JPH0799374B2 - 免疫分析用試薬およびこれを用いる免疫分析方法 - Google Patents
免疫分析用試薬およびこれを用いる免疫分析方法Info
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- JPH0799374B2 JPH0799374B2 JP62024473A JP2447387A JPH0799374B2 JP H0799374 B2 JPH0799374 B2 JP H0799374B2 JP 62024473 A JP62024473 A JP 62024473A JP 2447387 A JP2447387 A JP 2447387A JP H0799374 B2 JPH0799374 B2 JP H0799374B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫分析用試薬およびこれを用いた免疫分析方
法に係り、特に、試料中に存在する特定の抗原または抗
体を定量するに好適な免疫分析用試薬およびこれを用い
た免疫分析方法に関する。
法に係り、特に、試料中に存在する特定の抗原または抗
体を定量するに好適な免疫分析用試薬およびこれを用い
た免疫分析方法に関する。
試料成分を高感度に定量するために、従来よりラジオイ
ムノアッセイ法（RIA）が使用されている。しかしなが
ら、RIA法はラジオアイソトープを用いるため、その管
理や廃棄などの面で取扱いが面倒であるという問題があ
り、これに代わる分析法が検討されている。
ムノアッセイ法（RIA）が使用されている。しかしなが
ら、RIA法はラジオアイソトープを用いるため、その管
理や廃棄などの面で取扱いが面倒であるという問題があ
り、これに代わる分析法が検討されている。
例えば、特開昭56−132564号公報には、小胞体たとえば
リポソームとして脂質分子膜を用い、これに抗原または
抗体を結合させて用いる免疫分析方法が開示されてい
る。
リポソームとして脂質分子膜を用い、これに抗原または
抗体を結合させて用いる免疫分析方法が開示されてい
る。
小胞体を用いる分析法は、小胞体内に酵素や螢光物質や
発光物質などの標識物質あるいはその前駆体を担持させ
ることができ、抗原抗体反応によるリポソームの破壊に
伴う標識物質の流出量を測定することにより、測定対象
物質の濃度を定量することができる。
発光物質などの標識物質あるいはその前駆体を担持させ
ることができ、抗原抗体反応によるリポソームの破壊に
伴う標識物質の流出量を測定することにより、測定対象
物質の濃度を定量することができる。
この種の分析方法のもう１つの例として、特開昭59−28
661号公報には、小胞体としてヒツジの赤血球膜を用
い、酵素又は基質を小胞体内に収容させて酵素反応を利
用する免疫分析用試薬およびこれを用いる免疫分析方法
が示されている。
661号公報には、小胞体としてヒツジの赤血球膜を用
い、酵素又は基質を小胞体内に収容させて酵素反応を利
用する免疫分析用試薬およびこれを用いる免疫分析方法
が示されている。
これらのような小胞体を用いる分析方法は、いずれも、
補体溶解反応を利用している。補体は、膜（小胞体膜、
リポソーム膜）表面上における抗原抗体反応部位を認識
して膜溶解を生じさせる補体活性と呼ばれる働きを持
つ。
補体溶解反応を利用している。補体は、膜（小胞体膜、
リポソーム膜）表面上における抗原抗体反応部位を認識
して膜溶解を生じさせる補体活性と呼ばれる働きを持
つ。
小胞体上で抗原抗体反応物が生成しても、補体が存在し
なければ小胞体の溶解は起こらない。しかし、試薬とし
て補体を加えると、小胞体が溶解し、小胞体内から、封
入しておいた標識物が流失することになる。
なければ小胞体の溶解は起こらない。しかし、試薬とし
て補体を加えると、小胞体が溶解し、小胞体内から、封
入しておいた標識物が流失することになる。
前記したいずれの方法においても、小胞体の表面には測
定対象の抗原または抗体を結合させている。測定対象物
質の抗原を小胞体に結合させて用いる従来の分析方法に
おいては、いずれも、試薬として加える抗体に対して、
小胞体結合抗原と試料中の抗原が競合的に反応するいわ
ゆる競合反応法が提案されている。
定対象の抗原または抗体を結合させている。測定対象物
質の抗原を小胞体に結合させて用いる従来の分析方法に
