JPH07507925A - プロテインｌおよび組換えｄｎａ法によるその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロティンＬおよび組換えＤＮＡ法によるその製法この発明は、新規な免疫グロ ブリン結合性タンパク質、その製造法、それをコードする組換えＤＮＡ分子およ びそのプローブとして有用な組換えＤＮＡ分子に関する。

さらに詳しくは、本発明は、実質的に純粋および／または完全および／または均 質な形態のプロティンＬと称するタンパク質およびプロティンＬをコードする組 換えＤＮＡ分子に関する。

Ｈ鎖との相互作用により哺乳動物の免疫グロブリンと親和性のある表面タンパク 質を発現する多数のグラム陽性細菌種が単離されている。これら免疫グロブリン 結合性タンパク質のうちで最もよく知られているのは、タイプ１スタフイロコツ カスプロテインＡおよびタイプ２ストレプトコツカスプロテインＧであり、これ らはヒト免疫グロブリンのＦｃ領域上の主としてＣ２−Ｃ５境界と相互作用する ことが示されている。加えて、両プロティンはＦａｂ領域とも弱い相互作用をす ることが示されているが、その場合も免疫グロブリンのＨ鎖によるものである。

最近、ペプトコソカス・マグヌス（Ｐ　ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ） からの新規タンパク質であるプロティンＬが報告されたが、このタンパク質は、 ヒト、ウサギ、ブタ、マウスおよびラットの免疫グロブリンにＬ鎖との相互作用 によってのみ結合することがわかった。ヒトにおいては、この相互作用はカッパ 鎮としか起こらないことが示されている。カッパおよびラムダの両り鎖は異なる クラスに共通に存在するので、プロティンＬはすべてのヒトクラス、とりわけ多 サブユニット形態のＩｇＭと強（結合し、同様に、プロティンＬＬ鎖結合を示す 種におけるすべてのクラスに結合することが予想されている。

ペブトコッカスおよびペプトストレプトコッカス（ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃ ｏｃｃｕｓ）の両者とも、ヒト免疫グロブリンのカッパし鎖に結合するプロティ ンＬを産生ずることが報告されている。プロティンＬはビルレンス因子であるこ とが提唱されている：ビルレンスでないペプトコッカスおよびペブトストレブト コッカスは、プロティンＬを発現もしないし、その構造遺伝子を有することもな いと思われる（カスターン（Ｋａｓｔｅｒｎ）ら、１９９０）。

プロティンＬは、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラスに存在する カッパし鎮に結合することが報告されているので、特に興味がもたれる。そのよ うなものとして、プロティンＬはＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ法に使用できる有用な 診断試薬であるに違いない。現在のプロティンＬの製造法は、一般に、細胞表面 上にプロティンＬを発現する細菌から抽出および精製することによっている。

そのような方法は、その本質において非効率的であり、不純なタンパク質を低収 率で産生じ、しかも長時間を要する。加えて、このようにして得られたプロティ ンＬは不完全である。

ＥＰ−Ａ−０２５５４９７には、標準タンパク質精製法によるプロティンＬの精 製および特徴付けの試みが記載されている。その後、ＥＰ−Ａ−０２５５４９７ の著者らは、プロティンＬの性質および構造をさらに探求する多（の科学論文を 発表しているが、現在のところ、該タンパク質を完全に特徴付けることは失敗に 終わっている。それゆえ、最近、カスターン（Ｗ、　Ｋａｓｔｅｒｎ）らによる 「プロティンＬ細菌の免疫グロブリン−結合性タンパク質および可能なビルレン ス決定因子」と題する論文（Ｉ　ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉ　ｍｍｕｎｉｔ ｙ１１９９０年５月、１２１７〜１２２２頁）において、プロティンＬのトリプ シン断片のＮ−末端アミノ酸配列を決定し得られた配列情報を用いて該遺伝子を 単離するためのプローブを構築することによるプロティンＬをコードする遺伝子 を単離する試みが失敗に終わったことが記載されている。

しかしながら、現在までのところ、プロティンＬの遺伝子を単離および特徴付け る問題は解決されておらず、そのためプロティンＬ製造の有意な改善が妨げられ ている。

さらに、プロティンＬの配列情報が得られておらず、免疫グロブリンカッパＬ鎖 との複合体生成に関与する配列を同定することが可能ではなかった。

この発明は、いまや単離されたプロティンＬをコードするｃＤＮＡ挿入物を完全 に包含するｃＤＮＡ配列に基づいており、それゆえ上記問題を解決することがで きる。このｃＤＮＡ配列およびその最長の読み取り枠に対応するアミノ酸配列を 図１に示しである。図１に示す最長の読み取り枠の配列は、ＴＴＧ（１０３）か らＡＡＡ　（３１８３）までにわたっており、図示したＤＮＡは、非成熟プロテ ィンＬをコードするヌクレオチド２０８からヌクレオチド３１８３にわたるコー ド領域を含む。

