加したＰＢＳ／ＥＤＴＡ／Ｎａ
Ｎ₃ ３０ｍｌに懸濁し、ナイロンメッシュ（ポアサイズ
１００μｍ）で濾過を行い凝集物を取り除いた。この細
胞懸濁液を、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（カッペル 5507
1）を固定化した３０個の１０ｃｍパンニング用プレー
トに分配した。室温で２時間インキュベーションしたの
ち、ＰＢＳで穏やかに洗浄することにより非付着細胞を
取り除き、イトウ N.(Itoh N.)等の方法で染色体外ＤＮ
Ａを付着細胞から抽出し（Cell, 66巻、233-243 頁、19
90年）。以上の１回目のパンニング操作で得られたＤＮ
Ａを用い、エレクトロポレーションにより大腸菌を形質
転換させ、４．１×１０⁶ 個のコロニーを得た。これら
よりプラスミドＤＮＡを調製し、９．６×１０⁷ 個のＣ
ＯＳ−７細胞（６０プレート）を形質転換した。

【０１１７】これをパンニング用プレート３０枚に分配
して２回目のパンニングを行い、１回目と同様に付着細
胞からＤＮＡを調製した。回収したプラスミドＤＮＡを
用い大腸菌を形質転換し、８．０×１０⁶ 個のクローン
を得た。これらよりプラスミドＤＮＡを調製し、４．０
×１０⁷ 個のＣＯＳ−７細胞（１０プレート）を形質転
換した。これをパンニング用プレート３０枚に分配して
３回目のパンニングを行った。１回目、２回目と同様に
付着細胞からプラスミドＤＮＡを回収し、大腸菌を形質
転換させ、３．８×１０⁶ 個のクローンを得た。これら
より調製したプラスミドＤＮＡで１．０×１０⁷ 個のＣ
ＯＳ−７細胞（２５プレート）を形質転換し、１０枚の
パンニング用プレートに分配して、４回目のパンニング
操作を行った。

【０１１８】以上の４回目のパンニング操作を終了した
後、ＣＯＳ−７細胞から染色体外ＤＮＡを調製し、大腸
菌を形質転換させた。各菌体クローンより、プラスミド
ＤＮＡを調製して解析したところ、４８クローン中１６
クローンが、１. ０ｋｂｐ以上のインサートを有してい
た。これらのプラスミドＤＮＡをそれぞれＣＯＳ−７細
胞に導入した後、ＣＯＳ−７細胞をビオチン化ｍＦａｓ
−Ｆｃで染色し、実施例２の方法でフローサイトメトリ
ーを行った。その結果、５つのクローンが染色された。
この５クローンのうちの１つで、１．６ｋｂｐのインサ
ートをもつクローン、ｐＴＮ２４−１５で形質転換させ
たＣＯＳ−７細胞（ＣＯＳ／ｐＴＮ２４−１５）の結果
を図１ｃに示した。このｐＴＮ２４−１５で形質転換さ
せたＣＯＳ−７細胞はビオチン化ｈＴＮＦβ−Ｆｃで
は、染色されなかった。また、外来遺伝子を含まないｐ
ＣＥＶ４で形質転換させたＣＯＳ−７細胞はビオチン化
ｍＦａｓ−Ｆｃで染色されなかった。

【０１１９】（実施例５）ＤＮＡ配列の決定およびその
解析 実施例４で得られた５クローンについて制限酵素マッピ
ングをしたところ、それらが互いにオーバーラップして
いることがわかった。そこで、この５クローンのうちの
１つ、ｐＴＮ２４−１５をさらに詳しく解析した。ＤＮ
Ａ配列の決定はＤＮＡシーケンサー（３７０Ａ型、パー
キンエルマージャパン（株）製）とTaqダイ デオキシ
サイクル シーケンシング キット（Taq Dye Deoxy
cycle sequencing kit，パーキンエルマージャパン
（株）製）を使用して行った。クローンｐＴＮ２４−１
５の塩基配列と、それから推定したアミノ酸配列を図
２、３と、配列表の配列番号１５に示した。このｃＤＮ
Ａは、１６２３塩基から成り、１つのオープンリーディ
ングフレームを有していた。

【０１２０】また、この配列中には、配列表の配列番号
２４に示すコザック M. （Kozak M., J. Cell Biol., 1
15巻、887-903 頁、1991年）によって提唱された配列
（ＣＣＡ／ＧＣＣＡＴＧＧ）は認められなかったが、翻
訳開始部位は塩基番号７４〜７６に位置するＡＴＧと考
えられた。このオープンリーディングフレームは、９０
８〜９１０の終止コドンＴＡＡで終わっている。そし
て、このｃＤＮＡは、２７８アミノ酸をコードすること
がわかった。アミノ酸配列から推定される分子量は３
１，１３８であり、等電点は９. ５３である。

【０１２１】このｃＤＮＡがコードする２７８アミノ酸
のうちＮ末端側の７７アミノ酸は、極めてプロリンに富
んだ配列であった。Ｎ末端付近に典型的なシグナル配列
は確認できなかったが、ヒドロパシー分析（Hydropathy
Analysis ）により、Ｆａｓリガンドは、プロリンリッ
チな領域に続いて、おそらくトランスメンブランアンカ
ーとして機能すると考えられる２２個の疎水性アミノ酸
を有することがわかった。シグナル配列が欠如してお
り、内部に疎水性ドメインを有する構造から、Ｆａｓリ
ガンドはII型のトランスメンブレン蛋白質であることが
示唆された。細胞外領域として推定される領域はＣ末端
側に存在し、１７９アミノ酸から成り、４つのＮ−グリ
コシレーションサイト（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）
を含むことが確認された。これらのグリコシレーション
サイトは、図２、図３中に＊で示した。

【０１２２】ｃＤＮＡライブラリー作成に使用したｄ１
０Ｓ−２細胞は、ラットとマウスのハイブリドーマであ
る。ＦａｓリガンドｃＤＮＡの由来を決定するために、
ＦａｓリガンドｃＤＮＡの３’末端ノンコーディング領
域からプライマーを設計、合成し、ラットとマウスの脾
臓細胞から得た染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行っ
た。すなわち、配列表の配列番号１５の塩基番号１００
６〜１０２５、１３０５〜１３２４をセンスプライマー
２および３（配列表の配列番号２５および２６）とし、
配列表の配列番号１５の１３２７〜１３４６および１５
４３〜１５６２をアンチセンスプライマー２および３
（配列表の配列番号２７および２８）として用いた。そ
の結果、ラット染色体ＤＮＡでのみ、サイズ３４１ｂｐ
と２５８ｂｐのバンドが得られた。これらの結果は、ク
ローンｐＴＮ２４−１５より得られたｃＤＮＡがｄ１０
Ｓハイブリドーマ細胞のラット遺伝子に由来することを
示している。なお、ハナハン等の方法(Hanahan D. 著、
Techniques for Transformation ofE. coli, In DNA Cl
oning, vol.1, グローバー D. M.(Glover D. M.)編、10
9-136 頁、IRL 出版(IRL Press), 1985 年) を用いて、
上記ｐＴＮ２４−１５で大腸菌を形質転換させ、得られ
た形質転換体ＤＨ１０Ｂ（ｐＴＮ２４−１５）を工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託している（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３９５３）。

【０１２３】（実施例６）ノーザンハイブリダイゼーシ
ョン ファルマシアのｍＲＮＡ分離キットを用い、ｄ１０Ｓ、
ｄ１０Ｓ−２、ラット各組織（脳、肺、心臓、肝臓、小
腸、腎臓、卵巣、精巣、骨格筋）および細胞（脾細胞、
胸腺細胞）からポリ（Ａ）ＲＮＡを調製した。５０％ホ
ルムアミド中で６５℃で５分間加熱しＲＮＡを変性さ
せ、６．６％のホルマリンを含む１．５％アガロースゲ
ルで電気泳動を行い、ニトロセルロースあるいはナイロ
ン膜（シュライヒャー アンド シュエル(Schleicher
and Schuell)社）に転写させた。

【０１２４】プローブとして、実施例４で得られたｐＴ
Ｎ２４−１５の４３〜９６７のＤＮＡ配列（配列表の配
列番号２９）を含む９２０ｂｐの２本鎖ＤＮＡフラグメ
ントをＰＣＲにより調製し、ランダムプライマーラベリ
ングキット（ベーリンガーマンハイム社製）によって³²
Ｐ標識した。ヒトＥＦ１αのｃＤＮＡ（ウエツキ T.( U
etsuki T. 等、 J. Biol. Chem., 264巻、5791-5798
頁、1989年）の１．８ｋｂの長さを有するＢａｍＨＩフ
ラグメントの³²Ｐ標識物を、コントロールプローブとし
て使用した。ハイブリダイゼーション操作は、ハイスト
リンジェンシー（high stringency ）の条件下でサムブ
ルック J. （Sambrook J. ）らの方法（Molecular Clon
ing: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Har
bor Laboratory, ニューヨーク(New York), 1989年）を
用いた。

【０１２５】図４には、ｄ１０Ｓ、ｄ１０Ｓ−２、ｄ１
０Ｓ−１６各細胞をｐＭＡとイオノマイシンで刺激した
場合と刺激しない場合の、ノーザンハイブリダイゼーシ
ョンの結果を示した。図４から明らかなように、ｄ１０
Ｓから得たポリ（Ａ）ＲＮＡは、約２. ０ｋｂの弱いハ
イブリダイゼーションバンドを示した。このバンドのシ
グナルの強さは、ＰＭＡやイオノマイシンでｄ１０Ｓ細
胞を刺激すると増加する。ｄ１０Ｓ−２細胞は、ＰＭＡ
とイオノマイシンで刺激したｄ１０Ｓよりも約４倍強い
シグナルを示し、ｄ１０Ｓ−２細胞ではＦａｓリガンド
ｍＲＮＡの発現量がｄ１０Ｓ細胞よりも、約４倍高いこ
とが示唆された。また、実施例２の操作を１６回繰り返
して得たｄ１０Ｓ−１６細胞では、ｍＲＮＡ発現量はｄ
１０Ｓ細胞よりも約１００倍多かった。ｄ１０Ｓ−１６
の細胞障害活性は、ｄ１０Ｓ細胞より１００倍高く、Ｆ
ａｓリガンドｍＲＮＡ発現量の増加は、細胞障害活性、
ｍＦａｓ−Ｆｃで染色される強さと正の相関関係にある
事が分かった。

【０１２６】図５には、ラットの脾臓および胸腺より調
製した脾細胞、胸腺細胞の調製直後（培養前）、刺激剤
なしで３７℃で８時間培養後（未処理）、各刺激剤を加
えて３７℃で８時間培養後のノーザンハイブリダイゼー
ションの結果を示した。ラットの脾細胞では、Ｆａｓリ
ガンドｍＲＮＡの弱い発現が認められた。ラット脾細胞
をＰＭＡとイオノマイシン、もしくはＣｏｎＡとＩＬ−
２で８時間刺激した時、ＦａｓリガンドｍＲＮＡの量は
著しく増加した。ラット胸腺細胞では、培養前及び未処
理の場合ＦａｓリガンドｍＲＮＡは、ほとんど発現して
いなかった。しかしながら、ラット胸腺細胞をＰＭＡと
イオノマイシン、もしくはＣｏｎＡとＩＬ−２で刺激す
ると、ＦａｓリガンドｍＲＮＡの発現量は、脾細胞にお
けるそれと同等にまで増加した（図５）。

【０１２７】ラットの各組織におけるＦａｓリガンドｍ
ＲＮＡの発現量を調べた結果を図６に示す。図６に示し
たように、精巣に於いて約２．０ｋｂの強いシグナルを
有するバンドが確認された。小腸、腎臓、肺では、普通
もしくは弱いシグナルを有するバンドが確認されたが、
その他の組織ではＦａｓリガンドｍＲＮＡの発現は認め
られなかった。なお、すべてのｍＲＮＡがインタクト
（intact）であることは、ヒトＥＦ１αのｃＤＮＡプロ
ーブと再ハイブリダイゼーションした全ての細胞および
組織において、１. ８ｋｂのバンドが認められたことか
ら明らかである（図４、５および６の下段）。

【０１２８】（実施例７）Ｆａｓリガンドの生化学的解
析 ｄ１０Ｓ−１２細胞で発現しているＦａｓリガンド及び
ｐＴＮ２４−１５で形質転換させたＣＯＳ−７細胞で発
現しているＦａｓリガンドの生化学的性状を検討した。
ｄ１０Ｓ−１２細胞は、実施例２の操作を１２回繰り返
して得られた細胞集団である。まず、ｄ１０Ｓ−１２あ
るいはｐＴＮ２４−１５で形質転換させたＣＯＳ−７細
胞の細胞表面蛋白質をＤ−ビオチニル−ε−アミノカプ
ロン酸 Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（biotin
-CNHS-ester 、ベーリンガーマンハイム社製）用いるマ
イヤー（Meier ）らの方法でビオチン化した（Anal. Bi
ochem.,204 巻、220-226 頁、1992年）。なお、ｐＴＮ
２４−１５で形質転換させたＣＯＳ−７細胞の対照とし
て、外来遺伝子を含まないｐＣＥＶ４ベクターで形質転
換させたＣＯＳ−７細胞を用いた。細胞（７．５×１０
⁶ 個）を１ｍｌのライシスバッファー（１％NP−40、50
mMトリス−塩酸緩衝液（以下、50mM Tris-HCl と略す、
pH 8.0）、150mM NaCl、１mM（ｐ−アミノフェニル）メ
チルスルホニルフロライド塩酸塩（APMSF ）、１μｇ／
ｍｌペプスタチンおよび１mMロイペプチンを含む）中に
加え氷上で３０分間インキュベーションし、細胞を溶解
させた。

【０１２９】１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心操作を
行った後、上清を１０μｇ／ｍｌのｈＴＮＦＲβ−Ｆｃ
と氷上で６０分間インキュベーションし、さらに５％液
量のプロテインＡ−セファロース４Ｂと、４℃で６０分
間インキュベーションした。プロテインＡ−セファロー
ス４Ｂを除去したのち、上清に１０μｇ／ｍｌのマウス
Ｆａｓ−Ｆｃを加え、氷上で６０分間インキュベーショ
ンした。１％液量のプロテインＡ−セファロース４Ｂを
この混合物に加え、４℃で一夜インキュベーションし
た。遠心操作の後、沈降物をライシスバッファーで洗浄
し、５％の２−メルカプトエタノールを含む２０μｌの
ラエムリ(Laemmli) の試料用緩衝液（２％SDS 、10％グ
リセリンおよび0.002 ％ブロモフェノールブルーを含む
62.5mM Tris-HCl(pH6.3)）に再懸濁し、９５℃で２分間
加熱した。次いで、０．１％ＳＤＳを含む１０−２０％
グラジエントポリアクリルアミドゲルを用いてグラジエ
ントゲル電気泳動を行い、ＰＶＤＦ膜へ転写し、ＥＣＬ
システム（アマーシャム社製）で検出した。

【０１３０】図７に、ｍＦａｓとｄ１０Ｓ−１２、Ｃｏ
ｓ７／ｐＣＥＶ４またはＣｏｓ７／ｐＴＮ２４−１５と
の免疫沈降の結果を示す。図７に示したように、ｍＦａ
ｓ−Ｆｃは、ｄ１０Ｓ−１２細胞ライセート中の分子量
約４０，０００の蛋白質と免疫沈降し、一方、ｐＴＮ２
４−１５で形質転換させたＣＯＳ−７細胞（ＣＯＳ７／
ｐＴＮ２４−１５）からのライセート中では分子量約３
７，０００−４５，０００の蛋白質とともに免疫沈降し
た。外来遺伝子を含まないｐＣＥＶ４ベクターで形質転
換させたＣＯＳ−７細胞（ＣＯＳ７／ｐＣＥＶ４）で
は、免疫沈降物は認められなかった。ｐＴＮ２４−１５
で形質転換させたＣＯＳ−７細胞とｄ１０Ｓ−１２細胞
で免疫沈降した蛋白質の分子量は、いずれも前述したア
ミノ酸配列より推定される分子量よりも大きかった。こ
れら２つの細胞間での分子量の差、およびアミノ酸配列
から推定される分子量との差は、４つあるＮ−グリコシ
レーションサイトのいくつかにおいてグリコシレーショ
ンに違いが生じているためと考えられた。

【０１３１】（実施例８）Ｆａｓリガンドの細胞障害活
性の測定 （１）エフェクター細胞による細胞障害活性の測定 ｄ１０Ｓ細胞およびｐＴＮ２４−１５で形質転換させた
ＣＯＳ−７細胞の、細胞障害活性を、マウスＷ４細胞を
ターゲット細胞として測定した。マウスＷ４細胞は、Ｆ
ａｓ抗原を発現させるようにマウスＷＲ１９Ｌ細胞を形
質転換させた細胞である。このＷＲ１９Ｌ細胞は、Ｆａ
ｓ抗原を殆んど発現せず、ＴＮＦの細胞障害作用に感受
性の細胞である。細胞障害活性の検定は、ルービエ E.
（Rouvier E.）等の方法に準じて行った（J. Exp. Me
d., 177 巻、195-200 頁、1993年）。まず、ｄ１０Ｓ細
胞（２．５〜５×１０⁵ 細胞／ｍｌ）を、１０ｎｇ／ｍ
ｌのＰＭＡ（シグマ社製）およびカルシウムイオノフォ
アであるイオノマイシン（カルビオケム社製）５００ｎ
ｇ／ｍｌが添加された１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ中
で、３７℃で３時間インキュベーションした後、Ｄ−Ｍ
ＥＭで洗浄し、エフェクター細胞とした。また、ＣＯＳ
−７細胞をｐＴＮ２４−１５でＤＥＡＥ−デキストラン
法で形質転換し、エフェクター細胞とした。一方、１０
０μｌの１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で、２
０μＣｉの［⁵¹Ｃｒ］クロム酸ナトリウム（アマーシャ
ム社製）と共に１×１０⁶ 個のＷＲ１９Ｌ細胞あるいは
Ｗ４細胞を３７℃で２時間インキュベートした。培養液
（RPMI1640）で洗浄した後、これらの細胞を標的細胞と
して使用した。ｄ１０Ｓをエフェクター細胞とし、Ｗ１
９ＬまたはＷ４を標的細胞としたときの特異的細胞障害
活性を図８に示した。また、エフェクター細胞をＣＯＳ
／ｐＴＮ２４−１５としたときの特異的細胞障害活性を
図９に示した。

【０１３２】標的細胞１×１０⁴ 個とエフェクター細胞
とを、さまざまな比で丸底のマイクロタイタープレート
の各ウェル中で混合した。このとき全液量が計２００μ
ｌになるようにした。７００ｒｐｍで２分間、プレート
の遠心操作を行ったのち、３７℃で４時間インキュベー
ションした。さらに、１，２００ｒｐｍで５分間、プレ
ートの遠心操作を行い、各ウェルより上清１００μｌを
分取してγカウンターを用いて放射活性を測定し、特異
的細胞溶解率を算出した。⁵¹Ｃｒの自然放出は、培地の
みで標的細胞をインキュベーションすることにより決定
し、一方、最大放出量は、標的細胞に０．１％となるよ
うにトライトンＸ１００を加えることにより決定した。
また、特異的細胞溶解率は次の式により計算した。

【０１３３】図９に示したように、ｐＴＮ２４−１５で
形質転換させたＣＯＳ−７細胞（ＣＯＳ／ｐＴＮ２４−
１５）は、Ｗ４細胞を溶解させたが、外来遺伝子を含ま
ないｐＣＥＶ４ベクターで形質転換させたＣＯＳ−７細
胞（ＣＯＳ／ｐＣＥＶ４）では、Ｗ４細胞の溶解は認め
られなかった。ｐＴＮ２４−１５で形質転換させたＣＯ
Ｓ−７細胞（ＣＯＳ／ｐＴＮ２４−１５）と、ｄ１０Ｓ
細胞の細胞障害活性を、Ｗ４細胞に対するＥ／Ｔ（エフ
ェクター細胞／標的細胞）比で比較すると、前者は後者
に比べ少なくとも１０倍高い活性を有していた。また、
ｄ１０Ｓ細胞およびｐＴＮ２４−１５で形質転換させた
ＣＯＳ−７細胞（ＣＯＳ／ｐＴＮ２４−１５）は、とも
にＷＲ１９Ｌ細胞に対しては細胞障害作用を示さなかっ
た（図８、９）。

【０１３４】（２）細胞の培養上清の添加による細胞障
害活性の検討 図１０に、ＣＯＳ／ｐＴＮ２４−１５またはＣＯＳ／ｐ
ＣＥＶ４の培養上清を種々の濃度で添加したときの標的
細胞（Ｗ４，ＷＲ１９Ｌ）に対する細胞障害活性を示し
た。ｐＴＮ２４−１５で形質転換させたＣＯＳ−７細胞
（ＣＯＳ／ｐＴＮ２４−１５）の培養上清の細胞障害活
性をみたところ、Ｗ４細胞に対し顕著な細胞障害活性が
認められたが、ＷＲ１９Ｌ細胞に対しては細胞障害活性
は認められなかった（図１０）。これは、ＣＯＳ−７細
胞上で発現されたリコンビナントＦａｓリガンドが切断
され、可溶型になっていることを示す結果である。

【０１３５】（３）ｍＦａｓ−ＦｃおよびｈＴＮＦＲβ
−Ｆｃによる細胞障害活性の阻害 さらに、ｍＦａｓ−Ｆｃ、ｈＴＮＦＲβ−Ｆｃをアッセ
イ系に加えて、エフェクター細胞による細胞障害活性の
変化を検討した。この結果を図１１に示す。図１１に示
すように、Ｆａｓリガンドを発現するＣＯＳ−７細胞
（ＣＯＳ／ｐＴＮ２４−１５）の細胞障害活性は、ｄ１
０Ｓ細胞と同様に、１０μｇ／ｍｌのｍＦａｓ−Ｆｃで
阻害され、１０μｇ／ｍｌのｈＴＮＦβ−Ｆｃでは阻害
されなかった。

