JPH0795882A - アルカリプロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 バチルスｓｐ．ＴＨＳ−１００１株のゲノム
ＤＮＡの一部を発現させて得られる下記性質を有するア
ルカリプロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子：(1)
至適ｐＨは 9.5〜10.5；(2) 安定ｐＨは 3.5〜１２；
(3) 至適作用温度は約５０℃；(4) ｐＨ１０で３０℃ま
で全く安定、６０℃までかなり安定、７０℃で完全失
活；(5) Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA を分解；(6) エレク
トロフォーカシング（焦点電気泳動法）による等電点は
１１以上；(7) ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量は約2
9,000；（8) キモスタチン、アンチパインおよびフェ
ニルメタンスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）より阻
害される。 【効果】 本発明による遺伝子を導入した形質転換微生
物を培養することによりアルカリ及び熱に対して安定
で、洗浄補助剤などの工業用酵素として有用な本発明に
よるアルカリプロテアーゼを得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なアルカリプロテ
アーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。さらに詳
しく言えば、バチルスｓｐ．ＴＨＳ−１００１株を培養
して得られる熱に対する安定性に優れた新規なアルカリ
プロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】バチルス属細菌が分泌する典型的な菌体
外産生蛋白のアルカリプロテアーゼは、皮革加工用、食
品工業用、洗剤添加用、医薬品用など多岐にわたって利
用されている。しかし、自然界から得られる微生物由来
の野生型アルカリプロテアーゼは、その特性において十
分満足できるものではなく、産業上利用するためには、
温度、ｐＨ、酸素、溶媒、圧力、酸化剤、界面活性剤、
その他の反応液中の添加剤などに対する安定性を改良す
る必要がある。

【０００３】特に洗浄補助剤として添加されるプロテア
ーゼは、粉末タイプのみならず、液体タイプの洗剤に配
合された状態で十分な安定性を示し、さらに十分な機能
を発揮することが望まれる。しかし、液体タイプの洗剤
中では、粉末タイプと比べてプロテアーゼの安定性が低
く、製品として保存されている間に分解を受けたり洗浄
中に失活するなどの問題があり、十分な洗浄効果を上げ
るに至っていない。

【０００４】そこで、新しい界面活性剤の開発、安
定化剤の添加、酵素のマイクロカプセル化等により酵
素の液体洗剤中での安定性を向上させる技術が多数開示
されている（特開平2-41398 号、米国特許第4287082
号、英国特許第2021142 号、特開昭62-596号、特開昭63
-137996 号等）。

【０００５】しかし、酵素の安定化技術と共に、酵素自
体の液体洗剤中での安定性が従来品よりもより優れたも
のが強く求められるようになり、安定性に優れたアルカ
リプロテアーゼを生産する新規な微生物の探索が行なわ
れている。また、より安定性に優れ、応用価値の高いプ
ロテアーゼが常に求められており、いわゆる蛋白質工学
により、アミノ酸配列の部位特異的改変を用いたプロテ
アーゼの安定性の改良の開示もなされている（欧州特許
第0130756 号、米国特許第4760025 号等）。

【０００６】洗剤添加用アルカリプロテアーゼは、その
殆どが比較的高温度で高い活性を示すものが多い中で、
バチルス属（Bacillus sp.）ＮＫＳ−２１（以下、バチ
ルスＮＫＳ−２１という。）は、比較的低い温度で活性
を有するアルカリプロテアーゼＡＰＩ−２１（以下、Ａ
ＰＩ−２１という。）を菌体外に生産することが知られ
ており（特公昭60-55118号）、その後この菌体の変異株
であるＳＤ−５１５株（微工研菌寄第9968号）はアルカ
リプロテアーゼＳＤＰ−５１５（以下、ＳＤＰ−５１５
という。）を生産することが明らかにされている（特開
平1-281084号参照) 。

