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JPH0720882B2 - 免疫原活性を付与されたハプテンとムラムル―ペプチドとの組成物 - Google Patents

免疫原活性を付与されたハプテンとムラムル―ペプチドとの組成物

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JPH0720882B2
JPH0720882B2 JP58041623A JP4162383A JPH0720882B2 JP H0720882 B2 JPH0720882 B2 JP H0720882B2 JP 58041623 A JP58041623 A JP 58041623A JP 4162383 A JP4162383 A JP 4162383A JP H0720882 B2 JPH0720882 B2 JP H0720882B2
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muramyl
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カレリ・クロ−ド
シエデイドウ・ルイ
ルフランシエ・ピエ−ル
レベル・ミシエル
シヨアイ・ジヤン
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アジヤ−ンス・ナシヨナル・ド・ヴアロリザシヨン・ド・ラ・ルシエルシユ（ア−・エヌ・ヴエ・ア−・エル）
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ムラミル−ペプチド誘導体により変性された
低分子量の分子の化合物、誘導体の新規な範疇に関する
ものであり、この変性はこれらのムラミル−ペプチドに
よるそれらの変性前には本質的に欠如する免疫原特性を
それらの化合物、誘導体に付与するために採用されるも
のである。
一般に“ムラミル−ペプチド”という名称で知られ、サ
ツカリド単位を含有し（特にＮ−アセチル−ムラミル型
のもの）、このサツカリド単位にペプチド鎖が結合して
いる誘導体は、免疫学的補助作用（佐薬）特性を具有し
ているものとして知られている。これらのムラミル−ペ
プチドの数多くの例が技術文献に記載されている。
意図されるそれらの適用を可能としうる抗原に対する、
例えば免疫原作因を用いる種痘組成物に対する宿主の免
疫性応答を刺激増進するというムラミル−ペプチドが具
有する能力は、広範な精製により、特に毒性の存在ある
いは初期抗原における他の厄介な副作用により、天然に
おいては弱く、または弱められているかのいずれかであ
る。
ムラミル−ペプチドの補助作用的な免疫学的作用をさら
に増強するために、特にヨーロツパ特許出願第3833号に
は、これらのムラミル−ペプチド誘導体を研究下の抗原
に特に共有結合を通じて固定すること、換言すればこれ
らをこのような抗原に“結合”（conjugate）すること
も提案されている。幾つかの場合には、このタイプの結
合は、このように変性された抗原の免疫原作用の増強を
さらに可能としうる。しかしながら、この結合は発熱特
性及び別個の免疫原反応、さらに詳細にはムラミル−ペ
プチド誘導体自体に向けられた免疫原反応を伴なうとい
うことも観察された。これは、破傷風トキシンとムラミ
ル−ペプチド誘導体間に形成された結合体により観察さ
れたものであり、その一例である。
これらの技術と並行して、自然のもしくは“天然”の抗
原の一部の構造を有する断片と担体分子、特に天然のま
たは合成高分子との間の結合生成物からなる新しいタイ
プの免疫原抗原が開発された。例えば、前記断片は天然
のペプチド抗原においても存在する序列（シーケンス）
を具有するペプチドからなる。しかしながら、極めて弱
いが検出可能な免疫原活性を付与しうるに充分な多数の
アミノ酸をそれ自身既に具有する幾つかのペプチドを除
き、これら断片の免疫原活性は、一般に、上記支持体と
のその結合に従属される。
このような免疫原特性について記載する最近の出版物と
しては、例えば以下のものを参照されたい。
−AUDIBERT,JOLIVET,CHEDID,ALOUF,BOQUET,RIVAILLE an
d SIFEERT,“Nature".Vol.289,NO.5798,p.593−594,12
February 1981, −MOZES,SELA and CHEDID,“Proc.Natl.Acad.Sci.USA",
vol.77,NO.8,p.4933−4937,August 1980, −ARNON,SELA,PARANT and CHEDID,“Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA",vol.77,NO.11,p.6769−6772,November 1980, −LERNER,GREEN,ALEXANDER,LIU,SUTCLIFFE and SHINNIC
K,“Proc.Natl.Acad.Sci.USA",vol.78,NO.6,p.3403−34
07,June 1981, −ARNON,MARON,SELA and ANFINSEN,“Proc.Natl.Acad.S
ci.USA",vol.68,NO.7,p.1450−1455,July 1981,and −SHUJ IMATSUURA,MASANOBU OHASHI,HAOCHIA CHEN and
Gary D.HODGEN,“Endocrin ology",vol.104,NO.2,1979. 何人かの著者は、支持高分子との全ゆる先行カツプリン
グが存在していない場合において抗体の生成を惹起する
幾つかのペプチドの能力をすでに試験している。例え
ば、上述した書籍のアール．エイ．レルナー（R.A.LERN
ER）ら及びジー・アール・ドリースマン（G.R.DREESMA
N）（“Nature",vol.295,1982年１月14日,158−160頁）
は、HBsAg抗原と同じようなシーケンスを有する幾つか
のペプチドは、マウスにおいて検出可能な抗体生成を生
ずるということを観察した。ドリースマンによれば、こ
れらのペプチドと佐薬（adjuvant）、さらに詳細には完
全フロインド（Freund）抗原（FCA）、ミヨウバン、リ
ポゾーム（liposomes）、これと共にＮ−アセチル−ム
ラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（MDP）を
添加することも可能、の協合は、この種のタイプのペプ
チドにより惹き起こされた一次免疫原応答を著しく増大
する効果を有しなかつた。
本発明者らは、本質的に担体高分子の不存在下での、MD
Pまたはその類似体、同族体もしくは誘導体、特に抗原
について免疫原応答の補助作用特性を有するものとして
知られている全てのムラミル−ペプチド誘導体または類
似体の共有結合による、少なくとも一つの“抗原部位”
（antigenic site）を具有する低分子量のハプテンまた
はハプテン断片へのカツプリングにより、予期せざる生
体内免疫原応答作用を有する免疫原化合物が得られると
いうことを見い出し、本発明を完成するに至つたもので
ある。
これらの免疫原は、先に述べたようなMDPと高分子量の
抗原（これは天然抗原、または分子、特に抗原部位を有
するペプチドと支持高分子との結合体からなる）との結
合体とは逆に、さらに生体内発熱作用が実際上あるいは
全くないという予期せざる特性を有する。この生体内発
熱作用がないということは、発熱性であるMDPの誘導体
または類似体について、これらが単独で投与されその発
熱性が小さくなり、さらになおさらハプテンとのカツプ
リング後に消失することにより、また発熱作用を有しな
いMDPの誘導体または類似体について、これらが単独で
投与されその無発熱性が結合後に維持されていることに
