JPH07313157A - 新規チロシンキナーゼ - Google Patents
新規チロシンキナーゼInfo
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- JPH07313157A JPH07313157A JP6189444A JP18944494A JPH07313157A JP H07313157 A JPH07313157 A JP H07313157A JP 6189444 A JP6189444 A JP 6189444A JP 18944494 A JP18944494 A JP 18944494A JP H07313157 A JPH07313157 A JP H07313157A
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- tyrosine kinase
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- glu
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒト巨核芽球細胞株からクローニングされた
新規なチロシンキナーゼ遺伝子、及びその形質転換細
胞、並びにその遺伝子がコードするポリペプチド。 【効果】 血液細胞分化の評価、制御が可能であり、医
薬品の開発、アンチセンス医薬品の開発に有用な材料と
なる。
新規なチロシンキナーゼ遺伝子、及びその形質転換細
胞、並びにその遺伝子がコードするポリペプチド。 【効果】 血液細胞分化の評価、制御が可能であり、医
薬品の開発、アンチセンス医薬品の開発に有用な材料と
なる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は新規チロシンキナーゼお
よびそれをコードするDNAに関するものである。
よびそれをコードするDNAに関するものである。
【0002】
【従来の技術】ヒトの血液中には多種類の細胞があり、
それぞれが重要な役割を担っている。例えば、赤血球は
体内での酸素運搬を、血小板は止血作用を、白血球は免
疫系を構成して感染を防御している。これらの多様な細
胞は骨髄中の造血幹細胞に由来する。
それぞれが重要な役割を担っている。例えば、赤血球は
体内での酸素運搬を、血小板は止血作用を、白血球は免
疫系を構成して感染を防御している。これらの多様な細
胞は骨髄中の造血幹細胞に由来する。
【0003】造血幹細胞は体内の種々の造血因子や環境
要因により影響を受け、各種血液細胞、破骨細胞、肥満
細胞などに分化することが近年明らかにされて来た。し
かし、この細胞分化のメカニズムには、未だ不明な点が
多い。近年の研究からチロシンキナーゼが動物、昆虫の
発生や分化に大きく関わっていることが明らかになって
おり、造血幹細胞の分化においてもチロシンキナーゼが
大きく関与していると考えられている。例えば、リセプ
ター型チロシンキナーゼの一種であるc−kitは造血
幹細胞の表面に発現しており、造血幹細胞増殖因子、肥
満細胞増殖因子の受容体であることがわかっている(Wi
tle et al.Cell 63: 5,1992)。このリセプター型チロ
シンキナーゼを介して細胞の分化が制御されている。
要因により影響を受け、各種血液細胞、破骨細胞、肥満
細胞などに分化することが近年明らかにされて来た。し
かし、この細胞分化のメカニズムには、未だ不明な点が
多い。近年の研究からチロシンキナーゼが動物、昆虫の
発生や分化に大きく関わっていることが明らかになって
おり、造血幹細胞の分化においてもチロシンキナーゼが
大きく関与していると考えられている。例えば、リセプ
ター型チロシンキナーゼの一種であるc−kitは造血
幹細胞の表面に発現しており、造血幹細胞増殖因子、肥
満細胞増殖因子の受容体であることがわかっている(Wi
tle et al.Cell 63: 5,1992)。このリセプター型チロ
シンキナーゼを介して細胞の分化が制御されている。
【0004】チロシンキナーゼはタンパク質のチロシン
残基をりん酸化する酵素であり、その生理活性部位は約
250個のアミノ酸残基から構成されている。また、チ
ロシンキナーゼの中には、きわめてよく保存されたアミ
ノ酸配列があり(Hanks et al. Science 241:42,198
8)、保存された部分に対応する配列のDNAを設計
し、RT−PCR法のプライマ−として利用すれば、チ
ロシンキナーゼ遺伝子断片を得ることができる(Wilks.
Methods in Enzymology 200:533, 1991)。なお、チロ
シンキナーゼは、転写調節やシグナル伝達を司る重要な
物質であり、この酵素をコードする遺伝子の変異やウイ
ルス感染により細胞が癌化することが知られている。
残基をりん酸化する酵素であり、その生理活性部位は約
250個のアミノ酸残基から構成されている。また、チ
ロシンキナーゼの中には、きわめてよく保存されたアミ
ノ酸配列があり(Hanks et al. Science 241:42,198
8)、保存された部分に対応する配列のDNAを設計
し、RT−PCR法のプライマ−として利用すれば、チ
ロシンキナーゼ遺伝子断片を得ることができる(Wilks.
Methods in Enzymology 200:533, 1991)。なお、チロ
シンキナーゼは、転写調節やシグナル伝達を司る重要な
物質であり、この酵素をコードする遺伝子の変異やウイ
ルス感染により細胞が癌化することが知られている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】チロシンキナ−ゼは、
リセプター型と細胞質型に大きく分けられる。リセプタ
−型に比べて、細胞質型チロシンキナ−ゼには不明な点
が多く、クロ−ニングが望まれていた。本発明が解決し
ようとする課題は、血液細胞の分化を制御しうる細胞質
型の新規チロシンキナ−ゼを提供することにある。
リセプター型と細胞質型に大きく分けられる。リセプタ
−型に比べて、細胞質型チロシンキナ−ゼには不明な点
が多く、クロ−ニングが望まれていた。本発明が解決し
ようとする課題は、血液細胞の分化を制御しうる細胞質
型の新規チロシンキナ−ゼを提供することにある。
【0006】
【課題を解決する手段】本発明者は、RT−PCR法を
用いて、ヒト巨核芽球白血病細胞株UT−7の分化に関
与するチロシンキナーゼ遺伝子のクローニングを行っ
た。その結果、未分化な状態ではmRNA発現がほとん
ど見られないが、分化に伴い発現量が上昇してくる新規
なチロシンキナーゼ遺伝子断片を見い出した。この遺伝
子断片をプローブとして用い、UT−7のcDNAライ
ブラリーから全長をコードするcDNAを得、その塩基
配列を決定し、本遺伝子を利用してアンチセンスDNA
及びRNA、形質転換細胞作成、抗体作成、化学物質の
スクリーニング等を行い、本発明を完成した。
用いて、ヒト巨核芽球白血病細胞株UT−7の分化に関
与するチロシンキナーゼ遺伝子のクローニングを行っ
た。その結果、未分化な状態ではmRNA発現がほとん
ど見られないが、分化に伴い発現量が上昇してくる新規
なチロシンキナーゼ遺伝子断片を見い出した。この遺伝
子断片をプローブとして用い、UT−7のcDNAライ
ブラリーから全長をコードするcDNAを得、その塩基
配列を決定し、本遺伝子を利用してアンチセンスDNA
及びRNA、形質転換細胞作成、抗体作成、化学物質の
スクリーニング等を行い、本発明を完成した。
【0007】すなわち、本発明は、配列表の配列番号1
記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列表の
配列番号2記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ド、配列表の配列番号3記載のアミノ酸配列を含有する
するポリペプチド、配列表の配列番号4記載のアミノ酸
配列を含有するポリペプチド、配列表の配列番号5記載
のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、及びこれらの
ポリペプチドをコードするDNA、並びにこれらのDN
Aを含む発現ベクター及びこれらの発現ベクターを用い
たポリペプチド産生系、これらのポリペプチドを用いて
作製された化学物質スクリーニング方法及び抗体に関
し、更に配列表の配列番号11で表される遺伝子配列の
少なくとも12mer以上の部分に対するアンチセンス
及びセンスDNA及びRNA、に関する。
記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列表の
配列番号2記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ド、配列表の配列番号3記載のアミノ酸配列を含有する
するポリペプチド、配列表の配列番号4記載のアミノ酸
配列を含有するポリペプチド、配列表の配列番号5記載
のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、及びこれらの
ポリペプチドをコードするDNA、並びにこれらのDN
Aを含む発現ベクター及びこれらの発現ベクターを用い
たポリペプチド産生系、これらのポリペプチドを用いて
作製された化学物質スクリーニング方法及び抗体に関
し、更に配列表の配列番号11で表される遺伝子配列の
少なくとも12mer以上の部分に対するアンチセンス
及びセンスDNA及びRNA、に関する。
【0008】以下、本発明を詳細に説明する。クローニ
ングに必要なcDNAの作製、ノザンブロットによる発
現の検討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニン
グ、組換えDNAの作製、DNAの塩基配列の決定、c
DNAライブラリーの作製等の実験は通常の実験書に記
載の方法によって行うことができる。例えば、Mani
atisらの編集したMolecular Cloning, A laborarto
ry manual, 1989, Eds., Sambrook,J., Fritsch, E.F.,
and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Loboratory Pr
essを挙げることができる。
ングに必要なcDNAの作製、ノザンブロットによる発
現の検討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニン
グ、組換えDNAの作製、DNAの塩基配列の決定、c
DNAライブラリーの作製等の実験は通常の実験書に記
載の方法によって行うことができる。例えば、Mani
atisらの編集したMolecular Cloning, A laborarto
ry manual, 1989, Eds., Sambrook,J., Fritsch, E.F.,
and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Loboratory Pr
essを挙げることができる。
【0009】チロシンキナーゼ遺伝子に特徴的なアミノ
酸配列に対応したPCRプライマーの作製並びにPCR
はWilksの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:160
3,1989 )で行うことができる。すなわち、市販のDN
A合成機でオリゴヌクレオチドを作成し、精製してか
ら、PCRにより特定部位を増幅する。これにより、チ
ロシンキナーゼのキナーゼ部分約210bpを増幅する
ことができる。このPCR産物をアガロース電気泳動な
どで分離し、さらにDNA断片を精製し回収する。この
回収したDNA断片を各種ベクターに再クローニング
し、遺伝子配列を決定し、各種チロシンキナーゼの配列
との比較から新規チロシンキナーゼ遺伝子の断片がクロ
ーニングされていることを確認できる。
酸配列に対応したPCRプライマーの作製並びにPCR
はWilksの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:160
3,1989 )で行うことができる。すなわち、市販のDN
A合成機でオリゴヌクレオチドを作成し、精製してか
ら、PCRにより特定部位を増幅する。これにより、チ
ロシンキナーゼのキナーゼ部分約210bpを増幅する
ことができる。このPCR産物をアガロース電気泳動な
どで分離し、さらにDNA断片を精製し回収する。この
回収したDNA断片を各種ベクターに再クローニング
し、遺伝子配列を決定し、各種チロシンキナーゼの配列
との比較から新規チロシンキナーゼ遺伝子の断片がクロ
ーニングされていることを確認できる。
【0010】全長をクローニングするには、前記の方法
にて部分クローニングされた遺伝子をアイソトープ標
識、あるいは各種非アイソトープ標識し、cDNAライ
ブラリーを、ハイブリダイゼーションなどの方法にてス
クリーニングすることによって得ることができる。アイ
ソトープの標識法としては、例えば、[32P]γ−AT
PとT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端をラベ
ルする方法や、他のニックトランスレーション法または
プライマー伸長法などの標識法が利用できる。また、配
列表の配列番号11に示したDNA配列をもとにしてP
CR法によって得ることもできる。
にて部分クローニングされた遺伝子をアイソトープ標
識、あるいは各種非アイソトープ標識し、cDNAライ
ブラリーを、ハイブリダイゼーションなどの方法にてス
クリーニングすることによって得ることができる。アイ
ソトープの標識法としては、例えば、[32P]γ−AT
PとT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端をラベ
ルする方法や、他のニックトランスレーション法または
プライマー伸長法などの標識法が利用できる。また、配
列表の配列番号11に示したDNA配列をもとにしてP
CR法によって得ることもできる。
【0011】本発明の新規チロシンキナーゼのcDNA
塩基配列を配列表の配列番号11に示した。配列表の配
列番号11に示した塩基配列は、5’端の207塩基か
らなる5’非翻訳領域、それに続く1521塩基の新規
チロシンキナーゼをコードする領域、及び3’端の21
4塩基からなる3’非翻訳領域により構成されている。
塩基配列を配列表の配列番号11に示した。配列表の配
列番号11に示した塩基配列は、5’端の207塩基か
らなる5’非翻訳領域、それに続く1521塩基の新規
チロシンキナーゼをコードする領域、及び3’端の21
4塩基からなる3’非翻訳領域により構成されている。
【0012】本発明の新規チロシンキナーゼのアミノ酸
配列を配列表の配列番号4および配列番号5に示した。
本ペプチドは、細胞質型チロシンキナ−ゼ群の遺伝子産
物と類似した部分配列であるSH2ドメイン、SH3ド
メイン及びチロシンキナーゼドメインを含む(Koch et