【０１３６】（実施例９）染色体ＤＮＡのフラグメンテ
ーションについての検定 ２４ウェルプレート内の８×１０⁴ 個のＣＯＳ−７細胞
を、１０μｇのｐＴＮ２４−１５で形質転換した。トラ
ンスフェクトの７２時間後、２×１０⁵ 個のＷＲ１９Ｌ
細胞あるいはＷ４細胞（オガサワラ J.(Ogasawara J.)
等、Nature, 364 巻、806-809 頁, 1993年）をウェルに
加え、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ中３７℃で、１〜
３時間インキュベーションした。Ｗ１９ＬまたはＷ４細
胞のうち、ウェル内壁に付着しない非付着細胞を集め、
レイード P. W.(Laird P. W.) らに準じて染色体ＤＮＡ
を調製し（Laird P. W. 等、Nucleic Acids Res., 19
巻、4293頁、1991年）、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジ
ウム存在下でアガロースゲルを使用して電気泳動を行っ
た。

【０１３７】上述のＷ１９ＬまたはＷ４細胞の染色体Ｄ
ＮＡの電気泳動の結果を図１２に示した。図１２から明
らかなように、ｐＴＮ２４−１５で形質転換させたＣＯ
Ｓ−７細胞（ＣＯＳ／ｐＴＮ２４−１５）とコカルチャ
ーしたＷ４細胞では、染色体ＤＮＡが、アポトーシスの
特徴であるステップラダー様式（step-ladder fashion
）でフラグメント化していた。ＤＮＡのラダーは、イ
ンキュベーション後１. ０時間で観察され、インキュベ
ーション後２時間で、ほとんどのＤＮＡが断片化してし
まった。このようなＤＮＡのフラグメント化は、外来遺
伝子を含まないｐＣＥＶ４で形質転換させたＣＯＳ−７
細胞では認められなかった。さらに、このようなＤＮＡ
の断片化はＷ４細胞でのみ確認され、ＷＲ１９Ｌ細胞で
は確認されなかった。

【０１３８】（実施例１０）アフィニティークロマトグ
ラフィーを用いたＦａｓリガンドの精製 （１）細胞表面蛋白質のビオチン化 以下で、トレーサー蛋白質として使用するため、マイヤ
ー（Meier ）等の方法（Anal. Biochem., 204 巻、220
頁、1992年）に従って細胞表面のビオチン化を行った。
すなわち、細胞を５０μｇ／ｍｌのＮＨＳ−ＬＣ−ビオ
チンを含む１０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝生理食塩水
で、１×１０⁷ 細胞／ｍｌになるように懸濁し、室温で
１５分間インキュベートした。最終濃度が１０ｍＭにな
るように塩化アンモニウムを添加し、反応を停止後、１
５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０、以下ＴＢＳと略す）で３回洗浄し、細胞
表面蛋白質をビオチン化した。

【０１３９】（２）ｍＦａｓ−Ｆｃアフィニティーカラ
ムの調製 実施例１で作製したキメラ蛋白質ｍＦａｓ−Ｆｃの精製
標品４ｍｇを４ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した
後、２ｍｌのプロテインＡ−セファロース４Ｂと混合
し、４℃で１時間結合させた。遊離の蛋白質を除去する
ため、樹脂をＴＢＳで３回、次に２００ｍＭのホウ酸ナ
トリウム溶液（ｐＨ９．０）で１回洗浄した。さらに、
ジメチルピメリミデイト（ＤＭＰ）を含む２００ｍＭホ
ウ酸溶液（ｐＨ９．０）で室温４５分間インキュベート
することにより、樹脂にｍＦａｓ−Ｆｃを共有結合させ
た。

【０１４０】（３）Ｆａｓリガンドの精製 実施例２の操作を１２回繰り返して得られたｄ１０Ｓの
サブライン、ｄ１０Ｓ−１２を、５０ｎＭの２−メルカ
プトエタノールと２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）を添加
した１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭを培地を用いて、３７
℃にて、１０本のローラーボトルで培養した。細胞密度
が２×１０⁵ 細胞／ｍｌに到した時点で１０ｎｇ／ｍｌ
のＰＭＡと５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンを添加
し、さらに４時間インキュベートした。培養後の細胞浮
遊液を２５０×ｇで２０分間遠心後ペレットを回収し、
ＰＢＳで３回、ＴＢＳで１回洗浄した。ペレットの状態
で、−８０℃で保存し、以下の細胞膜画分の調製に使用
した。また、一部を（１）の細胞表面蛋白質のビオチン
化に使用した。

【０１４１】凍結した細胞ペレットは４倍量の１ｍＭの
ｐ−アミノフェニル メタンスルフォニル フルオライ
ド ハイドロクロライド（p-aminophenyl methanesulfo
nylfluoride hydrochloride, APMSF ）、１μｇ／ｍｌ
ペプスタチン、１μｇ／ｍｌロイペプチンおよび０．０
２％ ＮａＮ₃ を含む０．３Ｍショ糖溶液中で、ウルト
ラ−トラックスＴ２５（Ultra-Turrax T25, ヤンク
ウント クンケル、スタウフェン（Janke & Kunkel, St
aufen)社製）を用い、ブルーポジションで、氷上で２分
間、破砕した。１，０００×ｇで２０分間、４℃にて遠
心し、核および破砕されていない細胞を除去した。次に
上清を１００，０００×ｇで９０分間、４℃にて遠心
し、膜分画を得た。この膜分画を４０ｍｌのライシスバ
ッファー（１％NP−40、１mM APMSF、１μｇ／ｍｌペプ
スタチンおよび１μｇ／ｍｌロイペプチンを含むＴＢ
Ｓ）に溶解し、４℃で一晩振とうし可溶化した。可溶化
した膜分画を１００，０００×ｇで６０分間、４℃にて
遠心し、上清を−８０℃で保存した。細胞表面タンパク
をビオチン化した細胞も同様に処理し、−８０℃で保存
した。

【０１４２】Ｆａｓリガンドのトレーサーとして可溶化
した膜分画１００ｍｌに、ビオチン化した細胞からの可
溶化膜分画１０ｍｌを添加した。その混合物を１％ＮＰ
−４０を含むＴＢＳで平衡化したｍＦａｓ−Ｆｃカラム
（１．４ｍｌ）にアプライした。カラムを１％ＮＰ−４
０を含むＴＢＳ ５０ｍｌおよび０．１％ＮＰ−４０を
含むＴＢＳ ５０ｍｌで洗浄後、１Ｍ ＮａＣｌおよび
０．１％ＮＰ−４０を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）でＦａｓリガンドを溶出した。１ｍｌづ
つフラクションを集め、各フラクションの１０μｌをＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。ビ
オチン化した蛋白質は、ＨＲＰＯ標識ストレプトアビジ
ンと反応させて染色し、使用説明書通りにＥＣＬシステ
ム（アマーシャム社）で検出した。４０ｋＤのビオチン
化Ｆａｓリガンドを含む画分をプールし、１０μｌのＣ
ｏｎＡ−アガロースビーズ（ＥＹ ラボラトリーズ社）
と４℃で１晩インキュベートした。０．１％ＮＰ−４０
を含むＴＢＳで４回洗浄後、０．１％ ＮＰ−４０およ
び２Ｍ α−メチルマンノシドを含むＰＢＳ２００μｌ
でＦａｓリガンドを溶出し、精製Ｆａｓリガンドを得
た。

【０１４３】（４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動 （３）で得た精製Ｆａｓリガンドを用いて０．１％ＳＤ
Ｓを含む１０−２０％グラジエントポリアクリルアミド
電気泳動を行い、シルバーステイニングキット（和光純
薬工業（株））で染色、およびＰＶＤＦ膜に転写後、Ｅ
ＣＬシステムでバンドを検出した。Ｆａｓリガンド精製
の結果を図１３に示す。図中、レーン１は、銀染色の結
果を、レーン２はＥＣＬシステムでの検出結果である。
図１３に示したように、精製されたＦａｓリガンドは銀
染色およびＥＣＬシステムでともに非還元下、分子量約
４０ｋＤの１本のバンドとして検出された。

【０１４４】（５）細胞障害活性 実施例８の方法に従って、精製Ｆａｓリガンドの細胞障
害活性を測定した。ただし、これまでの細胞障害活性で
エフェクター細胞として用いられたｄ１０Ｓ細胞および
ｐＴＮ２４−１５で形質転換させたＣＯＳ−７細胞の代
わりに、（３）で得られた精製Ｆａｓリガンドを使用
し、標的細胞であるＷ４細胞およびＷＲ１９Ｌ細胞に対
する特異的細胞溶解率を指標として、細胞障害活性を測
定した。精製されたＦａｓリガンドの細胞障害活性の検
討結果を図１４に示す。図１４より明らかなように、Ｆ
ａｓ抗原を発現していないＷＲ１９Ｌ細胞に対しては細
胞障害活性は認められなかったが、Ｆａｓ抗原を発現し
ているＷ４細胞に対しては濃度依存的な細胞障害活性が
確認された。

【０１４５】（実施例１１）ラットＦａｓリガンドＤＮ
Ａの一部を使用したスクリーニング （１）ヒト染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニング ヒト（胎盤）染色体ＤＮＡファージライブラリー（ＥＭ
ＢＬ３ ＳＰ６／Ｔ７、クローンテック(Clontech)社
製）を指示菌（菌名ＶＣＳ２５７）に感染させ、軟寒天
と混合し、寒天プレートに重層した。３７℃にて一晩イ
ンキュベーションし、ファージプラークを形成させた。
これを一旦、４℃で約４時間冷却し、その後、ファージ
をニトロセルロースフィルターに転写した。一方、実施
例４で得たプラスミドｐＴＮ２４−１５を鋳型として、
センスプライマー４（ＡＧＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴ
ＣＡＣＣＡ）およびアンチセンスプライマー４（ＣＡＡ
ＴＡＴＴＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧ）配列（配列表の
配列番号３０および３１）を用いてＰＣＲを行い、ラッ
トＦａｓリガンドｃＤＮＡの細胞外領域をコードするｃ
ＤＮＡ（配列表の配列番号１５の塩基番号４００から９
６７番）を増幅させた。ランダムプライマーラベリング
キット（ベーリンガーマンハイム社製）を使用して実施
例６の方法で増幅産物を³²Ｐ標識して、プローブ１（配
列表の配列番号３２）を作製した。配列表の配列番号１
５の５’末端側、すなわち配列表の配列番号１５の塩基
番号４３から２３３をＰＣＲにより増幅させ、得られた
増幅産物を上述のように³²Ｐ標識して、プローブ２（配
列表の配列番号３３）を作製した。

【０１４６】ショウ（Shaw）等の方法（Nucleic Acids
Res., 11巻, 555-573 頁、1983年）を一部改変して、上
記の各プローブとニトロセルロースフィルターとをハイ
ブリダイゼーションさせた。すなわち、フィルターを、
６５℃で一晩、０．１％ＳＤＳを含む３×ＳＳＣで洗浄
し、次いで、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶
液、０．１％ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｌの変性サケ精子
ＤＮＡを含む５×ＳＳＣＰ中で、４２℃、５時間プレハ
イブリダイゼーションした。次に、５０％ホルムアミ
ド、１×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ
／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗ／ｖ）デキス
トラン硫酸を含む５×ＳＳＣＰに上述のプローブを１．
１×１０⁶ ｃｐｍ／ｍｌとなるように添加し、前記フィ
ルターを２８℃で１８時間ハイブリダイゼーションさせ
た。０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣＰを用い、室温で
２回フィルターを洗浄し、次いで、０．１％ＳＤＳを含
む０．３×ＳＳＣＰを用い、３７℃で３回洗浄した。オ
ートラジオグラフィーを行ったところ、複数のポジティ
ブクローンが検出された。

【０１４７】（２）ポジティブクローンの解析−１ プローブ１とのハイブリダイゼーションで得られたポジ
ティブクローンのうち２つのクローン、λｈＦＬ４およ
びλｈＦＬ７から、公知方法（サムブルック J.(Sambro
ok J.)等、Molecular Cloning: a Laboratory Manual,
2nd ed., ColdSpring Harbor Laboratory, ニューヨー
ク(New York), 1989年参照）でファージＤＮＡを調製し
た。クローンλｈＦＬ４およびλｈＦＬ７中には、ぞれ
ぞれ１８ｋｂ、１７ｋｂのヒト染色体ＤＮＡを含んでお
り、制限酵素マップを作成した結果、互いに重複した範
囲を含んでいる事が分かった。配列表の配列番号１５の
塩基配列中の５２４番目から９６７番目に相当するＤＮ
Ａ断片（配列表の配列番号３４）を実施例４で得られた
プラスミドｐＴＮ２４−１５から調製し、実施例６の方
法で³²Ｐで標識してプローブ３とした。クローンλｈＦ
Ｌ４とλｈＦＬ７を数種の制限酵素で切断した後、上記
プローブ３を使用してサザンハイブリダイゼーションを
行った。その結果、クローンλｈＦＬ４とλｈＦＬ７中
の２．８ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントが、当該
プローブとハイブリダイズすることが確認された。

【０１４８】クローンλｈＦＬ４からＤＮＡを調製し、
ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。得られた２．８ｋｂのフラ
グメントを、ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＫＳ（＋）に組み込み、プラスミドｐＢＬ−
ｈＦＬ４Ｈと命名した。ｐＢＬ−ｈＦＬ４Ｈ中のＤＮＡ
配列をＤＮＡシーケンサー（３７０Ａ型、パーキンエル
マージャパン（株）製）を使用して解析したところ、当
該プラスミドには、ヒトＦａｓリガンドの細胞外領域の
Ｃ末端側の１３０アミノ酸をコードするＤＮＡを有する
ＤＮＡ配列が含まれていることが確認された。結果を、
図１５と配列表の配列番号１６に示した。図１５中、
５’末端より数えて１２番目まではイントロンである。
エクソン部分は１３番目のＧから始まっており、４０５
番目から４０７番目の配列ＴＡＡは終止コドンである。

【０１４９】実施例５で解析したｐＴＮ２４−１５の塩
基配列を比較し、図１５にはヒトＦａｓリガンドと異な
るラットＦａｓリガンドのアミノ酸および塩基のみに下
線をつけて示した。ここで配列を確認した部位は、配列
番号１５の塩基番号５１４番目から９１０番目の塩基配
列と高いホモロジーを有しており、塩基配列で８６．７
％、アミノ酸で８１．５％のホモロジーを有していた。
なお、本発明者らは、配列表の配列番号１６に示すプラ
スミドｐＢＬ−ｈＦＬ４Ｈで形質転換させた形質転換体
である大腸菌ＤＨ１０Ｂ（ｐＢＬ−ｈＦＬ４Ｈ）を、工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託している（寄託
番号 ＦＥＲＭＰ−１４０１４）。

【０１５０】（３）ポジティブクローンの解析−２ プローブ２とのハイブリダイゼーションで得られたポジ
ティブクローンのうち１つのクローンλｈＦＬ５から、
同様に、ファージＤＮＡを調製した。このクローン中に
は１８ｋｂｐの染色体ＤＮＡが含まれていることが確認
された。クローンλｈＦＬ５からＤＮＡを調製し、Ｂａ
ｍＨＩで消化した。得られた４．４ｋｂのフラグメント
を、ＢａｍＨＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｋ
Ｓ（＋）に組み込み、プラスミドｐＢＬ−ｈＦＬ５Ｂ１
と命名した。ｐＢＬ−ｈＦＬ５Ｂ１中のＤＮＡ配列をＤ
ＮＡシーケンサーを使用して解析したところ、当該プラ
スミドには、ヒトＦａｓリガンドの細胞内領域を含む１
３０アミノ酸をコードするＤＮＡを有するＤＮＡ配列が
含まれていることが確認された。得られた塩基配列を、
ｐＴＮ２４−１５の塩基配列と比較し、プロモーター領
域、イントロン、エクソンを決定した。（２）および
（３）で得られた結果をまとめて、図１６〜１８に示し
た。図中--------で示した部位は、配列未確認の塩基配
列である。ヒトＦａｓリガンドに対する染色体遺伝子
は、４つのエクソンよりなる。すべてのスプライシング
サイトにはＧＴ----ＡＧの配列が存在し、エクソンとの
境界で切断され、それぞれのフラグメントが再構成され
ることが予想された。

【０１５１】（実施例１２） ヒトＦａｓリガンドをコ
ードするｃＤＮＡのクローニングおよび発現 （１）ヒトＦａｓリガンドｃＤＮＡのＰＣＲによるクロ
ーニング ヒト末梢血よりＴ細胞を採取し、１０％ＦＣＳ、５０μ
Ｍのβ−メルカプトエタノール、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ
−２を含むＲＰＭＩ１６４０培地（日本水産（株）製）
に、２×１０⁶ 細胞／ｍｌとなるように懸濁し、３７℃
で一晩培養した。次いで、ＣｏｎＡを５μｇ／ｍｌとな
るように加え、３７℃でさらに４日間培養した。死細胞
をヒストパック１０８３（シグマ社）を用いた密度勾配
遠心で除き、ｍＲＮＡ調製キット（ファルマシア社製）
を用いてｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを調製した。カワサキ
E. S.等の方法（Kawasaki E. S., Amplification of RN
A in PCR Protocols. A Guide to Methods and Amplifi
cations., M. A.イニス(M.A.Innis)等編，アカデミック
出版(Academic Press), サンディエゴ(San Diego),21-2
7頁、1990年）に従い、以下のように一本鎖ｃＤＮＡの
合成およびＰＣＲを行った。

【０１５２】まず、センスプライマー５（ＧＣＴＣＴＡ
ＧＡＣＴＡＣＡＧＧＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴ）およ
びアンチセンスプライマー５（ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＡ
ＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＣＴＧＴＡＡＣ）を作製した（配
列表の配列番号３５および３６）。このセンスプライマ
ーは、ＡＴＧ開始コドンの上流域と５’末端のＸｂａＩ
サイト（ＧＣＴＣＴＡＧＡ）を含んでいる（配列表の配
列番号３７）。一方、アンチセンスプライマーはＴＡＡ
終始コドンの下流領域とＸｂａＩサイト（ＧＣＴＣＴＡ
ＧＡ）を含んでいる。先述のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ １
μｇに、５０ｎｇのランダムヘキサマー、２００ユニッ
トのＭＭＬＶ ＲＮａｓｅ Ｈ−リバーストランスクリ
プターゼ（ギブコ BRL社製）を添加した。この反応液
２．０μｌを、先述のセンスプライマー、アンチセンス
プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌ含むＰＣＲバッフ
ァー１００μｌで希釈した。ＤＮＡサーマル サイクラ
ー（DNA thermal cycler、パーキン−エルマー／シータ
ス（Perkin-Elmer/Cetus）社製）を使用して、ＰＣＲを
行った。なお、ＰＣＲは；９４℃、１分；５５℃、２
分；７２℃、３分を１サイクルとする反応を２０サイク
ル行った。

【０１５３】得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｂａＩ
で処理した後、１％アガロースゲル（ロー ゲル テン
ペレーチャー(Low Gel Temperature), バイオラッド(B
ioRad)社製）で分離した。約９７０ｂｐのＤＮＡフラグ
メントをゲルより回収後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｉ
ＩのＸｂａＩサイトに組み込み、プラスミドｐＢＸ−ｈ
ＦＬ１と命名した。ｐＢＸ−ｈＦＬ１中のＤＮＡ配列を
ＤＮＡシーケンサーを使用して確認した。当該プラスミ
ドに含まれる９７０ｂｐのＤＮＡフラグメントの塩基配
列は、実施例１１で得られた染色体遺伝子の配列と一致
することが確認された。クローンｐＢＸ−ｈＦＬ１中の
塩基配列の解析結果を配列表の配列番号１７および図１
９〜２０に示す。

【０１５４】ヒトＦａｓリガンドは、ラットＦａｓリガ
ンドと同じく、Ｎ末端にシグナル配列を持たないが、タ
ンパク分子の中央部分に２２個の疎水性アミノ酸を有
し、II型膜タンパクであることがわかった。細胞内領域
はＭｅｔから始まる８０アミノ酸からなり、プロリンが
８０残基中に３２含まれる。Ｃ末端細胞外領域は１７９
アミノ酸からなり、４箇所のＮ−グリコシレーションサ
イト（Ａｓｎ−ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）が存在する。本発
明者等は、ハナハンの方法（既出）に準じて、プラスミ
ドｐＢＸ−ｈＦＬ１で大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換し、
得られた形質転換体、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（ｐＢＸ−ｈＦ
Ｌ１）を工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託して
いる（寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４２２５）。

【０１５５】（２）ＣＯＳ細胞への導入 （１）で得られた９７０ｂｐＸｂａＩ ＤＮＡフラグメ
ントを動物細胞発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（ミズシマ
およびナガタ( Mizushima & Nagata, NucleicAcids Re
s., 18巻、5322頁、1990年) のＸｂａＩ部位に挿入し、
プラスミドｐＥＸ−ｈＦＬ１と命名した。１０％ＦＣＳ
を含むＤ−ＭＥＭ培地に、ＣＯＳ−７細胞を１０ｃｍシ
ャーレ当り２×１０⁶ 細胞となるように植え込み、５μ
ｇのプラスミドｐＥＸ−ｈＦＬ１をＤＥＡＥ−デキスト
ラン法（フクナガ R.(Fukunaga R.)等、Cell, 61巻、 3
41-350頁、1990年）で導入し、形質転換体ＣＯＳ／ｐＥ
Ｘ−ｈＦＬ１を得た。

【０１５６】（３）形質転換体の細胞障害活性 （２）で形質転換させたＣＯＳ細胞をエフェクター細胞
とし、１０⁶ のＷＲ１９ＬまたはＷＣ８Ａ細胞をターゲ
ット細胞として、実施例８と同様に、組換え細胞の細胞
障害活性を確認した。ＷＣ８Ａ細胞は、マウスＷＲ１９
Ｌ細胞をヒトＦａｓ抗原を発現するように形質転換した
細胞である（Itoh N. 等、J.Immunol.,151巻、 621-627
頁、1993年) 。すなわち、１０⁶ のＷＲ１９ＬまたはＷ
Ｃ８Ａ細胞を、２０μＣｉの［⁵¹Ｃｒ］クロム酸ナトリ
ウム( アマーシャム(Amersham)社製）を含むＲＰＭＩ１
６４０培地で３７℃２時間培養し、⁵¹Ｃｒで標識した。
この⁵¹Ｃｒで標識した細胞（１×１０⁴ ）を、ＣＯＳ／
ｐＥＸ−ｈＦＬ１と様々な割合で混合し、３７℃で４時
間培養後、⁵¹Ｃｒの遊離を指標に細胞障害活性を測定し
た。この結果を図２１に示す。

