JPH08112063A - 風味良好な乳清蛋白加水分解物及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 純度が少なくとも７０％（重量）の乳清蛋白
質の加水分解物であって、分子量５，０００〜１０，０
００ダルトンの画分が、全加水分解物の１％（重量）未
満であること、抗乳清蛋白質血清を用いたエライザ抑制
試験法により測定した抗原残存活性が１０^-5以下である
こと、加水分解物の全アミノ酸の量に対する遊離アミノ
酸の量の割合が１０〜１５％（重量）であること、乳清
蛋白質に含まれる全リジンの量に対する遊離リジンの量
の割合が１２〜２０％（重量）であること、アンモニア
含量が０．２％（重量）以下であること、を特徴とする
風味良好な乳清蛋白加水分解物、及びその製造法。 【効果】 消化吸収能の未熟な乳幼児又は消化吸収能が
低下している高齢者、病人、アレルギー患者、アレルギ
ー予防を目的として乳幼児、妊産婦、免疫機能の低下し
た病人への蛋白質供給源用素材として使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、特異な理化学的性状を
有する乳清蛋白加水分解物及びその製造法に係るもので
あり、腸管吸収性及びアミノ酸バランスに優れ、食餌ア
レルギーに対する予防及び治療効果並びに抗酸化作用を
有し、風味が良好であり、広範な種々の用途に利用でき
る新規な乳清蛋白加水分解物及びその製造法である。本
明細書において、百分率は透過率及び抑制率を除き、特
に断りのない限り、重量による表示である。

【０００２】

【従来の技術】最近、消化吸収の観点から、遊離アミノ
酸混合物よりもオリゴペプチドが、吸収速度及び吸収後
のアミノ酸バランスにおいて優れていることが明らかに
されている（酪農科学・食品の研究、第３９巻、第Ａ−
２８３ページ、１９９０年）。一方、食餌蛋白質に起因
するアレルギー患者が急増し、特に乳児においては乳清
蛋白質、特にβ−ラクトグロブリンに起因するアレルギ
ーが多発していることが明らかになり（酪農科学・食品
の研究、第３９巻、第Ａ−２８３ページ、１９９０
年）、乳児用食品中の乳清蛋白質の抗原性低減又は乳児
用食品からの乳清蛋白質抗原の実質的除去が、求められ
ている。

【０００３】乳児用食品中の乳清蛋白質の抗原性低減又
は乳児用食品からの乳清蛋白質抗原の実質的除去の手段
として、乳清蛋白質の加水分解が広範に採用されている
が、アミノ酸遊離率の極端に低い分解物は苦味を呈する
場合が多く、摂取するときの障害となることがある。ま
た、乳清蛋白質の加水分解物は、熱に対して不安定にな
る場合があるので、溶液の状態では沈殿物の生成、褐変
化等の不都合が生じ、従来の分解物は経口栄養剤等とし
て利用するときに問題があった。

【０００４】更に、乳清蛋白加水分解物を食品に使用す
る場合、特に脂肪と共存する食品（例えば、乳幼児用の
調製粉乳では、１００ｇ当たり脂肪が２７％も含まれて
いる）においては、酸化防止が重大な問題となってい
る。即ち、脂肪を含有する食品においては、栄養学的な
観点から飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸とのバランスが考慮
されているが、特に不飽和脂肪酸は容易に酸化される欠
点があり、最近、脳・神経・網膜組織の生体膜に多く含
まれ、その機能発現に関与していると考えられているＤ
ＨＡ等は、一旦酸化されると極めて強い酸化臭を放出
し、製品品質に著しい悪影響を与えるため、酸化の進行
防止が待望されている。

【０００５】一方、摂取したアミノ酸がトランスグルタ
ミナーゼ、グルタノートデヒドロゲナーゼなどによって
分解されて、アンモニアが生成するが、生成したアンモ
ニアは有毒であり、肝臓で直ちに処理される必要があ
り、摂取する食品にアンモニアが含有されていないこと
が必要である。このような点から、乳清蛋白加水分解物
にも、アンモニアが含有されていないことが、極めて重
要である。

【０００６】また、成長した動物の窒素平衡は、窒素の
最低代謝量に見合う量の窒素を摂取すればよいが、この
窒素を単にアンモニアとして与えても無効であり、必須
アミノ酸として摂取しなければならない。そのために
は、摂取する食品に必要量の必須アミノ酸が含まれてい
なければならない。

【０００７】以上のような蛋白質及びアミノ酸の栄養・
生理学の背景から、乳清蛋白質を酵素で加水分解した分
解物を製造する種々の方法が開発されているが、それら
の幾つかを例示すれば次のとおりである。

【０００８】１）乳清蛋白質をバシラス・サチリス由来
のエンドペプチダーゼとトリプシンの２種類の酵素、又
はバシラス・サチリス由来のエンドペプチダーゼ、トリ
プシン及びキモトリプシンの３種類の酵素で分解し、分
子量２，０００ダルトン以下、抗原残存率１０^-4以下、
アミノ酸遊離率が５％以下のオリゴペプチド混合物が開
示されている（特開平４−２４８９５９号公報）。

【０００９】２）乳蛋白質をアルカリプロテアーゼで分
解し、ジペプチド及びトリペプチドが７５モル％以上、
アミノ酸遊離率が５％未満、４個以上のアミノ酸からな
り、かつ平均鎖長６．２のペプチドが２０モル％未満の
分解物が開示されている（特表平５−５０５３０４号公
報）。

【００１０】３）乳清、カゼイン、大豆をペプシン、ト
リプシン・キモトリプシンで分解し、限外濾過し、４〜
１０個のアミノ酸を有するペプチドが４０〜６０％であ
り、分子量６０，０００ダルトン以下のオリゴペプチド
が開示されている（特開平３−１８７３４８号公報）。

【００１１】４）乳清蛋白質を熱変性させながらｐＨ６
〜１０、６０〜８０℃で分解し、酵素を加熱失活し、分
子量１００００ダルトン以下、メインピーク１，０００
〜５，０００、平均ペプチド鎖長３〜８、遊離アミノ酸
含量２０％以下、β−ラクトグロブリンの抗原性１／１
０，０００以下の分解物が開示されている（特開平４−
１１２７５３号公報）。

【００１２】５）牛乳蛋白質をトリプシン、α−キモト
リプシン、アスペルギルス属、バチルス属菌の酵素で分
解し、分子量１０，０００ダルトン以下の経口寛容誘導
能を有する低アレルゲン性ペプチドが開示されている
（特開平５−５０００号公報）。

【００１３】６）カゼインを酸性プロテアーゼで分解
し、中性でペプチダーゼで分解し、分子量３，０００ダ
ルトン以下、遊離アミノ酸含量３０〜５５％、α_S −カ
ゼインに対するインヒビションＥＬＩＳＡ試験がα_S −
カゼインの１０，０００分の１以下、５％溶液の苦味官
能値がカフェイン０．０４％水溶液相当以下のペプチド
が開示されている（特開平６−１１３８９３号公報）。

【００１４】７）ホエーを中性プロテアーゼ（アスペル
ギルス属）を用いてｐＨ５〜１１で加水分解し、ｐＨ２
〜４で加熱し、沈殿を除去し、ジペプチド及びトリペプ
チドを５０％の割合で得る方法が開示されている（特公
平５−８２４１２号公報）。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記従
来技術においては、乳清蛋白加水分解物の抗原性の低
下、苦味の改善、遊離アミノ酸含量、分子量分布等につ
いては、考慮されているが、乳清蛋白加水分解物のアン
モニア含有量及び抗酸化作用については何等考慮されて
いない。そのため、従来、乳清蛋白加水分解物を広範な
食品に使用できないという不都合があった。

【００１６】本発明者らは、前記の従来技術に鑑みて鋭
意研究を行い、乳清蛋白質を加水分解することによって
得られ、食餌アレルギーの回避、予防及び治療に有効で
あり、消化吸収に優れ、アンモニア含有量が低く、かつ
抗酸化作用を有し、広範囲な用途に利用できる風味良好
な乳清蛋白加水分解物及びその製造法を見い出し、本発
明を完成した。