al. Science 252:668,1991)。この3つのドメインは、
c−srcを始めとする多くの細胞質型チロシンキナ−
ゼに認められる。さらに、SH2ドメイン、SH3ドメ
インは細胞質型チロシンキナ−ゼのみならず、ホスホリ
パ−ゼC−γ、IP3キナ−ゼ、ras−GAPなどの
シグナル伝達物質にも存在し、その重要性が指摘されて
いる(Pawson and Gish, cell, 71; 359,1992 )。SH
3ドメインは配列表の配列番号1のアミノ酸配列に相当
し、またSH2ドメイン配列表の配列番号2のアミノ酸
配列に相当し、チロシンキナーゼドメインは配列表の配
列番号3のアミノ酸配列に相当する。同様に、SH3ド
メインは、配列表の配列番号4の7番目から70番目ま
でのアミノ酸配列に相当し、また、SH2ドメインは同
じく81番目から155番目に相当し、チロシンキナー
ゼドメインは192番目から437番目に相当する。さ
らに同様に、SH3ドメインは、配列表の配列番号5の
48番目から111番目までのアミノ酸配列に相当し、
また、SH2ドメインは同じく122番目から196番
目に相当し、チロシンキナーゼドメインは233番目か
ら478番目に相当する。また、配列表の配列番号6は
配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするcDNAの配列の1例に相当し、配列番号7は配
列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するcDNAの配列の1例に相当し、配列番号8は配列
番号3のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るcDNAの配列の1例に相当する。
配列を配列表の配列番号4および配列番号5に示した。
本ペプチドは、細胞質型チロシンキナ−ゼ群の遺伝子産
物と類似した部分配列であるSH2ドメイン、SH3ド
メイン及びチロシンキナーゼドメインを含む(Koch et
al. Science 252:668,1991)。この3つのドメインは、
c−srcを始めとする多くの細胞質型チロシンキナ−
ゼに認められる。さらに、SH2ドメイン、SH3ドメ
インは細胞質型チロシンキナ−ゼのみならず、ホスホリ
パ−ゼC−γ、IP3キナ−ゼ、ras−GAPなどの
シグナル伝達物質にも存在し、その重要性が指摘されて
いる(Pawson and Gish, cell, 71; 359,1992 )。SH
3ドメインは配列表の配列番号1のアミノ酸配列に相当
し、またSH2ドメイン配列表の配列番号2のアミノ酸
配列に相当し、チロシンキナーゼドメインは配列表の配
列番号3のアミノ酸配列に相当する。同様に、SH3ド
メインは、配列表の配列番号4の7番目から70番目ま
でのアミノ酸配列に相当し、また、SH2ドメインは同
じく81番目から155番目に相当し、チロシンキナー
ゼドメインは192番目から437番目に相当する。さ
らに同様に、SH3ドメインは、配列表の配列番号5の
48番目から111番目までのアミノ酸配列に相当し、
また、SH2ドメインは同じく122番目から196番
目に相当し、チロシンキナーゼドメインは233番目か
ら478番目に相当する。また、配列表の配列番号6は
配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするcDNAの配列の1例に相当し、配列番号7は配
列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するcDNAの配列の1例に相当し、配列番号8は配列
番号3のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るcDNAの配列の1例に相当する。
【0013】SH2の機能は、りん酸化されたチロシン
残基を含むタンパク質を認識し、結合することであり
(Songyang et al. Cell 72:767,1993)、またSH3の
機能も、プロトオンコジーンであるras等に対する交
換因子SOSのプロリン残基に富んだ配列を認識するこ
ととされている(Egan et al. Nature 363:45,1993)。
これらの部位のみ、あるいはこれらを組み合わせて作製
されたペプチドも、同様の認識機能を有すると考えられ
る。また、その部位に対するセンスもしくはアンチセン
スDNA、またはその誘導体は、チロシンキナ−ゼの測
定等に用いるうえで重要である。
残基を含むタンパク質を認識し、結合することであり
(Songyang et al. Cell 72:767,1993)、またSH3の
機能も、プロトオンコジーンであるras等に対する交
換因子SOSのプロリン残基に富んだ配列を認識するこ
ととされている(Egan et al. Nature 363:45,1993)。
これらの部位のみ、あるいはこれらを組み合わせて作製
されたペプチドも、同様の認識機能を有すると考えられ
る。また、その部位に対するセンスもしくはアンチセン
スDNA、またはその誘導体は、チロシンキナ−ゼの測
定等に用いるうえで重要である。
【0014】本発明の配列表の配列番号5に示す新規チ
ロシンキナーゼのアミノ酸配列は、すでに報告されてい
る細胞質型チロシンキナーゼであるCSK(Nada et a
l., Nature:351,60,1991 )と高い相同性を示し、ホモ
ロジーは全体で53.9%、SH2ドメインで57.4
%、SH3ドメインで40.5%、キナーゼドメインで
58.9%である。CSKとは、SH2、SH3ドメイ
ンを持つ細胞質型チロシンキナーゼであり、またその活
性は、多くのsrcファミリー遺伝子産物のC末端側の
チロシン残基を特異的にりん酸化することである。この
りん酸化によって、srcファミリー遺伝子産物の活性
化は抑えられる。最近のCSKジーンターゲッティング
マウスの解析によれば、srcファミリー遺伝子産物が
恒常的に活性化されると、マウスは神経管形成がうまく
ゆかず、初期分化時にすべて死んでしまうことが明らか
となっている。CSKの遺伝子発現は、各種の臓器で見
られるが、本発明の遺伝子発現は血液系細胞の特定の分
化段階でのみ見られることから、CSKとは異なった役
割を担っていると考えられる。
ロシンキナーゼのアミノ酸配列は、すでに報告されてい
る細胞質型チロシンキナーゼであるCSK(Nada et a
l., Nature:351,60,1991 )と高い相同性を示し、ホモ
ロジーは全体で53.9%、SH2ドメインで57.4
%、SH3ドメインで40.5%、キナーゼドメインで
58.9%である。CSKとは、SH2、SH3ドメイ
ンを持つ細胞質型チロシンキナーゼであり、またその活
性は、多くのsrcファミリー遺伝子産物のC末端側の
チロシン残基を特異的にりん酸化することである。この
りん酸化によって、srcファミリー遺伝子産物の活性
化は抑えられる。最近のCSKジーンターゲッティング
マウスの解析によれば、srcファミリー遺伝子産物が
恒常的に活性化されると、マウスは神経管形成がうまく
ゆかず、初期分化時にすべて死んでしまうことが明らか
となっている。CSKの遺伝子発現は、各種の臓器で見
られるが、本発明の遺伝子発現は血液系細胞の特定の分
化段階でのみ見られることから、CSKとは異なった役
割を担っていると考えられる。
【0015】数あるチロシンキナーゼの多くは一般に基
質としてエノラーゼタンパク、チロシン残基を多く持つ
合成ペプチド等をりん酸化するが、細胞内の生理活性を
示す際の基質は各々のチロシンキナーゼにより異なった
特定のものがあり、今までに見いだされている他のチロ
シンキナーゼの基質と本発明の新規チロシンキナーゼの
それとは異なっていると考えられる。同様に、SH3ド
メイン、SH2ドメインもりん酸化チロシンを含む合成
ペプチドライブラリーを用いた近年の研究から、各々特
定の配列を認識して結合することが理解されつつある。
従って、本発明の新規チロシンキナーゼは全体及びSH
3ドメイン、SH2ドメイン、キナーゼドメイン各々に
ついても今までに見いだされたチロシンキナーゼとは異
なった基質、結合タンパクを持つと考えられる。
質としてエノラーゼタンパク、チロシン残基を多く持つ
合成ペプチド等をりん酸化するが、細胞内の生理活性を
示す際の基質は各々のチロシンキナーゼにより異なった
特定のものがあり、今までに見いだされている他のチロ
シンキナーゼの基質と本発明の新規チロシンキナーゼの
それとは異なっていると考えられる。同様に、SH3ド
メイン、SH2ドメインもりん酸化チロシンを含む合成
ペプチドライブラリーを用いた近年の研究から、各々特
定の配列を認識して結合することが理解されつつある。
従って、本発明の新規チロシンキナーゼは全体及びSH
3ドメイン、SH2ドメイン、キナーゼドメイン各々に
ついても今までに見いだされたチロシンキナーゼとは異
なった基質、結合タンパクを持つと考えられる。
【0016】同じ塩基配列を有するmRNAであって
も、開始コドンAUGが複数存在すれば、複数のポリペ
プチドに翻訳されうることは、M.Kozak(J. Cell Bio
l.,115:887,1991)の総説などからも、明らかである。
配列表の配列番号11に示すcDNAにも、開始コドン
は208〜210番目と331〜333番目の2つ存在
するので、本発明の新規チロシンキナーゼも、配列表の
配列番号5および配列番号4に示す2つのポリペプチド
が得られる。また、配列表の配列番号9は配列番号4の
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするcDN
Aの配列の1例に相当し、配列番号10は配列番号5の
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするcDN
Aの配列の1例に相当する。
も、開始コドンAUGが複数存在すれば、複数のポリペ
プチドに翻訳されうることは、M.Kozak(J. Cell Bio
l.,115:887,1991)の総説などからも、明らかである。
配列表の配列番号11に示すcDNAにも、開始コドン
は208〜210番目と331〜333番目の2つ存在
するので、本発明の新規チロシンキナーゼも、配列表の
配列番号5および配列番号4に示す2つのポリペプチド
が得られる。また、配列表の配列番号9は配列番号4の
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするcDN
Aの配列の1例に相当し、配列番号10は配列番号5の
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするcDN
Aの配列の1例に相当する。
【0017】配列表の配列番号4および配列番号5に示
すアミノ酸配列を有する新規チロシンキナーゼを基にす
れば、チロシンキナーゼの機能を損なうことなく、遺伝
的変異を導入したチロシンキナ−ゼを作出することもで
きる。また、配列表の配列番号4および配列番号5に示
したポリペプチドをコードするDNA、及び配列表の配
列番号11に示すDNAは、新規チロシンキナーゼをコ
ードするcDNA、イントロン及びエクソンを含む染色
体DNA、同染色体のイントロンを除去し、エクソンを
連結したDNA,更に合成DNA法にて人為的に作製し
たオリゴヌクレオチドを連結したDNAなど、様々な形
態で存在しうる。更に、遺伝コードの縮重という概念が
知られており、塩基配列が異なっても、同一のアミノ酸
配列を有するポリペプチドが翻訳されうる。また5’非
翻訳領域及び3’非翻訳領域はポリペプチドのアミノ酸
配列の規定に関与しないので、それらの領域のDNA配
列は変異しやすいことも知られている。 新規チロシン
キナーゼ遺伝子のmRNA発現量は、UT−7が未分化
な条件では低いが、巨核球、赤芽球へと分化するに伴い
上昇してくる。よって血液細胞の分化に極めて重要な働
きを持つと推察される。
すアミノ酸配列を有する新規チロシンキナーゼを基にす
れば、チロシンキナーゼの機能を損なうことなく、遺伝
的変異を導入したチロシンキナ−ゼを作出することもで
きる。また、配列表の配列番号4および配列番号5に示
したポリペプチドをコードするDNA、及び配列表の配
列番号11に示すDNAは、新規チロシンキナーゼをコ
ードするcDNA、イントロン及びエクソンを含む染色
体DNA、同染色体のイントロンを除去し、エクソンを
連結したDNA,更に合成DNA法にて人為的に作製し
たオリゴヌクレオチドを連結したDNAなど、様々な形
態で存在しうる。更に、遺伝コードの縮重という概念が
知られており、塩基配列が異なっても、同一のアミノ酸
配列を有するポリペプチドが翻訳されうる。また5’非
翻訳領域及び3’非翻訳領域はポリペプチドのアミノ酸
配列の規定に関与しないので、それらの領域のDNA配
列は変異しやすいことも知られている。 新規チロシン
キナーゼ遺伝子のmRNA発現量は、UT−7が未分化
な条件では低いが、巨核球、赤芽球へと分化するに伴い
上昇してくる。よって血液細胞の分化に極めて重要な働
きを持つと推察される。
【0018】新規チロシンキナーゼ遺伝子で形質転換し
た細胞は、チロシンキナーゼの基礎研究やドラッグデザ
インの研究に利用したり、医薬品の開発に使用したりす
る事が可能である。医薬品としては、チロシンキナーゼ
を介したシグナル伝達系を特異的に制御する抗ガン剤、
又はアンチセンスDNAやアンチセンスRNAもしくは
それらにメチル化等を施した核酸誘導体を用いた血液細
胞の分化制御剤などが考えられる。すなわち、配列表の
配列番号11の配列で表わされる塩基配列の一部と対を
なすDNAまたはRNAは、血液細胞の分化研究や医薬
品に利用可能である。あるいは、配列表の配列番号4お
よび配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチドに
対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体で、細胞
内の遺伝子発現を調節することも可能である。
た細胞は、チロシンキナーゼの基礎研究やドラッグデザ
インの研究に利用したり、医薬品の開発に使用したりす
る事が可能である。医薬品としては、チロシンキナーゼ
を介したシグナル伝達系を特異的に制御する抗ガン剤、
又はアンチセンスDNAやアンチセンスRNAもしくは
それらにメチル化等を施した核酸誘導体を用いた血液細
胞の分化制御剤などが考えられる。すなわち、配列表の
配列番号11の配列で表わされる塩基配列の一部と対を
なすDNAまたはRNAは、血液細胞の分化研究や医薬
品に利用可能である。あるいは、配列表の配列番号4お
よび配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチドに
対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体で、細胞
内の遺伝子発現を調節することも可能である。
【0019】実施例8に示した通り、アンチセンスDN
Aは、本発明の遺伝子のmRNAに特異的に結合する。