【０００７】また、本出願人は、バチルスＮＫＳ−２１
株由来のＡＰＩ−２１のアミノ酸配列を遺伝子改変技術
を用いた特異的部位改変により、より安定なプロテアー
ゼの生産を提案している（特開平 5-91876号参照）。

【０００８】さらに、本発明者らはバチルスＮＫＳ−２
１のゲノムＤＮＡを制限酵素により部分分解した断片を
ショットガン法により導入して形質転換した微生物を培
養するスクリーニング法によりバチルスＮＫＳ−２１の
ゲノムＤＮＡの未発現部分を発現させて得られる安定性
に優れたアルカリプロテアーゼ、そのプロテアーゼをコ
ードする遺伝子、そのプロテアーゼの製造方法、および
その洗剤組成物に対する用途を先に提案している（特願
平4-296360号）。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、バチ
ルス属細菌由来の安定性に優れた新規なアルカリプロテ
アーゼ、およびそのプロテアーゼをコードする遺伝子を
提供することにある。

【００１０】本発明で用いたバチルスｓｐ．ＴＨＳ−１
００１株は、東京都の土壌から採取したものであり、ｐ
Ｈ１０以上のアルカリ性領域で生育できるが、中性ｐＨ
では生育できない好アルカリ細菌である。

【００１１】本細菌は、グラム陽性の桿菌で、胞子を形
成することから、バチルス属に属する好アルカリ細菌で
あることが明らかになった。本細菌は、バチルスｓｐ．
ＴＨＳ−１００１株と命名され、工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１３８６９として寄託され
ている。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、 １）実質的に配列番号２で示されるアミノ酸配列を有
し、等電点が１１以上のアルカリプロテアーゼ、 ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するアルカ
リプロテアーゼをコードする遺伝子、および ３）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するアルカ
リプロテアーゼをコードする配列番号３で示される遺伝
子 を提供するものである。

【００１３】本発明に係る新規アルカリプロテアーゼ
は、実質的に配列番号２で示されるアミノ酸配列を有す
る。すなわち、これと必ずしも同一である必要はなく、
等電点が１１以上であるという基本的な特徴が変化しな
い範囲でアミノ酸置換、欠失、または挿入した形のもの
も含まれる。

【００１４】本発明に係る新規アルカリプロテアーゼ
は、バチルスｓｐ．ＴＨＳ−１００１株を培養すること
により、または本発明の遺伝子を微生物中に導入し、そ
の微生物を培地中で培養することにより生産させ、培養
液からプロテアーゼを回収することにより取得できる。
この際用いるＤＮＡとしては、前記バチルスｓｐ．ＴＨ
Ｓ−１００１株から得られる遺伝子が用いられるが、こ
のＤＮＡ中には少なくとも配列番号３で示される本アル
カリプロテアーゼ遺伝子または配列番号２で示されるア
ミノ酸配列をコードする塩基配列のＤＮＡが含まれてい
ればよく、必ずしもバチルスｓｐ．ＴＨＳ−１００１株
由来の遺伝子全部を含んでいる必要はない。また、本ア
ルカリプロテアーゼ構造遺伝子部分に、別のプロモータ
ー領域やシグナル配列、ターミネーター領域等を結合し
たＤＮＡ断片を用いることもできる。この際用いるプロ
モーター領域やシグナル配列、ターミネーター領域等は
遺伝子を導入する宿主菌中でアルカリプロテアーゼを発
現、生産することができるものであれば如何なるものを
用いてもよい。