【００１７】本発明の目的は、腸管吸収及びアミノ酸バ
ランスに優れ、食餌アレルギーの予防及び治療効果並び
に抗酸化作用を有し、アンモニア含有量が低く、広範囲
な用途に利用できる風味良好な乳清蛋白加水分解物及び
その製造法を提供することである。

【００１８】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決する本発
明の第１の発明は、純度が少なくとも７０％（重量）の
乳清蛋白質の加水分解物であって、次のａ）〜ｈ）の理
化学的性質； ａ）分子量５，０００〜１０，０００ダルトンの画分
が、全加水分解物の１％（重量）未満であること、 ｂ）抗乳清蛋白質血清を用いたエライザ抑制試験法によ
り測定した抗原残存活性が１０^-5以下であること、 ｃ）加水分解物の全アミノ酸の量に対する遊離アミノ酸
の量の割合が１０〜１５％（重量）であること、 ｄ）乳清蛋白質に含まれる全リジンの量に対する遊離リ
ジンの量の割合が１２〜２０％（重量）であること、 ｅ）アンモニア含量が０．２％（重量）以下であるこ
と、 ｆ）１０％（重量）溶液を１ｃｍのセル、５４０ｎｍで
測定した透過率が９８％以上であること、 ｇ）ｐＨ４〜７の５％（重量）溶液を１２０℃で１０分
間加熱して沈殿を生じないこと、及び ｈ）抗酸化作用を有すること、を有することを特徴とす
る風味良好な乳清蛋白加水分解物である。

【００１９】前記課題を解決する本発明の第２の発明
は、純度が少なくとも７０％（重量）の乳清蛋白質を１
５％（重量）以下の濃度で水に溶解し、該水溶液のｐＨ
を７．５〜１０に調整し、該水溶液にバシラス・サチリ
ス(Bacillus subtilis) 由来のエンドペプチダーゼ及び
乳酸菌由来のエキソペプチダーゼの２種類の蛋白分解酵
素を添加して加水分解を開始し、分解液中の遊離リジン
量を経時的に測定し、出発原料である乳清蛋白質に含ま
れる全リジンの量に対する遊離リジンの量の割合が１２
〜２０％（重量）の範囲で加水分解を停止し、限外濾過
して分子量１０，０００ダルトン以上の画分を完全に除
去することを特徴とする風味良好な乳清蛋白加水分解物
の製造法である。

【００２０】次に本発明について詳述するが、本発明の
理解を容易にするために、本発明の第２の発明から説明
する。本発明の方法の出発原料として使用する乳清蛋白
質は、少なくとも７０％の純度を有する市販品等が使用
可能であり、乳清蛋白濃縮物（ＷＰＣ）、乳清蛋白分離
物（ＷＰＩ）として知られているより純度の高い市販品
等が好適である。これらの乳清蛋白質を１５％以下、望
ましくは８〜１２％、の濃度で水に溶解し、アルカリ水
溶液でｐＨを７．５〜１０、望ましくは８〜９、に調整
する。

【００２１】次いで、前記乳清蛋白溶液にバシラス・サ
チリス(Bacillus subtilis) 由来のエンドペプチダーゼ
及び乳酸菌由来のエキソペプチダーゼの２種類の蛋白分
解酵素を添加する。その他、トリプシン、パパイン等の
エンドペプチダーゼを極少量添加することもできる。た
だし、乳酸菌由来以外のエキソペプチダーゼ（パンクレ
アチン等を含む）の添加は、風味を悪化させるので避け
るべきである。バシラス・サチリス(Bacillus subtili
s) 由来のエンドペプチダーゼは、市販品等が使用可能
であり、乳清蛋白質１ｇ当たり１，０００〜７，５００
ＰＵＮ単位（この単位については後記する）、望ましく
は２，０００〜３，０００ＰＵＮ単位、の割合で添加す
る。

【００２２】ＰＵＮ単位は、カゼイン［ハマーシュタイ
ン(Hammerstein) 。メルク社製］にバシラス・サチリス
(Bacillus subtilis) 由来のエンドペプチダーゼを作用
させ、３０℃で１分間に１μｇのチロシンに相当するア
リルアミノ酸のフォリン試薬での呈色反応を示す酵素活
性を１ＰＵＮ単位とする。

【００２３】乳酸菌由来のエキソペプチダーゼは、例え
ば特公昭５４−３６２３５号公報第６欄４行「（３）使
用する酵素について」の項に記載の方法により次のとお
り製造することができる。乳酸菌（ビフィズス菌を含
む）を公知の方法（例えば特公昭４８−４３８７８号公
報記載の方法）により培養し、得られた培養液を遠心分
離して乳酸菌菌体を回収し、滅菌水に菌体を懸濁し、遠
心分離して乳酸菌菌体を回収する操作を２回反復し、菌
体を洗浄し、２０％の濃度で菌体を滅菌水に懸濁し、菌
体破砕機［例えば、ダイノミル（Willy Bachnfen Engin
eering Works）社製。ＫＤＬ型］により菌体を破砕し、
凍結乾燥し、乳酸菌由来のエキソペプチダーゼ粉末を得
る。この酵素を乳清蛋白質１ｇ当たり２０〜２００活性
単位（この単位については後記する）、望ましくは６０
〜９０活性単位、の割合で添加する。

【００２４】活性単位は、次の方法により測定する。エ
キソペプチダーゼを含有する粉末を０．２ｇ／１００ｍ
ｌの割合で０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
分散又は溶解して酵素溶液を調製する。一方、ロイシル
パラニトロアニリド（国産化学社製。以後Ｌｅｕ−ｐＮ
Ａと記載する）を０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶解して２ｍＭの基質溶液を調製する。酵素溶液
１ｍｌに基質溶液１ｍｌを添加し、３７℃で５分間反応
させ、のち３０％の酢酸溶液２ｍｌを添加して反応を停
止させる。反応液をメンブランフィルターで濾過し、波
長４１０ｎｍで濾液の吸光度を測定する。エキソペプチ
ダーゼの活性単位は、１分間に１μｍｏｌのＬｅｕ−ｐ
ＮＡを分解するのに必要な酵素量を１活性単位と定義
し、次式により求めた。 活性単位（粉末１ｇ当たり）＝２０×（Ａ／Ｂ） ただし、前記の式においてＡ及びＢは、それぞれ波長４
１０ｎｍにおける試料の吸光度及び０．２５ｍＭパラニ
トロアニリンの吸光度を示す。

【００２５】酵素を添加した溶液を３０〜６０℃、望ま
しくは４５〜５５℃に保持して乳清蛋白質の加水分解を
開始する。なお、加水分解反応が進行してｐＨが低下す
る場合には、そのｐＨを６以上、好ましくは６〜７に保
持することが望ましい。加水分解を開始後、経時的に分
解液中の遊離リジン量を測定し得る装置、例えば、バイ
オテックアナライザー（旭化成工業社製）等、を用いて
経時的に分解液中の遊離リジン量を測定し、出発原料で
ある乳清蛋白質に含まれる全リジンの量に対する遊離リ
ジンの量の割合が１２〜２０％、望ましくは１４〜１７
％、の範囲に達したとき、直ちに反応液を加熱（例え
ば、８５℃で１５分間等）して酵素を失活させ、加水分
解を停止する。

【００２６】得られた反応液をクエン酸等の酸によりｐ
Ｈを５．５〜７の範囲に調整し、公知の装置［例えば、
限外濾過モジュール（旭化成工業社製）等］により限外
濾過し、分子量１０，０００ダルトン以上の画分を完全
に除去し、目的とする風味良好な乳清蛋白加水分解物を
得る。この乳清蛋白加水分解物を含有する液を、公知の
方法により濃縮し、濃縮液とすることもでき、更にこの
濃縮液を公知の方法により乾燥し、粉末とすることもで
きる。