アンチセンスDNAまたはその誘導体は12mer以上
であればよいが、14merから16merがより望ま
しい。さらに同様に、実施例9に示したようにアンチセ
ンスRNAも同様に有効である。アンチセンスDNA、
RNAまたはその誘導体は、メチルフォスフェート化、
脱アミノ化、チオフォスフェイト化したものでもよく、
本発明の遺伝子と特異的に対をなすものであればよい。
Aは、本発明の遺伝子のmRNAに特異的に結合する。
アンチセンスDNAまたはその誘導体は12mer以上
であればよいが、14merから16merがより望ま
しい。さらに同様に、実施例9に示したようにアンチセ
ンスRNAも同様に有効である。アンチセンスDNA、
RNAまたはその誘導体は、メチルフォスフェート化、
脱アミノ化、チオフォスフェイト化したものでもよく、
本発明の遺伝子と特異的に対をなすものであればよい。
【0020】さらに、本チロシンキナーゼ酵素活性を阻
害もしくは附活化することを指標にして、本チロシンキ
ナーゼの活性を調節する化学物質のスクリーニングする
ことが可能であり、同様に、SH2ドメイン、SH3ド
メイン及びその認識部位との結合阻害を指標に新規チロ
シンキナーゼの細胞内のシグナル伝達を調節する化学物
質をスクリーニングすることが可能である。この方法に
より抗癌剤、細胞増殖阻害剤、促進剤などの有用な医薬
品を開発する手法を提供する。以下実施例によって、本
発明をより具体的に説明する。
害もしくは附活化することを指標にして、本チロシンキ
ナーゼの活性を調節する化学物質のスクリーニングする
ことが可能であり、同様に、SH2ドメイン、SH3ド
メイン及びその認識部位との結合阻害を指標に新規チロ
シンキナーゼの細胞内のシグナル伝達を調節する化学物
質をスクリーニングすることが可能である。この方法に
より抗癌剤、細胞増殖阻害剤、促進剤などの有用な医薬
品を開発する手法を提供する。以下実施例によって、本
発明をより具体的に説明する。
【0021】
【0022】
【実施例1】 ヒト血液細胞株UT−7のPoly(A) + R
NAの調製 UT−7細胞の培養、継代は、培地として牛胎児血清
(FCS)を10%含むイスコフ改変ダルベッコ培地
(IMDM)を用い、ヒト顆粒球単球コロニー形成因子
(hGM−CSF)を2ng/mlとなるように加え、
CO2 インキュベーターにて37℃の条件で行った。未
刺激細胞も、同じ条件で培養した細胞を用いた。巨核球
に分化させる際には、細胞濃度2×105 cells/
mlに希釈し、hGM−CSFを2ng/mlとなるよ
うに加え、さらに Phorbol 12-Myristate 13-Acetate
(PMA)を10ng/mlとなるように加え、3日間
培養後細胞を回収した。また、赤芽球に分化させる際に
は細胞濃度を2×105 cells/mlに希釈し、ヒ
トエリスロポエチン(hEPO)を1unit/mlと
なるように加え、酪酸(Butyric acid)を1.3mMと
なるように加え、3日間培養後細胞を回収した。これら
3条件で培養した細胞を各々細胞数1×108 個回収
し、PBS(−)にて三回洗浄し、RNAの抽出に用い
た。
NAの調製 UT−7細胞の培養、継代は、培地として牛胎児血清
(FCS)を10%含むイスコフ改変ダルベッコ培地
(IMDM)を用い、ヒト顆粒球単球コロニー形成因子
(hGM−CSF)を2ng/mlとなるように加え、
CO2 インキュベーターにて37℃の条件で行った。未
刺激細胞も、同じ条件で培養した細胞を用いた。巨核球
に分化させる際には、細胞濃度2×105 cells/
mlに希釈し、hGM−CSFを2ng/mlとなるよ
うに加え、さらに Phorbol 12-Myristate 13-Acetate
(PMA)を10ng/mlとなるように加え、3日間
培養後細胞を回収した。また、赤芽球に分化させる際に
は細胞濃度を2×105 cells/mlに希釈し、ヒ
トエリスロポエチン(hEPO)を1unit/mlと
なるように加え、酪酸(Butyric acid)を1.3mMと
なるように加え、3日間培養後細胞を回収した。これら
3条件で培養した細胞を各々細胞数1×108 個回収
し、PBS(−)にて三回洗浄し、RNAの抽出に用い
た。
【0023】回収した細胞から Lithium Chloride/Urea
法(Eur.J.Biochem. 107:303 (1980) )にて TotalRN
Aを抽出した。次に、Oligotex-dT 30(宝酒造株式会
社)にて、Poly(A) + RNAを分離・精製した。
法(Eur.J.Biochem. 107:303 (1980) )にて TotalRN
Aを抽出した。次に、Oligotex-dT 30(宝酒造株式会
社)にて、Poly(A) + RNAを分離・精製した。
【0024】
【実施例2】 チロシンキナーゼに特異的なプライマー
の作成 Wilksの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1603,1
989)に従い、チロシンキナーゼのサブドメイン7と9
に対応し、かつ制限酵素の認識部位を連結した混合プラ
イマー、すなわちセンスプライマーPTKI: 5'-TTGT
CGACAC(AC)G(AG)GA(CT)(CT)T(CG)GC(ACGT)GC(ACGT)(AC)
G-3'、(27mer :制限酵素の認識部位として SalI 部
位が付加されている)およびアンチセンスプライマーP
TKII:3'-CT(AG)CA(CG)ACC(AT)(CG)(AG)A(AT)ACCTT
AAGGT-5'(24 mer:制限酵素の認識部位としてEcoRI
部位が付加されている)を用い以下のPCRを行った。
の作成 Wilksの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1603,1
989)に従い、チロシンキナーゼのサブドメイン7と9
に対応し、かつ制限酵素の認識部位を連結した混合プラ
イマー、すなわちセンスプライマーPTKI: 5'-TTGT
CGACAC(AC)G(AG)GA(CT)(CT)T(CG)GC(ACGT)GC(ACGT)(AC)
G-3'、(27mer :制限酵素の認識部位として SalI 部
位が付加されている)およびアンチセンスプライマーP
TKII:3'-CT(AG)CA(CG)ACC(AT)(CG)(AG)A(AT)ACCTT
AAGGT-5'(24 mer:制限酵素の認識部位としてEcoRI
部位が付加されている)を用い以下のPCRを行った。
【0025】合成オリゴヌクレオチドは固相法を原理と
する全自動DNA合成機を使用して作成した。全自動D
NA合成機としてはアプライドバイオシステム社391
PCR−MATEを使用した。ヌクレオチド、3'-ヌク
レオチドを固定した担体、溶液、および試薬は同社の指
示に従って使用した。所定のカップリング反応を終了
し、トリクロロ酢酸で5’末端の保護基を除去したオリ
ゴヌクレオチド担体を濃アンモニア中に室温で1時間放
置することにより、担体からオリゴヌクレオチドを遊離
させた。次に、核酸及びリン酸の保護基を遊離させるた
めに、核酸を含む反応液を、封をしたバイアル内におい
て濃アンモニア溶液中で55℃にて14時間以上放置し
た。担体及び保護基を遊離した各々のオリゴヌクレオチ
ドの精製をアプライドバイオシステム社のOPCカート
リッジを使用して行い、2%トリフルオロ酢酸で脱トリ
チル化した。精製後のプライマーは最終濃度が1μg/
μlとなるように脱イオン水に溶解してPCRに使用し
た。
する全自動DNA合成機を使用して作成した。全自動D
NA合成機としてはアプライドバイオシステム社391
PCR−MATEを使用した。ヌクレオチド、3'-ヌク
レオチドを固定した担体、溶液、および試薬は同社の指
示に従って使用した。所定のカップリング反応を終了
し、トリクロロ酢酸で5’末端の保護基を除去したオリ
ゴヌクレオチド担体を濃アンモニア中に室温で1時間放
置することにより、担体からオリゴヌクレオチドを遊離
させた。次に、核酸及びリン酸の保護基を遊離させるた
めに、核酸を含む反応液を、封をしたバイアル内におい
て濃アンモニア溶液中で55℃にて14時間以上放置し
た。担体及び保護基を遊離した各々のオリゴヌクレオチ
ドの精製をアプライドバイオシステム社のOPCカート
リッジを使用して行い、2%トリフルオロ酢酸で脱トリ
チル化した。精製後のプライマーは最終濃度が1μg/
μlとなるように脱イオン水に溶解してPCRに使用し
た。
【0026】
【実施例3】 cDNAの合成 実施例1により得られたPoly(A) + RNAを用いてcD
NAの合成を行った。すなわち、Poly(A) + RNAの2
μgを脱イオン水12.3μlに溶解し、10×緩衝液
(500mM KCl,100mM Tris-HCl pH8.3, 15mM MgCl2, 0.01
%ゼラチン)2μl、dNTP(2.5mM )4μl、前述
のチロシンキナーゼに特異的なアンチセンスプライマー
PTKII(1μg/μl)1μl、アビアンミエロブ
ラストシスウイルス逆転写酵素(avian myeloblastosis
virus reverse transcriptase:Life Science社:32
U/μl)0.2μl、及びRNaseインヒビター
(Boehringer:40U/μl)0.5μl加えて37℃
で75分間放置後、65℃で10分間放置した。
NAの合成を行った。すなわち、Poly(A) + RNAの2
μgを脱イオン水12.3μlに溶解し、10×緩衝液
(500mM KCl,100mM Tris-HCl pH8.3, 15mM MgCl2, 0.01
%ゼラチン)2μl、dNTP(2.5mM )4μl、前述
のチロシンキナーゼに特異的なアンチセンスプライマー
PTKII(1μg/μl)1μl、アビアンミエロブ
ラストシスウイルス逆転写酵素(avian myeloblastosis
virus reverse transcriptase:Life Science社:32
U/μl)0.2μl、及びRNaseインヒビター
(Boehringer:40U/μl)0.5μl加えて37℃
で75分間放置後、65℃で10分間放置した。
【0027】
【実施例4】 チロシンキナーゼに特異的なプライマー
によるPCR PCRによる増幅は以下のように行った。実施例3で得
られたcDNA溶液20μlを使用し、10×緩衝液
(500mM KCl,100mM Tris-HCl pH8.3, 15mM MgCl2, 0.01
% ゼラチン)8μl、dNTP(2.5mM )6.4μl、
前述のチロシンキナーゼに特異的なセンスプライマーP
TKI(1μg/μl)1.5μl、及びTaqDNA
ポリメラーゼ(AmpliTaq:5U/μl)0.2μlを加
え、最後に脱イオン水を加えて全量を100μlとし
て、94℃で1分間、37℃で2分間、72℃で3分間
からなる工程を1サイクルとして、この工程を40サイ
クル行い、最後に72℃にて7分間放置してPCRを行
った。このPCR産物の一部で2%アガロースゲル電気
泳動を行い、エチジュウムブロマイドにて染色後、紫外
線下で観察し、約210bpのcDNAが増幅されてい
ることを確認した。
によるPCR PCRによる増幅は以下のように行った。実施例3で得
られたcDNA溶液20μlを使用し、10×緩衝液
(500mM KCl,100mM Tris-HCl pH8.3, 15mM MgCl2, 0.01
% ゼラチン)8μl、dNTP(2.5mM )6.4μl、
前述のチロシンキナーゼに特異的なセンスプライマーP
TKI(1μg/μl)1.5μl、及びTaqDNA
ポリメラーゼ(AmpliTaq:5U/μl)0.2μlを加
え、最後に脱イオン水を加えて全量を100μlとし
て、94℃で1分間、37℃で2分間、72℃で3分間
からなる工程を1サイクルとして、この工程を40サイ
クル行い、最後に72℃にて7分間放置してPCRを行
った。このPCR産物の一部で2%アガロースゲル電気
泳動を行い、エチジュウムブロマイドにて染色後、紫外
線下で観察し、約210bpのcDNAが増幅されてい
ることを確認した。
【0028】
【実施例5】 PCR産物のクローニング及び塩基配列
の決定 PCR産物の全量を、低沸点アガロースにて作成した2
%アガロースゲルで電気泳動し、エチジュウムブロマイ
ドにて染色後、紫外線照射下にて約210bpのバンド
を切り出し、cDNAを精製回収した。回収したcDN
Aを制限酵素EcoRI及び SalIにて消化したのち、一部を
再度アガロース電気泳動にて泳動し、ベクターへの組み
込みに用いた。
の決定 PCR産物の全量を、低沸点アガロースにて作成した2
%アガロースゲルで電気泳動し、エチジュウムブロマイ
ドにて染色後、紫外線照射下にて約210bpのバンド
を切り出し、cDNAを精製回収した。回収したcDN
Aを制限酵素EcoRI及び SalIにて消化したのち、一部を
再度アガロース電気泳動にて泳動し、ベクターへの組み
込みに用いた。
【0029】ベクターとしては pBluescript II KS(To
yobo社)を用い、先のcDNAを組み込む前に、制限酵
素 EcoRI及びSalIで消化し、さらに末端をアルカリフォ
スファターゼ(CIAP:宝酒造)にて末端の脱リン酸
を行った。これらの処理を行ったベクターと先のcDN
Aのモル比が1:5となるように混ぜ合わせて、T4リ
ガーゼ(T4 ligase, NEB社)にてベクターにcDNAを
組み込んだ。cDNAが組み込まれた pBluescriptを大
腸菌JM109に遺伝子導入し、アンピシリンを50μ
g/ml含むL−Broth半固型培地のプレートに蒔
き、12時間程度37℃に放置し、現れてきたコロニー
をランダムに選択し、cDNAが組み込まれていること
を制限酵素 EcoRI及びSalIにて消化して、210bpの
cDNAが切れ出されてくることを確認し、確認された
クローンについて、組み込まれているcDNAの塩基配
列をアプライドバイオシステム社の螢光シークエンサー
にて決定した。その結果、未刺激のUT−7細胞の場合
には98クローンのうち1クローンしか現れてこない
が、巨核球に分化させた場合には51クローンのうち8
クローン、赤芽球に分化させた場合53クローン中7ク
ローンと分化させた際に高頻度に現れてくる新規チロシ
ンキナーゼ遺伝子断片が存在することが確認された。こ
の遺伝子断片は配列表の配列番号11の1276番目か
ら1421番目に相当する。
yobo社)を用い、先のcDNAを組み込む前に、制限酵
素 EcoRI及びSalIで消化し、さらに末端をアルカリフォ
スファターゼ(CIAP:宝酒造)にて末端の脱リン酸
を行った。これらの処理を行ったベクターと先のcDN
Aのモル比が1:5となるように混ぜ合わせて、T4リ
ガーゼ(T4 ligase, NEB社)にてベクターにcDNAを
組み込んだ。cDNAが組み込まれた pBluescriptを大
腸菌JM109に遺伝子導入し、アンピシリンを50μ
g/ml含むL−Broth半固型培地のプレートに蒔
き、12時間程度37℃に放置し、現れてきたコロニー