おいては、いずれも、試薬として加える抗体に対して、
小胞体結合抗原と試料中の抗原が競合的に反応するいわ
ゆる競合反応法が提案されている。
競合反応法では、一定量の抗体試薬に対して、一定量の
小胞体結合抗原試薬と試料中の濃度未知の抗原とが競合
して反応する。すなわち、試料中の測定対象抗原が含ま
れない場合には、抗体試薬と小胞体結合抗原試薬のみが
反応する。試料中の測定対象抗原濃度が増すにつれて、
抗体と反応できる小胞体結合抗原は減ることになる。す
なわち、小胞体の溶解は、小胞体表面上で抗原抗体反応
が生じたことを補体が認識して生じることから、測定対
象抗原がゼロ量のときに小胞体の溶解が最も多くすす
み、測定対象抗原量が増すにつれて、小胞体の溶解は抑
えられることになる。
小胞体結合抗原試薬と試料中の濃度未知の抗原とが競合
して反応する。すなわち、試料中の測定対象抗原が含ま
れない場合には、抗体試薬と小胞体結合抗原試薬のみが
反応する。試料中の測定対象抗原濃度が増すにつれて、
抗体と反応できる小胞体結合抗原は減ることになる。す
なわち、小胞体の溶解は、小胞体表面上で抗原抗体反応
が生じたことを補体が認識して生じることから、測定対
象抗原がゼロ量のときに小胞体の溶解が最も多くすす
み、測定対象抗原量が増すにつれて、小胞体の溶解は抑
えられることになる。
しかしながら、本発明者らの研究によれば、脂溶性抗原
を小胞体に担持させると、抗原としての活性が低下する
場合のあることが判明した。
を小胞体に担持させると、抗原としての活性が低下する
場合のあることが判明した。
さらに、抗原が蛋白質成分であるときには、グルタルア
ルデヒド等の二官能性架橋試薬を用いて小胞体に担持さ
せることが多いが、このような架橋試薬で蛋白質を小胞
体に担持させると、抗原としての活性が低下する場合の
あることも判明した。
ルデヒド等の二官能性架橋試薬を用いて小胞体に担持さ
せることが多いが、このような架橋試薬で蛋白質を小胞
体に担持させると、抗原としての活性が低下する場合の
あることも判明した。
そして、これらの結果、競合反応時における、抗原抗体
反応に伴う小胞体（リポソームなど）の破壊が引起こさ
れにくくなり、このために、測定の検出感度が著しく低
下したり、所要反応時間が長くなったりする場合のある
ことが判明した。
反応に伴う小胞体（リポソームなど）の破壊が引起こさ
れにくくなり、このために、測定の検出感度が著しく低
下したり、所要反応時間が長くなったりする場合のある
ことが判明した。
また、小胞体に結合させた抗原の起源と、反応に使用す
る抗体の起源とが異なる場合には、両者の起源が一致す
る場合と比較して、その反応性が低下し、測定の検出感
度を低下させる場合があることも判明した。
る抗体の起源とが異なる場合には、両者の起源が一致す
る場合と比較して、その反応性が低下し、測定の検出感
度を低下させる場合があることも判明した。
例えば、測定対象物質がヒトインシュリンのように、合
成が困難であったり、またはそれ自体が高価であるよう
な場合には、起源の異なるもので代用することが多い。
すなわち、ヒトインシュリンを測定する場合に、ウシイ
ンシュリンを小胞体に結合させて反応に使用することが
できる。
成が困難であったり、またはそれ自体が高価であるよう
な場合には、起源の異なるもので代用することが多い。
すなわち、ヒトインシュリンを測定する場合に、ウシイ
ンシュリンを小胞体に結合させて反応に使用することが
できる。
ところが、試料中のヒトインシュリンと反応性の高いヒ
ト起源のインシュリンに対する抗体、すなわち抗ヒトイ
ンシュリン抗体に対して、前記ウシインシュリン結合小
胞体と試料中のヒトインシュリンとを競合的に反応させ
る場合、ヒトインシュリンに比べて、ウシインシュリン
の抗ヒトインシュリン抗体に対する反応性が低いため
に、結果として小胞体の破壊が起こりにくいという現象
が確認された。
ト起源のインシュリンに対する抗体、すなわち抗ヒトイ
ンシュリン抗体に対して、前記ウシインシュリン結合小
胞体と試料中のヒトインシュリンとを競合的に反応させ
る場合、ヒトインシュリンに比べて、ウシインシュリン
の抗ヒトインシュリン抗体に対する反応性が低いため
に、結果として小胞体の破壊が起こりにくいという現象
が確認された。
本発明は、前述のような問題点を解決するためになされ
たもので、本発明の目的は、抗原または抗体結合小胞体