それゆえ、一つの態様において本発明は、プロティンＬと称し、免疫グロブリン カッパＬ鎖と複合体を生成することのできるポリペプチドを提供するものであり 、該ポリペプチドは実質的に均質および／または完全および／または完全長の形 態であることを特徴とする。

本発明のポリペプチドは、好ましくは、（ｉ）実質的に均質であること、（ｉｉ ）完全であること、および（ｉｉｉ）実質的に完全長の形態であることのうち少 なくとも２つ、さらに好ましくは３つの特性を有する。

上記完全長のポリペプチドは、長さが少な（とも９００のアミノ酸であり、さら に好ましくは長さが少なくとも９５０のアミノ酸であり、最も好ましくは長さが 少なくとも９７５のアミノ酸である。

本発明によって提供される完全長ポリペプチドには、成熟配列および非成熟配列 の両方が含まれる。トリプレットＡＴＧ　（２０８）は、３０〜３５アミノ酸に わたるシグナル配列の開始部であると思われる。それゆえ、本発明のポリペプチ ドには、Ｍｅｔ　（２０８）からＬｙｓ　（３１８３）までの非成熟ポリペプチ ドと該Ｎ−末端から３０〜３５アミノ酸が省かれた成熟ポリペプチドの両方が包 含される。

要約すると、完全長の非成熟プロティンＬ（またはプレプロティンＬ）は９９２ アミノ酸からなると思われ、本発明の非成熟ポリペプチドは長さが少なくとも９ ９０アミノ酸であるポリペプチドからなるのが最適である。

本発明による非成熟ポリペプチドは、Ｎ−末端２列Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　ｌ１ｅＡｓ ｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌ ａｃｌｙ　Ａｈａ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙの少なくとも７、 より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも１５のアミノ酸に対 応するＮ−末端配列を有するのが好ましい。

これらＮ−末端配列は以下の通りである。

６１１１１１：　Ｌｙｓ　ｌｌａ　Ａｓｎ　ＬｙＳ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＮｅｔ　Ｌ ｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｅ　＾１ａＭｅ ｔ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｌ ａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ本発明はさらに、シグナル配列が省 かれた上記ポリペプチドを包含する。シグナル配列は、長さが２０〜３５アミノ 酸、さらに詳しくは長さが２３〜２７アミノ酸である。それゆえ、本発明の完全 長の成熟ポリペプチドは、以下のＮ−末端配列のうちの一つで開始され、Ｌｅｕ 　（３１３）から図１に示す配列が続（。

ｃｒｙ＾ｌａ　Ａｓｎ＾ｌａ　Ｔｙｒ＾１ａ＾ｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　 Ａｓｎ　Ｔｈｒ＾ｓｐ＾ｓｎ　Ａ３１１　、、。

ＡＬａ　Ａｓｎ　ＡＬａ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　 Ａｓｎ　丁ｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　、、。

へｓｎ＾１ａＴｙｒ＾１ａ＾１ａＧＬｕＧｌｕＡｓｐＡｓｎＴｈｒＡｓｐＡｓｎ Ａｓｎ、、。

ＡＬａ　Ｔｙｒ　＾１＆　ＡＬａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｃ　 Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　、、。

”Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＧＬｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ 　Ａｓｎ　Ａｓｎ　、　、　。

Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｃ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　 Ａｓｎ　、、。

ＡＬａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｇ＾ｉｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　ＡＳｎ　Ａｍｎ　、、 。

Ｃ＋ｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　、　、。

Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｒ＋　Ａｇｎ　、５゜Ｔｈｒ　Ａｓｐ　 Ａｓｎ　Ａｓｎ　、、。

プロティンＬの実際の成熟配列は上記配列の符号１本」から開始されると思われ る、すなわち、図１において成熟配列はｒＭＪでマークされており、シグナル配 列は「ＳＳ」のマークが付されている。

本発明はまた上記ポリペプチドの変異体をも包含するものであるが、すべての変 異体が免疫グロブリンカッパし鎖と複合体を生成することができる。

望ましくは、本発明の変異体ポリペプチドは、図１に示すアミノ酸配列と少なく とも７５％の配列相同性、好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を有する。

最も好ましくは、本発明の変異体ポリペプチドは、図１に示すアミノ酸配列と少 なくとも９５％の配列相同性、好ましくは少な（とも９８％の配列相同性を有す る。

図１に示す完全長のポリペプチドは、Ｃ−末端配列Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＡｌａＡｌ ａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｙ ｒＶａｔ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓを有する。

本発明によるポリペプチドは、Ｃ−末端配列Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　ＡｌａＡ ｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｖ ａｌＳｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　の少なくとも７、より 好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少な（とも１５のアミノ酸に対応す るＣ−末端配列を有する。

