JPH0734753B2 - 組換え宿主細胞から得られる組換えｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質の安定化方法 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】

【０００１】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡはいく
つかのオープンリーディングフレームを含み、その１つ
はｅｎｖ遺伝子である。この遺伝子は３種の密接に関連
したタンパク質：preＳ１＋preＳ２＋Ｓ、preＳ２＋Ｓ
及びＳをそれらの各々５'-３'遺伝子順序でコードし、
それらは構造エンベロープ、即ち表面（“Ｓ”）タンパ
ク質を含んでいる。包括的に、preＳ１＋ preＳ２＋
Ｓ、preＳ２＋Ｓ及びＳタンパク質はＢ型肝炎ウイルス
表面タンパク質と称される。 preＳ２＋Ｓ及びＳタンパ
ク質は集合して２２ナノメーター（２２ｎｍ）粒子又は
オーストラリア抗原として知られる構造をとることがで
きる。２２ｎｍ粒子は異るＳタンパク質の組合わせから
なるか又は均質に１種のＳタンパク質からなる。すべて
のＳ関連タンパク質は完全ＨＢＶビリオン中にみとめら
れる。

【０００２】組換えＤＮＡ技術の適用により、Ｓタンパ
ク質をコードするＤＮＡは様々な宿主細胞（例えば大腸
菌、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞培養物）内に導入する
ことができ、preＳ１＋ preＳ２＋Ｓ、preＳ２＋Ｓ及び
Ｓタンパク質を合成した後にpreＳ２＋Ｓ及びＳタンパ
ク質から２２ｎｍ粒子を形成しうることが証明された。
これら３種の形態のＳタンパク質は全てインビボで免疫
原性であることが知られ、これらのＳタンパク質に対す
る抗体は保護的であって、 preＳ２＋Ｓタンパク質は p
reＳ２領域があるので免疫優性である。 perＳ２領域は
ウイルス複製過程に際して細胞膜との相互作用配列とし
て機能する。

【０００３】酵母細胞におけるpreＳ２＋Ｓタンパク質
の発現は、preＳ２＋Ｓタンパク質が酵母細胞膜と相互
作用すること、 preＳ２＋Ｓタンパク質の精製がこの性
質により容易になることを証明した。

【０００４】現在、実質上純粋な膜結合 preＳ２＋Ｓタ
ンパク質を精製する方法がある。この方法はいくつかの
欠点、即ちａ）精製経路の初期段階における相当量の酵
母タンパク質の混入、ｂ）高レベルの混入酵母プロテア
ーゼによる preＳ２＋Ｓタンパク質の分解、ｃ） preＳ
２＋Ｓタンパク質の分解を阻止するためのプロテアーゼ
阻害剤の添加（及びしかる後の除去）及びｄ）上記ファ
クターの積み重ねによる生成物収率低下、などがある。
加えて、こうして精製されたこのタンパク質はＨＢＶ感
染の予防用ワクチンとしてヒトに用いられている。

【０００５】組換えタンパク質は天然又は古典的形とし
ては通常典型的でない形で提供されるため、どんな精製
方法が組換えタンパク質にとり有用であるかは予想でき
ない。この理由から、組換えタンパク質では既知操作の
新規組合わせ又は全く新しい精製方法を要することが多
い。加えて、ヒト用のワクチン製剤では極端な純度を必
要とするが、これは精製経路の結果に関して非常に大き
な非予測性を生じる。

【０００６】組換え宿主細胞から組換えＢ型肝炎ウイル
ス表面タンパク質を実質上精製する方法を提供すること
が本発明の目的である。本発明のもう１つの目的は精製
中にプロテアーゼ阻害剤を導入する必要性を解消したＢ
型肝炎ウイルス表面タンパク質の精製方法を提供するこ
とである。本発明のもう１つの目的は更に安定な表面タ
ンパク質産物を得る組換え宿主細胞からの組換えＢ型肝
炎ウイルス表面タンパク質の精製方法を提供することで
ある。本発明のこれらの及び他の目的は以下の記載から
明らかになるであろう。

【０００７】本発明を要約すると： ａ）組換え表面タンパク質を発現する全細胞を中性pＨ
緩衝液中で熱処理する； ｂ）熱処理された細胞（ａ）
を破壊して粗抽出物を得る； ｃ）界面活性剤の存在下でｉ）遠心又はii）精密濾過に
より熱処理抽出物（ｂ）から砕片を除去して、熱処理さ
れた清澄化抽出物を得る； ｄ）熱処理された抽出物（ｃ）の濃縮及び透析濾過； ｅ）ステップ（ｄ）の生成物を界面活性剤を吸着する樹
脂と接触させることにより加えられた界面活性剤を除去
してかつ表面タンパク質から混入宿主細胞タンパク質を
分離させ、しかる後表面タンパク質を吸着及び保持する
が混入タンパク質は吸着しない広孔シリカと接触させ
る； ｆ）広孔シリカから吸着された表面タンパク質を溶出さ
せる； ｇ）更に低分子量不純物を除去して最終生成物を濃縮す
るため（ｆ）の溶出液を透析濾過に付し、実質上精製さ
れた表面タンパク質を得る； ステップからなる、組換え宿主細胞からの組換えＢ型肝
炎ウイルス表面タンパク質の精製方法を提供する。

【０００８】以下本発明を詳細に説明する。本発明のプ
ロセスは組換え宿主細胞抽出物から組換えＢ型肝炎ウイ
ルス表面タンパク質を精製する方法に関する。これらの
方法では中性ｐＨ及び高温において全細胞の混合的処理
を行う。

【０００９】本発明の新規精製プロセスは、タンパク質
がヒトもしくは動物血清由来であるか又は組換え生物由
来であるかにかかわらず、Ｓ、 preＳ１＋ preＳ２＋Ｓ
及びpre Ｓ２＋Ｓタンパク質を含めた広範囲のＢ型肝炎
ウイルス表面タンパク質又はその部分に適用しうると解
釈される。様々な組換え宿主細胞種が本発明の方法に包
含されることも理解される。包括的に、preＳ１＋ pre
Ｓ２＋Ｓ、preＳ２＋Ｓ及びＳタンパク質はＢ型肝炎ウ
イルス表面タンパク質と称される。Ｓ、 preＳ１＋ pre
Ｓ２＋Ｓ及び preＳ２＋Ｓの全部又は一部を含む融合タ
ンパク質並びに組換え宿主細胞で同時に産生される多く
の形のＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質も含まれる。

【００１０】１つの主要な例は酵母細胞で産生される組
換え preＳ２＋Ｓタンパク質である。この酵母発現系は
preＳ２＋Ｓアミノ酸配列を産生する。もう１つの例は
酵母細胞で産生される組換えＳタンパク質である。その
他Ｓタンパク質の変異アミノ酸配列の精製プロセスも本
発明に包含される。本発明のプロセスは本発明の原則に
従いＳタンパク質変異体並びに preＳ１＋ preＳ２＋Ｓ
及び preＳ２＋Ｓ変異体とそれらの各融合タンパク質を
含めてあらゆるＳタンパク質又はＳ融合タンパク質を精
製する迅速かつ効率的な方法を提供するように考案され
ている。例えば、preＳ１＋preＳ２＋Ｓアミノ酸配列に
おける保存的置換［テイラー，Ｗ．Ｒ.,ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー，第１８８巻，第２３
３頁，１９８６年（Ｔaylor, Ｗ. Ｒ.， Ｊ, Ｍol. Ｂi
ol. １８８：２３３（１９８６））の表１で示すように
定義される］は通常本発明の原則及び実施にいかなる実
質的又は新規な変更も加えない。Ｓ抗原の保存的置換は
公知である；エルファシー，Ｅ．ら，ジャーナル・オブ
・セオレティカル・バイオロジー，第１２１巻，第３７
１頁，１９８６年［Ｅlfassi, Ｅ. et al., J. Theor,
Biol. １２１：３７１（１９８６）］参照。加えて、
Ｓ、preＳ１又はpreＳ２＋Ｓ領域内における欠失も通常
ここで記載された精製プロセスに変更を加える必要はな
い。本出願における組換えＳタンパク質もしくは表面抗
原又は組換えpreＳ１＋preＳ２＋Ｓタンパク質もしくは
preＳ２＋Ｓタンパク質又はそれらの一部は、保存的ア
ミノ酸置換であれ、欠失又は他のプロセスによるもので
あれ、アミノ酸配列のこのようなあらゆるバリエーショ
ンを含むと理解すべきであるが、その組換えＳタンパク
質、表面抗原、組換え preＳ１＋Ｓ２＋Ｓタンパク質又
はそれらの一部は preＳ１＋Ｓ２＋Ｓタンパク質もしく
はその一部、２２ｎｍ粒子、オーストラリア抗原又は他
の天然形のＨＢＶ表面抗原配列に特異的な抗体と免疫化
学的に反応性でなければならない。