【００１５】また、宿主菌としては、目的とするプロテ
アーゼ遺伝子を導入でき、発現、生産可能なものであれ
ばどのようなものを用いてもよいが、その生育速度、プ
ロテアーゼ生産性の観点より、工業的生産においてはバ
チルス属細菌もしくは大腸菌を用いることが望ましい。
宿主菌の形質転換法は、通常用いられる方法で可能であ
る。例えば、プロトプラスト法、エレクトロポレーショ
ン法、コンピーテントセル法などにより実施可能であ
る。導入したプロテアーゼ遺伝子は、プラスミド等を用
いて染色体外に存在、複製させる方法で安定に保持させ
てもよいし、染色体中に組み込む方法でもかまわない。
染色体外の存在、複製する方法の場合には、宿主菌中で
複製可能なベクターを用いる。例えば、大腸菌を宿主菌
として用いる場合、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｃｏｌ
Ｅ１等を用いることができる。一方、バチルス属細菌の
宿主染色体中に組み込む方法では、ベクターを用いない
か、あるいは宿主菌内で複製しないものを用いることが
望ましく、例えば上記プラスミドあるいはｐＥ１９４等
を用いることができるが、必ずしもこれらに限定されな
い。

【００１６】形質転換体の選択は、スキムミルクあるい
はカゼインを加えた寒天培地上でのクリアゾーン形成
や、導入遺伝子に結合した遺伝子マーカーの発現により
行なうことができるが、必ずしもこれらに限られない。

【００１７】上記のようにして得た形質転換体、または
バチルスｓｐ．ＴＨＳ−１００１株を培養する培地とし
ては特に制限はなく、生育可能なものであればどのよう
な培地でも用いることができる。培養液からのプロテア
ーゼの分離精製は、一般的な蛋白質の分離精製法にした
がって行なうことができる。例えば、塩析、イオンクロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等により可
能であるが、必ずしもこれに限るものではない。

【００１８】

【酵素活性の測定法】本発明においては酵素の活性は次
のような方法で測定した。５０ｍＭ Atkins-Pantin 緩
衝液（ｐＨ10.0）1.5 ｍｌに、１０ｍＭになるように合
成基質サクシニル−ロイシル−ロイシル−バリル−チロ
シル−４−メチルクマリル−７−アミド（以下、Suc-Le
u-Leu-Val-Tyr-MCA と略す。）をジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）に溶解させたもの５μｌを混合し、この混
合液に酵素溶液１０μｌを添加する。反応温度を３０℃
とし、３４５ｎｍの励起光より生じる７−アミノ−４メ
チルクマリン（ＡＭＣ）の蛍光を４４０ｎｍで検出す
る。１秒間に１モルのＡＭＣを生成する酵素量を１ｋａ
ｔａｌとする。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例１：新規アルカリプロテアーゼの精製 ５００ｍｌ容坂口フラスコに大豆粉４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４
0.8ｇ、ＭｇＳＯ_４0.08ｇおよび水９０ｍｌを加え、１
１５℃、１５分間オートクレーブで滅菌した。別にそれ
ぞれ同条件で滅菌した５０％マルトース溶液１０ml及び
１０％Ｎａ_２ＣＯ_３溶液１ｍｌを上記坂口フラスコに無
菌的に加えた。バチルスｓｐ．ＴＨＳ−１００１株を前
記培地に植菌し、３０℃で４４時間振盪培養した。得ら
れた培養液を9000×ｇで１５分間遠心分離し、上清液
（９２ｍｌ）の酵素活性を測定したところ、培養液１ｇ
当たり１２５ｎｋａｔａｌであった。この溶液を凍結乾
燥することにより粗酵素末を得た。

【００２０】以下、精製操作はすべて４℃以下で行なっ
た。上記の粗酵素末１ｇを、２ｍＭのカルシウムイオン
を含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ7.
2 ）（以下、緩衝液Ａという。）５０ｍｌに溶解させ
た。この酵素液を、予め緩衝液Ａで平衡化したDEAE-TOY
OPEARL 650S カラム（３×８ｃｍ）にかけ、上記緩衝液
Ａで溶出させた。未吸着の活性画分を分取し、１０ｍＭ
Atkins-Pantin 緩衝液（ｐＨ10.0）で透析した後、同
緩衝液で平衡化させたCM-Sephadex C-50カラム（２×２
５ｃｍ）にかけ、０〜1.0 ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配で
溶出させた。活性画分を分取し、１０ｍＭ Atkins-Pan
tin 緩衝液（ｐＨ10.0）で平衡化したHW-50F−ゲルろ過
を行ない蛋白的に均一な精製酵素（活性収率１０％）を
得た。