よつて、いずれについても観察される。
本発明は、さらに詳細には、結合体のムラミル−ペプチ
ド部分に対し向けられる抗体の生成を惹き起こさないハ
プテン−ムラミルペプチド結合体に関するものである。
前記において、用語“ハプテン”は非常に広範な意味を
有する。これは、その製造方法如何に拘らず、また分
離、解重合、合成または遺伝再結合の如何に拘らず、低
分子量のあるゆるハプテンまたはハプテン断片を意味す
る。
また前記において、表現“抗原部位”とは、このハプテ
ンと同じような部位を有する抗原について、予め形成さ
れた抗体により確認可能なハプテンのあらゆる構造、特
に表面構造を意味する。その立体配座が本発明に従って
MDPタイプの生成物への結合により変性されうるハプテ
ンは、それ自体に対してだけでなく、さらに−ハプテン
が天然抗原と同じような構造要素を有する場合には−天
然抗原自体に対しても、あるいはハプテンと高分子支持
体とのカツプリングによりおそらく形成されうる抗原に
対しても、生体内抗体または特異細胞媒介反応を惹き起
こす。例えば、わずかな数のアミノ酸を有するシーケン
スからなるハプテンは、ムラミル−ペプチドとカツプリ
ングされたときに、ポリペプチドまたはハプテンと同じ
ように同一アミノ酸シーケンスを有する抗原タンパク質
に対し活性な生体内抗体形成を惹き起こすことができ
る。
このことはまた、排他的にペプチド的というものではな
いハプテンについても同様にして適用される。この点に
おいて、ハプテンは、例えば、モノサツカリドまたは例
えばグリコシドタイプの結合により互いに連結された幾
つかのモノサツカリドにより構成されうる低分子量のオ
シド構造からなる。これらのオリゴサツカリドは直鎖状
または分岐状のいずれでもよい。これらは、ヘキソース
またはペントースの族に属するものでよく、また中性で
もよく、あるいはアミノ化されたものでもよく、ウロン
酸または唾液酸単位を含有するものでもよい。これら
は、アセチル、サルフエートまたはホスフエートなど、
天然構造に通常含有される置換基を有するものでもよ
い。上記の内容は単に例を有するものであつてこれらに
何ら限定されるものでないことはもとよりであり、また
一般に、高分子量の抗原に含有される構造要素に相当す
る構造要素を含む全てのペプチドハプテンまたはオシド
ハプテンが含まれ、このハプテンは鎖中含まれるか、末
端位置に配置されるかは問わない。
本発明は、さらに詳細には、生体内投与されたときに、
関連するタイプのハプテンに存在する構造要素を含有す
る天然抗原に関して、免疫性反応（抗体または細胞媒介
反応の生成）を惹き起こすような、既に前記した範疇に
属するハプテンとムラミル−ペプチドとの結合体に関す
るものである。以下において、抗体の生成を惹き起こす
本発明に係るハプテンの能力について引照する場合、こ
れは用語の単純化に等しくその性質が何ら限定されるも
のではないと理解される。一般に、この表現は、ここで
は細胞媒介反応を含むあらゆる免疫性反応を包含するで
あろうと自然に理解されるべきである。
一般に、本発明に係る結合体の構成に採用されうるハプ
テンは、前述した条件下であらゆるタイプの公知の抗原
または種痘成分として有用な抗原と同じような構造要素
を有する。関連する抗原の例としては、感染性微生物か
ら抽出された有効成分または感染性微生物自体が挙げら
れる（弱化もしくは死滅させたワクチン）。さらに詳細
には、本発明の範囲内で採用できるハプテンは、これら
の病原性作因（細菌、寄生ビールス、リケツチア、原生
動物など）の構成分に存在する構造要素を有するもので
よい。その例としては、Ｂビールス性肝炎、インフルエ
ンザ、ビールス性疱疹などのビールスの範疇に属する抗
原タンパク質あるいはまた例えば連鎖球菌など細菌壁の
タンパク質と同じような構造要素を有するハプテンが挙
げられる。ペプチドあるいは非ペプチド的かに限定され
ることなく抗原と同じような構造要素を有するハプテン
としては、オリゴサツカリド、グリコペプチド、リポペ
プチド、糖脂質、脂質、ステロイド、などが挙げられ
る。さらに一般には、ヨーロツパ特許出願第3833号に提
供されている情報も参照されたい。
本発明はまた、特に合成的に得られる低分子量のハプテ
ンまたはハプテン断片にまで及ぶものである。
本発明はまた、ホルモン、特にペプチドホルモン、例え
ば低血圧、性腺など血圧を調節しあるいは各種内分泌腺
の活性を調節しうるホルモン、ステロイドホルモンまた
はニユーロペプチドを含む神経中間部などの分子の、あ
るいは例えば血液型の抗原決定因子、リムフオキン（ly
mphokins）または細胞受容体など、生体内に自然に存在
しまたはこれにより免疫学的に許容される組織抗原決定
因子の、他の分子または断片とムラミル−ペプチドの結
合体に関するものである。
本発明は、それ故、さらに詳細には、このような特定の
分子または分子断片とMDP誘導体との結合体に関し、こ
れにより、得られた結合体により獲得される免疫原特性
がそれらにこれらの分子が投与される生体の免疫性挙動
における変性を惹き起こせしめ、さらに詳細にはこれら
生体において上記特定分子または分子断片自体に対し活
性な抗体の生成を促進せしめる。特定の分子または分子
断片は、天然の分子からなり、または天然の分子から誘
導されうる。このような変性が例えば生存種の再生産に
干渉するホルモンのレベルで調査されるという領域があ
ることは知られている。この点において、本発明は避妊
手段としておそらく使用される変性ホルモンに適用され
る。
プロセスによつてもまた、例えば成長ホルモン、ACTH,T
SH、並びに下垂体後葉のホルモンなど、生体の生命機能
にとつて極めて重要性を有する脳下垂体のホルモンをそ
のまま残す選択的免疫学的下垂体摘除術の成果が許容さ
れる。この選択的、非外科的下垂体摘除術の使用は、重
要な臨床的適応を有し、特に幾つかの依存性の脳下垂体
または向性腺ホルモン腫瘍の場合に重要な臨床的適応を
有する。
本発明は、さらに直接的にはなお、免疫学的去勢により
食肉生産を増大させうる獣医のワクチンとして有用な、
本発明に従つて変性されたホルモンに関するものであ
る。
プロセスの興味はまた、依存性のLH−RHホルモンが動物
の適当な育成及び何ケ月（６〜９ケ月）かまでのその重
量増加にとつて重要であるということにあり、この年令
では、実際、通常３ケ月前に行なわれる効果的な外科的
去勢を行なうことはもはや不可能となる。免疫学的去勢
は、食肉生産にとつて最も好都合な時期に、激烈な方法
を用いることなく、停止される脳下垂体ホルモンの分泌
を可能とする。
本発明は、従つて、ハプテン部分が、同じムラミル−ペ
プチドと高分子量の抗原とのカツプリングの場合に観察
される発熱作用を消去できる程に充分な低分子量を有す
る、ハプテンとムラミル−ペプチドの結合体に関するも
のである。ハプテン部分は、さらになお、予測せざる免
疫原特性に加えて、結合体のムラミル−ペプチド部分自
体に対して向けられる抗体の生成を惹き起こさないよう
に、得られた結合体に対し充分に低分子量を有さねばな
らない。
特に、本発明は、ムラミル−ペプチドと約5,000以下、
有利には3,000未満の分子量を有するハプテンとの結合
体に関する。有利な場合には、免疫原性及び無発熱性結
合体の分子量はせいぜい2,000のオーダーである。幾つ
かの著しい例外（特にLH−RH）を除き、本発明の係る範
疇にあるハプテンは、未結合状態においては検出されう
る免疫原性を欠如し、このことはMDPとの協合において
さえもそうであるということが観察される。
本発明が係るハプテンは、結合体に対して充分に低い分
子量を有するものからなり、MDPと形成可能であり、キ
ロ当り100μｇの服用量割合で、さらに300、またさらに
キロ当り結合体500μｇの割合でさえも、静脈内投与で
兎に投与されたときに、0.6℃の温度上昇の生成感応を
超える発熱反応を生じないようなものに特定することも
できる。