【０１５７】図２１に示すようにＣＯＳ／ｐＥＸ−ｈＦ
Ｌ１はＷＣ８Ａ細胞に対しを濃度依存的に細胞障害活性
を示した。ＷＲ１９Ｌに対してはアポトーシスは誘導し
なかった。さらに、ＣＯＳ／ｐＥＸ−ｈＦＬ１の細胞障
害活性を調べた結果を図２２に示す。この細胞障害活性
は、実施例１で作製したヒトＦａｓ抗原の細胞外領域を
含むキメラ蛋白質（ｈＦａｓ−Ｆｃ）あるいはマウスＦ
ａｓ抗原の細胞外領域を含むキメラ蛋白質（ｍＦａｓ−
Ｆｃ）を添加することにより阻害されたが、可溶型のヒ
トＴＮＦレセプター（ｈＴＮＦＲβ−Ｆｃ）を添加して
も阻害されなかった（図２２）。以上の結果より、
（１）で単離した９７０ｂｐのｃＤＮＡによりコードさ
れる蛋白質は、Ｆａｓ抗原と結合してアポトーシスを誘
導する活性を有するＦａｓリガンドであることが確認さ
れた。

【０１５８】（実施例１３）マウスＦａｓリガンド染色
体遺伝子の単離 １２９／Ｓｖマウス染色体ＤＮＡをラムダＦＩＸ ＩＩ
ベクターに導入して作成したマウス染色体ＤＮＡライブ
ラリー（ストラタジーン（Stratagene) 社製、ラホヤ(L
a Jolla), CA））を指示菌に感染させ、軟寒天と混合
し、寒天プレートに重層し、１．３×１０⁶ 個のプラー
クを得た。これを一旦４℃で約４時間冷却し、ファージ
をニトロセルロースフィルターに転写した。実施例４で
得たプラスミドｐＴＮ２４−１５を鋳型として、センス
プライマー４（ＡＧＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＣＡＣ
ＣＡ）およびアンチセンスプライマー４（ＣＡＡＴＡＴ
ＴＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧ）配列を用いてＰＣＲを
行い、細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ（配列表の
配列番号１５の塩基配列の塩基番号４００から９６７
番）を増幅させた。ランダムプライマーラベリングキッ
ト（ベーリンガーマンハイム社製）を使用して実施例６
の方法で増幅産物を³²Ｐ標識して、プローブ１を作製し
た。また、配列表の配列番号１５の５’末端側、すなわ
ち配列表の配列番号１５の塩基番号４３から２３３をＰ
ＣＲにより増幅させ、上述のように³²Ｐ標識して、プロ
ーブ２を作製した。

【０１５９】プローブ１および２をそれぞれ、ニトロセ
ルロースフィルターとハイブリダイゼーションさせた。
ハイブリダイゼーションの条件は後述する実施例１６と
同様の穏やかな条件で行った。すなわち３３℃で１８時
間ハイブリダイゼーションした後、フィルターを室温に
て０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣＰで２回洗浄した
後、３７℃の０．１％ＳＤＳを含む０．３×ＳＳＣＰで
洗浄した。オートラジオグラフィーを行ったところ、２
つのポジティブクローンを得た（λＭＦＬ５，λＭＦＬ
１８）。ポジティブクローンのプラークを単離し、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＫＳ（＋）（ストラタジーン
(Stratagene)社製）にサブクローニングした後、挿入さ
れているマウスＤＮＡの制限酵素地図の作成、ＤＮＡシ
ーケンサーを使用して塩基配列を決定した。この２クロ
ーンについて制限酵素地図を作成し、サザンハイブリダ
イゼーション解析したところ、λＭＦＬ５，λＭＦＬ１
８は、それぞれＦａｓリガンド染色体遺伝子の５’、
３’領域を有していた。また、ラットＦａｓリガンドｃ
ＤＮＡと相応する領域、プロモーター領域の塩基配列を
決定したところ、決定された塩基配列は、ラットＦａｓ
リガンドｃＤＮＡと高い相同性を示し、クローニングさ
れたλＦＩＸ ＩＩベクターに組み込んだＤＮＡがマウ
スＦａｓリガンド遺伝子であることがわかった。

【０１６０】図２３〜２４に、マウスＦａｓリガンド遺
伝子のプロモーター、エクソン、３’フランキング領域
とラットＦａｓリガンドｃＤＮＡの塩基配列を示した。
ＴＡＴＡ ｂｏｘから１０７ｂｐ下流のＡＴＧ開始コド
ンから８３７ｂｐのオープンリーディングフレームがあ
り、２７９アミノ酸（アミノ酸部分の分子量３１，４４
０）をコードしている。マウスＦａｓリガンドは、ラッ
トＦａｓリガンドと同様Ｎ末端にシグナル配列を持たな
いが、タンパク分子の中央部分に２２疎水性アミノ酸を
有していた。これにより、マウスＦａｓリガンドはII型
膜タンパクであることが明らかになった。細胞内領域は
７８アミノ酸からなりプロリンが７８残基中２５含まれ
る。Ｃ末端細胞外領域は１７９アミノ酸からなり、５箇
所のＮ−グリコシレーションサイト（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅ
ｒ／Ｔｈｒ）が存在する。また、マウスＦａｓリガンド
ｃＤＮＡは、ラットＦａｓリガンドｃＤＮＡと塩基配列
で９０．６％、アミノ酸配列で９１．４％の相同性を持
ち、３’ノンコーディング領域で８４．５％の相同性を
持つことが確認された。

【０１６１】（実施例１４）マウスＦａｓリガンドをコ
ードするｃＤＮＡのＰＣＲによるクローニングおよび発
現 （１）プラスミドｐＢＬ−ＭＦＬＷ４の調製 野生型（Ｃ３Ｈ−＋／＋）マウスの脾臓細胞を、１０％
ＦＣＳ、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、１．５
μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を含
むＲＰＭＩ１６４０培地（日本水産（株）製）に、２×
１０⁶ 細胞／ｍｌとなるように懸濁し、３７℃で２日間
培養した。１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ、５００ｎｇ／ｍｌ
のイオノマイシンで４時間処理した後、死細胞をヒスト
パック１０８３（シグマ社製）を用いた密度勾配遠心で
除き、ｍＲＮＡ調製キット（ファルマシア社製）を用い
てｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを調製した。

【０１６２】カワサキ(Kawasaki)等の方法（Kawasaki
E. S., Amplification of RNA In PCR Protocols. A Gu
ide to Methods and Amplifications., M. A.イニス(M.
A. Innis) 編、アカデミック出版(Academic Press),
サンディエゴ(San Diego) 、21-27 頁、1990年）に従
い、以下のように一本鎖ｃＤＮＡの合成およびＰＣＲを
行った。まず、センスプライマー６（ＧＣＴＣＴＡＧＡ
ＧＡＧＡＡＧＧＡＡＡＣＣＣＴＴＴＣＣＴＧ）およびア
ンチセンスプライマー６（ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＴ
ＣＣＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＧＡＴ）を作製した（配列表
の配列番号３７および３８）。このセンスプライマー６
は、ＡＴＧ開始コドンの上流域と５’末端のＸｂａＩの
サイト（ＧＣＴＣＴＡＧＡ）を含んでいる。一方、アン
チセンスプライマーはＴＡＡ終始コドンの下流領域とＸ
ｂａＩサイト（ＧＣＴＣＴＡＧＡ）を含んでいる。

【０１６３】先述のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ １μｇに、
５０ｎｇのランダムヘキサマー、２００ユニットのＭＭ
ＬＶ ＲＮａｓｅ Ｈ−リバーストランスクリプターゼ
（ギブコBRL(Gibco BRL)社）を添加した。この反応液
１．０μｌを、先述のセンスプライマー、アンチセンス
プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌ含むＰＣＲバッフ
ァー１００μｌで希釈した。ＤＮＡサーマル サイクラ
ー（DNA thermal cycler、パーキン−エルマー／シータ
ス（Perkin-Elmer/Cetus）社製）を使用して、ＰＣＲ産
物を、制限酵素ＸｂａＩで処理した後、１％アガロース
ゲル（ロー ゲルテンペレーチャー(Low Gel Temperatu
re), バイオラッド社製）で分離した。

【０１６４】約９４０ｂｐのＤＮＡフラグメントをゲル
より回収後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＫＳ（＋）
のＸｂａＩサイトに組み込み、プラスミドｐＢＬ−ＭＦ
ＬＷ４と命名した。ｐＢＬ−ＭＦＬＷ４中のＤＮＡ配列
をＤＮＡシーケンサーを使用して確認した。その結果、
ｐＢＬ−ＭＦＬＷ４は、配列表の配列番号１８の塩基配
列を有しており、当該塩基配列は、実施例１３で得られ
た染色体遺伝子の配列と一致することが確認された。本
発明者等は、ハナハンの方法（既出）に準じて、プラス
ミドｐＢＬ−ＭＦＬＷ４で大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換
し、得られた形質転換体、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（ｐＢＬ−
ＭＦＬＷ４）を工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託している（寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４２２６）。

【０１６５】（２）ＣＯＳ細胞への導入と細胞障害活性
のアッセイ法 （１）で得られた９４０ｂｐのＸｂａＩフラグメントを
動物細胞発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（ミズシマ及びナ
ガタ(Mizushima & Nagata), 1990年）のＸｂａＩ部位に
挿入し、プラスミドｐＥＦ−ＭＦＬＷ４Ｆと命名した。
ＣＯＳ−７細胞を１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地
に、１０ｃｍシャーレ当り２×１０⁶ 細胞となるように
植え込み、５μｇのプラスミドｐＥＦ−ＭＦＬＷ４Ｆを
ＤＥＡＥ−デキストラン法（フクナガ(Fukunaga), 1990
年）で導入した。

【０１６６】（３）形質転換体の細胞障害活性 （２）で形質転換させたＣＯＳ細胞（ＣＯＳ／ｐＥＦ−
ＭＦＬＷ４Ｆ）をエフェクター細胞とし、１０⁶ のＷＲ
１９ＬまたはＷ４細胞をターゲット細胞として、実施例
８と同様に、組換え細胞の細胞障害活性を確認した。Ｗ
４細胞はマウスＷＲ１９Ｌ細胞をマウスＦａｓ抗原を発
現するように形質転換した細胞である（オガサワラ J.
(Ogasawara J.) 等，Nature, 364 巻，806-809 頁，199
3年）。すなわち、１０⁶ のＷＲ１９Ｌ細胞またはＷ４
細胞を、２０μＣｉの［⁵¹Ｃｒ］クロム酸ナトリウム
（アマーシャム(Amersham)社製）を含むＲＰＭＩ１６４
０培地を用いて３７℃で２時間培養し、⁵¹Ｃｒで標識し
た。この⁵¹Ｃｒで標識した細胞（１×１０⁴ ）を、ＣＯ
Ｓ／ｐＥＦ−ＭＦＬＷ４Ｆ細胞と様々な割合で混合し、
３７℃で４時間培養後、⁵¹Ｃｒの遊離を指標に細胞障害
活性を測定し、結果を図２５に示した。

【０１６７】図２５に示すようにＣＯＳ／ｐＥＦ−ＭＦ
ＬＷ４Ｆ細胞はＷ４細胞を濃度依存的に細胞障害活性を
示したが、ＷＲ１９Ｌ細胞に対してはアポトーシスを誘
導しなかった。また、図２１に示したように、ＷＣ８Ａ
細胞に対しても、濃度依存的に細胞障害活性を示した。
さらに、ＣＯＳ／ｐＥＦ−ＭＦＬＷ４Ｆ細胞の細胞障害
活性は、実施例１で作製したマウスＦａｓ抗原の細胞外
領域を含むキメラ蛋白質（ｍＦａｓ−Ｆｃ）２０μｇ／
ｍｌを添加することにより阻害されたが、ヒトＴＮＦレ
セプターの可溶型（ｈＴＮＦＲβ−Ｆｃ）では阻害され
なかった。以上の結果より、（１）で単離した９４０ｂ
ｐのｃＤＮＡによりコードされる蛋白質は、Ｆａｓ抗原
と結合してアポトーシスを誘導する活性を有するＦａｓ
リガンドであることが確認された。

【０１６８】（実施例１５）モノクローナル抗体の作製 （１）ペプチドの合成及びキャリアー結合投与抗原の調
製 実施例１２で決定したアミノ酸配列に基づき４種類のペ
プチドを合成した。配列表の配列番号３９に示すペプチ
ド（ＬＶＭＭＥＧＫＭＭＳＹ）はＦｍｏｃ法を用いた
ペプチド合成キット、コクサン（国産化学（株）製）の
使用説明書に従って合成し、樹脂から脱保護切断した後
エーテルにより粗ペプチド２７５．７ｍｇを得た。次に
粗ペプチド１０ｍｇを５％アンモニア水溶液を用いて溶
解し、セファデクスＧ１０により脱塩した。得られた溶
液を逆相ＨＰＬＣカラム カプセルパックＣ１８（CAPC
ELLPAK C18120Å、５μｍ、4.6mm ×250mm 、資生堂
（株）製）を用いて精製した。溶出液を凍結乾燥し、精
製ペプチドを得た。また、ペプチド（ＫＳＮＳＲＳＭ
ＰＬＥＷＥＤＴＹＧＩＶＬＬ）、ペプチド（ＳＫＹＰ
ＱＤＬＶＭＭＥＧＫＭＭＳ）およびペプチド（ＬＳＬ
ＶＮＦＥＥＳＱＴＦＦ）は（株）不二家バイオサイエン
ス研究所に合成を依頼した（配列表の配列番号４０〜４
２）。

【０１６９】得られたペプチドを以下の方法でキーホー
ルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ：ピアス(Pierce)社
製）およびカチオン化ＢＳＡ（ピアス(Pierce)社製）に
結合し投与抗原とした。ＫＬＨおよびカチオン化ＢＳＡ
は蒸留水に溶解し１０ｍｇ／ｍｌに調製した。各々のペ
プチドを蒸留水または５％アンモニア水に溶解し１ｍｇ
／ｍｌに調製した。ＫＬＨではペプチドとキャリアーの
モル比が１００対１となるように、カチオン化ＢＳＡで
は１０対１となるようにそれぞれ混合し、塩酸を用いて
ｐＨ５に調整した。次に水溶性カルボジイミド（1-Ethy
l-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochlo
ride、同仁化学研究所製）をキャリアー１ｍｇ当たり等
量添加し、室温にて４時間撹拌した。反応液をセファデ
ックスＧ２５（ファルマシア社製）により精製し、最初
に溶出してくる画分を投与抗原とした。

【０１７０】（２）投与および抗血清の調製 （１）で調製した投与抗原１００μｇと等量のフロイン
ド完全アジュバントとを混合し、Ｂａｌｂ／ｃまたはｄ
ｄｙマウス（５〜６週令、♀）の腹腔内に投与した。１
週間後、同量をフロインド不完全アジュバントと混合
し、腹腔内に投与した。さらに１週間間隔で２回追加投
与を行い、さらに１週間後に投与抗原２０μｇを生理食
塩水で希釈し、静脈内投与し、２日後に細胞融合を行っ
た。２回投与後、抗血清を眼底静脈より採血し、血清を
分離して得た。

【０１７１】（３）抗血清のペプチドとの反応性の測定 アミノプレート（住友ベークライト（株）製）の各ウェ
ルに２．５％のグルタールアルデヒド溶液７０μｌを分
注し、室温で１時間静置し、内容液を廃棄した。０．０
７６ＭのＰＢＳ（ｐＨ６．４）で５μｇ／ｍｌに希釈し
たペプチド溶液５０μｌを加え、３７℃で１時間処理し
た。プレートを氷水で冷却後、イオン交換水でプレート
を５回洗浄し、０．２％のゼラチンを溶解したＰＢＳ１
００μｌを分注し、３０分静置しブロッキングを行っ
た。次に抗血清をＰＢＳで５００倍に希釈し５０μｌ添
加した。３７℃で１時間反応後、０．００５％ Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含む生理食塩水（以下、洗浄液と略す）で２
回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブ
リンズ抗体（ダコ(DAKO)社製）を０．２５％のゼラチン
を溶解したＰＢＳで２，０００倍に希釈して添加した。
３７℃で１時間反応させた後、洗浄液で５回洗浄した。
オルトフェニレンジアミンを３ｍｇ／ｍｌ、過酸化水素
を０．０２７％を含むマッキルベイン緩衝液ｐＨ５．０
を５０μｌを添加し室温で１０分間反応させた。反応
後、２Ｎ硫酸５０μｌを添加し反応を停止し、４９２ｎ
ｍの吸光度を測定した。各抗血清とも投与したペプチド
と反応性を示した。

【０１７２】（４）モノクローナル抗体の作製 （２）で免疫したマウスを屠殺し、脾臓を取り出した。
これを細断した後、ステンレス・メッシュを通し、ＲＰ
Ｍ１６４０培地に浮遊させ、脾細胞浮遊液を得た。この
脾細胞とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ
１）を１０：１の割合で混合して遠心（１，４００ｒｐ
ｍで８分間）した。得られた沈殿に０．５ｍｌの４２．
５％のポリエチレングリコール１５４０と１５％のジメ
チルスルフォキサイドを含むＲＰＭＩ１６４０をすばや
く加え、さらに１分間激しく細胞を振とうした後、１０
ｍｌのＲＰＭＩ１６４０をゆっくり加えた後、遠心（８
００ｒｐｍで５分間）を行った。この沈殿をＨＡＴ培地
（ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍ、アミノプテリン４×１
０^-7Ｍ、チミジン１．６×１０^-5Ｍ、１０％ＦＢＳを含
むＲＰＭＩ１６４０培地）に２×１０⁵ 細胞／ｍＬにな
るように懸濁し、９６穴マイクロプレートのウェル当り
０．２ｍＬを分注した。２〜３日毎に半量の培地を交換
し、その後ＨＴ培地（ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍ、チ
ミジン１．６×１０^-5Ｍ、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ
１６４０培地）に交換した。

【０１７３】ハイブリドーマ細胞の生育が認められたと
ころで、ＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングを行った。
すなわち、実施例１５（１）で作製したペプチドを不溶
化させた９６ウェルプレートを洗浄液で２回洗浄後、
０．２５％ゼラチンを含むＰＢＳで１０倍に希釈した培
養上清１００μｌを各ウェルに添加し、室温で２時間反
応させた。反応終了後、洗浄液で５回洗浄し、第２抗体
として０．２５％ゼラチンを含むＰＢＳで２，０００倍
に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇｓ
抗体（ダコ(DAKO)社製）５０μｌを添加し、室温で２時
間反応させた。反応終了後、洗浄液で５回洗浄後、３ｍ
ｇ／ｍｌオルトフェニレンジアミンおよび０．０２７％
過酸化水素を含む０．１Ｍマッキルベイン緩衝液ｐＨ
５．０を１００μｌ添加し、室温で１０分間酵素反応を
行い、１００μｌの２Ｎ硫酸で反応を停止し、４９２ｎ
ｍの吸光度を測定した。

【０１７４】ＥＬＩＳＡ法で陽性であったウェルのハイ
ブリドーマを、９６穴マイクロプレートに１ウェルあた
り２個、１個、あるいは０．５個となるよう１０％ＦＢ
Ｓを含むＲＰＭ１６４０を用いて希釈した。ウイスター
ラットの胸腺細胞をフィーダー細胞として加えて、プレ
ートの各ウェルに植え込み、クローニングを行った。顕
微鏡下で観察して、確実にシングルセルコロニーである
ウェルを選択し、それらの培養上清を（３）のＥＬＩＳ
Ａ法によりスクリーニング、モノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを得た。

【０１７５】（５）ウエスタンブロッティングによる反
応性の確認 前記（２）で得られた抗血清（ペプチドを使用して作
成した抗原で免疫、ｌｏｔ．１９−３）および前記
（４）で得られたモノクローナル抗体（ペプチドを使
用して作成した抗原で免疫、Ｆ８６４−５−１）との反
応性を、実施例１２でＣＯＳ細胞に発現させたヒトＦａ
ｓリガンド、実施例１４で発現させたマウスＦａｓリガ
ンドおよびＦａｓリガンドの配列を含まないベクターを
トランスフェックトしたＣＯＳ細胞をコントロールとし
てウエスタンブロッティングで確認した。まず、各ＣＯ
Ｓ細胞約１×１０⁴ 個を１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％の
ＮＰ−４０、０．１％デオキシコール酸ナトリウム（So
dium deoxycolate) 、０．１％ＳＤＳおよび０．２Ｕ／
ｍｌのアプロチニン(Aprotinin) を含む５０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７．５）９μｌと混合し、さらに等量の２％
ＳＤＳ、３０％グリセロール、１０％２−メルカプトエ
タノールおよび０．０１％ＢＰＢ（ブロモフェノールブ
ルー(Bromophenol blue)）を含む０．２５Ｍトリス塩酸
（ｐＨ６．８）と混合した。

【０１７６】３７℃で１時間処理した後、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（４−２０％グラジエント
ゲル）を行い、泳動終了後ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）
に４℃にて２００ｍＡ、９０分の条件で転写した。メン
ブレンをブロックエース（雪印乳業（株）社製）で３７
℃２時間ブロッキングを行った。次にメンブレンを洗浄
液で２回、３７℃で４分撹拌して洗浄し、ＰＢＳで５倍
に希釈したブロックエースで５００倍に希釈した抗血清
１９−３、または培養上清Ｆ８６４−５−１と３７℃で
１．５時間反応させた。反応終了後、洗浄液で２回洗浄
し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリンズ
抗体（Cat.No. P260、ダコ社製）をＰＢＳで５倍に希釈
したブロックエースで１，０００倍に希釈した溶液に浸
し、３７℃で１．５時間反応させた。メンブレンを洗浄
液で３回、蒸留水で２回洗浄し、表面の水を切りＴＭＢ
試薬（Cat.No. TM9125、シツク（SCYTK)社製）で発色さ
せた。図２７及び２８に、抗血清１９−３とモノクロー
ナル抗体Ｆ８６４−５−１を使用したウエスタンブロッ
ティングの結果をそれぞれ示した。図２７及び２８から
明らかなように、ヒトＦａｓリガンド発現ＣＯＳ細胞抽
出液と反応するバンドが見られるのに対して、マウスＦ
ａｓリガンドおよびコントロールではバンドは認められ
なかった。

