JPH0759576A - 発現調節ｄｎａ、該ｄｎａを含む発現ベクターおよびそれを用いたタンパク質の産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 原核細胞および真核細胞の両宿主においてプ
ロモーター活性を有する新規な発現調節ＤＮＡ、該ＤＮ
Ａを含む発現ベクターおよびそれを用いたタンパク質の
産生方法。原核細胞を宿主とした場合、酢酸またはグリ
セロール並びに乳酸によりプロモーター活性が誘導さ
れ、真核細胞を宿主をした場合、酢酸、グリセロール並
びに乳酸、エタノールまたはオレイン酸によりプロモー
ター活性が誘導される。本発明の発現調節ＤＮＡは、例
えば、カンジダ・トロピカリスのイソクエン酸リアーゼ
遺伝子の上流に存在する。 【効果】 本発明の発現調節ＤＮＡは、大腸菌等の原核
細胞および酵母等の真核細胞の両宿主において、酢酸、
グリセロール、乳酸等の低分子かつ安価な化合物の存在
下、そのプロモーター活性が誘導されることから、これ
らを宿主細胞とする発現効率のよいタンパク質の生産法
を提供することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な発現調節ＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを含む発現ベクターおよびそれを用いたタ
ンパク質の産生方法に関し、詳細には酢酸、グリセロー
ル、乳酸等の安価な化合物の存在下においてそのプロモ
ーター活性が誘導される新規な発現調節ＤＮＡ、当該Ｄ
ＮＡを含む発現ベクターおよびそれを用いたタンパク質
の産生方法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、遺伝子組換え技術を用いて産業上有用なタンパク質
を大量に発現させようという試みが盛んに行われてい
る。具体的には、目的とするタンパク質をコードする構
造遺伝子を原核細胞、真核細胞、動物細胞等の宿主細胞
に導入し、その上流に当該構造遺伝子の発現を調節する
ＤＮＡ、例えばプロモーターを存在させる。その結果、
目的とする当該タンパク質はプロモーターが機能する特
定の条件下において大量に発現されることになる。すな
わち遺伝子操作でタンパク質を経済的に生産するために
は、このプロモーターの機能を十二分に活用する必要が
ある。

【０００３】このプロモーターを効率よく機能させるた
めには、形質転換された宿主細胞の培養時にプロモータ
ーの発現誘導剤が添加される。例えば宿主細胞として大
腸菌を使用する場合、発現調節ＤＮＡとしてｌａｃプロ
モーター（ラクトースオペロンのプロモーター）等が知
られているが、このプロモーターの発現誘導剤としてＩ
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）が用いられている。また酵母を宿主細胞として使用
する場合、発現調節ＤＮＡとしてＧＡＬ系プロモーター
が知られているが、このプロモーターの発現誘導剤はガ
ラクトースである。従って遺伝子組換え技術を用いて産
業上有用なタンパク質を生産するには、プロモータおよ
びその発現誘導剤の選択が生産性に大きな影響を与える
重要な鍵となっている。

【０００４】ところで従来使用されてきたプロモーター
およびその発現誘導剤は、前述のｌａｃプロモーター−
ＩＰＴＧの組合わせに代表されるように性能としてはす
ぐれるものの、ＩＰＴＧが高価であるという問題があっ
た。よって、従来より使用されてきたプロモーターの発
現を誘導し得る安価で新しい誘導剤の開発や、安価な物
質により発現の調節を行うことができる新たなＤＮＡ
（プロモーター）の開発が望まれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、安価な物
質により発現が誘導され得る新規なＤＮＡを提供するべ
く検討を重ねてきた結果、酢酸、グリセロール等により
誘導が可能で、しかも原核細胞および真核細胞のいずれ
においてもプロモーター活性を機能し得るＤＮＡを初め
て見出し、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち本発明の要旨は、下記性質を有す
ることを特徴とする発現調節ＤＮＡ、該ＤＮＡを含む発
現ベクターおよびそれを用いたタンパク質の産生方法に
存する。 （１） 原核細胞および真核細胞の両宿主においてプロ
モーター活性を有する。 （２） 原核細胞を宿主とした場合、酢酸またはグリセ
ロール並びに乳酸によりプロモーター活性が誘導され
る。 （３） 真核細胞を宿主とした場合、酢酸、グリセロー
ル並びに乳酸、エタノールまたはオレイン酸によりプロ
モーター活性が誘導される。

【０００７】以下、本発明につき詳細に説明する。本発
明の発現調節ＤＮＡは、例えばカンジダ・トロピカリス
（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ） ｐＫ２３３
（ＡＴＣＣ ２０３３６）が有するイソクエン酸リアー
ゼ（以下、「ＩＣＬ」と略記する）をコードする遺伝子
の上流より調製することができる。

【０００８】本発明の発現調節ＤＮＡを含有するＤＮＡ
ライブラリーとしては、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐ
Ｋ２３３から調製してきた染色体ＤＮＡを用いて、常法
により作成したファージライブラリーが利用できる。こ
のＤＮＡライブラリーからファージを富沢らの方法（バ
クテリオファージの実験法，ｐ．９９−１７４，岩波書
店１９７０年５月３０日発行）により大腸菌に感染させ
培養する。培養後に形成されたプラークを、ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．，２２０，３１−３５（１９８７）に記載の
部分ＤＮＡ断片、もしくはＩＣＬタンパク質の部分アミ
ノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡをプローブ
として、Ｂｅｎｔｏｎらのプラークハイブリダイゼーシ
ョン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６，１８０−１８２（１
９７７））によって選択し、目的とするＤＮＡを含むＤ
ＮＡフラグメントを得ることができる。

【０００９】さらに上記のスクリーニング陽性のファー
ジから富沢らの方法によりファージを増殖させ、Ｔ．Ｍ
ａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．８５，１９８２）によりＤＮ
Ａを調製し、適当な制限酵素で切断後、ｐＵＣ１９（Ｇ
ｅｎｅ，３３，１０３−１１９（１９８５））等のプラ
スミドにクローニングし、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ
法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
７４，５４６３（１９７７））によって目的とするＤＮ
Ａを含むＤＮＡフラグメントの塩基配列が決定できる。
このようにして決定されるＤＮＡフラグメントの塩基配
列は、ＩＣＬタンパク質の全コーディング領域およびそ
の上流域を含むものである。

【００１０】本発明の発現調節ＤＮＡは、例えば以下の
ようにして決定することができる。すなわち、上述した
ＩＣＬタンパク質の全コーディング領域およびその上流
域を含むクローンを用いて、ＩＣＬタンパク質をコード
する遺伝子の上流域の５’側から種々の長さに調製した
欠失クローンを、ｋｉｌｏ−Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｋｉｔ
（宝酒造社製）、ポリメラーゼチェインリアクション法
（以下、「Ｐ．Ｃ．Ｒ．法」と略記する：Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２３９，４８７−４９１（１９８３））等によって
作製する。これらのＤＮＡをｐＵＣ１９、ｐＭＴ３４
（−Ｇ７）（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６，２４
６−２５６（１９８６）に記載のプラスミドｐＭＴ３４
をＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩと反応させて、ＧＡＬ７
プロモーターを除いたもの）等にクローニングし、この
プラスミドをＨａｎａｈａｎの方法（ＤＮＡ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ｖｏｌ．１，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，ｐ１０９−
１３６（１９８５））により大腸菌等の原核細胞へ、ま
たはＨｉｎｎｅｎらのプロトプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９
（１９７８））により酵母等の真核細胞へ形質転換す
る。