【００１１】多くの酵母系発現系は組換えｐｒｅＳ２＋
Ｓ、Ｓ及びＳ関連タンパク質の供給源として明らかに適
している。サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓaccharom
ycescerevisiae）の発現系を主要源と考えるものではな
い。他の酵母ベクターとしては格別限定されず、シャト
ルベクター、コスミドプラスミド、キメラプラスミド及
び２ミクロン環状プラスミド由来配列を有したものがあ
る。

【００１２】サッカロミセス属は様々な種からなる。
Ｓ．セレビシアエ即ちパン酵母が様々な外来ポリペプチ
ドの組換えＤＮＡ媒介発現用の宿主として最も普通に用
いられる。しかしながら、サッカロミセス属の他の種間
における区別は必ずしも充分に定義されているわけでは
ない。これらの種の多くはＳ．セレビシアエと交差接合
することができ、Ｓ．セレビシアエの場合と類似した又
は同一の調節プロモーター並びに他の転写及び翻訳調節
要素を有しているらしい。したがって、Ｓ関連ポリペプ
チドの発現に関する宿主の選択が格別限定されずにカー
ルスベルゲンシス（carlsbergensis）、ウバラム（uvar
um）、ロウキシイ（rouxii）、モンタナス（montanu
s）、クルイベリ（kluyveri）、エロングルグソラス（el
ongrgsorus）、ノルベンシス（norbensis）、オビフォ
ルミス（oviformis）及びジアスタチクス（diastaticu
s）を 含めたサッカロミセス属の他の種にも拡張しうる
ことは当業者にとり明らかであろう。

【００１３】デーン粒子（血清型ａｄｗ）がウイルスオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）単離用のＨＢＶ
核酸源として利用された。この操作がウイルス遺伝子多
様性に基づき他の血清学的反応性を有したＨＢＶ株から
の核酸の使用にも拡張しうることは当業者にとり明らか
である。内在ポリメラーゼ反応はＨＢビリオン中に天然
で存在するニック及びギャップ形成核酸形からＨＢＶゲ
ノムの共有結合閉環二本鎖ＤＮＡを得るために用いられ
た。ＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩで完全に切断し、ｐＢ
Ｒ３２２のＥｃｏＲＩ部位に組込んでクローニングして
ｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１を得た。 preＳ領域のＥｃｏＲＩ
部位で環状変換形のＨＢＶゲノムを組込んだ組換えプラ
スミドが選択された。 preＳ２領域の５５アミノ酸（ａ
ａ）及びＳ領域の２２６ａａをコードする完全ＯＲＦ
は、まずＥｃｏＲ Ｉ及びＡｃｃ ＩでｐＨＢＶ／ＡＤＷ
−１を切断して得られた０．８キロ塩基対（ｋｂｐ）断
片を精製して組立てられたが、この断片は開始コドン、
アミノ末端３ａａ、カルボキシ末端３ａａ及び翻訳終結
コドンのみを欠いた preＳ２＋Ｓポリペプチドをコード
している。

【００１４】オリゴヌクレオチドを合成し、この断片に
結合させて、１０ｂｐ酵母由来非翻訳５’フランキング
配列及び完全 preＳ２＋Ｓ ＯＲＦを含むＨｉｎｄ III
断片に変換した。preＳ２＋Ｓ ＯＲＦの３’側における
配列は、終結コドンがＡＤＨ１転写ターミネーターにお
ける天然Ｈｉｎｄ III 部位に直接隣接し、このためい
かなる付加的介在塩基もなく完全な天然酵母由来結合を
形成するように選択した。 preＳ２＋Ｓの発現にとり適
切であればいかなる酵母活性転写ターミネーターもＡＤ
Ｈ １の代わりに用いうることは当業者にとり明らかで
ある。

【００１５】構築のための５’フランキング配列（ＡＣ
ＡＡＡＡＣＡＡＡＡ）は酵母遺伝子ＧＡＰ６３（ＧＡ
Ｐ）の非翻訳リーダー（ＮＴＬ）と対応するように選択
されたが［ホランド，ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー，第２２５巻，第２５９６頁，１９８
０年（Ｈolland， Ｊ. Ｂiol. Ｃhem., ２２５，２５９
６（１９８０））］、これはＧＡＰ遺伝子群におけるコ
ンセンサス配列でもある。その組立てはいかなる付加的
塩基の介在もなしにＮＴＬをpreＳ２＋Ｓ ＯＲＦの開始
コドンに直接隣接させるように行われた。したがって、
エンベロープポリペプチドの発現に関するＮＴＬ配列の
選択が適切な発現レベルを生じる他の配列にも拡張され
ることは当業者にとり明らかである。

【００１６】ＤＮＡ配列分析から２塩基が置換されてお
り、ｐＨＢ preＳＧＡＰ３４７／１９ＴのＤＮＡでコー
ドされる preＳ２＋Ｓ配列［バレンズエラら，バイオテ
クノロジー，第３巻，第４号，第３１７−３２０頁，１
９８５年（Valenzuela et al., Biotechnology, ３
（４），３１７−３２０（１９８５））］とａａ相違を
生じることが示された。双方の組立てに関して同一のポ
リペプチドで評価するため、ＨＢＶpreＳ２＋Ｓの８４
６ｂｐ ＯＲＦの塩基６４がＣからＴになり（Ｌｅｕで
はなくｐｈｅをコードする）塩基３５２がＡからＣに代
わった（ＧｌｎではなくＨｉｓをコードする）これらの
ヌクレオチド置換を部位特定変異誘発により変異させた
［ゾラーら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１
０巻，第６４８７−６５００頁，１９８２年（Ｚoller
et al., Ｎucleic Ａcids Ｒesearch,１０：６４８７−
６５００（１９８２））］。次いで最適の構築用にコー
ド化されたａａ配列が確認された。本発明がこの配列に
限定されず、ＤＮＡがＨＢＶ抗原性を有するポリペプチ
ドをコードするあらゆる配列に拡張されうることは当業
者にとり明らかである。

【００１７】変異誘発後、前記の断片を用い、（ａ）約
１.１ ｋｂｐのＧＡＰ４９１プロモーター、（ｂ）１０
ｂｐの酵母由来隣接配列、（ｃ）ウイルス隣接配列は全
く有さない８４６塩基対のＨＢＶ preＳ２＋Ｓ遺伝子
（血清型ａｄｗ）及び（ｄ）約０．４ｋｂｐの酵母ＡＤ
Ｈ１ターミネーターから構成される、ニスカーンらによ
り記載されたような［ニスカーンら，ジーン，第４６
巻，第１３５−１４１頁，１９８６年（Kniskern et a
l., Gene, ４６：１３５−１４１（１９８６）)］発現
カセットを組立てた。この発現カセットを酵母シャトル
ベクターｐＣ １/１［ベッグス，ネーチャー，第２７５
巻，第１０４頁，１９７８年（Ｂeggs, Ｎature, ２７
５：１０４（１９７８））；ローゼンバーグ（Rosenber
g）ら、ネーチャー，第３１２巻，第７７頁，１９８４
年］に挿入してプラスミドｐＹＧ preＳ２Ｓ−１を得、
これを用いて酵母株ＣＦ４２を形質転換させて以下ｐＦ
４０３と称される形質転換株を得た。この形質転換株は
評価及びその後の実験のため凍結ストックとして保存し
た。親株ＣＦ４２は下記のようにして得られた：酵母株
２１５０−２−３［Ｌ．ハートウェル（Ｌ. Ｈartwel
l）、ワシントン大学］の 自然ｕｒａ３変異が選択され
た［ベークら，モレキュラー・アンド・ゼネラル・ジェ
ネティクス，第１９７巻，第３４５−３４６頁，１９８
４年（Ｂoeke et al., Ｍol. Ｇen. Ｇenet., １９
７：３４５−３４６（１９８４））］。 得られた株
（ＭＡＴａ、ａｄｅｌ^-、lｅｕ２−０４^-、ｕｒａ３^-、
ｃｉｒ°）はプラスミドＹＣｐ５０−ＨＯで形質転換し
て二倍体化した［ジェンセンら、プロシーディング・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳ
Ａ，第８０巻，第３０３５-３０３９頁，１９８３年（J
ensen et al., Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，８０：３０３
５−３０３９（１９８３））］。機能性酵母遺伝子ＨＯ
は細胞において接合型を転換させることができる。この
ため、単一細胞形質転換株からの子孫はａ及びａ接合型
双方の混合物であり、コロニー増殖中に接合する。二倍
体クローン単離株からそのプラスミドを除去し、ＣＦ４
２（ＭＡＴａ／ａ、ａｄｅ１^-、ｌｅｕ２−０４^-、ｕｒ
ａ３^-）と命名した。これらの形質転換株は評価及びそ
の後の実験のため凍結ストックとした。

