JPH07504566A - ペプチドのアルキルエステルの酵素的合成方法，かくして得られる生成物及びかかる生成物の用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチドのアルキルエステルの　Ａ　゛、か　して′　れる　びかかる　の　゛ 本発明は、ペプチドエステルを得ることができるようにする、タンパク質の酵素 的アルコーリシスと呼ばれる酵素による合成方法に関する。本発明は、同様に、 この方法によって得られる生成物、ならびに、農産物加工製品、化粧品、医薬品 及び化学製品における添加剤及び成分としてのこれらの生成物の用途にも関する 。

動物性タンパク質（コラーゲン、カゼイン、ゼラチンなど）及び植物性タンパク 質ならびにそのペプチド誘導体は、それが豊富に存在し有利な特性をもつことか ら、化学産業、農産物加工業、医薬品業界及び化粧品業界にとって優れた原料と なっている。

例えば、国際特許出願明細書ＷＯ−Ａ−９０１０３１２３は、食料品中の脂肪代 用品として利用されるべきタンパク質の微粒子の製造について記載している。こ れらの微粒子は、アルコール媒質中のプロラミンなどの疎水性タンパク質の溶液 を水性媒質に対して添加することによって製造される。タンパク質は、微粒子の 形で沈殿させられる。水性媒質と接触させる前に、タンパク質を酵素による加水 分解に付すことができる。この場合、微粒子は、約ｉ、ｏｏｏダルトンのモル質 量をもつポリペプチドから成る。

化粧品業界では、ペプチド調製物は、その乳化能、保水能、シャンプー用のコン ディショナー効果、及びその柔軟化能のため請求められているものである。利用 されるペプチドは、最も頻繁には１０．０００未満、そしてむしろ５，０００未 満のモル質量を有する、これらは一般に酵素的方法によって得られる。

化粧品における植物性タンパク質の使用は特にめられていることである。

例えば、１０．Ｏ’００未満、好ましくは３，０００〜５，０００の間のモル質 量のグルテンペプチドの利用は、その保水能及びそのコンディショナー効果を理 由として提案された（特開昭６３−２５３０１２）、このようなペプチドは、ア ルカラーゼ、ペプシン又はＡｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒの酸性プロテア ーゼを用いて酵素的加水分解により得られる。

化粧品の利用分野のためには、ペプチドエステルも同様に提案された（特開昭６ ０−０９７０４３、特開昭６０−０９７０４２、特開昭６Ｏ−０８４２０９）。

これらのペプチドエステルは、システィンプロテアーゼ（ＥＣ３，４，２２）を 触媒とした、アミノ酸の脂肪酸エステル又はポリヒドロキシルエステルとペプチ ドの縮合により得られる。

タンパク質誘導体の製造のためにこれまで記載されてぎた方法は、比較的効果的 なものであるものの、それでもい（っかの欠点を呈している。例えば、微生物に よる反応媒質の汚染は、往々にして問題となり、作業条件は微生物の成長に有利 に作用する。その上、水性媒質中での加水分解に際して、生成物のモル質量は制 御が困難であり、反応は往々にして望ましいものより低いモル質量の生成物とい う結果をもたらす。

従って、本発明の方法は、媒質の微生物汚染の危険性を最小限におさえながら、 ペプチド及びペプチドエステルの製造のため、未加工状態でさえ植物性及び動物 性タンパク質に高い価値を生じさせることができる経済的な方法を完成させるこ とを目的として編み出されたものである。

本発明者は、アルコール媒質中で展開し、タンパク質分解性であると同時にエス テル分解性である酵素を触媒とするタンパク質基質の処理方法を完成させた。

ペプチド結合を加水分解するその能力のため知られているいくつかの酵素（ペプ チドヒドロラーゼ、ＥＣ３，４，）のエステラーゼ活性は、水性緩衝液中に低濃 度で存在する合成ペプチド又はアミノ酸のアルキルエステル結合の加水分解の触 媒として作用することができるということを特徴とする。

本発明者は、基質がアルコール媒質中に存在するペプチド又はタンパク質の混合 物であり、一定のｐＨ条件下である場合に、プロテアーゼ活性とエステラーゼ活 性を同時に示すいくつかの酵素がペプチドエステル合成を導くということを確認 した。この酵素は、タンパク質又はペプチドの２つのアミノ酸の間のペプチド結 合を切断するため水の代わりにアルコールを利用するが、又はアミノ酸又はペプ チドのアルキルエステルの加水分解の際にみられる反応とは逆の反応に従ったア ルコールとその末端カルボキシル基とを介してのペプチドの縮合に触媒として作 用することができる。

基質がタンパク質又はペプチドの混合物であり、補基質がアルコールである酵素 反応は、アルコーリシス反応と呼ばれる。。

アルコール媒質中で、かつ一定のｐＨ条件下で、本発明者は、ペプチドエステル の蓄積を観察した。すなわち、エステル合成反応（アルコーリシス反応）と前記 エステルの加水分解反応との間の平衡は、合成反応の方に押された状態にある。

