JPH0771497B2 - 新規プラスミド - Google Patents
新規プラスミドInfo
- Publication number
- JPH0771497B2 JPH0771497B2 JP1049547A JP4954789A JPH0771497B2 JP H0771497 B2 JPH0771497 B2 JP H0771497B2 JP 1049547 A JP1049547 A JP 1049547A JP 4954789 A JP4954789 A JP 4954789A JP H0771497 B2 JPH0771497 B2 JP H0771497B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- gene
- amylase
- stem
- loop structure
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、宿主細胞内でα−アミラーゼを高発現させる
クローニングベクターとして有用な新規プラスミドに関
する。
クローニングベクターとして有用な新規プラスミドに関
する。
［従来の技術と発明が解決しようとする課題］ バチルス（Bacillus）属の細菌である枯草菌（Bacillus
subtilis）はα−アミラーゼ、プロテアーゼ等を菌体
外に多量に分泌生産するので、発酵や洗剤等に用いる酵
素生産菌として工業的に広く利用されている。またこの
枯草菌は、エンドトキシン等を生産せず、しかも人や動
物に病原微生物として寄生したり共生することがないの
で、大腸菌に比べて安全性が高く、遺伝子組換えの宿主
菌として大腸菌に次いで遺伝的解析が進んでいる。
subtilis）はα−アミラーゼ、プロテアーゼ等を菌体
外に多量に分泌生産するので、発酵や洗剤等に用いる酵
素生産菌として工業的に広く利用されている。またこの
枯草菌は、エンドトキシン等を生産せず、しかも人や動
物に病原微生物として寄生したり共生することがないの
で、大腸菌に比べて安全性が高く、遺伝子組換えの宿主
菌として大腸菌に次いで遺伝的解析が進んでいる。
この枯草菌の代表的な菌体外酵素であるα−アミラーゼ
は、枯草菌の場合、遺伝子の発現を制御する制御部位
が、塩基配列の違いによりamyR1、amyR2およびamyR3の
３つのタイプに分類されており、amyR2タイプの制御部
位が最も活性が高いとされている。また枯草菌の場合、
そのデンプン分解活性によりマーバーグ（Marburg）型
（以下、Ｍタイプという）とナットウ（Natto）型（以
下、Ｎタイプという）とアミロサッカリティカス型（以
下、Ｓタイプという）に分類される。
は、枯草菌の場合、遺伝子の発現を制御する制御部位
が、塩基配列の違いによりamyR1、amyR2およびamyR3の
３つのタイプに分類されており、amyR2タイプの制御部
位が最も活性が高いとされている。また枯草菌の場合、
そのデンプン分解活性によりマーバーグ（Marburg）型
（以下、Ｍタイプという）とナットウ（Natto）型（以
下、Ｎタイプという）とアミロサッカリティカス型（以
下、Ｓタイプという）に分類される。
そして、これらのα−アミラーゼのクローニグとその遺
伝的機作に関する多くの報告があり、その構造も明らか
になっている。例えばアミラーゼ遺伝子（amyR1−Ｍタ
イプ）のクローニングとシークエンスによる遺伝子構造
（Maria Yang,Nucleic Acids Research,Vol.11,Number
2,237−249（1983））や、α−アミラーゼ高発現性株B.
subtilis NA64由来のα−アミラーゼの制御遺伝子amyR2
と構造遺伝子amyEをクローニングし、更に多コピープラ
スミドpUB110に再クローニングすることが報告されてい
る（Yamazaki et al,J.Bacteriol.,156,327−337（198
3））。
伝的機作に関する多くの報告があり、その構造も明らか
になっている。例えばアミラーゼ遺伝子（amyR1−Ｍタ
イプ）のクローニングとシークエンスによる遺伝子構造
（Maria Yang,Nucleic Acids Research,Vol.11,Number
2,237−249（1983））や、α−アミラーゼ高発現性株B.
subtilis NA64由来のα−アミラーゼの制御遺伝子amyR2
と構造遺伝子amyEをクローニングし、更に多コピープラ
スミドpUB110に再クローニングすることが報告されてい
る（Yamazaki et al,J.Bacteriol.,156,327−337（198
3））。
またＭタイプとＮタイプとＳタイプα−アミラーゼとの
違いは、翻訳停止が、α−アミラーゼ遺伝子の異なる部
位で起ることに起因していると報告されている（Yamane
et al,J.Biochem.,96,1849−1858（1984））。さらに
はB.subtilis 2633のα−アミラーゼ遺伝子を大腸菌（E
scherichia coli）にクローニングし、α−アミラーゼ
遺伝子を含む組換体プラスミドpAM26をB.subtilis6160
に導入すると、amyR3タイプのプロモーターに起因し
て、α−アミラーゼが高発現することが報告されている
（Emori et al,Agric.Biol.Chem.,52（２）,399−406,1
988）。
違いは、翻訳停止が、α−アミラーゼ遺伝子の異なる部
位で起ることに起因していると報告されている（Yamane
et al,J.Biochem.,96,1849−1858（1984））。さらに
はB.subtilis 2633のα−アミラーゼ遺伝子を大腸菌（E
scherichia coli）にクローニングし、α−アミラーゼ
遺伝子を含む組換体プラスミドpAM26をB.subtilis6160
に導入すると、amyR3タイプのプロモーターに起因し
て、α−アミラーゼが高発現することが報告されている
（Emori et al,Agric.Biol.Chem.,52（２）,399−406,1
988）。
またバチルス・チューリンゲネス（B.thuringiensis）
のクリスタルプロティン（cry）遺伝子から得られたタ
ーミネーターをバチルス・リヘニホルミス（B.lichenif
ormis）由来のペニシリナーゼ遺伝子等と連結し、宿主
内での機能を検討した結果、ターミネータがmRNAの安定
性に寄与すること（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,Vol.83,3
233−3237,May（1986））や、バチルス・アミロリキフ
ァシエンス（B.amyloliquefaciens）中性プロテアーゼ
のプロモーターの下流に、ヒト成長ホルモンを連結し、
更にその下流に中性プロテアーゼ遺伝子のターミネータ
ーを連結すると、ターミネーターが存在しない場合に比
べて、その発現分泌が増大することが報告されている
（Journal of Biotechnology,8,123−134（1988））。
のクリスタルプロティン（cry）遺伝子から得られたタ
ーミネーターをバチルス・リヘニホルミス（B.lichenif
ormis）由来のペニシリナーゼ遺伝子等と連結し、宿主
内での機能を検討した結果、ターミネータがmRNAの安定
性に寄与すること（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,Vol.83,3
233−3237,May（1986））や、バチルス・アミロリキフ
ァシエンス（B.amyloliquefaciens）中性プロテアーゼ
のプロモーターの下流に、ヒト成長ホルモンを連結し、
更にその下流に中性プロテアーゼ遺伝子のターミネータ
ーを連結すると、ターミネーターが存在しない場合に比
べて、その発現分泌が増大することが報告されている
（Journal of Biotechnology,8,123−134（1988））。
しかしながら、α−アミラーゼの発現性を高めるため、
最も活性が強いとされるamyR2タイプの制御部位を有す
るα−アミラーゼ遺伝子を、枯草菌の多コピープラスミ
ドであるpUB110にクローニングしても、プラスミドのコ
ピー数が約40〜50コピー存在しているにも拘らず、α−
アミラーゼ活性は染色体供与体の約20倍程度にしかなら
ない。
最も活性が強いとされるamyR2タイプの制御部位を有す
るα−アミラーゼ遺伝子を、枯草菌の多コピープラスミ
ドであるpUB110にクローニングしても、プラスミドのコ
ピー数が約40〜50コピー存在しているにも拘らず、α−
アミラーゼ活性は染色体供与体の約20倍程度にしかなら
ない。
従って、本発明の目的は、宿主に導入し、宿主細胞内で
α−アミラーゼを効率的に多量に生産させる上で有用な
新規プラスミドを提供することにある。
α−アミラーゼを効率的に多量に生産させる上で有用な
新規プラスミドを提供することにある。
［発明の構成］ 本発明者らは、α−アミラーゼ構造遺伝子の下流に存在
するステム・アンド・ループ構造を含む特定の塩基配列
がα−アミラーゼ活性に大きく影響することを見出し、
本発明を完成した。すなわち、本発明は、枯草菌由来の