【００１８】ｐＦ４０３凍結ストックからの組換え酵母
はＹＥＨＤ培地で増殖させた［カーティら，ジャーナル
・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー，第
２巻，第１１７−１２１頁，１９８７年（Ｃarty et a
l., J. Industrial Micro.,２，１１７−１２１（１９
８７））］。定常期まで増殖させた後、酵母細胞を回収
した。溶菌液を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分
離して、ＨＢｓＡｇに対する抗体と免疫ブロットを行っ
た。２つの主なポリペプチドが、preＳ２＋Ｓ ＯＲＦの
翻訳産物及びそのグリコシル化誘導体の予想分子量と一
致する約３０ＫＤ及び３４ＫＤの分子量を有していた。
高グリコシル化種の群に相当しかつ抗酵母及び抗ＨＢｓ
血清と免疫反応するもう１つの多分散（分子量約５０Ｋ
Ｄ）糖ペプチドハンドも検出された。更に、組換え酵母
の溶菌液はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で preＳ２
＋Ｓに関して陽性であったが、親株では認められなかっ
た。部分的精製酵母溶菌液を電子顕微鏡観察すると、高
密度の典型的２２ｎｍ preＳ２＋Ｓ粒子が認められた。

【００１９】酵母由来プロモーターはpreＳ２＋Ｓ遺伝
子の転写を開始させる。したがって、いかなる酵母活性
プロモーター配列もＧＡＰ４９１プロモーターの代わり
になりうることは当業者にとって容易に明らかである。
最大収率を達成するための培養物回収時間を最適化する
ように、適切なアッセイ系、例えば免疫ブロット、ＲＩ
Ａ又は酵素結合免疫アッセイ（ＥＩＡ）をこの系におけ
る preＳ２＋Ｓポリペプチドの発現を調べるのに利用す
ることも当業者にとり容易に明らかである。

【００２０】ＧＡＰ４９１プロモーターはＨＢｓＡｇを
含めたいくつかの外来タンパク質の酵母内発現にとり有
用であった［ビッター（Bitter）ら，ジーン，第３２
巻，第２６３-２７４頁，１９８４年；ワンプラー（Wam
pler）ら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８２巻，第６８３
０−６８３４頁，１９８５年］。可溶性酵母タンパク質
の約４０％までＨＢｃＡｇが発現された我々の以前の結
果に基づき（ニスカーンら，前掲）、我々は適切な酵母
宿主細胞で preＳ２＋Ｓ抗原を発現させるためにこのプ
ロモーターを用いた。

【００２１】組換え酵母発現 preＳ２＋Ｓタンパク質の
グリコシル化をコントロール及び規定するために、前記
発現カセットを含んだ酵母発現プラスミド（ｐＹＧ pre
Ｓ２Ｓ−１）を用い、下記のように組立てられたＳ．セ
レビシアエ株ＫＨＹ−１０７（ｃｉｒ⁺、ａｄｅ １⁺、
ｌｅｕ２^-、ｍｎｎ９^-）を形質転換した。

【００２２】ａ接合型株ＣＺ５／ＬＢ３４７−１Ｃ（ｍ
ｎｎ９^-、ＳＵＣＺ^-）［Ｃ．バロー（Ｃ. Ｂallou）、カ
リフォルニア大学］をＹＥＨＤ寒天プレート上で株を混
ぜることによりａ型株２１５０−２−３（ｌｅｕ２^-、
ａｄｅ１^-）（Ｌ．ハートウェル、ワシントン大学）と
接合させた（カーティら，前掲）。二倍体を選択するた
め、接合した株は唯一の炭素源として２％スクロースを
含有した無ロイシン（ｌｅｕ^-）の 最少培地上にレプリ
カ培養された。単一コロニーを単離した後、二倍体に胞
子形成させ、子嚢を標準技術で切開した。ＫＨＹ−１０
７株は単一胞子として単離され、（シッフ染色技術によ
り）ｃｉｒ⁺、ａｄｅ １⁺、ｌｅｕ２^-及びｍｎｎ９^-と
して特徴付けられた。形質転換されたクローンを１Ｍソ
ルビトール含有の最少培地（ｌeｕ^-）上で選択した。こ
れらのクローン化形質転換株は後の評価及び次の実験の
ため１７％グリセロール中で凍結ストックとして確立さ
れた。

【００２３】発現プラスミドｐＹＧ preＳ２Ｓ−１もＫ
ＨＹ-１０７（ｃｉｒ°、ａｄｅ１⁺、ｌｅｕ２^-、ｍｎｎ
９^-）を形質転換するために用いられたが、これは［ブ
ローチ，Ｇ．Ｒ．, 「メソッド イン エンザイモロジ
ー」第１０１巻，パートＣ，第３０７-３２５頁，１９
８７年，アカデミックプレス，ニューヨーク（Broach,
G. R,“Methods in Enzymology”，Ｖol．１０１，ｐａ
ｒｔ Ｃ，ｐｇ．３０７−３２５，１９８７，Ａcademic
Ｐress, Ｎ. Ｙ.）］記載のように 株ＫＨＹ−１０７
（ｃｉｒ⁺、ａｄｅ１⁺、ｌｅｕ２^-、ｍｎｎ９^-）から誘
導されたものである。形質転換されたクローン単離物は
後の評価及び次の実験のため１７％グリセロール中で凍
結ストックとして確立した。

【００２４】発現プラスミドｐＹＧ ｐｒｅ Ｓ２Ｓ−１
含有形質転換酵母［ＫＨＹ−１０７（ｃｉｒ⁺、ａｄｅ
１⁺、ｌｅｕ２^-、ｍｎｎ９^-）］のクローンは１Ｍソル
ビトール含有ｌeｕ^-選択寒天プレート上で、３０℃で２
〜３日間インキュベートされた。これらの酵母を１Ｍソ
ルビトール含有複合ＹＥＨＤ（カーティら，前掲）培地
の５〜７ｍｌ培養中に接種し、通気下３０℃で１２〜１
８時間インキュベートした。１Ｍソルビトール含有５０
ｍｌ複合ＹＥＨＤ培地（以下、ＹＥＨＤＳと称される）
を含むフラスコに上記培養物を（初期Ａ₆₀₀約0.1まで）
接種し、振盪下（３５０ｒｐｍ）３０℃で４８〜７２時
間にわたり最終Ａ₆₀₀ １０〜１６までインキュベートし
た。１０Ａ₆₀₀ 単位のサンプルをチューブに分注し、酵
母細胞を２０００ｘｇで１０分間かけてペレット化し
た。サンプルはそのまま分析するか又は−７０℃で凍結
貯蔵した。アッセイ時には、そのペレットは２ｍＭフェ
ニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）含有リン
酸緩衝液（ＰＢＳ）０．４ｍｌに再懸濁され、１.５ｍ
ｌエッペンドルフチューブに移された。酵母細胞は、
１）洗浄したガラスビーズ（０．４５ｍｍ）２００〜３
００ｍｇを加えて渦巻式ミキサーで１５分間攪拌、２）
トリトンＸ−１００を０．５％になるよう添加、３）渦
巻式ミキサーで２分間攪拌、４）４℃で１０分間インキ
ュベートすることにより破壊された。細胞砕片及びガラ
スビーズは２０００ｘｇで１０分間の遠心により除去さ
れた。清澄化された上澄液をとり、蛋白量［ローリー（L
owry）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー，第１９３巻，第２６５頁，１９５１年］及び p
reＳ２＋Ｓに特異的なＲＩＡ［ハンソンら，インフェク
ション・アンド・イムノロジー，第２６巻，第１２５−
１３０頁，１９７９年（Hanssonet al., Infect. Immun
ol.２６：１２５−１３０（１９７９））；マチダら，
ガストロエンテロロジー（Ｇastroenterology），第８
６巻，第９１０−９１８頁，１９８４年］の分析を行っ
た。

【００２５】５つのクローンが並行して評価され、参照
として１．０の値に標準化されたクローンｐＦ４０３か
らの相当細胞ペレットと比較された。５つのクローンの
抗原産生力の典型的な相対値は、実施例７に示す。