これらの条件下で、アルコールは、基質と溶剤の役目を果たす。

換言すると、アルコールは、エステル形成を担っていると同時に、その分解を妨 げている。

類似の現象は、Ｖｉｄａｌｕｃら　（Ｔｅｔｒａ、ｈｅｄｒｏｎ、　ＶＯｌ、３ ９．　ＮＱ、２．　ｐｐ。

２６９−２７４．１９８３）によってすでに記載された。この論文では、α−キ モトリプシンにより触媒される、アルコール媒質中でのアミノ酸からのアミノ酸 エステル合成について報告されている。従って、複合タンパク質基質からのペプ チドエステル合成については記載されていなかった。実際、エステル分解酵素に より触媒され、その基質が通常率さいサイズのペプチド又はアミノ酸である合成 反応が、タンパク質と複合ポリペプチドから成るタンパク質基質上で行なわれつ る、ということは全（驚（べきことである。

本発明の反応により得られる生成物は、加水分解及びアルコーリシスの同時反応 に由来するペプチドエステルとペプチドの混合物である。この混合物は、従来の 加水分解からのペプチドの特性に類似した特性を呈するが、より顕著な疎水性を 有しており、このことは、多くの工業的利用分野にとって重要な利点を示す。

アルコール媒質は、微生物汚染の危険性を減少させることができ、その上、生成 物のモル質量の制御を可能にする。アルコール媒質は、同様に、植物性タンパク 質の主要アミノ酸であるグルタミンのような基質の優れた化学的安定性をも確保 する。反応は、廉価でしかも容易に入手できる酵素を触媒としている。

より具体的に言うと、本発明は、動物性又は植物性タンパク質基質を、一方では タンパク質又はペプチド上でのエステル分解活性及びタンパク質分解活性を同時 に有する少なくとも１つの酵素と、他方では水に完全に混和できるか又は水中に 少なくとも部分的に溶解可能である少なくとも１つのアルコールと、同時に接触 させることを含むペプチドのアルキルエステルの酵素による合成方法において、 タンパク質基質、酵素及びアルコールの同時接触を、ペプチドのアルキルエステ ル形成を可能にするｐＨにて行なうことを特徴とする合成方法に関する。

アルコーリシス反応は、以下の図式に従って推移する。

Ｒ，−Ｃ−ＮＨ−Ｒ，＋　Ｘ−ＯＨ−Ｒ−Ｃ−ＯＸ−Ｒ，ＮＨ。

タンパク質基質　アルコール　ペプチドエステル本発明において「動物性又は植 物性タンパク質基質」という表現は、タンパク質分解／エステル分解酵素のため の基質の役目を果たすことのできるタンパク質又はポリペプチドのあらゆる供給 源を意味する。動物性タンパク質基質としては、ゼラチン又はゼラチンを含む全 ての物質が好ましい。

植物性タンパク質基質としては、小麦、トウモロコシ、大麦、カラスムギ、米、 ライムギ、ソバ、モロコシ及びライコムギのような穀物の全粒、又は小麦粉又は セモリナのような穀粒を粉砕して得られるあらゆる製品又はその分画に由来する タンパク質を挙げることができる。

タンパク質基質は、必ずしも純粋なものである必要はなく、非りンバク質物質に 関連する複合混合物の形でも使用することができる。タンパク質基質が穀粒の粉 又はその分画から成る場合がそれである。同様に、非タンパク質分画から分離さ れた穀物のタンパク質分画を利用することも可能である。麦のグルテンは、この タイプの基質の一例である。本発明に従うと、例えばグリアジン、ゼイン、ホル デイン及びカフィリン（Ｋａｆｉｒｉｎｅ）のような、「プロラミン」という名 前で知られている疎水性タンパク質を基質として利用することが特に好ましい、 これらのタンパク質は水には不溶性であるが、アルコールには可溶性であり、穀 物粒の主要成分である。例えば小麦グルテンは約４５％のグリアジンを含み、ト ウモロコシのタンパク質分画は約６０％のゼインな含んでいる。

アルコーリシス反応のタンパク質基質は、同様に、ペプチド又はポリペプチド物 質であってもよい。

本発明のこの変形態様に従うと、ペプチド物質は、タンパク質物質の部分的予備 加水分解から得ることができる。この場合、アルコーリシス反応の前に部分的加 水分解工程がある。このときペプチドエステルは、アルコール上でのペプチドの 縮合によって得られる。部分的予備加水分解は、酵素的方法、化学的方法又は熱 による方法によって実施できる。酵素的方法が好ましい。部分的加水分解方法の ためには、後にアルコーリシス反応において利用されるものと同じタンパク質分 解／エステル分解酵素を使用することが有利である。アルコーリシス反応は、か くして単にアルコールを添加し、ｐｔ＋をエステルの安定した形成を可能にする 値に調整することによって開始させることができる。こうして加水分解の程度を 容易に制御することが可能となり、タンパク質基質の完全な加水分解が回避され る。ペプチド基質は、通常、約４，０００〜６，０００ダルトンの平均モル質量 を有する。従って、ここで問題となるのは、平均サイズのポリペプチドである。