をランダムに選択し、cDNAが組み込まれていること
を制限酵素 EcoRI及びSalIにて消化して、210bpの
cDNAが切れ出されてくることを確認し、確認された
クローンについて、組み込まれているcDNAの塩基配
列をアプライドバイオシステム社の螢光シークエンサー
にて決定した。その結果、未刺激のUT−7細胞の場合
には98クローンのうち1クローンしか現れてこない
が、巨核球に分化させた場合には51クローンのうち8
クローン、赤芽球に分化させた場合53クローン中7ク
ローンと分化させた際に高頻度に現れてくる新規チロシ
ンキナーゼ遺伝子断片が存在することが確認された。こ
の遺伝子断片は配列表の配列番号11の1276番目か
ら1421番目に相当する。
【0030】
【実施例6】 cDNAライブラリーの作成及び新規チ
ロシンキナーゼ遺伝子の全長クローニング 前述の方法にて分離精製された未刺激状態のUT−7細
胞のPoly(A) + RNAを用いてcDNAライブラリーを
作成した。cDNAライブラリーの作成にはpCDM8
ベクターcDNAライブラリー作成キット(インビトロ
ゲン社)を用い、添付の作成方法に従って作成した。
ロシンキナーゼ遺伝子の全長クローニング 前述の方法にて分離精製された未刺激状態のUT−7細
胞のPoly(A) + RNAを用いてcDNAライブラリーを
作成した。cDNAライブラリーの作成にはpCDM8
ベクターcDNAライブラリー作成キット(インビトロ
ゲン社)を用い、添付の作成方法に従って作成した。
【0031】次に、このcDNAライブラリーからコロ
ニーハイブリダイゼーションにて全長cDNAクローン
の検索を5×105 個程度のコロニーから行った。出現
したコロニーをナイロンフィルター(Hybond N+ :Amer
sham社)に転写し、転写したナイロンフィルターをアル
カリ処理(1.5M NaCl, 0.5M NaOHを染み込ませたろ紙上
に7分間放置)し、次いで中和処理(1.5M NaCl,0.5M T
ris-HCl pH7.2, 1mM EDTA を染み込ませたろ紙上に3分
間放置)を2回行い、次に2倍濃度のSSPE(0.36M
NaCl, 0.02M リン酸ナトリウム pH7.7, 2mM EDTA)中で
5分間振とう後洗浄し、風乾した。その後、0.4M NaOH
を染み込ませたろ紙上に20分間放置し、5倍濃度のS
SPEで5分間振とう後洗浄し、再度風乾し、このフィ
ルターを放射性同位元素32P標識されたcDNAプロー
ブでスクリーニングを行った。
ニーハイブリダイゼーションにて全長cDNAクローン
の検索を5×105 個程度のコロニーから行った。出現
したコロニーをナイロンフィルター(Hybond N+ :Amer
sham社)に転写し、転写したナイロンフィルターをアル
カリ処理(1.5M NaCl, 0.5M NaOHを染み込ませたろ紙上
に7分間放置)し、次いで中和処理(1.5M NaCl,0.5M T
ris-HCl pH7.2, 1mM EDTA を染み込ませたろ紙上に3分
間放置)を2回行い、次に2倍濃度のSSPE(0.36M
NaCl, 0.02M リン酸ナトリウム pH7.7, 2mM EDTA)中で
5分間振とう後洗浄し、風乾した。その後、0.4M NaOH
を染み込ませたろ紙上に20分間放置し、5倍濃度のS
SPEで5分間振とう後洗浄し、再度風乾し、このフィ
ルターを放射性同位元素32P標識されたcDNAプロー
ブでスクリーニングを行った。
【0032】放射性同位元素32Pにて標識されたcDN
Aプローブは以下のように作成した。すなわち、新規チ
ロシンキナーゼの部分cDNAが組み込まれた pBluesc
riptより、SalIと EcoRIにてベクターより切り出し、低
融点アガロースゲルからDNA断片を精製回収した。得
られたcDNA断片をDNAラベリングキット(Megapr
ime DNA labeling system :Amersham社)を用いて標識
した。すなわち、DNA25ngにプライマー液5μl
及び脱イオン水を加えて全量を33μlとして沸騰水浴
を5分間行い、その後、dNTPを含む反応緩衝液10
μl、α-32P−dCTP5μl、及びT4DNAポリヌク
レオチドキナーゼ溶液2μlを加えて、37℃で10分
間水浴し、更にその後、セファデックスカラム(Quick
Spin Column Sephadex G-50 :Boehringer社)で精製
し、5分間沸騰水浴をしたのち、2分間氷冷して使用し
た。
Aプローブは以下のように作成した。すなわち、新規チ
ロシンキナーゼの部分cDNAが組み込まれた pBluesc
riptより、SalIと EcoRIにてベクターより切り出し、低
融点アガロースゲルからDNA断片を精製回収した。得
られたcDNA断片をDNAラベリングキット(Megapr
ime DNA labeling system :Amersham社)を用いて標識
した。すなわち、DNA25ngにプライマー液5μl
及び脱イオン水を加えて全量を33μlとして沸騰水浴
を5分間行い、その後、dNTPを含む反応緩衝液10
μl、α-32P−dCTP5μl、及びT4DNAポリヌク
レオチドキナーゼ溶液2μlを加えて、37℃で10分
間水浴し、更にその後、セファデックスカラム(Quick
Spin Column Sephadex G-50 :Boehringer社)で精製
し、5分間沸騰水浴をしたのち、2分間氷冷して使用し
た。
【0033】前述の方法にて作成したフィルターを、各
々の成分の最終濃度が5倍濃度のSSPE、5倍濃度の
デンハルト液、0.5%SDS(ドデシル硫酸ナトリウ
ム)、及び10mg/mlの沸騰水浴により変性したサ
ケ精子DNAであるプレハイブリダイゼーション液中に
浸し、65℃にて2時間振とうしたのち、前述の方法で
32P標識されたプローブを含むプレハイブリダイゼーシ
ョン液と同一組成のハイブリダイゼーション液に浸し、
65℃にて16時間振とうし、ハイブリダイゼーション
を行った。
々の成分の最終濃度が5倍濃度のSSPE、5倍濃度の
デンハルト液、0.5%SDS(ドデシル硫酸ナトリウ
ム)、及び10mg/mlの沸騰水浴により変性したサ
ケ精子DNAであるプレハイブリダイゼーション液中に
浸し、65℃にて2時間振とうしたのち、前述の方法で
32P標識されたプローブを含むプレハイブリダイゼーシ
ョン液と同一組成のハイブリダイゼーション液に浸し、
65℃にて16時間振とうし、ハイブリダイゼーション
を行った。
【0034】次に、フィルターを0.1%SDSを含む
SSPE溶液に浸し、65℃にて振とうし2回洗浄後、
さらに0.1%SDSを含む10倍希釈したSSPE溶
液に浸し、65℃にて4回洗浄した。洗浄を終了したフ
ィルターを増感スクリーンを使用して、オートラジオグ
ラフィーを行った。その結果、強く露光された部分のク
ローンを拾い、再度コロニーを蒔き直し前述の方法にて
スクリーニングを行い、クローンを分離した。
SSPE溶液に浸し、65℃にて振とうし2回洗浄後、
さらに0.1%SDSを含む10倍希釈したSSPE溶
液に浸し、65℃にて4回洗浄した。洗浄を終了したフ
ィルターを増感スクリーンを使用して、オートラジオグ
ラフィーを行った。その結果、強く露光された部分のク
ローンを拾い、再度コロニーを蒔き直し前述の方法にて
スクリーニングを行い、クローンを分離した。
【0035】分離されたクローンから前掲の Maniatis
らの実験書に掲載の方法に従いプラスミドを精製し、制
限酵素 XohI にて消化し、低融点アガロース電気泳動に
てcDNAを精製し、 pBluescriptに組み込んだ。組み
込まれたcDNAのサイズはおよそ2kbpであった。
らの実験書に掲載の方法に従いプラスミドを精製し、制
限酵素 XohI にて消化し、低融点アガロース電気泳動に
てcDNAを精製し、 pBluescriptに組み込んだ。組み
込まれたcDNAのサイズはおよそ2kbpであった。
【0036】
【実施例7】 新規チロシンキナーゼの塩基配列の決定 新規チロシンキナーゼのcDNAの塩基配列決定はファ
ルマシア社ALFDNAシークエンサーおよびファルマ
シア社ALFシークエンサー用ラベリングキットを用
い、添付の使用説明書に従って行った。全長の塩基配列
決定を行うため宝酒造株式会社キロシークエンス用デリ
ューションミュータント・キットを用い、添付の使用説
明書に従い、デリューションミュタントを作成し、cD
NAの両方向についての塩基配列を決定した。
ルマシア社ALFDNAシークエンサーおよびファルマ
シア社ALFシークエンサー用ラベリングキットを用
い、添付の使用説明書に従って行った。全長の塩基配列
決定を行うため宝酒造株式会社キロシークエンス用デリ
ューションミュータント・キットを用い、添付の使用説
明書に従い、デリューションミュタントを作成し、cD
NAの両方向についての塩基配列を決定した。
【0037】
【実施例8】 ノザンブロッティングによるmRNAの
発現 本新規チロシンキナーゼのmRNAの発現を調べるた
め、あらかじめmRNAが転写されているフィルターで
ある Clotech社 Human Multiple Tissue Northern Blo
t、Human Multiple Tissue Northern Blot II、Human F
etal Multiple Tissue Northern Blot、Human Brain Mu
ltiple Tissue Northern Blot、並びに実施例1に示し
た方法にて回収されたmRNAをアガロース電気泳動
し、Zeta-Prob(Bio-Rad 社)にトランスファーして作
成したフィルターを用い、新規チロシンキナーゼの全長
のcDNAをsmaIにて消化し、生じた約800塩基
対の断片を前掲のDNAラベリングキット(MegaPrime
DNA labelingsystem:Amersham社)にて32P標識し発現
を調べた。
発現 本新規チロシンキナーゼのmRNAの発現を調べるた
め、あらかじめmRNAが転写されているフィルターで
ある Clotech社 Human Multiple Tissue Northern Blo
t、Human Multiple Tissue Northern Blot II、Human F
etal Multiple Tissue Northern Blot、Human Brain Mu
ltiple Tissue Northern Blot、並びに実施例1に示し
た方法にて回収されたmRNAをアガロース電気泳動
し、Zeta-Prob(Bio-Rad 社)にトランスファーして作
成したフィルターを用い、新規チロシンキナーゼの全長
のcDNAをsmaIにて消化し、生じた約800塩基
対の断片を前掲のDNAラベリングキット(MegaPrime
DNA labelingsystem:Amersham社)にて32P標識し発現
を調べた。
【0038】ヒト成人組織のうち心臓、胎盤、肝臓、骨
格筋、腎臓、すい臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸では発
現がまったく見られず、脳、脾臓、大腸、末梢血リンパ
球において発現が認められ、また、弱いながら肺、胸腺
においても発現が認められた。ヒト胎児組織においては
心臓、肺、肝臓、腎臓において発現が認められなかった
が、脳において発現が認められた。更に、ヒト成人脳組
織においてはAmygdala、Caudate Nucleus、Corpus Call
osum、Hippocampus、 Hypothalamus、Substantia Nigr
a、Subthalamic Nucleus、Thalamusのいずれにおいても
発現が認められた。また、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株
KG1a(Blood 62:709,1983 ),ヒトさい帯血から樹
立された細胞株KMT−2(Blood 76:501,1990 ),ヒ
ト慢性骨髄性白血病細胞株K562(Blood 45:321,197
5 ),並びに前述の骨髄巨核芽球性白血病由来細胞株U
T−7において発現がみられ、さらにK562,UT−
7においてはPMAにて刺激を加え巨核球へ分化させる
と発現量が増加することが認められた。
格筋、腎臓、すい臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸では発
現がまったく見られず、脳、脾臓、大腸、末梢血リンパ
球において発現が認められ、また、弱いながら肺、胸腺
においても発現が認められた。ヒト胎児組織においては
心臓、肺、肝臓、腎臓において発現が認められなかった
が、脳において発現が認められた。更に、ヒト成人脳組
織においてはAmygdala、Caudate Nucleus、Corpus Call
osum、Hippocampus、 Hypothalamus、Substantia Nigr
a、Subthalamic Nucleus、Thalamusのいずれにおいても
発現が認められた。また、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株
KG1a(Blood 62:709,1983 ),ヒトさい帯血から樹
立された細胞株KMT−2(Blood 76:501,1990 ),ヒ
ト慢性骨髄性白血病細胞株K562(Blood 45:321,197
5 ),並びに前述の骨髄巨核芽球性白血病由来細胞株U
T−7において発現がみられ、さらにK562,UT−
7においてはPMAにて刺激を加え巨核球へ分化させる
と発現量が増加することが認められた。
【0039】しかしながら、肝細胞ガン細胞株Hep3
B(Nature 282:615,1979 )、胎児肺繊維芽細胞株MR
C−5(Nature 227:168,1970 )、急性リンパ球性白血
病細胞株MOLT−4(J.Nat.Cancer Inst. 49:891,19
72)などのリンパ球系細胞においては発現が認められな
かった。以上のことから、この遺伝子は血液細胞に特異
的に発現されており、さらに未分化細胞の分化に伴い発
現されると考えられる。
B(Nature 282:615,1979 )、胎児肺繊維芽細胞株MR
C−5(Nature 227:168,1970 )、急性リンパ球性白血
病細胞株MOLT−4(J.Nat.Cancer Inst. 49:891,19
72)などのリンパ球系細胞においては発現が認められな
かった。以上のことから、この遺伝子は血液細胞に特異
的に発現されており、さらに未分化細胞の分化に伴い発
現されると考えられる。
【0040】
【実施例9】 インサイチューハイブリダイゼーション
による末梢血球におけるmRNAの発現の確認 末梢血リンパ球の発現細胞の詳細を知るため、成人末梢
血より単核細胞をフィコールパック(ファルマシア社)
にて分離し、シェルダン社サイトスピンにてスライドグ
ラスに血液細胞を固定し、4%パラフォルムアルデヒド
PBSにて15分間固定し、ついで10mMTris−