【０１７７】（６）阻止反応によるペプチドとの反応性
の確認−１ 前記（４）で得られたモノクローナル抗体（ペプチド
を使用して作成した抗原で免疫、Ｆ８８３−１−１）
と、投与抗原ペプチド（ペプチド）との反応性を阻止
反応により確認した。アミノプレート（住友ベークライ
ト（株）製）の各ウェルに２．５％のグルタールアルデ
ヒド溶液７０μｌを分注し、室温で１時間静置後、内容
液を廃棄した。０．０７６ＭのＰＢＳ（ｐＨ６．４）で
５μｇ／ｍｌに希釈したペプチド溶液５０μｌを加
え、３７℃で１時間処理した。プレートを氷水で冷却
後、イオン交換水でプレートを５回洗浄し、０．２％の
ゼラチンおよび０．１Ｍグリシンを含むＰＢＳ１００μ
ｌを分注し、３０分間静置してブロッキングを行った。
次に、阻止ペプチドとして上記ペプチド、、をＰ
ＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈して阻止抗原溶液とし、ネ
ガティブコントロールとして阻止抗原を含まない溶液を
調製した。これらの各溶液をそれぞれ２５μｌ添加後、
０．２％ゼラチンを溶解したＰＢＳを用いて０．４μｇ
／ｍｌに希釈したＦ８８３−１−１を２５μｌ加えた。
３７℃で１時間反応後、洗浄液で２回洗浄した。

【０１７８】次に、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイム
ノグロブリンズ抗体（ダコ社製）を０．２％のゼラチン
を溶解したＰＢＳで２，０００倍に希釈して各ウェルに
５０μｌを添加した。３７℃で１時間反応させた後、洗
浄液で５回洗浄した。オルトフェニレンジアミンを３ｍ
ｇ／ｍｌ、過酸化水素を０．０２７％含むマッキルベイ
ン緩衝液ｐＨ５．０を上記各ウェルに５０μｌ添加して
室温で１０分間反応させた。２Ｎ硫酸５０μｌを添加し
て反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測定した。結果
を図２９に示した。図２９では、阻止抗原無添加のウェ
ル（ネガティブコントロール）の吸光度を１００とした
場合の各ウェルの吸光度を算出し、阻止率として示し
た。図２９から明らかなように、Ｆ８８３−１−１抗体
と抗原ペプチドとの反応性は、阻止ペプチドとしてペプ
チドを使用した場合にのみ阻止されることが確認され
た。

【０１７９】（７）阻止反応によるペプチドとの反応性
の確認−２ 前記（４）で得られたＩｇＭ型モノクローナル抗体（ペ
プチドを使用して作製した抗原で免疫したマウスより
得た脾細胞とミエローマから作成したハイブリドーマＦ
８９７−１−２の産生する抗体Ｆ８９７−１−２）と、
投与抗原ペプチド（ペプチド）との反応性を阻止反応
により確認した。まず、中根ら（Immunofluorescence a
nd Related Staining Techniques, W.Knapp, K.Holubar
and G.Wick eds. 1978 ）の方法に従い、ペプチドを
ペルオキシダーゼで標識した。すなわち、ペルオキシダ
ーゼ（RZ3.11、東洋紡（株）製）を６ｍｇ秤量し、１．
５ｍｌの蒸留水で溶解した。次に蒸留水で溶解した０．
１Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウムを０．３ｍｌ添加し室温
で１５分間静置し、続いて蒸留水で溶解した１．５％エ
チレングリコール０．３ｍｌを添加し室温で２０分間静
置した。この溶液を０．００１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ
４．４）に対して４℃で一夜透析した。得られた活性化
ペルオキシダーゼ１５９μｌ（ペルオキシダーゼ５００
μｇ相当）に１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を９μｌ添
加し、続けて蒸留水で溶解して１ｍｇ／ｍｌに調製した
ペプチドを４２８μｌ（ペルオキシダーゼに対して２
０倍モル量）添加し２５℃にて２時間反応させた。次
に、０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で溶解した４
ｍｇ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウムを１５μｌ添加し
４℃で２時間静置し、さらに蒸留水で０．２Ｍに希釈し
たグリシンを２５μｌ添加し室温で１時間静置した。次
に０．０７６ＭのＰＢＳ（ｐＨ６．４）に対して４℃で
一夜透析し、得られたペルオキシダーゼ標識ペプチド
溶液に等量のグリセロールを添加し−２０℃にて保存し
た。

【０１８０】次に、イムノプレート（ヌンク(NUNC)社
製、マキシソープ（MaxiSorp^TM) ）の各ウェルに０．０
７６ＭのＰＢＳ（ｐＨ６．４）で２０μｇ／ｍｌに希釈
した抗マウスイムノグロブリン抗体（Z259、ダコ社製）
を５０μｌ加え、４５℃で３０分処理した。プレートを
氷水で冷却後、イオン交換水でプレートを５回洗浄し、
０．２％ゼラチンを含むＰＢＳ１００μｌを分注し、４
℃で一夜静置してブロッキングを行った。ブロッキング
後、ＰＢＳで１００倍に希釈した塩析抗体（Ｆ８９７−
１−２）を５０μｌ加え３７℃で１時間静置した後、
０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．９％ＮａＣｌの
洗浄液で２回洗浄し、さらにイオン交換水で１回洗浄し
た。一方、ペプチドをＰＢＳで３μｇ／ｍｌ、１０μ
ｇ／ｍｌに希釈して阻止抗原溶液とし、ネガティブコン
トロールとして阻止抗原を含まない溶液を調製した。こ
れらの溶液を２５μｌ添加後、ＰＢＳで２００倍に希釈
したペルオキシダーゼ標識ペプチドを２５μｌ加え、
３７℃で１時間反応させた。反応終了後洗浄液で５回洗
浄し、続いてイオン交換水で２回洗浄した。オルトフェ
ニレンジアミンを３ｍｇ／ｍｌ、過酸化水素０．０２７
％を含むマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．０）を上記各
ウェルに５０μｌ添加して室温で５分間反応させた。２
Ｎ硫酸５０μｌを添加して反応を停止し、４９２ｎｍの
吸光度を測定した。阻止抗原無添加のウェル（ネガティ
ブコントロール）の吸光度を１００とした場合の各ウェ
ルの吸光度を算出し、反応性（％）とした。結果を図３
１に示した。図３１から明らかなように、Ｆ８９７−１
−２抗体と抗原ペプチドとの反応性は、ペプチドによ
り阻止されることが確認された。

【０１８１】（実施例１６）アポトーシス抑制活性の評
価−１ 実施例１５で得られた抗体Ｆ８８３−１−１のアポトー
シス抑制活性を、Ｆａｓリガンドを発現する形質転換体
およびＦａｓ抗原を発現する形質転換体を使用した以下
の方法で確認した。まず、ヒトＦａｓリガンドをコード
するｃＤＮＡを含むプラスミドｐＥＸ−ｈＦＬ１（実施
例１２参照）で、マウス正常骨髄細胞由来細胞株ＦＤＣ
−Ｐ１を形質転換した。その中の１クローン、ＦＬｈ１
細胞を、５０Ｕ／ｍｌのマウスＩＬ−３（コスモバイオ
（株）製）および１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１
６４０培地（ギブコ BRL社製）中で、５％ＣＯ₂ 存在
下、３７℃にて４日間培養した。培養後、ＦＬｈ１細胞
を１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に５×
１０⁵ 細胞／ｍｌとなるよう懸濁し、この懸濁液を９６
穴平底プレートの各ウェルに５０μｌずつ添加した。一
方、実施例１５で得られた抗体Ｆ８８３−１−１をＰＢ
Ｓ^- を使用して各種濃度に調製した。これを上述の各ウ
ェルに１０μｌずつ添加し、５％ＣＯ₂ 存在下、３７℃
にて３０分間インキュベートした。

【０１８２】次に、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１
６４０培地に、ヒトＦａｓ抗原を発現する形質転換体Ｗ
Ｃ８細胞（実施例１２参照）を６．３×１０⁵ 細胞／ｍ
ｌとなるよう懸濁し、これを各ウェルに４０μｌずつ添
加した。５％ＣＯ₂ 存在下、３７℃で１６時間インキュ
ベートした後、トリパンブルーを各ウェルに１００μｌ
ずつ添加して、各ウェルあたりの生細胞数をカウントし
た。Ｆ８８３−１−１抗体のアポトーシス抑制活性を図
３０に示した。図３０から明らかなように、ＦＬｈ１に
よるＷＣ８のアポトーシスはＦ８８３−１−１抗体によ
り用量依存的に抑制された。なお、本発明者等はモノク
ローナル抗体Ｆ８８３−１−１を産生するハイブリドー
マＦ８８３−１−１を、平成６年８月９日付で工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託している（寄託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１４４６４）。

【０１８３】（実施例１７）アポトーシス抑制活性の評
価−２ 実施例１５で得られた抗体Ｆ８９７−１−２のアポトー
シス抑制活性を、以下に述べる実施例１８（３）の方法
で作製した形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＥＸ−ｈＦＬ１の
培養上清およびヒトＦａｓ抗原を発現する形質転換体Ｗ
Ｃ８細胞を使用して、実施例８および１２の方法に準じ
て確認した。まず、１０⁶ 個のＷＣ８細胞を２０μＣｉ
の［⁵¹Ｃｒ］クロム酸ナトリウム（アマーシャム社製）
および１０％の非働化ウシ血清を含有するＲＰＭＩ１６
４０培地中で３７℃で２時間培養し、⁵¹Ｃｒで標識し
た。

【０１８４】次に、９６穴Ｕ底プレート（コーニング(C
ORNING) 社製）の各ウェルに、ＣＯＳ−１／ｐＥＸ−ｈ
ＦＬ１の培養上清を終濃度が３％になるように６μｌ、
１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０を７４μｌ
ずつ添加した。さらに、実施例１５で得られた抗体Ｆ８
９７−１−２を、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ^-
で３００μｇ／ｍｌになるように調整し、終濃度が３０
μｇ／ｍｌとなるように各ウェルに２０μｌずつ添加し
た。３７℃で３０分間インキュベートした後、⁵¹Ｃｒで
標識したＷＣ８細胞を１×１０⁴ 個／１００μｌ／ウェ
ルとなるよう各ウェルに添加し、３７℃で４時間培養し
た。培養後、⁵¹Ｃｒの遊離を指標に細胞障害活性を測定
した。結果を図３２に示した。図３２より明らかなよう
に、ＣＯＳ−１／ｐＥＸ−ｈＦＬ１の培養上清中に存在
するＦａｓリガンドによるＷＣ８細胞のアポトーシス
は、Ｆ８９７−１−２抗体により抑制された。なお、本
発明者等はモノクローナル抗体であるＦ８９７−１−２
抗体を産生するハイブリドーマＦ８９７−１−２を、工
業技術院生命工学工業技術研究所に、平成６年９月１日
付けで寄託している（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４４９
７）。

【０１８５】（実施例１８）ヒトＦａｓリガンドの細胞
外領域の発現 （１）プラスミドｐＭ１０６７の作製 まず、センスプライマー７（ＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧ
ＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡ）およびアンチセンスプライ
マー７（ＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＴＴＡ
ＧＡＧＣＴＴＡＴＡＴＡＡ）を化学合成機にて合成した
（配列表の配列番号４３および４４）。このセンスプラ
イマーはヒトＦａｓリガンド細胞外領域のＮ末端側に位
置するアミノ酸配列をコードする塩基配列とＰｓｔＩサ
イト（ＣＴＧＣＡＧ）を含んでいる。また、アンチセン
スプライマーは、ＴＡＡ終止コドンを含む領域とＨｉｎ
ｄIII サイト（ＡＡＧＣＴＴ）、ＫｐｎＩサイト（ＧＧ
ＴＡＣＣ）を含んでいる。

【０１８６】得られたセンスプライマーおよびアンチセ
ンスプライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌ、実施例１２
（１）で得たプラスミドｐＢＸ−ｈＦＬ１を５０ｎｇ、
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ２
０ｎｍｏｌ、２．５ユニットのｐｆｕポリメラーゼと添
付のｐｆｕバッファー（共にストラタジーン社製）を１
０μｌ含む１００μｌの溶液を調整した。ＤＮＡサーマ
ルサイクラー（ＰＣＲシステム９６００，パーキンエル
マー社製）を使用して；９４℃、３０秒；５５℃、３０
秒；７２℃、１分を１サイクルとするＰＣＲを３０サイ
クル行った。得られたＰＣＲ産物をＰｓｔＩ、Ｈｉｎｄ
III で二重消化し、ｐＵＣ１１８のＰｓｔＩ、Ｈｉｎｄ
III サイトに組み込み、得られたプラスミドをｐＭ１０
６７と命名した。

【０１８７】（２）プラスミドｐＭ１０７０の作製 センスプライマー８（ＴＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧ
ＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧ）およびアンチセンスプライ
マー８（ＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧ
ＡＧＣＡＡＣＡＧＡＣＧＴＡＡＧ）を化学合成機にて合
成した（配列表の配列番号４５および４６）。このセン
スプライマーはヒトＦａｓ抗原シグナルペプチドをコー
ドする配列の５’末端領域とＥｃｏＲＩサイト（ＧＡＡ
ＴＴＣ）を含んでいる。一方、アンチセンスプライマー
はヒトＦａｓ抗原シグナルペプチドをコードする配列の
３’末端領域とヒトＦａｓリガンド細胞外領域のＮ末端
側をコードする塩基配列およびＰｓｔＩサイトを含んで
いる。

【０１８８】得られたセンスプライマー、アンチセンス
プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌ、実施例１（３）
で使用したプラスミドｐＢＬＦ５８−１を５０ｎｇ、ｄ
ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ２０
ｎｍｏｌ、２．５ユニットのｐｆｕポリメラーゼと添付
のｐｆｕバッファー（共にストラタジーン社製）を１０
μｌ含む１００μｌの溶液を調整し、（１）と同様にＰ
ＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ、Ｐｓ
ｔＩで二重消化し、（１）で得たプラスミドｐＭ１０６
７のＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩサイト間に組み込んだ。さら
に、これをＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩで二重消化し、アガロ
ースゲル電気泳動に供した。約６００ｂｐの断片を回収
し、キアジエン（QIAGEN）社製のキアエックス（QIAEX
^TM）キットを使用して、ＤＮＡを精製した。実施例１４
（２）で使用したｐＥＦ−ＢＯＳにＤＨＦＲ遺伝子を組
換えたプラスミドｐＭ１１０３を準備し、そのＥｃｏＲ
Ｉ、ＫｐｎＩサイト間に、上述の約６００ｂｐのＤＮＡ
断片を組み込み、得られたプラスミドをｐＭ１０７０と
命名した。

【０１８９】（３）ＣＯＳ細胞への導入 ｐＭ１０７０および実施例１２（１）で作製したｐＥＸ
−ｈＦＬ１を各々ＣＯＳ−１細胞へ導入し、形質転換体
ＣＯＳ−１／ｐＭ１０７０およびＣＯＳ−１／ｐＥＸ−
ｈＦＬ１を作製した。すわなち、８. １μｇのｐＭ１０
７０あるいはｐＥＸ−ｈＦＬ１を４０μｌの１０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）／１ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸（以下、Tris/EDTA と記す）溶液に溶解した。
これらに、それぞれ、０．２ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキ
ストランおよび５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.
４）を含有するＤ−ＭＥＭ（日水製薬（株）製）１１.
３ｍｌを添加し、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液
を作製した。

【０１９０】１５０ｃｍ² のルーフラスコ内でセミコン
フルエントまで単層培養したＣＯＳ−１細胞にＤＮＡ−
ＤＥＡＥデキストラン混合液を滴下し、５％ＣＯ₂ 存在
下で、３７℃にて培養し、形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＭ
１０７０およびＣＯＳ−１／ｐＥＸ−ｈＦＬ１を得た。
４時間後、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液を除去
し、１０％ＦＢＳ（アーバンサイエンティフィック社
製）を含有するＤ−ＭＥＭに交換し、さらに４８〜９６
時間培養した。ＣＯＳ−１／ｐＭ１０７０およびＣＯＳ
−１／ｐＥＸ−ｈＦＬ１の培養上清を回収し、以下の
（４）および（５）で使用した。

【０１９１】（４）細胞障害活性の確認 （３）で得た培養上清の細胞障害活性を、ＷＣ８細胞あ
るいはＷ４細胞をターゲット細胞として、実施例８およ
び実施例１２と同様に測定した。すなわち、１０⁶個の
ＷＣ８細胞あるいはＷ４細胞を、２０μＣｉの［⁵¹Ｃ
ｒ］クロム酸ナトリウム（アマーシャム社製）を含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地を用いて３７℃で２時間培養し、⁵¹
Ｃｒで標識した。⁵¹Ｃｒで標識した細胞を１×１０⁴個
含む反応液中に、（３）で得た細胞培養上清を終濃度３
％あるいは１０％となるように添加し、３７℃で４時間
培養後、⁵¹Ｃｒの遊離を指標に細胞障害活性を測定し
た。結果を図３３および３４に示した。図から明らかな
ように、ＣＯＳ−１／ｐＭ１０７０およびＣＯＳ−１／
ｐＥＸ−ｈＦＬ１の培養上清は、ＷＣ８細胞あるいはＷ
４細胞に対して濃度依存的に細胞障害活性を示した。図
中、Ｍｏｃｋは、コントロール（対照）を示す。以上の
結果より、これらの培養上清中には、Ｆａｓ抗原と結合
してアポトーシスを誘導する活性を有するＦａｓリガン
ドが含まれていることが確認された。

【０１９２】（５）形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＭ１０７
０およびＣＯＳ−１／ｐＥＸ−ｈＦＬ１の培養上清を使
用したウエスタンブロッティング ヒトＦａｓリガンドのアミノ酸配列の一部（ＰＳＰＰＰ
ＥＫＫＥＬＲＫＶＡＨ、配列表の配列番号４７）を認識
するウサギ抗血清を公知方法に従って作製し、以下の方
法でウエスタンブロッティングを行った。まず、（３）
で得た形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＭ１０７０およびＣＯ
Ｓ−１／ｐＥＸ−ｈＦＬ１の培養上清１０μｌをそれぞ
れ蒸留水５μｌとを混合した。これらに、４％ＳＤＳ、
２８％グリセロール、０．１６％ＢＰＢを含む０．２Ｍ
トリス塩酸（ｐＨ６．８）５μｌもしくは４％ＳＤＳ、
２８％グリセロール、０．８％ＤＴＴ、０．１６％ＢＰ
Ｂを含む０．２Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．８）５μｌを加
え、それぞれ３７℃で１時間処理した後、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（５−２０％グラジエント
ゲル）を行った。泳動終了後、ＰＶＤＦ膜（アトー社
製）に室温にて２００ｍＡ、６０分の条件で転写した。
スキムミルク（雪印乳業（株）社製）を使用して４℃、
一夜反応させ、ブロッキングを行ったのち、メンブレン
をＰＢＳで１回（室温で１５分インキュベート）、０．
１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで２回（室温で５分インキ
ュベート）洗浄した。

【０１９３】上述のウサギ抗血清を０．５％ＢＳＡ／
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで１，０００倍に希釈
し、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、０．１％
Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、さら
に、０．５％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ
で１，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサ
ギイムノグロブリンズ抗体（Cat.No. P448、ダコ社製）
溶液に浸し、室温で１時間反応させた。メンブレンを
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄し、表面の
水を切り、ＥＣＬシステム（アマーシャム社製）で検出
した。その結果、ＣＯＳ−１／ｐＭ１０７０の培養上清
では、還元条件下で２９ｋＤ付近に、非還元条件下で２
６ｋＤ付近に、それぞれバンドが認められた。一方、Ｃ
ＯＳ−１／ｐＥＸ−ｈＦＬ１の培養上清では、還元条件
下で２６ｋＤ付近に、非還元条件下で２４ｋＤ付近にそ
れぞれバンドが検出された。非還元条件下でのウェスタ
ンブロットの結果をそれぞれ図３５および３６に示し
た。図中、Ｍｏｃｋは、図３３および３４と同じであ
る。

【０１９４】（実施例１９）アンチセンスオリゴヌクレ
オチドによるＦａｓリガンドの発現抑制 （１）アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成 配列表の配列番号１７の２０番目から４１番目の塩基配
列（ＴＡＡＡＡＣＣＧＴＴＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧ）
をもつ２２塩基よりなるフォスフォロチオエート型セン
スオリゴヌクレオチド（以下、センスオリゴヌクレオチ
ドＳ２０と呼ぶ）およびそれに相補的な塩基配列（ＣＣ
ＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＡＡＣＧＧＴＴＴＴＡ）をもつフ
ォスフォロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチ
ド（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ４１と呼
ぶ）を公知方法にて合成した（配列表の配列番号４８お
よび４９）。得られた合成オリゴヌクレオチドを１ｍＭ
となるようにＴＥバッファーに溶解した。

【０１９５】（２）アンチセンスオリゴヌクレオチドの
細胞への導入 ヒトＦａｓリガンドを発現する形質転換体ＦＬｈ１細胞
（実施例１６参照）を１０％の非働化ＦＢＳを含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地に懸濁し、２．０×１０⁴ 個／１９６
μｌ／ウェルとなるように９６ウェルプレート（ヌンク
社製）の各ウェルに添加した。（１）で得た１ｍＭのア
ンチセンスオリゴヌクレオチドＡ４１を、終濃度２０μ
Ｍとなるように４μｌずつ各ウェルに添加し、５％ＣＯ
₂ 存在下で３日間培養し、細胞にオリゴヌクレオチドを
導入した。同様に、１ｍＭのセンスオリゴヌクレオチド
Ｓ２０あるいはＴＥバッファーをそれぞれ４μｌずつ各
ウェルに添加し、５％ＣＯ₂ 存在下で３日間培養し、コ
ントロールとした。

【０１９６】（３）細胞障害活性の測定 （２）で３日間培養したＦＬｈ１細胞をエフェクター細
胞とし、ヒトＦａｓ抗原を発現する形質転換体ＷＣ８に
対する細胞障害活性を測定した。細胞障害活性の測定
は、実施例８および１２で用いた方法に従い行った。す
なわち、１０⁶ 個のＷＣ８細胞を２０μＣｉの［⁵¹Ｃ
ｒ］クロム酸ナトリウム（ＮＥＮ社製）を含むＲＰＭＩ
１６４０培地を用いて３７℃で２時間培養し、⁵¹Ｃｒで
標識した細胞（１×１０⁴ ）を上記エフェクター細胞と
Ｅ／Ｔ比３対１の割合で混合した。３７℃で５時間培養
後、⁵¹Ｃｒの遊離を指標に細胞障害活性を測定した。そ
の結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ４１を導入
したＦＬｈ１細胞ではＷＣ８細胞に対するアポトーシス
誘導活性が抑制された（図３７）。