あらゆる場合において、この方法の基質は１，０００ダルトン以上の平均モル質 量を有する。

タンパク質基質は、水溶性であってもよいし、アルコールに可溶性であってもよ い。アルコーリシス反応はアルコール媒質の中で行なわれることから、ゼラチン のようなアルコールに不溶性のタンパク質の利用は、不均質な反応媒質を生じさ せる。基質が、約５０％がアルコール可溶性で５０％が水溶性である異なるタン パク質から成るグルテンのような複合基質である場合、反応媒質は多相である。

本発明の方法に従うと、動物性又は植物性タンパク質基質を、ペプチド又はタン パク質に対するエステル分解及びタンパク質分解活性をもつ少なくとも１つの酵 素と接触させる。酵素は、好ましくはプロテアーゼであるか又はカルボキシペプ チダーゼである。それぞれズブチリシン（桿菌種、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ 　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のもの）又はパパイン（パパイヤ乳液由来の もの）を例とするセリン又はシスティンプロテアーゼは、特に好ましい。プロテ アーゼとエステラーゼという二重の活性は、全てのプロテアーゼが有する特性で はない。従って、エステル形成を検出するために以下の試験を応用することによ り、当業者は、本発明の方法に適するものを容易に識別することができる。酵素 は、例えば微生物培養の上清のような酵素の粗混合物の形態のような酵素調製物 の形態であってもよいし、あるいは逆に、その他のあらゆるタイプの酵素活性及 びその他の夾雑物質を含まない精製された形態であってもよい。酵素調製物は、 同様に、−緒に機能できることを条件として、異なる起源のプロテアーゼの混合 物であってもよい。

通常、酵素は遊離形態で利用されるが、シリカのような固体支持体上又は当該技 術分野において既知の球もしくは膜上に、固定化することもできる。酵素の固定 化は、連続的に本発明の方法を実施することを可能にする。

作業条件、特にｐＨは、本発明の方法に従うと、アルコーリシス反応の効率にと ってきわめて重要である。加水分解反応とアルコーリシス反応は、平行して展開 するが、ある種のｐＨ条件下では、エステルは反応媒質中に蓄積しない。しかし ながら、エステル形成が有効であるｐＨの範囲というものが存在する。本発明者 は、同一の酵素について、アルコーリシス反応のために最適なｐＨが、排他的に 水性の媒質において従来行なわれているもののような加水分解反応について最適 なｐＨよりもかなり低いものであることを確認した。例えば、ズブチリシンによ る加水分解反応のための最適なｐＨはｐＨ８前後であり、一方アルコーリシス反 応のための最適なｐＨはｐＨ５前後である。

加水分解反応のための最適なｐＨがおよそ７であるパパインは、ｐＨ５〜７、特 にｐＨ６前後でアルコーリシス反応の触媒として作用する。一般に、エステルの 安定した形成を可能にするため、ｐＨは酸性でな（ではならない。ズブチリシン 及びアルコールとのタンパク質基質の接触は、ｐＨ３〜８、好ましくはｐ１１４ 〜６、例えばｐｏ約５で行なう。

本発明の方法に従うと、当業者は、ペプチドのアルキルエステル形成が得られる ｐＨを能無（決定することができる。以下の例１において記載されるエステル基 の塩基性加水分解による生成物に結合したアルコール量の測定試験を実施するだ けで充分なのである。この測定を、一連の異なるｐＨ値について実施し、か（し てアルキルエステル形成を可能にする値を決定する。本発明においては、有意な ものとみなされる生成物のエステル化率は、少なくとも約１０％である。好まし くは、エステル化率は少な（とも２５％、有利には４０％以上である。

本発明の方法に従うと、アルコーリシスは、タンパク質基質、酵素、及び完全に 水に混和できるか又は水中に少なくとも部分的に溶解しつるアルコールを、同時 に接触させることによって行なう。

このタイプのアルコールの例としては、１〜５個の炭素原子を有する脂肪族アル カノール、例えばメタノール、エタノール、プロパツール、ブタノール及びペン タノールを挙げることができる。

ｎ−プロパツール、ｎ−ブタノール及びｎ−ペンタノールが好ましい。メタノー ル、エタノール及びｎ−プロパツールのような全ての割合で完全に水に混和でき るアルコールが、特に有利である。しかしながら、アルコールが水に対し部分的 に混和可能又は混和不能である場合、アルコーリシス反応の効率は、例えば２− プロパツールのような水にもアルコールにも同時に混和できる別の化合物の存在 によって増大させつる。