【００２７】以上のようにして得られた乳清蛋白加水分
解物は、後記する実施例からも明らかなように次の理化
学的性状を有している。 ａ）図１に示すとおり、分子量５，０００〜１０，００
０ダルトンの画分が、全加水分解物の１％（重量）未満
であり、分子量１０，０００ダルトン以上の画分を含ま
ず、分子量１，０００ダルトン未満の画分が７０％以上
であり、分子量５００ダルトン及び分子量１，０００ダ
ルトンにピークを有し、数平均分子量３００〜４００ダ
ルトン、重量平均分子量６００〜８００ダルトンであ
る。図１は、実施例１により得られた本発明の乳清蛋白
加水分解物の分子量分布を示し、縦軸及び横軸は、それ
ぞれ分布割合及び分子量を示す。

【００２８】ｂ）図２に示すとおり、抗乳清蛋白質血清
を用いたエライザ抑制試験法により測定した抗原残存活
性が１０^-5以下、望ましくは１０^-6以下である。図２
は、実施例１により得られた本発明の乳清蛋白加水分解
物の抗原残存活性を示し、縦軸及び横軸は、それぞれ抑
制割合及び最終試料濃度を示す。図中＋及び□は、それ
ぞれ乳清蛋白質及び本発明の乳清蛋白分解物を示す。

【００２９】ｃ）加水分解物の全アミノ酸の量に対する
遊離アミノ酸の量の割合が１０〜１５％（重量）、望ま
しくは１１〜１３％（重量）である。 ｄ）乳清蛋白質に含まれる全リジンの量に対する遊離リ
ジンの量の割合が１２〜２０％（重量）、望ましくは１
４〜１７％（重量）である。 ｅ）アンモニア含量が０．２％（重量）以下、望ましく
は０．１％（重量）以下である。 ｆ）１０％溶液を１ｃｍのセル、５４０ｎｍで測定した
透過率が９８％以上である。 ｇ）ｐＨ４〜７の５％（重量）溶液を１２０℃で１０分
間加熱して沈殿を生じない。

【００３０】ｈ）図３に示すとおり、公知の抗酸化剤で
あるα−トコフェロールと同等又はそれ以上の抗酸化活
性を有する。図３は、実施例１により得られた本発明の
乳清蛋白加水分解物の抗酸化活性を示し、縦軸及び横軸
は、それぞれ抗酸化能残存率及び時間を示す。図中◇、
＋及び□は、それぞれ本発明の乳清蛋白分解物、α−ト
コフェロール及び対照（試料又は標品無添加）を示す。

【００３１】次に、試験例を示して本発明を詳述する。
本発明の試験例においては、次の試験方法を採用した。 （１）分子量の測定方法 高速液体クロマトグラフィー（宇井信生ら編、「タンパ
ク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー」、化学
増刊第１０２号、第２４１ページ、化学同人、１９８４
年）により次のようにして測定した。ポリハイドロキシ
エチル・アスパルアミド・カラム［ポリエルシー(PolyL
C)社製。直径４．６ｍｍ及び長さ２００ｍｍ］を用い、
２０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭぎ酸により溶出速度
０．４ｍｌ／分で溶出した。検出はＵＶ検出器を用い、
データ解析はＧＰＣ分析システム（島津製作所製）を使
用した。

【００３２】（２）抗原残存活性の測定方法 エライザ測定試験法（日本小児アレルギー学会誌、第１
巻、第３６ページ、１９７８年）により次のようにして
測定した。９６穴プレート（ヌンク社製）に乳清蛋白質
をコーティングし、洗浄し、ウサギ抗乳清蛋白質血清及
び加水分解物試料の混合液をプレートの穴に供給して反
応させ、洗浄後アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ウサ
ギＩｇＧ抗体（ザイメッド・ラボラトリー社製）を反応
させ、洗浄後ｐ−ニトロフェニル・リン酸ナトリウムを
添加し、３０分後に５Ｎ水酸化ナトリウムを添加して反
応を停止させ、反応生成物をマイクロプレートリーダー
（和光純薬工業社製）で測定した。なお、抑制用被検抗
原液添加による反応抑制の程度の表現には次の式で算出
した抑制率を用いた。 抑制率（％）＝（１−被検抗原液での吸光度／対照の吸
光度）×１００ ただし、被検抗原液の吸光度及び対照の吸光度は抗乳清
蛋白血清にそれぞれ等量の被検試料液又は希釈液の混合
液を入れた穴の反応後測定した値である。

【００３３】（３）アミノ酸組成の測定方法 トリプトファン、システイン及びメチオニン以外のアミ
ノ酸については、試料を６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間
加水分解し、トリプトファンについては、水酸化バリウ
ムで１１０℃、２２時間アルカリ分解し、システイン及
びメチオニンについては、過ぎ酸処理後６Ｎ塩酸で１１
０℃、１８時間加水分解し、それぞれアミノ酸分析機
（日立製作所製。８３５型）により分解し、アミノ酸の
質量を測定した。

【００３４】（４）遊離アミノ酸組成の測定方法 スルホサリチル酸で試料を除蛋白し、アミノ酸分析機
（日立製作所製。８３５型）により分析し、前記アミノ
酸組成の分析で得られた各アミノ酸の質量に対する遊離
アミノ酸質量の百分率を算出した。

【００３５】（５）遊離リジン含量の測定方法 リジン測定用酵素電極、２０ｍＭＬ−リジン標準液、
０．１Ｍ燐酸Ｌ−リジン測定用緩衝液及び洗浄用界面活
性剤（いずれも旭化成工業社製）を用い、バイオテック
アナライザー（旭化成工業社製）により遊離リジン濃度
をバッチ式又はオンラインで測定し、乳清蛋白質のリジ
ン含有量に対する分解溶液のリジン含有量から全リジン
に対する遊離リジンの量の割合を算出した。

【００３６】（６）アンモニア含量の測定方法 スルホサリチル酸で試料を除蛋白し、アミノ酸分析機
（日立製作所製。８３５型）により分析し、アンモニア
の質量を測定した。

【００３７】（７）抗酸化作用の測定方法 リノール酸、β−カロチンをＴｗｅｅｎ２０で乳化し、
これに試料又は標品としてα−トコフェロールを添加
し、経時変化を比色法により測定した［フィトケミスト
リー(Phytochemistry)、第１０巻、第１４４５ページ、
１９７１年］。リノール酸、β−カロチン、Ｔｗｅｅｎ
２０、試料及びα−トコフェロールの最終濃度は、それ
ぞれ０．９６ｍｇ／ｍｌ、４．８μｇ／ｍｌ、９．６ｍ
ｇ／ｍｌ、０．１９ｍｇ／ｍｌ及び０．１９ｍｇ／ｍｌ
であった。

【００３８】試験例１ この試験は、抗原性と密接に関連する高分子量画分の比
率を指標として、加水分解に供する乳清蛋白質溶液の好
適な濃度を調べるために行った。 １）試料の調製 表１に示すとおり乳清蛋白質濃度を変更したことを除
き、実施例１と同一の方法により乳清蛋白質溶液を加水
分解し、７種類の試料を調製した。

【００３９】２）試験方法 分子量５，０００〜１０，０００ダルトンの画分の比率
は前記分子量の測定方法により求めた。

【００４０】３）試験結果 この試験結果は、表１に示すとおりである。表１から明
らかなように、分子量５，０００〜１０，０００ダルト
ンの画分が１％未満となる乳清蛋白質の濃度は、１５％
以下、望ましくは１２％以下であることが判明した。反
応効率を考慮するならば、８〜１２％が最も望ましい。
尚、乳清蛋白質の種類、バシラス・サチリス由来のエン
ドペプチダ−ゼ及び乳酸菌由来のエキソペプチダ−ゼの
種類、及び後記する試験例３において求められた範囲内
で、その酵素量を変更して試験したが、ほぼ同様の結果
が得られた。