合成または天然のペプチドが関係するときは、本発明に
おいて用いられるハプテンは、好ましくは50未満のアミ
ノアシル残基（β−hCGのＣ−末端エイコサペプチドを
除く）、特に30未満、好ましくは20未満のアミノアシ
ル、有利には15未満のアミノアシルからなる。本発明は
また、オリゴマーが前述した他の条件を満足する限り、
免疫原を形成するのに結合しうるハプテンとしてオリゴ
マー化されたハプテンを用いることができる。
本発明に係る結合体を製造するのに利用可能なハプテン
の例としては、まず第一にホルモン、特にペプチドまた
はグリコペプチドホルモンの範疇のホルモンが挙げられ
る。後者の中には、名称LH−RHとして知られるルテオト
ロフイン遊離構成分、ペプチド断片あるいは同様の特性
を付与された合成ペプチド、例えばGLu−His−Trp−Ser
−Tyr−Gly−Leu−Arg−Pro−Gly−NH2タイプのデカペ
プチドあるいは相当する遊離酸p Glu−His−Trp−Ser−
Try−Gly−Leu−Arg−Pro−Glyが挙げられる。これに加
えて、さらに詳細には、エイコサペプチドを除き、ヒト
絨毛ゴナドトロピン（hCG）のＣ−末端ペプチドが挙げ
られる。例としては、hCGの副単位のＣ−末端ペプチ
ド、特にhCG−β中のものに相当するアミノアシル残基
を含有するトリアコンタペプチドまたはエス・マツウラ
（S.MATSUURA）ら（既に述べた刊行物）により述べられ
ているタイプの末端合成誘導体、FSH断片など、あるい
はアーサス．シー．ジエイ．リー（Arthus C.J.LEE）ら
“Molecular Immunology"vol.17.P.749−756に記載の本
質的にhCH−βのＣ−末端副単位の109−145及び111−14
5シーケンスからなるペプチドが挙げられる。ムラミル
−ペプチドとのカツプリングによるこれらのホルモンの
変性により、関連する天然ホルモンに対する抗体の生体
内生成しうる免疫原性成分を生じ、このようにして得ら
れたハプテン−変性免疫原が著しく低い分子量を有する
ほどなおさら免疫原性は顕著になる。
同様に挙げられるのは、既に述べた刊行物に同定されて
いるような、特にその端末アミノアシルが以下の配置:4
8−81;2−16;22−35;95−109;117−137;122−137;117−
135（パセク（PASEK）らにより与えられている構造に従
う。またレルナー（LERNER）の文献に再生されている）
を占めるHBsAgのシーケンス中のそれに相当するもので
あるようなものなど、HBsAg抗原の有効構成分ペプチド
と共にアミノアシル残基の共通のシーケンスを有する各
種合成ペプチドとムラミル−ペプチドとの間のカツプリ
ングを働かせている結合体である。さらに、ムラミル−
ペプチドとカツプリングしたときに、化膿連鎖球菌の表
面のタンパク質Ｍに対して活性な抗体を形成しうる、イ
ー．エイチ．ビーチエイ（E.H.BEACHEY）らにより述べ
られているタイプの合成ペプチドが挙げられる。また同
様に、米国特許第4,284,537号に特定されているペプチ
ドシーケンス、特に略号CB6及びCB7として特定されてい
るものを参照されたい。
サツカリドもしくはオシドハプテンの例としては、例え
ば、ダブリユ．エフ．ジヨーベル（W.F.GOEBEL）"J.Ex
p.Medicine",1939,353−363頁、に記載されているよう
な、血液型Ａ及びＢ、連鎖球菌ＣのポリサツカリドＣ、
セロビウロン酸（cellobiuronic acid）（pheumo タイ
プIII）などが挙げられる。
本発明に係るカツプリングを行なわしめうるタイプの各
種ハプテンに関しては、有利にはトーマス、ピー．ホツ
プ（Thomas P.HOPP）らにより“Proc.Natl.Acad.SCi.US
A"、vol.78,NO.6,3824−3828頁に記載のペプチドシーケ
ンスを参照されたい。ここでは、支持高分子とのカツプ
リングにより抗原性が付与されうる他のペプチドシーケ
ンスが見られるが、これも本発明の範囲内であり、ムラ
ミル−ペプチド誘導体とのカツプリングにより同様に免
疫原性が付与される。
当然のこと乍ら、各種ペプチド及び文献に考察されてい
るようなタイプの他のハプテンも、またこの点におい
て、本発明で規定されているような免疫原作因を構成す
るのに用いることができるものも使用することのできる
各種ハプテンの例として挙げられる。本発明の条件に合
致し所定の抗原に相当するハプテンが、常に直ちに入手
可能というわけでないのは、自ら明らかである。抗原の
構成が公知でありあるいは知ることができるときには、
特にこれがそのシーケンスが知られまたは決定できるポ
リペプチドからなるときには、先に指示した条件下で免
疫原部位を担持することのできるこの抗原の構造のシー
ケン要素を探究することは専門家にとつては可能であろ
う。この問題に対する幾つかの試みが、既に先行刊行物
の主題となつている。これを思い出すには、例えば前述
したレルナー（LERNER）とホツプ（HOPP）の文献を挙げ
ることができ、ここでの調査方法は、ペプチド構造の抗
原に含有され免疫原部位を担持しうるシーケンスのマー
キング（付印）を行なうことが提案されており、関係シ
ーケンスは次いで合成可能であり、また本発明の技法に
よるときに、すなわちそれらの免疫原性能力のための、
さらに詳細には天然抗原に対して活性は抗体の生体内生
成を惹き起こすそれらの能力のためのムラミル−ペプチ
ドとのカツプリングにより、特に簡便に試験可能であ
る。
本発明に係る結合体におけるハプテンは、免疫学的佐薬
特性を有するあらゆるムラミル−ペプチド誘導体にカツ
プリングされうる。
ハプテンに結合されるムラミル−ペプチド部分は、有利
には下記一般式(I)に相当するムラミル−ペプチドから
誘導される。
ここで、（関係基がハプテンに共有結合的に結合してい
る場合を除き） R5は遊離のカルボキシル基もしくはアミド基、または１
〜10の炭素原子を有する脂肪族アルコールによりエステ
ル化されたカルボキシル基、あるいはそれ自身遊離のカ
ルボキシル基、アミド化されたカルボキシル基もしくは
１〜10の炭素原子を有する脂肪族アルコールによりエス
テル化されたカルボキシル基を有するアミノ酸により置
換されたカルボキシル基であり、 Ｒは水素またはメチル基であり、 R2はアセトアミドまたはグリコリル−アミド基であり、 R1は−NH2,OH、または場合によつてはヒドロキシル、ア
ミン、カルボキシアミド、スルホンアミド、エーテル、
チオエーテル、エステルまたはチオエステル置換基を有
し、アルキル、アリール、アリールアルキルまたはアル
キルアリール基に相当するせいぜい10の炭素原子を有す
るラジカルであり、 R4はヒドロキシルまたは１〜４の炭素原子を有するオキ
シアシル基、特にオキシアセチル基であり、 Ｘはアラニル、アルギニル、アスパラギル、アスパルチ
ル、システイニル、グルタミニル、グルタミル、グリシ
ル、ヒスチジル、ヒドロキシ−プロリル、イソロイシ
ル、ロイシル、リシル、メチオニル、フエニルアラニ
ル、プロリル、セリル、スレオニル、トリプトフアニ
ル、チロシル、バリル及びアミノブチリルからなる群の
アミノアシル残基であり、 Ｚは下記一般式（II）を有し、ムラミル酸のＣ−６の位
置を置換する基であり、 −R6−（R7）ｘ （II） ここで、ｘ＝０または１であり、 ｘ＝０のとき、 R6はヒドロキシルまたはアミノ基であり、 ｘ＝１のとき、 R6はヒドロキシルもしくはアミノ基、カルボキシアミ
ド、スルホンアミドエーテルもしくはチオエーテル、エ
ステルもしくはチオエステルであり、 R7はそのとき−CH2,−CH＝CH−，−Ｓ−，−CO−または
NH基、−CH2−；−CH＝CH−，またはNH基の鎖であり、
該基は任意的にアリール基好ましくはフエニル基によ
り、または以下に示す複素環基、またはカルボキシル、
アミノ、スルホヒドリルもしくはヒドロキシル基によ