これらＣ−末端配列は以下の通りである。

Ｌｅｕ＾ｌａ　ＡＬａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａ ｌａ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅ＝本発明はさらに、第二の側面にお いて、上記ポリペプチドをコードする挿入物を有する組換えＤＮＡ分子を提供す る。

本発明の一つの態様において、本発明の非成熟ポリペプチドをコードする組換え ＤＮＡ分子は、（ａ）２０８に位置するＡＴＧがら始まり３１８３に位置するＡ ＡＡまで広がる因１に示すＤＮＡコード配列、および（ｂ）同アミノ酸配列をコ ードする縮重ＤＮＡ配列から選ばれる。

さらに別の態様においで、本発明の成熟ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ 分子は、（ｃ）２１１の位置から３１３の位置の領域にあるコドンから開始され ３１８３の位置にあるＡＡＡまで広がる図１に示すＤＮＡコード配列、および（ ｄ）同アミノ酸配列をコードする縮重ＤＮＡ配列から選ばれる。

第三の側面において、本発明は、上記ＤＮＡコード配列を含有する発現ベクター で形質転換した形質転換宿主を培養することを特徴とする、免疫グロブリン結合 性タンパク質の製造法を提供する。形質転換した宿主は、真核性または原核性で ありでよく、たとえば細菌または酵母または動物細胞、培養哺乳動物細胞または 昆虫細胞であってよい。

本発明はさらに第四の側面において、図１のＤＮＡ配列に示す少なくとも１２、 好ましくは１５、最も好ましくは１７塩基の隣接配列からなり、免疫グロブリン 結合性タンパク質をコードする他のＤＮＡ配列を単離するためのプローブとして 有用な組換えＤＮＡ分子を提供する。それゆえ、第四の側面において、図１に示 すＤＮＡ配列を、プロティンＬに関連する配列のポリペプチドをコードするＤＮ Ａ配列の遺伝子バンクをプローブするのに有用なプローブを構築するのに用いる 。

本発明はさらに第五の側面において、上記プローブで遺伝子バンクをプローブす ることにより単離したＤＮＡコード配列を含有する発現ベクターを培養すること を特徴とする、免疫グロブリン結合性タンパク賀の製造法を提供する。

プロティンＣの特異的結合特性（免疫グロブリンのカッパＬ鎖に結合する能力を 含む）は、該分子のアミノ酸配列内に認識し得るほどに繰り返された特徴を有す る配列の存在によるものと思われる。本明細書において用いる「認識し得るほど に繰り返された特徴」なる語は、アミノ酸配列が、それぞれ長さが２０〜４５ア ミノ酸の少なくとも２つの配列からなり、これら配列が互いに少なくとも７５９ ６、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を 有することを意味する。

図１に示すポリペプチド配列には１０組の繰り返し配列が含まれ、そのうち少な くとも２つが免疫グロブリンカッパＬ錯結合に関与していると思われる。

これら１０組の繰り返し配列は、そのＮ−末端にて以下のように分類される。

（１）ＡＩ、Ａ２およびＡ３； （２）ＢｌおよびＢ２： （３）Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４： （４）ＤＩ、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４： （５）Ｅｌ、Ｂ２およびＢ３； （６）Ｆｌ、Ｆ２、Ｂ３およびＢ４゜ （７）ＧｌおよびＧ２； （９）ＨｌおよびＲ２：および （１０）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８これら各繰り返 し配列は、２５〜４５アミノ酸の長さを有する。

カッパＬ鎖に結合する能力は、繰り返し配列Ａ、Ｂ、ＣおよびＤＣ上記（１）〜 （４））の１または２以上と関連すると思われる。

それゆえ、図１においてそのＮ−末端にてＡｌ、Ａ２およびＡ３；ＢｌおよびＢ ２；Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４：およびＤｌ、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４として分 類される配列から選択される複数の認識し得るほどに繰り返された結合ドメイン からなる合成免疫グロブリン結合性分子を提供することは本発明の他の特徴であ る。該合成免疫グロブリン結合性分子は、該ドメインを２〜１５含むのが好まし い。これら選択された１または２以上のドメインは、図１においてそのＮ−末端 にてＡ１、Ａ２およびＡ３；ＢｌおよびＢ２；Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４；お よびＤｌ、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４として分類される配列と同一であるか、または これらと少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少な くとも９５％の相同性を有することを条件として該配列から変化してよい。

そのＮ−末端にてＥｌ、Ｂ２およびＢ３：およびＦｌ、Ｆ２、Ｂ３およびＢ４と して分類された配列は、アルブミン結合性に関与していると思われ、本発明によ って提供される合成結合性分子には、配列Ｅ１、Ｂ２およびＢ３；およびＦｌ、 Ｆ２、Ｂ３およびＢ４、またはこれら配列と少なくとも７５％、好ましくは少な くとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有することを条件と して該配列から変化した関連配列が含まれる。