【００４１】

【表１】

【００４２】試験例２ この試験は、抗原性を指標として、加水分解のために好
適な酵素処理初発ｐＨ範囲を調べるために行った。 １）試料の調製 加水分解の初発ｐＨを次のとおり変更したことを除き、
実施例１と同一の方法により乳清蛋白質溶液を加水分解
し、５種類の試料を調製した。 試料１：初発ｐＨをｐＨ６．５に調整した後、加水分解
を行った。 試料２：初発ｐＨをｐＨ７．５に調整した後、加水分解
を行った。 試料３：初発ｐＨをｐＨ８．０に調整した後、加水分解
を行った。 試料４：初発ｐＨをｐＨ９．０に調整した後、加水分解
を行った。 試料５：初発ｐＨをｐＨ１０．０に調整した後、加水分
解を行った。

【００４３】２）試験方法 抗原残存活性は、前記抗原残存活性の測定方法により測
定した。

【００４４】３）試験結果 この試験結果は、表２に示すとおりである。表２から明
らかなように、低い抗原性の乳清蛋白加水分解物を得る
ためには、加水分解のための初発ｐＨは７．５〜１０．
０、望ましくは８〜９であることが判明した。尚、乳清
蛋白質の種類、バシラス・サチリス由来のエンドペプチ
ダ−ゼ及び乳酸菌由来のエキソペプチダ−ゼの種類、及
び後記する試験例３において求められた範囲内で、その
酵素量を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られ
た。

【００４５】

【表２】

【００４６】試験例３ この試験は、抗原性と密接に関連する高分子量画分の比
率、アンモニア含量、及び抗酸化活性を指標として、酵
素の適正な使用量を調べるために行った。 １）試料の調製 表３に示すように酵素の使用量を変更したことを除き、
実施例１と同一の方法により乳清蛋白質溶液を加水分解
し、１２種類の試料を調製した。なお、試料番号１及び
７は、３０時間加水分解を行っても遊離リジン量が、１
４％に到達しなかったので、その時点で加水分解を終了
した。

【００４７】２）試験方法 分子量５，０００〜１０，０００ダルトンの画分の比率
は前記分子量の測定方法、アンモニア含量は前記アンモ
ニア含量の測定方法、及び抗酸化活性は前記抗酸化作用
の測定方法により求めた。なお、試料の抗酸化活性は、
α−トコフェロ−ルの抗酸化活性に対する相対的な強さ
を指標として表わした。

【００４８】３）試験結果 この試験結果は、表３に示すとおりである。表３から明
らかなように、分子量５，０００〜１０，０００ダルト
ンの画分が１％以下、アンモニア含量が０．２％以下、
かつα−トコフェロ−ルと同等又はそれ以上の抗酸化活
性となる酵素の使用量は、乳清蛋白質１ｇあたりバシラ
ス・サチリス由来のエンドペプチダーゼが１，０００〜
７，５００ＰＵＮ単位、望ましくは２，０００〜３，０
００ＰＵＮ単位、乳酸菌由来のエキソペプチダーゼが２
０〜２００活性単位、望ましくは６０〜９０活性単位の
範囲であることが判明した。尚、乳清蛋白質の種類、及
びバシラス・サチリス由来のエンドペプチダ−ゼ及び乳
酸菌由来のエキソペプチダ−ゼの種類を変更して試験し
たが、ほぼ同様の結果が得られた。

【００４９】

【表３】

【００５０】試験例４ この試験は、風味、抗原性と密接に関連する高分子量画
分の比率、及び風味に影響を及ぼす遊離アミノ酸の含量
を指標として、加水分解物の適正なリジンの遊離率を調
べるために行った。 １）試料の調製 表４に示すとおり、加水分解反応を、所望の遊離リジン
の量の割合で、適宜、酵素を失活させて停止させたこと
を除き、実施例１と同一の方法により７種類の試料を調
製した。

【００５１】２）試験方法 分子量５，０００〜１０，０００ダルトンの画分の比率
及び遊離アミノ酸の含量は、いずれも前記の方法により
求めた。なお、風味は下記の方法により試験した。 ａ）風味試験 男女各１０名のパネルにより官能的に試験し、風味良
（０点）から風味不良（３点）までの４段階に評価し、
評価点の平均値から、０．５点未満を良、０．５点以上
〜１．５点未満をやや良、１．５点以上〜２．５点未満
をやや不良及び２．５点以上〜３．０点未満を不良と判
定した。

【００５２】３）試験結果 この試験の結果は、表４に示すとおりである。表４から
明らかなように風味が良い乳清蛋白質分解物は、リジン
の遊離率が１２〜２０％、望ましくは１４〜１７％であ
ることが判明した。尚、乳清蛋白質の種類、バシラス・
サチリス由来のエンドペプチダ−ゼ及び乳酸菌由来のエ
キソペプチダ−ゼの種類、及び前記する試験例３におい
て求められた範囲内で、その酵素量を変更して試験した
が、ほぼ同様の結果が得られた。

【００５３】

【表４】

【００５４】試験例５ この試験は、抗原性と密接に関連する高分子量画分の比
率、抗原性、食品素材として好適な性質である透明性の
基準となる透過率及び熱安定性を指標として、加水分解
物の好適な瀘過方法を調べるために行った。 １）試料の調製 表５に示すとおり瀘過膜（分画分子量）を変更したこと
を除き、実施例１と同一の方法により乳清蛋白質溶液を
加水分解し、３種類の試料を調製した。なお、瀘過膜と
して、旭化成工業社製の分画分子量３，０００ダルトン
及び１０，０００ダルトンの限外瀘過膜、及び孔径０．
２５μm の精密瀘過膜を使用した。

【００５５】２）試験方法 分子量５，０００〜１０，０００ダルトンの画分の比
率、抗原残存活性、透過率、及び熱安定性は、いずれも
前記の方法により求めた。

【００５６】３）試験結果 この試験の結果は、表５に示すとおりである。表５から
明らかなように、分子量５，０００〜１０，０００ダル
トンの画分が１％未満、透過率が９８％以上、耐熱性を
有する限外濾過処理方法は、クエン酸でｐＨを５．５〜
７に調整し、分画分子量１０，０００以下、望ましくは
３，０００以下、の限外濾過膜を用いることが必要であ
ることが判明した。尚、乳清蛋白質の種類、バシラス・
サチリス由来のエンドペプチダ−ゼ及び乳酸菌由来のエ
キソペプチダ−ゼの種類、及び前記する試験例３におい
て求められた範囲内で、その酵素量を変更して試験した
が、ほぼ同様の結果が得られた。

【００５７】

【表５】

【００５８】試験例６ この試験は、風味と抗酸化活性を指標として、加水分解
のために好適な酵素の種類を調べるために行った。 １）試料の調製 表６に示すとおり使用する酵素の種類及び添加量を変更
したことを除き、実施例１と同一の方法により６種類の
試料を調製した。なお、酵素としては、バシラス・サチ
リス由来のエンドペプチダーゼとして、ビオプラ−ゼ
６．０Ｓ（長瀬生化学工業社製）、乳酸菌由来のエキソ
ペプチダ−ゼとして、後記する参考例１と同様の方法で
調整したラクトバチルス・ヘルベティカス菌体破砕物又
はビフィドバクテリウム・プレビス菌体破砕物、その他
のエンドペプチダーゼとして、トリプシン（ノボノルデ
ィスク社製）、及びその他のエキソペプチダ−ゼとし
て、デナチ−ムＡＰ（長瀬産業社製）を用いた。また、
試料番号１及び２は、３０時間加水分解を行っても遊離
リジン量が、１４％に達しなかったので、その時点で加
水分解を終了した。

【００５９】２）試験方法 風味及び抗酸化活性は、いずれも前記の方法により求め
た。

【００６０】３）試験結果 この試験の結果は、表６に示すとおりである。表６から
明らかなように風味が良くかつα−トコフェロールと同
等又はそれ以上の抗酸化活性を有する乳清蛋白質分解物
は、バシラス・サチリス由来のエンドペプチダーゼ及び
乳酸菌由来のエキソペプチダーゼの２種類の蛋白分解酵
素で加水分解したものであることが判明した。尚、乳清
蛋白質の種類、酵素の種類及び量を変更（バシラス・サ
チリス由来のエンドペプチダ−ゼ及び乳酸菌由来のエキ
ソペプチダ−ゼについては、前記する試験例３において
求められた範囲内で、その酵素量を変更）して試験した
が、ほぼ同様の結果が得られた。