を用いて抗体または抗原を定量するための、高感度な免
疫分析を実現するための免疫分析用試薬およびこれを用
いた免疫分析法を提供することにある。
たもので、本発明の目的は、抗原または抗体結合小胞体
を用いて抗体または抗原を定量するための、高感度な免
疫分析を実現するための免疫分析用試薬およびこれを用
いた免疫分析法を提供することにある。
上記の目的は、補体活性により溶解（破壊）作用を受け
るリポソームなどの小胞体上に抗原または抗体を結合さ
せ、さらに、前記抗原または抗体と特異的に（それのみ
に、あるいはそれに対して特に活性に）反応する抗体ま
たは抗原の至適量を、前記抗原、または抗体の少なくと
も一部と予じめ反応させて試薬を作成した後に、この試
薬に試料中の抗体または抗原を加えて反応させることに
より達成される。
るリポソームなどの小胞体上に抗原または抗体を結合さ
せ、さらに、前記抗原または抗体と特異的に（それのみ
に、あるいはそれに対して特に活性に）反応する抗体ま
たは抗原の至適量を、前記抗原、または抗体の少なくと
も一部と予じめ反応させて試薬を作成した後に、この試
薬に試料中の抗体または抗原を加えて反応させることに
より達成される。
小胞体に結合させた抗原又は抗体の少なくとも一部と、
これと特異的に反応する抗体または抗原とをあらかじめ
反応させて免疫分析用試薬を準備したのち、この試薬に
試料を反応させることにより、小胞体結合の抗原あるい
は抗体の活性が低下している場合や、試薬中の抗体ある
いは抗原との反応性が低い場合においても、短時間で高
感度な免疫分析を実現することができる。
これと特異的に反応する抗体または抗原とをあらかじめ
反応させて免疫分析用試薬を準備したのち、この試薬に
試料を反応させることにより、小胞体結合の抗原あるい
は抗体の活性が低下している場合や、試薬中の抗体ある
いは抗原との反応性が低い場合においても、短時間で高
感度な免疫分析を実現することができる。
以下、本発明を実施例によって更に詳細に説明する。
本発明の試薬による定量が可能な測定対象物質は、α−
フェトプロティンなどの腫瘍マーカや免疫グロブリン、
甲状腺ホルモンやインシュリンなどの抗原、あるいはそ
れらに対応する抗体であって、きわめて広範囲に及ぶも
のである。
フェトプロティンなどの腫瘍マーカや免疫グロブリン、
甲状腺ホルモンやインシュリンなどの抗原、あるいはそ
れらに対応する抗体であって、きわめて広範囲に及ぶも
のである。
小胞体内に封入される標識物質は、親水性であって、小
胞体から流出されたときに定量可能な物質、あるいはそ
の前駆体であれば、どのようなものでもよい。それ故
に、この明細書においては、「標識物質」なる用語はそ
の前駆体をも含むものとして定義される。
胞体から流出されたときに定量可能な物質、あるいはそ
の前駆体であれば、どのようなものでもよい。それ故
に、この明細書においては、「標識物質」なる用語はそ
の前駆体をも含むものとして定義される。
本発明の免疫分析用試薬の製造およびこの試薬を用いる
免疫分析方法は、例えば、次の様にして実施される。
免疫分析方法は、例えば、次の様にして実施される。
まず、測定対象の抗原を結合させた小胞体を常法（例え
ば、特開昭59−28661号公報に開示されている）に従っ
て調製する。次に、前記抗原に対して特異的な反応性を
示す適量の抗体を加えて前記抗原と十分に反応させ、小
胞体表面上の抗原に抗体を結合させる。
ば、特開昭59−28661号公報に開示されている）に従っ
て調製する。次に、前記抗原に対して特異的な反応性を
示す適量の抗体を加えて前記抗原と十分に反応させ、小
胞体表面上の抗原に抗体を結合させる。
最後に、未反応の抗体を遠心洗浄によって除去すれば、
その表面上に結合された抗原の少くとも一部が抗体と反
応した状態の小胞体−すなわち、免疫分析用試薬が得ら
れる。
その表面上に結合された抗原の少くとも一部が抗体と反
応した状態の小胞体−すなわち、免疫分析用試薬が得ら
れる。
前述のようにして得られた免疫用試薬においては、小胞
体の表面上に結合された抗原のすべてが、後に加えられ
た抗体と反応していることは必ずしも必要ではないが、
抗体と反応している抗原の割合が大であるほど、免疫分
析の感度は高くなる。
体の表面上に結合された抗原のすべてが、後に加えられ
た抗体と反応していることは必ずしも必要ではないが、