り、または５以下の炭素原子を有するアルキル基によ
り、または８以下の炭素原子を有するアルキルアリー
ル、アリールアルキル基により、または６以下の炭素原
子及び１または２の酸素、窒素もしくはイオウ原子を有
する複素環基により置換されているものであり、上記ア
ルキルアリールまたはアリールアルキル基はさらに任意
にカルボニル基を含有し、または任意的にカルボキシ
ル、アミノ、スルホヒドリルもしくはヒドロキシル基に
より置換されているものであり、また前記複素環基はそ
れ自身任意的に５以下の炭素原子を有するアルキル基、
カルボキシル、アミノ、スルホヒドリルもしくはヒドロ
キシル基により置換されているものであり、また前記R7
基はそれにも拘らずｎ−デシル炭化水素鎖の長さを超え
ない長さを有するものであり、 Ｙは遊離のもしくはアミド化されたカルボキシル基、ま
たは10以下の炭素原子を有するエステル基またはアミノ
酸好ましくはリシン、オルニチン、グルタミン酸、アス
パラギン酸もしくはチロシンからなる三官能アミノ酸に
より置換されたエステル基、すなわちカルボキシル基及
びアミノ基の他にさらにカルボキシルアミノもしくはヒ
ドロキシル基を含有するエステル基、またはＹは下記一
般式（III）に相当する基である。
R8−（R9）ｘ （III） ここでｘは０または１であり、またR8はｘが０のときに
はアミドもしくはエステル結合であり、ｘが０でないと
きは、R8はカルボキシアミド、エステルもしくはチオエ
ステル基であり、R9はそのときR7と同じである。
上記一般式に相当する好ましいクラスのムラミル−ペプ
チドは、Ｘがグリシル、セリル、バリル、ロイシル、ア
ミノブチリル残基、またはさらに好ましくはアラニルで
あるものである。
これら全てのアミノアシル基は、好ましくは（グリシン
を除き）左旋性のアミノアシル基である。
前記クラスのそれぞれにおいて、前記式に相当する好ま
しいサブクラスはしかしながらｘがゼロに等しいもので
あり、この場合Ｚは有利にはヒドロキシルまたはアミン
官能基である。
先に規定したクラスのそれぞれにおいて、前記一般式
（II）に相当する他の好ましいサブクラスは ｘ＝１であり、 R6がカルボキシアミド結合またはスルホンアミドエーテ
ルもしくはチオエーテル、エステルもしくはチオエステ
ルであり、また R7が下記に示すような基の一つを表わすものである。
−（CH2）ｎ−COOH、特にｎ＝1,2,3または４ −（CH2）ｎ−NH2、特にｎ＝1,2,3または４ 特にｎ＝1,2,3または４ −（CH2）ｎ−C6H5−NH2、特にｎ＝０または１ −（CH2）ｎ−SH、特にｎ＝２ 本発明はまた、R5基がｎ−ブチルアルコールによりエス
テル化されたカルボキシル官能基であり、また、好まし
くはまた同時にＹが−CONH2基であるような前記クラス
及びサブクラスのいずれかに属するムラミル−ペプチド
から誘導された結合体に関するものである。
本発明はさらに、前記した各クラス及び各サブクラス内
でも、ムラミル−ペプチド基のＲ基がメチル基であるハ
プテン−ムラミル−ペプチド結合体の好ましい範疇に関
する。
本発明はさらにまた、前記した各クラス、各サブクラス
及び範疇の中でも、本発明に係る結合体のムラミル−ペ
プチド部分のR6基が１〜５の炭素原子を含むエステル基
である好ましいものに関する。
本発明はさらに、前記したクラス、サブクラス及び範疇
の中でも、ムラミル−ペプチド部分のＺ基がスクシニル
基である結合体のサブ範疇に関する。
本発明はさらにまた、前記した各クラス、サブクラス、
範疇及びサブ範疇の中でも、結合体のムラミル−ペプチ
ド部分が、R1及びR4が同時にヒドロキシル基、R2がアセ
トアミド基である結合体の他のサブ範疇に関する。
前記したクラス、サブクラス、範疇にそれぞれにおい
て、本発明に係る結合体の他の好ましいサブ範疇には、
同時にＺ、Ｒ、及びR4がヒドロキシル基であり、R2がア
セトアミド基であり、R4がメチル基であり、Ｘがアラニ
ル基であり、R5がカルボキシアミド基または選択的に１
〜５の炭素原子を有するエステル基であり、Ｙがカルボ
キシアミド官能基であるムラミル−ペプチド部分を含有
するものである。
また本発明に係る好ましい結合体は、MDPから、または
Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミ
ンのα−ｎ−ブチルエステルから、あるいはまた上記二
つのムラミル−ペプチドの６−ｏ−スクシニル誘導体か
ら誘導されたムラミル−ペプチド部分を含有するもので
ある。
本発明に係る結合体の組成に入る他の好適なムラミル−
ペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−
Ｄ−グルタミン酸（MDPA）のモノ−α−もしくはγ−エ
ステルまたはジエステル（ここでエステル基は１〜５の
炭素原子を含有するものである）である。
本発明に係る好ましい結合体の製造に用いられるムラミ
ル−ペプチドの他の範疇においては、Ｙ基はリシル基を
含むものであり、これにより、他の基は、先に規定した
好ましいクラスまたはサブクラスのいずれかとに関係し
て規定されるものに従う。上記結合体に含まれる好まし
いムラミル−ペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ
−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−リシン（MD
P）からなる。
本発明はまた、前記したクラス、サブクラスまたは範疇
の一つに属するムラミル−ペプチドとハプテン間のこれ
ら結合体の製造方法に関するものであり、この方法は種
々の可能な変形を包含する。
第一の技法によれば、ハプテン及びムラミル−ペプチド
の両者がアミン官能基を含むまで、グルタルアルデヒド
を通してのカツプリング反応による手段をとるものであ
る、 有利には、ムラミル−ペプチド部分上の所定位置への作
用を行なうことができる他の形態のカツプリングによる
手段がとられる。特に、これらの結合は、サツカリド環
のC6位置またはC1位置、あるいはまたペプチド鎖のＹの
Ｃ−末端のいずれかのレベルで行なわれることができ
る。
Ｚ基またはＹ基を含む置換に関しては、例えば一方はア
ミン官能基を有し、他方はカルボキシル、ヒドロキシル
またはスルフヒドリル官能基を有しまたはこの逆である
ように、一方ではムラミル−ペプチドによりまた他方で
はハプテンにより担持される適当な官能基基間のペプチ
ド結合を形成できるまで、ペプチド合成に通常使用され
るカツプリング方法による手段をとることができる。Ｚ
基またはＹ基のいずれかには、次いで、専門家に周知の
技法に従つてサツカリド基の６位置の炭素のレベルで、
またはこれと逆にペプチド鎖の末端のレベルでの固定を
行なうために、所望に応じて、適当な末端官能基が導入
される。
また同様に、ヨーロツパ特許出願第3833号に考察されて
いる一般技法も参照されたい。
当然のこと乍ら、例えばテイー．キタガワ（T.KITAGAW
A）及びテイ．アイカガワ（T.AIKAGAWA）により“J.Bio
chem."79（1976）233に記載されている技法を用いるこ
とにより、ハプテンとムラミル−ペプチドからなるパー
トナーの一つにより担持されるスルフヒドリル官能基
と、他の試薬により担持されるマレイミド基との間で起
こる結合を行なう他のあらゆるタイプの結合手段も可能
である。
結合はまた、ジアゾ化またはイソチオシアネートを作用
させる反応の通常の方法を用いることによつても行なう
ことができ、特にムラミル−ペプチドが芳香族アミン官
能基を有するとき（特に基ＡまたはR1のレベルに）、ま
たはハプテンがこの反応に関与しうるアミン官能基を有
するときに行なうことができる。このような生成技法
は、例えば、ビイー．エフ．エルランガー（B.F.ERLANG
ER）により、“Pharmacol.Rev."25（1973）271に記載さ