【００６１】

【表６】

【００６２】参考例１ コーンスティープリカー２０部（重量。以下同じ）に水
道水１００部及び石灰５部を添加し、コーンスティープ
リカーに含まれている酸を中和し、濾過助剤としてセラ
イト５０部を添加して濾過し、濾液Ａを得た。これとは
別に、フィシュリバー２０部、モラセス３５部及び水道
水２００部の混合液にセライト５０部を添加して濾過
し、濾液Ｂを得た。

【００６３】前記濾液Ａ及び濾液Ｂの当量混合液５００
部にグルコース５部、リン酸一カリウム２．５部、リン
酸二カリウム２．５部及び酢酸ナトリウム５部を添加
し、３０％水酸化ナトリウムでｐＨを６．４に調整し、
水を添加して１０００部に調整した。

【００６４】滅菌した前記組成の培地１０リッタ−にラ
クトバチルス・ヘルベティカスを培養し、得られた培養
液を遠心分離して乳酸菌菌体を回収し、滅菌水に菌体を
懸濁し、遠心分離して乳酸菌菌体を回収する操作を２回
反復して菌体を洗浄し、のち２０％の濃度で菌体を滅菌
水に懸濁し、超音波破砕機（ブランソン社製。SONIFIER
model250）により菌体を破砕し、凍結乾燥し、乳酸菌
由来のエキソペプチダーゼ粉末約２５ｇを得た。

【００６５】参考例２ 実施例２と同一の方法で得た乳清蛋白加水分解物（蛋白
質等量７９．４％）２５．０ｋｇを水１４０ｋｇに溶解
し、５ｋｇの水に溶解した所定量のミネラル類を加え、
６０℃に加熱し、ＤＨＡ７０ｇを含む植物性脂肪２．０
ｋｇ、マルツデキストリン６５．１ｋｇ、砂糖６．６ｋ
ｇ及び所定量のビタミン類を混合し、この混合液を高圧
均質機で十分均質化し、１２０℃で２秒間殺菌し、噴霧
乾燥し、粉末状の抗アレルギー性組成物約９９ｋｇを得
た。

【００６６】次に実施例を示して本発明を更に詳述する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【実施例】

実施例１ 純度７５％の乳清蛋白質粉末（カリフォルニア・プロテ
イン社製）１ｋｇを、脱イオン水９ｋｇに溶解し、７５
℃に１５秒間保持して殺菌し、ｐＨを９．０に調整し、
プロテア−ゼＮアマノ（天野製薬社製）１８０万ＰＵＮ
単位（乳清蛋白質１ｇ当たり２４００ＰＵＮ単位）及び
前記参考例１と同一の方法で調整したラクトバチルス・
ヘルベティカス菌体破砕物６．８万活性単位（乳清蛋白
質１ｇ当たり９０活性単位）を添加し、５０℃に保持し
て加水分解し、バイオテックアナライザー（旭化成工業
社製）を用いて経時的に遊離リジンの量を測定し、遊離
リジン量が１４％に達した時点で、８０℃で６分間加熱
して酵素を失活させ、冷却し、のちクエン酸でｐＨを
６．０に調整し、分画分子量１０，０００の限外濾過膜
（日東電工社製）で限外濾過し、乳清蛋白質加水分解物
を５．９％含有する溶液約１６ｋｇを得た。

【００６７】得られた乳清蛋白質加水分解物を前記試験
方法により試験した結果の一部を図１、図２及び図３に
示す。これらの結果、乳清蛋白質加水分解物は、分子量
５，０００〜１０，０００ダルトンの画分が、全加水分
解物の０．３％、抗原残存活性が１０^-6以下、リジンの
遊離率が１４％、遊離アミノ酸含量１１％、アンモニア
含有量が０．０７％、１０％溶液の透過率が９８％、５
％溶液のｐＨ未調整及びｐＨ４における１２０℃、１０
分間の加熱にも安定であり、α−トコフェロ−ルと同等
の抗酸化活性を有した。また、前記試験方法により試験
したアミノ酸組成（乳清蛋白加水分解物１ｇ当たり）は
次のとおりであった。

【００６８】 Ｌ−アラニン ５２．８（ｍｇ） Ｌ−アルギニン ２３．４ Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−アスパラギンを含む）１０２．６ Ｌ−システイン １７．１ Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−グルタミンを含む） １８５．１ Ｌ−グリシン １８．８ Ｌ−ヒスチジン １７．７ Ｌ−イソロイシン ５９．９ Ｌ−ロイシン １００．１ Ｌ−リジン ９４．６ Ｌ−メチオニン １５．８ Ｌ−フェニルアラニン ２９．５ Ｌ−プロリン ６１．４ Ｌ−セリン ４９．２ Ｌ−スレオニン ７０．３ Ｌ−トリプトファン １６．７ Ｌ−チロシン ２６．１ Ｌ−バリン ５４．７

【００６９】実施例２ 純度８５％の乳清蛋白質粉末（デンマーク・プロテイン
社製）１ｋｇを、脱イオン水１９ｋｇに溶解し、ｐＨを
１０に調整し、市販のトリプシン（ノボノルディスク社
製）を１１万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり１３０
ＰＵＮ単位）、プロテア−ゼＮアマノ（天野製薬社製）
１８０万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり２１００Ｐ
ＵＮ単位）及び前記参考例１と同様の方法で調整したラ
クトバチルス・ブルガリカス菌体破砕物５．１万活性単
位（乳清蛋白質１ｇ当たり６０活性単位）を添加し、４
０℃で加水分解し、バイオテックアナライザー（旭化成
工業社製）を用いて経時的に遊離リジンの量を測定し、
遊離リジン量が１７％に達した時点で、１３０℃で２秒
間加熱して酵素を失活させ、冷却し、のちクエン酸でｐ
Ｈを６．５に調整し、分画分子量３，０００の限外濾過
膜（旭化成工業社製）で限外濾過し、濃縮し、噴霧乾燥
し、粉末状の乳清蛋白質加水分解物約８００ｇを得た。

【００７０】得られた乳清蛋白質加水分解物を前記の試
験方法により試験した結果、分子量５，０００〜１０，
０００ダルトンの画分が、全加水分解物の０．２％、抗
原残存活性が１０^-6以下、リジンの遊離率が１７％、遊
離アミノ酸含量１３％、アンモニア含有量が０．０４
％、１０％溶液の透過率が９９％、５％溶液のｐＨ未調
整及びｐＨ４における１２０℃、１０分間の加熱にも安
定であり、α−トコフェロ−ルと同等の抗酸化活性を有
した。

【００７１】実施例３ 純度９０％の乳清蛋白質粉末（バイオポール社製）１ｋ
ｇを、脱イオン水１９ｋｇに溶解し、７５℃に１５秒間
保持して殺菌し、ｐＨを８．０に調整し、市販のパパイ
ン（天野製薬社製）を１０万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１
ｇ当たり１１０ＰＵＮ単位）、ニュートラーゼ（ノボノ
ルディスク社製）２２０万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ
当たり２４００ＰＵＮ単位）及び前記参考例１と同様の
方法で調整したビフィドバクテリウム・プレビス菌体破
砕物９万活性単位（乳清蛋白質１ｇ当たり１００活性単
位）を添加し、５０℃に保持して加水分解し、バイオテ
ックアナライザー（旭化成工業社製）を用いて経時的に
遊離リジンの量を測定し、遊離リジン量が２０％に達し
た時点で、８５℃で１５分間加熱して酵素を失活させ、
冷却し、のちクエン酸でｐＨを７．０に調整し、分画分
子量１０，０００の限外濾過膜（日東電工社製）で限外
濾過し、濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状の乳清蛋白質加水
分解物約８００ｇを得た。