本発明の方法により得られる生成物は、加水分解とアルコーリシスの同時反応か らのペプチドエステルとペプチドの混合物である。

この混合物は、種々の鎖長のペプチドエステル及びペプチドの不均質な集団から 成り、エステルのアルキル基は直接アルコールに由来し、従って１〜５個の炭素 原子をもつ。生成物の正確な性質は、一方では基質の性質によって、又他方では 酵素の純度によって影響される。例えば、異なるタンパク質の混合物から成るタ ンパク質基質は、エステルとペプチドの非常に複雑な混合物を生じさせる。同様 にして、その他の酵素活性を呈するその他の酵素により汚染されたプロテアーゼ 又はカルボキシペプチダーゼは、特に基質も同様に純度が低い場合に、生成物中 にその他の化学物質を存在させることになりつる。ペプチドとペプチドエステル の混合物は、エステルが豊富な混合物を得るべ（精製工程に付すことができる。

水中又はアルコール中での生成物の可溶性は試薬によって変化し、常に基質のも のと同じというわけではない。例えば、基質として小麦のグリアジンを利用する と、水溶性のエステルが生じるのに対し、トウモロコシのゼインを利用すると、 アルコールに可溶性のエステルの形成が導かれる。それでも、グリアジン及びゼ インは、両方共アルコールに可溶性である。タンパク質基質が、異なる可溶性を 呈するタンパク質の複合混合物である場合、アルコーリシス反応の生成物は、異 なる溶解度をもつペプチド及びエステルで構成されることになる確率が高い。こ の場合、水溶性又はアルコール可溶性の分画を、生成物のその後の利用に応じて 回収することができる。例λば、化粧品では、水溶性生成物が好まれる。

アルコーリシス反応の持続時間は、タンパク質基質及びアルコールの性質に従っ て２時間から３０時間まで変化する。例えば、グルテンのような複合タンパク質 基質のアルコーリシスは、好ましくは約２４時間展開する。これとは逆に、小麦 のグリアジンのような純粋タンパク質基質は、水に混和するアルコール媒質中で 、わずか２〜６時間後に高いエステル化率を生み出す。反応は、場合によっては 約５０°で３０〜５０分間の加熱と共に、ｐｎを強酸性値に調整することによる 酵素の変性によって停止させる。

アルコーリシス反応は、通常、２０℃〜４５℃の間に含まれる温度、例えば２５ °前後にて展開する。

アルコール濃度は、少なくとも３０％（ｖ／ｖ）　、好ましくは７０％（Ｖ／Ｖ ）以上である。アルコールがエタノールである場合、濃度は９０％（Ｖ／Ｖ）で あることができる。アルコールの濃度があまりにも低すぎる場合、アルコーリシ ス反応は起こり得ず、加水分解反応が支配的となる。

生成物の平均モル質量は、ゲル浸透クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）によって決定 でき、得られたペプチドエステル及びペプチドのサイズを反映する。生成物の平 均モル質量は、タンパク質基質の性質、すなわちタンパク質かペプチドによって 、及び反応時間の長さ及び酵素の濃度によって、変化する。一般に、タンパク質 のアルコーリシスからの生成物の平均モル質量は、ｉｏ、ｏｏｏ未満、例えば６ ，０００〜１０，０００であり、ペプチドのアルコーリシスからの生成物の平均 モル質量は、５，０００未満、例えば３．０００〜５，０００である。あらゆる 場合において、生成物の平均モル質量は、１，０００ダルトンより大きい。従っ て、本発明の反応は、水性媒質での加水分解反応後に得られる平均モル質量より も高い平均モル質量をもつ生成物を、結果としてもたらす。実際、アルコール性 媒質［ｎ−プロパツール、７０％（ｖ／ｖ）　］中で、水溶性であるグルテンの アルコーリシス反応生成物の平均モル質量は、６，２００　（例１）であるのに 対して、水溶性であるグルテンの加水分解反応生成物は４，２００である（例２ ）。ｎ−プロパツール上でのトウモロコシのペプチドの縮合は、平均モル質量４ ．２００のエステル化されたペプチド集団の形成を導（。

本発明の一変形態様に従うと、この方法は、微粒子の形での本発明の生成物の回 収を可能にする補足的な工程を含むことができる。

この変形態様によると、生成物はアルコール性媒質中に可溶性でなくてはならな い。通常、この工程には、水相での生成物の沈殿（アルコール性媒質中で可溶性 ）が含まれている。水相は、有利にも、小さいサイズの粒子の形成を容易にする 少なくとも１つの凝集防止剤を含んでいる。凝集防止剤としては、アラビアゴム 及びカルボキシメチルセルロースのようなゴム及び界面活性剤を挙げることがで きる。凝集防止剤は、水相中に０．２％〜１．０％（重量／体積）の間の濃度で 存在している。微粒子というのは、本発明では、０．２〜１０μ、好ましくは１ μ前後、例えば０．８〜１．２μのサイズをもつ粒子のことである。水溶液中へ のアルコール溶液の導入には、激しい撹拌が伴われる。当然のことながら、生成 物が変性しないようにすることが重要である。