ペブトコッカスプロテインＬをコードする遺伝子の特徴付けおよび単離並びに標 準タンパク賀精製法による単離との比較を以下の実施例に記載する。

実施例１−標準タンパク質精製法によるプロティンＬの単離および特徴付けの試 み グラム陽性嫌気性球菌の５６の異なる臨床単離物の集合を、ルトン・パブリック ・ヘルス・ラボラトリ−（Ｌｕｔｏｎ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ）　アンニアローブレファレンスユニット（Ａｎａｅｒｏｂｅ　Ｒ ｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｕｎｉｔ）　、バス・パブリック・ヘルス・ラボラトリ−（ Ｂａｔｈ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）およびソール スベリ−・パブリック・ヘルス・ラボラトリ−（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ　Ｐｕｂｌ ｉｃ　ＨｅａｌｔｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）から入手した。ペブトコッカスおよ びペプトストレプトコッカスの凹型は、ナショナル・コレクション・オブ・タイ プ・カルチャーズ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ）　、セントラル・パブリック・ヘルス・ラボラトリ−（Ｃｅ ｎｔｒａｌ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、（コリン ディル、ロンドン）からのものであった。

１．１細胞抽出物の調製 上記株を０．０５％ツイーン８０を添加したトッド−ヒユーイツト（Ｔｏｄｄ− Ｈｅｖｉｔｔ）ブロス中、常法により嫌気的に培養した。８，０００ｇで遠心分 離することにより細胞を回収し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，８） で洗浄し、ついで同緩衝液中に再懸濁して１０％の細胞密度（湿重量／容量）と した。

ムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）　（シグマ：細菌墾濁液１ｍｌ当たり ５０単位）を加えて溶解を行った。３７℃で２〜３時間インキュベートした後、 細胞抽出物を１２．０００ｇで１５分間遠心分離にか広−２０℃でアリコートと して貯蔵するかまたはＳＤＳ　ＰＡＧＥ負荷緩衝液中で１０分間沸騰させた（バ ーロウ＆レイン（Ｈａｒｌｏｔ　＆　Ｌａｎｅ）　、１９８８）。

１．２　タンパク質のＳＤＳ　ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング上記細 胞抽出物からのタンパク質を７．５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル上で電気泳 動にかけて分離し、ウェスタンブロッティング（バーロウ＆レイン、１９８８） により電気泳動的にニトロセルロース膜（ハイボンドＣ（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｃ）； アマ−ジャム）に移した。−夜移した後、０．０２％ツイーン２０を含有するリ ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）中で膜を数回洗浄し、ついでＰＢＳ−Ｔ中の１２ ゼラチン（シグマ）中で１時間インキュベートすることによりタンパク質結合部 位をブロックした。ついで、アルカリホスファターゼを結合したヒトＩｇＧかま たはホスファターゼを結合したＬ鎖（還元、アルキル化およびＦＰＬＣによる分 離によりヒトＩｇＧから調製−ハーロウおよびレイン、１９８８）とともにイン キュベートすることにより、免疫グロブリン結合性タンパク質を検出した。免疫 グロブリン結合性タンパク質をニトロ−ブルーテトラゾリウムおよびＸ−ホスを 用いて検出した（バーロウ＆レイン、１９８８）。

１．３　プロティンＬのアフィニティー精製株１０１８の４−リットル培養液を 上記のようにして増殖、回収および溶解した。この細胞抽出物を遠心分離工程に かける前に熱処理（８０℃、１０分間）した。上澄み液を２５０ｍＭＮａＣｌと し、ＩｇＧ−セファ０−スの５ｍｌカラム（直径１５ｍｍ）に適用した。このカ ラムを５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ８，０）で洗浄し、免疫グロブリ ン結合性タンパク質を１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ　（ｐＨ２，０）で溶出した 。このタンパク質を含有する溶出液を、ウェスタンブロッティングにより分析す る前にトリス−ＨＣｌでｐＨ７，５に中和した。

ペプトコッカス・マグヌスの単離物における免疫グロブリン結合性タンパク質の サイズは、プロティンＬについて報告されたサイズに対応する。１９９０年にカ スターンらによってなされた結果とは対照的に、本発明者らは、免疫グロブリン 結合性タンパク質を含む臨床単離物は創傷単離物または感染した外科創傷からの ものであることを見いだした。

免疫グロブリン結合性タンパク質は、ヒトＩｇＧから調製したアルカリホスファ ターゼ−標識り鎖調製物を用いて検出された。

１４結論 これら結果から、免疫グロブリン結合性タンパク質がアフィニティー精製工程中 に有意に分解されて、ＩｇＧＬ鎖に結合する能力を保持した一層小さな生成物を 与えることが確認される。