【００７２】得られた乳清蛋白質加水分解物を前記試験
方法により試験した結果、分子量５，０００〜１０，０
００ダルトンの画分が、全加水分解物の０．３％、抗原
残存活性が１０^-6以下、リジンの遊離率が２０％、遊離
アミノ酸含量１５％、アンモニア含有量が０．０９％、
１０％溶液の透過率が９８％、５％溶液のｐＨ未調整及
びｐＨ４における１２０℃、１０分間の加熱にも安定で
あり、α−トコフェロ−ルと同等の抗酸化活性を有し
た。

【００７３】実施例４ 純度７０％の乳清蛋白質粉末（ミライ社製）１ｋｇを、
脱イオン水５．７ｋｇに溶解し、ｐＨを９．０に調整
し、ビオプラーゼ６．０Ｓ（長瀬生化学工業社製）１６
０万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり２０００ＰＵＮ
単位）及び前記参考例１と同様の方法で調整したストレ
プトコッカス・ラクチス菌体破砕物６．３万活性単位
（乳清蛋白質１ｇ当たり９０活性単位）を添加し、４５
℃で加水分解し、バイオテックアナライザー（旭化成工
業社製）を用いて経時的に遊離リジンの量を測定し、遊
離リジン量が１９％に達した時点で、１３０℃で２秒間
加熱して酵素を失活させ、冷却し、のちクエン酸でｐＨ
を７．０に調整し、分画分子量１０，０００の限外濾過
膜（旭化成社製）で限外濾過し、乳清蛋白質加水分解物
を８．４％含有する溶液約１１ｋｇを得た。

【００７４】得られた乳清蛋白質加水分解物を前記の試
験方法により試験した結果、分子量５，０００〜１０，
０００ダルトンの画分が、全加水分解物の０．９％、抗
原残存活性が１０^-6以下、リジンの遊離率が１９％、遊
離アミノ酸含量１４．５％、アンモニア含有量が０．１
０％、１０％溶液の透過率が９８％、５％溶液のｐＨ未
調整及びｐＨ４における１２０℃、１０分間の加熱にも
安定であり、α−トコフェロ−ルと同等の抗酸化活性を
有した。

【００７５】実施例５ 純度８０％の乳清蛋白質粉末（ニュージーランド・デー
リー・ボード製）１ｋｇを、脱イオン水１２．３ｋｇに
溶解し、７５℃に１５秒間保持して殺菌し、ｐＨを８．
５に調整し、市販のパパイン（天野製薬社製）を８万Ｐ
ＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり１００ＰＵＮ単位）、
ビオプラーゼ（長瀬生化学工業社製）２２０万ＰＵＮ単
位（乳清蛋白質１ｇ当たり２７００ＰＵＮ単位）及び前
記参考例１と同様の方法で調整したストレプトコッカス
・クレモリス菌体破砕物５．６万活性単位（乳清蛋白質
１ｇ当たり７０活性単位）を添加し、ｐＨを６．５に保
持して５５℃で加水分解し、バイオテックアナライザー
（旭化成工業社製）を用いて経時的に遊離リジンの量を
測定し、遊離リジン量が１７％に達した時点で、９０℃
で５分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、のちクエン
酸でｐＨを５．５に調整し、分画分子量１０，０００の
限外濾過膜（日東電工社製）で限外濾過し、濃縮し、噴
霧乾燥し、粉末状の乳清蛋白質加水分解物約８００ｇを
得た。

【００７６】得られた乳清蛋白質加水分解物を前記試験
方法により試験した結果、分子量５，０００〜１０，０
００ダルトンの画分が、全加水分解物の０．３％、抗原
残存活性が１０^-6以下、リジンの遊離率が１７％、遊離
アミノ酸含量１３％、アンモニア含有量が０．１１％、
１０％溶液の透過率が９９％、５％溶液のｐＨ未調整及
びｐＨ４における１２０℃、１０分間の加熱にも安定で
あり、α−トコフェロ−ルと同等の抗酸化活性を有し
た。

【００７７】実施例６ 純度７０％の乳清蛋白質粉末（カリフォルニア・プロテ
イン社製）１ｋｇを、脱イオン水７ｋｇに溶解し、ｐＨ
を８．０に調整し、ブロメライン（天野製薬社製）３５
万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり５００ＰＵＮ単
位）、ニュートラーゼ（ノボノルディスク社製）２３０
万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり３３００ＰＵＮ単
位）及び前記参考例１と同様の方法で調整したラクトバ
チルス・ブルガリカス菌体破砕物５．６万活性単位（乳
清蛋白質１ｇ当たり８０活性単位）を添加し、４７℃で
加水分解し、バイオテックアナライザー（旭化成工業社
製）を用いて経時的に遊離リジンの量を測定し、遊離リ
ジン量が１７％に達した時点で、８５℃で１５分間加熱
して酵素を失活させ、冷却し、のちクエン酸でｐＨを
５．５に調整し、分画分子量１０，０００の限外瀘過膜
（日東電工社製）で限外濾過し、濃縮し、噴霧乾燥し、
粉末状の乳清蛋白質加水分解物約８００ｇを得た。

【００７８】得られた乳清蛋白質加水分解物を前記の試
験方法により試験した結果、分子量５，０００〜１０，
０００ダルトンの画分が、全加水分解物の０．４％、抗
原残存活性が１０^-6以下、リジンの遊離率が１７％、遊
離アミノ酸含量１３％、アンモニア含有量が０．１０
％、１０％溶液の透過率が９８％、５％溶液のｐＨ未調
整及びｐＨ４における１２０℃、１０分間の加熱にも安
定であった。

【００７９】実施例７ 純度８０％の乳清蛋白質粉末（デンマーク・プロテイン
社製）１ｋｇを、脱イオン水９ｋｇに溶解し、ｐＨを
７．５に調整し、市販のニュートラーゼ（ノボノルディ
スク社製）を１６０万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当た
り２０００ＰＵＮ単位）及び前記参考例１と同様の方法
で調整したビフィドバクテリウム・プレビス菌体破砕物
２．８万活性単位（乳清蛋白質１ｇ当たり３５活性単
位）を添加し、ｐＨ７．５に保持して４５℃で加水分解
し、バイオテックアナライザー（旭化成工業社製）を用
いて経時的に遊離リジンの量を測定し、遊離リジン量が
１２％に達した時点で、９０℃で２０分間加熱して酵素
を失活させ、冷却し、のちクエン酸でｐＨを７．０に調
整し、分画分子量３，０００の限外濾過膜（旭化成社
製）で限外濾過し、濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状の乳清
蛋白質加水分解物約８００ｇを得た。

【００８０】得られた乳清蛋白質加水分解物を前記試験
方法により試験した結果、分子量５，０００〜１０，０
００ダルトンの画分が、全加水分解物の０．４％、抗原
残存活性が１０^-6以下、リジンの遊離率が１２％、遊離
アミノ酸含量１０％、アンモニア含有量が０．０９％、
１０％溶液の透過率が１００％、５％溶液のｐＨ未調整
及びｐＨ４における１２０℃、１０分間の加熱にも安定
であった。

【００８１】

【発明の効果】以上詳述したように本発明は、風味良好
な乳清蛋白加水分解物及びその製造法であり、本発明に
よって奏せられる効果は、次のとおりである。 １）本発明の乳清蛋白質加水分解物は、腸管吸収性にお
いて優れ、アミノ酸バランスが良好なので、消化吸収能
の未熟な乳幼児又は消化吸収能が低下している高齢者、
病人への蛋白質供給源用素材として使用できる。 ２）本発明の乳清蛋白質加水分解物は、抗原残存活性が
ないので、アレルギー患者、アレルギー予防を目的とし
て乳幼児、妊産婦、免疫機能の低下した病人への蛋白質
供給源用素材として使用できる。 ３）本発明の乳清蛋白質加水分解物は、抗酸化作用を有
し、熱安定性、透明性も高く、風味良好なので母乳強化
組成物や経口経腸栄養剤の蛋白質供給源用素材として使
用できる。 ４）本発明の方法により、広範な用途を有する乳清蛋白
質加水分解物を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の乳清蛋白加水分解物の分子量分布を示
す。