HCl(pH8.0)、1mMEDTA、10μg/m
lプロナーゼKで構成された溶液に15分間浸し、4%
パラフォルムアルデヒドPBSにて15分間固定し、P
BSにて1回洗浄後、0.2MHClに10分間浸し、
PBSにて1回洗浄し、0.1Mトリエタノールアミン
−HCl(pH8.0)に1分間浸し、ついで0.1M
トリエタノールアミン−HCl(pH8.0)、0.2
5%アセトアルデヒドに10分間浸し、PBSで洗浄し
た後70%エタノール15秒間、80%エタノール15
秒間、90%エタノール15秒間、100%エタノール
15秒間と順次浸して完全に脱水を行い、風乾した。上
記の反応液は全て4℃に冷やしたものを用いた。以上の
方法によって固定したサンプルを以下のインサイチュー
ハイブリダイゼーションのサンプルとして用いた。
による末梢血球におけるmRNAの発現の確認 末梢血リンパ球の発現細胞の詳細を知るため、成人末梢
血より単核細胞をフィコールパック(ファルマシア社)
にて分離し、シェルダン社サイトスピンにてスライドグ
ラスに血液細胞を固定し、4%パラフォルムアルデヒド
PBSにて15分間固定し、ついで10mMTris−
HCl(pH8.0)、1mMEDTA、10μg/m
lプロナーゼKで構成された溶液に15分間浸し、4%
パラフォルムアルデヒドPBSにて15分間固定し、P
BSにて1回洗浄後、0.2MHClに10分間浸し、
PBSにて1回洗浄し、0.1Mトリエタノールアミン
−HCl(pH8.0)に1分間浸し、ついで0.1M
トリエタノールアミン−HCl(pH8.0)、0.2
5%アセトアルデヒドに10分間浸し、PBSで洗浄し
た後70%エタノール15秒間、80%エタノール15
秒間、90%エタノール15秒間、100%エタノール
15秒間と順次浸して完全に脱水を行い、風乾した。上
記の反応液は全て4℃に冷やしたものを用いた。以上の
方法によって固定したサンプルを以下のインサイチュー
ハイブリダイゼーションのサンプルとして用いた。
【0041】新規チロシンキナーゼのインサイチューハ
イブリダイゼーション用ジゴキシゲニンラベルされたR
NAプローブの作製のため、前述のノザンブロットに用
いた新規チロシンキナーゼのSmaIフラグメントを再
度、末端脱燐酸化を行ったpBluescript のSmaIサイ
トにライゲーションをしてインサイチューハイブリダイ
ゼーション用ベクターを作製した。本ベクターをキアゲ
ン社のプラスミド精製カラムにて精製調整し、制限酵素
BamHI及びEcoRIにて消化して、これをT3も
しくはT7RNAポリメラーゼを用い、ベーリンガーマ
ンハイム社DIG RNAラベリングキットにて添付の
説明書に従って新規チロシンキナーゼのセンス及びアン
チセンスRNAプローブを作成した。これらを使って末
梢血単核細胞中の新規チロシンキナーゼ発現細胞の確認
を行った。
イブリダイゼーション用ジゴキシゲニンラベルされたR
NAプローブの作製のため、前述のノザンブロットに用
いた新規チロシンキナーゼのSmaIフラグメントを再
度、末端脱燐酸化を行ったpBluescript のSmaIサイ
トにライゲーションをしてインサイチューハイブリダイ
ゼーション用ベクターを作製した。本ベクターをキアゲ
ン社のプラスミド精製カラムにて精製調整し、制限酵素
BamHI及びEcoRIにて消化して、これをT3も
しくはT7RNAポリメラーゼを用い、ベーリンガーマ
ンハイム社DIG RNAラベリングキットにて添付の
説明書に従って新規チロシンキナーゼのセンス及びアン
チセンスRNAプローブを作成した。これらを使って末
梢血単核細胞中の新規チロシンキナーゼ発現細胞の確認
を行った。
【0042】ハイブリダイゼーション液(50%フォル
ムアミド、10mMTris−HCl(pH7.6)、
200μg/mltRNA,1倍デンハルト溶液、10
%デキストラン硫酸、600mMNaCl、0.25%
SDS、1mMEDTA(pH8.0))を85℃、1
0分間加温し、作製したセンス及びアンチセンスRNA
プローブを10μg/mlとなるように加え、更に3分
間85℃におき、RNAプローブを変性させた。このプ
ローブを含むハイブリダイゼーション液を前述の風乾さ
せたサンプルの上に滴下し、パラフィルムでおおい、5
0℃にて16時間放置してハイブリダイゼーションさせ
た。
ムアミド、10mMTris−HCl(pH7.6)、
200μg/mltRNA,1倍デンハルト溶液、10
%デキストラン硫酸、600mMNaCl、0.25%
SDS、1mMEDTA(pH8.0))を85℃、1
0分間加温し、作製したセンス及びアンチセンスRNA
プローブを10μg/mlとなるように加え、更に3分
間85℃におき、RNAプローブを変性させた。このプ
ローブを含むハイブリダイゼーション液を前述の風乾さ
せたサンプルの上に滴下し、パラフィルムでおおい、5
0℃にて16時間放置してハイブリダイゼーションさせ
た。
【0043】ハイブリダイゼーションの後、50℃の5
×SSCに浸してパラフィルムをはがした後、スライド
グラスを2×SSC,50%フォルムアミドにて60
℃、30分間放置する。その後、37℃にて10mMT
ris−HCl(pH7.6)、500mMNaCl、
1mMEDTA溶液に10分間浸し、ついで37℃の同
溶液に20μg/mlRNAasAとなるように加えた
溶液に30分間浸し、更にRNaseAを含まない同溶
液に37℃、10分間浸す。その後、2×SSCにて5
0℃、20分間浸し、更に0.2×SSC、50℃、2
0分間を2回繰り返してサンプルを洗浄した。
×SSCに浸してパラフィルムをはがした後、スライド
グラスを2×SSC,50%フォルムアミドにて60
℃、30分間放置する。その後、37℃にて10mMT
ris−HCl(pH7.6)、500mMNaCl、
1mMEDTA溶液に10分間浸し、ついで37℃の同
溶液に20μg/mlRNAasAとなるように加えた
溶液に30分間浸し、更にRNaseAを含まない同溶
液に37℃、10分間浸す。その後、2×SSCにて5
0℃、20分間浸し、更に0.2×SSC、50℃、2
0分間を2回繰り返してサンプルを洗浄した。
【0044】上記のサンプルをアルカリフォスファター
ゼ標識抗DIG抗体を用いたベーリンガーマンハイム社
製DIG核酸検出キットを使用し、添付の説明書に従っ
て、新規チロシンキナーゼ遺伝子発現部位を染色した。
また、その後、ヘマトキシリン染色を行い発現細胞の同
定を形態学的に行った。その結果、リンパ球様細胞に強
く発現されていることが確認された。
ゼ標識抗DIG抗体を用いたベーリンガーマンハイム社
製DIG核酸検出キットを使用し、添付の説明書に従っ
て、新規チロシンキナーゼ遺伝子発現部位を染色した。
また、その後、ヘマトキシリン染色を行い発現細胞の同
定を形態学的に行った。その結果、リンパ球様細胞に強
く発現されていることが確認された。
【0045】更に、詳細に発現細胞を同定するため、上
記の方法で分離されたヒト末梢血単核細胞をFITC標
識抗CD3抗体(Leu4、ベクトンデッキンソン社)
でT細胞、FITC標識抗CD19抗体(Leu12、
ベクトンデッキンソン社)でB細胞、抗FITC標識C
D56抗体(Leu19、ベクトンデッキンソン社)で
NK細胞を各々染色し、コールター社製フローサイトメ
ーターEPICSエリートにて各抗体に反応する細胞群
を選別した。これらの細胞を上記の方法にて新規チロシ
ンキナーゼ遺伝子発現細胞を調べたところ、CD3抗体
反応細胞のおよそ5%から20%程度、CD56抗体反
応細胞30%から70%程度の細胞が発現しているのが
確認できた。しかしながら、CD19抗体反応細胞は殆
ど発現していなかった。このことから、T細胞、NK細
胞の分化、増殖、機能にとって重要な働きを持っている
ことが明かとなった。
記の方法で分離されたヒト末梢血単核細胞をFITC標
識抗CD3抗体(Leu4、ベクトンデッキンソン社)
でT細胞、FITC標識抗CD19抗体(Leu12、
ベクトンデッキンソン社)でB細胞、抗FITC標識C
D56抗体(Leu19、ベクトンデッキンソン社)で
NK細胞を各々染色し、コールター社製フローサイトメ
ーターEPICSエリートにて各抗体に反応する細胞群
を選別した。これらの細胞を上記の方法にて新規チロシ
ンキナーゼ遺伝子発現細胞を調べたところ、CD3抗体
反応細胞のおよそ5%から20%程度、CD56抗体反
応細胞30%から70%程度の細胞が発現しているのが
確認できた。しかしながら、CD19抗体反応細胞は殆
ど発現していなかった。このことから、T細胞、NK細
胞の分化、増殖、機能にとって重要な働きを持っている
ことが明かとなった。
【0046】
【実施例10】 新規チロシンキナーゼDNA導入形質
転換細胞株の作成 得られた配列表の配列番号9および配列番号10に示す
配列を有するDNAを配列番号11に示した新規チロシ
ンキナーゼ遺伝子からPCR法を用いて作成し、これら
の上流にSV40ウィルスの初期プロモーターをつな
ぎ、下流に停止コドン(DNA配列のTGA)を付加
し、さらにSV40ウィルスのPoly(A) + シグナルをつ
なぎ、更に同様な形でジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をつ
なぎ、配列表の配列番号4および配列番号5に記載のア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する発現プラ
スミドベクターを構築した。
転換細胞株の作成 得られた配列表の配列番号9および配列番号10に示す
配列を有するDNAを配列番号11に示した新規チロシ
ンキナーゼ遺伝子からPCR法を用いて作成し、これら
の上流にSV40ウィルスの初期プロモーターをつな
ぎ、下流に停止コドン(DNA配列のTGA)を付加
し、さらにSV40ウィルスのPoly(A) + シグナルをつ
なぎ、更に同様な形でジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をつ
なぎ、配列表の配列番号4および配列番号5に記載のア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する発現プラ
スミドベクターを構築した。
【0047】このプラスミドを精製し、その20μgを
グルコース液に懸濁したCHO細胞に導入した。導入に
はバイオラド社のジーンパルサーを用い、600Vの電
圧をかけることで、遺伝子導入を行った。細胞は2日
間、10%牛胎児血清を含む培地で培養後、メトトキセ
ート(MTX)剤を含む培地(ダルベッコMEM,10
%透析牛胎児血清)で培養し、遺伝子導入による形質転
換細胞を選択した。この細胞からmRNAを抽出し、オ
リゴdTゲルカラムによりPoly(A) + RNAを得て、実
施例8に示した方法に従ってノザンブロット用フィルタ
ーを作成し、同様な方法にて本出願チロシンキナーゼ遺
伝子のmRNAの検出を行った。その結果、mRNAが
発現していることを確認した。これにより、本出願チロ
シンキナーゼを含む形質転換細胞を得たことを確認し
た。
グルコース液に懸濁したCHO細胞に導入した。導入に
はバイオラド社のジーンパルサーを用い、600Vの電
圧をかけることで、遺伝子導入を行った。細胞は2日
間、10%牛胎児血清を含む培地で培養後、メトトキセ
ート(MTX)剤を含む培地(ダルベッコMEM,10
%透析牛胎児血清)で培養し、遺伝子導入による形質転
換細胞を選択した。この細胞からmRNAを抽出し、オ
リゴdTゲルカラムによりPoly(A) + RNAを得て、実
施例8に示した方法に従ってノザンブロット用フィルタ
ーを作成し、同様な方法にて本出願チロシンキナーゼ遺
伝子のmRNAの検出を行った。その結果、mRNAが
発現していることを確認した。これにより、本出願チロ
シンキナーゼを含む形質転換細胞を得たことを確認し
た。
【0048】配列表の配列番号6および配列番号7およ
び配列番号8に示すDNAをPCRを用いて作成し、グ
ルタチオーンSトランスフェラーゼとの融合蛋白を発現
する発現ベクターpGEX−4T−2(ファルマシア
社)の制限酵素SmaIサイトにつなぐことによって配
列表の配列番号1および配列番号2および配列番号3に
記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する
発現プラスミドベクターを構築した。このベクターを大
腸菌株DH5αに遺伝子導入し、アンピシリンによる選
択によって形質転換細胞株を得た。
び配列番号8に示すDNAをPCRを用いて作成し、グ
ルタチオーンSトランスフェラーゼとの融合蛋白を発現
する発現ベクターpGEX−4T−2(ファルマシア
社)の制限酵素SmaIサイトにつなぐことによって配
列表の配列番号1および配列番号2および配列番号3に
記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する
発現プラスミドベクターを構築した。このベクターを大
腸菌株DH5αに遺伝子導入し、アンピシリンによる選
択によって形質転換細胞株を得た。
【0049】
【実施例11】 新規チロシンキナーゼペプチドの発現
の確認 新規チロシンキナーゼペプチドの発現を確認するため、
ポリクローナル抗体の作製を行った。遺伝子配列から予
想されたアミノ酸配列のC末端部に相当する配列表の配
列番号5の488番から507番に相当するアミノ酸の
配列をもったペプチドに、C末端にシステインを付加し
たペプチド、すなわち Cys Pro Ala SerVal Ser Gly Gl
n Asp Ala Asp Gly Ser Thr Ser Pro Arg Ser Gln Glu
Proのアミノ酸配列をもったペプチドをペプチド合成装
置にて作製し、KLH(KeyholeLimpet Hemocyanin )
とチオール基を介してカップリングを行い、これを免疫
原とした。免疫はウサギに行い、Freundのアジュ
バントと混合して免疫し、抗血清を得た。
の確認 新規チロシンキナーゼペプチドの発現を確認するため、
ポリクローナル抗体の作製を行った。遺伝子配列から予
想されたアミノ酸配列のC末端部に相当する配列表の配
列番号5の488番から507番に相当するアミノ酸の
配列をもったペプチドに、C末端にシステインを付加し
たペプチド、すなわち Cys Pro Ala SerVal Ser Gly Gl
n Asp Ala Asp Gly Ser Thr Ser Pro Arg Ser Gln Glu
Proのアミノ酸配列をもったペプチドをペプチド合成装
置にて作製し、KLH(KeyholeLimpet Hemocyanin )
とチオール基を介してカップリングを行い、これを免疫
原とした。免疫はウサギに行い、Freundのアジュ
バントと混合して免疫し、抗血清を得た。
【0050】実施例10によって得られた配列表の配列
番号4もしくは配列番号5のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドを発現する形質転換細胞をRIPAバッファー
(0.1%SDS、1%TritonX−100、0.