抗体と反応している抗原の割合が大であるほど、免疫分
析の感度は高くなる。
このような免疫用試薬に抗原を含む試料を加えて競合反
応させることにより、本発明の目的とする高感度な分析
が可能となる。
応させることにより、本発明の目的とする高感度な分析
が可能となる。
また、前述した試薬の製造工程とは逆に、まず最初に抗
体を結合させた小胞体を調整し、その後に、前記抗体に
対して特異的な反応性を示す抗原を加えて抗体抗原反応
を起させることによっても、同様の免疫分析用試薬を得
ることができる。
体を結合させた小胞体を調整し、その後に、前記抗体に
対して特異的な反応性を示す抗原を加えて抗体抗原反応
を起させることによっても、同様の免疫分析用試薬を得
ることができる。
実施例1. 小胞体は、例えば脂質の薄膜で形成された小粒子から成
り、その表面に測定対象の抗原が結合される。このよう
な小胞体の調製方法は、例えば、Hsia等により開示され
ている〔酵素学的方法:Method in Enzymology,74,152
（1981）〕。
り、その表面に測定対象の抗原が結合される。このよう
な小胞体の調製方法は、例えば、Hsia等により開示され
ている〔酵素学的方法:Method in Enzymology,74,152
（1981）〕。
前記小胞体の内部には、螢光物質であるカルボキシフル
オレセインを、標識物質として収容し、小胞体表面には
チロキシン（Thyroxine（T4））を結合させた。調製し
た小胞体500μに対して、抗T4抗体を100μ加え、室
温で２時間反応させた。
オレセインを、標識物質として収容し、小胞体表面には
チロキシン（Thyroxine（T4））を結合させた。調製し
た小胞体500μに対して、抗T4抗体を100μ加え、室
温で２時間反応させた。
次に、ベロナール（Veronal）緩衝液（pH7.4）1mlを加
えて15,000rpmの回転速度で30分間遠心洗浄し、上清を
流去した。この操作を３回繰り返して未反応の抗体を除
去した。以上の方法で得られた沈澱を、500μの前記
緩衝液に懸濁して試薬液を作り、試料（被分析抗原を含
む）との反応に用いた。
えて15,000rpmの回転速度で30分間遠心洗浄し、上清を
流去した。この操作を３回繰り返して未反応の抗体を除
去した。以上の方法で得られた沈澱を、500μの前記
緩衝液に懸濁して試薬液を作り、試料（被分析抗原を含
む）との反応に用いた。
このようにして得た試薬液２μと、測定試料20μお
よび補体液５μを前記緩衝液173μに加え、室温で3
0分間反応させた。抗原抗体反応によって小胞体が破ら
れ、その内部から流出したカルボキシフルオレセインの
螢光量を測定することによって、試料中のT4濃度を定量
した。
よび補体液５μを前記緩衝液173μに加え、室温で3
0分間反応させた。抗原抗体反応によって小胞体が破ら
れ、その内部から流出したカルボキシフルオレセインの
螢光量を測定することによって、試料中のT4濃度を定量
した。
なお、試料の定量には、あらかじめ作成した検量線を利
用した。従来の競合反応法により得られたT4定量のため
の検量線と、本発明の方法により得られた検量線を、第
１図にそれぞれＡおよびＢで示す。
用した。従来の競合反応法により得られたT4定量のため
の検量線と、本発明の方法により得られた検量線を、第
１図にそれぞれＡおよびＢで示す。
第１図から分るように、T4濃度の変化に対して螢光強度
が変化する領域は、本発明の試薬および分析法を用いる
場合はT4濃度が１〜40μg/dlの範囲であるのに対し、従
来の試薬および分析法を用いる場合はT4濃度が100〜500
μg/dlの範囲である。この実測結果から、本発明の分析
方法が、従来法に比べて格段に高感度であることがわか
る。
が変化する領域は、本発明の試薬および分析法を用いる
場合はT4濃度が１〜40μg/dlの範囲であるのに対し、従
来の試薬および分析法を用いる場合はT4濃度が100〜500
μg/dlの範囲である。この実測結果から、本発明の分析
方法が、従来法に比べて格段に高感度であることがわか
る。
実施例2. 実施例１と同様の方法により、抗原としてのウシインシ
ュリンを結合させた小胞体を得た。小胞体の内部には、
実施例１と同様に、カルボキシフルオレセインを収容し
た。
ュリンを結合させた小胞体を得た。小胞体の内部には、
実施例１と同様に、カルボキシフルオレセインを収容し