【図２】本発明の乳清蛋白加水分解物の抗原残存活性を
示す。

【図３】本発明の乳清蛋白加水分解物の抗酸化活性を示
す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年３月９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２８】ｂ）図２に示すとおり、抗乳清蛋白質血清
を用いたエライザ抑制試験法により測定した抗原残存活
性が１０^−５以下、望ましくは１０^−６以下である。図
２は、実施例１により得られた本発明の乳清蛋白加水分
解物の抗原残存活性を示し、縦軸及び横軸は、それぞれ
抑制割合及び最終試料濃度を示す。図中＋及び□は、そ
れぞれ本発明の乳清蛋白分解物及び乳清蛋白質を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成７年１２月１３日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００５】一方、摂取したアミノ酸がトランスグルタ
ミナーゼ、グルタメートデヒトロゲナーゼ等によって分
解されて、アンモニアが生成するが、生成したアンモニ
アは有毒であり、肝臓で直ちに処理される必要があり、
摂取する食品にアンモニアが含有されていないことが必
要である。このような点から、乳清蛋白加水分解物に
も、アンモニアが含有されていないことが、極めて重要
である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１２】５）牛乳蛋白質をトリプシン、α−キモト
リプシン、アスペルギルス属、バシラス属菌の酵素で分
解し、分子量１０，０００ダルトン以下の経口免疫寛容
誘導能を有する低アレルゲン性ペプチドが開示されてい
る（特開平５−５０００号公報）。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１３】６）カゼインを酸性プロテアーゼで分解
し、中性でペプチダーゼで分解し、分子量３，０００ダ
ルトン以下、遊離アミノ酸含量３０〜５５％、α_Ｓ−カ
ゼインに対するＥＬＩＳＡ抑制試験がα_Ｓ−カゼインの
１０，０００分の１以下、５％溶液の苦味官能値がカフ
ェイン０．０４％水溶液相当以下のペプチドが開示され
ている（特開平６−１１３８９３号公報）。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３２】（２）抗原残存活性の測定方法ＥＬＩＳＡ抑制 試験法（日本小児アレルギー学会誌、第
１巻、第３６ページ、１９７８年）により次のようにし
て測定した。９６穴プレート（ヌンク社製）に乳清蛋白
質をコーティングし、洗浄し、ウサギ抗乳清蛋白質血清
及び加水分解物試料の混合液をプレートの穴に供給して
反応させ、洗浄後アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ウ
サギＩｇＧ抗体（ザイメッド・ラボラトリー社製）を反
応させ、洗浄後ｐ−ニトロフェニル・リン酸ナトリウム
を添加し、３０分後に５Ｎ水酸化ナトリウムを添加して
反応を停止させ、反応生成物をマイクロプレートリーダ
ー（和光純薬工業社製）で測定した。なお、抑制用被検
抗原液添加による反応抑制の程度の表現には次の式で算
出した抑制率を用いた。 抑制率（％）＝（１−被検抗原液での吸光度／対照の吸
光度）×１００ ただし、被検抗原液の吸光度及び対照の吸光度は抗乳清
蛋白血清にそれぞれ等量の被検試料液又は希釈液の混合
液を入れた穴の反応後測定した値である。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３３】（３）アミノ酸組成の測定方法 トリプトファン、システイン及びメチオニン以外のアミ
ノ酸については、試料を６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間
加水分解し、トリプトファンについては、水酸化バリウ
ムで１１０℃、２２時間アルカリ分解し、システイン及
びメチオニンについては、過ぎ酸処理後６Ｎ塩酸で１１
０℃、１８時間加水分解し、それぞれアミノ酸分析機
（日立製作所製。８３５型）により分析し、アミノ酸の
質量を測定した。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３５】（５）遊離リジン含量の測定方法 リジン測定用酵素電極、２０ｍＭＬ−リジン標準液、
０．１Ｍ燐酸Ｌ−リジン測定用緩衝液及び洗浄用界面活
性剤（いずれも旭化成工業社製）を用い、バイオテック
アナライザー（旭化成工業社製）により遊離リジン濃度
をバッチ式又はオンラインで測定し、乳清蛋白質のリジ
ン含有量に対する分解溶液の遊離リジン含有量から全リ
ジンに対する遊離リジンの量の割合を算出した。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４９】

【表３】

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５８】試験例６ この試験は、風味と抗酸化活性を指標として、加水分解
のために好適な酵素の種類を調べるために行った。 １）試料の調製 表６に示すとおり使用する酵素の種類及び添加量を変更
したことを除き、実施例１と同一の方法により６種類の
試料を調製した。なお、酵素としては、バシラス・サチ
リス由来のエンドペプチダーゼとして、ビオプラーゼ
６．０Ｓ（長瀬生化学工業社製）、乳酸菌由来のエキソ
ペプチダーゼとして、後記する参考例１と同様の方法で
調製したラクトバシラス・ヘルベティカス菌体破砕物又
はビフィドバクテリウム・ブレーベ菌体破砕物、その他
のエンドペプチダーゼとして、トリプシン（ノボノルデ
ィスク社製）、及ひその他のエキソペプチダーゼとし
て、デナチームＡＰ（長瀬産業社製）を用いた。また、
試料番号１及び２は、３０時間加水分解を行っても遊離
リジン量が、１４％に達しなかったので、その時点で加
水分解を終了した。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６１】

【表６】

【手続補正１０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６４】滅菌した前記組成の培地１０リッターに乳
酸菌ラクトバシラス・ヘルベティカスを培養し、得られ
た培養液を遠心分離して乳酸菌菌体を回収し、滅菌水に
菌体を懸濁し、遠心分離して乳酸菌菌体を回収する操作
を２回反復して菌体を洗浄し、のち２０％の濃度で菌体
を滅菌水に懸濁し、超音波破砕機（ブランソン社製。Ｓ
ＯＮＩＦＩＥＲ ｍｏｄｅｌ２５０）により菌体を破砕
し、凍結乾燥し、乳酸菌由来のエキソペプチダーゼ粉末
約２５ｇを得た。

【手続補正１１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６６】次に実施例を示して本発明を更に詳述する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【実施例】 実施例１ 純度７５％の乳清蛋白質粉末（カリフォルニア・プロテ
イン社製）１ｋｇを、脱イオン水９ｋｇに溶解し、７５
℃に１５秒間保持して殺菌し、ｐＨを９．０に調整し、
プロテアーゼＮアマノ（天野製薬社製）１８０万ＰＵＮ
単位（乳清蛋白質１ｇ当たり２４００ＰＵＮ単位）及び
前記参考例１と同一の方法で調製したラクトバシラス・
ヘルベティカス菌体破砕物６．８万活性単位（乳清蛋白
質１ｇ当たり９０活性単位）を添加し、５０℃に保持し
て加水分解し、バイオテックアナライザー（旭化成工業
社製）を用いて経時的に遊離リジンの量を測定し、遊離
リジン量が１４％に達した時点で、８０℃で６分間加熱
して酵素を失活させ、冷却し、のちクエン酸でｐＨを
６．０に調整し、分画分子量１０，０００の限外濾過膜
（日東電工社製）で限外濾過し、乳清蛋白質加水分解物
を５．９％含有する溶液約１６ｋｇを得た。

【手続補正１２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６９】実施例２ 純度８５％の乳清蛋白質粉末（デンマーク・プロテイン
社製）１ｋｇを、脱イオン水１９ｋｇに溶解し、ｐＨを
１０に調整し、市販のトリプシン（ノボノルディスク社
製）を１１万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり１３０
ＰＵＮ単位）、プロテアーゼＮアマノ（天野製薬社製）
１８０万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり２１００Ｐ
ＵＮ単位）及び前記参考例１と同様の方法で調製したラ
クトバシラス・プルガリカス菌体破砕物５．１万活性単
位（乳清蛋白質１ｇ当たり６０活性単位）を添加し、４
０℃で加水分解し、バイオテックアナライザー（旭化成
工業社製）を用いて経時的に遊離リジンの量を測定し、
遊離リジン量が１７％に達した時点で、１３０℃で２秒
間加熱して酵素を失活させ、冷却し、のちクエン酸でｐ
Ｈを６．５に調整し、分画分子量３，０００の限外濾過
膜（旭化成工業社製）で限外濾過し、濃縮し、噴霧乾燥
し、粉末状の乳清蛋白質加水分解物約８００ｇを得た。