制御遺伝子amyRと、この制御遺伝子の下流側のα−アミ
ラーゼ構造遺伝子amyEと、この構造遺伝子の下流側のス
テム・アンド・ループ構造を含む塩基配列とを有する環
状プラスミドであって、ステム・アンド・ループ構造を
含む塩基配列が下記式〔Ｉ〕 （式中、矢印は、ステム・アンド・ループ構造をとりう
る部位を示す）で表される新規プラスミドにより、上記
課題を解決するものである。
するステム・アンド・ループ構造を含む特定の塩基配列
がα−アミラーゼ活性に大きく影響することを見出し、
本発明を完成した。すなわち、本発明は、枯草菌由来の
制御遺伝子amyRと、この制御遺伝子の下流側のα−アミ
ラーゼ構造遺伝子amyEと、この構造遺伝子の下流側のス
テム・アンド・ループ構造を含む塩基配列とを有する環
状プラスミドであって、ステム・アンド・ループ構造を
含む塩基配列が下記式〔Ｉ〕 （式中、矢印は、ステム・アンド・ループ構造をとりう
る部位を示す）で表される新規プラスミドにより、上記
課題を解決するものである。
また本発明はα−アミラーゼ構造遺伝子amyEの上流に
ステム・アンド・ループ構造をとりうる配列を有する枯
草菌由来の制御遺伝子amyR2または前記配列のない枯草
菌由来の制御遺伝子amyR3と、この制御遺伝子の下流
側のα−アミラーゼ構造遺伝子amyEと、この構造遺伝
子の下流側のステム・アンド・ループ構造を含む塩基配
列とを有する環状プラスミドであって、ステム・アンド
・ループ構造が、少なくとも下記式〔II〕 （式中、矢印は、ステム・アンド・ループ構造をとりう
る部位を示す）で表されるステム・アンド・ループ構造
を含む塩基配列とを有する新規プラスミドにより、上記
課題を解決するものである。なお、α−アミラーゼ活性
を高めるには、ステム・アンド・ループ構造を含む塩基
配列が式〔Ｉ〕で表される塩基配列を有するのが好まし
い。
ステム・アンド・ループ構造をとりうる配列を有する枯
草菌由来の制御遺伝子amyR2または前記配列のない枯草
菌由来の制御遺伝子amyR3と、この制御遺伝子の下流
側のα−アミラーゼ構造遺伝子amyEと、この構造遺伝
子の下流側のステム・アンド・ループ構造を含む塩基配
列とを有する環状プラスミドであって、ステム・アンド
・ループ構造が、少なくとも下記式〔II〕 （式中、矢印は、ステム・アンド・ループ構造をとりう
る部位を示す）で表されるステム・アンド・ループ構造
を含む塩基配列とを有する新規プラスミドにより、上記
課題を解決するものである。なお、α−アミラーゼ活性
を高めるには、ステム・アンド・ループ構造を含む塩基
配列が式〔Ｉ〕で表される塩基配列を有するのが好まし
い。
本明細書において、塩基配列における核酸の表示はIUPA
Cにより採択されている表示法に従うものとする。
Cにより採択されている表示法に従うものとする。
本発明のプラスミドの制御遺伝子amyRは、枯草菌に由来
する限り特に限定されず、前記amyR1タイプ、amyR2タイ
プ及びamyR3タイプのいずれであってもよい。これらの
制御遺伝子は公知の菌株に存在し、プロモータとして機
能する。上記制御遺伝子amyR1は、例えば、B.subtilis
168及びB.subtilis 6160株等に由来する。制御遺伝子am
yR2は、例えばB.natto IAM1212、B.subtilis N7、B.sub
tilis 1A412株（オハイオ大学のThe Bacillus Genetic
stock centerより入手可能である）等に由来する。また
制御遺伝子amyR3は、例えばB.subtilis 2633、B.subtil
is T2N26株（微生物工業技術研究所に微工研菌寄第3344
号、第3345号として寄託されている）等に来する。これ
らの制御遺伝子amyRのうちα−アミラーゼ活性の高い制
御遺伝子amyR2及びamyR3が好ましい。制御遺伝子amyR2
は、他の制御遺伝子amyR1およびamyR3と異なり、α−ア
ミラーゼ構造遺伝子の上流にステム・アンド・ループ構
造の下記塩基配列 （式中、矢印は、ステム・アンド・ループ構造をとりう
る部位を示す）を有する（Yamazaki et al,J.Bacterio
l.,156,327−337（1983）参照）。
する限り特に限定されず、前記amyR1タイプ、amyR2タイ
プ及びamyR3タイプのいずれであってもよい。これらの
制御遺伝子は公知の菌株に存在し、プロモータとして機
能する。上記制御遺伝子amyR1は、例えば、B.subtilis
168及びB.subtilis 6160株等に由来する。制御遺伝子am
yR2は、例えばB.natto IAM1212、B.subtilis N7、B.sub
tilis 1A412株（オハイオ大学のThe Bacillus Genetic
stock centerより入手可能である）等に由来する。また
制御遺伝子amyR3は、例えばB.subtilis 2633、B.subtil
is T2N26株（微生物工業技術研究所に微工研菌寄第3344
号、第3345号として寄託されている）等に来する。これ
らの制御遺伝子amyRのうちα−アミラーゼ活性の高い制
御遺伝子amyR2及びamyR3が好ましい。制御遺伝子amyR2
は、他の制御遺伝子amyR1およびamyR3と異なり、α−ア
ミラーゼ構造遺伝子の上流にステム・アンド・ループ構
造の下記塩基配列 （式中、矢印は、ステム・アンド・ループ構造をとりう
る部位を示す）を有する（Yamazaki et al,J.Bacterio
l.,156,327−337（1983）参照）。
前記制御遺伝子amyR1、amyR2およびamyR3の特色および
塩基配列については多くの文献に報告されており、例え
ば、制御遺伝子amyR1については文献「Nucleic Acids R
esearch」Vol.11,No.2,237−249（1983）など、制御遺
伝子amyR2については文献「Journal of Bacteriology」
Vol.156,No.1,p327−337（183）などを参照でき、制御
遺伝子amyR3については文献「Nucleic Acids Researc
h」Vol.16,No.14,7178（1988）などを参照できる。
塩基配列については多くの文献に報告されており、例え
ば、制御遺伝子amyR1については文献「Nucleic Acids R
esearch」Vol.11,No.2,237−249（1983）など、制御遺
伝子amyR2については文献「Journal of Bacteriology」
Vol.156,No.1,p327−337（183）などを参照でき、制御
遺伝子amyR3については文献「Nucleic Acids Researc
h」Vol.16,No.14,7178（1988）などを参照できる。
上記制御遺伝子の下流にはα−アミラーゼ構造遺伝子am
yEが近接して存在する。α−アミラーゼ構造遺伝子amyE
は前記Ｍタイプの構造遺伝子amyEmであってもよいが、
α−アミラーゼ活性の点で477アミノ酸からなるα−ア
ミラーゼをコードする構造遺伝子が好ましい。この477
アミノ酸からなるα−アミラーゼをコードする構造遺伝
子には、前記Ｎタイプの構造遺伝子amyEn及びＳタイプ
の構造遺伝子amyEsなどが含まれる。
yEが近接して存在する。α−アミラーゼ構造遺伝子amyE
は前記Ｍタイプの構造遺伝子amyEmであってもよいが、
α−アミラーゼ活性の点で477アミノ酸からなるα−ア
ミラーゼをコードする構造遺伝子が好ましい。この477
アミノ酸からなるα−アミラーゼをコードする構造遺伝
子には、前記Ｎタイプの構造遺伝子amyEn及びＳタイプ
の構造遺伝子amyEsなどが含まれる。
そして、α−アミラーゼ構造遺伝子amyEの下流には、前
記式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ループ構造を含
む塩基配列が存在する。このステム・アンド・ループ構
造が存在すると、α−アミラーゼ活性が著しく高まる。
記式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ループ構造を含
む塩基配列が存在する。このステム・アンド・ループ構
造が存在すると、α−アミラーゼ活性が著しく高まる。
なお、制御遺伝子がamyR2又はamyR3タイプであり、α−
アミラーゼ構造遺伝子がα−アミラーゼ構造遺伝子amy
E、特に477アミノ酸からなるα−アミラーゼをコードす
る構造遺伝子amyEn及び構造遺伝子amyEsなどである場
合、少なくとも前記式〔II〕で表されるステム・アンド
・ループ構造を有する塩基配列、特に前記式〔Ｉ〕で表
されるステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列が好
ましい。なお、このステム・アンド・ループ構造の塩基
配列はターミネーターとして機能するようである。
アミラーゼ構造遺伝子がα−アミラーゼ構造遺伝子amy
E、特に477アミノ酸からなるα−アミラーゼをコードす
る構造遺伝子amyEn及び構造遺伝子amyEsなどである場
合、少なくとも前記式〔II〕で表されるステム・アンド