【００２１】実施例２：精製酵素の性質 (1) ｐＨ安定性および至適ｐＨの測定 ｐＨ安定性は以下のような方法で測定した。実施例１で
得られた新規アルカリプロテアーゼを、各ｐＨに調製し
た0.1 ＭBritton-Robinson広域緩衝液と等量ずつ混合
し、３０℃で１０分間インキュベートした後、0.1 Ｍ
Atkins-Pantin 緩衝液（ｐＨ10.0）で４０μＭ Suc-Leu
-Leu-Val-Tyr-MCAを基質として活性の測定を行なった。
ｐＨ10.0における活性を100として表示した結果を図１
に示す。また、至適ｐＨは、上記測定で用いたのと同様
の各ｐＨの緩衝液を用いて、３０℃で、同じく Suc-Leu
-Leu-Val-Tyr-MCAを基質として活性の測定を行なうこと
により求めた。最高の活性を示したｐＨ10.0での活性を
１００として表示した結果を図２に示す。図１および２
より、本アルカリプロテアーゼは約ｐＨ 3.5〜１２の範
囲で安定であり、至適ｐＨが 9.5〜10.5であることがわ
かった。

【００２２】(2) 熱安定性および至適温度の測定 熱安定性は以下のような方法で測定した。すなわち、同
じく実施例１で得られた新規アルカリプロテアーゼを、
ｐＨ10.0で各温度にて１０分間インキュベートした後、
Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAを基質として３０℃、ｐＨ1
0.0で活性の測定を行なった。３０℃で処理した時の活
性を１００として表示した結果を図３に示す。図３よ
り、本アルカリプロテアーゼは約３０℃まで全く安定で
あり、６０℃まではかなり安定であるが、７０℃で完全
失活することがわかった。また、至適温度は、ｐＨ10.0
で４０μＭ Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAを基質とし１０分
間反応させた時の各温度における活性の測定により求め
た。３０℃における値を１００として表示した結果は図
４に示すとおりであり、その至適温度は約５０℃であ
る。

【００２３】(3) 等電点の測定 同じく実施例１で得られた新規アルカリプロテアーゼ
を、エレクトロフォーカシング（焦点電気泳動法）を用
いて等電点を測定した。まず、アガロースゲル電気泳動
を行ない、終了後、基質の Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAを
含有する Atkins-Pantin 緩衝液（ｐＨ10.0）を含ませ
たプロッティングろ紙を置き、室温で１０〜３０分間反
応させた。その結果、従来公知のものでは最高の等電点
（10.6）を示すアルカリエラスターゼであるＹａＢ(Jou
rnal of Bacteriology,171, 5232〜5236,1989 ）よりも
高い等電点（１１以上）を示した。本発明の酵素と一次
構造の相関性の最も高い約７０％の値をもつアルカリプ
ロテアーゼ 221の等電点はｐＨ9.4 であり（鶴大典，微
生物，５，322 頁(1989)）、本発明の酵素とは明らかに
異なっている。 (4) 分子量の測定 同じく実施例１で得られた新規アルカリプロテアーゼ
を、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により分子量を測定したところ、約29,000であった。

【００２４】(5) 合成基質に対する各種セリンプロテア
ーゼとの活性の比較測定 本発明および各種既知のセリンプロテアーゼを用い、基
質として表１に示すＭＣＡ基質を用い、各々１％になる
ように調製し、ｐＨ10.0にて活性測定を行なった（表１
中、基質を構成するアミノ酸はアルファベット１文字略
号で示す）。Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAに対する活性を
１００とする相対活性により表示した結果を表１に示
す。各種合成基質に対する本新規アルカリプロテアーゼ
の活性は、既知のアルカリプロテアーゼに見られないユ
ニークな特異性を示している。