【０１９７】（実施例２０）アンチセンスオリゴヌクレ
オチドによるＦａｓリガンドの発現抑制（リポフェクシ
ョン） （１）アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成 配列表の配列番号１７のヒトＦａｓリガンドをコードす
るＤＮＡ配列を参考に、フォスフォロチオエート型のセ
ンスオリゴヌクレオチド、Ｓ５０、Ｓ１６３、Ｓ３３
８、Ｓ４８４、Ｓ７１４、Ｓ９０５、およびフォスフォ
ロチオエート型のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡ６
９、Ａ１８４、Ａ３５５、Ａ５０５、Ａ７３３、Ａ９２
４を公知方法にて合成した（配列表の配列番号５０〜６
１）。このうち、センスオリゴヌクレオチドＳ５０およ
びアンチセンスオリゴヌクレオチドＡ６９は、それぞ
れ、配列番号１７の５０番目から６９番目の塩基配列
（ＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣ）および
その相補的な配列（ＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＡＧＣ
ＴＧＧＴ）をもつ２０塩基よりなるオリゴヌクレオチド
である。

【０１９８】センスオリゴヌクレオチドＳ１６３および
アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ１８４は、それぞ
れ、配列番号１７の１６３番目から１８４番目の塩基配
列（ＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＡ）
およびそれに相補的な塩基配列（ＴＧＡＣＣＡＧＧＣＣ
ＴＴＣＴＧＧＧＣＡＣＡＧ）をもつ２２塩基からなるオ
リゴヌクレオチドである。センスオリゴヌクレオチドＳ
３３８およびアンチセンスオリゴヌクレオチドＡ３５５
は、それぞれ、配列番号１７の３３８番目から３５５番
目の塩基配列（ＣＴＴＧＧＴＡＧＧＡＴＴＧＧＧＣＣ
Ｔ）およびそれに相補的な塩基配列（ＡＧＧＣＣＣＡＡ
ＴＣＣＴＡＣＣＡＡＧ）をもつ１８塩基からなるオリゴ
ヌクレオチドである。

【０１９９】センスオリゴヌクレオチドＳ４８４および
アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ５０５は、配列番号
１７の４８４番目から５０５番目の塩基配列（ＡＧＣＴ
ＧＡＧＧＡＡＡＧＴＧＧＣＣＣＡＴＴＴ）およびそれに
相補的な塩基配列（ＡＡＡＴＧＧＧＣＣＡＣＴＴＴＣＣ
ＴＣＡＧＣＴ）をもつ２２塩基からなるオリゴヌクレオ
チドである。センスオリゴヌクレオチドＳ７１４および
アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ７３３は、それぞれ
配列番号１７の７１４番目から７３３番目の塩基配列
（ＣＣＣＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴ）および
それに相補的な塩基配列（ＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＧＡＴ
ＣＣＴＧＧＧＧ）をもつ２０塩基からなるオリゴヌクレ
オチドである。

【０２００】センスオリゴヌクレオチドＳ９０５および
アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ９２４はそれぞれ、
配列番号１７の９０５番目から９２４番目の塩基配列
（ＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＴＴＣ）および
それに相補的な塩基配列（ＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧ
ＣＴＴＣＴＣＴ）をもつ２０塩基からなるオリゴヌクレ
オチドである。得られた上記の合成オリゴヌクレオチド
を、それぞれ１ｍＭ濃度となるようにＴＥバッファーに
溶解した。

【０２０１】（２）アンチセンスオリゴヌクレオチドの
細胞への導入 まず、ヒトＦａｓリガンドをコードするｃＤＮＡを含む
プラスミドｐＥＸ−ｈＦＬ１（実施例１２（２）参照）
でマウス線維芽細胞様細胞株Ｌ９２９を形質転換した。
そのうちの１クローンＬＦＬｈ３細胞を１０％のＦＢＳ
を含むＤ−ＭＥＭに懸濁し、３．０×１０⁵ 個／２．０
ｍｌ／ウェルとなるように６ウェルプレート（ヌンク社
製）に植え込み、５％ＣＯ₂ 存在下、３７℃にて一夜培
養した。翌日、（１）で合成したオリゴヌクレオチドを
終濃度１μＭとなるようにリポフェクトアミン（ギブコ
BRL社製）４０μｇを含有するオプティ−ＭＥＭＩ（Ｏ
ＰＴＩ−ＭＥＭ^TMＩ、ギブコ BRL社製）１，０００μｌ
に懸濁し、オリゴヌクレオチドリポフェクトアミン混合
液を作製し、５％ＣＯ₂ 存在下、３７℃にて一夜培養
し、培地を除去した後、ＬＦＬｈ３細胞に添加した。５
％ＣＯ₂ 存在下、３７℃にて４時間培養後、２０％非働
化ＦＢＳ及び１μＭオリゴヌクレオチドを含有するＤ−
ＭＥＭを１，０００μｌ添加し、さらに１６時間培養す
ることにより、ＬＦＬｈ３細胞に（１）で合成したオリ
ゴヌクレオチドを導入した。

【０２０２】（３）細胞障害活性の測定 （２）でオリゴヌクレオチドを導入したＬＦＬｈ３細胞
を回収し、トリプシン溶液で３分間処理した後、細胞障
害活性測定用のエフェクター細胞として用いた。細胞障
害活性の測定は、実施例８および１２で用いた方法に従
い行った。すなわち、１０⁶ 個のＷＣ８細胞を２０μＣ
ｉの［⁵¹Ｃｒ］クロム酸ナトリウム（ＮＥＮ社製）を含
むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて３７℃で２時間培養
し、⁵¹Ｃｒで標識した細胞（１×１０⁴ ）を上記エフェ
クター細胞とＥ／Ｔ比１対１の割合で混合した。３７℃
で４時間培養後、⁵¹Ｃｒの遊離を指標に細胞障害活性を
測定した。その結果、上述のアンチセンスオリゴヌクレ
オチド、Ａ６９，Ａ１８４，Ａ３５５，Ａ５０５，Ａ７
３３，Ａ９２４を導入したＬＦＬｈ３細胞ではＷＣ８細
胞に対するアポトーシス誘導活性が抑制された。これら
のアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異的細胞溶解抑
制率を以下の式より計算し、図３８に示した。

【０２０３】ＳＣＬ（％）＝１−（ＳＣＬ_AON-LFLh−Ｓ
ＣＬ_SON-LFLh） ＳＣＬ：特異的細胞溶解抑制率 ＳＣＬ_AON-LFLh：アンチセンスオリゴヌクレオチドを導
入したＬＦＬｈ３細胞の特異的細胞溶解率 ＳＣＬ_SON-LFLh：センスオリゴヌクレオチドを導入した
ＬＦＬｈ３細胞の特異的細胞溶解率

【０２０４】（参考例１）ｇｌｄ（Ｃ３Ｈ−ｇｌｄ／ｇ
ｌｄ）マウスからのＦａｓリガンドに対するｃＤＮＡの
クローニング ｇｌｄ（Ｃ３Ｈ−ｇｌｄ／ｇｌｄ）マウスの脾臓細胞を
実施例１４の方法で培養し、実施例１４の方法で１本鎖
ｃＤＮＡの合成およびＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ
産物を、ＸｂａＩで制限酵素処理後、１％アガロースゲ
ルで分離し、約９４０ｂｐＤＮＡフラグメントを回収し
た。これを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）の
ＸｂａＩサイトにサブクローニングし、その塩基配列を
決定した。得られた塩基配列を、実施例１４（１）で確
認した配列と比較したところ、得られたＰＣＲ産物の配
列は、実施例１４（１）で得られた配列の３’末端近く
のＴ（配列番号１８の塩基番号８４９）がＣに変異して
いることが明らかになった（配列表の配列番号６２）。
この１塩基の変異により、アミノ酸配列にも変異が生じ
ていた。すなわち、ｇｌｄマウスにおいては、マウスＦ
ａｓリガンドの細胞外領域に位置する２７３番目のアミ
ノ酸がフェニルアラニンからロイシンに変異していた。

【０２０５】（参考例２）ｇｌｄマウス由来のＦａｓリ
ガンドの細胞障害活性 参考例１で得られた約９４０ｂｐのＸｂａＩフラグメン
トを、動物細胞発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳのＸｂａＩ
部位に挿入した。実施例（２）と同様の方法で、ＣＯＳ
細胞を形質転換した。形質転換したＣＯＳ細胞をエフェ
クター細胞とし、実施例１４（３）の方法で細胞障害活
性を測定した。その結果、ｇｌｄマウスより得られたＦ
ａｓリガンドｃＤＮＡで形質転換させたＣＯＳ細胞は細
胞障害活性を示さなかった（図２６）。以上の結果よ
り、自己免疫疾患のモデルであるｇｌｄマウスでは、Ｆ
ａｓリガンドによるアポトーシスの誘導が正常に起こら
ないことが確認された。今回の結果と、オガサワラ(Oga
sawara J.)等の報告から、自己免疫疾患の原因として、
Ｆａｓ抗原の異常およびＦａｓリガンドの異常の少なく
とも２つがあることが示唆された。いずれの場合も、自
己反応性のＴ細胞にアポトーシスを誘導することができ
ず、自己反応性のＴ細胞が生体内より除去されなかった
ため、自己免疫疾患が生じることが予想された。

【０２０６】

【発明の効果】本発明により、Ｆａｓ抗原に結合する新
規蛋白質が提供される。当該新規蛋白質は、Ｆａｓ抗原
を介したアポトーシスが関与する疾患、たとえば自己免
疫疾患や、ウイルス感染の治療薬として開発する事がで
きる。また、当該新規蛋白質は抗体を作製する際の抗原
として使用できるほか、試料中の当該蛋白質を、抗体を
使用して競合反応にて測定する際に使用することができ
る。本発明によればまた、Ｆａｓ抗原に結合する新規蛋
白質をコードするＤＮＡが提供される。

【０２０７】当該ＤＮＡは、前記新規蛋白質を遺伝子工
学的手法を使用して、工業的に大量生産するために使用
できる。また、ＤＮＡプローブを作製するためにも使用
できる。さらに、自己免疫疾患では、遺伝的にアポトー
シスの機構が欠損しているケースが考えられるが、当該
新規ＤＮＡは、このような疾患の遺伝子治療にも使用す
る事ができる。さらに、ＤＮＡ配列が明らかになったこ
とにより、Ｆａｓリガンド遺伝子もしくはＦａｓリガン
ドに対するｍＲＮＡの一部に相補的な塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体が提
供される。当該オリゴヌクレオチドは、Ｆａｓリガンド
の発現を調節するために使用できる他、診断用プローブ
としても利用できる。

【０２０８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２８１ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列： Met Gln Gln Pro Xaa Asn Tyr Pro Xaa Pro Gln Ile Xaa Trp Val 5 10 15 Asp Ser Ser Ala Xaa Ser Xaa Trp Ala Pro Pro Gly Xaa Val Xaa 20 25 30 Xaa Cys Pro Xaa Xaa Xaa Pro Arg Xaa Pro Xaa Gln Arg Arg Pro 35 40 45 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Pro Pro Pro Xaa 50 55 60 Xaa Pro Xaa Pro Xaa Xaa Pro Leu Xaa Pro Leu Lys Lys Xaa Xaa 65 70 75 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Xaa Val Xaa Phe Phe Met Val 80 85 90 Leu Val Ala Leu Val Gly Xaa Gly Leu Gly Met Xaa Gln Leu Phe 95 100 105 His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Xaa Thr Xaa Xaa 110 115 120 Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Ser Xaa Glu Lys Gln Ile Xaa Xaa Pro Ser 125 130 135 Xaa Pro Xaa Glu Xaa Lys Xaa Xaa Arg Xaa Val Ala His Leu Thr 140 145 150 Gly Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ser Xaa Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr 155 160 165 Tyr Gly Xaa Xaa Leu Xaa Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly 170 175 180 Leu Val Ile Asn Glu Xaa Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val 185 190 195 Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Xaa Xaa Pro Leu Xaa His Lys 200 205 210 Val Tyr Met Arg Asn Xaa Lys Tyr Pro Xaa Asp Leu Val Xaa Met 215 220 225 Glu Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Xaa Trp Ala 230 235 240 Xaa Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Xaa Ala Asp 245 250 255 His Leu Tyr Val Asn Xaa Ser Xaa Leu Ser Leu Xaa Asn Phe Glu 260 265 270 Glu Ser Xaa Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 280 281

【０２０９】配列番号：２ 配列の長さ：２８１ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ヒト 配列： Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val 5 10 15 Asp Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu 20 25 30 Pro Cys Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro 35 40 45 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly 65 70 75 Asn His Ser Thr Gly Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val 80 85 90 Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe 95 100 105 His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln 110 115 120 Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly His Pro Ser 125 130 135 Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr 140 145 150 Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr 155 160 165 Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly 170 175 180 Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val 185 190 195 Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys 200 205 210 Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met 215 220 225 Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala 230 235 240 Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp 245 250 255 His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu 260 265 270 Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 280 281

【０２１０】配列番号：３ 配列の長さ：２７８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ラット 配列： Met Gln Gln Pro Val Asn Tyr Pro Cys Pro Gln Ile Tyr Trp Val 5 10 15 Asp Ser Ser Ala Thr Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Ser Val Phe 20 25 30 Ser Cys Pro Ser Ser Gly Pro Arg Gly Pro Gly Gln Arg Arg Pro 35 40 45 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Pro Pro Pro Ser Gln 50 55 60 Pro Pro Pro Leu Pro Pro Leu Ser Pro Leu Lys Lys Lys Asp Asn 65 70 75 Ile Glu Leu Trp Leu Pro Val Ile Phe Phe Met Val Leu Val Ala 80 85 90 Leu Val Gly Met Gly Leu Gly Met Tyr Gln Leu Phe His Leu Gln 95 100 105 Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Phe Thr Asn His Ser Leu Arg 110 115 120 Val Ser Ser Phe Glu Lys Gln Ile Ala Asn Pro Ser Thr Pro Ser 125 130 135 Glu Thr Lys Lys Pro Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn Pro 140 145 150 Arg Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Thr 155 160 165 Ala Leu Ile Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile 170 175 180 Asn Glu Ala Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg 185 190 195 Gly Gln Ser Cys Asn Ser Gln Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met 200 205 210 Arg Asn Phe Lys Tyr Pro Gly Asp Leu Val Leu Met Glu Glu Lys 215 220 225 Lys Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Ile Trp Ala His Ser Ser 230 235 240 Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Val Ala Asp His Leu Tyr 245 250 255 Val Asn Ile Ser Gln Leu Ser Leu Ile Asn Phe Glu Glu Ser Lys 260 265 270 Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 278

【０２１１】配列番号：４ 配列の長さ：２７９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：マウス 配列： Met Gln Gln Pro Met Asn Tyr Pro Cys Pro Gln Ile Phe Trp Val 5 10 15 Asp Ser Ser Ala Thr Ser Ser Trp Ala Pro Pro Gly Ser Val Phe 20 25 30 Pro Cys Pro Ser Cys Gly Pro Arg Gly Pro Asp Gln Arg Arg Pro 35 40 45 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val Ser Pro Leu Pro Pro Pro Ser Gln 50 55 60 Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Thr Pro Leu Lys Lys Lys Asp His 65 70 75 Asn Thr Asn Leu Trp Leu Pro Val Val Phe Phe Met Val Leu Val 80 85 90 Ala Leu Val Gly Met Gly Leu Gly Met Tyr Gln Leu Phe His Leu 95 100 105 Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Phe Thr Asn Gln Ser Leu 110 115 120 Lys Val Ser Ser Phe Glu Lys Gln Ile Ala Asn Pro Ser Thr Pro 125 130 135 Ser Glu Lys Lys Glu Pro Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn 140 145 150 Pro His Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly 155 160 165 Thr Ala Leu Ile Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val 170 175 180 Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe 185 190 195 Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Gln Pro Leu Asn His Lys Val Tyr 200 205 210 Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Glu Asp Leu Val Leu Met Glu Glu 215 220 225 Lys Arg Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Ile Trp Ala His Ser 230 235 240 Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu 245 250 255 Tyr Val Asn Ile Ser Gln Leu Ser Leu Ile Asn Phe Glu Glu Ser 260 265 270 Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 279

【０２１２】配列番号：５ 配列の長さ：１７９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列： Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Xaa 5 10 15 Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Ser Xaa Glu Lys Gln Ile Xaa 20 25 30 Xaa Pro Ser Xaa Pro Xaa Glu Xaa Lys Xaa Xaa Arg Xaa Val Ala 35 40 45 His Leu Thr Gly Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ser Xaa Pro Leu Glu Trp 50 55 60 Glu Asp Thr Tyr Gly Xaa Xaa Leu Xaa Ser Gly Val Lys Tyr Lys 65 70 75 Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Xaa Gly Leu Tyr Phe Val Tyr 80 85 90 Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Xaa Xaa Pro Leu 95 100 105 Xaa His Lys Val Tyr Met Arg Asn Xaa Lys Tyr Pro Xaa Asp Leu 110 115 120 Val Xaa Met Glu Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Tyr Cys Thr Thr Gly Gln 125 130 135 Xaa Trp Ala Xaa Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr 140 145 150 Xaa Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Xaa Ser Xaa Leu Ser Leu Xaa 155 160 165 Asn Phe Glu Glu Ser Xaa Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 170 175 179

【０２１３】配列番号：６ 配列の長さ：１７９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ヒト 配列： Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser 5 10 15 Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly 20 25 30 His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala 35 40 45 His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp 50 55 60 Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys 65 70 75 Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr 80 85 90 Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu 95 100 105 Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu 110 115 120 Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln 125 130 135 Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr 140 145 150 Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val 155 160 165 Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 170 175 179

【０２１４】配列番号：７ 配列の長さ：１７９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ラット 配列： Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Phe 5 10 15 Thr Asn His Ser Leu Arg Val Ser Ser Phe Glu Lys Gln Ile Ala 20 25 30 Asn Pro Ser Thr Pro Ser Glu Thr Lys Lys Pro Arg Ser Val Ala 35 40 45 His Leu Thr Gly Asn Pro Arg Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp 50 55 60 Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu Ile Ser Gly Val Lys Tyr Lys 65 70 75 Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Ala Gly Leu Tyr Phe Val Tyr 80 85 90 Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Ser Gln Pro Leu 95 100 105 Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Phe Lys Tyr Pro Gly Asp Leu 110 115 120 Val Leu Met Glu Glu Lys Lys Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gln 125 130 135 Ile Trp Ala His Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr 140 145 150 Val Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Ile Ser Gln Leu Ser Leu Ile 155 160 165 Asn Phe Glu Glu Ser Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 170 175 179

【０２１５】配列番号：８ 配列の長さ：１７９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：マウス 配列： Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Phe 5 10 15 Thr Asn Gln Ser Leu Lys Val Ser Ser Phe Glu Lys Gln Ile Ala 20 25 30 Asn Pro Ser Thr Pro Ser Glu Lys Lys Glu Pro Arg Ser Val Ala 35 40 45 His Leu Thr Gly Asn Pro His Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp 50 55 60 Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu Ile Ser Gly Val Lys Tyr Lys 65 70 75 Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr 80 85 90 Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Gln Pro Leu 95 100 105 Asn His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Glu Asp Leu 110 115 120 Val Leu Met Glu Glu Lys Arg Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gln 125 130 135 Ile Trp Ala His Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr 140 145 150 Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Ile Ser Gln Leu Ser Leu Ile 155 160 165 Asn Phe Glu Glu Ser Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 170 175 179

【０２１６】配列番号：９ 配列の長さ：８４３ 配列の型：核酸 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ヒト 直接の起源： クローン名：ｐＢＸ−ｈＦＬ１ 配列： ATG CAG CAG CCC TTC AAT TAC CCA TAT CCC CAG ATC TAC TGG GTG 45 Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val 5 10 15 GAC AGC AGT GCC AGC TCT CCC TGG GCC CCT CCA GGC ACA GTT CTT 90 Asp Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu 20 25 30 CCC TGT CCA ACC TCT GTG CCC AGA AGG CCT GGT CAA AGG AGG CCA 135 Pro Cys Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro 35 40 45 CCA CCA CCA CCG CCA CCG CCA CCA CTA CCA CCT CCG CCG CCG CCG 180 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 CCA CCA CTG CCT CCA CTA CCG CTG CCA CCC CTG AAG AAG AGA GGG 225 Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly 65 70 75 AAC CAC AGC ACA GGC CTG TGT CTC CTT GTG ATG TTT TTC ATG GTT 270 Asn His Ser Thr Gly Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val 80 85 90 CTG GTT GCC TTG GTA GGA TTG GGC CTG GGG ATG TTT CAG CTC TTC 315 Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe 95 100 105 CAC CTA CAG AAG GAG CTG GCA GAA CTC CGA GAG TCT ACC AGC CAG 360 His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln 110 115 120 ATG CAC ACA GCA TCA TCT TTG GAG AAG CAA ATA GGC CAC CCC AGT 405 Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly His Pro Ser 125 130 135 CCA CCC CCT GAA AAA AAG GAG CTG AGG AAA GTG GCC CAT TTA ACA 450 Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr 140 145 150 GGC AAG TCC AAC TCA AGG TCC ATG CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACC 495 Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr 155 160 165 TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAG GGT GGC 540 Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly 170 175 180 CTT GTG ATC AAT GAA ACT GGG CTG TAC TTT GTA TAT TCC AAA GTA 585 Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val 185 190 195 TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC AAC AAC CTG CCC CTG AGC CAC AAG 630 Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys 200 205 210 GTC TAC ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCC CAG GAT CTG GTG ATG ATG 675 Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met 215 220 225 GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC TGC ACT ACT GGG CAG ATG TGG GCC 720 Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala 230 235 240 CGC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTG TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAT 765 Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp 245 250 255 CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG CTC TCT CTG GTC AAT TTT GAG 810 His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu 260 265 270 GAA TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG CTC 843 Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 280 281