・ループ構造を有する塩基配列、特に前記式〔Ｉ〕で表
されるステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列が好
ましい。なお、このステム・アンド・ループ構造の塩基
配列はターミネーターとして機能するようである。
なお、制御部位を構成する制御遺伝子amyR以外の制御遺
伝子には、アミラーゼ及びプロテアーゼの産生を同時に
制御する遺伝子pap、抗生物質ツニカマイシン（tunicam
ycin）抵抗性をコードする耐性遺伝子tmr、遺伝子sacU
やオペレーター等が含まれる。
伝子には、アミラーゼ及びプロテアーゼの産生を同時に
制御する遺伝子pap、抗生物質ツニカマイシン（tunicam
ycin）抵抗性をコードする耐性遺伝子tmr、遺伝子sacU
やオペレーター等が含まれる。
さらには、翻訳開始コドンATGの上流に、シャイン・ア
ンド・ダルガーノ（SD）塩基配列が存在していてもよ
く、制御遺伝子amyR2およびamyR3の制御部位は約−10領
域のプリブノーボックス（Pribnow box）やこれと相同
の塩基配列TAAAAT（amyR1の場合はTTAAAT）、約−35領
域やこれと相同の塩基配列TTGATAを含んでいる。また翻
訳開始コドンの下流側にはオープン・リーディング・フ
レームが存在していてもよい。
ンド・ダルガーノ（SD）塩基配列が存在していてもよ
く、制御遺伝子amyR2およびamyR3の制御部位は約−10領
域のプリブノーボックス（Pribnow box）やこれと相同
の塩基配列TAAAAT（amyR1の場合はTTAAAT）、約−35領
域やこれと相同の塩基配列TTGATAを含んでいる。また翻
訳開始コドンの下流側にはオープン・リーディング・フ
レームが存在していてもよい。
構造遺伝子amyEは翻訳終止コドンTAA、TAG、TGAに近接
している。なお、終始コドンとステム・アンド・ループ
構造との間にはスペーサが介在していてもよい。
している。なお、終始コドンとステム・アンド・ループ
構造との間にはスペーサが介在していてもよい。
第１図に本発明の新規プラスミドpMD490（1989年２月23
日付けにて微生物工業技術研究所に寄託された微工研菌
寄第10559号）の制限酵素地図、第２図に本発明の他の
新規プラスミドpTUB125の制限酵素地図を示す。なお、
これらの制限酵素地図は、ベクターとして用いたpUB110
上のEcoRIサイトを起点として示している。またEcoRIサ
イトを起点とする上記制限酵素地図において断片の分子
量は約±0.2Kbの範囲内に収まる。
日付けにて微生物工業技術研究所に寄託された微工研菌
寄第10559号）の制限酵素地図、第２図に本発明の他の
新規プラスミドpTUB125の制限酵素地図を示す。なお、
これらの制限酵素地図は、ベクターとして用いたpUB110
上のEcoRIサイトを起点として示している。またEcoRIサ
イトを起点とする上記制限酵素地図において断片の分子
量は約±0.2Kbの範囲内に収まる。
本発明の新規プラスミドは、次のような特徴を有する。
（１） アガロースゲル電気泳動法による分子量： （Ａ） プラスミドpMD490は約8.8Kb、 （Ｂ） プラスミドpTUB125は約8.1Kbの分子量を有す
る。
る。
（２） 制限酵素による切断性： （Ａ） プラスミドpMD490 ０と2.6KbにEcoRI切断部位が存在する。制限酵素EcoRI
で処理することにより、約2.6KBと約6.2Kbの２つの断片
に切断される。
で処理することにより、約2.6KBと約6.2Kbの２つの断片
に切断される。
制限酵素BclIで約2.1Kbと約6.7Kbの２つの断片に切断さ
れる。
れる。
（Ｂ） プラスミドpTUB125 ０と1.9KbにEcoRI切断部位が存在する。制限酵素EcoRI
で処理することにより、約1.9Kbと約6.2Kbの２つの断片
に切断される。
で処理することにより、約1.9Kbと約6.2Kbの２つの断片
に切断される。
（３） 薬剤耐性：いずれのプラスミドもカナマイシン
に対して抵抗性を示す。従って、本発明のプラスミドを
導入した宿主は、15μg/mlのカナマイシンを含有する培
地、例えばLB培地で生育可能である。
に対して抵抗性を示す。従って、本発明のプラスミドを
導入した宿主は、15μg/mlのカナマイシンを含有する培
地、例えばLB培地で生育可能である。
（４） コピー数： 本発明のプラスミドのコピー数はいずれも約40〜50であ
る。
る。
なお、pTUB125において翻訳終始コドンTGA以降の下流領
域のステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列は下記
式〔III〕に示される通りである。
域のステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列は下記
式〔III〕に示される通りである。
本発明の新規プラスミドを、宿主内に導入すると、染色
体中にα−アミラーゼ遺伝子を１コピー有するα−アミ
ラーゼ遺伝子供与株の100倍以上のα−アミラーゼを生
産させることができる。
体中にα−アミラーゼ遺伝子を１コピー有するα−アミ
ラーゼ遺伝子供与株の100倍以上のα−アミラーゼを生
産させることができる。
なお、pTUB125にクローニングされた断片のうち前記式
〔III〕で表されるステム・アンド・ループ構造を含む
側の末端から0.9Kb欠失させた環状プラスミド、すなわ
ち前記式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ループ構造
を含む塩基配列を有する環状プラスミドはα−アミラー
ゼ活性が高い。これに対して前記式〔III〕の下流側末
端から1.1Kb欠失させると、前記式〔Ｉ〕で表されるス
テム・アンド・ループ構造の塩基配列が欠失し、α−ア
ミラーゼ活性が著しく低下する。
〔III〕で表されるステム・アンド・ループ構造を含む
側の末端から0.9Kb欠失させた環状プラスミド、すなわ
ち前記式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ループ構造
を含む塩基配列を有する環状プラスミドはα−アミラー
ゼ活性が高い。これに対して前記式〔III〕の下流側末
端から1.1Kb欠失させると、前記式〔Ｉ〕で表されるス
テム・アンド・ループ構造の塩基配列が欠失し、α−ア
ミラーゼ活性が著しく低下する。
本発明の新規プラスミドが導入される宿主としては、菌
体外にα−アミラーゼを多量に分泌生産する枯草菌が好
ましい。
体外にα−アミラーゼを多量に分泌生産する枯草菌が好
ましい。
本発明の新規プラスミドは、従来公知のバチルス・ズブ
チリス（Bacillus subtilis）に属する菌株のうち、制
御遺伝子amyR及びα−アミラーゼ構造遺伝子amyEを有す
る菌株のDNA断片と、構造遺伝子amyE及び前記式〔Ｉ〕
又は〔II〕で表されるステム・アンド・ループ構造を含
む塩基配列を有する菌株のDNA断片とを連結することに
より調製できる。
チリス（Bacillus subtilis）に属する菌株のうち、制
御遺伝子amyR及びα−アミラーゼ構造遺伝子amyEを有す
る菌株のDNA断片と、構造遺伝子amyE及び前記式〔Ｉ〕
又は〔II〕で表されるステム・アンド・ループ構造を含
む塩基配列を有する菌株のDNA断片とを連結することに
より調製できる。
より具体的には、本発明の新規プラスミドのうち、制御
遺伝子amyR3と構造遺伝子amyEsと前記式〔Ｉ〕で表され
るステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列とを有す
るプラスミドpTUB125は、B.subtilis T2N26株（微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第3345号として寄託されて
いる）の染色体DNを多コピープラスミドに組込むことに
より調製できる。
遺伝子amyR3と構造遺伝子amyEsと前記式〔Ｉ〕で表され
るステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列とを有す
るプラスミドpTUB125は、B.subtilis T2N26株（微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第3345号として寄託されて
いる）の染色体DNを多コピープラスミドに組込むことに
より調製できる。
B.subtils T2N26株からの染色体DNAの抽出は、菌株を培
養した後、集菌し、慣用の方法、例えば、斉藤・三浦法
（H.Saito,et al.,Biochim.Biophys.Acta.,72,619（196
3））により行なうことができる。なお、抽出された染
色体DNAは、制御遺伝子amyR3と構造遺伝子amyEsと前記
式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ループ構造の塩基
配列を含んでいる。
養した後、集菌し、慣用の方法、例えば、斉藤・三浦法
（H.Saito,et al.,Biochim.Biophys.Acta.,72,619（196