【００１１】続いて例えば大腸菌を用いた場合、得られ
た形質転換体をグルコースを含むＬＢ培地で培養し、適
当な時期に酢酸ナトリウムを加えＩＣＬタンパク質を誘
導させ、さらに培養を続ける。この菌体を用いて、Ａｇ
ｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４１（２），２７５−
２７９（１９７７））に詳述されるようにフェニルヒド
ラジン−塩酸から生成されたグリオキシレイト−フェニ
ルヒドラゾンが有する３２４ｎｍの吸収を測定すること
により、ＩＣＬタンパク質の発現量を測定し、これから
本発明の発現調節ＤＮＡ部位を決定することができる。

【００１２】また酵母を用いた場合、Ｓ系（０．６７％
Ｂａｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓ
ｅ ｗ／ｏ Ａ．Ａ．，２０ｍｇ／ｌ Ａｄｅｎｉｎ
Ｓｕｌｆａｔｅ，２０ｍｇ／ｌ Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｅ−
ＨＣｌ，２０ｍｇ／ｌ Ｌ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，３
０ｍｇ／ｌ Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅ）＋グルコースで前培
養し、Ｓ系＋酢酸ナトリウムあるいは他の誘導剤で本培
養を行い、ＩＣＬタンパク質を誘導させる。その後上記
の大腸菌の例と同様に、フェニルヒドラジン−塩酸から
生成されたグリオキシレイト−フェニルヒドラゾンが有
する３２４ｎｍの吸収を測定することにより、ＩＣＬタ
ンパク質の発現量、ひいては本発明の発現調節ＤＮＡを
決定することができる。またこのＩＣＬタンパク質を用
いて、常法によりウサギ血清より得たＩＣＬタンパク質
抗体でウエスタンブロットによっても発現タンパクを確
認することができる。

【００１３】本発明の発現調節ＤＮＡが、原核細胞およ
び真核細胞の両宿主でプロモーター活性を有し、タンパ
ク質を産生できることは、例えば以下のようにして確認
することができる。すなわち、本発明の発現調節ＤＮＡ
の下流にＩＣＬタンパク質をコードする遺伝子が連結さ
れたフラグメントを、ｐＭＴ３４（−Ｇ７）ベクター等
に挿入する。このベクター用いて、常法に従い大腸菌等
の原核細胞および酵母等の真核細胞の両宿主に形質転換
を行う。上述したようにＩＣＬタンパク質を誘導させ、
フェニルヒドラジン−塩酸からグリオキシレイト−フェ
ニルヒドラゾンを形成させる能力を測定し、ＩＣＬタン
パク質の発現を確認することにより、原核細胞および真
核細胞の両宿主でプロモーター活性を有するか否かが確
認できる。

【００１４】また本発明の発現調節ＤＮＡは、公知のプ
ロモーター、例えばｌａｃプロモーター等と組み合わせ
ることにより、融合発現調節ＤＮＡとして用いることも
できる。例えば、本発明の発現調節ＤＮＡの下流にＩＣ
Ｌタンパク質をコードする遺伝子が連結されたフラグメ
ントをｐＵＣ１９ベクターのｌａｃプロモーターの下
流、具体的にはＢａｍＨＩサイト等に挿入する。このベ
クターを用いて、常法に従い大腸菌を形質転換する。上
記と同様にＩＣＬタンパク質を誘導させ、フェニルヒド
ラジン−塩酸からのグリオキシレイト−フェニルヒドラ
ゾン形成能を測定してＩＣＬタンパク質の発現を確認す
ることにより、融合発現調節ＤＮＡの大腸菌でのプロモ
ーター活性を測定することができる。

【００１５】さらに本発明の発現調節ＤＮＡを用いるこ
とにより、タンパク質を遺伝子組換え法により効率よく
生産することができる。すなわち、本発明の発現調節Ｄ
ＮＡ、タンパク質をコードする構造遺伝子、転写終結配
列、およびプロモーター活性を制御する遺伝子よりなる
発現ベクターを構築する。これを、常法に従って大腸菌
等の原核細胞および／または酵母等の真核細胞に導入す
る。かかる形質転換体をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）に記載の方法あるいはそ
れに準じて培養する。このときプロモーター活性を誘導
する目的で、培養時に発現誘導剤を添加してもよい。か
かる発現誘導剤としては、原核細胞を宿主とする場合は
酢酸、またはグリセロールと乳酸との併用が好適で、真
核細胞を宿主とする場合は酢酸、グリセロールと乳酸と
の併用、エタノールまたはオレイン酸が好適に使用され
る。目的とするタンパク質は、常法により宿主細胞から
単離・精製される。

【００１６】

【発明の効果】本発明の発現調節ＤＮＡは、大腸菌等の
原核細胞および酵母等の真核細胞の両宿主において、酢
酸、グリセロール、乳酸等の低分子かつ安価な化合物の
存在下、そのプロモーター活性が誘導されることから、
これらを宿主細胞とする発現効率のよいタンパク質の生
産法を提供することができる。

【００１７】

【実施例】以下、本発明につき実施例を挙げてより具体
的に説明するが、その要旨を越えない限り以下に限定さ
れるものではない。 実施例１ カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ｐＫ２３３の遺伝子ライブラリ
ーの調製Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐＫ２３３のゲノミックＤ
ＮＡライブラリーは、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７，
２６２−２６６（１９９０）およびＦＥＢＳＬｅｔ
ｔ．，２２０，３１−３５（１９８７）に記載の方法に
従って調製した。

【００１８】このゲノミックＤＮＡライブラリーは、Ｉ
ＣＬタンパク質の部分アミノ酸配列から推定されるＤＮ
Ａ断片を用いてスクリーニングされた。陽性クローンの
中で約１６ｋｂの挿入断片を有するクローン（λＣＴ−
ＩＣＬ）を選び出し、常法に従い約２ｋｂのＢａｍＨＩ
−ＢａｍＨＩフラグメントを得た。このフラグメントが
ＩＣＬタンパク質をコードする部分ＤＮＡ断片とハイブ
リダイズすることから、かかるフラグメント内にＩＣＬ
タンパク質をコードするＤＮＡが含まれていることが確
認された。かかるＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメント
の塩基配列を常法により決定した（配列表の配列番号
１）。