1%デオキシコール酸ナトリウム、20mMTris−
HCl(PH7.4)、1mMPMSF、0.2U/m
lアプロチニン)にて可溶化し、タンパク量を定量後、
SDSにて熱変性し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(SDS−PAGE)を行った。電気泳動後、PVDF
(バイオラッド社)にタンパクをブロットした。タンパ
クのブロットされたフィルターを抗血清及び免疫前の血
清と反応させた後、ペルオキシダーゼ標識された抗ウサ
ギ抗体マウスモノクローナル抗体を反応させ、ECLウ
エスタンブロット・ディテクション・システム(アマー
シャム社)にて発光後、フィルムに感光させてタンパク
を検出した。その結果、免疫前の血清との比較から、お
よそ分子量が55キロダルトンの新規チロシンキナーゼ
タンパクが確認された。
番号4もしくは配列番号5のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドを発現する形質転換細胞をRIPAバッファー
(0.1%SDS、1%TritonX−100、0.
1%デオキシコール酸ナトリウム、20mMTris−
HCl(PH7.4)、1mMPMSF、0.2U/m
lアプロチニン)にて可溶化し、タンパク量を定量後、
SDSにて熱変性し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(SDS−PAGE)を行った。電気泳動後、PVDF
(バイオラッド社)にタンパクをブロットした。タンパ
クのブロットされたフィルターを抗血清及び免疫前の血
清と反応させた後、ペルオキシダーゼ標識された抗ウサ
ギ抗体マウスモノクローナル抗体を反応させ、ECLウ
エスタンブロット・ディテクション・システム(アマー
シャム社)にて発光後、フィルムに感光させてタンパク
を検出した。その結果、免疫前の血清との比較から、お
よそ分子量が55キロダルトンの新規チロシンキナーゼ
タンパクが確認された。
【0051】実施例10に示した配列表の配列番号1お
よび配列番号2および配列番号3のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド産生細胞株をアンピシリンを含む大腸菌
用液体培地にて一晩培養後、同培地に10倍希釈して2
時間培養後、最終濃度1mMのIPTGを加え、更に5
時間培養しタンパク発現を誘導後、遠心分離機を用いて
細胞を回収した。そして、細胞を1%TritonX1
00を含むPBSに懸濁し、超音波細胞破砕装置(タイ
テック社)にて氷で冷やしながら破砕し、遠心分離後、
この上清を上記と同様にSDS−PAGEを行い、同P
VDFフィルターにタンパクをブロット後、抗GSTヤ
ギ抗体(ファルマシア社)を反応させ、更にペルオキシ
ダーゼ標識抗ヤギ抗体ウサギ抗体を反応させ、同様にE
CLにてタンパクに検出を行った。その結果、各々の細
胞株が配列表の配列番号1のアミノ酸配列を含有するお
よそ33キロダルトンのポリペプチド、配列表の配列番
号2のアミノ酸配列を含有するおよそ35キロダルトン
のポリペプチド、および配列表の配列番号3のアミノ酸
配列を含有する63キロダルトンのポリペプチドの各々
を発現していることを確認した。次に、これらの3種の
GST融合新規チロシンキナーゼ部分ポリペプチドを各
々の細胞破砕溶液からグルタチオーンセファロースカラ
ム(ファルマシア社)を用いて、添付の取扱い説明書に
従って、精製した。これらの精製ポリペプチドについて
SDS−PAGEを行い、クマシー染色を行ったとこ
ろ、ウエスタンブロットと同様な分子量のポリペプチド
が分取、精製されていることを確認した。
よび配列番号2および配列番号3のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド産生細胞株をアンピシリンを含む大腸菌
用液体培地にて一晩培養後、同培地に10倍希釈して2
時間培養後、最終濃度1mMのIPTGを加え、更に5
時間培養しタンパク発現を誘導後、遠心分離機を用いて
細胞を回収した。そして、細胞を1%TritonX1
00を含むPBSに懸濁し、超音波細胞破砕装置(タイ
テック社)にて氷で冷やしながら破砕し、遠心分離後、
この上清を上記と同様にSDS−PAGEを行い、同P
VDFフィルターにタンパクをブロット後、抗GSTヤ
ギ抗体(ファルマシア社)を反応させ、更にペルオキシ
ダーゼ標識抗ヤギ抗体ウサギ抗体を反応させ、同様にE
CLにてタンパクに検出を行った。その結果、各々の細
胞株が配列表の配列番号1のアミノ酸配列を含有するお
よそ33キロダルトンのポリペプチド、配列表の配列番
号2のアミノ酸配列を含有するおよそ35キロダルトン
のポリペプチド、および配列表の配列番号3のアミノ酸
配列を含有する63キロダルトンのポリペプチドの各々
を発現していることを確認した。次に、これらの3種の
GST融合新規チロシンキナーゼ部分ポリペプチドを各
々の細胞破砕溶液からグルタチオーンセファロースカラ
ム(ファルマシア社)を用いて、添付の取扱い説明書に
従って、精製した。これらの精製ポリペプチドについて
SDS−PAGEを行い、クマシー染色を行ったとこ
ろ、ウエスタンブロットと同様な分子量のポリペプチド
が分取、精製されていることを確認した。
【0052】
【実施例12】 新規チロシンキナーゼのチロシンキナ
ーゼ酵素活性の確認 実施例10によって得られた配列表の配列番号4及び配
列番号5のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを産生
する形質転換細胞をRIPAバッファーにて1.5ml
のエッペンドルフチューブ中で可溶化し、これに対して
プロテインGセファロースゲル(ファルマシア社)を加
え、4℃にて一晩ゆっくりと撹拌させ反応させた。その
後、遠心分離にてプロテインGセファロースゲル及びプ
ロテインG非特異反応物を沈澱させて除去した。このよ
うに新規チロシンキナーゼペプチドを含む細胞破砕液を
得た。次に、この細胞破砕液に対し、実施例11に示し
た坑新規チロシンキナーゼポリクローナル抗体を加え、
4℃にて1時間反応させた後、プロテインGセファロー
スゲルを加えゆっくりと撹拌しながら4℃にて1時間反
応させた。その後、遠心分離にて、新規チロシンキナー
ゼを吸着したプロテインGセファロースゲルを沈澱画分
に分離し、上記のRIPAバッファーにて同様に3回遠
心洗浄を繰り返し、最終的にプロテインGセファロース
ゲル上に吸着された新規チロシンキナーゼペプチドを得
た。
ーゼ酵素活性の確認 実施例10によって得られた配列表の配列番号4及び配
列番号5のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを産生
する形質転換細胞をRIPAバッファーにて1.5ml
のエッペンドルフチューブ中で可溶化し、これに対して
プロテインGセファロースゲル(ファルマシア社)を加
え、4℃にて一晩ゆっくりと撹拌させ反応させた。その
後、遠心分離にてプロテインGセファロースゲル及びプ
ロテインG非特異反応物を沈澱させて除去した。このよ
うに新規チロシンキナーゼペプチドを含む細胞破砕液を
得た。次に、この細胞破砕液に対し、実施例11に示し
た坑新規チロシンキナーゼポリクローナル抗体を加え、
4℃にて1時間反応させた後、プロテインGセファロー
スゲルを加えゆっくりと撹拌しながら4℃にて1時間反
応させた。その後、遠心分離にて、新規チロシンキナー
ゼを吸着したプロテインGセファロースゲルを沈澱画分
に分離し、上記のRIPAバッファーにて同様に3回遠
心洗浄を繰り返し、最終的にプロテインGセファロース
ゲル上に吸着された新規チロシンキナーゼペプチドを得
た。
【0053】次に、この新規チロシンキナーゼペプチド
を含むゲル及び実施例11に示した配列表の配列番号3
のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを用いて、ベー
リンガー・マンハイム社製チロシンキナーゼアッセイキ
ット、ノンラディオリアクティブを用いてチロシンキナ
ーゼ活性を測定した。測定法はキットに添付してある取
扱い説明書にしたがって行った。その結果、いずれのポ
リペプチドもチロシンキナーゼ酵素活性を有していた。
を含むゲル及び実施例11に示した配列表の配列番号3
のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを用いて、ベー
リンガー・マンハイム社製チロシンキナーゼアッセイキ
ット、ノンラディオリアクティブを用いてチロシンキナ
ーゼ活性を測定した。測定法はキットに添付してある取
扱い説明書にしたがって行った。その結果、いずれのポ
リペプチドもチロシンキナーゼ酵素活性を有していた。
【0054】
【実施例13】 新規チロシンキナーゼを用いた化学物
質のスクリーニング 実施例12記載の方法にて精製された新規チロシンキナ
ーゼペプチド及び実施例11記載の方法で精製されたポ
リペプチドを用いて、新規チロシンキナーゼ酵素活性を
阻害する物質を見つけだすために、各種放線菌培養上清
中より上記のりん酸化活性を指標として、これを阻害す
る物質の精製並びに同定を行った。
質のスクリーニング 実施例12記載の方法にて精製された新規チロシンキナ
ーゼペプチド及び実施例11記載の方法で精製されたポ
リペプチドを用いて、新規チロシンキナーゼ酵素活性を
阻害する物質を見つけだすために、各種放線菌培養上清
中より上記のりん酸化活性を指標として、これを阻害す
る物質の精製並びに同定を行った。
【0055】ある放線菌株培養上清に新規チロシンキナ
ーゼの酵素活性を阻害する活性が見いだされ、この阻害
物質を上記の活性阻害を指標に精製、単離を行った。単
離精製した物質を質量分析、NMR、IRによる解析を
行ない、構造を推定したところアーブスタチン(Umezaw
a et al.,39:170,1986)であった。この結果から、この
新規チロシンキナーゼを用いた薬剤スクリーニング法は
チロシンキナーゼ阻害剤などの有用な化学物質を見いだ
す有効な手段であることが明らかになった。
ーゼの酵素活性を阻害する活性が見いだされ、この阻害
物質を上記の活性阻害を指標に精製、単離を行った。単
離精製した物質を質量分析、NMR、IRによる解析を
行ない、構造を推定したところアーブスタチン(Umezaw
a et al.,39:170,1986)であった。この結果から、この
新規チロシンキナーゼを用いた薬剤スクリーニング法は
チロシンキナーゼ阻害剤などの有用な化学物質を見いだ
す有効な手段であることが明らかになった。
【0056】
【発明の効果】本発明により得られる新規チロシンキナ
ーゼ遺伝子及びそのペプチドを用いることにより、血液
細胞分化の程度を評価、あるいは制御することが可能で
ある。また、本発明の遺伝子を材料として、多様な薬剤
の評価系が構築できる。更には、制ガン剤としての利用
が期待されるだけでなく、血液幹細胞などを未分化なま
まで培養することが可能であり、遺伝子治療への応用も
期待される。
ーゼ遺伝子及びそのペプチドを用いることにより、血液
細胞分化の程度を評価、あるいは制御することが可能で
ある。また、本発明の遺伝子を材料として、多様な薬剤
の評価系が構築できる。更には、制ガン剤としての利用
が期待されるだけでなく、血液幹細胞などを未分化なま
まで培養することが可能であり、遺伝子治療への応用も
期待される。
【0057】
配列番号:1 配列の長さ:64 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 起源 生物名:ヒト 株名:UT−7 配列 Ala Pro Gly Thr Gln Cys Ile Thr Lys Cys Glu His Thr Arg Pro Lys Pro Gly 1 5 10 15 Glu Leu Ala Phe Arg Lys Gly Asp Val Val Thr Ile Leu Glu Ala Cys Glu Asn 20 25 30 35 Lys Ser Trp Tyr Arg Val Lys His His Thr Ser Gly Gln Glu Gly Leu Leu Ala 40 45 50 Ala Gly Ala Leu Arg Glu Arg Glu Ala Leu 55 60 64 配列番号:2 配列の長さ:75 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 起源 生物名:ヒト 株名:UT−7 配列 Trp Phe His Gly Lys Ile Ser Gly Gln Glu Ala Val Gln Gln Leu Gln Pro Pro 1 5 10 15 Glu Asp Gly Leu Phe Leu Val Arg Glu Ser Ala Arg His Pro Gly Asp Tyr Val 20 25 30 35 Leu Cys Val Ser Phe Gly Arg Asp Val Ile His Tyr Arg Val Leu His Arg Asp 40 45 50 Gly His Leu Thr Ile Asp Glu Ala Val Phe Phe Cys Asn Leu Met Asp Met Val 55 60 65 70 Glu His Tyr 75 配列番号:3 配列の長さ:246 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 起源 生物名:ヒト 株名:UT−7 配列 Gln His Leu Thr Leu Gly Ala Gln Ile Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ala Val Leu 1 5 10 15 Gln Gly Glu Tyr Leu Gly Gln Lys Val Ala Val Lys Asn Ile Lys Cys Asp Val 20 25 30 35 Thr Ala Gln Ala Phe Leu Asp Glu Thr Ala Val Met Thr Lys Met Gln His Glu 40 45 50 Asn Leu Val Arg Leu Leu Gly Val Ile Leu His Gln Gly Leu Tyr Ile Val Met 55 60 65 70 Glu His Val Ser Lys Gly Asn Leu Val Asn Phe Leu Arg Thr Arg Gly Arg Ala 75 80 85 90 Leu Val Asn Thr Ala Gln Leu Leu Gln Phe Ser Leu His Val Ala Glu Gly Met 95 100 105 Glu Tyr Leu Glu Ser Lys Lys Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile 110 115 120 125 Leu Val Ser Glu Asp Leu Val Ala Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Ala 130 135 140 Glu Arg Lys Gly Leu Asp Ser Ser Arg Leu Pro Val Lys Trp Thr Ala Pro Glu 145 150 155 160 Ala Leu Lys His Gly Lys Phe Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val 165 170 175 180 Leu Leu Trp Glu Val Phe Ser Tyr Gly Arg Ala Pro Tyr Pro Lys Met Ser Leu 185 190 195 Lys Glu Val Ser Glu Ala Val Glu Lys Gly Tyr Arg Met Glu Pro Pro Glu Gly 200 205 210 215 Cys Pro Gly Pro Val His Val Leu Met Ser Ser Cys Trp Glu Ala Glu Pro Ala 220 225 230 Arg Arg Pro Pro Phe Arg Lys Leu Ala Glu Lys Leu 235 240 245 246 配列番号:4 