3））により行なうことができる。なお、抽出された染
色体DNAは、制御遺伝子amyR3と構造遺伝子amyEsと前記
式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ループ構造の塩基
配列を含んでいる。
次いで、α−アミラーゼ染色体DNAをクローニングする
ため、上記染色体DNAを制限酵素で部分消化する。制限
酵素による部分消化は、慣用の方法で行なうことができ
る。また部分消化した染色体DNAを単離する。染色体DNA
は、有機溶媒、例えばフェノール、クロロホルム、イソ
アミルアルコールやこれらの混合溶媒で抽出し、エタノ
ール、イソプロパノール等の低級アルコールで沈澱させ
ることにより単離できる。
ため、上記染色体DNAを制限酵素で部分消化する。制限
酵素による部分消化は、慣用の方法で行なうことができ
る。また部分消化した染色体DNAを単離する。染色体DNA
は、有機溶媒、例えばフェノール、クロロホルム、イソ
アミルアルコールやこれらの混合溶媒で抽出し、エタノ
ール、イソプロパノール等の低級アルコールで沈澱させ
ることにより単離できる。
一方、クローニングベクターとして抗生物質耐性マーカ
ーを有する多コピープラスミドを用い、該クローニング
ベクターを、制限酵素で消化、分解し、単離した上記染
色体DNAをDNAリガーゼ、好ましくはT4 DNAリガーゼで連
結する。なお、クローニングベクターとしては、公知の
B.subtilis株を抗生物質を含む培地で培養し、菌体から
アルカリ法（Molecular cloning,Cold Spring Harbor L
aboratory,T.Maniatis,p90,（1982））で抽出した種々
の公知のベクターが使用できるが、例えばカナマイシン
耐性遺伝子を有するpUB110が好ましい。pUB110は、B.su
btilis IE6株（オハイオ大学のThe Bacillus Genetic s
tock centerより入手可能である）から抽出して得られ
る分子量4.5Kbの公知の多コピープラスミドであり、米
国シグマ社から販売されている。
ーを有する多コピープラスミドを用い、該クローニング
ベクターを、制限酵素で消化、分解し、単離した上記染
色体DNAをDNAリガーゼ、好ましくはT4 DNAリガーゼで連
結する。なお、クローニングベクターとしては、公知の
B.subtilis株を抗生物質を含む培地で培養し、菌体から
アルカリ法（Molecular cloning,Cold Spring Harbor L
aboratory,T.Maniatis,p90,（1982））で抽出した種々
の公知のベクターが使用できるが、例えばカナマイシン
耐性遺伝子を有するpUB110が好ましい。pUB110は、B.su
btilis IE6株（オハイオ大学のThe Bacillus Genetic s
tock centerより入手可能である）から抽出して得られ
る分子量4.5Kbの公知の多コピープラスミドであり、米
国シグマ社から販売されている。
連結したDNAを宿主に導入し、α−アミラーゼ遺伝子を
有する形質転換菌株をスクリーニングする。宿主として
はα−アミラーゼ欠損株であれば特に制限されず、例え
ば枯草菌、大腸菌、酵母などの菌株から適宜選択でき
る。上記宿主のうちB.subtilis IA289株（オハイオ大学
のThe Bacilus Genetic stock centerより入手可能であ
る）が有利である。宿主へのDNAの導入は、例えば、プ
ロトプラストトランスフォーメーション（S.Chang et a
l.,Molec.Gen.Genet.,168,111（1979））等の慣用の方
法で行なうことができる。またスクリーニングは、抗生
物質を含む培地で培養し、抗生物質に対する耐性、アミ
ラーゼ生産性Amy+を示す株をコロニーとして選択するこ
とにより行なわれる。
有する形質転換菌株をスクリーニングする。宿主として
はα−アミラーゼ欠損株であれば特に制限されず、例え
ば枯草菌、大腸菌、酵母などの菌株から適宜選択でき
る。上記宿主のうちB.subtilis IA289株（オハイオ大学
のThe Bacilus Genetic stock centerより入手可能であ
る）が有利である。宿主へのDNAの導入は、例えば、プ
ロトプラストトランスフォーメーション（S.Chang et a
l.,Molec.Gen.Genet.,168,111（1979））等の慣用の方
法で行なうことができる。またスクリーニングは、抗生
物質を含む培地で培養し、抗生物質に対する耐性、アミ
ラーゼ生産性Amy+を示す株をコロニーとして選択するこ
とにより行なわれる。
このようにして調製したプラスミドpTUB125を制限酵素E
coRIで切断した断片のうち、約6.2Kbの断片は、α−ア
ミラーゼ遺伝子の下流部分と翻訳終止部位から約1.6Kb
下流までを含む断片である。
coRIで切断した断片のうち、約6.2Kbの断片は、α−ア
ミラーゼ遺伝子の下流部分と翻訳終止部位から約1.6Kb
下流までを含む断片である。
また本発明の新規プラスミドのうち制御遺伝子amyR2と4
77アミノ酸からなるα−アミラーゼをコードする構造遺
伝子と前記式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ループ
構造とを有するプラスミドであるpMD490は、上記プラス
ミドpTUB125と、B.subtilis 1A412株（オハイオ大学のT
he Bacillus Genetic stock centerより入手可能であ
る）の染色体DNAを上記多コピープラスミドpUB110に組
込んだプラスミドpDCA100とをそれぞれ制限酵素で処理
して切断し、得られた断片を組換えてT4 DNAリガーゼで
連結することにより製造できる。
77アミノ酸からなるα−アミラーゼをコードする構造遺
伝子と前記式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ループ
構造とを有するプラスミドであるpMD490は、上記プラス
ミドpTUB125と、B.subtilis 1A412株（オハイオ大学のT
he Bacillus Genetic stock centerより入手可能であ
る）の染色体DNAを上記多コピープラスミドpUB110に組
込んだプラスミドpDCA100とをそれぞれ制限酵素で処理
して切断し、得られた断片を組換えてT4 DNAリガーゼで
連結することにより製造できる。
なお、プラスミドpDCA100は、前記B.subtilis T2N26株
に代えてB.subtilis 1A412株を用いる以外、上記プラス
ミドpTUB125の調製と同様にして調製することができ
る。なお、上記B.subtilis 1A412株から抽出された染色
体DNAは、制御遺伝子amyR2と構造遺伝子amyEmとを含ん
でいる。プラスミドpDCA100の分子量は約7.5Kbであり、
制限酵素EcoRIで約2.6Kbの断片と約4.9Kbの断片に切断
される。約2.6Kbの断片は制限遺伝子amyR2を含むα−ア
ミラーゼ遺伝子の上流部分の断片である。
に代えてB.subtilis 1A412株を用いる以外、上記プラス
ミドpTUB125の調製と同様にして調製することができ
る。なお、上記B.subtilis 1A412株から抽出された染色
体DNAは、制御遺伝子amyR2と構造遺伝子amyEmとを含ん
でいる。プラスミドpDCA100の分子量は約7.5Kbであり、
制限酵素EcoRIで約2.6Kbの断片と約4.9Kbの断片に切断
される。約2.6Kbの断片は制限遺伝子amyR2を含むα−ア
ミラーゼ遺伝子の上流部分の断片である。
そして、プラスミドpTUB125を含む株とプラスミドpDCA1
00を含む株とを培養し、プラスミドを抽出し、それぞれ
制限酵素EcoRIで切断する。次いでpTUB125の約6.2Kbの
断片とpDCA100の約2.6Kbの断片とを、分離、精製し、単
離する。
00を含む株とを培養し、プラスミドを抽出し、それぞれ
制限酵素EcoRIで切断する。次いでpTUB125の約6.2Kbの
断片とpDCA100の約2.6Kbの断片とを、分離、精製し、単
離する。
そして、上記断片をDNAリガーゼ、好ましくはT4 DNAリ
ガーゼを用いてインキュベートして連結し、α−アミラ
ーゼ欠損株である前記と同様の宿主にプロトプラストト
ランスフォーメーション法等により導入し、前記と同様
にして、抗生物質耐性及びアミラーゼ生産性Amy+を示す
株をスクリーニングすることにより、キメラ型α−アミ
ラーゼ遺伝子を含むプラスミドpMD490が得られる。
ガーゼを用いてインキュベートして連結し、α−アミラ
ーゼ欠損株である前記と同様の宿主にプロトプラストト
ランスフォーメーション法等により導入し、前記と同様
にして、抗生物質耐性及びアミラーゼ生産性Amy+を示す
株をスクリーニングすることにより、キメラ型α−アミ
ラーゼ遺伝子を含むプラスミドpMD490が得られる。
なお、制限酵素により消化及び切断された断片の分離、
精製には、従来公知の分離、精製法、例えば、塩析、溶