本発明のこの実施態様によって得られた生成物は、ペプチド及びペプチドエステ ルの微粒子の安定した水性分散液である。これらは、農産物加工、医薬品及び化 粧品の利用分野のために利用することができる。脂肪代用品として農産物加工業 界におしＡで本発明の微粒子を利用することは、特に有利であることがわ力）つ てしする。

生成物の特性は、一部には平均モル質量によって左右される。

従って、作業条件及び出発物質は、生成物のその後の用途をこ応して選択するこ とができる。

例えば、脂肪代用品として利用されるべき生成物につし）で（よ、予め部分的に 予備加水分解を行なうことな（タン７（り質基質上で直接アルコーリシス反応を 実施することが有利である。

本発明の生成物は、乳化特性、柔軟化特性及び保水能な有する。

これらの物理的及び化学的特性は、化粧品の中で、乳化剤、被膜升ヨ成剤として 、例えばシャンプー中のコンディショナーとして、柔軟剤として、粘稠剤として 、水分補給剤として、洗浄・起泡ベースとして、又はその地金ての添加剤又は成 分として、有利＝活用される。

本発明の生成物は、同様に、農産物加工業又は医薬品業界におし１て、糊料用成 分又は添加剤として、脂質の代用品として、起泡前１］として、又は乳化剤とし て、利用することもできる。さらに、イヒ学製品の中で、例えば洗剤製品用の湿 潤剤として、乳化剤として、柔軟剤として、被膜形成剤として、及び紡糸剤とし て、本発明の生成物を利用することも可能である。

以下の例により、本発明のさまざまな実施態様を例示する。

叉施困 】：ハ　グルテンのタンパク　のアルコーリシス利用された生命維持に不可欠な 小麦グルテンは、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ社（Ｌｅｓｔｅｒｍ　、フランス）により市 販されている。

３００ｇのグルテンを、１．２４の７０％（ｖ／ｖ）　ｎ−プロパツール中に分 散させる。ｌ　７ｍｍｏｌｅｓのＨＣβを用いて懸濁液のｐｔ＋を５．２に調整 する。食用品質のズブチリシン（Ａｌｃａｌａｓｅ１１２．４Ｌ；ズブチリシン Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）は、Ｎ０ＶＯＮ０ＲＤＩＳＫＲ（Ｆｏｎｔｅｎａｙ　５ｏ ｕｓｂｏｉｓ、フランス）から市販されている。懸濁液に、２４−のズブチリシ ン調製物を添加する。混合物を、穏やかに撹拌しながら２５℃で２４時間インキ ュベートする。

次に、ｌ　１５ｍｍｏｌｅｓのＨ（ｌを用いて混合物のｐｏを３．５に調整し、 ４０分間５０℃に加熱することによって、ズブチリシンを変性させる。

５５℃での蒸発によりｎ−プロパツールを除去し、生成物を水中に懸濁させる（ 水性懸濁液の体積：３．３Ｉ２、ｐＨ＝３．１）。

水性懸濁液のｐ）Ｉを、ｌ　１３ｍｍｏｌｅｓのＮａＯＨを用いて６．０に調整 する。可溶性生成物を遠心分離により収集しく５．０００ｇ、１５分）、０．２ ミクロンのフィルター上で限外ろ過し、凍結乾燥する。不溶物は除去する。

凍結乾燥の後、可溶性生成物の収集量は１１０ｇである。

の゛′ンモル　の゛ 生成物の平均モル質量は、５ｕｐｅｒｏｓｅ１２ＲＨＲ１０／３０力ラムＰｈａ ｒｍａｃｉａＬｌを用いたゲル浸透クロマトグラフィＣＦ、Ｐ、Ｌ、Ｃ）により 決定する。溶出剤は、１５０ｍＭＮａＣｊ２を含むｐ）１７．０の５０ｍＭリン 酸ナトリウム緩衝液である。溶出流量は０．５ｙｄ！／分である。溶出生成物は 、吸収波長を２８０ｎｍに定めた分光光度計を用いて検出する。カラムの較正（ モル質量／溶出時間の対応性）及び合計体積の決定は、Ｐｈａｒｍａｃｉａの技 術文書中に示されているとおりタンパク質モル質量の常用対数を表現することに よって得られる。

アルコーリシス反応後の水溶性グルテン生成物の平均モル質量は、溶出時間又は 溶出体積ｉについて、 −Ｍｉを、較正直線上の溶出時間又は溶出体積ｉで溶出された生成物のモル質量 とし、 −ｈｉを、溶出時間又は溶出体積ｉについてのピークでの高さとして、 という公式を用いて、溶出クロマトグラムに従って計算される。

試料は、溶出緩衝液中に５　ｇ／Ｉ２の濃度に調製し、必要とあらば遠心分離す る。

エステル　の塩　口　に１人したアルコール　のゞ定 試料中に含まれる総アルコールは、生成物に結合したアルコール、そして場合に よっては、蒸発及び凍結乾燥により除去されなかった残留遊離アルコールに相当 する。