【００１９】実施例２ 発現調節ＤＮＡ部位の測定 実施例１で作製したＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメン
トを、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩサイトに組み込み、ＩＣ
Ｌタンパク質をコードする遺伝子とその上流を含むクロ
ーン（以下、「ｐＵＣ１９−ＩＣＬ」と略記する）を得
た。以下の実施例ではこのクローンを使い、ｋｉｌｏ−
Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）およびＰ．
Ｃ．Ｒ．法を用いた。

【００２０】すなわちｋｉｌｏ−Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｋ
ｉｔを用いる場合、ｐＵＣ１９−ＩＣＬ ３μｇを制限
酵素ＰｓｔＩおよびＳａｌＩで切断した。反応液をフェ
ノール：クロロホルム＝１：１溶液で抽出し、続いてク
ロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１溶液で更
に抽出した（以下、この操作を「フェノール抽出」と略
記する）。この抽出液に終濃度が０．３Ｍとなるように
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加え、更に２．５倍量
のエタノールを加えて−２０℃で１時間以上冷却した
後、１５０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心し、沈殿させた。上
清を除き、７０％エタノールを加えて攪拌した後、再度
１５０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心し、沈殿させた（以下、
この操作を「エタノール沈殿」と略記する）。この沈殿
を乾燥後、２０μｌの滅菌イオン水に溶解した。この切
断したプラスミドにｋｉｌｏ−Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｋｉ
ｔを使用説明書に従い用いて、種々の長さのＤＮＡ断片
を有するＤｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔを得た。

【００２１】これらを常法に従い宿主大腸菌に形質転換
し、得られたコロニーからプラスミドを常法（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．８６，１
９８２）に従い調製した。これらを制限酵素ＳｐｈＩで
切断し、得られた反応液をフェノール抽出、エタノール
沈殿処理した。得られた沈殿を１６μｌの滅菌イオン水
に溶解し、１０倍濃度のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液
（０．０３Ｍ トリス−酢酸（ｐＨ７．９），０．６６
Ｍ 酢酸カリウム，０．１Ｍ 酢酸マグネシウム，５ｍ
Ｍ ＤＴＴ）２μｌ、１．２５ｍＭ ４ｄＮＴＰ １μ
ｌ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ １μｌ（６ユニット）を
加えて２０μｌの系とし、３７℃で３０分間反応させ、
２本鎖の平滑末端ＤＮＡを得た（以下、この処理を「Ｂ
ｌｕｎｔｉｎｇ処理」と略記する）。この反応液をフェ
ノール抽出、エタノール沈殿処理した。この沈殿を乾燥
後、２０μｌの滅菌イオン水に溶解し、ＳａｌＩリンカ
ーＤＮＡとライゲーションキット（宝酒造社製）を使用
説明書に従って連結した。得られたベクターをユニバー
サルプライマーとリバースプライマー（ともにファルマ
シア社製）を用いて、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ法
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７
４，５４６３（１９７７））によりその塩基配列を決定
した。配列の決定後、ＳａｌＩおよびＳｍａＩで切断
し、得られた反応液をフェノール抽出、エタノール沈殿
処理した。得られた沈殿を１０μｌの滅菌イオン水に溶
解し、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、目
的とするバンドを常法に従って切り出してＤＮＡフラグ
メントを回収し、エタノール沈殿処理した。このＤＮＡ
フラグメントを大腸菌−酵母間のシャトルベクターであ
るｐＭＴ３４（−Ｇ７）のＳａｌＩおよびＰｖｕＩＩサ
イトにライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて組
み込んだ。

【００２２】Ｐ．Ｃ．Ｒ．法は、パーキンエルマーシー
タス ＤＮＡサーマルサイクラーを使用して、その使用
説明書に基づき、ジーンアンプキットを使って行った。
すなわち基質ＤＮＡ ｐＵＣ１９−ＩＣＬを１μｌ
（０．５μｇ相当量）、１０倍濃度の反応緩衝液（５０
０ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．３），１５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，０．１％（ｗ／ｖ）
ゼラチン）１０μｌ、１．２５ｍＭ ４ｄＮＴＰ １
６μｌ、５０μＭ Ｍ１３プライマーＭ３（宝酒造社
製）、種々の長さのＤＮＡ断片を得るためにＳａｌＩサ
イトを導入したプライマー（配列表の配列番号１４〜２
０）各５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ ０．５μｌを加え
て１００μｌの系とする。反応は９４℃で２分間（変性
ステップ）、５５℃で２分間（アニーリングステッ
プ）、７２℃で２分３０秒間（伸長ステップ）のインキ
ュベーションを２５サイクル行った。得られた反応液を
フェノール抽出、エタノール沈殿処理した。得られた沈
殿を１６μｌの滅菌イオン水に溶解した。ＳａｌＩで切
断し、得られた反応液をフェノール抽出、エタノール沈
殿処理した。得られた沈殿を１０μｌの滅菌イオン水に
溶解し、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、
目的とするバンドを常法に従って切り出してＤＮＡフラ
グメントを回収し、エタノール沈殿処理した。このＤＮ
ＡフラグメントをベクターｐＵＣ１９のＳａｌＩおよび
ＳｍａＩサイトに、またベクターｐＭＴ３４（−Ｇ７）
のＰｖｕＩＩおよびＳａｌＩサイトにライゲーションキ
ット（宝酒造社製）を用いて組み込んだ。

【００２３】以上の操作により、配列表の配列番号２〜
１３に示す種々の長さの発現調節ＤＮＡ、およびそれと
ＩＣＬタンパク質の全コーディング領域とが連結されて
いるベクターｐＵＣ１９、ベクターｐＭＴ３４（−Ｇ
７）を得た。かくして得たベクターを、常法に従い大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）および酵母
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）に形質転換した。大腸菌の場合、ＬＢ培地（０．５
％ 酵母抽出物，１％ バクトトリプトン，０．５％塩
化ナトリウム）＋１％ グルコース ３ｍｌで前培養
し、ＬＢ培地＋１．３７％ 酢酸ナトリウム ８ｍｌに
前培養液８０μｌを添加し、本培養を行った。酢酸によ
り誘導をかけ、ＩＣＬタンパク質を発現させた。本培養
を一晩行い、培養液を３０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間遠
心分離し、菌体を回収した。これらを滅菌イオン水で２
回洗い、０．０５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ７．５）緩
衝液に溶かし、１ｍｌ当たり乾燥重量２０ｍｇとなるよ
うにした。懸濁液を４℃下、２０ｋｉｌｏｃｙｃｌｅ／
ｓｅｃで２０秒間ソニケイションした。その後１０００
０ｇで２０分間遠心分離し、その上清を酵素画分として
用いた。酵母の場合、Ｓ系（０．６７％ Ｂａｃｔｏ−
Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏＡ．
Ａ．，２０ｍｇ／ｌ Ａｄｅｎｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ，
２０ｍｇ／ｌ Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｅ−ＨＣｌ，２０ｍｇ
／ｌ Ｌ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，３０ｍｇ／ｌ Ｌ−
Ｌｅｕｃｉｎｅ）＋２％ グルコースで前培養し、Ｓ系
＋１．３７％ 酢酸ナトリウム ８ｍｌに前培養液８０
μｌを添加し、本培養を行った。その後の操作は大腸菌
を培養した際と同様に行った。