媒沈澱法などの溶解度差を利用する方法、透析法、限外
濾過法、ゲル濾過法、SDS−アガロースゲル電気泳動
法、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主と
して分子量差を利用する方法、電気溶出（electro elut
ion）法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電差を
利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の
親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ
ー等の疎水性差を利用する方法等や、これらを組合せた
方法が利用できる。
精製には、従来公知の分離、精製法、例えば、塩析、溶
媒沈澱法などの溶解度差を利用する方法、透析法、限外
濾過法、ゲル濾過法、SDS−アガロースゲル電気泳動
法、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主と
して分子量差を利用する方法、電気溶出（electro elut
ion）法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電差を
利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の
親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ
ー等の疎水性差を利用する方法等や、これらを組合せた
方法が利用できる。
本発明の新規プラスミドの塩基配列は、従来慣用の塩基
配列決定法、例えば、マキサム−ギルバート法（Maxam
−Gilbert,Methods Enzymol.,65,499−560（1980））、
ジデオキシ鎖終結法（Sanger et al,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA 74,5463−5467（1977））などの方法で決定する
ことができる。
配列決定法、例えば、マキサム−ギルバート法（Maxam
−Gilbert,Methods Enzymol.,65,499−560（1980））、
ジデオキシ鎖終結法（Sanger et al,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA 74,5463−5467（1977））などの方法で決定する
ことができる。
なお、上記の例ではプラスミドpTUB125及びpMD490の場
合を例にとって説明したが、制御遺伝子amyR、構造遺伝
子amyE及び前記式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ル
ープ構造を含む塩基配列に対応した遺伝子を含む菌株を
用い、上記と同様に処理することにより、種々の遺伝子
の組合せからなるプラスミドを構築できる。
合を例にとって説明したが、制御遺伝子amyR、構造遺伝
子amyE及び前記式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ル
ープ構造を含む塩基配列に対応した遺伝子を含む菌株を
用い、上記と同様に処理することにより、種々の遺伝子
の組合せからなるプラスミドを構築できる。
また前記式〔II〕で表されるステム・アンド・ループ構
造を含む塩基配列を欠失させたプラスミドは、上記のよ
うにして得られたプラスミドのうち式〔Ｉ〕で表される
ステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列の下流を制
限酵素、例えば制限酵素Hind IIIやKpn I等で切断し、
所定領域欠失させ、DNA断片を除去すると共に、従来慣
用の方法で末端を連結することにより構築できる。な
お、欠失には、例えばエキソヌクレアーゼIII、S1ヌク
レアーゼ、Bal31エキソヌクレアーゼ等が使用できる。
また制限酵素Hind IIIやKpn I等の認識部位が存在しな
い場合、例えば、上記制限酵素の認識部位を有する合成
DNAを連結し、合成DNAを制限酵素Hind III等で切断し、
上記エキソヌクレアーゼIII等で欠失させてもよい。ま
た欠失した末端を、従来慣用の方法、例えば、ヌクレア
ーゼで平滑末端化し、クレノーフラグメントで修飾し、
リガーゼで連結してもよい。
造を含む塩基配列を欠失させたプラスミドは、上記のよ
うにして得られたプラスミドのうち式〔Ｉ〕で表される
ステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列の下流を制
限酵素、例えば制限酵素Hind IIIやKpn I等で切断し、
所定領域欠失させ、DNA断片を除去すると共に、従来慣
用の方法で末端を連結することにより構築できる。な
お、欠失には、例えばエキソヌクレアーゼIII、S1ヌク
レアーゼ、Bal31エキソヌクレアーゼ等が使用できる。
また制限酵素Hind IIIやKpn I等の認識部位が存在しな
い場合、例えば、上記制限酵素の認識部位を有する合成
DNAを連結し、合成DNAを制限酵素Hind III等で切断し、
上記エキソヌクレアーゼIII等で欠失させてもよい。ま
た欠失した末端を、従来慣用の方法、例えば、ヌクレア
ーゼで平滑末端化し、クレノーフラグメントで修飾し、
リガーゼで連結してもよい。
［発明の効果］ 以上のように、本発明の新規プラスミドによれば、ステ
ム・アンド・ループ構造を含む塩基配列を有するので、
宿主に導入することにより、宿主細胞内でα−アミラー
ゼを効率よく大量に生産させることができる。
ム・アンド・ループ構造を含む塩基配列を有するので、
宿主に導入することにより、宿主細胞内でα−アミラー
ゼを効率よく大量に生産させることができる。
［実施例］ 以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明す
る。
る。
実施例１ プラスミドpTUB125の構築 （１） 染色体の抽出 B.subtilis T2N26株（微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第3345号として寄託されている）をLB培地（バクトト
リプトン（Bactotryptone）１重量％、イースト抽出物
0.5重量％、塩化ナトリウム0.5重量％含有）10mlで16時
間培養し、温度４℃、回転数3000rpmで20分間遠心分離
して集菌した。得られた菌体から前記斉藤・三浦法で染
色体DNAを抽出した。
寄第3345号として寄託されている）をLB培地（バクトト
リプトン（Bactotryptone）１重量％、イースト抽出物
0.5重量％、塩化ナトリウム0.5重量％含有）10mlで16時
間培養し、温度４℃、回転数3000rpmで20分間遠心分離
して集菌した。得られた菌体から前記斉藤・三浦法で染
色体DNAを抽出した。
（２） 制限酵素Sau3AIによる部分消化 α−アミラーゼ遺伝子をクローニングするため、得られ
た染色体DNAを制限酵素Sau3AI（TAKARA酒造（株）製）
で次のようにして部分消化した。すなわち、得られた染
色体DNA3μｇを、10mMのトリス塩酸（pH7.5）、7mMの塩
化マグネシウム、100mMの塩化ナトリウムからなる緩衝
溶液100μに懸濁し、10U（単位）の制限酵素Sau3AIを
加え、温度37℃で１〜５分間インキュベションした。次
いで試料と等量のフェノール100μを加え攪拌した
後、回転数15000rpmで５分間遠心分離し、上層を容器
（エッペルドルフチューブ）に採取し、フェノール抽出
した。上層をエタノールで沈澱させ、回転数15000rpmで
20分間遠心分離し、上清を捨て、乾固し、TE緩衝溶液
（10mMのトリス塩酸−1mMのEDTA（pH7.5））100μに
懸濁した。
た染色体DNAを制限酵素Sau3AI（TAKARA酒造（株）製）
で次のようにして部分消化した。すなわち、得られた染
色体DNA3μｇを、10mMのトリス塩酸（pH7.5）、7mMの塩
化マグネシウム、100mMの塩化ナトリウムからなる緩衝
溶液100μに懸濁し、10U（単位）の制限酵素Sau3AIを
加え、温度37℃で１〜５分間インキュベションした。次
いで試料と等量のフェノール100μを加え攪拌した
後、回転数15000rpmで５分間遠心分離し、上層を容器
（エッペルドルフチューブ）に採取し、フェノール抽出
した。上層をエタノールで沈澱させ、回転数15000rpmで
20分間遠心分離し、上清を捨て、乾固し、TE緩衝溶液
（10mMのトリス塩酸−1mMのEDTA（pH7.5））100μに
懸濁した。
（３） 枯草菌プラスミドpUB110の調製 ベクターとして用いたプラスミドpUB110の保持菌株であ
るB.subtilis IE6株はオハイオ大学のThe Bacillus Gen
etic stock centerより入手した。このB.subtilis IE6
株を、カナマイシン（Km）を終濃度15μg/となるよう
に添加した１のLB培地で、OD600nmが0.5〜0.8になる