【００２６】発現プラスミド含有形質転換酵母［ＫＨＹ
−１０７（ｃｉｒ°、ａｄｅ １⁺、ｌeｕ２^-、ｍｎｎ９
^-）］のクローンを１Ｍソルビトール含有ｌｅｕ^-選択寒
天プレート上で、３０℃で２〜３日間インキュベートし
た。これらの酵母を複合ＹＥＨＤＳ培地の５〜７ｍｌ培
養中に接種し、通気下３０℃で１２〜１８時間インキュ
ベートした。５０ｍｌ複合ＹＥＨＤＳ培地含有フラスコ
に上記培養物を（初期Ａ₆₀₀が０.１になるよう）接種
し、振盪下（３５０ｒｐｍ）３０℃で４８〜７２時間に
わたり最終Ａ₆₀₀１０〜１６までインキュベートした。
１０Ａ₆₀₀単位のサンプルを３連のチューブに分注し、
酵母細胞を２０００ｘｇで１０分間ペレット化した。サ
ンプルは前記のように直接分析されるか又は−７０℃で
凍結貯蔵された。 ５つのクローンが並行して評価さ
れ、参照として１．０の値に標準化されたクローンｐＦ
４０３と比較された。５つのクローンに関する抗原産生
力の典型的相対値は実施例８で示すようであった。

【００２７】ｍｎｎ９表現型の宿主細胞における前記す
べての組換えクローンから得られたpre Ｓ２＋Ｓポリペ
プチドの免疫ブロット分析では、見かけの分子量３０Ｋ
Ｄ及び３４ｋＤを有する２つのバンドが認められた。多
分散（５０ｋＤ以上の分子量）高グリコシル化種は抗酵
母又は抗ＨＢｓ血清のいずれでも検出されなかった。

【００２８】発現されるタンパク質の固有的性質がＨＢ
Ｓ preＳ２＋Ｓのグリコシル化の調節を規定する発現ベ
クターを提供するため、preＳ２＋Ｓ ＯＲＦ内のＮ結合
グリコシル化に関する認識配列［Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ］
を変異させた。クローンｐＵＣ１３ preＳ２Ｓをこの組
立てに関する出発物質として用いた。

【００２９】preＳ２＋Ｓ ＯＲＦの５’部分を再組立て
するため、ＢａｍＨＩからＡＴＧ上流の１０ｂｐ ＮＴ
Ｌ及びＨｉｎｄ III部位を経てＥｃｏＲ Ｉ適合末端に
至るＯＲＦを再組立てする一対のオリゴヌクレオチドが
合成された。塩基３１におけるＡからＣへの変異及び塩
基３３におけるＴからＡへの変異を含み、その結果Ｓ２
タンパク質ドメインの４位においてＡｓｎからＧｌｎに
ａａ変化を生じるこのオリゴヌクレオチドの配列は下記
のとおりである：

【化１】 この合成オリゴヌクレオチド対をＥｃｏＲ Ｉ及びＢａ
ｍＨ Ｉで予め切断されたｐＵＣ１９に結合させた。得
られたプラスミドをＢａｍＨ Ｉ及びＳａｌ Ｉで切断
し、しかる後ｐＵＣ１３ preＳ２Ｓから切断及び精製さ
れた０．８ｋｂｐのＢａｍＨ Ｉ−Ｓａｌ Ｉ断片と結合
して、プラスミドｐＵＣ１９ preＳ２ＳＷＧ−１を得た
が、これはＨｉｎｄ III断片として４位がＡｓｎからＧ
ｌｎに代わったpreＳ２＋Ｓ ＯＲＦを含有している。こ
のＯＲＦは前記と同様にして酵母発現ベクターを得るた
めに用いられた。

【００３０】同様にして０．８ｋｂｐ Ｈｉｎｄ III断
片がｐＵＣ１３ preＳ２Ｓから単離され、ＥｃｏＲ Ｉ
及びＢａｍＨ Ｉ部位が予め破壊されたｐＵＣ１９ベク
ターに結合された。得られたベクターをＥｃｏＲ Ｉ及
びＢａｍＨ Ｉで切断し、一対の合成オリゴヌクレオチ
ドと結合させたが、このオリゴヌクレオチドは preＳ２
ドメインのアミノ酸＋６位でＴｈｒからＡｌａへのアミ
ノ酸変換をもたらすオリゴヌクレオチドの塩基＋７位に
おけるＡからＧへの変異を有し、ＥｃｏＲＩからＢａｍ
Ｈ ＩまでのpreＳ２＋ＳエンベロープＯＲＦを再形成す
るようにデザインされていた。

【００３１】このオリゴヌクレオチドの配列は下記のと
おりである：

【化２】 この組立てにより、 preＳ２ドメインのアミノ酸６位に
おいてＴｈｒがＡｌａに代わったＨｉｎｄ III断片とし
てＯＲＦを含むｐＵＣ１９ preＳ２ＳＷＧ−２を得た。
このＯＲＦは前記と同様にして酵母発現ベクターを得る
ために用いられた。

【００３２】pre Ｓ２＋Ｓ抗原発現は前記のように評価
され、前記形質転換株で得られた場合と相同の産生力を
有することが示された。変異体のクローンは２つとも次
の評価のため凍結ストックとして保存された。抗ＨＢｓ
血清又は抗 preＳ２血清のいずれかで展開された免疫ブ
ロット分析では、preＳ２＋Ｓ ＯＲＦの非グリコシル化
翻訳産物として予想されたものと一致する約３０ＫＤの
分子量を有する単一の主要な種が検出された。

【００３３】インビボ抗力測定のため、非高グリコシル
化 preＳ２＋Ｓ調製物をアルミナに吸着させ、何群かの
マウスに抗原を増量しながら注射した。６週間後、マウ
ス血清を［ノーラス，ジャーナル・オブ・メディシナル
・バイロロジー，第１７巻，第１１９-１２１頁，１９
８５年（Ｎeurath, Ｊ. Ｍed. Ｖirol., １７，１１９-
１２１（１９８５）に従い］抗ＨＢｓ抗体（ＡＵＳＡＢ
^*）及び抗 preＳ２抗体に関して分析した。このような
実験の結果は preＳ２＋Ｓ調製物が抗ＨＢｓ抗体応答の
誘導に関してＨＢｓＡｇコントロール調製物と同程度に
有効であることを示した（有効な免疫用量は対照ＨＢｓ
Ａｇの０．２５ｍｇに対して preＳ２＋Ｓの場合０．３
４ｍｇであった）。加えて、preＳ２＋Ｓ調製物はpreＳ
２ドメインに特異的な付随抗体応答を誘導しうる強い
（有効免疫用量０．１４ｍｇ）能力を証明した。

【００３４】サッカロミセス属は様々な種からなる。様
々な外来ポリペプチドの組換えＤＮＡ媒介発現用の宿主
として最も普通に用いられるのはＳ．セレビシアエ即ち
パン酵母である。しかしながら、サッカロミセス属の他
の種間における区別は必ずしも充分に規定されているわ
けではない。これらの種の多くはＳ．セレビシアエと交
差接合することができ、Ｓ．セレビシアエの場合と類似
した又は同一の調節プロモーター並びに他の転写及び翻
訳調節要素を有しているらしい。したがって、Ｓ関連ポ
リペプチドの発現に関する宿主の選択が格別限定されず
にカールスバーゲンシス、ウバラム、ロウキシイ、モン
タナス、クルイベリ、エロングルグソラス、ノルベンシ
ス、オビフォルミス及びジアスタチクスを含めたサッカ
ロミセス属の他の種にも拡張しうることは当業者にとり
容易に明らかであろう。

【００３５】ハンセヌラ（Hansenula）、カンジダ（Cand
ida）、トルロプシス（Torulopsis）及びピチア（Pichi
a）のようないくつかの酵母属は生育に唯一の炭素源と
してメタノールを利用するための代謝経路を有している
ことがわかっている。この代謝経路に関与する酵素、ア
ルコールオキシダーゼの遺伝子がピチア・パストリス
（Pichia pastoris）から単離された。Ｐ.パストリスア
ルコールオキシダーゼ遺伝子プロモーターが単離され、
メタノールの存在下で誘導がかかることが示された。こ
のような誘導性プロモーター系は宿主で負の効果を有す
るポリペプチドの発現に有用である。特に、このプロモ
ーターはＰ．パストリスにおいてＳポリペプチドの発現
を調節する活性を有することが示されたが、これは免疫
性形Ｓポリペプチドの組換えＤＮＡ媒介遺伝子発現用宿
主として他の酵母属が機能しうる能力を明らかにしてい
る。したがって、 preＳ２＋Ｓ含有ポリペプチドの発現
に関する宿主の選択が格別限定されずにピチア、カンジ
ダ、ハンセヌラ、トルロプシス、クルイベロミセス（Kl
uyveromyces）及び サッカロミコプシス（Saccharomyco
psis）を含めたサッカロミセス科（Saccharomycetacea
e）及びクリプトコッカス科（Cryptococcaceae）の 他
の酵母属の種に拡張しうることは当業者にとり明らかで
あろう。