【００２４】ＩＣＬタンパク質の活性の測定は、以下の
溶液のもとで行った。すなわち、１００μＭ リン酸カ
リウム（ｐＨ７．０）、７．５μＭ 塩化マグネシウ
ム、５μＭ フェニルヒドラジン−塩酸、３μＭ シス
テイン−塩酸、１２．５μＭｓｏｄｉｕｍ Ｄ，Ｌ−ｉ
ｓｏｃｉｔｒａｔｅ、これに調製した酵素画分を加え、
１．５ｍｌとした。生成されたグリオキシレイト−フェ
ニルヒドラゾンが持つ３２４ｎｍの吸収を測定すること
により、ＩＣＬタンパク質の活性、すなわちタンパクの
発現量を測定した。結果を表１に示す。

【００２５】またこのＩＣＬタンパク質を用いて常法に
よりウサギ血清より得たＩＣＬタンパク質抗体でウエス
タンブロッティングを行ったところ、ＩＣＬタンパク質
の発現が確認された。大腸菌における発現は、ウエスタ
ンブロッティングにより確認した。

【００２６】

【表１】 ──────────────────────────────── 配列表の配列番号 ＩＣＬタンパク質の産生量 （配列の長さ） （ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ） ──────────────────────────────── ２（１５３０） ５５ ３（ ７２８） ６ ４（ ６３１） ３．８ ５（ ５４６） ８．７ ６（ ４４２） ８．５ ７（ ４２２） ６．２ ８（ ３９１） ５ ９（ ３５５） ７．６ １０（ ３２７） ４．５ １１（ １５６） ３．６ １２（ １１８） ２．１ １３（ ６９） ８．１ 参考（ ０） １．５ ────────────────────────────────

【００２７】実施例３ 発現誘導剤の検討 配列表の配列番号２〜１３に示す本発明の発現調節ＤＮ
Ａ、およびその下流にＩＣＬタンパク質をコードする遺
伝子が連結されたＤＮＡフラグメントを有するベクター
ｐＭＴ３４（−Ｇ７）を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）および酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の両宿主
細胞を形質転換し、実施例２と同様にしてＩＣＬタンパ
ク質を発現させた。このとき、大腸菌においては酢酸ナ
トリウム、グリセロールと乳酸で誘導をかけ、酵母にお
いては酢酸ナトリウム、グリセロールと乳酸、エタノー
ルおよびオレイン酸で誘導をかけて発現させた。発現さ
れたＩＣＬタンパク質は、実施例２と同様に確認し、活
性を測定した。結果を表２に示す。なお、大腸菌での発
現およびオレイン酸による酵母での発現は、ウエスタン
ブロッティングにより確認した。

【００２８】

【表２】 ──────────────────────────────────── 配列番号 ＩＣＬタンパク質の産生量（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ） 酢酸ナトリウム グリセロール＋乳酸 エタノール ──────────────────────────────────── ２ ２９００ ４２００ ４８００ ３ ２０００ ４ ３１００ ５ ２５００ ６ ５６００ ７ ４１００ ２３００ ８ ４２００ １４００ ９ ３８０ １１０ １０ ２４０ １１ １９０ １２ ２６０ １３ ２３０ ────────────────────────────────────

【００２９】 実施例４ ｌａｃプロモーターとの融合発現調節ＤＮＡ 配列表の配列番号２〜１３に示す本発明の発現調節ＤＮ
Ａ、およびその下流にＩＣＬタンパク質をコードする遺
伝子が連結されたＤＮＡフラグメントを有するベクター
ｐＵＣ１９を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転
換し、これを培養してＩＣＬタンパク質を発現させた。
なお発現誘導剤として、酢酸ナトリウムを使用した。発
現されたＩＣＬタンパク質は、実施例２と同様に確認
し、活性を測定した。結果を表３に示す。なお「参考」
とあるのは、本発明の発現調節ＤＮＡを持たないもの、
すなわちｌａｃプロモーターのみを有するものである。

【００３０】

【表３】 ─────────────────────────────────── 配列番号 ＩＣＬタンパク質の産生量（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ） 誘導なし 酢酸ナトリウム ─────────────────────────────────── ２ ０．７１ ９００ ３ ４９ ６２０ ４ ２７ １１０ ５ ４５ １７０ ６ ２８ １８００ ７ ２７ １１００ ８ ４２ １２００ ９ ４５ １３００ １０ ５７ ２１００ １２ ４７ ２４００ １３ ５９ １０００ 参考 ０．６９ ───────────────────────────────────