まで培養し、得られた菌体から前記アルカリ法によりプ
ラスミドベクターpUB110を抽出した。
るB.subtilis IE6株はオハイオ大学のThe Bacillus Gen
etic stock centerより入手した。このB.subtilis IE6
株を、カナマイシン（Km）を終濃度15μg/となるよう
に添加した１のLB培地で、OD600nmが0.5〜0.8になる
まで培養し、得られた菌体から前記アルカリ法によりプ
ラスミドベクターpUB110を抽出した。
（４） ベクターDNAの制限酵素BamHIによる消化と分解 ５μｇのプラスミドベクターpUB110を、10mMのトリス塩
酸（pH8.0）、7mMの塩化マグネシウム、100mMの塩化ナ
トリウム、2mMの２−メルカプトエタノール、0.01重量
％のウシ血清アルブミンからなる緩衝溶液に懸濁した。
10U（単位）の制限酵素BamHI（TAKARA酒造（株）製）を
添加し、温度300℃で２時間反応させ、さらに1U（単
位）のアルカリフォスファターゼを加え、温度65℃で30
分間加熱した。フェノール抽出を３回行ない、エタノー
ルで沈澱させ、100μのTE緩衝溶液に懸濁し、ベクタ
ーDNAとした。
酸（pH8.0）、7mMの塩化マグネシウム、100mMの塩化ナ
トリウム、2mMの２−メルカプトエタノール、0.01重量
％のウシ血清アルブミンからなる緩衝溶液に懸濁した。
10U（単位）の制限酵素BamHI（TAKARA酒造（株）製）を
添加し、温度300℃で２時間反応させ、さらに1U（単
位）のアルカリフォスファターゼを加え、温度65℃で30
分間加熱した。フェノール抽出を３回行ない、エタノー
ルで沈澱させ、100μのTE緩衝溶液に懸濁し、ベクタ
ーDNAとした。
（５） 染色体DNA−Sau3AI部分消化物とベクターDNAと
の連結 ベクターDNA1μｇ、染色体DNA−Sau3AI部分消化物１μ
ｇを66mMのトリス塩酸（pH7.6）、6.6mMの塩化マグネシ
ウム、10mMのDTT、0.1mMのATPからなる緩衝溶液に懸濁
し、350U（単位）のT4 DNAリガーゼを添加し、温度16℃
で16時間反応させた。
の連結 ベクターDNA1μｇ、染色体DNA−Sau3AI部分消化物１μ
ｇを66mMのトリス塩酸（pH7.6）、6.6mMの塩化マグネシ
ウム、10mMのDTT、0.1mMのATPからなる緩衝溶液に懸濁
し、350U（単位）のT4 DNAリガーゼを添加し、温度16℃
で16時間反応させた。
（６） 枯草菌宿主への導入とα−アミラーゼ遺伝子の
スクリーニング 上記（５）で得たDNAをα−アミラーゼ欠損株であるB.s
ubtilis IA289株（オハイオ大学のThe Bacillus Geneti
c stock centerより入手可能である）に前記プロトプラ
ストトランスフォーメーション法により導入し、カナマ
イシン150μg/ml、可溶性デンプン１重量％を含むDM3プ
レート上で、カナマイシン耐性Kmr、アミラーゼ生産性A
my+を示す株をスクリーニングした。約5000株のKmr株か
ら１株のアミラーゼ生産株を得た。
スクリーニング 上記（５）で得たDNAをα−アミラーゼ欠損株であるB.s
ubtilis IA289株（オハイオ大学のThe Bacillus Geneti
c stock centerより入手可能である）に前記プロトプラ
ストトランスフォーメーション法により導入し、カナマ
イシン150μg/ml、可溶性デンプン１重量％を含むDM3プ
レート上で、カナマイシン耐性Kmr、アミラーゼ生産性A
my+を示す株をスクリーニングした。約5000株のKmr株か
ら１株のアミラーゼ生産株を得た。
このようにして得た株より、amyR3タイプの制御部位を
有するアミラーゼ遺伝子を含むプラスミドpTUB125を得
た。
有するアミラーゼ遺伝子を含むプラスミドpTUB125を得
た。
このプラスミドpTUB125は約3.6Kbの染色体遺伝子断片が
クローニングされており、各種制限酵素による消化及び
DNAシークエンスの結果、amyR3タイプの制限部位を有
し、477のアミノ酸からなるＳタイプのα−アミラーゼ
遺伝子の存在が確認された。プラスミドpTUB125は前記
式〔III〕で表される塩基配列を有していた。第２図に
プラスミドpTUB125の制限酵素地図を示す。
クローニングされており、各種制限酵素による消化及び
DNAシークエンスの結果、amyR3タイプの制限部位を有
し、477のアミノ酸からなるＳタイプのα−アミラーゼ
遺伝子の存在が確認された。プラスミドpTUB125は前記
式〔III〕で表される塩基配列を有していた。第２図に
プラスミドpTUB125の制限酵素地図を示す。
実施例２ プラスミドpDCA100の調製 上記実施例１のステップ（１）で用いたB.subtilis T2N
26株に代えて、B.subtilis 1A412株（オハイオ大学のTh
e Bacillus Genetic stock centerより入手可能である
を用いる以外、上記プラスミドpTUB125の調製と同様の
手順でプラスミドpDCA100を調製した。
26株に代えて、B.subtilis 1A412株（オハイオ大学のTh
e Bacillus Genetic stock centerより入手可能である
を用いる以外、上記プラスミドpTUB125の調製と同様の
手順でプラスミドpDCA100を調製した。
このプラスミドpDCA100は約3.0Kbの染色体遺伝子断片が
クローニングされており、各種制限酵素による消化及び
DNAシークエンスの結果、amyR2タイプの制御部位を有
し、561のアミノ酸からなるＭタイプのα−アミラーゼ
遺伝子の存在が確認された。第３図にプラスミドpDCA10
0の制限酵素地図を示す。
クローニングされており、各種制限酵素による消化及び
DNAシークエンスの結果、amyR2タイプの制御部位を有
し、561のアミノ酸からなるＭタイプのα−アミラーゼ
遺伝子の存在が確認された。第３図にプラスミドpDCA10
0の制限酵素地図を示す。
プラスミドpMD490の構築 （１） プラスミドpTUB125を含む株とプラスミドpDCA1
00を含む株とをそれぞれ1000ml培養し、前記アルカリ法
によりプラスミドを抽出した。
00を含む株とをそれぞれ1000ml培養し、前記アルカリ法
によりプラスミドを抽出した。
（２） 制限酵素EcoRIによる切断 10μｇのプラスミドpTUB125を、100mMのトリス塩酸（pH
7.5）、7mMの塩化マグネシウム、50mMの塩化ナトリウ
ム、7mMの２−メルカプトエタノール、0.01重量％のウ
シ血清アルブミンからなる緩衝溶液100μに懸濁し
た。次いで、50U（単位）の制限酵素EcoRI（TAKARA酒造
（株）製）を添加し、温度37℃で３時間かけて切断した
ところ、約1.9Kbの断片と約6.2Kbの断片に切断されてい
た。
7.5）、7mMの塩化マグネシウム、50mMの塩化ナトリウ
ム、7mMの２−メルカプトエタノール、0.01重量％のウ
シ血清アルブミンからなる緩衝溶液100μに懸濁し
た。次いで、50U（単位）の制限酵素EcoRI（TAKARA酒造
（株）製）を添加し、温度37℃で３時間かけて切断した
ところ、約1.9Kbの断片と約6.2Kbの断片に切断されてい
た。
上記断片のうちα−アミラーゼ構造遺伝子の下流部分
と、さらにその下流部分、すなわちステム・アンド・ル
ープ構造とを含む断片は約6.2Kbの断片であった。
と、さらにその下流部分、すなわちステム・アンド・ル
ープ構造とを含む断片は約6.2Kbの断片であった。
またプラスミドpDCA100も同様にして制限酵素EcoRIで切
断したところ、約2.6Kbの断片と、約4.9Kbの断片に切断
されていた。上記断片のうちamyR2タイプの制御部位と
α−アミラーゼ構造遺伝子の上流部分とを含む断片は、
約2.6Kbの断片であった。
断したところ、約2.6Kbの断片と、約4.9Kbの断片に切断
されていた。上記断片のうちamyR2タイプの制御部位と
α−アミラーゼ構造遺伝子の上流部分とを含む断片は、
約2.6Kbの断片であった。
そこで、0.8重量％アガロースゲル電気泳動により、上
記断片を分離し、透析膜を用いた電気溶出（electro el
ution）法により、目的とする断片を単離した。なお、
アガロースゲル電気泳動及び電気溶出は、常法に従って
行なった。
記断片を分離し、透析膜を用いた電気溶出（electro el
ution）法により、目的とする断片を単離した。なお、
アガロースゲル電気泳動及び電気溶出は、常法に従って
行なった。
次いで、pTUB125の約6.2Kbの断片とpDCA100の約2.6Kbの
断片とを、66mMのトリス塩酸（pH7.6）、6.6mMの塩化マ
グネシウム、10mMのDTT、0.1mMのATP100mlからなる緩衝
溶液に懸濁し、700U（ユニット）のT4 DNAリガーゼ（TA
KARA酒造（株）製）を添加し、温度16℃で16時間インキ
ュベートした。
断片とを、66mMのトリス塩酸（pH7.6）、6.6mMの塩化マ
グネシウム、10mMのDTT、0.1mMのATP100mlからなる緩衝
溶液に懸濁し、700U（ユニット）のT4 DNAリガーゼ（TA