実施例２プロテインＬの全ヌクレオチド配列の決定および他の配列決定した免疫 グロブリン結合性タンパク質との翻訳アミノ酸配列の比較２．１材料 放射性化学物質はアマ−ジャム・インターナショナルから得た。Ｘ−ＯｍａｔＳ Ｘ−ｒａｙフィルムはコダックから得た。デオキシヌクレオシド三リン酸および ジデオキシヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡリガーゼ、制限エンドヌクレアーゼお よび他のＤＮＡ−修飾酵素はベーリンガーから得た。アガロース、アクリルアミ ド、ビスアクリルアミドおよびフェノールはベセスダ・リサーチ・ラボラトリー ズから得た。クロマトグラフィー媒体はファルマンアーＬＫＢ　（ウプサラ、ス ウェーデン）から得た。ヒト免疫グロブリンおよび血清アルブミンはシグマから 得た。他の試薬はすべてシグマまたはＢＤＨから得た。ニトロセルロースはアン ダーマン（Ａｎｄｅｒ＋ｃａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、、）　（キックストンーアポン ーテームズ、サリー、英国）から購入した。

２．２培地および培養条件 大腸菌ＴＧＩを２ｘＹＴブロース（２％（ｗ／ｖ））リブトン／１％（ｗ／　ｖ 　）酵母エキス／１％（ｗ／ｖ）ＮａＣ１）中、３７℃で一夜培養した。培地を ２％（Ｗ／Ｖ）バクトーアガー（ジフコ）で固化した。Ｍ１３重層のためのＨＴ −アが−ニハ、１％（ｗ／ｖ））リブトン、０８％（ｗ／ｖ）　Ｎ　ａ　Ｃｌお よび０．８％（Ｗ／Ｖ）バクトーアガ−（ジフコ）が含まれていた。必要な場合 は、形質転換体の選択および増殖のために５０μｇ／ｍｌの濃度のアンピシリン を用いた。

機能性β−ガラクトシダーゼの検出を、５−ブロモ−４−クロロインドリル−β −Ｄ−ガラクトンドを最終濃度６００μｇ／ｍｌで添加することにより、および 必要な場合にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノンドを最終濃度２０ ０μｇ／ｍｌで添加することにより行った。

プラスミドおよびファージＲＦ　ＤＮＡの精製を、大腸菌からブリジ溶解および ＣｓＣｌ／エチジウムブロマイド密度勾配遠心分離により行った。ペブトコツカ スの染色体ＤＮＡの単離をいずれにも記載のようにして行った。

２．３遺伝子操作手順 ＤＮＡ修飾酵素を緩衝液中および供給者（ベーリンガー）の推奨する条件下で使 用した。大腸菌の形質転換を本質的に以前に記載のようにして行った。ＤＮＡ断 片の電気泳動を、トリス−酢酸緩衝液（４０ｍＭ−トリス／２０ｍＭ−酢酸ナト リウム／２ｍＭ−ＥＤＴＡ、酢酸でｐＨ７，９に調整）中、垂直１％（ｗ／ｖ） −アガローススラブゲル上で行った。ＤＮＡ断片のサイズを、前辺て制限エンド ヌクレアーゼＨｉｎｄｌｌｌで消化したラムダファージＤＮＡの断片と比較する ことにより評価した。ＤＮＡ断片の精製を、本質的に以前に記載のようにして電 気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）により行った。

２．４　ヌクレオチド配列決定 ショットガンプロトコールを用いてランダム鋳型を生成するＭ１３鋳型上のチェ インターミネータ−法によりヌクレオチド配列を決定した。ＤＮＡ５ＴＡＲＩｎ ｃ（マディソン、米国）により提供されたプログラムを用い、複数の重複配列を 集めた。これら同じプログラムを用い、配列決定した遺伝子および翻訳したタン パク質を分析した。オリゴヌクレオチドプライマーの合成をアブライドバイオシ ステムダ３８０ＢＤＮＡ合成機を用いて行った。

２．５細胞の超音波処理 細胞懸濁液をＭＳＥ超音波音波管し、超音波処理に供した（ＭＳＥ　ソニプレッ プ１５０ソニケーター（ＭＳ　Ｅ　５ｏｎｉｐｒｅｐ　１５０５ｏｎｉｃａｔｏ ｒ）を用い、４℃にて３０秒間隔で１８ＭＨｚで３×３０秒バースト）。

２．６１ｇＧ−セファロース４Ｂ上のアフィニティークロマトグラフィー超音波 手順を用い、ＩｇＧ−セファロースＦＦ上のアフィニティークロマトグラフィー によるＰＰＬの小スケール精製からの細菌細胞を破砕した。培養液（３００ｍｌ ）を−夜増殖させ、ついで遠心分離にかけ（４℃、１５０００ｇで１０分間）、 １００ｍＭトリｘ−ＨＣＬ　ｐＨ７，５，２５０ｍＭ　ＮａＣｌ　（３ｍｌ）中 に再懸濁した。この懸濁液を超音波処理し、遠心分離にかけ（４℃、３００００ ｇで１０分間）、上澄み液を、１００ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，２５０ ｍＭ　ＮａＣｌ　（５ｍｌ）で平衡化し洗浄するＩｇＧ−セファ０−スＦＦの１ ｍｌカラム（１，６ｃｍｘＱ、９Ｑｃｍ内径）に通した。１００ｍＭグリシン− ＭＣＩ、ｐＨ２，０でタンパク質を溶出し、１Ｍトリス、ｐＨ８，０を用いてｐ Ｈを７．５に上げた。