【００２５】

【表１】

【００２６】また、配列番号４に示すアミノ酸配列を有
する過ギ酸酸化インシュリンＢ鎖を基質として同様に本
発明および既知のセリンプロテアーゼ８種［酵素２２１
(H.Tamaki et al., Biosci. Biotech. Biochem.,56,333
-334(1992) ）、エラスターゼＹａＢ（同上）、AH101
（バチルスｓｐ．No. ＡＨ−１０１菌の耐熱性アルカリ
プロテアーゼ（同上））、ＢＹＡ（バチルスｓｐ．Ｙの
生産するアルカリ耐性プロテアーゼ（H.Shimogaki et a
l.,Agric.Biol.Chem.,55,2251-2258(1991)))、ＡＬＰＩ
（バチルスｓｐ．ＮＫＳ−２１の生産するアルカリプロ
テアーゼ（ O.Tsuchida et al., Curr. Microbiol., 1
4, 7-12(1986) ）、スブチリシンCarls-berg （上記Ta
makiらの報文）、スブチリシンＢＰＮ´（同上）、ＮＡ
Ｔ（納豆菌バチルス・ナットーの生産するセリンプロテ
アーゼ（E.Ichishima et al.,Biochim. Biophys. Acta,
869,178-184(1986)）］を用い反応させ、生成するぺプ
チドの分析により、作用結合部位を調べた結果を図５に
示す（図５中、上欄の酸化インシュリンＢ鎖のアミノ酸
は、アルファベットからなる１文字略号で示されてい
る。なお、Ｃ^＊はシステインを示す）。

【００２７】表１および図５の結果から本発明のアルカ
リプロテアーゼは既知のセリンプロテーアーゼとは異な
る基質特異性を有することが分かる。 (6) 化学物質による活性阻害 表２に記載されている濃度の各種化学物質の存在下、４
℃で２０時間インキュベートした後、合成基質Suc-Leu-
Leu-Val-Tyr-MCA （４０μＭ）を用いて蛍光分光法によ
り活性を測定した。化学物質を添加しない場合（対照
区）の阻害率を０（％）として示した結果を表２に示
す。

【００２８】

【表２】

【００２９】この結果より、本アルカリプロテアーゼは
キモスタチン、アンチパインおよびフェニルメタンスル
フォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）によりほぼ完全に阻害
され、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（Ｔ
ＰＣＫ）、エラスタチナールにより阻害されることがわ
かった。

【００３０】(7) 界面活性剤に対する安定性 本発明に係る酵素溶液に、表３に記載した界面活性剤
（１０％溶液）を各々設定濃度（0.05、0.1 、１％）に
なるように加え、６０分間、３０℃、ｐＨ10.0でインキ
ュベートした後、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA を用いて活
性測定を行なった。結果を表３に示す。

【００３１】

【表３】

【００３２】表３より、本アルカリプロテアーゼは非イ
オン性界面活性剤に対して安定であることがわかる。

【００３３】実施例３：新規アルカリプロテアーゼをコ
ードするＤＮＡの単離 バチルスｓｐ．ＴＨＳ−１００１株からのクローニング
はショットガン法を用いて行なった。すなわち、バチル
スｓｐ．ＴＨＳ−１００１株のゲノムＤＮＡを制限酵素
Ｓａｕ３ＡＩで部分消化して断片を得た。次にこれをア
ガロースゲル電気泳動にかけ、ジーンクリーン(GENECLE
AN) （Ｂｉｏ１０１社製）を用いて２〜６ｋｂのＤＮＡ
断片のみを調製した。