【０２１７】配列番号：１０ 配列の長さ：８３４ 配列の型：核酸 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ラット 株名 ：ＰＣ６０−ｄ１０Ｓ−２ 直接の起源： クローン名：ｐＴＮ２４−１５ 配列： ATG CAG CAG CCC GTG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TAC TGG GTA 45 Met Gln Gln Pro Val Asn Tyr Pro Cys Pro Gln Ile Tyr Trp Val 1 5 10 15 GAC AGC AGT GCC ACT TCT CCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT 90 Asp Ser Ser Ala Thr Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Ser Val Phe 20 25 30 TCT TGT CCA TCC TCT GGG CCT AGA GGG CCA GGA CAA AGG AGA CCA 135 Ser Cys Pro Ser Ser Gly Pro Arg Gly Pro Gly Gln Arg Arg Pro 35 40 45 CCG CCT CCA CCA CCA CCT CCA TCA CCA CTA CCA CCG CCT TCC CAA 180 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Pro Pro Pro Ser Gln 50 55 60 CCA CCC CCG CTG CCT CCA CTA AGC CCT CTA AAG AAG AAG GAC AAC 225 Pro Pro Pro Leu Pro Pro Leu Ser Pro Leu Lys Lys Lys Asp Asn 65 70 75 ATA GAG CTG TGG CTA CCG GTG ATA TTT TTC ATG GTG CTG GTG GCT 270 Ile Glu Leu Trp Leu Pro Val Ile Phe Phe Met Val Leu Val Ala 80 85 90 CTG GTT GGA ATG GGG TTA GGA ATG TAT CAA CTC TTT CAT CTA CAG 315 Leu Val Gly Met Gly Leu Gly Met Tyr Gln Leu Phe His Leu Gln 95 100 105 AAG GAA CTG GCA GAA CTC CGT GAG TTC ACC AAC CAC AGC CTT AGA 360 Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Phe Thr Asn His Ser Leu Arg 110 115 120 GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC AAC CCC AGC ACA CCC TCT 405 Val Ser Ser Phe Glu Lys Gln Ile Ala Asn Pro Ser Thr Pro Ser 125 130 135 GAA ACC AAA AAG CCA AGG AGT GTG GCC CAC TTA ACA GGG AAC CCC 450 Glu Thr Lys Lys Pro Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn Pro 140 145 150 CGC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACA TAT GGA ACT 495 Arg Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Thr 155 160 165 GCT TTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA GGC GGC CTT GTG ATC 540 Ala Leu Ile Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile 170 175 180 AAT GAG GCT GGG TTG TAC TTC GTA TAT TCC AAA GTA TAC TTC CGG 585 Asn Glu Ala Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg 185 190 195 GGT CAG TCT TGC AAC AGC CAG CCC CTA AGC CAC AAG GTC TAT ATG 630 Gly Gln Ser Cys Asn Ser Gln Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met 200 205 210 AGG AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG GTG CTA ATG GAG GAG AAG 675 Arg Asn Phe Lys Tyr Pro Gly Asp Leu Val Leu Met Glu Glu Lys 215 220 225 AAG TTG AAT TAC TGC ACT ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC AGC 720 Lys Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Ile Trp Ala His Ser Ser 230 235 240 TAC CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC GTT GCT GAC CAT TTA TAT 765 Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Val Ala Asp His Leu Tyr 245 250 255 GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG 810 Val Asn Ile Ser Gln Leu Ser Leu Ile Asn Phe Glu Glu Ser Lys 260 265 270 ACC TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT 834 Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 278

【０２１８】配列番号：１１ 配列の長さ：８３７ 配列の種類：核酸 配列の型：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：マウス 直接の起源： クローン名：ｐＢＬ−ＭＦＬＷ４ 配列： ATG CAG CAG CCC ATG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TTC TGG GTA 45 Met Gln Gln Pro Met Asn Tyr Pro Cys Pro Gln Ile Phe Trp Val 5 10 15 GAC AGC AGT GCC ACT TCA TCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT 90 Asp Ser Ser Ala Thr Ser Ser Trp Ala Pro Pro Gly Ser Val Phe 20 25 30 CCC TGT CCA TCT TGT GGG CCT AGA GGG CCG GAC CAA AGG AGA CCG 135 Pro Cys Pro Ser Cys Gly Pro Arg Gly Pro Asp Gln Arg Arg Pro 35 40 45 CCA CCT CCA CCA CCA CCT GTG TCA CCA CTA CCA CCG CCA TCA CAA 180 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val Ser Pro Leu Pro Pro Pro Ser Gln 50 55 60 CCA CTC CCA CTG CCG CCA CTG ACC CCT CTA AAG AAG AAG GAC CAC 225 Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Thr Pro Leu Lys Lys Lys Asp His 65 70 75 AAC ACA AAT CTG TGG CTA CCG GTG GTA TTT TTC ATG GTT CTG GTG 270 Asn Thr Asn Leu Trp Leu Pro Val Val Phe Phe Met Val Leu Val 80 85 90 GCT CTG GTT GGA ATG GGA TTA GGA ATG TAT CAG CTC TTC CAC CTG 315 Ala Leu Val Gly Met Gly Leu Gly Met Tyr Gln Leu Phe His Leu 95 100 105 CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC CGT GAG TTC ACC AAC CAA AGC CTT 360 Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Phe Thr Asn Gln Ser Leu 110 115 120 AAA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC AAC CCC AGT ACA CCC 405 Lys Val Ser Ser Phe Glu Lys Gln Ile Ala Asn Pro Ser Thr Pro 125 130 135 TCT GAA AAA AAA GAG CCG AGG AGT GTG GCC CAT TTA ACA GGG AAC 450 Ser Glu Lys Lys Glu Pro Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn 140 145 150 CCC CAC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACA TAT GGA 495 Pro His Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly 155 160 165 ACC GCT CTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA GGT GGC CTT GTG 540 Thr Ala Leu Ile Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val 170 175 180 ATC AAC GAA ACT GGG TTG TAC TTC GTG TAT TCC AAA GTA TAC TTC 585 Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe 185 190 195 CGG GGT CAG TCT TGC AAC AAC CAG CCC CTA AAC CAC AAG GTC TAT 630 Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Gln Pro Leu Asn His Lys Val Tyr 200 205 210 ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCT GAG GAT CTG GTG CTA ATG GAG GAG 675 Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Glu Asp Leu Val Leu Met Glu Glu 215 220 225 AAG AGG TTG AAC TAC TGC ACT ACT GGA CAG ATA TGG GCC CAC AGC 720 Lys Arg Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Ile Trp Ala His Ser 230 235 240 AGC TAC CTG GGG GCA GTA TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAC CAT TTA 765 Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu 245 250 255 TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT 810 Tyr Val Asn Ile Ser Gln Leu Ser Leu Ile Asn Phe Glu Glu Ser 260 265 270 AAG ACC TTT TTC GGC TTG TAT AAG CTT 837 Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 279

【０２１９】配列番号：１２ 配列の数：５３７ 配列の型：核酸 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ヒト 配列： CAG CTC TTC CAC CTA CAG AAG GAG CTG GCA GAA CTC CGA GAG TCT 45 Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser 5 10 15 ACC AGC CAG ATG CAC ACA GCA TCA TCT TTG GAG AAG CAA ATA GGC 90 Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly 20 25 30 CAC CCC AGT CCA CCC CCT GAA AAA AAG GAG CTG AGG AAA GTG GCC 135 His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala 35 40 45 CAT TTA ACA GGC AAG TCC AAC TCA AGG TCC ATG CCT CTG GAA TGG 180 His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp 50 55 60 GAA GAC ACC TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT GGA GTG AAG TAT AAG 225 Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys 65 70 75 AAG GGT GGC CTT GTG ATC AAT GAA ACT GGG CTG TAC TTT GTA TAT 270 Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr 80 85 90 TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC AAC AAC CTG CCC CTG 315 Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu 95 100 105 AGC CAC AAG GTC TAC ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCC CAG GAT CTG 360 Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu 110 115 120 GTG ATG ATG GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC TGC ACT ACT GGG CAG 405 Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln 125 130 135 ATG TGG GCC CGC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTG TTC AAT CTT ACC 450 Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr 140 145 150 AGT GCT GAT CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG CTC TCT CTG GTC 495 Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val 155 160 165 AAT TTT GAG GAA TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG CTC 537 Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 170 175 179

【０２２０】配列番号：１３ 配列の数：５３７ 配列の型：核酸 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ラット 株名 ：ＰＣ６０−ｄ１０Ｓ−２ 直接の起源： クローン名：ｐＴＮ２４−１５ 配列： CAA CTC TTT CAT CTA CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC CGT GAG TTC 45 Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Phe 5 10 15 ACC AAC CAC AGC CTT AGA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC 90 Thr Asn His Ser Leu Arg Val Ser Ser Phe Glu Lys Gln Ile Ala 20 25 30 AAC CCC AGC ACA CCC TCT GAA ACC AAA AAG CCA AGG AGT GTG GCC 135 Asn Pro Ser Thr Pro Ser Glu Thr Lys Lys Pro Arg Ser Val Ala 35 40 45 CAC TTA ACA GGG AAC CCC CGC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG 180 His Leu Thr Gly Asn Pro Arg Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp 50 55 60 GAA GAC ACA TAT GGA ACT GCT TTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG 225 Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu Ile Ser Gly Val Lys Tyr Lys 65 70 75 AAA GGC GGC CTT GTG ATC AAT GAG GCT GGG TTG TAC TTC GTA TAT 270 Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Ala Gly Leu Tyr Phe Val Tyr 80 85 90 TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AGC CAG CCC CTA 315 Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Ser Gln Pro Leu 95 100 105 AGC CAC AAG GTC TAT ATG AGG AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG 360 Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Phe Lys Tyr Pro Gly Asp Leu 110 115 120 GTG CTA ATG GAG GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC ACT ACT GGC CAG 405 Val Leu Met Glu Glu Lys Lys Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gln 125 130 135 ATA TGG GCC CAC AGC AGC TAC CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC 450 Ile Trp Ala His Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr 140 145 150 GTT GCT GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC 495 Val Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Ile Ser Gln Leu Ser Leu Ile 155 160 165 AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT 537 Asn Phe Glu Glu Ser Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 170 175 179

【０２２１】配列番号：１４ 配列の数：５３７ 配列の種類：核酸 配列の型：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：マウス 直接の起源： クローン名：ｐＢＬ−ＭＦＬＷ４ 配列： CAG CTC TTC CAC CTG CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC CGT GAG TTC 45 Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Phe 5 10 15 ACC AAC CAA AGC CTT AAA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC 90 Thr Asn Gln Ser Leu Lys Val Ser Ser Phe Glu Lys Gln Ile Ala 20 25 30 AAC CCC AGT ACA CCC TCT GAA AAA AAA GAG CCG AGG AGT GTG GCC 135 Asn Pro Ser Thr Pro Ser Glu Lys Lys Glu Pro Arg Ser Val Ala 35 40 45 CAT TTA ACA GGG AAC CCC CAC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG 180 His Leu Thr Gly Asn Pro His Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp 50 55 60 GAA GAC ACA TAT GGA ACC GCT CTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG 225 Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu Ile Ser Gly Val Lys Tyr Lys 65 70 75 AAA GGT GGC CTT GTG ATC AAC GAA ACT GGG TTG TAC TTC GTG TAT 270 Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr 80 85 90 TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AAC CAG CCC CTA 315 Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Gln Pro Leu 95 100 105 AAC CAC AAG GTC TAT ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCT GAG GAT CTG 360 Asn His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Glu Asp Leu 110 115 120 GTG CTA ATG GAG GAG AAG AGG TTG AAC TAC TGC ACT ACT GGA CAG 405 Val Leu Met Glu Glu Lys Arg Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gln 125 130 135 ATA TGG GCC CAC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTA TTC AAT CTT ACC 450 Ile Trp Ala His Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr 140 145 150 AGT GCT GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC 495 Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Ile Ser Gln Leu Ser Leu Ile 155 160 165 AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC TTT TTC GGC TTG TAT AAG CTT 537 Asn Phe Glu Glu Ser Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 170 175 179

【０２２２】配列番号：１５ 配列の長さ：１６２３ 配列の型：核酸 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ラット 株 名：ＰＣ６０−ｄ１０Ｓ−２ 直接の起源： クローン名：ｐＴＮ２４−１５ 配列： TCAGAGTCCT 10 GTCCTTGACA CTTCAGTCTC CACAAGACTG AGAGGAGGAA ACCCTTTCCT GGGGCTGGGT 70 GCC ATG CAG CAG CCC GTG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TAC TGG GTA 118 Met Gln Gln Pro Val Asn Tyr Pro Cys Pro Gln Ile Tyr Trp Val 1 5 10 15 GAC AGC AGT GCC ACT TCT CCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT TCT 166 Asp Ser Ser Ala Thr Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Ser Val Phe Ser 20 25 30 TGT CCA TCC TCT GGG CCT AGA GGG CCA GGA CAA AGG AGA CCA CCG CCT 214 Cys Pro Ser Ser Gly Pro Arg Gly Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro 35 40 45 CCA CCA CCA CCT CCA TCA CCA CTA CCA CCG CCT TCC CAA CCA CCC CCG 262 Pro Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Pro Pro Pro Ser Gln Pro Pro Pro 50 55 60 CTG CCT CCA CTA AGC CCT CTA AAG AAG AAG GAC AAC ATA GAG CTG TGG 310 Leu Pro Pro Leu Ser Pro Leu Lys Lys Lys Asp Asn Ile Glu Leu Trp 65 70 75 CTA CCG GTG ATA TTT TTC ATG GTG CTG GTG GCT CTG GTT GGA ATG GGG 358 Leu Pro Val Ile Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly Met Gly 80 85 90 95 TTA GGA ATG TAT CAA CTC TTT CAT CTA CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC 406 Leu Gly Met Tyr Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu 100 105 110 CGT GAG TTC ACC AAC CAC AGC CTT AGA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA 454 Arg Glu Phe Thr Asn His Ser Leu Arg Val Ser Ser Phe Glu Lys Gln 115 120 125 ATA GCC AAC CCC AGC ACA CCC TCT GAA ACC AAA AAG CCA AGG AGT GTG 502 Ile Ala Asn Pro Ser Thr Pro Ser Glu Thr Lys Lys Pro Arg Ser Val 130 135 140 GCC CAC TTA ACA GGG AAC CCC CGC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG 550 Ala His Leu Thr Gly Asn Pro Arg Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp 145 150 155 GAA GAC ACA TAT GGA ACT GCT TTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA 598 Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu Ile Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys 160 165 170 175 GGC GGC CTT GTG ATC AAT GAG GCT GGG TTG TAC TTC GTA TAT TCC AAA 646 Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Ala Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys 180 185 190 GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AGC CAG CCC CTA AGC CAC AAG 694 Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Ser Gln Pro Leu Ser His Lys 195 200 205 GTC TAT ATG AGG AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG GTG CTA ATG GAG 742 Val Tyr Met Arg Asn Phe Lys Tyr Pro Gly Asp Leu Val Leu Met Glu 210 215 220 GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC ACT ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC 790 Glu Lys Lys Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Ile Trp Ala His Ser 225 230 235 AGC TAC CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC GTT GCT GAC CAT TTA TAT 838 Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Val Ala Asp His Leu Tyr 240 245 250 255 GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC 886 Val Asn Ile Ser Gln Leu Ser Leu Ile Asn Phe Glu Glu Ser Lys Thr 260 265 270 TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT TAAAGGAAAA AGCATTTTAG AATGATCTAT 937 Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 278 TATTCTTTAT CATGGATGCC AGGAATATTG TCTTCAATGA GAGTCTTCTT AAGACCAATT 997 GAGCCACAAA GACCACAAGG TCCAACAGGT CAGCTACCCT TCATTTTCTA GAGGTCCATG 1057 GAGTGGTCCT TAATGCCTGC ATCATGAGCC AGATGGGAAG AAGACTGTTC CTGAGGAACA 1117 TAAAGTTTTG GGCTGCTGTG TGGCAATGCA GAGGCAAAGA GAAGGAACTG TCTGATGTTA 1177 AATGGCCAAG AGCATTTTAG CCATTGAAGA AAAAAAAAAC CTTTAAACTC ACCTTCCAGG 1237 GTGGGTCTAC TTGCTACCTC ACAGGAGGCC GTCTTTTAGA CACATGGTTG TGGTATGACT 1297 ATACAAGGGT GAGAAAGGAT GCTAGGTTTC ATGGATAAGC TAGAGACTGA AAAAAGCCAG 1357 TGTCCCATTG GCATCATCTT TATTTTTAAC TGATGTTTTC TGAGCCCACC TTTGATGCTA 1417 ACAGAGAAAT AAGAGGGGTG TTTGAGGCAC AAGTCATTCT CTACATAGCA TGTGTACCTC 1477 CAGTGCAATG ATGTCTGTGT GTGTTTTTAT GTATGAGAGT AGAGCGATTC TAAAGAGTCA 1537 CATGAGTACA ACGCGTACAT TACGGAGTAC ATATTAGAAA CGTATGTGTT ACATTTGATG 1597 CTAGAATATC TGAATGTTTC TTGCTA 1623

【０２２３】配列番号：１６ 配列の長さ：４２６ 配列の型：核酸 配列の種類：染色体ＤＮＡ 起源： 生物名：ヒト 株 名： 直接の起源： クローン名：ｐＢＬ−ｈＦＬ４Ｈ 配列： GATTTATTTC AGGC AAG TCC AAC TCA AGG TCC ATG CCT CTG GAA TGG GAA 50 Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu 1 5 10 GAC ACC TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAG GGT 98 Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly 15 20 25 GGC CTT GTG ATC AAT GAA ACT GGG CTG TAC TTT GTA TAT TCC AAA GTA 146 Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val 30 35 40 TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC AAC AAC CTG CCC CTG AGC CAC AAG GTC 194 Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val 45 50 55 60 TAC ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCC CAG GAT CTG GTG ATG ATG GAG GGG 242 Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly 65 70 75 AAG ATG ATG AGC TAC TGC ACT ACT GGG CAG ATG TGG GCC CGC AGC AGC 290 Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser 80 85 90 TAC CTG GGG GCA GTG TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAT CAT TTA TAT GTC 338 Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val 95 100 105 AAC GTA TCT GAG CTC TCT CTG GTC AAT TTT GAG GAA TCT CAG ACG TTT 386 Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe 110 115 120 TTC GGC TTA TAT AAG CTC TAAGAGAAGC ACTTTGGGAT TC 426 Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 125 130

【０２２４】配列番号：１７ 配列の長さ：９６７ 配列の種類：核酸 配列の型：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ヒト 組織名：Ｔリンパ球 直接の起源：ｐＢＸ−ｈＦＬ１ 配列： CTACAGGACT 10 GAGAAGAAGT AAAACCGTTT GCTGGGGCTG GCCTGACTCA CCAGCTGCC 59 ATG CAG CAG CCC TTC AAT TAC CCA TAT CCC CAG ATC TAC TGG GTG 104 Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val 5 10 15 GAC AGC AGT GCC AGC TCT CCC TGG GCC CCT CCA GGC ACA GTT CTT 149 Asp Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu 20 25 30 CCC TGT CCA ACC TCT GTG CCC AGA AGG CCT GGT CAA AGG AGG CCA 194 Pro Cys Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro 35 40 45 CCA CCA CCA CCG CCA CCG CCA CCA CTA CCA CCT CCG CCG CCG CCG 239 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 CCA CCA CTG CCT CCA CTA CCG CTG CCA CCC CTG AAG AAG AGA GGG 284 Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly 65 70 75 AAC CAC AGC ACA GGC CTG TGT CTC CTT GTG ATG TTT TTC ATG GTT 329 Asn His Ser Thr Gly Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val 80 85 90 CTG GTT GCC TTG GTA GGA TTG GGC CTG GGG ATG TTT CAG CTC TTC 374 Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe 95 100 105 CAC CTA CAG AAG GAG CTG GCA GAA CTC CGA GAG TCT ACC AGC CAG 419 His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln 110 115 120 ATG CAC ACA GCA TCA TCT TTG GAG AAG CAA ATA GGC CAC CCC AGT 464 Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly His Pro Ser 125 130 135 CCA CCC CCT GAA AAA AAG GAG CTG AGG AAA GTG GCC CAT TTA ACA 509 Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr 140 145 150 GGC AAG TCC AAC TCA AGG TCC ATG CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACC 554 Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr 155 160 165 TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAG GGT GGC 599 Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly 170 175 180 CTT GTG ATC AAT GAA ACT GGG CTG TAC TTT GTA TAT TCC AAA GTA 644 Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val 185 190 195 TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC AAC AAC CTG CCC CTG AGC CAC AAG 689 Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys 200 205 210 GTC TAC ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCC CAG GAT CTG GTG ATG ATG 734 Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met 215 220 225 GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC TGC ACT ACT GGG CAG ATG TGG GCC 779 Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala 230 235 240 CGC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTG TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAT 824 Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp 245 250 255 CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG CTC TCT CTG GTC AAT TTT GAG 869 His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu 260 265 270 GAA TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG CTC TAA GAGAAGCACT 915 Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 280 281 TTGGGATTC 924