KARA酒造（株）製）を添加し、温度16℃で16時間インキ
ュベートした。
得られた連結サンプルを宿主B.subtilis 1A289株に前記
プロトプラストトランスフォーメーション法により導入
し、前記と同様にして、カナマイシン耐性Kmr、アミラ
ーゼ生産性Amy+を示す株をスクリーニングし、プラスミ
ドpMD490を得た。このプラスミドpMD490は制限酵素EcoR
Iにより、約2.6Kbと約6.2Kbに切断された。プラスミドp
MD490は前記式（III）で表される塩基配列を有してい
た。第１図にプラスミドpMD490の制限酵素地図を示し、
第４図にプラスミドpDCA100とプラスミドpTUB125とから
プラスミドpMD490を構築する工程図を示す。
プロトプラストトランスフォーメーション法により導入
し、前記と同様にして、カナマイシン耐性Kmr、アミラ
ーゼ生産性Amy+を示す株をスクリーニングし、プラスミ
ドpMD490を得た。このプラスミドpMD490は制限酵素EcoR
Iにより、約2.6Kbと約6.2Kbに切断された。プラスミドp
MD490は前記式（III）で表される塩基配列を有してい
た。第１図にプラスミドpMD490の制限酵素地図を示し、
第４図にプラスミドpDCA100とプラスミドpTUB125とから
プラスミドpMD490を構築する工程図を示す。
なお、前記各実施例における制限酵素Sau3AI、BamHI、E
coRIの活性は、各酵素反応液50μ中、温度37℃、１時
間で１μｇのλDNAを完全に分解する酵素量を1Uとし
た。アルカリフォスファターゼの活性は、ｐ−ニトロフ
ェニルホスフェートを基質として、温度25℃、pH8.0に
おいて１分間に１μmoleのｐ−ニロフェノールを遊離さ
せる酵素活性を1Uとした。またT4DNAリガーゼの活性
は、６μg/20μのλDNA−Hind III分解物を、温度16
℃で30分間に90％以上連結させる酵素活性を1Uとした。
coRIの活性は、各酵素反応液50μ中、温度37℃、１時
間で１μｇのλDNAを完全に分解する酵素量を1Uとし
た。アルカリフォスファターゼの活性は、ｐ−ニトロフ
ェニルホスフェートを基質として、温度25℃、pH8.0に
おいて１分間に１μmoleのｐ−ニロフェノールを遊離さ
せる酵素活性を1Uとした。またT4DNAリガーゼの活性
は、６μg/20μのλDNA−Hind III分解物を、温度16
℃で30分間に90％以上連結させる酵素活性を1Uとした。
実施例３ 欠失変異プラスミドを導入した株の調製 ステム・アンド・ループ構造の有用性を確認するため、
実施例１で得たプラスミドpTUB125のうち前記式（III）
で表されるステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列
を次のようにして欠失させた。第５図にプラスミドpTUB
125からプラスミドpTUB125HKと欠失変異株pTUB125HKdを
構築する工程図を示す。
実施例１で得たプラスミドpTUB125のうち前記式（III）
で表されるステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列
を次のようにして欠失させた。第５図にプラスミドpTUB
125からプラスミドpTUB125HKと欠失変異株pTUB125HKdを
構築する工程図を示す。
（１） pTUB125への合成DNAの連結 先ず、pTUB125を、10mMのトリス塩酸（pH7.5）、7mMの
塩化マグネシウム、60mMの塩化ナトリウム、7mMの２−
メルカプトエタノールからなる緩衝溶液に懸濁し、プラ
スミドpTUB125のうちプラスミドpUB110に由来する切断
部位を制限酵素Sph I、Pvu IIで切断し、前記実施例１
のステップ（４）と同様にしてDNA断片を単離し、ベク
ターDNAとした。
塩化マグネシウム、60mMの塩化ナトリウム、7mMの２−
メルカプトエタノールからなる緩衝溶液に懸濁し、プラ
スミドpTUB125のうちプラスミドpUB110に由来する切断
部位を制限酵素Sph I、Pvu IIで切断し、前記実施例１
のステップ（４）と同様にしてDNA断片を単離し、ベク
ターDNAとした。
一方、制限酵素Hind III、Kpn Iの切断部位を有する合
成DNAをアプライドバイオシステムズ社のDNA合成装置
（モデル381A）を用いて合成した。この合成DNAは下記
の塩基配列を有する。
成DNAをアプライドバイオシステムズ社のDNA合成装置
（モデル381A）を用いて合成した。この合成DNAは下記
の塩基配列を有する。
次いで、上記DNA断片１μｇと合成DNA30ngとを実施例１
のステップ（５）と同様にして、350U（単位）のT4 DNA
リガーゼで連結させた。
のステップ（５）と同様にして、350U（単位）のT4 DNA
リガーゼで連結させた。
（２） 枯草菌宿主への導入とスクリーニング 前記実施例１のステップ（６）と同様にして、連結した
DNAを枯草菌B.subtilis 1A289株に導入すると共に、カ
ナマイシン耐性Kmr、アミラーゼ生産性Amy+を示す株を
スクリーニングし、プラスミドpTUB125HKを得た。な
お、得られたプラスミドpTUB125HKは、上記合成DNAのう
ち制限酵素Hind III、Kpn Iの認識部位で切断されるこ
とを予め確認した。
DNAを枯草菌B.subtilis 1A289株に導入すると共に、カ
ナマイシン耐性Kmr、アミラーゼ生産性Amy+を示す株を
スクリーニングし、プラスミドpTUB125HKを得た。な
お、得られたプラスミドpTUB125HKは、上記合成DNAのう
ち制限酵素Hind III、Kpn Iの認識部位で切断されるこ
とを予め確認した。
（３） 制限酵素Kpn I、Hind IIIによる切断 プラスミドpTUB125HK10μｍを10mMのトリス塩酸（pH7.
5）、7mMの塩化マグネシウム、7mMの２−メルカプトエ
タノール緩衝溶液100μに懸濁し、200U（単位）の制
限酵素Kpn Iを添加して、温度37℃で４時間インキュベ
ーションした。またアガロースゲル電気泳動法により分
別し、前記実施例１のステップ（２）と同様にしてフェ
ノール抽出、エタノール沈澱処理を施しTE緩衝溶液450
μに懸濁した。
5）、7mMの塩化マグネシウム、7mMの２−メルカプトエ
タノール緩衝溶液100μに懸濁し、200U（単位）の制
限酵素Kpn Iを添加して、温度37℃で４時間インキュベ
ーションした。またアガロースゲル電気泳動法により分
別し、前記実施例１のステップ（２）と同様にしてフェ
ノール抽出、エタノール沈澱処理を施しTE緩衝溶液450
μに懸濁した。
次いで、10mMのトリス塩酸（pH7.5）、7mMの塩化マグネ
シウム、60mMの塩化ナトリウムの緩衝溶液と、100U（単
位）の制限酵素Hind IIIとを加えた。また温度37℃で４
時間インキュベーションして切断した後、前記実施例１
のステップ（２）と同様にしてフェノール抽出、エタノ
ール沈澱処理を施し、50mMのトリス塩酸（pH8.0）、5mM
の塩化マグネシウム及び10mMの２−メルカプトエタノー
ルの緩衝溶液100μに懸濁した。
シウム、60mMの塩化ナトリウムの緩衝溶液と、100U（単
位）の制限酵素Hind IIIとを加えた。また温度37℃で４
時間インキュベーションして切断した後、前記実施例１
のステップ（２）と同様にしてフェノール抽出、エタノ
ール沈澱処理を施し、50mMのトリス塩酸（pH8.0）、5mM
の塩化マグネシウム及び10mMの２−メルカプトエタノー
ルの緩衝溶液100μに懸濁した。
（４） ３′末端の欠失 180U（単位）のエクソヌクレアーゼIIIを添加し、消化
処理時間１分、２分、３分、3.5分、４分、５分、5.5
分、６分、７分毎に10μサンプリングし、30mMの酢酸
ナトリウム（pH5.0）、100mMの塩化ナトリウム、1mMの
酢酸亜鉛、10％のグリセロールの緩衝溶液100μに注
入し、温度65℃で５分処理した。次いで、各試料に10U
（単位）のマングビーンヌクレアーゼ（Mung Bean Nucl
ease）を添加し、温度37℃で25分間かけて、末端平滑化
処理した後、前記実施例１のステップ（２）と同様にし
てフェノール抽出、エタノール沈澱処理を施し、洗浄し
乾固した。
処理時間１分、２分、３分、3.5分、４分、５分、5.5
分、６分、７分毎に10μサンプリングし、30mMの酢酸
ナトリウム（pH5.0）、100mMの塩化ナトリウム、1mMの
酢酸亜鉛、10％のグリセロールの緩衝溶液100μに注
入し、温度65℃で５分処理した。次いで、各試料に10U
（単位）のマングビーンヌクレアーゼ（Mung Bean Nucl
ease）を添加し、温度37℃で25分間かけて、末端平滑化
処理した後、前記実施例１のステップ（２）と同様にし
てフェノール抽出、エタノール沈澱処理を施し、洗浄し
乾固した。
各試料に、67mMのリン酸カリウム（pH7.4）、6.7mMの塩
化マグネシウム、1mMの２−メルカプトエタノール及び3
3μＭのdNTPsの緩衝溶液50μを加え、2U（単位）のク
レノーフラグメント（Klenow Fragment）を添加し、温