れている。
カツプリングはまた、試薬の一つにより担持されるアル
デヒド官能基と他の試薬により担持されるアミン官能基
との間に形成されるシツフ（chiff）塩基の還元によつ
ても行なわれる（G.R.GRAY,“Arch.Biochem.Biophys."1
63（1974）,426）。
これらの反応は全てそれ自体周知であり、同じ結果に到
達するのに数多くの変形を導入できるということは、専
門家にとつて明らかなところであろう。さらに詳細には
基Ｙ及びＺに関しては、ムラミル−ペプチドとハプテン
間において、結合は例えば二官能性試薬からなる架橋剤
を用いる架橋によつて形成できるということも、注意さ
れるべきであろう。結局、最終結合体におけるムラミル
−ペプチドとハプテン間の架橋基は、好ましくはｐ−デ
シル炭化水素鎖の長さに相当する連鎖長さを超えないで
あろう。
このような架橋剤は例えば1978年６月５日出願のフラン
ス特許第7816792号に記載されている。
前記において、ムラミル−ペプチドとペプチド性質のハ
プテン間のカツプリングの場合について特に述べた。ハ
プテンがオリゴサツカリドにより構成されているとき
は、同じタイプの反応が採用でき、ハプテンが遊離のカ
ルボキシル官能基またはアミン官能基あるいはさらにア
ルコール官能基を有するやいなや、これらはついでムラ
ミル−ペプチドに担持される適切な官能基とアミドまた
はエステル結合を形成できる。
一つの変形としては、還元端末糖を有するか、さもなく
ば偽アルデヒド官能基がカルボキシル官能基に酸化され
ているオリゴサツカリドのC1位置へムラミル−ペプチド
を結合する手段も可能であり（G.ASHWELL,“Methods in
Enzymol."28（1972）,219）、あるいは前記方法（既に
述べたR.GRAY）も使用できる。最初のケースではペプチ
ドまたはエステル結合が確立され、第二のケースではア
ルキルアミン結合である。
ムラミル−ペプチドへのハプテンの固定は、ムラミル−
ペプチドの幾つかの点で起こり、また同様にその逆も起
こり、従つて本発明は二つの構成成分が適当な化学的官
能を有する割合までのムラミル−ペプチドとハプテンと
のオリゴマーにもその範囲が及ぶ。しかしながら、この
ような結合体の分子量は、通常5,000を超えてはいけな
いと理解される。
一般に、ハプテン成分とムラミル−ペプチド成分は、有
利には約１乃至10、特に1.5乃至10、有利には２乃至３
の重量比であろう。
本発明はまた、本発明に係る結合体を適当な賦形薬と共
に含有してなるワクチンの形態に調製された組成物に関
するものである。
有利な製薬学的組成物は、少なくとも一つの本発明に係
る結合体の有効量を含有する溶液、懸濁液または注射可
能なリポゾームからなるものである。好ましくは、これ
らの溶液、懸濁液またはリポゾームの形態は、等張無菌
水性相、好ましくは生理食塩水またはグルコースの水性
相で調製される。
本発明は、さらに詳細には、皮膚内、筋肉内または皮下
注射あるいはさらに乱刺法により投与されるべく適合さ
れたこのような懸濁液、溶液またはリポゾーム形態に関
する。
さらに、本発明は、他の経路、特に経口的にまたは直腸
経路により、あるいはさらに粘膜、特に眼、鼻、肺また
は腟の粘膜と接触せしめられるようにエロゾールの形態
で投与可能な製薬学的組成物に関するものである。
従つて、本発明は、本発明に係る少なくとも一つの結合
体が、経口、経眼、経鼻形態の構成に適合された固体も
しくは液体の製薬学的に受容可能な佐薬、または直腸投
与形態の構成に適合された佐薬、あるいはさらに腟投与
用のゼラチン状佐薬と共に見い出される製薬学的組成物
に関するものである。さらにまた、膠様組織、特に眼ま
たは鼻への投与用に適合された、本発明に係る少なくと
も一つの結合体を含有する等張液組成物に関するもので
ある。最後に、本発明は、本発明に係る結合体が懸濁液
中に溶解ないし保持され、その解放がエロゾールへの分
散を生ずる“噴射剤”型の製薬学的に受容可能な液化ガ
スから形成された組成物に関するものである。
有利には、本発明に係るワクチン組成物は、さらにワク
チンの実証を促進するポリビニルピロリドンなどの賦形
薬を含有する。ポリビニルピロリドンに代えて、過去に
おいてこの表現に与えられた通常の意味におけるあらゆ
るタイプの佐薬、すなわち医薬の吸収をより容易にし、
あるいは生体内でその作用を促進する物質を用いること
ができる。後者のタイプの他の佐薬の例としては、カル
ボキシメチルセルロース、水酸化アルミニウム、ホスフ
エート、あるいは当業技術者にとつて周知のこのタイプ
のあらゆる他の佐薬が挙げられる。
本発明に係る製薬学的組成物は、従つて本質的に、宿主
に免疫反応を生起せしめ、ハプテンと同じようなシーケ
ンスを有する抗原またはハプテン自体に関して、抗体ま
たは細胞媒介免疫性を生成せしめようとするものであ
る。最後のケースは、ハプテンが、その作用が緩和され
るべきホルモンなどの天然ペプチドからなる場合に特に
興味のあることである。これらの製薬学的組成物は、従
つて、ヒトまたは動物生体の挙動の発展における修正が
探究されているそれぞれのときに、ヒトまたは獣医治療
に特に有用である。探究される発展は、動物種における
受精能力、または幾つかのホルモンの抑制に対するヒト
または動物宿主の代謝の制御された方向の制御からな
る。後者の場合、使用された結合体に入るハプテンは、
ホルモン自体または後者の断片からなるだろう。
獣医の分野においては、さらに他の構成成分の犠性で幾
つかの構成成分の生成が増大するといえる。例えば、免
疫学的去勢により、食肉生産の動物の増加目的で投与さ
れる獣医ワクチンの応用が挙げられる。
本発明は特に、ハプテン自体が、ペプチドまたはグリコ
ペプチドホルモンのクラスに属するホルモン自体、また
ろ該ホルモンと共通部分を有するペプチドシーケンスの
いずれかからなるハプテン結合体に関する。この点にお
いて特に興味のあるホルモンは、菌体刺激ホルモンLH−
RHの遊離因子からなる。
本発明はさらにまた、本質的にこれらのハプテン抗体結
合体から形成された生物学的薬剤に関する。特に、ハプ
テン部分は薬剤の有効成分からなり（例えばモルヒ
ネ）、関連する生物学的薬剤はそこで特に低減された無
熱性の抗体、特に一価の抗体及び単一（monoclonal）抗
体を製造するのに用いられる。これらの抗体は、そこ
で、例えば生体宿主に関連する医薬の作用の研究を行な
える薬剤構成に有用である。特に、これらの抗体は細胞
受容体の検出、あるいはさらに代謝及び関係薬剤の作用
モードの研究を可能にする。
本発明はまた、さらに一般に、抗体自体、または本発明
に係るハプテンとムラミル−ペプチドとの結合体の生体
宿主への投与により得られるような抗体の調製にも関す
るものである。これらの抗体の本質的固定特徴は、当然
のこと乍ら、本発明に係る結合体、及びさらにそのハプ
テン部分が天然抗原と同じような構造要素を有するとき
にはこれ、を中和する能力にある。
本発明は、特に、後述する実施例の一つに示すように、
2,000ダルトン未満の分子量を有し、高い免疫原性を有
し、それと同時に、結合体に入るムラミル−ペプチドが
それ自体あるレベルの発熱性を有する場合でさえも発熱
作用が無視し得あるいはさらに存在しない、前記ホルモ
ンとムラミル−ペプチドとの結合体を提供するものであ
る。さらに、高分子量の抗原とムラミル−ペプチドから
形成される従来の結合体で観察されるものとは逆に、本
発明のものは現在使用されている検出方法で検出されう
る限度内で、ムラミル−ペプチド構成成分に関する免疫
原作用が欠如している。
本発明の他の特徴は、本発明を実施する以下の好ましい
実施例及び本発明に係る結合体により得られる結果から
より明らかとなろう。
好ましい実施態様： Ｉ−（LH−RH）−MTPの合成 代表的な結合反応を得るために、LH−RH3mgを、溶剤と
してのジメチルホルムアミド（DMF）0.4ml中のＮ−エチ