【００３４】ベクターとしてプラスミドｐＵＣ１１９を
用い、制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。これをフェノー
ル処理、アルカリホスファターゼ処理した後、アガロー
スゲル電気泳動し、同じくジーンクリーン(GENECLEAN)
（Ｂｉｏ１０１社製）を用いて切断断片を調製した。ゲ
ノムＤＮＡの制限酵素切断断片とベクタープラスミドと
のライゲーションを行ない、バチルスｓｐ．ＴＨＳ−１
００１株由来のゲノムＤＮＡの断片が組込まれたプラス
ミドＤＮＡを得た。

【００３５】このプラスミドＤＮＡを用い、大腸菌ＨＢ
１０１株に形質転換を行ない、アンピシリン（５０μｌ
／ｍｌ）が添加されたＬＢ−スキムミルク寒天培地で３
７℃、２４〜２８時間培養し、アンピシリン耐性の形質
転換体の中からコロニー周辺のクリアゾーン形成を指標
として目的の形質転換体を選択した。これらの形質転換
体を新たな同一プレート上で培養し、クリアゾーンを形
成させた。培地上でのクリアゾーン形成部分からパンチ
で断片を切り取り、電気泳動用のアガロースゲルにはめ
込み、そのままアガロース電気泳動にかけた。

【００３６】電気泳動終了後、基質として４０μＭの合
成基質 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAを含有する0.1 Ｍ At
kins-Pantin 緩衝液（ｐＨ10.0）を含ませたプロッティ
ングろ紙を置き、室温で１０〜３０分間反応させると、
実施例１で得られた新規アルカリプロテアーゼと等しく
トランスイルミネーター上で１１以上の等電点を有する
プロテアーゼを得、 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAの Tyr-M
CA間の結合の切断により生じた７−アミノ−４−メチル
クマリン（ＡＭＣ）の蛍光が生じるのが確認できた。こ
のプロテアーゼ生産株は、約15,000株に１株の割合で得
られた。

【００３７】実施例４：アルカリプロテアーゼのＤＮＡ
塩基配列及びアミノ酸配列の決定 実施例３で得られたアルカリプロテアーゼをコードする
遺伝子の塩基配列をサンガー法により決定し解析を行な
ったところ、配列番号１に示すようにＴＴＧより始まる
1.15ｋｂのオープンリーディングフレームを見出した。
さらに実施例１で得られた新規アルカリプロテアーゼの
Ｎ末端から１０残基をアプライドバイオシステムズ社製
４７３Ａ プロテイン・シ−ケンサ−により決定した
結果、配列番号１で示されるアミノ酸配列のはじめの１
０残基と完全に一致し、取得した遺伝子は、実施例１で
得られた新規アルカリプロテアーゼをコードするもので
あることが確認された。

【００３８】既知のプロテアーゼとの相同性を調べたと
ころ、好アルカリ性バチルスｓｐ．２２１のアルカリセ
リンプロテアーゼ（等電点：9.4 、鶴大典，微生物，
５，322 (1989)）と最も高い相同性を示すが、その相同
性は約７０％であり、本酵素が新規な酵素であることが
明かとなった。

【００３９】本酵素は 269残基のアミノ酸よりなる分子
量27,232のタンパク質で、そのＮ末端にはアスパラギン
が存し、構造的にも、従来にない新規なセリンプロテア
ーゼであることが明らかとなった。

【００４０】

【発明の効果】本発明のアルカリプロテアーゼは、新規
なアルカリプロテアーゼであり、洗浄補助剤をはじめと
する工業用酵素として有用である。また、本発明の遺伝
子は、それを導入した形質転換微生物を培養することに
より、本発明のアルカリプロテアーゼを効率良く得るこ
とができる他、タンパク質工学用試料として用いること
もできるので、産業上有用である。