従って、生成物に結合したアルコールは、生成物１グラムあたりの総アルコール から生成物１グラムあたりの遊離アルコールを差引いたものに相当する。

血此ヱ止ユニ匹 エッペンドルフ管の中に６７ｍｇの生成物を入れる。０．３７ｎｌの水、次に０ ．３−の２ＮＮａＯＨを添加し、管に栓をする。混合物を撹拌し、常温で２時間 インキュベートする。その後、混合物を、０、：３＋／の２．ＩＮ　Ｈ２ＳＯ４ を用いて酸性化する。混合物を遠心分離し、生成物１グラムあたりの総アルコー ル量を遠心分離上清のＨＰＬＣ分析によって決定する。

星離ヱ及ユニ丑 エッペンドルフ管の中に６７ｍｇの生成物を入れる。０．３−の水、次に０．　 ６１ｎｌの１０ｍＮＨｉ　ＳＯ４を添加し、管に栓をする。

混合物を撹拌し、常温で２時間インキュベートし、遠心分離して、前述のとおり 生成物１グラムあたりの遊離アルコール量を決定する。

Ｐｏ１ｙｐｏｒｅＨカラム（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　Ｌａｂｓ　、　２５０　ｘ　７ ．　Ｏｍｍ、ｌ　０ミクロン）を用いて、ＨＰＬＣによりアルコールを分析する 。溶出剤は、０．３５〜０．７０ｄ／分の流量の１０ｍＮＨ，ＳＯ４水溶液であ る。注入体積は２０パである。検出器は屈折計である。

玉入ヱ土進Ｊ エステル化率は、生成物１グラムあたりの結合アルコールのマイクロモル数を、 生成物１グラムあたりのペプチド及びペプチドエステルのマイクロモル数で除し たものに相当する。

７０％ｖ／ｖ　ｎ−プロパツールの、でのズブチリシンによるグルテンのアルコ ーリシスによって′られた　゛　の、　づけ−ペプチド含有量ニア１％ （Ｋｊｅｌｄａｈｌの方法） −平均モル質量＋６，２００ −　結合ｎ−プロパツール＝２．７ｍｇ／ｇペプチド−エステル化率：２８％ １２：ハ　グルテンのペプチドのアルコーリシス小麦グルテンのペプチドは、ｐ Ｈ＝８でのズブチリシン（アルカラーゼ）による加水分解によって調製した。例 １で記載された条件に従って決定された水溶性ペプチドの平均モル質量は、４， ２００である。

グルテンの加水分解生成物７５ｇを、７０％（ｖ／ｖ）　ｎ−プロパツール０． ７５β中に分散させる。反応媒質のｐｕを、１２０ｍｍｏｌｅｓのＨＣｊ２を用 いて５．１に調整する。懸濁液に、１５−のズブチリシン（Ａｌｃａｓｅ”　２ 　、４　Ｌ　）を添加する。混合物を、穏やかに撹拌しながら２５℃で２０時間 インキュベートする。

次に、８０　ｍｍｏｌｅｓのＨＯ２を用いて混合物のｐＨを３．５に調整し４０ 分間５０℃で加熱することにより、ズブチリシンを変性させる。５５℃での蒸発 によりｎ−プロパツールを除去し、生成物を水中で懸濁状態におく（水性懸濁液 の体積＋０．７５ρ、ｐＨ＝２．９）　。

水性懸濁液のｐＨを、８５　ｍｍｏｌｅｓのＮａＯＨを用いて６．０に調整する 。可２容性生成物を遠心分離により収集し、０．２ミクロンのフィルター上で炉 外ろ過し、凍結乾燥する。不溶物は除去する。凍結乾燥の後、可溶性生成物の収 集量は６１ｇである。

７０％■／ｖ　ｎ−プロパツールの　−　でのズブチリシンによるグルテンペプ チドのアルコ−１シスによって′られた　の、乏すニ ーペプチド含有量：６２％ （Ｋｊｅｌｄａｈｌの方法） −平均モル質量二３，９００ −　結合ｎ−プロパツール：８．２ｍｇ／ｇ−エステル化率：５３％ ３：　ゞ　アルコール　び　１′　アルコールの　でのグＩアジンのアルコ−軍 シス −グリアジン（Ｓｉｇｍａ　Ｇ−３３７５）　：　３０ｇ／４２−　ズブチリシ ン（アルカラーゼ２．４Ｌ＞：２％（ｖ／ｖ）−アルコールニア０％ を含む反応媒質を、ｐＨ＝５（ＨＣｌを用いて調整）で調製し、穏やかに撹拌し ながら２５℃でインキュベートする。インキュベーションの後、ＨＣＱを用いて ｐＨを２に調整することによってズブチリシンを変性させ、アルコールを蒸発さ せ、生成物を水中に懸濁させる。その後、混合物を凍結乾燥し、反応生成物を特 徴づけする。