配列の長さ:466 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 起源 生物名:ヒト 株名:UT−7 配列 Met Pro Thr Arg Arg Trp Ala Pro Gly Thr Gln Cys Ile Thr Lys Cys Glu His 1 5 10 15 Thr Arg Pro Lys Pro Gly Glu Leu Ala Phe Arg Lys Gly Asp Val Val Thr Ile 20 25 30 35 Leu Glu Ala Cys Glu Asn Lys Ser Trp Tyr Arg Val Lys His His Thr Ser Gly 40 45 50 Gln Glu Gly Leu Leu Ala Ala Gly Ala Leu Arg Glu Arg Glu Ala Leu Ser Ala 55 60 65 70 Asp Pro Lys Leu Ser Leu Met Pro Trp Phe His Gly Lys Ile Ser Gly Gln Glu 75 80 85 90 Ala Val Gln Gln Leu Gln Pro Pro Glu Asp Gly Leu Phe Leu Val Arg Glu Ser 95 100 105 Ala Arg His Pro Gly Asp Tyr Val Leu Cys Val Ser Phe Gly Arg Asp Val Ile 110 115 120 125 His Tyr Arg Val Leu His Arg Asp Gly His Leu Thr Ile Asp Glu Ala Val Phe 130 135 140 Phe Cys Asn Leu Met Asp Met Val Glu His Tyr Ser Lys Asp Lys Gly Ala Ile 145 150 155 160 Cys Thr Lys Leu Val Arg Pro Lys Arg Lys His Gly Thr Lys Ser Ala Glu Glu 165 170 175 180 Glu Leu Ala Arg Ala Gly Trp Leu Leu Asn Leu Gln His Leu Thr Leu Gly Ala 185 190 195 Gln Ile Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ala Val Leu Gln Gly Glu Tyr Leu Gly Gln 200 205 210 215 Lys Val Ala Val Lys Asn Ile Lys Cys Asp Val Thr Ala Gln Ala Phe Leu Asp 220 225 230 Glu Thr Ala Val Met Thr Lys Met Gln His Glu Asn Leu Val Arg Leu Leu Gly 235 240 245 250 Val Ile Leu His Gln Gly Leu Tyr Ile Val Met Glu His Val Ser Lys Gly Asn 255 260 265 270 Leu Val Asn Phe Leu Arg Thr Arg Gly Arg Ala Leu Val Asn Thr Ala Gln Leu 275 280 285 Leu Gln Phe Ser Leu His Val Ala Glu Gly Met Glu Tyr Leu Glu Ser Lys Lys 290 295 300 305 Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Ser Glu Asp Leu Val 310 315 320 Ala Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Ala Glu Arg Lys Gly Leu Asp Ser 325 330 335 340 Ser Arg Leu Pro Val Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ala Leu Lys His Gly Lys Phe 345 350 355 360 Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Val Phe Ser 365 370 375 Tyr Gly Arg Ala Pro Tyr Pro Lys Met Ser Leu Lys Glu Val Ser Glu Ala Val 380 385 390 395 Glu Lys Gly Tyr Arg Met Glu Pro Pro Glu Gly Cys Pro Gly Pro Val His Val 400 405 410 Leu Met Ser Ser Cys Trp Glu Ala Glu Pro Ala Arg Arg Pro Pro Phe Arg Lys 415 420 425 430 Leu Ala Glu Lys Leu Ala Arg Glu Leu Arg Ser Ala Gly Ala Pro Ala Ser Val 435 440 445 450 Ser Gly Gln Asp Ala Asp Gly Ser Thr Ser Pro Arg Ser Gln Glu Pro 455 460 465 配列番号:5 配列の長さ:507 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 起源 生物名:ヒト 株名:UT−7 配列 Met Ala Gly Arg Gly Ser Leu Val Ser Trp Arg Ala Phe His Gly Cys Asp Ser 1 5 10 15 Ala Glu Glu Leu Pro Arg Val Ser Pro Arg Phe Leu Arg Ala Trp His Pro Pro 20 25 30 35 Pro Val Ser Ala Arg Met Pro Thr Arg Arg Trp Ala Pro Gly Thr Gln Cys Ile 40 45 50 Thr Lys Cys Glu His Thr Arg Pro Lys Pro Gly Glu Leu Ala Phe Arg Lys Gly 55 60 65 70 Asp Val Val Thr Ile Leu Glu Ala Cys Glu Asn Lys Ser Trp Tyr Arg Val Lys 75 80 85 90 His His Thr Ser Gly Gln Glu Gly Leu Leu Ala Ala Gly Ala Leu Arg Glu Arg 95 100 105 Glu Ala Leu Ser Ala Asp Pro Lys Leu Ser Leu Met Pro Trp Phe His Gly Lys 110 115 120 125 Ile Ser Gly Gln Glu Ala Val Gln Gln Leu Gln Pro Pro Glu Asp Gly Leu Phe 130 135 140 Leu Val Arg Glu Ser Ala Arg His Pro Gly Asp Tyr Val Leu Cys Val Ser Phe 145 150 155 160 Gly Arg Asp Val Ile His Tyr Arg Val Leu His Arg Asp Gly His Leu Thr Ile 165 170 175 180 Asp Glu Ala Val Phe Phe Cys Asn Leu Met Asp Met Val Glu His Tyr Ser Lys 185 190 195 Asp Lys Gly Ala Ile Cys Thr Lys Leu Val Arg Pro Lys Arg Lys His Gly Thr 200 205 210 215 Lys Ser Ala Glu Glu Glu Leu Ala Arg Ala Gly Trp Leu Leu Asn Leu Gln His 220 225 230 Leu Thr Leu Gly Ala Gln Ile Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ala Val Leu Gln Gly 235 240 245 250 Glu Tyr Leu Gly Gln Lys Val Ala Val Lys Asn Ile Lys Cys Asp Val Thr Ala 255 260 265 270 Gln Ala Phe Leu Asp Glu Thr Ala Val Met Thr Lys Met Gln His Glu Asn Leu 275 280 285 Val Arg Leu Leu Gly Val Ile Leu His Gln Gly Leu Tyr Ile Val Met Glu His 290 295 300 305 Val Ser Lys Gly Asn Leu Val Asn Phe Leu Arg Thr Arg Gly Arg Ala Leu Val 310 315 320 Asn Thr Ala Gln Leu Leu Gln Phe Ser Leu His Val Ala Glu Gly Met Glu Tyr 325 330 335 340 Leu Glu Ser Lys Lys Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val 345 350 355 360 Ser Glu Asp Leu Val Ala Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Ala Glu Arg 365 370 375 Lys Gly Leu Asp Ser Ser Arg Leu Pro Val Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ala Leu 380 385 390 395 Lys His Gly Lys Phe Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu 400 405 410 Trp Glu Val Phe Ser Tyr Gly Arg Ala Pro Tyr Pro Lys Met Ser Leu Lys Glu 415 420 425 430 Val Ser Glu Ala Val Glu Lys Gly Tyr Arg Met Glu Pro Pro Glu Gly Cys Pro 435 440 445 450 Gly Pro Val His Val Leu Met Ser Ser Cys Trp Glu Ala Glu Pro Ala Arg Arg 455 460 465 Pro Pro Phe Arg Lys Leu Ala Glu Lys Leu Ala Arg Glu Leu Arg Ser Ala Gly 470 475 480 485 Ala Pro Ala Ser Val Ser Gly Gln Asp Ala Asp Gly Ser Thr Ser Pro Arg Ser 490 495 500 Gln Glu Pro 505 配列番号:6 配列の長さ:192 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 起源 生物名:ヒト 株名:UT−7 配列 GCCCCGGGCA CCCAGTGTAT CACCAAATGC GAGCACACCC GCCCCAAGCC AGGGGAGCTG 60 GCCTTCCGCA AGGGCGACGT GGTCACCATC CTGGAGGCCT GCGAGAACAA GAGCTGGTAC 120 CGCGTCAAGC ACCACACCAG TGGACAGGAG GGGCTGCTGG CAGCTGGGGC GCTGCGGGAG 180 CGGGAGGCCC TC 192 配列番号:7 配列の長さ:225 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 起源 生物名:ヒト 株名:UT−7 配列 TGGTTCCACG GGAAGATCTC GGGCCAGGAG GCTGTCCAGC AGCTGCAGCC TCCCGAGGAT 60 GGGCTGTTCC TGGTGCGGGA GTCCGCGCGC CACCCCGGCG ACTACGTCCT GTGCGTGAGC 120 TTTGGCCGCG ACGTCATCCA CTACCGCGTG CTGCACCGCG ACGGCCACCT CACAATCGAT 180 GAGGCCGTGT TCTTCTGCAA CCTCATGGAC ATGGTGGAGC ATTAC 225 配列番号:8 配列の長さ:738 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 起源 生物名:ヒト 株名:UT−7 配列 CAGCATTTGA CATTGGGAGC ACAGATCGGA GAGGGAGAGT TTGGAGCTGT CCTGCAGGGT 60 GAGTACCTGG GGCAAAAGGT GGCCGTGAAG AATATCAAGT GTGATGTGAC AGCCCAGGCC 120 TTCCTGGACG AGACGGCCGT CATGACGAAG ATGCAACACG AGAACCTGGT GCGTCTCCTG 180 GGCGTGATCC TGCACCAGGG GCTGTACATT GTCATGGAGC ACGTGAGCAA GGGCAACCTG 240 GTGAACTTTC TGCGGACCCG GGGTCGAGCC CTCGTGAACA CCGCTCAGCT CCTGCAGTTT 300 TCTCTGCACG TGGCCGAGGG CATGGAGTAC CTGGAGAGCA AGAAGCTTGT GCACCGCGAC 360 CTGGCCGCCC GCAACATCCT GGTCTCAGAG GACCTGGTGG CCAAGGTCAG CGACTTTGGC 420 CTGGCCAAAG CCGAGCGGAA GGGGCTAGAC TCAAGCCGGC TGCCCGTCAA GTGGACGGCG 480 CCCGAGGCTC TCAAACACGG GAAGTTCACC AGCAAGTCGG ATGTCTGGAG TTTTGGGGTG 540 CTGCTCTGGG AGGTCTTCTC ATATGGACGG GCTCCGTACC CTAAAATGTC ACTGAAAGAG 600 GTGTCGGAGG CCGTGGAGAA GGGGTACCGC ATGGAACCCC CCGAGGGCTG TCCAGGCCCC 660 GTGCACGTCC TCATGAGCAG CTGCTGGGAG GCAGAGCCCG CCCGCCGGCC ACCCTTCCGC 720 AAACTGGCCG AGAAGCTG 738 配列番号:9 配列の長さ:1398 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 起源 生物名:ヒト 株名:UT−7 配列 ATGCCAACGA GGCGCTGGGC CCCGGGCACC CAGTGTATCA CCAAATGCGA GCACACCCGC 60 CCCAAGCCAG GGGAGCTGGC CTTCCGCAAG GGCGACGTGG TCACCATCCT GGAGGCCTGC 120 GAGAACAAGA GCTGGTACCG CGTCAAGCAC CACACCAGTG GACAGGAGGG GCTGCTGGCA 180 GCTGGGGCGC TGCGGGAGCG GGAGGCCCTC TCCGCAGACC CCAAGCTCAG CCTCATGCCG 240 TGGTTCCACG GGAAGATCTC GGGCCAGGAG GCTGTCCAGC AGCTGCAGCC TCCCGAGGAT 300 GGGCTGTTCC TGGTGCGGGA GTCCGCGCGC CACCCCGGCG ACTACGTCCT GTGCGTGAGC 360 TTTGGCCGCG ACGTCATCCA CTACCGCGTG CTGCACCGCG ACGGCCACCT CACAATCGAT 420 GAGGCCGTGT TCTTCTGCAA