【手続補正１３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７１】実施例３ 純度９０％の乳清蛋白質粉末（バイオポール社製）１ｋ
ｇを、脱イオン水１９ｋｇに溶解し、７５℃に１５秒間
保持して殺菌し、ｐＨを８．０に調整し、市販のパパイ
ン（天野製薬社製）を１０万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１
ｇ当たり１１０ＰＵＮ単位）、ニュートラーゼ（ノボノ
ルディスク社製）２２０万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ
当たり２４００ＰＵＮ単位）及び前記参考例１と同様の
方法で調整したビフィドバクテリウム・ブレーベ菌体破
砕物９万活性単位（乳清蛋白質１ｇ当たり１００活性単
位）を添加し、５０℃に保持して加水分解し、バイオテ
ックアナライザー（旭化成工業社製）を用いて経時的に
遊離リジンの量を測定し、遊離リジン量が２０％に達し
た時点で、８５℃で１５分間加熱して酵素を失活させ、
冷却し、のちクエン酸でｐＨを７．０に調整し、分画分
子量１０，０００の限外濾過膜（日東電工社製）で限外
濾過し、濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状の乳清蛋白質加水
分解物約８００ｇを得た。

【手続補正１４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７３】実施例４ 純度７０％の乳清蛋白質粉末（ミライ社製）１ｋｇを、
脱イオン水５．７ｋｇに溶解し、ｐＨを９．０に調整
し、ビオプラーゼ６．０Ｓ（長瀬生化学工業社製）１６
０万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり２０００ＰＵＮ
単位）及び前記参考例１と同様の方法で調製したストレ
プトコッカス・ラクチス菌体破砕物６．３万活性単位
（乳清蛋白質１ｇ当たり９０活性単位）を添加し、４５
℃で加水分解し、バイオテックアナライザー（旭化成工
業社製）を用いて経時的に遊離リジンの量を測定し、遊
離リジン量が１９％に達した時点で、１３０℃で２秒間
加熱して酵素を失活させ、冷却し、のちクエン酸でｐＨ
を７．０に調整し、分画分子量１０，０００の限外濾過
膜（旭化成社製）で限外濾過し、乳清蛋白質加水分解物
を８．４％含有する溶液約１１ｋｇを得た。

【手続補正１５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７５】実施例５ 純度８０％の乳清蛋白質粉末（ニュージーランド・デー
リー・ボード製）１ｋｇを、脱イオン水１２．３ｋｇに
溶解し、７５℃に１５秒間保持して殺菌し、ｐＨを８．
５に調整し、市販のパパイン（天野製薬社製）を８万Ｐ
ＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり１００ＰＵＮ単位）、
ビオプラーゼ（長瀬生化学工業社製）２２０万ＰＵＮ単
位（乳清蛋白質１ｇ当たり２７００ＰＵＮ単位）及び前
記参考例１と同様の方法で調製したストレプトコッカス
・クレモリス菌体破砕物５．６万活性単位（乳清蛋白質
１ｇ当たり７０活性単位）を添加し、ｐＨを６．５に保
持して５５℃で加水分解し、バイオテックアナライザー
（旭化成工業社製）を用いて経時的に遊離リジンの量を
測定し、遊離リジン量が１７％に達した時点で、９０℃
で５分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、のちクエン
酸でｐＨを５．５に調整し、分画分子量１０，０００の
限外濾過膜（日東電工社製）で限外濾過し、濃縮し、噴
霧乾燥し、粉末状の乳清蛋白質加水分解物約８００ｇを
得た。

【手続補正１６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７７】実施例６ 純度７０％の乳清蛋白質粉末（カリフォルニア・プロテ
イン社製）１ｋｇを、脱イオン水７ｋｇに溶解し、ｐＨ
を８．０に調整し、ブロメライン（天野製薬社製）３５
万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり５００ＰＵＮ単
位）、ニュートラーゼ（ノボノルディスク社製）２３０
万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり３３００ＰＵＮ単
位）及び前記参考例１と同様の方法で調製したラクトバ
シラス・ブルガリカス菌体破砕物５．６万活性単位（乳
清蛋白質１ｇ当たり８０活性単位）を添加し、４７℃で
加水分解し、バイオテックアナライザー（旭化成工業社
製）を用いて経時的に遊離リジンの量を測定し、遊離リ
ジン量が１７％に達した時点で、８５℃で１５分間加熱
して酵素を失活させ、冷却し、のちクエン酸でｐＨを
５．５に調整し、分画分子量１０，０００の限外瀘過膜
（日東電工社製）で限外濾過し、濃縮し、噴霧乾燥し、
粉末状の乳清蛋白質加水分解物約８００ｇを得た。

【手続補正１７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７９】実施例７ 純度８０％の乳清蛋白質粉末（デンマーク・プロテイン
社製）１ｋｇを、脱イオン水９ｋｇに溶解し、ｐＨを
７．５に調整し、市販のニュートラーゼ（ノボノルディ
スク社製）を１６０万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当た
り２０００ＰＵＮ単位）及び前記参考例１と同様の方法
で調製したビフィドバクテリウム・ブレーベ菌体破砕物
２．８万活性単位（乳清蛋白質１ｇ当たり３５活性単
位）を添加し、ｐＨ７．５に保持して４５℃で加水分解
し、バイオテックアナライザー（旭化成工業社製）を用
いて経時的に遊離リジンの量を測定し、遊離リジン量が
１２％に達した時点で、９０℃で２０分間加熱して酵素
を失活させ、冷却し、のちクエン酸でｐＨを７．０に調
整し、分画分子量３，０００の限外濾過膜（旭化成社
製）で限外濾過し、濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状の乳清
蛋白質加水分解物約８００ｇを得た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 磯村 奈生子 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者 赤染 陽子 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者 越智 浩 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者 河本 美穂子 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社栄養科学研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 純度が少なくとも７０％（重量）の乳清
   蛋白質の加水分解物であって、次のａ）〜ｈ）の理化学
   的性質； ａ）分子量５，０００〜１０，０００ダルトンの画分
   が、全加水分解物の１％（重量）未満であること、 ｂ）抗乳清蛋白質血清を用いたエライザ抑制試験法によ
   り測定した抗原残存活性が１０^-5以下であること、 ｃ）加水分解物の全アミノ酸の量に対する遊離アミノ酸
   の量の割合が１０〜１５％（重量）であること、 ｄ）乳清蛋白質に含まれる全リジンの量に対する遊離リ
   ジンの量の割合が１２〜２０％（重量）であること、 ｅ）アンモニア含量が０．２％（重量）以下であるこ
   と、 ｆ）１０％（重量）溶液を１ｃｍのセル、５４０ｎｍで
   測定した透過率が９８％以上であること、 ｇ）ｐＨ４〜７の５％（重量）溶液を１２０℃で１０分
   間加熱して沈殿を生じないこと、及び ｈ）抗酸化活性を有すること、を有することを特徴とす
   る風味良好な乳清蛋白加水分解物。
2. 【請求項２】 純度が少なくとも７０％（重量）の乳清
   蛋白質を１５％（重量）以下の濃度で水に溶解し、該水
   溶液のｐＨを７．５〜１０に調整し、該水溶液にバシラ
   ス・サチリス(Bacillus subtilis) 由来のエンドペプチ
   ダーゼ及び乳酸菌由来のエキソペプチダーゼの２種類の
   蛋白分解酵素を添加して加水分解を開始し、分解液中の
   遊離リジン量を経時的に測定し、出発原料である乳清蛋
   白質に含まれる全リジンの量に対する遊離リジンの量の
   割合が１２〜２０％（重量）の範囲で加水分解を停止
   し、限外濾過して分子量１０，０００ダルトン以上の画
   分を完全に除去することを特徴とする風味良好な乳清蛋
   白加水分解物の製造法。