た。
調製した小胞体500μに対して抗ヒトインシュリン抗
体を200μ加えて、室温で１時間反応させた。未反応
の抗体を遠心洗浄により除いた後、ベロナール緩衝液
（pH7.4）500μに懸濁した。
体を200μ加えて、室温で１時間反応させた。未反応
の抗体を遠心洗浄により除いた後、ベロナール緩衝液
（pH7.4）500μに懸濁した。
このようにして調製した小胞体２μと試料50μと補
体液５μを前記緩衝液143μに加えて室温で30分間
反応させた。反応液の螢光強度を、実施例１と同様の方
法で測定することにより、試料中のヒトインシュリン濃
度を求めることができた。
体液５μを前記緩衝液143μに加えて室温で30分間
反応させた。反応液の螢光強度を、実施例１と同様の方
法で測定することにより、試料中のヒトインシュリン濃
度を求めることができた。
実施例２の場合の検量線を第２図に示す。Ａは本発明方
法によるもの、Ｂは従来法によるものである。
法によるもの、Ｂは従来法によるものである。
本発明によれば、小胞体感作抗原の抗原性が低下してい
る場合や、抗体との反応性が低い場合においても高感度
な免疫分析方法を提供することができる。
る場合や、抗体との反応性が低い場合においても高感度
な免疫分析方法を提供することができる。
第１図は、本発明の一実施例のT4定量のための検量線の
一例を示す図である。第２図は本発明によるインシュリ
ン検量線の一例を示す図である。 Ａ……本発明の試薬を用いたときのT4検量線、 Ｂ……従来の試薬を用いたときのT4検量線
一例を示す図である。第２図は本発明によるインシュリ
ン検量線の一例を示す図である。 Ａ……本発明の試薬を用いたときのT4検量線、 Ｂ……従来の試薬を用いたときのT4検量線
Claims (3)
- 【請求項１】その内部に標識物質が封入され、補体活性
によって溶解作用を受ける小胞体と、 前記小胞体の表面に予め結合された、分析対象の抗原ま
たは抗体と競合反応し得る抗原または抗体の一方と、 前記小胞体の表面に結合された抗原または抗体の一方に
対して特異的な反応性を有し、前記抗原または抗体の一
方の少なくとも一部と反応した抗原または抗体の他方と
よりなることを特徴とする免疫分析用試薬。 - 【請求項２】前記抗原または抗体の一方のすべてが、前
記抗原または抗体の他方のすべてと反応したことを特徴
とする前記特許請求の範囲第１項記載の免疫分析用試
薬。 - 【請求項３】その内部に標識物質が封入され、補体活性
によって溶解作用を受ける小胞体の表面に、分析対象の
抗原または抗体と競合反応し得る抗原または抗体の一方
を結合させる工程と、 前記小胞体の表面に結合された抗原または抗体の一方に
対して特異的な反応性を有する抗原または抗体の他方
を、前記小胞体の表面に結合された抗原または抗体の一
方の少なくとも一部と反応させて免疫分析用試薬を得る
工程と、 前記免疫分析用試薬に分析対象である抗原または抗体の
一方を反応させる工程と、 前記工程によって小胞体から流出した標識物質を定量す
る工程とからなることを特徴とする免疫分析方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62024473A JPH0799374B2 (ja) | 1987-02-06 | 1987-02-06 | 免疫分析用試薬およびこれを用いる免疫分析方法 |
| EP87119257A EP0278116A3 (en) | 1987-02-06 | 1987-12-28 | A method for immunoassay and kit therefor |
| US07/140,117 US5128241A (en) | 1987-02-06 | 1987-12-31 | Microcapsule immunoassay and reagents therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62024473A JPH0799374B2 (ja) | 1987-02-06 | 1987-02-06 | 免疫分析用試薬およびこれを用いる免疫分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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