CCTCATGGAC ATGGTGGAGC ATTACAGCAA GGACAAGGGC 480 GCTATCTGCA CCAAGCTGGT GAGACCAAAG CGGAAACACG GGACCAAGTC GGCCGAGGAG 540 GAGCTGGCCA GGGCGGGCTG GTTACTGAAC CTGCAGCATT TGACATTGGG AGCACAGATC 600 GGAGAGGGAG AGTTTGGAGC TGTCCTGCAG GGTGAGTACC TGGGGCAAAA GGTGGCCGTG 660 AAGAATATCA AGTGTGATGT GACAGCCCAG GCCTTCCTGG ACGAGACGGC CGTCATGACG 720 AAGATGCAAC ACGAGAACCT GGTGCGTCTC CTGGGCGTGA TCCTGCACCA GGGGCTGTAC 780 ATTGTCATGG AGCACGTGAG CAAGGGCAAC CTGGTGAACT TTCTGCGGAC CCGGGGTCGA 840 GCCCTCGTGA ACACCGCTCA GCTCCTGCAG TTTTCTCTGC ACGTGGCCGA GGGCATGGAG 900 TACCTGGAGA GCAAGAAGCT TGTGCACCGC GACCTGGCCG CCCGCAACAT CCTGGTCTCA 960 GAGGACCTGG TGGCCAAGGT CAGCGACTTT GGCCTGGCCA AAGCCGAGCG GAAGGGGCTA 1020 GACTCAAGCC GGCTGCCCGT CAAGTGGACG GCGCCCGAGG CTCTCAAACA CGGGAAGTTC 1080 ACCAGCAAGT CGGATGTCTG GAGTTTTGGG GTGCTGCTCT GGGAGGTCTT CTCATATGGA 1140 CGGGCTCCGT ACCCTAAAAT GTCACTGAAA GAGGTGTCGG AGGCCGTGGA GAAGGGGTAC 1200 CGCATGGAAC CCCCCGAGGG CTGTCCAGGC CCCGTGCACG TCCTCATGAG CAGCTGCTGG 1260 GAGGCAGAGC CCGCCCGCCG GCCACCCTTC CGCAAACTGG CCGAGAAGCT GGCCCGGGAG 1320 CTACGCAGTG CAGGTGCCCC AGCCTCCGTC TCAGGGCAGG ACGCCGACGG CTCCACCTCG 1380 CCCCGAAGCC AGGAGCCC 1398 配列番号:10 配列の長さ:1521 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 起源 生物名:ヒト 株名:UT−7 配列 ATGGCGGGGC GAGGCTCTCT GGTTTCCTGG CGGGCATTTC ACGGCTGTGA TTCTGCTGAG 60 GAACTTCCCC GGGTGAGCCC CCGCTTCCTC CGAGCCTGGC ACCCCCCTCC CGTCTCAGCC 120 AGGATGCCAA CGAGGCGCTG GGCCCCGGGC ACCCAGTGTA TCACCAAATG CGAGCACACC 180 CGCCCCAAGC CAGGGGAGCT GGCCTTCCGC AAGGGCGACG TGGTCACCAT CCTGGAGGCC 240 TGCGAGAACA AGAGCTGGTA CCGCGTCAAG CACCACACCA GTGGACAGGA GGGGCTGCTG 300 GCAGCTGGGG CGCTGCGGGA GCGGGAGGCC CTCTCCGCAG ACCCCAAGCT CAGCCTCATG 360 CCGTGGTTCC ACGGGAAGAT CTCGGGCCAG GAGGCTGTCC AGCAGCTGCA GCCTCCCGAG 420 GATGGGCTGT TCCTGGTGCG GGAGTCCGCG CGCCACCCCG GCGACTACGT CCTGTGCGTG 480 AGCTTTGGCC GCGACGTCAT CCACTACCGC GTGCTGCACC GCGACGGCCA CCTCACAATC 540 GATGAGGCCG TGTTCTTCTG CAACCTCATG GACATGGTGG AGCATTACAG CAAGGACAAG 600 GGCGCTATCT GCACCAAGCT GGTGAGACCA AAGCGGAAAC ACGGGACCAA GTCGGCCGAG 660 GAGGAGCTGG CCAGGGCGGG CTGGTTACTG AACCTGCAGC ATTTGACATT GGGAGCACAG 720 ATCGGAGAGG GAGAGTTTGG AGCTGTCCTG CAGGGTGAGT ACCTGGGGCA AAAGGTGGCC 780 GTGAAGAATA TCAAGTGTGA TGTGACAGCC CAGGCCTTCC TGGACGAGAC GGCCGTCATG 840 ACGAAGATGC AACACGAGAA CCTGGTGCGT CTCCTGGGCG TGATCCTGCA CCAGGGGCTG 900 TACATTGTCA TGGAGCACGT GAGCAAGGGC AACCTGGTGA ACTTTCTGCG GACCCGGGGT 960 CGAGCCCTCG TGAACACCGC TCAGCTCCTG CAGTTTTCTC TGCACGTGGC CGAGGGCATG 1020 GAGTACCTGG AGAGCAAGAA GCTTGTGCAC CGCGACCTGG CCGCCCGCAA CATCCTGGTC 1080 TCAGAGGACC TGGTGGCCAA GGTCAGCGAC TTTGGCCTGG CCAAAGCCGA GCGGAAGGGG 1140 CTAGACTCAA GCCGGCTGCC CGTCAAGTGG ACGGCGCCCG AGGCTCTCAA ACACGGGAAG 1200 TTCACCAGCA AGTCGGATGT CTGGAGTTTT GGGGTGCTGC TCTGGGAGGT CTTCTCATAT 1260 GGACGGGCTC CGTACCCTAA AATGTCACTG AAAGAGGTGT CGGAGGCCGT GGAGAAGGGG 1320 TACCGCATGG AACCCCCCGA GGGCTGTCCA GGCCCCGTGC ACGTCCTCAT GAGCAGCTGC 1380 TGGGAGGCAG AGCCCGCCCG CCGGCCACCC TTCCGCAAAC TGGCCGAGAA GCTGGCCCGG 1440 GAGCTACGCA GTGCAGGTGC CCCAGCCTCC GTCTCAGGGC AGGACGCCGA CGGCTCCACC 1500 TCGCCCCGAA GCCAGGAGCC C 1521 配列番号:11 配列の長さ:1942 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 起源 生物名:ヒト 株名:UT−7 配列 CGGAGGCCCT CCTGGGGGCG GGCGCGGGGC GCGGCTCGGG GGCGCCCCCT GAGCAGAAAA 60 CAGGAAGAAC CAGGCTCGGT CCAGTGGCAC CCAGCTCCCT ACCTCCTGTG CCAGCCGACT 120 GGCCTGTGGC AGGCCATTCC CAGCGTCCCC GACTGTGACC ACTTGCTCAG TGTGCCTCTC 180 ACCTGCCTCA GTTTCCCTCT GGGGGCGATG GCGGGGCGAG GCTCTCTGGT TTCCTGGCGG 240 GCATTTCACG GCTGTGATTC TGCTGAGGAA CTTCCCCGGG TGAGCCCCCG CTTCCTCCGA 300 GCCTGGCACC CCCCTCCCGT CTCAGCCAGG ATGCCAACGA GGCGCTGGGC CCCGGGCACC 360 CAGTGTATCA CCAAATGCGA GCACACCCGC CCCAAGCCAG GGGAGCTGGC CTTCCGCAAG 420 GGCGACGTGG TCACCATCCT GGAGGCCTGC GAGAACAAGA GCTGGTACCG CGTCAAGCAC 480 CACACCAGTG GACAGGAGGG GCTGCTGGCA GCTGGGGCGC TGCGGGAGCG GGAGGCCCTC 540 TCCGCAGACC CCAAGCTCAG CCTCATGCCG TGGTTCCACG GGAAGATCTC GGGCCAGGAG 600 GCTGTCCAGC AGCTGCAGCC TCCCGAGGAT GGGCTGTTCC TGGTGCGGGA GTCCGCGCGC 660 CACCCCGGCG ACTACGTCCT GTGCGTGAGC TTTGGCCGCG ACGTCATCCA CTACCGCGTG 720 CTGCACCGCG ACGGCCACCT CACAATCGAT GAGGCCGTGT TCTTCTGCAA CCTCATGGAC 780 ATGGTGGAGC ATTACAGCAA GGACAAGGGC GCTATCTGCA CCAAGCTGGT GAGACCAAAG 840 CGGAAACACG GGACCAAGTC GGCCGAGGAG GAGCTGGCCA GGGCGGGCTG GTTACTGAAC 900 CTGCAGCATT TGACATTGGG AGCACAGATC GGAGAGGGAG AGTTTGGAGC TGTCCTGCAG 960 GGTGAGTACC TGGGGCAAAA GGTGGCCGTG AAGAATATCA AGTGTGATGT GACAGCCCAG 1020 GCCTTCCTGG ACGAGACGGC CGTCATGACG AAGATGCAAC ACGAGAACCT GGTGCGTCTC 1080 CTGGGCGTGA TCCTGCACCA GGGGCTGTAC ATTGTCATGG AGCACGTGAG CAAGGGCAAC 1140 CTGGTGAACT TTCTGCGGAC CCGGGGTCGA GCCCTCGTGA ACACCGCTCA GCTCCTGCAG 1200 TTTTCTCTGC ACGTGGCCGA GGGCATGGAG TACCTGGAGA GCAAGAAGCT TGTGCACCGC 1260 GACCTGGCCG CCCGCAACAT CCTGGTCTCA GAGGACCTGG TGGCCAAGGT CAGCGACTTT 1320 GGCCTGGCCA AAGCCGAGCG GAAGGGGCTA GACTCAAGCC GGCTGCCCGT CAAGTGGACG 1380 GCGCCCGAGG CTCTCAAACA CGGGAAGTTC ACCAGCAAGT CGGATGTCTG GAGTTTTGGG 1440 GTGCTGCTCT GGGAGGTCTT CTCATATGGA CGGGCTCCGT ACCCTAAAAT GTCACTGAAA 1500 GAGGTGTCGG AGGCCGTGGA GAAGGGGTAC CGCATGGAAC CCCCCGAGGG CTGTCCAGGC 1560 CCCGTGCACG TCCTCATGAG CAGCTGCTGG GAGGCAGAGC CCGCCCGCCG GCCACCCTTC 1620 CGCAAACTGG CCGAGAAGCT GGCCCGGGAG CTACGCAGTG CAGGTGCCCC AGCCTCCGTC 1680 TCAGGGCAGG ACGCCGACGG CTCCACCTCG CCCCGAAGCC AGGAGCCCTG ACCCCACCCG 1740 GTGGCCCTTG GCCCCAGAGG ACCGAGAGAG TGGAGAGTGC GGCGTGGGGG CACTGACCAG 1800 GCCCAAGGAG GGTCCAGGCG GGCAAGTCAT CCTCCTGGTG CCCACAGCAG GGGCTGGCCC 1860 ACGTAGGGGG CTCTGGGCGG CCCGTGGACA CCCCAGACCT GCGAAGGATG ATCGCCCGAT 1920 AAAGACGGAT TCTAAGGACT CT 1942
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 15/09 ZNA //(C12N 9/12 C12R 1:91) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:91) (C12N 15/00 ZNA A C12R 1:91)
Claims (10)
- 【請求項1】 配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列
を含有するポリペプチド。 - 【請求項2】 配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列
を含有するポリペプチドをコードするDNA。 - 【請求項3】 配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列
を含有するポリペプチド。 - 【請求項4】 配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列
を含有するポリペプチドをコードするDNA。 - 【請求項5】 配列表の配列番号3記載のアミノ酸配列
を含有するポリペプチド。 - 【請求項6】 配列表の配列番号3記載のアミノ酸配列
を含有するポリペプチドをコードするDNA。 - 【請求項7】 配列表の配列番号4記載のアミノ酸配列
を含有するポリペプチド。 - 【請求項8】 配列表の配列番号4記載のアミノ酸配列
を含有するポリペプチドをコードするDNA。 - 【請求項9】 配列表の配列番号5記載のアミノ酸配列
を含有するポリペプチド。 - 【請求項10】 配列表の配列番号5記載のアミノ酸配
列を含有するポリペプチドをコードするDNA。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6189444A JPH07313157A (ja) | 1993-08-25 | 1994-08-11 | 新規チロシンキナーゼ |
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5-210403 | 1993-08-25 | ||
JP21040393 | 1993-08-25 | ||
JP6-58553 | 1994-03-29 | ||
JP5855394 | 1994-03-29 | ||
JP6189444A JPH07313157A (ja) | 1993-08-25 | 1994-08-11 | 新規チロシンキナーゼ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07313157A true JPH07313157A (ja) | 1995-12-05 |
Family
ID=27296619
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6189444A Pending JPH07313157A (ja) | 1993-08-25 | 1994-08-11 | 新規チロシンキナーゼ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH07313157A (ja) |
-
1994
- 1994-08-11 JP JP6189444A patent/JPH07313157A/ja active Pending
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Legal Events
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040824 |
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A02 | Decision of refusal |
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