【００３１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３５０８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐＫ
２３３ 配列 GGATCCGTCT GAAGAAATCA AGAACCAACA GTTGGATATC ATCAAGGGAA TATTAGGCGA 60 AGAGGCATCT AGTAGTAGTG GCAGTGGTGA GAACGTGGGC GCTGCTATAG TGAACAATCT 120 CCAGTCGATG GTTAAGAAGA AGAGTGACAA ACCAGCAGTG AATGACTTGT CTGGGTCCGT 180 GAGGAAAAGA AAGAAGCCCG ACACAAAGGA CAGTAACGTC AAGAAACCCA AGAAATAGGG 240 GGGACCTGTT TAGATGTATA GGAATAAAAA CTCCGAGATG ATCTCAATGT GTAATGGAGT 300 TGTAATATTG CAAAGGGGGA AAATCAAGAC TCAAACGTGT GTATGAGTGA GCGTACGTAT 360 ATCTCCGAGA GTAGTATGAC ATAATGATGA CTGTGAATCA TCGTAATCTC ACACAAAAAC 420 CCCATTGTCG GCCATATACC ACACCAAGCA ACACCACATA TCCCCCGGAA AAAAAAACGT 480 GAAAAAAAGA AACAATCAAA ACTACAACCT ACTCCTTGAT CACACAGTCA TTGATCAAGT 540 TACAGTTCCT GCTAGGGAAT GACCAAGGTA CAAATCAGCA CCTTAATGGT TAGCACGCTC 600 TCTTACTCTC TCTCACAGTC TTCCGGCCCC TATTCAAAAT TCTGCACTTC CATTTGACCC 660 CAGGGTTGGG AAACAGGGCC ACAAAAGAAA AACCCGACGT GAATGAAAAA ACTAAGAAAA 720 GAAAAAAAAT TATCACACCA GAAATTTACC TAATTGGGTA ATTCCCATCG GTGTTTTTCC 780 TGGATTGTCG CACGCACGCA TGCTGAAAAA AGTGTTCGAG TTTTGCTTTT GCCTCGGAGT 840 TTCACGCAAG TTTTTCGATC TCGGAACCGG AGGGCGGTCG CCTTGTTGTT TGTGATGTCG 900 TGCTTTGGGT GTTCTAATGT GCTGTTATTG TGCTCTTTTT TTTTCTTCTT TTTTTGGTGA 960 TCATATGATA TTGCTCGGTA GATTACTTTC GTGTGTAGGT ATTCTTTTAG ACGTTTGGTT 1020 ATTGGGTAGA TATGAGAGAG AGAGAGTGGG TGGGGGAGGA GTTGGTTGTA GGAGGGACCC 1080 CTGGGAGGAA GTGTAGTTGA GTTTTCCCTG ACGAATGAAA ATACGTTTTT GAGAAGATAA 1140 TACAGGAAAG GTGTGTCGGT GAATTTCCAT CTATCCGAGG ATATGAGTGG AGGAGAGTCG 1200 TGTGCGTGTG GTTAATTTAG GATCAGTGGA ACACACAAAG TAACTAAGAC AGAGAGACAG 1260 AGAGAAAAAT CTGGGGAAGA GACAAAGAGT CAGAGTGTGT GAGTTATTCT GTATTGTGAA 1320 ATTTTTTTGC CCAACTACAT AATATTGCTG AAACTAATTT TACTTAAAAA GAAAAGCCAA 1380 CAACGTCCCC AGTAAAACTT TTCTATAAAT ATCAGCAGTT TTCCCTTTCC TCCATTCCTC 1440 TTCTTGTCTT TTTTCTTACT TTCCCTTTTT TATACCTTTT CATTATCATC CTTTATAATT 1500 GTCTAACCAA CAACTATATA TCTATCAACC ATG GCT TAC ACA AAG ATC GAC ATC 1554 Met Ala Tyr Thr Lys Ile Asp Ile 1 5 AAC CAA GAA GAA GCT GAC TTC CAA AAA GAA GTT GCT GAA ATC AAA AAA 1602 Asn Gln Glu Glu Ala Asp Phe Gln Lys Glu Val Ala Glu Ile Lys Lys 10 15 20 TGG TGG TCC GAA CCA AGA TGG AGA AAG ACC AAG AGA ATC TAT TCC GCT 1650 Trp Trp Ser Glu Pro Arg Trp Arg Lys Thr Lys Arg Ile Tyr Ser Ala 25 30 35 40 GAA GAC ATC GCT AAG AAG AGA GGT ACC TTG AAG ATT GCC TAC CCA TCT 1698 Glu Asp Ile Ala Lys Lys Arg Gly Thr Leu Lys Ile Ala Tyr Pro Ser 45 50 55 TCT CAA CAA TCC GAC AAA TTG TTC AAG TTG TTG GAA AAG CAC GAC GCT 1746 Ser Gln Gln Ser Asp Lys Leu Phe Lys Leu Leu Glu Lys His Asp Ala 60 65 70 GAA AAG TCT GTC TCC TTC ACC TTT GGT GCT TTG GAC CCA ATC CAC GTT 1796 Glu Lys Ser Val Ser Phe Thr Phe Gly Ala Leu Asp Pro Ile His Val 75 80 85 GCT CAA ATG GCC AAG TAC TTG GAC TCC ATC TAC GTT TCC GGA TGG CAA 1842 Ala Gln Met Ala Lys Tyr Leu Asp Ser Ile Tyr Val Ser Gly Trp Gln 90 95 100 TGT TCC TCC ACC GCT TCC ACT TCT AAC GAA CCA TCC CCA GAT TTG GCC 1890 Cys Ser Ser Thr Ala Ser Thr Ser Asn Glu Pro Ser Pro Asp Leu Ala 105 110 115 120 GAC TAC CCT ATG GAC ACC GTT CCA AAC AAG GTC GAA CAC TTG TGG TTT 1938 Asp Tyr Pro Met Asp Thr Val Pro Asn Lys Val Glu His Leu Trp Phe 125 130 135 GCT CAG TTG TTC CAC GAC AGA AAG CAA AGA GAA GAA AGA TTG AAC ATG 1986 Ala Gln Leu Phe His Asp Arg Lys Gln Arg Glu Glu Arg Leu Asn Met 140 145 150 ACC AAG GAA GAA AGA GCA AAC ACC CCA TAC ATT GAC TTT TTG AGA CCC 2034 Thr Lys Glu Glu Arg Ala Asn Thr Pro Tyr Ile Asp Phe Leu Arg Pro 155 160 165 ATC ATT GCT GAT GCC GAC ACT GGT CAC GGT GGT ATC ACC GCC ATT ATC 2082 Ile Ile Ala Asp Ala Asp Thr Gly His Gly Gly Ile Thr Ala Ile Ile 170 175 180 AAG TTG ACC AAG TTG TTC ATC GAA AGA GGT GCT GCT GGT ATC CAC ATT 2130 Lys Leu Thr Lys Leu Phe Ile Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile His Ile 185 190 195 200 GAA GAT CAA GCT CCA GGT ACC AAG AAG TGT GGT CAC ATG GCC GGT AAG 2178 Glu Asp Gln Ala Pro Gly Thr Lys Lys Cys Gly His Met Ala Gly Lys 205 210 215 GTC TTG GTT CCA GTC CAA GAA CAC ATC AAC AGA TTG GTT GCC ATC AGA 2226 Val Leu Val Pro Val Gln Glu His Ile Asn Arg Leu Val Ala Ile Arg 220 225 230 GCT TCT GCT GAT ATC TTT GGT TCC AAC TTG TTG GCT GTT GCC AGA ACT 2274 Ala Ser Ala Asp Ile Phe Gly Ser Asn Leu Leu Ala Val Ala Arg Thr 235 240 245 GAT TCT GAA GCT GCT ACT TTG ATC ACC TCC ACC ATT GAC CAC AGA GAC 2322 Asp Ser Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr Ser Thr Ile Asp His Arg Asp 250 255 260 CAT TAC TTT ATC ATT GGT GCC ACC AAC CCA GAA TCC GGC GAC TTG GCT 2370 His Tyr Phe Ile Ile Gly Ala Thr Asn Pro Glu Ser Gly Asp Leu Ala 265 270 275 280 GCC TTG ATG GCT GAA GCT GAA GCT AAG GGT ATC TAC GGT GAC GAA TTG 2418 Ala Leu Met Ala Glu Ala Glu Ala Lys Gly Ile Tyr Gly Asp Glu Leu 285 290 295 GCC CGT ATT GAA ACC GAA TGG ACC AAG AAA GCT GGC TTG AAA TTG TTC 2466 Ala Arg Ile Glu Thr Glu Trp Thr Lys Lys Ala Gly Leu Lys Leu Phe 300 305 310 CAC GAA GCC GTC ATC GAC GAA ATC AAG GCC GGT AAC TAC TCC AAC AAG 2514 His Glu Ala Val Ile Asp Glu Ile Lys Ala Gly Asn Tyr Ser Asn Lys 315 320 325 GAA GCT TTG ATC AAG AAG TTC ACC GAC AAG GTT AAC CCA TTG TCC CAC 2564 Glu Ala Leu Ile Lys Lys Phe Thr Asp Lys Val Asn Pro Leu Ser His 330 335 340 ACC TCC CAC AAG GAA GCC AAG AAG TTG GCC AAG GAA TTG ACC GGT AAG 2610 Thr Ser His Lys Glu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Glu Leu Thr Gly Lys 345 350 355 360 GAC ATC TAC TTC AAC TGG GAC GTT GCC AGA GCC AGA GAA GGT TAC TAC 2658 Asp Ile Tyr Phe Asn Trp Asp Val Ala Arg Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr 365 370 375 AGA TAC CAA GGT GGT ACC CAA TGT GCC GTC ATG AGA GGT AGA GCT TTT 2706 Arg Tyr Gln Gly Gly Thr Gln Cys Ala Val Met Arg Gly Arg Ala Phe 380 385 390 GCT CCA TAC GCC GAC TTG ATC TGG ATG GAG TCC GCT TTG CCA GAC TAC 2754 Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Ile Trp Met Glu Ser Ala Leu Pro Asp Tyr 395 400 405 AAC CAA GCC AAG GAA TTC GCT GAC GGT GTC AAG GCT GCT GTC CCA GAC 2802 Asn Gln Ala Lys Glu Phe Ala Asp Gly Val Lys Ala Ala Val Pro Asp 410 415 420 CAA TGG TTG GCT TAC AAC TTG TCC CCA TCT TTC AAC TGG AAC AAA GCC 2850 Gln Trp Leu Ala Tyr Asn Leu Ser Pro Ser Phe Asn Trp Asn Lys Ala 425 430 435 440 ATG CCA GCT GAC GAG CAA GAA ACT TAC ATC AAG AGA TTG GGT CAA TTG 2898 Met Pro Ala Asp Glu Gln Glu Thr Tyr Ile Lys Arg Leu Gly Gln Leu 445 450 455 GGT TAC GTG TGG CAA TTC ATC ACC TTG GCC GGT TTG CAC ACC ACT GCT 2946 Gly Tyr Val Trp Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly Leu His Thr Thr Ala 460 465 470 TTG GCT GTT GAT GAC TTC GCT AAC CAA TAC TCT CAA ATT GGT ATG AGA 2994 Leu Ala Val Asp Asp Phe Ala Asn Gln Tyr Ser Gln Ile Gly Met Arg 475 480 485 GCA TAC GGT CAA ACC GTC CAA CAA CCA GAA ATC GAA AAG GGT GTC GAA 3042 Ala Tyr Gly Gln Thr Val Gln Gln Pro Glu Ile Glu Lys Gly Val Glu 490 495 500 GTT GTC AAG CAC CAG AAA TGG TCC GGT GCC AAC TAC ATT GAC GGT TTG 3090 Val Val Lys His Gln Lys Trp Ser Gly Ala Asn Tyr Ile Asp Gly Leu 505 510 515 520 TTG AGA ATG GTC AGT GGT GGT GTC ACT TCT ACT GCT GCT ATG GGT GCT 3138 Leu Arg Met Val Ser Gly Gly Val Thr Ser Thr Ala Ala Met Gly Ala 525 530 535 GGT GTT ACT GAA GAT CAA TTC AAG GAA ACC AAG GCT AAG GTT TAA 3183 Gly Val Thr Glu Asp Gln Phe Lys Glu Thr Lys Ala Lys Val Stop 540 545 550 AAGAAAAAAG AAAAGGTAAA GAACTTCATT TGAGATGAAC TTTTGTATAT GACTTTTAGT 3243 TTCTACTTTT TTTTTTATTT ATTGCTTAAT TTTCTTTATT TCAATCCCCC ATAGTTTGTG 3303 TAGAATATAT TTATTCATTC TGGTAACTCA AACACGTAGC AAGCTCGTTG CATCTCGCCT 3363 CGTCACGGGT ACAGCTCTGG AACCAAAGAC AAAAAAAAAA GTTGATCCGA ACCCTCTCGC 3423 TATTCCTTGC TATGCTATCC ACGAGATGGG GTTTATCAGC CCAGGCAAGT CACTAAAGAG 3483 ACAAAGACCC AGAAAGAATG GATCC 3508