【００３６】本発明の組換え preＳ２＋Ｓの精製方法で
は以前はどの精製ステップにおいても必要だったプロテ
アーゼ阻害剤を用いる必要性を完全に解消している。Ｂ
型肝炎ウイルス表面タンパク質又はその変異体をコード
する発現ベクターで形質転換された酵母細胞を増殖させ
回収する。所望であればそれらの細胞は緩衝液、例えば
ＰＢＳで洗浄し、典型的には−７０℃で凍結貯蔵して細
胞ペーストにして貯蔵してもよい。

【００３７】精製は典型的には下記のように始める。１
回分の新鮮な又は凍結された細胞ペーストを緩衝液に懸
濁する。穏和な破壊法であるビーズ破砕法はスケールア
ップ用には適切であることがわかった。高圧ホモジナイ
ザーによる破壊［約１０，０００〜２０，０００ｐｓｉ
（約７００〜１４００ｋｇ／ｃｍ²）、ゴーリン（Gauli
n）又はスタンステッド（Stansted）ホモジナイザーを
用いる］が、迅速かつ効率的な操作のために好ましい。

【００３８】この時点で粗抽出物に界面活性剤を加える
ことが望ましい場合もある。界面活性剤の添加は不要な
細胞砕片からの酵母細胞膜の分離を促進させる。 preＳ
２＋Ｓタンパク質及び他の形の表面タンパク質は酵母細
胞膜に結合していることが示されている。格別限定され
ずトリトン−Ｎシリーズ、トリトン−Ｘシリーズ、ブリ
ッジ（ＢＲＩＪ）シリーズ、ツイーンシリーズもしくは
エマゾール（ＥＭＡＳＯＬ）シリーズ、デオキシコレー
ト、オクチルグルコピラノシド又はノニデット（ＮＯＮ
ＩＤＥＴ）−Ｎｐ−４０の界面活性剤を含めた様々な中
性又は非イオン系界面活性剤が使用できる。チャップス
（ＣＨＡＰＳ）又はチャプソ（ＣＨＡＰＳＯ）のような
双極性イオン界面活性剤も有用かつ適切な物質である。

【００３９】界面活性剤が用いられる場合、好ましい界
面活性剤は濃度約０．５％のトリトンＸ−１００であ
る。本発明の方法ではこのステップで界面活性剤の使用
を必要とせず、界面活性剤の使用は任意であることが強
調されねばならない。

【００４０】熱処理はある範囲の温度である範囲の処理
時間の時有効である。典型的には４０−５０℃の温度範
囲が用いられるが、４５℃が好ましい温度である。熱処
理時間は典型的には２０−４０分間の範囲内である、３
０分間が好ましい時間である。次いでその物質を好まし
くはそれを氷水浴に入れるかまたは熱交換器を用いて約
１０℃に冷却する。

【００４１】熱処理された粗抽出物からの細胞砕片の除
去は後の精製ステップで物理的めづまりを防止するため
に必要である。砕片は遠心、精密濾過又は清澄化抽出物
が得られる濾過により除去できる。遠心及び精密濾過が
最も好ましい方法である。遠心は異なる遠心力で時間の
長さを変えて行うことができる。４℃で１５分間にわた
る約３０００ｘｇでの遠心で充分であった。粗酵母細胞
抽出物に典型的な粘稠な性質を減少させるため遠心前に
抽出物を希釈しておくことも有利であろう。稀釈はこの
操作後のいかなるステップにも変更を与えない。

【００４２】精密濾過は濾過及び透析が同時に実施でき
るという利点を有している。いくつかのタイプの精密濾
過ユニット、例えばマイクロゴン社（Microgon Inc.）の
クロスフロ（ＫＲＯＳＦＬＯ）又はアミコン（Amicon）
もしくはＡ／Ｇテクノロジー（Ａ／Ｇ Ｔechnology）の
あらゆる種類の中空糸膜カートリッジがこのステップで
の使用に適している。好ましい精密濾過法ではｐＨ約１
０．４の約０．１Ｍトリス及び約０．１％トリトンＸ−
１００からなる緩衝液を用いて約２〜７ｐｓｉ（約０.
１４〜０.５ｋｇ／ｃｍ²）の 導入圧力で孔径約０.１〜
０.２ミクロンのプロスタック・デュラポア（Prostak Du
rapore）［ミリポア（Millipore）膜、プレート及びフ
レーム精密濾過ユニットに抽出物を通過させる。

【００４３】遠心による上清又は精密濾過による濾液は
この操作の次のステップ前に濃縮してもよい。濃縮は格
別限定されず、透析、濾過、凍結乾燥、限外濾過及び透
析濾過を含めたいくつかの方法で達成することができ
る。本発明の濃縮の好ましい方法は清澄化された抽出物
を１０⁵ 分子量分画中空糸膜限外濾過系で処理すること
である。清澄化された抽出物は通常、精密濾過生成物の
場合に約６．５倍、希釈した遠心生成物の場合約２倍ま
で濃縮され、濃縮貯留物を残す。濃縮後、貯留物は低分
子量の混入物質を更に除去するため透析濾過を行う。透
析濾過は１０⁵ 分子量分画中空糸膜系を用いて行われ
る。

【００４４】トリトンＸ−１００を加えた場合、それは
格別限定されないが透析、ある有機溶媒の添加、冷却、
クロマトグラフィー分離及びエクストラクトゲル（Extr
actogel）［ピアース（Pierce）］、ＸＡＤ樹脂［ロミ
コン（Romicon）］のような特に界面活性剤と結合する
ゲル又は樹脂との接触を含めたいくつかの慣用的方法で
除去することができる。トリトンＸ−１００を除去する
上で好ましい本発明の方法は、トリトンＸ−１００含有
の熱処理抽出物をＸＡＤ−２又はＸＡＤ−４樹脂（ポリ
スチレンジビニルベンゼン）のカートリッジ内で循環さ
せることである。熱処理抽出物を４℃で約１０時間にわ
たりＸＡＤカートリッジ内で循環させた後適切な容器、
例えば密封しうるガラスボトルに集める。

【００４５】細胞が高ｐＨ緩衝液中で破壊された場合、
その熱処理抽出物のｐＨは約ｐＨ７．０〜約７．９、好
ましくは約７．７のｐＨに調整される。本発明の方法に
従い高ｐＨで熱処理後にｐＨを約７．７に調整した場
合、後のステップで利用する広孔シリカへの表面タンパ
ク質の吸着を大いに促進することができる。熱処理抽出
物のｐＨ調整は操作結果に影響を与えることなくトリト
ンＸ−１００除去ステップ前に行うことができる。した
がって、本発明の方法によれば、ｐＨ調整及びトリトン
Ｘ−１００除去ステップが行われる順序がこの操作の結
果に有意の影響を与えずに逆転させうることは当業者に
とり明らかであろう。

【００４６】次いで表面タンパク質は混入物質から容易
に分離され、実質上精製されたＢ型肝炎表面タンパク質
を得ることができる。混入物質の好ましい除去方法は広
孔シリカに表面タンパク質を吸着させることである。本
発明の最も好ましい方法は孔径範囲約１０００〜１５０
０オングストローム及びシリカ粒径範囲約３０〜１３０
ミクロンの広孔シリカ（アミコン）に表面タンパク質を
吸着させることである。表面タンパク質はシリカの孔内
に容易に入りこみ、保留される。したがって、酵母細胞
タンパク質混入物質は容易に洗浄除去することができ
る。

【００４７】広孔シリカへの表面タンパク質の吸着はク
ロマトグラフィーで又はクロマトグラフィーではないバ
ッチ方式で行える。クロマトグラフィー吸着はカラムク
ロマトグラフィー装置内の広孔シリカ層にｐＨ調整抽出
物を通すことで行われる。典型的には、約１リットルの
熱処理抽出物を広孔シリカビーズ約３００ｍｌ（乾燥重
量約１００ｇ）含有の５ｃｍジャケット付カラム装置に
約２００ｍｌ／ｈｒの流速でかける。

【００４８】広孔シリカへの非クロマトグラフィー吸着
は典型的には適切な容器、例えば密封しうるガラスボト
ル内で熱処理抽出物をシリカと混ぜることにより行われ
る。好ましい方法はガラスボトル内で熱処理抽出物約１
リットルに広孔シリカ３００ｍｌを加えて一定のミキシ
ング下でインキュベートすることである。吸着は好まし
くは約４〜８℃で約１．５時間続けるが、但し異なる時
間及び温度でも適切である。