ル−Ｎ′−（３−メチル−アミノプロピル）−カルボジ
イミド塩酸塩（ECDI）242mg及び１−ヒドロキシ−ベン
ゾトリアゾール（HOBT）43mgに酸系態で加えた。周囲温
度で７時間、マグネチツクスターラーを用いて温置を行
なつた。次いで、この溶液に、蒸留水0.3mlに混合した
3.24mgのMTP（Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル
−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−リシン）を加え、周囲温
度で48時間、マグネチツクスターラーを用いて反応を続
けた。反応生成物を0.15MのNacl溶液にとり、形成され
た結合体をセフアデツクス（SEPHADEX）G10の分子篩上
での分別により回収した。結合体は死容積に溶離した。
ペプチドとムラミン酸の含量をレイストヒ（Reissig）
ら、J.Biol.Chem.217,959−966（1956）の方法により評
定した。93％のMTPがカツプリングされていることが解
つた。従つて、LH−RH分子当りのMTP分子の数は1:1に近
い。
MDP−破傷風トキシン結合体の合成（対照用） MTP16mgに、DMF0.15mg＋pH7.4のPBS0.01ml（燐酸塩で緩
衝された生理食塩水溶液）を、ついでECDI300μｇ、HOB
T1mg及び破傷風トキシン２mgを加えた。反応は、暗闇の
中で、周囲温度でマグネチツクスターラーを用いて15分
間続け、ついでこの混合物にECDI300μｇを加え、HOBT1
mg及び破傷風トキシン２mgを加えた。反応をさらに15分
続け、同じ操作を９回繰り返した。従つて、破傷風トキ
シンは20mg用いられたことになる。反応終了時に、セフ
アデツクスG75カラム上でのクロマトグラフイーによ
り、PBS中に結合体を回収した。結合体は最初の溶離ピ
ークに含有されていた。破傷風トキシン及びMTPのそれ
ぞれの測定はフオリン（Folin）とレイストヒの方法に
より行なつた。
新鮮な赤血球へのMTPのカツプリング ベンゾキノンによる新鮮な赤血球へのMTPのカツプリン
グを、以下の方法により行なつた。ベンゾキノン0.2ml
（30mg/ml）をpH７の0.2MのPBS0.2mlに溶解したMTP3mg
に加えた。反応は、暗闇で、撹拌しながら周囲温度で90
分続けた。pH8.0の0.1MのNaHCO3媒体中のセフアデツク
スG25分子篩のカラム上でのクロマトグラフイーにより
反応を停止した。ベンゾキノンにより活性化されたMTP
は死容積に溶離された。これを0.1MのNaHCO3溶液中の羊
の新鮮な赤血球50％懸濁液0.8mlに加えた。混合物を撹
拌しながら室温で夜通し温置し、ついで赤血球が残つて
いるPBSを有するMTPを三度洗滌した。
ムラミル−ペプチドにカツプリングされ、生理食塩水ま
たは不完全フロインド佐薬（FIA）に投与されたLH−RH
による免疫化 以下の溶液0.1mlを、年令６週間のスイス雄マウスの幾
つかのグループに、0,2,4及び29日目に皮下注射により
投与した。
(1)フロインド完全佐薬（FCA）に懸濁したLH−RH50μｇ (2)FIAに懸濁したLH−RH50μｇ (3)MDP4.3μｇと接合され、FIAに懸濁されたLH−RH8.6
μｇ (4)PBS中LH−RH50μｇ (5)PBS中のMDP4.3μｇと接合したLH−RH8.6μｇ さらに三つの対照グループにも、抗原もMDPも伴なわず
に、FCAまたはFIAまたはPBSのいずれかを注射した。
使用前に、抗原（LH−RH純粋物又はカツプリング物）は
0.9％Nacl中50％PVP（ポリビニルピロリドン）に吸収さ
れ、温置は２時間続けられたことは注意すべきであり、
ついで混合物はFIAまたはFCAとエマルジヨン化し、ある
いはPBSに加えられた。
皮下注射によりマウスに注射された0.1mlの容積には12.
5％のPVPが含有されていた。
23日目及び50日目に、全てのマウスは採血され、乱切さ
れ、それらの血精が集められ、各グループに対して組合
わされた。それらの睾丸及び精嚢は取り出され、計量さ
れ、ボイン（Boin）溶液に置かれ、組織学的試験用に調
製された。
抗−（LH−RH）抗体の検出 抗−（LH−RH）抗体が以下のようにして検出された。
被検未稀釈血清50μｌ、PBS中に1/80に稀釈された通常
の兎血清50μｌ及びヨード125（約1,000dpm,1分当りの
崩壊:dpm）と表示された（LH−RH）10μｌを加えた。こ
れを放置して４℃で72時間温置した。ついでデキストラ
ンで被覆された活性炭（活性炭250mgを0.01MのPBS中の
デキストラン溶液100mlに加えて得られたもの）の水冷
した懸濁液150μｌを加えた。これを４℃で５分間放置
した。2500rpmで20分間遠心分離後、上澄み液をデカン
トし、その放射能をヘイバー（HABER）ら“Manual of C
linical Immunology",Rose N.R.＆ Friedman H.発行,pp
190−196に記載の方法により測定した。予備研究によれ
ば、デキストランで被覆された活性炭は使用条件下で95
％までの純粋（LH−RH）を吸収することができた、とい
うことが示された。
抗−MTP抗体の検出 抗−MTP抗体の存在は、Ｕ状凹陥部を有するミクロ滴定
プレート（Cooke Engineering）で行なわれる溶血性試
験により、以下のようにしてチエツクした。
血清を56℃で30分間の不活性化により解補体化（decomp
lemented）した。二倍稀釈された血清50μｌをPBS50μ
ｌと混合した。新鮮な赤血球−MTP結合体20μｌを2.5％
の濃度で加え、プレートを37℃で15分間の温置のために
放置した。最後に、補体20μｌ（PBSで1:20に稀釈され
た標準のモルモツト血清）を加え、結果を記帳する前に
プレートを再度37℃で30分間の温置のために放置した。
発熱性の評定 試験は2.5〜2.8kgのニユージーランド兎で行なつた。約
８cmの長さに兎の直腸に導入され、遠隔温度計（モデル
NO.TE3;エラブ（Ellab），コペンハーゲン，デンマー
ク）に接続されたサーミスタ探針で温度を測定した。兎
は20℃の空調された部屋に置かれ、観察された。注射
は、その体温が30分間の経過段階において安定に保たれ
ているものにのみ行なつた。その発熱可能性が検査され
ている組成物の注入後３時間の体温を測定した。結果
は、検査下の組成物の静脈内注射後の３時間の過程の兎
について得られる平均温度変位（℃）として表わした。
最小発熱性服用量は0.6℃の上昇を生ずる量に相当す
る。
以下の結果が観察された。
ａ）免疫化試験 結果を下記第１表に示す。これらは、dpmの合計数に対
する、上澄み液の１分当りの崩壊（dpm）数の比率を100
倍したものとして表わされている。
抗原が存在しない場合には、FCA,FIAまたはPBSを注射し
た対照の血清には固定は観察されなかつた（測定された
（最大2.3％まで）固定は意味のあるものでない）。し
かしながら、FCAに懸濁された（LH−RH）50μｇの場合
抗体が生成する（30.5％固定）。FIA中（LH−RH）50μ
ｇを受けたグループには意味のある応答は検出されなか
つた（固定2.5％）。またPBS（10％）で得られた弱い応
答には意味がない。結合体MTP−（LH−RH）で免疫化さ
れた動物からの血清では、結合体はわずかに8.6μｇの
（LH−RH）及び4.4μｇのMTPを含有するに拘らず、強い
応答が得られる。驚くべきことに、抗体応答は等量のMT
P−（LH−RH）接合体が水性媒体に投与されたときでさ
えもより高い。これらの結果は、MTP−（LH−RH）結合
体は（LH−RH）とFCAの協合よりもより効果的であり、
またFIA中においてもまたPBS中においてもより効果的で
あるということを示している。