【００３２】配列番号：２ 配列の長さ：１５３０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐＫ
２３３ 配列 GGATCCGTCT GAAGAAATCA AGAACCAACA GTTGGATATC ATCAAGGGAA TATTAGGCGA 60 AGAGGCATCT AGTAGTAGTG GCAGTGGTGA GAACGTGGGC GCTGCTATAG TGAACAATCT 120 CCAGTCGATG GTTAAGAAGA AGAGTGACAA ACCAGCAGTG AATGACTTGT CTGGGTCCGT 180 GAGGAAAAGA AAGAAGCCCG ACACAAAGGA CAGTAACGTC AAGAAACCCA AGAAATAGGG 240 GGGACCTGTT TAGATGTATA GGAATAAAAA CTCCGAGATG ATCTCAATGT GTAATGGAGT 300 TGTAATATTG CAAAGGGGGA AAATCAAGAC TCAAACGTGT GTATGAGTGA GCGTACGTAT 360 ATCTCCGAGA GTAGTATGAC ATAATGATGA CTGTGAATCA TCGTAATCTC ACACAAAAAC 420 CCCATTGTCG GCCATATACC ACACCAAGCA ACACCACATA TCCCCCGGAA AAAAAAACGT 480 GAAAAAAAGA AACAATCAAA ACTACAACCT ACTCCTTGAT CACACAGTCA TTGATCAAGT 540 TACAGTTCCT GCTAGGGAAT GACCAAGGTA CAAATCAGCA CCTTAATGGT TAGCACGCTC 600 TCTTACTCTC TCTCACAGTC TTCCGGCCCC TATTCAAAAT TCTGCACTTC CATTTGACCC 660 CAGGGTTGGG AAACAGGGCC ACAAAAGAAA AACCCGACGT GAATGAAAAA ACTAAGAAAA 720 GAAAAAAAAT TATCACACCA GAAATTTACC TAATTGGGTA ATTCCCATCG GTGTTTTTCC 780 TGGATTGTCG CACGCACGCA TGCTGAAAAA AGTGTTCGAG TTTTGCTTTT GCCTCGGAGT 840 TTCACGCAAG TTTTTCGATC TCGGAACCGG AGGGCGGTCG CCTTGTTGTT TGTGATGTCG 900 TGCTTTGGGT GTTCTAATGT GCTGTTATTG TGCTCTTTTT TTTTCTTCTT TTTTTGGTGA 960 TCATATGATA TTGCTCGGTA GATTACTTTC GTGTGTAGGT ATTCTTTTAG ACGTTTGGTT 1020 ATTGGGTAGA TATGAGAGAG AGAGAGTGGG TGGGGGAGGA GTTGGTTGTA GGAGGGACCC 1080 CTGGGAGGAA GTGTAGTTGA GTTTTCCCTG ACGAATGAAA ATACGTTTTT GAGAAGATAA 1140 TACAGGAAAG GTGTGTCGGT GAATTTCCAT CTATCCGAGG ATATGAGTGG AGGAGAGTCG 1200 TGTGCGTGTG GTTAATTTAG GATCAGTGGA ACACACAAAG TAACTAAGAC AGAGAGACAG 1260 AGAGAAAAAT CTGGGGAAGA GACAAAGAGT CAGAGTGTGT GAGTTATTCT GTATTGTGAA 1320 ATTTTTTTGC CCAACTACAT AATATTGCTG AAACTAATTT TACTTAAAAA GAAAAGCCAA 1380 CAACGTCCCC AGTAAAACTT TTCTATAAAT ATCAGCAGTT TTCCCTTTCC TCCATTCCTC 1440 TTCTTGTCTT TTTTCTTACT TTCCCTTTTT TATACCTTTT CATTATCATC CTTTATAATT 1500 GTCTAACCAA CAACTATATA TCTATCAACC 1530