２．７　ＰＡＧＥ 試料を還元条件下で可溶化し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル上で電気 泳動にかけた。レムリの方法を用い、ＬＫＢ垂直電気泳動ユニット中でアクリル アミド（７，５％、ｗ　／　ｖ　）スラブゲルを処理した。タンパク質をクマシ ーブリリアントブルーＲ−２５０で染色し、タンパク質のバンドをコモスキャン −３（Ｃｈｏｍｏｓｃａｎ　−３）レーザー光学密度計（ジョイスーレープル（ Ｊ　ｏｙｃｅ　−Ｌｏｅｂｌ）、ゲーツヘッド、タインアンドウイア、英国）で 走査して見かけのＭ、を評価した。

２．７　ウェスタンブロッティング タンパク質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからの電気泳動的移動によりニト ロセルロース膜に適用し、１１２５標識したタンパク質でプローブした。

２．８Ｎ−末端配列決定 自動エドマンフェニルチオヒダントイン分解により、アブライドバイオンステム ダ４フフＡパルス液体タンパク質シークエンサー上でＮ−末端アミノ酸配列を決 定した。ＰＰＬ試料を５０ｍＭ−ＮａＣ＋に対して透析し、約５００ピコモルを 気相ンークエンサーに適用した。装置の操作は、本質的に製造業者の指示に従っ て行った。エドマン分解を繰り返すことにより該ペプチドからアミノ酸が連続的 に除去され、これを逆相ＨＰＬＣを用いて同定した。

２．９３３１６のスクリーニングおよび同定３３１６染色体ＤＮＡの部分５ａｕ ３Ａ消化から６．０〜８．ＯＫｂの断片を電気溶出により単離し、脱リン酸化Ｂ ａｍＨ１消化したｐＭＴＬ２３中にクローニングした。１１５２の組換えクロー ンを１２のマイクロタイタートレイ中に選び取り、３７℃で一夜インキユベート した。各ウェルにグリセリンを最終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で添加することにより 、この遺伝子バンクを一７０℃で貯蔵することができた。可能な免疫グロブリン 結合性タンパク質を迅速に同定するため、これらクローンを４８の２４０ツト（ ２マイクロタイタートレイ）にプールし、３７℃にて一夜震盪してインキュベー トした。超音波処理により放出された可溶性細胞タンパク質を　１１！ｌ放射性 標識したヒト免疫グロブリンＬ鎖を用いたウェスタンブロッティングに供した。

同定したプールから、最初のクローンストックを８のグループに再プールし、再 プローブした。最後に、陽性プールのクローンを個々に再スクリーニングして３ つのヒト免疫グロブリンＬ鎖結合性タンパク質を同定した。

２．１０特徴付け ３つのすべてのクローンについてヒｌ−１ｇＧアフィニティー精製した試料を７ ゜５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにかけたところ、ツマシーブルー染色後に １０４キロダルトン、９６キロダルトンおよび９０キロダルトンの３つの主要な バンドが示された。この同じバンドパターンはまた、粗製の超音波処理試料を用 いたウェスタンプロットをヒトＩｇＧ、Ｉ　ｇＡ、ＩｇＭ、Ｉ　ｇＤ、ＩｇＥお よびカッパＬ鎖でＬｌｓプローブした後にも認められたが、ラムダし鎖では認め られなかった。加えて、ヒト血清アルブミンも結合することがわかった。

プロティンＡおよびＧが熱に対して極めて安定であることがわかっていたので、 本発明者らは粗製の超音波処理物を８０℃にて１０分間加熱することによりプロ ティンＬの安定性を試験した。この処理によって溶液から沈殿したタンパク質を 廃棄し、可溶性フラクションを５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

クマンー染色は、大腸菌タンパク質の大部分が沈殿したがプロティンＬは溶液中 に残留したことを示した。ＩｇＧ−アフィニティー精製したプロティンＬと比較 することにより、加熱処理はタンパク質精製の他の迅速な方法であると思われる 。ウェスタンプロット分析によれば、このタンパク質は依然としてカッパＬ鎖お よびＨ８Ａに対する活性を保持している。プロティンＧで認められたのとは対照 的に、プロティンＬのタンパク質加水分解断片であると思われる一層小さなタン パク質のみがＨ３Ａに結合することは興味深いことである。