組織学的検査 睾丸の平均重量は、PBS（LH−RH）の５〜50μｇの投与
後にわずかに増加した（252mg〜279mg）。この増加は意
味があるけれども（p0.05）、いかなる組織学的変化も
伴なわなかつた。これとは逆に、FCA中に投与された抗
原の同量では、精液生成の減少及び幾つかの場合には精
管のわずかな萎縮を伴なう睾丸の実質的重量増加を生ず
る。これに反し、PBS溶液中の結合体MTP−（LH−RH）を
受けた動物においては、睾丸の重量は他のグループにお
けるよりも明瞭に低かつた（p0.01）。さらに、睾丸の
組織学的検査では、このグループにおいてのみ、同時に
腸管及び精管の著しい萎縮が示され、これは実際上10の
うち９のマウスに生殖細胞が欠如していた。
抗−MTP抗体の測定 125I−LH−RH固定活性について先に試験したのと同じよ
うに組合わせた血清を、赤血球とMTPとの結合体での溶
血性試験により、それらの抗−MTP抗体の含有量に関し
ても検査した。MTPのα−メチルエステルと牛のアルブ
ミン血清の結合体での過免疫化後に得られた抗−MTP兎
血清を、対照抗原として用いた。1:30.720の最終稀釈ま
での兎の抗−MTP血清では溶血反応が観察されたけれど
も、結合体MTP−（LH−RH）で処置したグループのいず
れにも抗−MTP抗体は検出されなかつた。
研究下の結合体及び比較分子との結合体の可能発熱性の
検出 結果を以下の第２表に示す。これによれば、単離状態に
あるときのムラミル−ペプチド自体あるいは同じムラミ
ル−ペプチドが破傷風トキシンなど天然抗原と形成され
た結合体のいずれの発熱性と比較しても、本発明に係る
結合体の発熱性が存在しないことが顕著である。本発明
に係る結合体「（LH−RH）−MTP」は、結合体中のMTPの
相対量がMTP9.3μｇのオーダーである場合でさえも、動
物における著しい温度上昇を惹起しない。これらの結果
は、特に比較接合体（TT−MTP）による同じ条件下で得
られるものと比較されるべきであり、これによれば、投
与された結合体中のMTPの相対比率が本発明におけるも
のよりも100倍も小さい場合でさえも、全く著しい温度
上昇を惹起する。
さらに注記すべきことは、MTP77μｇの相対比率を含有
する結合体（LH−RH）−MTPのより高い服用量でも、動
物における著しい温度上昇を惹起しないということであ
る。
上記表中、表示“−”は相対量のホルモンとMDPまたは
破傷風トキシンのいずれかとの間の試験接合体における
カツプリングを示し、上記量は表の標題“服用量（μ
ｇ）”下の同じライン上の最初及び第２の数から得られ
るものである。
II 下記式の６−ｏ−（スクシニルアミド−プロピル−
２−ｏ−（α−Ｌ−フコピラノシル）−３−ｏ−（α−
Ｄ−ガラクトピラノシル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル）−２−アセトアミド−２−デオキシ−３−ｏ−（Ｄ
−２−プロピオニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン）
−Ｄ−グルコピラノ−スのｎ−ブチルエステルの調製 ａ）２−アリロキシエチル−２−ｏ−（2,3,4−トリ−
ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−３−ｏ−
（2,3,4,6−テトラ−Ｄ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクト
ピラノシル）−4,6−ｏ−ベンジリデン−ガラクトピラ
ノシドの調製 ２−ヒドロキシエチル ２−ｏ−（2,3,4−トリ−ｏ−
ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−３−ｏ−（2,3,
4,6−テトラ−ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノ
シル）−4,6−ｏ−ベンジリデン−Ｄ−ガラクトピラノ
シド（フランス特許NO.78 10558/2.422.621に記載され
ている）の984mg（0.777mモル）を無水DMF（15ml）に溶
かし、ついでナトリウムの水素化合物（50％油中懸濁
液;150mg;3.1モル）を加えた。１時間後、臭化アリルを
加えた（0.25ml;2.9mモル）。２時間後にさらに臭化ア
リルの添加を行なつた（0.25ml;2.9mモル）。４時間
後、メタノールを加えた（3ml）。反応混合物を乾燥度
まで濃縮し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄したクロ
ロホルム中に再びとりあげ、ついで硫酸ナトリウム上で
乾燥した。蒸発後、残留物を酢酸エチル−ヘキサン（1/
2;v/v）混合物中のシリカゲルカラム（30g）上でのクロ
マトグラフイーにより精製した。
蒸発、乾燥後、白い泡状物が得られた:745mg（74.2％）
▲〔α〕20 D▼＝＋３゜（ｃ＝1,クロロホルム）。生成
物（Ｉ）はエタノール中に晶出し、103−104℃で溶融す
る。
ｂ）３−ヒドロキシプロピル ２−ｏ−（2,3,4−トリ
−ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−３−ｏ−
（2,3,4,6−テトラ−ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクト
ピラノシル）−4,6−ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド（II）の調製 生成物（Ｉ）の753mg（0.58mモル）をテトラヒドロフラ
ン無水物に溶かした。窒素通流下に撹拌されているこの
混合物に、９−ボラビシクロ（3.3.1）ノナン（1.8ml;
0.9mモル）の0.5M溶液を加えた。還流下に４時間後、エ
タノールを加え（0.3ml）、ついで10分後に3Mのソーダ
（0.4ml;1.2mモル）及び10Mの過酸化水素（0.6ml;5.8m
モル）を加えた。50℃で１時間後、ジクロロメタンを加
え（25ml）、ついで溶液が透明となるまで撹拌しながら
固形炭酸カリウムを除々に導入した。
濾過後、溶媒の蒸発及び乾燥を行ない、残留物を酢酸エ
チル−ヘキサン（2/1;v/v）混合物中のシリカＧカラム
（30g）上でのクロマトグラフイーにより精製した:857m
g（67.3％），▲〔α〕20 D▼＝＋1.5゜（c:1,クロロホ
ルム）。
ｃ）３−アジドプロピル−２−ｏ−（2,3,4−トリ−ｏ
−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−３−ｏ−（2,
3,4,6−テトラ−ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル）−4,6−ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−テラクト
ピラノシド（III）の調製 生成物（II）の517mg（0.39mモル）を乾燥クロロホルム
（10ml）に溶かした。トリエチルアミン（0.1ml;0.7mモ
ル）、Ｎ−ジメチル−アミノピリジン（４mg）及び新し
く結晶化されたトシルクロライド（82mg−0.429mモル）
を加えた。24時間後、さらにトリエチルアミン（0.025m
l）、Ｎ−ジメチル−アミノピリジン（３mg）及びトシ
ルクロライド（20mg）を加えた。
24時間後、ジクロロメタンを加え（20ml）、同様に水を
加えた（5ml）。
２時間撹拌後、有機相を2Mの塩酸で、また水、重炭酸ナ
トリウム飽和溶液及び水で洗浄した。
硫酸ナトリウム上での乾燥及び蒸発後、残留物が得られ
た（558mg;96.8％）。この生成物をジメチルホルムアミ
ド（15ml）に溶解し、ついでアジ化ナトリウム（76mg）
を加えた。反応混合物を80℃で２時間撹拌し、ついで乾