【００４９】表面タンパク質吸着シリカから非吸着物質
を洗い流すのは非クロマトグラフィー的に行っても、ま
た前述したクロマトグラフィー吸着の場合のようにシリ
カをカラム装置内に注いでもよい。バッチ式洗浄は広孔
シリカから熱処理抽出物を流し切り、シリカに吸着され
た表面タンパク質の溶出を起すことのない数倍容量の緩
衝液を加えて行う。好ましい緩衝液はＰＢＳである。シ
リカは水切り後、洗浄ステップを３〜５回繰返す。表面
タンパク質吸着シリカのクロマトグラフィー洗浄は、２
８０ｎｍの吸光度が一定になるまで流速約２００ｍｌ／
ｈｒでＰＢＳをシリカに通して行う。

【００５０】表面タンパク質は約８．５〜９．０のｐＨ
の緩衝液を用いて洗浄された広孔シリカから溶出され
る。表面タンパク質は好ましくはｐＨ約８．７の約０．
０５Ｍホウ酸からなる緩衝液を用いて脱着される。表面
タンパク質の脱着は広範囲にわたる昇温で促進すること
ができる。約５５℃での脱着が好ましい。非クロマトグ
ラフィー脱着はｐＨ８.７の０.０５Ｍホウ酸緩衝液１２
００ｍｌを洗浄表面タンパク質吸着広孔シリカ約７００
ｍｌと混ぜることで行われる。脱着は約２５分間続け
る。次いで溶出液を集め、脱着ステップを２回繰返し
て、溶出液を冷却する。

【００５１】クロマトグラフィー脱着は洗浄シリカのジ
ャケット付カラムを約５５℃に加温することで行われ
る。ｐＨ８.７の０.０５Ｍホウ酸緩衝液は５５℃に加温
してから５００ｍｌ／ｈｒの速度でカラムに流す。次い
で溶出液を集め、冷却する。溶出液の容量は通常広孔シ
リカに適用された熱処理抽出物の容量にほぼ相当する。

【００５２】溶出した表面タンパク質を濃縮することが
通常望まれる。好ましい濃縮方法はｐＨ８．７の０.０
５Ｍホウ酸緩衝液を用いて１０⁵分子量カットオフ中空
糸膜透析濾過系に溶出液を通すことである。溶出表面タ
ンパク質の容量は通常この系を用いて１６倍ほどに減少
させることができる。透析濾過貯留液は必要であれば精
密濾過で滅菌することができる。下記実施例は本発明に
ついて説明するが、しかしながら本発明をそれに限定す
るわけではない。下記実施例で記載された各参考文献の
開示は参考のためここに組込まれる。

【００５３】実施例１ ｐＢＲ３２２におけるＨＢＶ ＤＮＡのクローニング ＨＢＶデーン粒子（血清型ａｄｗ）をヒト（キャリア）
血漿から単離及び精製し、二本鎖ＤＮＡをランダース
ら、ジャーナル・オブ・バイロロジー、第２３巻、第３
６８−３７６頁、１９７７年 ［Ｌanders ｅｔ ａl.,
Ｊ．Ｖirology, ２３，３６８−３７６（１９７７）及
びルスカ（Ｈｒｕｓｋａ）ら、ジャーナル・オブ・バイ
ロロジー、第２１巻、１９７７年の方法に従いデーン粒
子の内在ポリメラーゼにより合成した。ＤＮＡはＳＤＳ
中でプロテイナーゼＫで消化し、フェノール／クロロホ
ルムで抽出し、エタノールで沈降させて単離した。ＨＢ
ＶゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断して単一の３．２ｋ
ｂｐ断片を得、これをｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に
組込んでクローニングし、ｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１を形成
させた。ＨＢＶ ＤＮＡの存在はＥｃｏＲＩ切断、ニト
ロセルロースへのサザンブロットトランスファー及び［
³²Ｐ］標識特異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイ
ブリッド形成により確認した。

【００５４】実施例２ ｐＧＡＰ−ｔＡＤＨ−２発現ベクターに組込んだｐｒｅ
Ｓ２＋Ｓ遺伝子のクローニング プラスミドｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１（実施例１で記載）を
ＥｃｏＲＩ及びＡｃｃＩで切断し、０．８ｋｂｐ断片を
調製用アガロースゲル電気泳動で精製した。ｐｒｅＳ２
＋Ｓ ＯＲＦの５’部分を再組立てするためのＥｃｏＲ
Ｉから上流のＡＴＧへ、さらに１０ｂｐＮＴＬ配列を経
てＨｉｎｄ III末端に至るＯＲＦを再組立てする一対の
オリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチ
ドの配列は下記のとおりである：

【化３】 ｐｒｅＳ２＋Ｓ ＯＲＦの３’部分を再組立てするた
め、ＡｃｃＩ部位から翻訳ターミネーターを経てＨｉｎ
ｄ III末端に至るＯＲＦを再組立てする第二の対のオリ
ゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチドの
配列は下記のとおりである：

【化４】 ｐＢＲ３２２中にＧＡＰ４９１プロモーター（ホランド
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第２５５巻、第２５９６頁、１９８０年）及びＡＤ
Ｈ１転写ターミネーターを含有するプラスミドｐＧＡＰ
−ｔＡＤＨ−２は唯一のＨｉｎｄ III クローニング部
位を有するが、そこに前記ｐｒｅＳ２＋ＳＯＲＦを結合
させて、ｐＥＧｐｒｅＳ２Ｓ−１を得た。ＨＢＶ ＤＮ
Ａの存在及び向きは制限エンドヌクレアーゼ分析及びサ
ザンブロットトランスファーにより確認した。ｐｒｅＳ
２＋Ｓ ＯＲＦ含有の発現カセットをＳｐｈＩ切断でｐ
ＥＧｐｒｅＳ２Ｓ−１から取出し、調製用アガロースゲ
ル電気泳動で単離した。次いでそのカセットをＳｐｈＩ
で予め切断されたシャトルベクターｐＣ１／１（ベッグ
ス、前掲；ローゼンバーグら、前掲）に組込みクローニ
ングして酵母発現ベクター（ｐＹＧｐｒｅＳ２Ｓ−１）
を得、しかる後これを用いて下記のようにＳ．セレビシ
アエを形質転換した。

【００５５】実施例３ グリコシル化に関して“野生型”の酵母での形質転換お
よびｐｒｅＳ＋Ｓ発現用種ストックの確立 得られた発現カセット含有プラスミドｐＹＧｐｒｅＳ２
Ｓ−１（前記実施例２から）を用いてＳ.セレビシアエ
株ＣＦ４２（ＭＡＴａ／ａ，ａｄｅ１^-，ｌｅｕ２−０
４^-、ｕｒａ３^-）を形質転換させたが、これは下記のよ
うにして得た：

【００５６】酵母株２１５０−２−３（Ｌ．ハートウェ
ル、ワシントン大学）のｕｒａ３変異を選択した（ベー
クら、前掲）。得られた株（ＭＡＴａ、ａｄｅｌ^-、ｌｅ
ｕ２−０４^-、ｕｒａ３^-、ｃｉｒ゜）をプラスミドＹＣ
ｐ５０−ＨＯで形質転換して二倍化させた（ジェンセン
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８０巻、第３０３５−３０
３９頁、１９８３年）。二倍体株をそのプラスミドを除
き、ＣＦ４２（ＭＡＴａ／ａ、ａｄｅ１^-、ｌｅｕ２−０
４^-、ｕｒａ３^-）と命名した。形質転換されたクローン
（ｐＦ４０３）を選択し、下記に述べる評価を行うため
凍結ストック（１７％グリセロール中）として確立し
た。

【００５７】実施例４ グリコシル化に関して“野生型”の酵母でのｐｒｅＳ２
＋Ｓ遺伝子の増幅及び発現
実施例３で記載された発現プラスミド含有酵母のクロー
ンｐＦ４０３をｌeｕ^-寒天プレート上で、３０℃で２〜
３日間インキュベートした。これらの酵母を複合ＹＥＨ
Ｄ培地の５〜７ｍｌ中に接種し、培養物を通気下３０℃
で１２〜１８時間インキュベートした。５０ｍｌ複合Ｙ
ＥＨＤ培地含有フラスコにＡ₆₀₀０.１となるよう上記培
養物を接種し、最終Ａ₆₀₀１０〜１６まで振盪下（３５０
ｒｐｍ）３０℃で４８〜７２時間インキュベートした。
１０Ａ₆₀₀ 単位のサンプルを三連のチューブに分注し、
酵母細胞を２０００×ｇで１０分間遠心してペレットに
した。ペレットは直接分析されるか、又は下記実施例
７、８、９及び１０で記載されたグリコシル化がコント
ロールされたクローンの評価のための内部参照標準とし
て用いるために−７０℃で貯蔵された（これらの比較の
ため、クローンｐＦ４０３に関する値は１．０に標準化
された）。アッセイ時に、そのペレットを２ｍＭＰＭＳ
Ｆ含有リン酸緩衝液０．４ｍｌに再懸濁した。酵母細胞
を１）洗浄されたガラスビーズ（０．４５ｍｍ）２００
〜３００ｍｇを加え、２）渦巻式ミキサーで１５分間攪
拌し、３）０．５％（ｖ／ｖ）までＴＸ−１００を添加
し、４）渦巻式ミキサーで２分間攪拌して５）４℃で１
０分間インキュベートすることにより破壊した。細胞砕
片及びガラスビーズを２０００×ｇで１０分間の遠心に
より除去した。清澄化された上澄液をとり、タンパク量
測定（ローリーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー、第１９３巻、第２６５頁、１９５１年
の方法により）及びｐｒｅＳ２＋Ｓに特異的なＲＩＡ
（ハンソンら、前掲；マチダら、前掲）を行なった。