及よ二述゛、アルコール　び　゛　アルコールの　でのグリアジンのアルコーリ シス （ａ）エステル化率は、第１アルコールについて示されている。

アルコーリシス反応の効率は、脂肪酸鎖の長さが増大した場合、低下する（エタ ノール、プロパツール）。

アルコールが部分的水混和性をもつ（ｎ−ブタノール）か又は水不混和性である （ｎ−ペンタノール）場合、アルコーリシス反応の効率は、水混和性とアルコー ル混和性を同時に有する第３の化合物（例えば２−プロパツール）の存在によっ て増大する。

４：アルコーリシス　店の　・に・　るＨのン使用アルコールとしてはエタノー ル及びｎ−プロパツールだけを用いて、例３に詳述したとおりに反応媒質を調製 し、反応媒質のｐｉｔを、ＨＣｌで５．Ｏ又は７．０に調整する。６時間のイン キュベーションの後、例３で記載したとおりに反応生成物を得、特徴づけしな（ 表２）。

ズブチリシンによるタンパク質の加水分解は、塩基性、すなわちｐＨ７〜１０で 効果的であった。しかしながら、アルコーリシス反応の効率は、反応媒質のｐＨ が酸性である場合に著しく増大することが観察された（ｐＨは特に５．０に調整 されている）。

２：ズブチリシンによるグリアジンのアルコーリシス　店の交皇監亙工玉到五１ １ ５：パパインによるハ　グルテンのタンパク　のアルコーリシス 生命維持に不可欠な小麦グルテン２５０ｇを、７０％（ｖ／ｖ）ｎ−プロパツー ル１．０ρ中に分散させる。懸濁液のｐＨを、ＨＣεを用いて６．０に調整する 。パパイン（６、５０ＯＮＦ　Ｇ１５ｔＢｒｏｃａｄｅｓ、　５ｅｃｌｉｎ、フ ランス）１００ｇ及びシスティン（最終濃度：１０ｍＭ）を懸濁液に添加する。

混合物を、穏やかに撹拌しなから２５℃で２４時間インキュベートする。例１に 記載したとおりに反応生成物を回収する。ｐＨ６，０で可溶性のペプチドの平均 モル質量は５，７００であり、エステル化率は９％に等しい。

１６：ズブチリシンによるゼラチンのアルコーリシス食用ゼラチン（１４０〜１ ６０果粉）２５ｇを、７０％（ｖ／ｖ）ｎ−プロパツール２５〇−中に分散させ る。　ＨＣｌ２　（０，３ｍｍｏｌｅ）を用いてｐＨを５．Ｏに調整する。ズブ チリシン（２，５ｙｄ！のアルカラーゼ２．４Ｌ）を添加し、混合物を穏やかに 撹拌しながら２５℃で２２時間インキュベートする。このとき、１２．５１ｄの ズブチリシン調製物を添加し、混合物を４時間インキュベートする。最後に、１ １　ｍｍｏｌｅｓのＨＣｌ２　（ｐＨ＝３．５）を添加してズブチリシンを変性 させ、混合物を３０分間５０℃に加熱する。アルコールを蒸発させ、水で希釈し た生成物を凍結乾燥する。ｐＨ＝７で水溶性の生成物の平均モル質量は、１２， ０００であり、エステル化率は２９％に等しい。

７：エタノールの　でのズブチリシンによるトウモロコシゼインのアルコーリシ ス　からの　亀　の・　１ゼイン（総合窒素物質：８０．７％　Ｓｉｇｍａ　Ｚ −３６２５）　１０ｇを、９０％（ｖ／ｖ）又は７０％（ｖ／ｖ）でエタノール １０〇−中に可溶化する。Ｈ（ｌを用いて混合物をｐＨ５に調整する。ズブチリ シン（２−のアルカラーゼ２．４Ｌ）を添加し、混合物を２５℃で４８時間イン キュベートする。その後、溶液を紙上でろ過し、次のプロトコールに従って微粒 子を調製する。

−７０℃に維持され、強く撹拌されている１０ｇ／ｇアラビアゴム水溶液０．８ β中に、４−７分の流量で、４０℃に維持されたアルコール溶液（１０Ｃ１ｔｆ ’）を圧送する。アルコール溶液は、水溶液中に沈む直径０．８ｍｍの針を介し て水溶液と接触する、−４℃で少なくとも４時間、微粒子懸濁液をインキュベー トし、紙上でろ過する。