【００３３】配列番号：３ 配列の長さ：７２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐＫ
２３３ 配列 CTGAAAAAAG TGTTCGAGTT TTGCTTTTGC CTCGGAGTTT CACGCAAGTT TTTCGATCTC 60 GGAACCGGAG GGCGGTCGCC TTGTTGTTTG TGATGTCGTG CTTTGGGTGT TCTAATGTGC 120 TGTTATTGTG CTCTTTTTTT TTCTTCTTTT TTTGGTGATC ATATGATATT GCTCGGTAGA 180 TTACTTTCGT GTGTAGGTAT TCTTTTAGAC GTTTGGTTAT TGGGTAGATA TGAGAGAGAG 240 AGAGTGGGTG GGGGAGGAGT TGGTTGTAGG AGGGACCCCT GGGAGGAAGT GTAGTTGAGT 300 TTTCCCTGAC GAATGAAAAT ACGTTTTTGA GAAGATAATA CAGGAAAGGT GTGTCGGTGA 360 ATTTCCATCT ATCCGAGGAT ATGAGTGGAG GAGAGTCGTG TGCGTGTGGT TAATTTAGGA 420 TCAGTGGAAC ACACAAAGTA ACTAAGACAG AGAGACAGAG AGAAAAATCT GGGGAAGAGA 480 CAAAGAGTCA GAGTGTGTGA GTTATTCTGT ATTGTGAAAT TTTTTTGCCC AACTACATAA 540 TATTGCTGAA ACTAATTTTA CTTAAAAAGA AAAGCCAACA ACGTCCCCAG TAAAACTTTT 600 CTATAAATAT CAGCAGTTTT CCCTTTCCTC CATTCCTCTT CTTGTCTTTT TTCTTACTTT 660 CCCTTTTTTA TACCTTTTCA TTATCATCCT TTATAATTGT CTAACCAACA ACTATATATC 720 TATCAACC 728

【００３４】配列番号：４ 配列の長さ：６３１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐＫ
２３３ 配列 GTGCTTTGGG TGTTCTAATG TGCTGTTATT GTGCTCTTTT TTTTTCTTCT TTTTTTGGTG 60 ATCATATGAT ATTGCTCGGT AGATTACTTT CGTGTGTAGG TATTCTTTTA GACGTTTGGT 120 TATTGGGTAG ATATGAGAGA GAGAGAGTGG GTGGGGGAGG AGTTGGTTGT AGGAGGGACC 180 CCTGGGAGGA AGTGTAGTTG AGTTTTCCCT GACGAATGAA AATACGTTTT TGAGAAGATA 240 ATACAGGAAA GGTGTGTCGG TGAATTTCCA TCTATCCGAG GATATGAGTG GAGGAGAGTC 300 GTGTGCGTGT GGTTAATTTA GGATCAGTGG AACACACAAA GTAACTAAGA CAGAGAGACA 360 GAGAGAAAAA TCTGGGGAAG AGACAAAGAG TCAGAGTGTG TGAGTTATTC TGTATTGTGA 420 AATTTTTTTG CCCAACTACA TAATATTGCT GAAACTAATT TTACTTAAAA AGAAAAGCCA 480 ACAACGTCCC CAGTAAAACT TTTCTATAAA TATCAGCAGT TTTCCCTTTC CTCCATTCCT 540 CTTCTTGTCT TTTTTCTTAC TTTCCCTTTT TTATACCTTT TCATTATCAT CCTTTATAAT 600 TGTCTAACCA ACAACTATAT ATCTATCAAC C 631

【００３５】配列番号：５ 配列の長さ：５４６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐＫ
２３３ 配列 ACTTTCGTGT GTAGGTATTC TTTTAGACGT TTGGTTATTG GGTAGATATG AGAGAGAGAG 60 AGTGGGTGGG GGAGGAGTTG GTTGTAGGAG GGACCCCTGG GAGGAAGTGT AGTTGAGTTT 120 TCCCTGACGA ATGAAAATAC GTTTTTGAGA AGATAATACA GGAAAGGTGT GTCGGTGAAT 180 TTCCATCTAT CCGAGGATAT GAGTGGAGGA GAGTCGTGTG CGTGTGGTTA ATTTAGGATC 240 AGTGGAACAC ACAAAGTAAC TAAGACAGAG AGACAGAGAG AAAAATCTGG GGAAGAGACA 300 AAGAGTCAGA GTGTGTGAGT TATTCTGTAT TGTGAAATTT TTTTGCCCAA CTACATAATA 360 TTGCTGAAAC TAATTTTACT TAAAAAGAAA AGCCAACAAC GTCCCCAGTA AAACTTTTCT 420 ATAAATATCA GCAGTTTTCC CTTTCCTCCA TTCCTCTTCT TGTCTTTTTT CTTACTTTCC 480 CTTTTTTATA CCTTTTCATT ATCATCCTTT ATAATTGTCT AACCAACAAC TATATATCTA 540 TCAACC 546

【００３６】配列番号：６ 配列の長さ：４４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐＫ
２３３ 配列 AAGTGTAGTT GAGTTTTCCC TGACGAATGA AAATACGTTT TTGAGAAGAT AATACAGGAA 60 AGGTGTGTCG GTGAATTTCC ATCTATCCGA GGATATGAGT GGAGGAGAGT CGTGTGCGTG 120 TGGTTAATTT AGGATCAGTG GAACACACAA AGTAACTAAG ACAGAGAGAC AGAGAGAAAA 180 ATCTGGGGAA GAGACAAAGA GTCAGAGTGT GTGAGTTATT CTGTATTGTG AAATTTTTTT 240 GCCCAACTAC ATAATATTGC TGAAACTAAT TTTACTTAAA AAGAAAAGCC AACAACGTCC 300 CCAGTAAAAC TTTTCTATAA ATATCAGCAG TTTTCCCTTT CCTCCATTCC TCTTCTTGTC 360 TTTTTTCTTA CTTTCCCTTT TTTATACCTT TTCATTATCA TCCTTTATAA TTGTCTAACC 420 AACAACTATA TATCTATCAA CC 442