【００４１】

【配列表】

【００４２】配列番号：１ 配列の長さ：１１５２ 配列の型：核酸とアミノ酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：バチルスｓｐ．ＴＨＳ−１００１（Bacillus s
p.THS-1001） 配列 TTGAAAAAGTTATTTACAAAGGTA 24 GTGGCAAGTGCCGCGTTATTATTGTCCATCTCTTTAACCGCAACATCCGTCTCAGCCGAGGAA 88 CAAAAGAAACAGTATTTAATTGGTTTTGAAAATCAACTACAAGTAACGGAATTTGTAGAAAGC 152 AGTGATAAAGGGCAAAGTGAAATGTCTCTTTTTGCTGAAGTGAATGATGAATCAATTGAAATG 216 GAACTTCTTTATGAATTCGAGGACATTCCAGTTGTATCAGTTGAATTGAGTCCAGAAGATGTA 280 AAGGACTTAGAAAAGGACCCTTCGATTACTTATATTGAGGAAGATATAGAAGTCACTATTACC 344 AAT CAA GTG ACT CCT TGG GGG ATT ACA CGT GTA CAA GCC CCT ACG GCA 392 Asn Gln Val Thr Pro Trp Gly Ile Thr Arg Val Gln Ala Pro Thr Ala 1 5 10 15 TGG ACT AGA GGA TAT ACT GGT ACG GGA GTT CGG GTA GCG GTA CTT GAT 440 Trp Thr Arg Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Val Arg Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 ACA GGG ATT TCT ACA CAT CCT GAT TTA AAT ATT CGA GGT GGA GTA AGT 488 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Val Ser 35 40 45 TTT GTT CCT GGT GAA CCA TCC TAT CAA GAT GGA AAT GGT CAT GGA ACA 536 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 CAT GTG GCA GGT ACA ATT GCT GCT TTA AAT AAT TCG ATT GGT GTT GTT 584 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Val 65 70 75 80 GGT GTA GCT CCA AAT GCG GAG CTC TAT GCC GTG AAA GTA CTA GGG GCA 632 Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 AAT GGT TCA GGC TCT GTT AGT TCA ATT GCT CAG GGA TTA CAA TGG ACA 680 Asn Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Gln Trp Thr 100 105 110 GCC CAA AAT AAT ATT CAT GTT GCT AAT TTA AGT TTA GGT AGT CCA GTA 728 Ala Gln Asn Asn Ile His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Val 115 120 125 GGA AGT CAA ACA CTA GAG TTA GCT GTT AAT CAA GCT ACA AAT GCA GGT 776 Gly Ser Gln Thr Leu Glu Leu Ala Val Asn Gln Ala Thr Asn Ala Gly 130 135 140 GTT TTA GTG GTA GCA GCA ACT GGT AAT AAT GGT TCT GGT ACA GTT TCT 824 Val Leu Val Val Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Ser 145 150 155 160 TAT CCC GCT CGT TAT GCG AAT GCT TTA GCG GTA GGT GCA ACA GAT CAA 872 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Leu Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 AAT AAT AAT CGT GCT AGC TTT TCA CAA TAT GGG ACA GGT TTA AAT ATC 920 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Leu Asn Ile 180 185 190 GTA GCT CCA GGA GTC GGA ATT CAG AGT ACG TAT CCT GGT AAC AGA TAT 968 Val Ala Pro Gly Val Gly Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Tyr 195 200 205 GCA AGT TTA AGT GGA ACA TCA ATG GCT ACT CCT CAT GTT GCT GGG GTC 1016 Ala Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val 210 215 220 GCT GCA CTC GTT AAG CAG AAG AAC CCA AGC TGG TCT AAT ACA CAA ATT 1064 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Thr Gln Ile 225 230 235 240 AGA CAA CAT CTT ACG TCT ACG GCC ACT TCA CTT GGG AAT TCA AAC CAG 1112 Arg Gln His Leu Thr Ser Thr Ala Thr Ser Leu Gly Asn Ser Asn Gln 245 250 255 TTT GGC AGT GGA CTT GTG AAT GCA GAA GCT GCA ACA AGG TAA 1152 Phe Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg * 260 265