−ろ液中に含まれたアルコールを蒸発させる。

−微粒子を水中懸濁状態で得、凍結乾燥により乾燥させる。

得られた生成物の特徴を表３に示す。

３：エタノール　でのズブチリシンによるトウモロコシゼインのアルコ−１シス 　か　の　１　の＝８：Ｎ−プロパツールの　でのトウモロコシペプチドのアル コーリジス トウモロコシペプチドを例２の方法に従って調製し、次にアルコーリシス反応に 付した。反応媒質及び反応条件は、以下のとおりであったニ ー　トウモロコシペプチド：１００ｇ／ｆ２（モル質量：５，７００） −〇−プロパツール：７０％（ｖ／ｖ）−　アルカラーゼ：２％（ｖ／ｖ） −ｐＨ：５．０ −　温度＝２５℃ −時間：２０時間 縮合生成物は、以下の特徴を有していたニー　モル質量：４，１００ −　エステル化率：５５％ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　４７／４２ 　Ｂ　７４３３−４ＣＩ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．動物性又は植物性タンパク質基質を、一方ではタンパク質又はペプチド上で のエステル分解活性及びタンパク質分解活性を同時に有する少なくとも１つの酵 素と、他方では水に完全に混和できるか又は水中に少なくとも部分的に溶解可能 である少なくとも１つのアルコールとを、同時に接触させることからなるペプチ ドのアルキルエステルの酵素による合成方法において、タンパク質基質、酵素及 びアルコールの同時接触を、ペプチドのアルキルエステル形成を可能にするｐＨ にて行なうことを特徴とする合成方法。
2. ２．タンパク質基質が、小麦、トウモロコシ、大麦、カラスムギ、米、ライムギ 、ソバ、モロコシ及びライコムギのような穀物の全粒、又は小麦粉又はセモリナ のような穀粒を粉砕して得られるあらゆる製品又はその分画に由来する植物性タ ンパク質であることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．タンパク質基質が動物性のものであり、ゼラチンを含むことを特徴とする、 請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．アルコールが、１〜５個の炭素原子を有する脂肪族アルカノール、好ましく はメタノール、エタノール又はｎ−プロパノールであることを特徴とする、請求 の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載の方法。
5. ５．タンパク質又はペプチドに対するエステラーゼ活性をもつ酵素が、プロテア ーゼ又はカルボキシペプチダーゼであることを特徴とする、請求の範囲第１項〜 第４項のいずれか１項記載の方法。
6. ６．酵素が、セリンプロテアーゼ又はシステインプロテアーゼ、例えばズブチリ シン又はパパインであることを特徴とする、請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．プロテアーゼがズブチリシンであることを特徴とする、請求の範囲第６項記 載の方法。
8. ８．ズブチリシン及びアルコールとのタンパク質基質との接触を、ｐＨ３〜８、 好ましくはｐＨ４〜６、例えばｐＨ約５で行なうことを特徴とする、請求の範囲 第７項記載の方法。
9. ９．プロテアーゼがパパインであることを特徴とする、請求の範囲第６項記載の 方法。
10. １０．接触を、約ｐＨ５〜７の間で行なうことを特徴とする、請求の範囲第９項 記載の方法。
11. １１．アルコールの濃度が、少なくとも３０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくと も７０％（ｖ／ｖ）、例えば７０％〜９０％の間であることを特徴とする、請求 の範囲第１項〜第１０項のいずれか１項記載の方法。
12. １２．アルコーリシス反応の前に、タンパク質基質の部分的加水分解反応工程、 好ましくは、プロテアーゼ特にアルコーリシスで使用されるものと同じプロテア ーゼと基質との接触を実施することを特徴とする、請求の範囲第１項〜第１１項 のいずれか１項記載の方法。
13. １３．微粒子の形成を可能にする工程、例えば水相におけるアルコール媒質に可 溶性の生成物の沈殿をさらに含むことを特徴とする、請求の範囲第２項又は第４ 項〜第１２項のいずれか１項記載の方法。
14. １４．請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか１項記載の方法により得られる、 ペプチドとペプチドのアルキルエステルとの混合物。
15. １５．少なくとも２５％、好ましくは４０％以上のエステル化率を有する、請求 の範囲第１３項記載の混合物。
16. １６．請求の範囲第１３項記載の方法によって得られた微粒子。
17. １７．０．２μ〜１０μのサイズを有する、請求の範囲第１６項記載の微粒子。
18. １８．乳化剤として、被膜形成剤として例えばシャンプー用コンディショナーと して、柔軟剤として、粘稠剤として、水分補給剤として、洗浄・起泡ペースとし て、又は化粧品中のその他のあらゆる添加剤又は成分としての、請求の範囲第１ ４項又は第１５項のいずれか１項記載の混合物の用途。
19. １９．糊料用成分又は添加剤として、起泡剤として、脂肪の代用品として、又は 乳化剤としての、農産物加工業又は医薬品産業における、請求の範囲第１４項又 は第１５項のいずれか１項記載の混合物の用途。
20. ２０．例えば洗剤用の湿潤剤として、乳化剤として、柔軟剤として、被膜形成剤 として、及び紡糸剤としての、化学工業における、請求の範囲第１４項又は第１ ５項のいずれか１項記載の混合物の用途。
21. ２１．脂肪の代用品としての、請求の範囲第１６項記載の微粒子の用途。