【００５８】実施例５ サークル（＋）ｍｎｎ９変異酵母における酵母形質転換
及びｐｒｅＳ２＋Ｓの種確立 発現カセットを含有する前記実施例２で得られたプラス
ミド（ｐＹＧｐｒｅＳ２Ｓ−１）を用いてＳ.セレビシ
アエＫＨＹ−１０７（ｃｉｒ⁺）を形質転換したが、こ
の株は下記のようにして組立てた：ａ接合型株ＣＺ５／
ＬＢ３４７−１Ｃ（ｍｎｎ９^-、ＳＵＣＺ^-）をＹＥＨＤ
ａ型株２１５０−２−３（ｌｅｕ２^-、ａｄｅ１^-）と完
全培地プレート上で混ぜることにより接合させた。二倍
体を選択するため、接合株を唯一の炭素源として２％ス
クロース含有ｌeｕ^-最少培地上でレプリカ培養した。単
一コロニーを単離した後、二倍体に胞子形成させ、子嚢
を標準技術で切開した。ＫＨＹ−１０７株を単一胞子と
して単離し、（シッフ染色技術により）ｃｉｒ⁺、ａｄ
ｅ１⁺、ｌｅｕ２^-、ｍｎｎ９^-として特徴付けた。クロ
ーンを最少培地（ｌｅｕ^-及び１Ｍソルビトール含有）
上で選択し、凍結ストック（１７％グリセロール中）と
して確立し、下記のように評価した。

【００５９】実施例６ Ｃｉｒ゜ｍｎｎ９変異酵母における酵母形質転換及びｐ
ｒｅＳ２＋Ｓの種確立 前記実施例２で記載された発現プラスミドを用いてＳ．
セレビシアエ株ＫＨＹ−１０７（ｃｉｒ゜）を形質転換
したが、この株はブローチ（メソッド イン エンザイモ
ロジー、第１０１巻、パートＣ、第３０７−３２５頁、
１９８３年）で記載されたように株ＫＨＹ−１０７（ｃ
iｒ⁺）から誘導された。クローンを選択し、実施例５で
前記されたように凍結ストックとして確立し、下記実施
例８で記載するようにｐｒｅＳ２＋Ｓの発現に関して評
価した。

【００６０】実施例７ サークル⁺ｍｎｎ９変異酵母におけるｐｒｅＳ２＋Ｓ遺
伝子の増殖及び発現 実施例５で記載された発現プラスミド含有酵母のクロー
ンを１Ｍソルビトール含有のｌeｕ^-選択寒天プレート上
で３０℃で２〜３日間インキュベートした。これらの酵
母を複合ＹＥＨＤＳの５〜７ｍｌに接種し、培養物を通
気下３０℃で１２〜１８時間インキュベートした。５０
ｍｌＹＥＨＤＳ培地含有フラスコに（初期Ａ₆₀₀＝０.１
となるよう）前記培養物を接種し、最終Ａ₆₀₀が１０〜１
６になるまで振盪下（３５０ｒｐｍ）３０℃で４８〜７
２時間インキュベートした。１０Ａ₆₀₀単位のサンプル
をチューブに分注し、酵母細胞を２０００×ｇで１０分
間遠心してペレット化した。サンプルは実施例４で記載
されたように直接分析するか又は−７０℃で凍結貯蔵し
た。細胞砕片及びガラスビーズを２０００×ｇで１０分
間の遠心により除去した。清澄化された上澄液を除去
し、前記のようにタンパク質量及びｐｒｅＳ２＋Ｓに特
異的なＲＩＡ分析を行った。５つのクローンを並行して
評価し、参照として１．０の値に標準化されたクローン
ｐＦ４０３からの相当細胞ペレット（前記実施例４参
照）と比較した。５つのクローンに関する抗原産生力の
典型的相対値は下記のとおりであった： 相対値^* 相対値^* クロ-ン mg preＳ２＋Ｓ／ｍｌ 単位preＳ２＋Ｓ／単位タンパク質 ａ １.６ ０.７ ｂ １.４ ０.２５ ｃ １.２ ０.５ ｄ １.５ ０.３ ｅ １.３ ０.２ pF403 １.０ １.０ ＊エリスら、１９８７年、“ウイルス肝炎及び肝臓疾
患”、Ａ．ズッカーマン（編集）、ニューヨーク：アラ
ンＲ．リス社、第１０７９頁［Ｅllis ｅｔａｌ.,（１
９８７） Ｉｎ“Ｖiral Ｈepotitis and Ｌiver Ｄis
ease”，Ａ．Ｚuckermann （ｅｄ.），Ｎew Ｙork: Ａl
an．Ｒ．Ｌiss Ｉｎｃ.,ｐ.１０７９］及びニスカーン
ら、１９８８年、ヘパトロジー、第８巻、第８２−８７
頁［Ｋniskern et al., （１９８８）Ｈepatology,
８，８２−８７］ｐｒｅＳ２ドメインに対するウサギ抗
ＨＢｓ又はＭｃＡｂで展開された免疫ブロット分析では
約３４ｋＤの分子量を有する単一の主要な種が検出され
た。以下クローン１４００７−２３０−１Ａと表示され
る上記クローン“ａ”を次の展開のために選択した。

【００６１】実施例８ Ｃｉｒ゜ｍｎｎ９変異酵母におけるｐｒｅＳ２＋Ｓ遺伝
子の増殖及び発現 実施例６で記載された発現プラスミド含有酵母のクロー
ンを１Ｍソルビトール含有ｌｅｕ^-選択寒天プレート上
で、３０℃、２〜３日間インキュベートした。これらの
酵母を５〜７ｍｌのＹＥＨＤＳ培地に接種し、培養物を
通気下３０℃で１２〜１８時間インキュベートした。５
０ｍｌ複合ＹＥＨＤＳ培地含有フラスコに初期Ａ₆₀₀が
０.１となるよう前記培養物を接種し、最終Ａ₆₀₀が１０
〜１６になるまで振盪下（３５０ｒｐｍ）３０℃で４８
〜７２時間インキュベートした。１０Ａ₆₀₀単位でサン
プルを三連のチューブに分割し、酵母細胞を２０００×
ｇで１０分間かけてペレット化した。サンプルを前記の
ように直接分析するか又は−７０℃で凍結貯蔵した。細
胞砕片及びガラスビーズは２０００×ｇで１０分間の遠
心により除去した。清澄化された上澄液をとり、前記の
ようにタンパク質及びｐrｅＳ２＋Ｓ抗原に関して分析
した。５つのクローンを並行して評価し、参照として
１．０の値に標準化されたクローンｐＦ４０３（前記実
施例４参照）と比較した。５つのクローンに関する抗原
産生力の典型的相対値は下記のとおりであった： 相対値^* 相対値^* クローン mg preＳ２＋Ｓ／ｍｌ 単位preＳ２＋Ｓ／単位タンパク質 ａ ２.１ １.２ ｂ １.７ １.１ ｃ １.６５ １.０ ｄ ２.０ １.２ ｅ ２.０ １.１ pF403 １.０ １.０ 14007-230-1A １.８ １.０ （実施例７から） ＊実施例７参照 イムノブロット分析（実施例７参照）から約３４ｋＤの
分子量の単一の主要バンドを検出した。以下クローン１
４００７−２８４−１Ａと表示される上記クローン
“ａ”を次の展開のために選択した。

【００６２】実施例９ 振盪フラスコ内におけるｐｒｅＳ２＋Ｓ産生Ｓ.セレビ
シアエ（ｍｎｎ９^-）の増殖の追加研究 凍結ストック培養物１４００７−２３０−１Ａ（前記実
施例７）を１Ｍソルビトール含有ｌeｕ^-プレート上に接
種した。プレートを２８℃で２〜３日間にわたり下向き
にしてインキュベートした。種培養物は前記実施例７に
記載したように確立するか又はプレート上の増殖物をＹ
ＥＨＤＳ培地に再懸濁し、再懸濁した増殖物をＹＥＨＤ
Ｓ５００ｍｌ含有の２リットルエーレンマイヤーフラス
コ内に移した。フラスコを制御環境シェーカーインキュ
ベーター内において２８℃及び３５０ｒｐｍで１８〜２
２時間インキュベートした。