２．１１ＤＮＡ配列決定 上記３つのクローンのＤＮＡ制限マツピングにより、ｐＰＰＩ、９が６．２Ｋｂ の最小の挿入物を含有することがわかり、サブクローニングによりｐｐｌ遺伝子 が４．２Ｋｂ　Ｐｓｔｌ断片まで限定された。このＰｓｔｌ断片を引き続き切り 出し、ショットガンにより超音波処理した。

これら挿入物を配列決定することにより、図１に示す全ＤＮＡ配列および関連ア ミノ酸配列が得られた。

２．１２結論 本発明に従って得ることのできる純粋で均質なプロティンＬは、カッパＬ鎖結合 が所望される多くの系の基礎となり得る。それゆえ、プロティンＬは、診断試験 においておよびアッセイにおいて、たとえばカラム上に抗体を固定化するための 試薬として用いることができる。他の使用法は、医薬製剤としておよび該医薬製 剤を調製するための試薬としてのものである。

本発明によるプロティンＬの重要な特質としては、以下の事項が挙げられる。

（１）Ｌ鎖への結合能、すなわちＦｃ−結合ではな（Ｆａｂ−結合（１１）熱安 定性、すなわち少なくとも８０℃で１０分間まで安定（ｉｉｉ）ヒト血清アルブ ミンへの結合能（ｉｖ）約４．６８のｐＫ 本発明による合成免疫グロブリン結合性分子はまた、カッパＬ鎖結合が所望され る多くの系、たとえば試験キット、生化学試薬、プロトコールの基礎となり得る 。加えて、これら合成分子は、アルブミン結合能を実質的に有しないように配列 Ｅ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆｌ、Ｆ２およびＦ３から選ばれる配列が省かれていてよい 。

ττＴＧＧＡｃＡＧτ　Ｇ（ＡＣＧＡＡＡＣＡ　ＡＧＡＡＣＡＣＴＧＡ　ＴＴτ 入ＡＴＡＡＡＴ　ＴＧＧＴＧＡＡＡＴＴ　ＣＧｋＴＴＧＴＴf八　６０ Ｌａｕ　Ｌ＠ｕ　ＧＬｙ　Ａｓｎ ＣＡＡ　ｍ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＡＡＴ　ＡＧＣＡＴＴ　大入Ａ　ＴＧＣ入ＡＡ　 ＡＡＡ　ＴＴＴ　八ＡＡ　ＡＧＧ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　１６２ＡＡＧ　ＡＴＴ　Ａ ＡＴ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＴＡ　ＴＴＡ　ＡＴに　ＣＣＴ　ＧＣＡ　ＣＴＴ　に ＣＡ　ＧＧＡ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＧＴＡ@２Ｓ８ ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　ＧＡＴ　ＴＣＡ　ＧＴＡ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　 ＣＴＡ　ＧＡＡ　にＡＡ　Ｇｋｋ　ＡＴＡ　ＧＡＣＣＡＡ　S０２ ＧＣＡ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＴＴＡ　Ｇ（：Ａ　ＧＡＡ　ＧＣＴ ＡＡＡ　ＧＡＡ＾ＣＡ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＣＡＴ　S５０ ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　 ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＣＡＴ　ＡＴＡ　ＧＡＴ　ＣＡＡ@６４２ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年１１月７日