【００４３】配列番号：２ 配列の長さ：２６９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Gln Val Thr Pro Trp Gly Ile Thr Arg Val Gln Ala Pro Thr Ala 16 Trp Thr Arg Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Val Arg Val Ala Val Leu Asp 32 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Val Ser 48 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 64 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Val 80 Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 96 Asn Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Gln Trp Thr 112 Ala Gln Asn Asn Ile His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Val 128 Gly Ser Gln Thr Leu Glu Leu Ala Val Asn Gln Ala Thr Asn Ala Gly 144 Val Leu Val Val Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Ser 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Leu Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 176 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Leu Asn Ile 192 Val Ala Pro Gly Val Gly Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Tyr 208 Ala Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val 224 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Thr Gln Ile 240 Arg Gln His Leu Thr Ser Thr Ala Thr Ser Leu Gly Asn Ser Asn Gln 256 Phe Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg * 269

【００４４】配列番号：３ 配列の長さ：８１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 AAT CAA GTG ACT CCT TGG GGG ATT ACA CGT GTA CAA GCC CCT ACG GCA 48 TGG ACT AGA GGA TAT ACT GGT ACG GGA GTT CGG GTA GCG GTA CTT GAT 96 ACA GGG ATT TCT ACA CAT CCT GAT TTA AAT ATT CGA GGT GGA GTA AGT 144 TTT GTT CCT GGT GAA CCA TCC TAT CAA GAT GGA AAT GGT CAT GGA ACA 192 CAT GTG GCA GGT ACA ATT GCT GCT TTA AAT AAT TCG ATT GGT GTT GTT 240 GGT GTA GCT CCA AAT GCG GAG CTC TAT GCC GTG AAA GTA CTA GGG GCA 288 AAT GGT TCA GGC TCT GTT AGT TCA ATT GCT CAG GGA TTA CAA TGG ACA 336 GCC CAA AAT AAT ATT CAT GTT GCT AAT TTA AGT TTA GGT AGT CCA GTA 384 GGA AGT CAA ACA CTA GAG TTA GCT GTT AAT CAA GCT ACA AAT GCA GGT 432 GTT TTA GTG GTA GCA GCA ACT GGT AAT AAT GGT TCT GGT ACA GTT TCT 480 TAT CCC GCT CGT TAT GCG AAT GCT TTA GCG GTA GGT GCA ACA GAT CAA 528 AAT AAT AAT CGT GCT AGC TTT TCA CAA TAT GGG ACA GGT TTA AAT ATC 576 GTA GCT CCA GGA GTC GGA ATT CAG AGT ACG TAT CCT GGT AAC AGA TAT 624 GCA AGT TTA AGT GGA ACA TCA ATG GCT ACT CCT CAT GTT GCT GGG GTC 672 GCT GCA CTC GTT AAG CAG AAG AAC CCA AGC TGG TCT AAT ACA CAA ATT 720 AGA CAA CAT CTT ACG TCT ACG GCC ACT TCA CTT GGG AAT TCA AAC CAG 768 TTT GGC AGT GGA CTT GTG AAT GCA GAA GCT GCA ACA AGG TAA 810

【００４５】配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 16 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala 30

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素のｐＨ安定性を示すグラフであ
る。

【図２】本発明の酵素の至適ｐＨ範囲を示すグラフであ
る。

【図３】本発明の酵素の熱安定性を示すグラフである。

【図４】本発明の酵素の至適温度範囲を示すグラフであ
る。

【図５】過ギ酸酸化インシュリンＢ鎖を基質として本発
明および既知のセリンプロテアーゼ８種を用い反応させ
たときに加水分解されるペプチド結合部位を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に配列番号２で示されるアミノ酸
   配列を有し、等電点が１１以上のアルカリプロテアー
   ゼ。
2. 【請求項２】 配列番号２で示されるアミノ酸配列を有
   するアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
3. 【請求項３】 配列番号２で示されるアミノ酸配列を有
   するアルカリプロテアーゼをコードする配列番号３で示
   される遺伝子。