【００６３】種フラスコからの接種原（５％ｖ／ｖ）を
各々ＹＥＨＤＳ５０ｍｌ又は５００ｍｌ含有の２５０ｍ
ｌ又は２リットルフラスコ内に移した。次いで産生フラ
スコを前記のように４０〜４６時間インキュベートし
た。８.０Ａ₆₆₀単位の光学密度が得られた。細胞は５０
０ｍｌ遠心ボトル内においてフラスコの内容物を１３０
０×ｇで１０分間遠心することにより回収した。上澄を
デカントし、細胞ペレットを緩衝液５０〜１００ｍｌに
再懸濁した。２０％洗浄細胞スラリーの一部（０．６ｍ
ｌ）を１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内でガラスビ
ーズ（０．４５〜０．５２ｍｍ）を用いて破壊した。Ｐ
ＭＳＦ（２００ｍＭストック６．５ｍｌ）をプロテアー
ゼ阻害剤として加えた。一部を破壊後にチューブから取
出し、免疫ブロット分析のため−７０℃で凍結した。ト
リトンＸ−１００をチューブ内の残留サンプルに最終濃
度０．５％まで加え、サンプルを簡単にまぜ、４℃で２
０〜４０分間インキュベートした。細胞砕片を遠心除去
し、清澄化された細胞抽出物をｐｒｅＳ ＲＩＡ及びタ
ンパク質（ローリー法）について分析した。得られた典
型的値は１５.６５ｍｇ ｐｒｅＳ２＋Ｓ／ｍｌ発酵ブ
ロス及び０．０４ｍｇｐｒｅＳ２＋Ｓ／ｍｇ全タンパク
質であった。

【００６４】実施例１０ 発酵槽内におけるｐｒｅＳ２＋Ｓ産生Ｓ．セレビシアエ
（ｍｎｎ９^-）の大規模培養 凍結ストック培養物１４００７-２３０−１Ａを１Ｍソ
ルビトール含有ｌｅｕ^-プレート上に接種した。プレー
トを２８℃で２〜３日間にわたり下向きにしてインキュ
ベートした。プレート上の増殖物をＹＥＨＤＳに再懸濁
し、再懸濁した増殖物をＹＥＨＤＳ５００ｍｌ含有の２
リットルエーレンマイヤーフラスコ内に移した。フラス
コを制御環境シェーカーインキュベーター内において２
８℃及び３５０ｒｐｍで１８〜２２時間インキュベート
した。次いでこれらの種培養物を用いて産生段階容器に
接種した。

【００６５】１以上のフラスコからの接種原（１〜５％
ｖ／ｖ）を各々ＹＥＨＤＳ１０リットル又は２００リッ
トル含有の１６リットル又は２５０リットル発酵槽内に
移した。１６リットル発酵槽は５００ｒｐｍ、空気５リ
ットル／ｍｉｎ及び２８℃で操作した。２５０リットル
発酵槽は１６０ｒｐｍ、空気６０リットル／ｍｉｎ及び
２８℃で操作した。発酵物は種培養物を接種後４０〜４
６時間目に回収した。典型的には１５.０Ａ₆₆₀単位の光
学密度値が得られた。回収は中空糸膜濾過装置を用いて
細胞を濃縮し、緩衝液中で細胞を洗浄して行なった。細
胞スラリーは下記のように分析するか又は次の処理及び
分析のため−７０℃で凍結貯蔵した。

【００６６】２０％洗浄細胞スラリーの少量サンプル
（０．６ｍｌ）を１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内
でガラスビーズ（０.４５〜０.５２ｍｍ）を用いて破壊
した。ＰＭＳＦ（２００ｍＭストック６.５ｍｌ）をプ
ロテアーゼ阻害剤として加えた。一部を破壊後にチュー
ブから取出し、免疫ブロット分析のため−７０℃で凍結
した。トリトンＸ−１００をチューブ内の残留サンプル
に最終濃度０．５％まで加え、サンプルを簡単にまぜ、
４℃で２０〜４０分間インキュベートした。細胞砕片を
遠心除去し、清澄化された細胞抽出物をｐｒｅＳ ＲＩ
Ａ及びタンパク質（ローリー法）分析した。抗原産生力
に関する平均値は８．４ｍｇ ｐｒｅＳ２＋Ｓ／ｍｌ発
酵ブロス及び０．０２５ｍｇ ｐｒｅＳ２＋Ｓタンパク
質／ｍｇ全タンパク質であった。

【００６７】実施例１１ 凍結細胞ペースト（組換えＳタンパク質産生）約２５０
ｇをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に１７％湿重量／容量
（約１５００ｍｌ）まで再懸濁した。ウォーターバス中
で４５℃まで加熱した。細胞を４５℃で１５分間保ち、
しかる後氷上で約１０℃に冷却した。次いで細胞をゴー
リンホモジナイザーに２回通して破壊した。 ホモジナ
イズ後。１０％トリトンＸ−１００を最終濃度０．３％
まで加え、約１５分間混合した。次いで細胞抽出物を４
℃、３６００×ｇで２０分間遠心し、上澄を集めた。

【００６８】次いで上澄をＸＡＤ−２樹脂約２００ｇ含
有カラムに通して、トリトンＸ−１００を除去した。次
いで溶出液を孔径約１５００オングストローム及び粒径
約５０ミクロンの広孔シリカ約１５０ｇ含有カラムに直
接通した。使用されたカラムは５ｃｍ径であり［ファル
マシア（Ｐharmacia）］、約２００ｍｌ／ｈｒの流速で
流した。

【００６９】シリカカラムはＡ₂₈₀がベースラインに戻
るまでＰＢＳで洗浄した。Ｓタンパク質はまず冷ホウ酸
緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．７、４℃）を用いて約５０
０ｍl／ｈｒの流速でＡ₂₈₀の上昇が観察されるまでシリ
カカラムから溶出させた。Ａ₂₈₀が上昇し始めてからカ
ラムを５５℃に加熱し、５５℃ホウ酸緩衝液を約５００
ｍｌ／ｈｒでカラムに流した。Ｓタンパク質含有溶出液
（約１リットル）を氷上で集めた。次いで溶出液は分子
分画量１０⁵ の中空糸膜透析濾過ユニットを用いてｐＨ
８．７の５０ｍＭホウ酸緩衝液に対し透析濾過を行って
約２００ｍｌに濃縮した。次いでＳタンパク質を０．２
ミクロンフィルターで濾過し、貯蔵した。生成物は安定
であることがわかり、有意の分解はウエスターンブロッ
ト分析で観察されなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 デニス ジェー．クベク アメリカ合衆国，26426 ウエスト ヴァ ージニア，セイレム，カロライナ アヴェ ニュー 76

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 組換え宿主細胞抽出物から組換えＢ型肝
   炎ウイルス表面タンパク質を実質上精製する方法であっ
   て、 ａ）宿主細胞を中性ｐＨの緩衝液中で約４０〜５０℃に
   加熱し、しかる後ほぼ周囲温度まで冷却する； ｂ）熱処理細胞（ａ）を破壊して粗抽出物を得る； ｃ）ステップ（ｂ）の生成物に界面活性剤を加える； ｄ）遠心又は精密濾過で望ましくない宿主細胞砕片を除
   去する； ｅ）ステップ（ｄ）の生成物を濃縮及び限外濾過する； ｆ）ステップ（ｅ）の生成物から界面活性剤を除去す
   る； ｇ）表面タンパク質を吸着させるためステップ（ｆ）の
   生成物を広孔シリカに付す； ｈ）広孔シリカから表面タンパク質を溶出させる； ｉ）ステップ（ｈ）の溶出液を濃縮して、実質上純粋な
   表面タンパク質を得る；ステップからなる方法。
2. 【請求項２】 ステップ（ｄ）の生成物が公称分画分子
   量約１００，０００の中空糸膜透析濾過装置で実施され
   る透析濾過により濃縮される、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 ステップ（ｇ）において、シリカ吸着が
   孔径範囲約１０００〜１５００オングストローム及びシ
   リカ粒径範囲約３０〜１３０μの広孔シリカを用いて行
   われる、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 ステップ（ｉ）が公称分画分子量約１０
   ０，０００の中空糸膜透析濾過装置での透析濾過により
   行われる、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 組換え宿主細胞が酵母種である、請求項
   １記載の方法。