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に均質および／または完全および／または完全長の形態であることを 特徴とする、プロテインＬと称され免疫グロブリンカッパＬ鎖と複合体を形成す ることのできるポリペプチド。
2. ２．（ｉ）実質的に均質であること、（ｉｉ）完全であること、および（ｉｉｉ ）実質的に完全長の形態であることの特性のうち少なくとも２つの特性を有する 請求項１に記載のポリペプチド。
3. ３．（ｉ）実質的に均質であること、（ｉｉ）完全であること、および（ｉｉｉ ）実質的に完全長の形態であることの特性のうち少なくとも３つの特性を有する 請求項１に記載のポリペプチド。
4. ４．実質的に図１に示すアミノ酸配列を有する、上記請求項のいずれかに記載の ポリペプチド。
5. ５．長さが少なくとも９００アミノ酸である、上記請求項のいずれかに記載のポ リペプチド。
6. ６．長さが少なくとも９５０アミノ酸である、上記請求項のいずれかに記載のポ リペプチド。
7. ７．長さが少なくとも９７５アミノ酸である、上記請求項のいずれかに記載のポ リペプチド。
8. ８．長さが少なくとも９９０アミノ酸である、上記請求項のいずれかに記載のポ リペプチド。
9. ９．長さが少なくとも９９２アミノ酸である、上記請求項のいずれかに記載のポ リペプチド。
10. １０．Ｎ−末端配列Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ の少なくとも７アミノ酸に対応するＮ−末端配列を有する、上記請求項のいずれ かに記載のポリペプチド。
11. １１．Ｎ−末端配列Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｌａの少なくとも１０アミノ酸に対応するＮ−末端配列を有 する、上記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
12. １２．Ｎ−末端配列Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａの少なくと も１５アミノ酸に対応するＮ−末端配列を有する、上記請求項のいずれかに記載 のポリペプチド。
13. １３．Ｎ−末端配列Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　 Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙの少なくとも２０アミノ酸に対応するＮ−末端 配列を有する、上記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
14. １４．図１に示すアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列相同性、好ましくは少 なくとも９０％の配列相同性を有する、上記請求項のいずれかに記載のポリペプ チド。
15. １５．図１に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列相同性、好ましくは少 なくとも９８％の配列相同性を有する、上記請求項のいずれかに記載のポリペプ チド。
16. １６．Ｃ−末端配列Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ の少なくとも７アミノ酸に対応するＣ−末端配列を有する上記請求項のいずれか に記載のポリペプチド。
17. １７．Ｃ−末端配列Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａの少なくとも１０アミノ酸に対応するＣ−末端配列を有 する上記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
18. １８．Ｃ−末端配列Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒの少なくと も１５アミノ酸に対応するＣ−末端配列を有する上記請求項のいずれかに記載の ポリペプチド。
19. １９．Ｃ−末端配列Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　 ＬｙｓＬｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓの少なくとも２０アミノ酸に対応するＣ−末端配 列を有する上記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
20. ２０．シグナル配列が省かれており、該シグナル配列が長さが２０〜３５アミノ 酸、より詳しくは長さが２３〜２７アミノ酸である、上記請求項のいずれかに記 載のポリペプチド。
21. ２１．以下のＮ−末端配列の一つから開始され、Ｌｅｕ（３１５）から図１に示 す配列が続く、請求項２０に記載のポリペプチド。 【配列があります】
22. ２２．以下のＮ−末端配列から開始され、Ｐｈｅ（３４３）から図１に示す配列 が続く、請求項２０に記載のポリペプチド。 【配列があります】．．．
23. ２３．上記請求項のいずれかに記載のポリペプチドをコードする挿入物を有する 組換えＤＮＡ分子。
24. ２４．（ａ）位置２０８のＡＴＧから位置３１８３のＡＡＡまでの図１に示すＤ ＮＡコード配列、および（ｂ）同アミノ酸配列をコードする縮重ＤＮＡ配列から 選ばれる、請求項２３に記載の組換えＤＮＡ分子。
25. ２５．図１のＤＮＡ配列の少なくとも１２塩基の隣接配列からなり、免疫グロブ リン結合性タンパク質をコードする他のＤＮＡ配列の分離のためのプローブとし て有用な組換えＤＮＡ分子。
26. ２６．図１のＤＮＡ配列の少なくとも１５塩基の隣接配列からなり、免疫グロブ リン結合性タンパク質をコードする他のＤＮＡ配列の分離のためのプローブとし て有用な組換えＤＮＡ分子。
27. ２７．図１のＤＮＡ配列の少なくとも１７塩基の隣接配列からなり、免疫グロブ リン結合性タンパク質をコードする他のＤＮＡ配列の分離のためのプローブとし て有用な組換えＤＮＡ分子。
28. ２８．形質転換宿主を培養することからなり、該宿主が、（ａ）請求項２３また は２４に記載のＤＮＡコード配列または（ｂ）請求項２５〜２７のいずれかに記 載のプローブで遺伝子バンクをプローブすることによって単離したＤＮＡコード 配列、を含有する発現ベクターで形質転換されていることを特徴とする、免疫グ ロブリン結合性タンパク質の製造方法。
29. ２９．図１中でそのＮ−末端にてＡ１、Ａ２およびＡ３；Ｂ１およびＢ２；Ｃ１ 、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４；およびＤ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４として分類される 配列から選ばれる複数の認識し得るほどに繰り返された結合性ドメインからなる 、合成免疫グロブリン結合性分子。
30. ３０．２〜１５の該ドメインからなる請求項２９に記載の合成免疫グロブリン結 合性分子。
31. ３１．選ばれた一つまたは複数の該ドメインが、図１中でそのＮ−末端にてＡ１ 、Ａ２およびＡ３；Ｂ１およびＢ２；Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４；およびＤ１ 、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４として分類される配列と同一であるか、または該配列と 少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９ ５％の相同性を有することを条件として該配列から変化したものである、請求項 ２９または３０に記載の合成免疫グロブリン結合性分子。
32. ３２．配列Ｅ１、Ｅ２およびＥ３；およびＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４、または 該配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％、量も好ましくは少な くとも９５％の相同性を有することを条件として該配列から変化した関連配列か ら選ばれるドメインをさらに含む、請求項２９〜３１のいずれかに記載の合成免 疫グロブリン結合性分子。
33. ３３．該ドメインの長さが２０〜４５アミノ酸である請求項２９〜３２のいずれ かに記載の合成免疫グロブリン結合性分子。