度37℃で10分間処理し、末端修飾した。次いで、前記と
同様にしてエタノール沈澱処理を施し、洗浄し乾固し、
TE緩衝溶液20μに懸濁させた。
化マグネシウム、1mMの２−メルカプトエタノール及び3
3μＭのdNTPsの緩衝溶液50μを加え、2U（単位）のク
レノーフラグメント（Klenow Fragment）を添加し、温
度37℃で10分間処理し、末端修飾した。次いで、前記と
同様にしてエタノール沈澱処理を施し、洗浄し乾固し、
TE緩衝溶液20μに懸濁させた。
（５） 連結 上記ステップ（４）で得られた各DNA15μに、66mMの
トリス塩酸（pH7.6）、6.6mMの塩化マグネシウム、10mM
のDTT、0.1mMのATPの緩衝溶液５μ、滅菌水25μ及
び1650U（単位）のT4 DNAリガーゼを添加し、温度16℃
で16時間インキュベーションし、末端を連結した。
トリス塩酸（pH7.6）、6.6mMの塩化マグネシウム、10mM
のDTT、0.1mMのATPの緩衝溶液５μ、滅菌水25μ及
び1650U（単位）のT4 DNAリガーゼを添加し、温度16℃
で16時間インキュベーションし、末端を連結した。
（６） 枯草菌宿主への導入とスクリーニング 前記実施例１のステップ（６）と同様にして、連結した
DNAを枯草菌B.subtilis 1A289株に導入すると共に、カ
ナマイシン耐性Kmr、アミラーゼ生産性Amy+を示す株を
スクリーニングし、欠失度の異なるプラスミドpTUB125H
Kd（ｄは欠失No.を示す）を含む菌株を得た。
DNAを枯草菌B.subtilis 1A289株に導入すると共に、カ
ナマイシン耐性Kmr、アミラーゼ生産性Amy+を示す株を
スクリーニングし、欠失度の異なるプラスミドpTUB125H
Kd（ｄは欠失No.を示す）を含む菌株を得た。
また塩基配列決定法により各プラスミドの塩基配列を決
定し、合成DNAの下流から1.1Kb欠失したプラスミド、す
なわち前記式〔Ｉ〕で表される塩基配列が欠失されてい
ないプラスミドpTUB125HK16を含む菌株、合成DNAの下流
から1.3Kb欠失したプラスミド、すなわち前記式〔Ｉ〕
で表される塩基配列が欠失したプラスミドpTUB125HK15
を含む菌株を選択した。
定し、合成DNAの下流から1.1Kb欠失したプラスミド、す
なわち前記式〔Ｉ〕で表される塩基配列が欠失されてい
ないプラスミドpTUB125HK16を含む菌株、合成DNAの下流
から1.3Kb欠失したプラスミド、すなわち前記式〔Ｉ〕
で表される塩基配列が欠失したプラスミドpTUB125HK15
を含む菌株を選択した。
α−アミラーゼ生産性 得られた５つのプラスミドpDCA100、pTUB125、pMD490、
pTUB125HK、pTUB125HK16、pTUB125HK15を含む菌株のα
−アミラーゼ生産性を次のようにして調べた。
pTUB125HK、pTUB125HK16、pTUB125HK15を含む菌株のα
−アミラーゼ生産性を次のようにして調べた。
各プラスミドを含む菌株を5mlのLB培地で12時間培養し
た後、100mlのLB培地（500ml坂口フラスコ使用）に１％
植菌し、温度37℃、回転数120rpmの条件で12時間往復振
盪培養した。次いで、1mlの培養液を15000rpmの回転数
で５分間遠心分離し、上清を酵素液とした。
た後、100mlのLB培地（500ml坂口フラスコ使用）に１％
植菌し、温度37℃、回転数120rpmの条件で12時間往復振
盪培養した。次いで、1mlの培養液を15000rpmの回転数
で５分間遠心分離し、上清を酵素液とした。
酵素液中のα−アミラーゼ活性は可溶性デンプンを基質
とし、H.Fuwa（J.Biochem.,42,583（1954）の方法に従
って測定した。なお、α−アミラーゼ活性は、１分間
に、基質としたスターチ（Starch）の１％を消化する酵
素活性を1U（単位）とした。結果を表及び第６図に示
す。
とし、H.Fuwa（J.Biochem.,42,583（1954）の方法に従
って測定した。なお、α−アミラーゼ活性は、１分間
に、基質としたスターチ（Starch）の１％を消化する酵
素活性を1U（単位）とした。結果を表及び第６図に示
す。
表より、前記式〔Ｉ〕で表されるステム・アンド・ルー
プ構造を含む塩基配列を有するプラスミドはα−アミラ
ーゼを高発現することが判明した。
プ構造を含む塩基配列を有するプラスミドはα−アミラ
ーゼを高発現することが判明した。
第１図は本発明の新規プラスミドpMD490の制限酵素地
図、 第２図に本発明の他の新規プラスミドpTUB125の制限酵
素地図、 第３図はプラスミドpDCA100の制限酵素地図、 第４図はプラスミドpDCA100とプラスミドPTUB125とから
プラスミドpMD490を構築する工程図、 第５図はプラスミドpTUB125からプラスミドpTUB125HK、
欠失変異プラスミドpTUB125HKdを構築する工程図、 第６図は各実施例におけるα−アミラーゼ生産性の結果
を示すグラフである。
図、 第２図に本発明の他の新規プラスミドpTUB125の制限酵
素地図、 第３図はプラスミドpDCA100の制限酵素地図、 第４図はプラスミドpDCA100とプラスミドPTUB125とから
プラスミドpMD490を構築する工程図、 第５図はプラスミドpTUB125からプラスミドpTUB125HK、
欠失変異プラスミドpTUB125HKdを構築する工程図、 第６図は各実施例におけるα−アミラーゼ生産性の結果
を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (3)
- 【請求項１】枯草菌由来の制御遺伝子amyRと、この制御
遺伝子の下流側のα−アミラーゼ構造遺伝子amyEと、こ
の構造遺伝子の下流側のステム・アンド・ループ構造を
含む塩基配列とを有する環状プラスミドであって、ステ
ム・アンド・ループ構造を含む塩基配列が下記式（Ｉ） （式中、矢印は、ステム・アンド・ループ構造をとりう
る部位を示す）で表されることを特徴とする新規プラス
ミド。 - 【請求項２】α−アミラーゼ構造遺伝子amyEの上流に
ステム・アンド・ループ構造をとりうる配列を有する枯
草菌由来の制御遺伝子amyR2または前記配列のない枯草
菌由来の制御遺伝子amyR3と、この制御遺伝子の下流
側のα−アミラーゼ構造遺伝子amyEと、この構造遺伝
子の下流側のステム・アンド・ループ構造を含む塩基配
列とを有する環状プラスミドであって、ステム・アンド
・ループ構造が、少なくとも下記式（II） AAAGAAACCA TCTATGATGG TTTCTTT （II） （式中、矢印は、ステム・アンド・ループ構造をとりう
る部位を示す）で表されるステム・アンド・ループ構造
を含む塩基配列を有することを特徴とする新規プラスミ
ド。 - 【請求項３】α−アミラーゼ構造遺伝子amyEの下流側の
ステム・アンド・ループ構造を含む塩基配列が式（Ｉ）
で表される塩基配列である請求項２記載の新規プラスミ
ド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1049547A JPH0771497B2 (ja) | 1989-02-28 | 1989-02-28 | 新規プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1049547A JPH0771497B2 (ja) | 1989-02-28 | 1989-02-28 | 新規プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02227083A JPH02227083A (ja) | 1990-09-10 |
| JPH0771497B2 true JPH0771497B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=12834222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1049547A Expired - Lifetime JPH0771497B2 (ja) | 1989-02-28 | 1989-02-28 | 新規プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0771497B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6118951A (en) * | 1997-01-13 | 2000-09-12 | Ricoh Company, Ltd. | Image forming apparatus and toner replenishing device therefor |
-
1989
- 1989-02-28 JP JP1049547A patent/JPH0771497B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02227083A (ja) | 1990-09-10 |
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