【０２２５】配列番号１８ 配列の長さ：９２７ 配列の型：核酸 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：マウス 直接の起源： クローン名：ｐＢＬ−ＭＦＬＷ４ 配列： GAGAAGGA AACCCTTTCC TGGGGCTGG GTGCC 32 ATG CAG CAG CCC ATG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TTC TGG GTA 77 Met Gln Gln Pro Met Asn Tyr Pro Cys Pro Gln Ile Phe Trp Val 5 10 15 GAC AGC AGT GCC ACT TCA TCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT 122 Asp Ser Ser Ala Thr Ser Ser Trp Ala Pro Pro Gly Ser Val Phe 20 25 30 CCC TGT CCA TCT TGT GGG CCT AGA GGG CCG GAC CAA AGG AGA CCG 167 Pro Cys Pro Ser Cys Gly Pro Arg Gly Pro Asp Gln Arg Arg Pro 35 40 45 CCA CCT CCA CCA CCA CCT GTG TCA CCA CTA CCA CCG CCA TCA CAA 212 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val Ser Pro Leu Pro Pro Pro Ser Gln 50 55 60 CCA CTC CCA CTG CCG CCA CTG ACC CCT CTA AAG AAG AAG GAC CAC 257 Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Thr Pro Leu Lys Lys Lys Asp His 65 70 75 AAC ACA AAT CTG TGG CTA CCG GTG GTA TTT TTC ATG GTT CTG GTG 302 Asn Thr Asn Leu Trp Leu Pro Val Val Phe Phe Met Val Leu Val 80 85 90 GCT CTG GTT GGA ATG GGA TTA GGA ATG TAT CAG CTC TTC CAC CTG 347 Ala Leu Val Gly Met Gly Leu Gly Met Tyr Gln Leu Phe His Leu 95 100 105 CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC CGT GAG TTC ACC AAC CAA AGC CTT 392 Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Phe Thr Asn Gln Ser Leu 110 115 120 AAA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC AAC CCC AGT ACA CCC 437 Lys Val Ser Ser Phe Glu Lys Gln Ile Ala Asn Pro Ser Thr Pro 125 130 135 TCT GAA AAA AAA GAG CCG AGG AGT GTG GCC CAT TTA ACA GGG AAC 482 Ser Glu Lys Lys Glu Pro Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn 140 145 150 CCC CAC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACA TAT GGA 527 Pro His Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly 155 160 165 ACC GCT CTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA GGT GGC CTT GTG 572 Thr Ala Leu Ile Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val 170 175 180 ATC AAC GAA ACT GGG TTG TAC TTC GTG TAT TCC AAA GTA TAC TTC 617 Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe 185 190 195 CGG GGT CAG TCT TGC AAC AAC CAG CCC CTA AAC CAC AAG GTC TAT 662 Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Gln Pro Leu Asn His Lys Val Tyr 200 205 210 ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCT GAG GAT CTG GTG CTA ATG GAG GAG 707 Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Glu Asp Leu Val Leu Met Glu Glu 215 220 225 AAG AGG TTG AAC TAC TGC ACT ACT GGA CAG ATA TGG GCC CAC AGC 752 Lys Arg Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Ile Trp Ala His Ser 230 235 240 AGC TAC CTG GGG GCA GTA TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAC CAT TTA 797 Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu 245 250 255 TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT 842 Tyr Val Asn Ile Ser Gln Leu Ser Leu Ile Asn Phe Glu Glu Ser 260 265 270 AAG ACC TTT TTC GGC TTG TAT AAG CTT TAA AAGAAAAAGC ATTTTAAAAT 892 Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 279 GATCTACTAT TCTTTATCAT GGGCACCAGG AATAT 927

【０２２６】配列番号：１９ 配列の長さ：２０ 配列の種類：核酸 起源： 生物名：マウス 直接の起源：Ｆａｓ抗原染色体遺伝子 配列： ＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＣＡＣＴＣＡＧＴＣＧ ２０

【０２２７】配列番号：２０ 配列の長さ：３７ 配列の種類：核酸 起源： 生物名：マウス 直接の起源：Ｆａｓ抗原染色体遺伝子 配列： ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＴＧＴＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＧＴＡＡ Ｔ ３７

【０２２８】配列番号：２１ 配列の長さ：６ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源：制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位 配列： ＧＧＡＴＣＣ ６

【０２２９】配列番号：２２ 配列の長さ：２４ 配列の種類：核酸 起源： 生物名：ヒト 直接の起源：センスプライマー１ 配列： ＡＴＧＣＣＣＡＡＧＴＧＡＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴ ２４

【０２３０】配列番号：２３ 配列の長さ：５０ 配列の種類：核酸 起源： 生物名：ヒト 直接の起源：アンチセンスプライマー１ 配列： ＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴＴＣＣＴ ＣＴＴＴＧＣＡＣＴＴＧＧＴＧ ５０

【０２３１】配列番号：２４ 配列の長さ：１０ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源：コザックにより提唱された配列 配列： ＣＣＡ／ＧＣＣＡＴＧＧ １０

【０２３２】配列番号：２５ 配列の長さ：２０ 配列の種類：核酸 起源： 生物名：ラット 直接の起源：ハイブリドーマｄ１０Ｓ−２細胞 センスプライマー２ 配列： ＡＡＧＡＣＣＡＣＡＡ ＧＧＴＣＣＡＡＣＡＧ ２０

【０２３３】配列番号：２６ 配列の長さ：２０ 配列の種類：核酸 起源： 生物名：ラット 直接の起源：ハイブリドーマｄ１０Ｓ−２細胞 センスプライマー３ 配列： ＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧ ＧＡＴＧＣＴＡＧＧＴ ２０

【０２３４】配列番号：２７ 配列の長さ：２０ 配列の種類：核酸 起源： 生物名：ラット 直接の起源：ハイブリドーマｄ１０Ｓ−２細胞 アンチセンスプライマー２ 配列： ＣＡＴＧＧＡＴＡＡＧ ＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧ ２０

【０２３５】配列番号：２８ 配列の長さ：２０ 配列の種類：核酸 起源： 生物名：ラット 直接の起源：ハイブリドーマｄ１０Ｓ−２細胞 アンチセンスプライマー３ 配列： ＧＴＡＣＡＡＣＧＣＧ ＴＡＣＡＴＴＡＣＧＧ ２０

【０２３６】配列番号：２９ 配列の長さ： 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源： クローン名：ｐＴＮ２４−１５ AGGAGGAA ACCCTTTCCT GGGGCTGGGT 70 GCC ATG CAG CAG CCC GTG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TAC TGG GTA 118 GAC AGC AGT GCC ACT TCT CCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT TCT 166 TGT CCA TCC TCT GGG CCT AGA GGG CCA GGA CAA AGG AGA CCA CCG CCT 214 CCA CCA CCA CCT CCA TCA CCA CTA CCA CCG CCT TCC CAA CCA CCC CCG 262 CTG CCT CCA CTA AGC CCT CTA AAG AAG AAG GAC AAC ATA GAG CTG TGG 310 CTA CCG GTG ATA TTT TTC ATG GTG CTG GTG GCT CTG GTT GGA ATG GGG 358 TTA GGA ATG TAT CAA CTC TTT CAT CTA CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC 406 CGT GAG TTC ACC AAC CAC AGC CTT AGA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA 454 ATA GCC AAC CCC AGC ACA CCC TCT GAA ACC AAA AAG CCA AGG AGT GTG 502 GCC CAC TTA ACA GGG AAC CCC CGC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG 550 GAA GAC ACA TAT GGA ACT GCT TTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA 598 GGC GGC CTT GTG ATC AAT GAG GCT GGG TTG TAC TTC GTA TAT TCC AAA 646 GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AGC CAG CCC CTA AGC CAC AAG 694 GTC TAT ATG AGG AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG GTG CTA ATG GAG 742 GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC ACT ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC 790 AGC TAC CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC GTT GCT GAC CAT TTA TAT 838 GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC 886 TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT TAAAGGAAAA AGCATTTTAG AATGATCTAT 937 TATTCTTTAT CATGGATGCC AGGAATATTG 967

【０２３７】配列番号：３０ 配列の長さ：２０ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源： クローン名：ｐＴＮ２４−１５ センスプライマー４： 配列： ＡＧＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＣＡＣＣＡ ２０

【０２３８】配列番号：３１ 配列の長さ：２０ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源： クローン名：ｐＴＮ２４−１５ アンチセンスプライマー４： 配列： ＣＡＡＴＡＴＴＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧ ２０

【０２３９】配列番号：３２ 配列の長さ：５６７ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源：ＰＣＲ増幅産物 配列： A GAA CTC CGT 406 CGT GAG TTC ACC AAC CAC AGC CTT AGA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA 454 ATA GCC AAC CCC AGC ACA CCC TCT GAA ACC AAA AAG CCA AGG AGT GTG 502 GCC CAC TTA ACA GGG AAC CCC CGC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG 550 GAA GAC ACA TAT GGA ACT GCT TTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA 598 GGC GGC CTT GTG ATC AAT GAG GCT GGG TTG TAC TTC GTA TAT TCC AAA 646 GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AGC CAG CCC CTA AGC CAC AAG 694 GTC TAT ATG AGG AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG GTG CTA ATG GAG 742 GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC ACT ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC 790 AGC TAC CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC GTT GCT GAC CAT TTA TAT 838 GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC 886 TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT TAAAGGAAAA AGCATTTTAG AATGATCTAT 937 TATTCTTTAT CATGGATGCC AGGAATATTG 967

【０２４０】配列番号：３３ 配列の長さ：１９０ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源：ＰＣＲ増幅産物 配列： AGGAGGAA ACCCTTTCCT GGGGCTGGGT 70 GCC ATG CAG CAG CCC GTG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TAC TGG GTA 118 GAC AGC AGT GCC ACT TCT CCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT TCT 166 TGT CCA TCC TCT GGG CCT AGA GGG CCA GGA CAA AGG AGA CCA CCG CCT 214 CCA CCA CCA CCT CCA TCA C 233

【０２４１】配列番号：３４ 配列の長さ：４４３ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源：ＰＣＲ増幅産物 配列： CGC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG 550 GAA GAC ACA TAT GGA ACT GCT TTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA 598 GGC GGC CTT GTG ATC AAT GAG GCT GGG TTG TAC TTC GTA TAT TCC AAA 646 GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AGC CAG CCC CTA AGC CAC AAG 694 GTC TAT ATG AGG AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG GTG CTA ATG GAG 742 GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC ACT ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC 790 AGC TAC CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC GTT GCT GAC CAT TTA TAT 838 GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC 886 TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT TAAAGGAAAA AGCATTTTAG AATGATCTAT 937 TATTCTTTAT CATGGATGCC AGGAATATTG 967

【０２４２】配列番号：３５ 配列の長さ：２８ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源：センスプライマー５ 配列： ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＡＧＧＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴ ２８

【０２４３】配列番号：３６ 配列の長さ：２８ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源：アンチセンスプライマー５ 配列： ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＡＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＣＴＧＴＡＡＣ ２８

【０２４４】配列番号：３７ 配列の長さ：２８ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源：センスプライマー６ 配列： ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＡＡＣＣＣＴＴＴＣＣＴＧ ２８

【０２４５】配列番号：３８ 配列の長さ：２８ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源：アンチセンスプライマー６ 配列： ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＧＡＴ ２８

【０２４６】配列番号：３９ 配列の長さ：１１ 配列の種類：アミノ酸 起源： 生物名： 直接の起源：ペプチド 配列： Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr １１

【０２４７】配列番号：４０ 配列の長さ：２０ 配列の種類：アミノ酸 起源： 生物名： 直接の起源：ペプチド 配列： Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu ２０

【０２４８】配列番号：４１ 配列の長さ：１６ 配列の種類：アミノ酸 起源： 生物名： 直接の起源：ペプチド 配列： Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser

【０２４９】配列番号：４２ 配列の長さ：１３ 配列の種類：アミノ酸 起源： 生物名： 直接の起源：ペプチド 配列： Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe

【０２５０】配列番号：４３ 配列の長さ：２４ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源：センスプライマー７ 配列： ＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡ

【０２５１】配列番号：４４ 配列の長さ：３３ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源：アンチセンスプライマー７ 配列： ＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＴＴＡＧＡＧＣＴＴＡＴＡＴＡＡ ３３

【０２５２】配列番号：４５ 配列の長さ：２７ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源：センスプライマー８ 配列： ＴＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧ ２７

【０２５３】配列番号：４６ 配列の長さ：３６ 配列の種類：核酸 起源： 生物名： 直接の起源：アンチセンスプライマー８ 配列： ＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＧＡＣＧＴＡＡＧ ３６

【０２５４】配列番号：４７ 配列の長さ：１５ 配列の種類：アミノ酸配列 起源： 生物名：ヒト 直接の起源：ヒトＦａｓリガンド 配列： Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His

【０２５５】配列番号：４８ 配列の長さ：２２ 配列の種類：核酸 起源： 直接の起源：ホスホロチオエート（ＰＳ）型センスオリ
ゴヌクレオチドＳ２０ 配列： ＴＡＡＡＡＣＣＧＴＴＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧ ２２

【０２５６】配列番号：４９ 配列の長さ：２２ 配列の種類：核酸 起源： 直接の起源：ホスホロチオエート（ＰＳ）型アンチセン
スオリゴヌクレオチドＡ４１ 配列： ＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＡＡＣＧＧＴＴＴＴＡ ２２

【０２５７】配列番号：５０ 配列の長さ：２０ 配列の種類：核酸 起源： 直接の起源：ＰＳ型センスオリゴヌクレオチドＳ５０ 配列： ＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣ ２０

【０２５８】配列番号：５１ 配列の長さ：２０ 配列の種類：核酸 起源： 直接の起源：ＰＳ型アンチセンスヌクレオチドＡ６９ 配列： ＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴＧＧＴ ２０

【０２５９】配列番号：５２ 配列の長さ：２２ 配列の種類：核酸 起源： 直接の起源：ＰＳ型センスオリゴヌクレオチドＳ１６３ 配列： ＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＡ ２２

【０２６０】配列番号：５３ 配列の長さ：２２ 配列の種類：核酸 起源： 直接の起源：ＰＳ型アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ
１８４ 配列： ＴＧＡＣＣＡＧＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＣＡＧ ２２

【０２６１】配列番号：５４ 配列の長さ：１８ 配列の種類：核酸 起源： 直接の起源：ＰＳ型センスオリゴヌクレオチドＳ３３８ 配列： ＣＴＴＧＧＴＡＧＧＡＴＴＧＧＧＣＣＴ １８

【０２６２】配列番号：５５ 配列の長さ：１８ 配列の種類：核酸 起源： 直接の起源：ＰＳ型アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ
３５５ 配列： ＡＧＧＣＣＣＡＡＴＣＣＴＡＣＣＡＡＧ １８

【０２６３】配列番号：５６ 配列の長さ：２２ 配列の種類：核酸 起源：ＰＳ型センスオリゴヌクレオチドＳ４８４ 配列： ＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＧＴＧＧＣＣＣＡＴＴＴ ２２

【０２６４】配列番号：５７ 配列の長さ：２２ 配列の種類：核酸 起源： 直接の起源：ＰＳ型アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ
５０５ 配列： ＡＡＡＴＧＧＧＣＣＡＣＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＴ ２２

【０２６５】配列番号：５８ 配列の長さ：２０ 配列の種類：核酸 起源： 直接の起源：ＰＳ型センスオリゴヌクレオチドＳ７１４ 配列： ＣＣＣＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴ ２０

【０２６６】配列番号：５９ 配列の長さ：２０ 配列の種類：核酸 起源： 直接の起源：ＰＳ型アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ
７３３ 配列： ＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧ ２０

【０２６７】配列番号：６０ 配列の長さ：２０ 配列の種類：核酸 起源： 直接の起源：ＰＳ型センスオリゴヌクレオチドＳ９０５ 配列： ＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＴＴＣ ２０

【０２６８】配列番号：６１ 配列の長さ：２０ 配列の種類：核酸 起源： 直接の起源：ＰＳ型アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ
９２４ 配列： ＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴＣＴ ２０

【０２６９】配列番号：６２ 配列の長さ：９２７ 配列の種類：核酸 起源： 生物名：マウス 直接の起源： クローン名：ｐＢＬ−ＭＦＬＷ４ 配列： GAGAAGGA AACCCTTTCC TGGGGCTGG GTGCC 32 ATG CAG CAG CCC ATG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TTC TGG GTA 77 GAC AGC AGT GCC ACT TCA TCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT 122 CCC TGT CCA TCT TGT GGG CCT AGA GGG CCG GAC CAA AGG AGA CCG 167 CCA CCT CCA CCA CCA CCT GTG TCA CCA CTA CCA CCG CCA TCA CAA 212 CCA CTC CCA CTG CCG CCA CTG ACC CCT CTA AAG AAG AAG GAC CAC 257 AAC ACA AAT CTG TGG CTA CCG GTG GTA TTT TTC ATG GTT CTG GTG 302 GCT CTG GTT GGA ATG GGA TTA GGA ATG TAT CAG CTC TTC CAC CTG 347 CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC CGT GAG TTC ACC AAC CAA AGC CTT 392 AAA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC AAC CCC AGT ACA CCC 437 TCT GAA AAA AAA GAG CCG AGG AGT GTG GCC CAT TTA ACA GGG AAC 482 CCC CAC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACA TAT GGA 527 ACC GCT CTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA GGT GGC CTT GTG 572 ATC AAC GAA ACT GGG TTG TAC TTC GTG TAT TCC AAA GTA TAC TTC 617 CGG GGT CAG TCT TGC AAC AAC CAG CCC CTA AAC CAC AAG GTC TAT 662 ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCT GAG GAT CTG GTG CTA ATG GAG GAG 707 AAG AGG TTG AAC TAC TGC ACT ACT GGA CAG ATA TGG GCC CAC AGC 752 AGC TAC CTG GGG GCA GTA TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAC CAT TTA 797 TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT 842 AAG ACC CTT TTC GGC TTG TAT AAG CTT TAA AAGAAAAAGC ATTTTAAAAT 892 GATCTACTAT TCTTTATCAT GGGCACCAGG AATAT 927

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｄ１０Ｓ、ｄ１０Ｓ−２、及びｐＴＮ２４−
１５で形質転換させたＣＯＳ−７細胞のフローサイトメ
トリーの解析結果を示す図である。

【図２】 クローンｐＴＮ２４−１５中の塩基配列およ
び推定されるアミノ酸配列を示す図である。

【図３】 クローンｐＴＮ２４−１５中の塩基配列およ
び推定されるアミノ酸配列を示す図である。

【図４】 ｄ１０Ｓ、ｄ１０Ｓ−２、ｄ１０Ｓ−１６の
ノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す模式図で
ある。

【図５】 ラット脾細胞と胸腺細胞とを用いたノーザン
ハイブリダイゼーションの結果を示す模式図である。

【図６】 ラット各組織のノーザンハイブリダイゼーシ
ョンの結果を示す模式図である。

【図７】 ｄ１０Ｓ−１２及びｐＴＮ２４−１５で形質
転換したＣＯＳ−７細胞の免疫沈降の結果を示す模式図
である。

【図８】 Ｗ４、Ｗ１９Ｌを標的細胞としたときのｄ１
０Ｓ細胞の細胞障害活性を示す図である。

【図９】 Ｗ４、Ｗ１９Ｌを標的細胞としたときのｐＴ
Ｎ２４−１５で形質転換したＣＯＳ−７細胞、ｐＣＥＶ
４で形質転換したＣＯＳ−７細胞の細胞障害活性を示す
図である。

【図１０】 Ｗ４、Ｗ１９Ｌを標的細胞としたときのｐ
ＴＮ２４−１５で形質転換したＣＯＳ−７細胞、ｐＣＥ
Ｖ４で形質転換したＣＯＳ−７細胞の細胞障害活性を示
す図である。

【図１１】 Ｗ４細胞に対するｄ１０Ｓ細胞及びｐＴＮ
２４−１５で形質転換したＣＯＳ−７細胞の細胞障害作
用のｍＦａｓ−Ｆｃによる阻害を示す図である。

【図１２】 ｐＴＮ２４−１５で形質転換したＣＯＳ−
７細胞をエフェクター細胞とし、Ｗ４、Ｗ１９Ｌ細胞を
標的細胞としたときの、標的細胞における染色体ＤＮＡ
の変化を示すゲル電気泳動の模式図である。

【図１３】 精製したＦａｓリガンドの１０−２０％グ
ラジエントＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の
結果を示す模式図である。

【図１４】 Ｗ４及びＷ１９Ｌ細胞を標的細胞としたと
きの精製Ｆａｓリガンドの細胞障害活性を示す図であ
る。

【図１５】 プラスミドｐＢＬ−ｈＦＬ４Ｈ中の塩基配
列及び推定されるアミノ酸配列を示す図である。

【図１６】 ヒトＦａｓリガンド染色体遺伝子の塩基配
列を示す図である。

【図１７】 ヒトＦａｓリガンド染色体遺伝子の塩基配
列を示す図である。

【図１８】 ヒトＦａｓリガンド染色体遺伝子の塩基配
列を示す図である。

【図１９】 クローンｐＢＸ−ｈＦＬ１中の塩基配列を
示す図である。

【図２０】 クローンｐＢＸ−ｈＦＬ１中の塩基配列を
示す図である。

【図２１】 ｐＥＸ−ｈＦＬ１で形質転換させたＣＯＳ
細胞およびｐＥＦ−ＭＦＬＷ４Ｆで形質転換させたＣＯ
Ｓ細胞をエフェクター細胞とし、ＷＲ１９ＬおよびＷＣ
８Ａを標的細胞とした時の、特異的細胞溶解率を示す図
である。

【図２２】 ｈＦａｓ−ＦｃおよびｍＦａｓ−Ｆｃによ
る、ｐＢＬ−ｈＦＬ１で形質転換させたＣＯＳ細胞のＷ
Ｃ８Ａ細胞に対する細胞障害活性の阻害を示す図であ
る。

【図２３】 クローンｐＢＬ−ＭＦＬＷ４中の塩基配列
を示す図である。

【図２４】 クローンｐＢＬ−ＭＦＬＷ４中の塩基配列
を示す図である。

【図２５】 ｐＥＦ−ＭＦＬＷ４Ｆで形質転換させたＣ
ＯＳ細胞をエフェクター細胞とし、ＷＲ１９ＬおよびＷ
４を標的細胞とした時の細胞障害活性を示す図である。

【図２６】 ｇｌｄマウスより単離したＦａｓリガンド
ｃＤＮＡを含むプラスミドで形質転換させたＣＯＳ細胞
をエフェクター細胞とし、ＷＲ１９ＬおよびＷ４を標的
細胞とした時の細胞障害活性を示す図である。

【図２７】 微生物の形態を表す図面代用写真であっ
て、抗血清１９−３とヒトＦａｓリガンド発現細胞を用
いたウエスタンブロッティングの結果を示す図面代用写
真である。

【図２８】 微生物の形態を表す図面代用写真であっ
て、モノクローナル抗体Ｆ８６４−５−１とヒトＦａｓ
リガンド発現細胞を用いたウエスタンブロッティングの
結果を示す図面代用写真である。

【図２９】 モノクローナル抗体Ｆ８８３−１−１のペ
プチドとの反応性を示す図である。

【図３０】 モノクローナル抗体Ｆ８８３−１−１のア
ポトーシス抑制活性を示す図である。

【図３１】 モノクローナル抗体Ｆ８９７−１−２のペ
プチドとの反応性を示す図である。

【図３２】 モノクローナル抗体Ｆ８９７−１−２のア
ポトーシス抑制活性を示す図である。

【図３３】 ＷＣ８およびＷ４を標的細胞とした時の、
形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＭ１０７０の培養上清の細胞
障害活性を示す図である。

【図３４】 ＷＣ８およびＷ４を標的細胞とした時の、
形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＥＸ−ｈＦＬ１の培養上清の
細胞障害活性を示す図である。

【図３５】 微生物の形態を示す図面代用写真であり、
非還元条件下における、形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＭ１
０７０の培養上清のウエスタンブロッティングの結果を
示す図面代用写真である。