【００３７】配列番号：７ 配列の長さ：４２２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐＫ
２３３ 配列 TGACGAATGA AAATACGTTT TTGAGAAGAT AATACAGGAA AGGTGTGTCG GTGAATTTCC 60 ATCTATCCGA GGATATGAGT GGAGGAGAGT CGTGTGCGTG TGGTTAATTT AGGATCAGTG 120 GAACACACAA AGTAACTAAG ACAGAGAGAC AGAGAGAAAA ATCTGGGGAA GAGACAAAGA 180 GTCAGAGTGT GTGAGTTATT CTGTATTGTG AAATTTTTTT GCCCAACTAC ATAATATTGC 240 TGAAACTAAT TTTACTTAAA AAGAAAAGCC AACAACGTCC CCAGTAAAAC TTTTCTATAA 300 ATATCAGCAG TTTTCCCTTT CCTCCATTCC TCTTCTTGTC TTTTTTCTTA CTTTCCCTTT 360 TTTATACCTT TTCATTATCA TCCTTTATAA TTGTCTAACC AACAACTATA TATCTATCAA 420 CC 422

【００３８】配列番号：８ 配列の長さ：３９１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐＫ
２３３ 配列 ATACAGGAAA GGTGTGTCGG TGAATTTCCA TCTATCCGAG GATATGAGTG GAGGAGAGTC 60 GTGTGCGTGT GGTTAATTTA GGATCAGTGG AACACACAAA GTAACTAAGA CAGAGAGACA 120 GAGAGAAAAA TCTGGGGAAG AGACAAAGAG TCAGAGTGTG TGAGTTATTC TGTATTGTGA 180 AATTTTTTTG CCCAACTACA TAATATTGCT GAAACTAATT TTACTTAAAA AGAAAAGCCA 240 ACAACGTCCC CAGTAAAACT TTTCTATAAA TATCAGCAGT TTTCCCTTTC CTCCATTCCT 300 CTTCTTGTCT TTTTTCTTAC TTTCCCTTTT TTATACCTTT TCATTATCAT CCTTTATAAT 360 TGTCTAACCA ACAACTATAT ATCTATCAAC C 391

【００３９】配列番号：９ 配列の長さ：３５５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐＫ
２３３ 配列 CGAGGATATG AGTGGAGGAG AGTCGTGTGC GTGTGGTTAA TTTAGGATCA GTGGAACACA 60 CAAAGTAACT AAGACAGAGA GACAGAGAGA AAAATCTGGG GAAGAGACAA AGAGTCAGAG 120 TGTGTGAGTT ATTCTGTATT GTGAAATTTT TTTGCCCAAC TACATAATAT TGCTGAAACT 180 AATTTTACTT AAAAAGAAAA GCCAACAACG TCCCCAGTAA AACTTTTCTA TAAATATCAG 240 CAGTTTTCCC TTTCCTCCAT TCCTCTTCTT GTCTTTTTTC TTACTTTCCC TTTTTTATAC 300 CTTTTCATTA TCATCCTTTA TAATTGTCTA ACCAACAACT ATATATCTAT CAACC 355

【００４０】配列番号：１０ 配列の長さ：３２７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐＫ
２３３ 配列 GCGTGTGGTT AATTTAGGAT CAGTGGAACA CACAAAGTAA CTAAGACAGA GAGACAGAGA 60 GAAAAATCTG GGGAAGAGAC AAAGAGTCAG AGTGTGTGAG TTATTCTGTA TTGTGAAATT 120 TTTTTGCCCA ACTACATAAT ATTGCTGAAA CTAATTTTAC TTAAAAAGAA AAGCCAACAA 180 CGTCCCCAGT AAAACTTTTC TATAAATATC AGCAGTTTTC CCTTTCCTCC ATTCCTCTTC 240 TTGTCTTTTT TCTTACTTTC CCTTTTTTAT ACCTTTTCAT TATCATCCTT TATAATTGTC 300 TAACCAACAA CTATATATCT ATCAACC 327

【００４１】配列番号：１１ 配列の長さ：１５６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐＫ
２３３ 配列 AGCCAACAAC GTCCCCAGTA AAACTTTTCT ATAAATATCA GCAGTTTTCC CTTTCCTCCA 60 TTCCTCTTCT TGTCTTTTTT CTTACTTTCC CTTTTTTATA CCTTTTCATT ATCATCCTTT 120 ATAATTGTCT AACCAACAAC TATATATCTA TCAACC 156

【００４２】配列番号：１２ 配列の長さ：１１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐＫ
２３３ 配列 CAGCAGTTTT CCCTTTCCTC CATTCCTCTT CTTGTCTTTT TTCTTACTTT CCCTTTTTTA 60 TACCTTTTCA TTATCATCCT TTATAATTGT CTAACCAACA ACTATATATC TATCAACC 118

【００４３】配列番号：１３ 配列の長さ：６９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｐＫ
２３３ 配列 TCCCTTTTTT ATACCTTTTC ATTATCATCC TTTATAATTG TCTAACCAAC AACTATATAT 60 CTATCAACC 69

【００４４】配列番号：１４ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTGTCGACGT GCTTTGGGTG TTCTAATGTG C 31

【００４５】配列番号：１５ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGTCGACTAC TTTCGTGTGT AGGTATTC 28

【００４６】配列番号：１６ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGTCGACGA AGTGTAGTTG ACTTTTCCC 29

【００４７】配列番号：１７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGTCGACCC TGACGAATGA AAATACG 27

【００４８】配列番号：１８ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGTCGACAA TACAGGAAAG GTGTGTCGG 29

【００４９】配列番号：１９ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGTCGACCC GAGGATATGA GTGGAGG 27

【００５０】配列番号：２０ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGTCGACTG CGTGTGGTTA ATTTAGG 27

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:74） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:74）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記性質を有することを特徴とする発現
   調節ＤＮＡ。 （１） 原核細胞および真核細胞の両宿主においてプロ
   モーター活性を有する。 （２） 原核細胞を宿主とした場合、酢酸またはグリセ
   ロール並びに乳酸によりプロモーター活性が誘導され
   る。 （３） 真核細胞を宿主とした場合、酢酸、グリセロー
   ル並びに乳酸、エタノールまたはオレイン酸によりプロ
   モーター活性が誘導される。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号２〜１３に記載の塩基
   配列で表されることを特徴とする請求項１記載のＤＮ
   Ａ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号２〜１３に記載の塩基
   配列で表されるＤＮＡとｌａｃプロモーターＤＮＡとの
   融合ＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載のＤＮ
   Ａ。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のＤＮＡの下流にタンパ
   ク質をコードする構造遺伝子が導入されてなる発現ベク
   ター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の発現ベクターで原核細胞
   または真核細胞を形質転換し、得られる形質転換体を培
   養してその培養物からタンパク質を取得することを特徴
   とするタンパク質の産生方法。