【図３６】 微生物の形態を示す図面代用写真であり、
非還元条件下における、形質転換体ＣＯＳ−１／ｐＥＸ
−ｈＦＬ１の培養上清のウエスタンブロッティングの結
果を示す図面代用写真である。

【図３７】 アンチセンスオリゴマーＡ４１のアポトー
シス抑制活性を示す図である。

【図３８】 アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ６９，
Ａ１８４，Ａ３５５，Ａ５０５，Ａ７３３，Ａ９２４の
アポトーシス抑制活性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 特願平6−180955 (32)優先日 平６(1994)７月８日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願平6−239363 (32)優先日 平６(1994)９月７日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 高 橋 智 裕 東京都新宿区四谷一丁目７番地 持田製薬 株式会社内 (72)発明者 中 村 範 夫 東京都新宿区四谷一丁目７番地 持田製薬 株式会社内

Claims (53)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｆａｓ抗原に結合することを特徴とする新
   規蛋白質。
2. 【請求項２】下記式１（配列表の配列番号１）のアミノ
   酸配列の少なくとも一部を有することを特徴とする請求
   項１に記載の新規蛋白質。 式１ Met Gln Gln Pro x-1 Asn Tyr Pro x-2 Pro 1 10 Gln Ile x-3 Trp Val Asp Ser Ser Ala x-4 15 20 Ser x-5 Trp Ala Pro Pro Gly x-6 Val x-7 25 30 x-8 Cys Pro x-9 x-10 x-11 Pro Arg x-12 Pro 35 40 x-13 Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro 45 50 Pro x-14 x-15 x-16 Pro x-17 Pro Pro Pro x-18 55 60 x-19 Pro x-20 Pro x-21 x-22 Pro Leu x-23 Pro 65 70 Leu Lys Lys x-24 x-25 x-26 x-27 x-28 x-29 x-30 75 80 Leu x-31 Leu x-32 Val x-33 Phe Phe Met Val 85 90 Leu Val Ala Leu Val Gly x-34 Gly Leu Gly 95 100 Met x-35 Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu 105 110 Leu Ala Glu Leu Arg Glu x-36 Thr x-37 x-38 115 120 x-39 x-40 x-41 x-42 Ser Ser x-43 Glu Lys Gln 125 130 Ile x-44 x-45 Pro Ser x-46 Pro x-47 Glu x-48 135 140 Lys x-49 x-50 Arg x-51 Val Ala His Leu Thr 145 150 Gly x-52 x-53 x-54 Ser Arg Ser x-55 Pro Leu 155 160 Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly x-56 x-57 Leu 165 170 x-58 Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly 175 180 Leu Val Ile Asn Glu x-59 Gly Leu Tyr Phe 185 190 Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln 195 200 Ser Cys Asn x-60 x-61 Pro Leu x-62 His Lys 205 210 Val Tyr Met Arg Asn x-63 Lys Tyr Pro x-64 215 220 Asp Leu Val x-65 Met Glu x-66 Lys x-67 x-68 225 230 x-69 Tyr Cys Thr Thr Gly Gln x-70 Trp Ala 235 240 x-71 Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn 245 250 Leu Thr x-72 Ala Asp His Leu Tyr Val Asn 255 260 x-73 Ser x-74 Leu Ser Leu x-75 Asn Phe Glu 265 270 Glu Ser x-76 Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys 275 280 Leu 281 （x-1 ないしx-76の各々には、アミノ酸が存在していて
   もいなくてもよく、アミノ酸が存在する場合は、Ala, A
   sp, Arg, Asn, Cys, Gly, Glu, Gln, His, Ile,Leu, Ly
   s, Met, Pro, Phe, Ser, Tyr, Thr, Trp, Valより選ば
   れるいずれかの１アミノ酸である。）
3. 【請求項３】下記式２（配列表の配列番号２）のアミノ
   酸配列の少なくとも一部を有する請求項１ないし２いず
   れかに記載の新規蛋白質。 式２ Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro 1 5 10 Gln Ile Tyr Trp Val Asp Ser Ser Ala Ser 15 20 Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu 25 30 Pro Cys Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro 35 40 Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro 45 50 Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro 55 60 Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Leu Pro Pro 65 70 Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly 75 80 Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val 85 90 Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu Gly 95 100 Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu 105 110 Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln 115 120 Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln 125 130 Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys 135 140 Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr 145 150 Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu 155 160 Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu 165 170 Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly 175 180 Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe 185 190 Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln 195 200 Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys 205 210 Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln 215 220 Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met 225 230 Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala 235 240 Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn 245 250 Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn 255 260 Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu 265 270 Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys 275 280 Leu 281
4. 【請求項４】下記式３（配列表の配列番号３）に記載の
   アミノ酸配列の少なくとも一部を有する請求項１または
   ２に記載の新規蛋白質。 式３ Met Gln Gln Pro Val Asn Tyr Pro Cys Pro 1 5 10 Gln Ile Tyr Trp Val Asp Ser Ser Ala Thr 15 20 Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Ser Val Phe 25 30 Ser Cys Pro Ser Ser Gly Pro Arg Gly Pro 35 40 Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro 45 50 Pro Pro Ser Pro Leu Pro Pro Pro Ser Gln 55 60 Pro Pro Pro Leu Pro Pro Leu Ser Pro Leu 65 70 Lys Lys Lys Asp Asn Ile Glu Leu Trp Leu 75 80 Pro Val Ile Phe Phe Met Val Leu Val Ala 85 90 Leu Val Gly Met Gly Leu Gly Met Tyr Gln 95 100 Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu 105 110 Leu Arg Glu Phe Thr Asn His Ser Leu Arg 115 120 Val Ser Ser Phe Glu Lys Gln Ile Ala Asn 125 130 Pro Ser Thr Pro Ser Glu Thr Lys Lys Pro 135 140 Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn Pro 145 150 Arg Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp Glu 155 160 Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu Ile Ser Gly 165 170 Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile 175 180 Asn Glu Ala Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser 185 190 Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn 195 200 Ser Gln Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met 205 210 Arg Asn Phe Lys Tyr Pro Gly Asp Leu Val 215 220 Leu Met Glu Glu Lys Lys Leu Asn Tyr Cys 225 230 Thr Thr Gly Gln Ile Trp Ala His Ser Ser 235 240 Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Val 245 250 Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Ile Ser Gln 255 260 Leu Ser Leu Ile Asn Phe Glu Glu Ser Lys 265 270 Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 278
5. 【請求項５】下記式４（配列表の配列番号４）のアミノ
   酸配列の少なくとも一部を有する請求項１または２に記
   載の新規蛋白質。 式４ Met Gln Gln Pro Met Asn Tyr Pro Cys Pro 1 5 10 Gln Ile Phe Trp Val Asp Ser Ser Ala Thr 15 20 Ser Ser Trp Ala Pro Pro Gly Ser Val Phe 25 30 Pro Cys Pro Ser Cys Gly Pro Arg Gly Pro 35 40 Asp Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro 45 50 Pro Val Ser Pro Leu Pro Pro Pro Ser Gln 55 60 Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Thr Pro Leu 65 70 Lys Lys Lys Asp His Asn Thr Asn Leu Trp 75 80 Leu Pro Val Val Phe Phe Met Val Leu Val 85 90 Ala Leu Val Gly Met Gly Leu Gly Met Tyr 95 100 Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala 105 110 Glu Leu Arg Glu Phe Thr Asn Gln Ser Leu 115 120 Lys Val Ser Ser Phe Glu Lys Gln Ile Ala 125 130 Asn Pro Ser Thr Pro Ser Glu Lys Lys Glu 135 140 Pro Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn 145 150 Pro His Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp 155 160 Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu Ile Ser 165 170 Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val 175 180 Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr 185 190 Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys 195 200 Asn Asn Gln Pro Leu Asn His Lys Val Tyr 205 210 Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Glu Asp Leu 215 220 Val Leu Met Glu Glu Lys Arg Leu Asn Tyr 225 230 Cys Thr Thr Gly Gln Ile Trp Ala His Ser 235 240 Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr 245 250 Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Ile Ser 255 260 Gln Leu Ser Leu Ile Asn Phe Glu Glu Ser 265 270 Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 279
6. 【請求項６】前記式１（配列表の配列番号１）のアミノ
   酸配列を有する請求項１または２に記載の新規蛋白質。
7. 【請求項７】前記式２（配列表の配列番号２）のアミノ
   酸配列を有する請求項１または２に記載の新規蛋白質。
8. 【請求項８】前記式３（配列表の配列番号３）のアミノ
   酸配列を有する請求項１または２に記載の新規蛋白質。
9. 【請求項９】前記式４（配列表の配列番号４）のアミノ
   酸配列を有する請求項１または２に記載の新規蛋白質。
10. 【請求項１０】下記式５（配列表の配列番号５）のアミ
    ノ酸配列の少なくとも一部を有する請求項１または２に
    記載の新規蛋白質。 式５ Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu y-1 Thr y-2 y-3 y-4 y-5 y-6 y-7 Ser Ser y-8 Glu Lys Gln Ile y-9 y-10 Pro Ser y-11 Pro y-12 Glu y-13 Lys y-14 y-15 Arg y-16 Val Ala His Leu Thr Gly y-17 y-18 y-19 Ser Arg Ser y-20 Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly y-21 y-22 Leu y-23 Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu y-24 Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn y-25 y-26 Pro Leu y-27 His Lys Val Tyr Met Arg Asn y-28 Lys Tyr Pro y-29 Asp Leu Val y-30 Met Glu y-31 Lys y-32 y-33 y-34 Tyr Cys Thr Thr Gly Gln y-35 Trp Ala y-36 Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr y-37 Ala Asp His Leu Tyr Val Asn y-38 Ser y-39 Leu Ser Leu y-40 Asn Phe Glu Glu Ser y-41 Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu （y-1 ないしy-41の各々には、アミノ酸が存在していて
    もいなくてもよく、アミノ酸が存在する場合は、Ala, A
    sp, Arg, Asn, Cys, Gly, Glu, Gln, His, Ile,Leu, Ly
    s, Met, Pro, Phe, Ser, Tyr, Thr, Trp, Valより選ば
    れる任意の１アミノ酸を意味する。）
11. 【請求項１１】下記式６（配列表の配列番号６）のアミ
    ノ酸配列の少なくとも一部を有する請求項１０に記載の
    新規蛋白質。 式６ Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala 1 10 Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His 11 20 Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly 21 30 His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu 31 40 Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys 41 50 Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp 51 60 Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser 61 70 Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val 71 80 Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr 81 90 Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys 91 100 Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr 101 110 Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu 111 120 Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr 121 130 Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser 131 140 Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr 141 150 Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser 151 160 Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser 161 170 Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 171 179
12. 【請求項１２】配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配
    列のＮ末端より数えて、３５番目のアミノ酸Pro から１
    ７９番目のアミノ酸Leu までのアミノ酸配列で示される
    請求項１０に記載の新規蛋白質。
13. 【請求項１３】下記式７（配列表の配列番号７）のアミ
    ノ酸配列の少なくとも一部を有する請求項１０に記載の
    新規蛋白質。 式７ Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Phe Thr Asn His Ser Leu Arg Val Ser Ser Phe Glu Lys Gln Ile Ala Asn Pro Ser Thr Pro Ser Glu Thr Lys Lys Pro Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn Pro Arg Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu Ile Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Ala Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Ser Gln Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Phe Lys Tyr Pro Gly Asp Leu Val Leu Met Glu Glu Lys Lys Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Ile Trp Ala His Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Val Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Ile Ser Gln Leu Ser Leu Ile Asn Phe Glu Glu Ser Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
14. 【請求項１４】下記式８（配列表の配列番号８）に記載
    のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する請求項１０に
    記載の新規蛋白質。 式８ Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Phe Thr Asn Gln Ser Leu Lys Val Ser Ser Phe Glu Lys Gln Ile Ala Asn Pro Ser Thr Pro Ser Glu Lys Lys Glu Pro Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn Pro His Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu Ile Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Gln Pro Leu Asn His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Glu Asp Leu Val Leu Met Glu Glu Lys Arg Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Ile Trp Ala His Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Ile Ser Gln Leu Ser Leu Ile Asn Phe Glu Glu Ser Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
15. 【請求項１５】配列表の配列番号５のアミノ酸配列を有
    する請求項１または２に記載の新規蛋白質。
16. 【請求項１６】配列表の配列番号６のアミノ酸配列を有
    する請求項１または２に記載の新規蛋白質。
17. 【請求項１７】配列表の配列番号７のアミノ酸配列を有
    する請求項１または２に記載の新規蛋白質。
18. 【請求項１８】配列表の配列番号８のアミノ酸配列を有
    する請求項１または２に記載の新規蛋白質。
19. 【請求項１９】請求項１ないし１８いずれかに記載の新
    規蛋白質をコードする塩基配列の相補鎖とハイブリダイ
    ズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有
    する請求項１に記載の新規蛋白質。
20. 【請求項２０】組換え型蛋白質である請求項１ないし１
    ９いずれかに記載の新規蛋白質。
21. 【請求項２１】請求項１ないし１９いずれかに記載の新
    規蛋白質をコードする塩基配列を有することを特徴とす
    る新規ＤＮＡ。
22. 【請求項２２】下記式９（配列表の配列番号９）に記載
    の塩基配列の少なくとも一部を有する請求項２１に記載
    の新規ＤＮＡ。
23. 【請求項２３】下記式１０（配列表の配列番号１０）に
    記載の塩基配列の少なくとも一部を有する請求項２１に
    記載の新規ＤＮＡ。
24. 【請求項２４】下記式１１（配列表の配列番号１１）に
    記載の塩基配列の少なくとも一部を有する請求項２１に
    記載の新規ＤＮＡ。
25. 【請求項２５】配列表の配列番号９の塩基配列を有する
    請求項２１に記載の新規ＤＮＡ。
26. 【請求項２６】配列表の配列番号１０の塩基配列を有す
    る請求項２１に記載の新規ＤＮＡ。
27. 【請求項２７】配列表の配列番号１１の塩基配列を有す
    る請求項２１に記載の新規ＤＮＡ。
28. 【請求項２８】下記式１２（配列表の配列番号１２）に
    記載の塩基配列の少なくとも一部を有する請求項２１に
    記載の新規ＤＮＡ。 式１２ CAG CTC TTC CAC CTA CAG AAG GAG CTG GCA GAA CTC CGA GAG TCT ACC AGC CAG ATG CAC ACA GCA TCA TCT TTG GAG AAG CAA ATA GGC CAC CCC AGT CCA CCC CCT GAA AAA AAG GAG CTG AGG AAA GTG GCC CAT TTA ACA GGC AAG TCC AAC TCA AGG TCC ATG CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACC TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAG GGT GGC CTT GTG ATC AAT GAA ACT GGG CTG TAC TTT GTA TAT TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC AAC AAC CTG CCC CTG AGC CAC AAG GTC TAC ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCC CAG GAT CTG GTG ATG ATG GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC TGC ACT ACT GGG CAG ATG TGG GCC CGC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTG TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAT CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG CTC TCT CTG GTC AAT TTT GAG GAA TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG CTC
29. 【請求項２９】下記式１３（配列表の配列番号１３）に
    記載の塩基配列の少なくとも一部を有する請求項２１に
    記載の新規ＤＮＡ。 式１３ CAA CTC TTT CAT CTA CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC CGT GAG TTC ACC AAC CAC AGC CTT AGA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC AAC CCC AGC ACA CCC TCT GAA ACC AAA AAG CCA AGG AGT GTG GCC CAC TTA ACA GGG AAC CCC CGC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACA TAT GGA ACT GCT TTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA GGC GGC CTT GTG ATC AAT GAG GCT GGG TTG TAC TTC GTA TAT TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AGC CAG CCC CTA AGC CAC AAG GTC TAT ATG AGG AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG GTG CTA ATG GAG GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC ACT ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC AGC TAC CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC GTT GCT GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT
30. 【請求項３０】下記式１４（配列表の配列番号１４）に
    記載の塩基配列の少なくとも一部を有する請求項２１に
    記載の新規ＤＮＡ。 式１４ CAG CTC TTC CAC CTG CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC CGT GAG TTC ACC AAC CAA AGC CTT AAA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC AAC CCC AGT ACA CCC TCT GAA AAA AAA GAG CCG AGG AGT GTG GCC CAT TTA ACA GGG AAC CCC CAC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACA TAT GGA ACC GCT CTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA GGT GGC CTT GTG ATC AAC GAA ACT GGG TTG TAC TTC GTG TAT TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AAC CAG CCC CTA AAC CAC AAG GTC TAT ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCT GAG GAT CTG GTG CTA ATG GAG GAG AAG AGG TTG AAC TAC TGC ACT ACT GGA CAG ATA TGG GCC CAC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTA TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC TTT TTC GGC TTG TAT AAG CTT
31. 【請求項３１】配列表の配列番号１２に記載の塩基配列
    を有する請求項２１に記載の新規ＤＮＡ。
32. 【請求項３２】配列表の配列番号１３に記載の塩基配列
    を有する請求項２１に記載の新規ＤＮＡ。
33. 【請求項３３】配列表の配列番号１４に記載の塩基配列
    を有する請求項２１に記載の新規ＤＮＡ。
34. 【請求項３４】請求項２１ないし３３いずれかに記載の
    新規ＤＮＡを含む事を特徴とする組み換えＤＮＡ分子。
35. 【請求項３５】請求項２１ないし３３いずれかに記載の
    新規ＤＮＡで形質転換された事を特徴とする形質転換
    体。
36. 【請求項３６】請求項３４に記載の組み換えＤＮＡ分子
    で形質転換された事を特徴とする形質転換体。
37. 【請求項３７】形質転換体が、下記ａ）ないしｃ）より
    選ばれる細胞もしくは生物を宿主としたものである請求
    項３５または３６に記載の形質転換体。 ａ）大腸菌 ｂ）酵母 ｃ）哺乳動物細胞
38. 【請求項３８】請求項３５ないし３７のいずれかに記載
    の形質転換体を培養し、その培養混合物から請求項１な
    いし２０のいずれかに記載の新規蛋白質を回収、精製す
    る事を特徴とする、前記蛋白質の製造方法。
39. 【請求項３９】請求項１ないし２０のいずれかに記載の
    新規蛋白質を含有する試料中より該新規蛋白質を精製す
    る方法であって、少なくとも、下記より選ばれるいずれ
    か１つ以上の精製工程を行う事を特徴とする、請求項１
    ないし２０いずれかに記載の新規蛋白質の精製方法。 （１）Ｆａｓ抗原を使用したアフィニティークロマトグ
    ラフィー （２）請求項１ないし２０のいずれかに記載の新規蛋白
    質を認識する抗体を使用したアフィニティークロマトグ
    ラフィー
40. 【請求項４０】請求項１ないし２０いずれかに記載の新
    規蛋白質を認識することを特徴とする新規抗体。
41. 【請求項４１】前記抗体がモノクローナル抗体である請
    求項４０に記載の新規抗体。
42. 【請求項４２】前記抗体がポリクローナル抗体である請
    求項４０に記載の新規抗体。
43. 【請求項４３】Ｆａｓリガンドが誘導するアポトーシス
    を抑制する効果を有する請求項４０ないし４２いずれか
    に記載の新規抗体。
44. 【請求項４４】Ｆａｓリガンド遺伝子の一部もしくはＦ
    ａｓリガンドに対するｍＲＮＡの一部に相補的な塩基配
    列を含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチドまたは
    オリゴヌクレオチド誘導体。
45. 【請求項４５】Ｆａｓリガンドの発現を調節する請求項
    ４４に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ
    チド誘導体。
46. 【請求項４６】Ｆａｓリガンドの発現を抑制する請求項
    ４４または４５に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリ
    ゴヌクレオチド誘導体。
47. 【請求項４７】配列表の配列番号１７に記載の塩基配列
    に相補的な塩基配列の一部を含む請求項４４ないし４６
    のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ
    クレオチド誘導体。
48. 【請求項４８】配列表の配列番号１５に記載の塩基配列
    に相補的な塩基配列の一部を含む請求項４４ないし４６
    のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ
    クレオチド誘導体。
49. 【請求項４９】配列表の配列番号１８に記載の塩基配列
    に相補的な塩基配列の一部を含む請求項４４ないし４６
    のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ
    クレオチド誘導体。
50. 【請求項５０】ＦａｓリガンドもしくはＦａｓリガンド
    を発現する形質転換体を使用することを特徴とするＦａ
    ｓリガンドに関連する物質のスクリーニング方法。
51. 【請求項５１】ＦａｓリガンドもしくはＦａｓリガンド
    を発現する形質転換体に加え、Ｆａｓ抗原もしくはＦａ
    ｓ抗原を発現する細胞を使用することを特徴とする請求
    項５０に記載のスクリーニング方法。
52. 【請求項５２】Ｆａｓリガンドに結合する物質、Ｆａｓ
    リガンドの発現に影響を与える物質、Ｆａｓ抗原の発現
    に影響を与える物質もしくはＦａｓリガンドの標的細胞
    に対する作用に影響を与える物質より選ばれるいずれか
    の物質をスクリーニングする請求項５０または５１いず
    れかに記載のスクリーニング方法。
53. 【請求項５３】下記の（１）ないし（３）のいずれかよ
    り選択される工程を含む請求項５０ないし５２いずれか
    に記載のスクリーニング方法。 （１）ａ．ＦａｓリガンドもしくはＦａｓリガンドを発
    現する形質転換体とＦａｓ抗原を発現する細胞とを共培
    養する。 ｂ．ａに被験物質もしくは被験物質を含む試料を添加す
    る。 ｃ．Ｆａｓ抗原を発現する細胞の生死、形態的変化もし
    くは生化学的変化のうち少なくともいずれか１つを測定
    する。 （２）ａ．被験物質もしくは被験物質を含む試料をＦａ
    ｓリガンドもしくはＦａｓリガンドを発現する形質転換
    体とインキュベートする。 ｂ．ａにＦａｓ抗原を発現する細胞を加えて、培養す
    る。 ｃ．Ｆａｓ抗原を発現する細胞の生死、形態的変化もし
    くは生化学的変化のうち少なくともいずれか１つを測定
    する。 （３）ａ．被験物質もしくは被験物質を含む試料をＦａ
    ｓ抗原を発現する細胞とインキュベートする。 ｂ．ａに、ＦａｓリガンドもしくはＦａｓリガンドを発
    現する形質転換体を加えて培養する。 ｃ．Ｆａｓ抗原を発現する細胞の生死、形態的変化もし
    くは生化学的変化のうち少なくともいずれか１つを測定
    する。