き度まで濃縮した。得られた残留物を、酢酸エチル−ヘ
キサン（1/1;v/v）中シリカＧゲル（20g）のカラム上で
精製した:462mg（87.8％）。生成物をエーテル−ヘキサ
ン中に晶出せしめた:m.p.86−87℃；▲〔α〕20 D▼＝＋
３゜（ｃ＝1,クロロホルム）。
ｄ）３−アミノプロピル ２−ｏ−（α−Ｌ−フコピラ
ノシル）−３−ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド（IV）の調製 生成物（III）の450mgを酢酸（30ml）中に溶かし、つい
で水素雰囲気下に木炭上５％パラジウムの存在下に４〜
５日間撹拌した。反応混合物を濾過し、凍結乾燥により
製品を得た（144.5mg;69％）。▲〔α〕25 D▼＝＋5.5゜
（ｃ＝2,水）。
ｅ）式Ｉの組成物の調製 ６−ｏ−スクシニル−２−アセトアミド−２−デオキシ
−３−ｏ−（Ｄ−２−プロピオニル−Ｌ−アラニル−Ｄ
−グルタミン）−Ｄ−グルコピラノ−ス（６−ｏ−Suc
−MDPG−onBu）のｎ−ブチルエステル（181.6mg;0.28m
モル）をジメチルホルムアミドに溶かした。ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（48.5mg;0.28mモル）及びＮ−シク
ロヘキシル−Ｎ′（β−（Ｎ−メチル−モノホリノ）−
エチル）カルボジイミドｐ−トルエンスルホネート（11
8.5mg;0.28mモル）を加えた。
１時間後、式（IV）の生成物（85mg;0.14mモル）をＮ−
メチルモルホリン（0.015ml）の存在下にジメチルホル
ムアミドの溶液（3ml）を加えた。24時間後、反応混合
物を乾き度に濃縮し、乾燥した。得られた残留物をAG−
50−Ｗ−X2（OH）の名称で知られるイオン交換樹脂のカ
ラム上で精製し、これを水で溶離した。薄層クロマトグ
ラフイーにより決定したフラクシヨンを結合し、凍結乾
燥した。得られた生成物（217mg）をAG−Ｉ−X2（アセ
テート）の名称で知られるイオン交換樹脂のカラム上で
精製し、これを水で溶離した。精製したフラクシヨンを
結合し、凍結乾燥した。得られた生成物（88mg）を最後
にシリカカラム（ローバーカラム、タイプA Merck）上
で精製し、酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水（５−５−
１−３及び６−２−0.6−1;v/v）の溶剤系の混合物に溶
離した。生成物（Ｉ）を含有するフラクシヨンを結合
し、凍結乾燥した:47mg▲〔α〕23 D▼＝＋23.1゜（ｃ＝
1.03,水）。
糖（ガラクト−ス及びフコーズ）の評価は、Z.DISCHEと
L.B.SHETTLES,“J.Biol.chem.",175（1948）595に従つ
て行ない、アミノ酸とアミノ酸分析によるムラミン酸の
それは、完全な酸加水分解（6N塩酸、110℃、20時間）
後に、S.MOOREとW.H.STEIN,“J.Biol.chem.",176（194
8）367によつた。
アミノ酸含量とガラクトース及びフコーズ含量との間に
見られる比率は0.95であつた。
最終的に得られた結合体は発熱性が欠如していた。0.5m
g／kgの服用量で、兎に0.1℃の殆んど意味のない温度上
昇が惹起しただけである。
III−MTPとバソブレツシンとの結合体の調製 出発生成物は、式 の〔Lys〕−バソプレツシン（LVP）であつた。３つの化
学基が結合のために採用された（２つのアミノ基と１つ
のヒドロキシル基）。
この化合物をトリプシンの作用を受けさせ、これにより
以下の化合物が得られた： “DesglyLVP"として指示されるこの化合物を、アミノ基
をブロツクするためにアセチル化した（pH７で、Desgly
LVPの当量当り2.1モル当量の酢酸によるアセチル化）。
アセチル化されたDesglyLVPを、ついで以下のようにし
てMTPに結合した： アセチル化されたDesglyLVPの１mgをECDI70mgに加え
（モル比1:328）、またDMF0.5ml中HOBT15mgに加えた。
混合物をマグチツクスターラーで撹拌しながら周囲温度
で７時間温置した。蒸留水0.3mlに溶解したMTP1.32mgを
先記混合物に加えた。
反応を起こさせるために、周囲温度で48時間撹拌しなが
ら接触を維持した。
反応混合物をついで濾過し、AMICON DIAFLO YM2の名称
で市販されている濾過膜上で濃縮した。
レイスイヒの方法によるMTPの投薬後、反応に付されたM
TPの60％が結合されたことが確認された。DesglyLVPとM
TPは、得られた接合体中では約1:1の分子比率であるこ
とが確認された。
バソプレツシンへのMTPの結合は、前者のホルモンを注
射可能とし、未変性バンプレツシンに対する抗体を引き
出すその能力を何ら変更しなかつた。特に、抗−バソプ
レツシン抗体が兎に得られ、その抗体は未変性バソプレ
ツシンのＮ−未端部分を確認することが見い出された。
IV−MTPとソマトスタテイン（Somatostatin）の結合体
の調製 出発ソマトスタテインは以下の式のものである。
遊離のアミノ基を、pH8.2で1.1モル当量の酢酸でアセチ
ル化し、これによりスレオニル及びセリル基のｃ−末端
シアテイル残基に最も近いスレオニル及びセリル基の遊
離ヒドロキシル基のｏ−アセチル化を避ける。アセチル
化されたソマトスタテイン誘導体を先に示した混合無水
物方法によりMTPに結合した。結合生成物をセフアデツ
クスGS15シーブ上での濾過により分離し、Amicon“DIAF
LO"YM2膜上で限外濾過して濃縮した。最終結合体は約8
3.16/32.3の重量比でソマトスタテイン誘導体とMTPを含
有していた。分子量は2276と測定された。
MTP−ソマトスタテイン結合体は、生理食塩水溶液の形
態で兎に注射された場合、変換されていないソマトスタ
テインに対し活性な抗体の生成を引き出した。
Ｖ−HBSの抗原部位を有するペプチドとMTPの結合体の調
製 使用されるペプチドは、先に述べたもののいずれでもよ
く、あるいはHBSポリペプチドと共通のシーケンスを有
し合成される同様のもののいずれでもよい。
反応は、MTP21mgと混合された、0.1M重炭酸ナトリウム
溶液2.5ml中に溶解したペプチド25mgを用いることによ
つて行なうことができる。周囲温度で撹拌下１時間接触
後、カツプリング試薬の0.1％最終溶液が得られるまで
グルタルアルデヒドを加えることができる。得られた結
合体は、ついで前述した実施例に記載の方法と同様の技
法により分離できる。
自ら明らかなように、また前記から既に明らかなよう
に、本発明は特に詳細に考察してきた適用のタイプ及び
態様に何ら限定されるものでなく、これに反して全ゆる
変性乃至修正を包含し、また特許請求の範囲に挙げられ
ているハプテン−ムラミルペプチド結合体の全ゆる例を
含むものである。ムラミル−ペプチド部分の重要な部分
は、以下の基礎構造からなると理解されるべきである。
この構造から出発して形成される各種誘導体または変性
物は、ここに規定したような置換基により完成される場
合、特許請求の範囲に挙げられているムラミル−ペプチ
ド部分と等価物とみなされるべきである。
さらに、ここに挙げた全ての構造部分は先に規定した構
造においてＸがＬ−アラニルのものと等価物または選択
物と考えられるべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シエデイドウ・ルイ フランス国75015パリ・リユ・ガストン・ ド・セラヴエ16−18番 (72)発明者 ルフランシエ・ピエ−ル フランス国91190ギフ・スイユル・イヴエ ツト・アレ−・ド・ラ・マレ・オアゼユ46 番 (72)発明者 レベル・ミシエル フランス国75012パリ・リユ・ズビユエ・ ビイ−62 24−26番 (72)発明者 シヨアイ・ジヤン フランス国75007パリ・リユ・サント−ギ ロ−メ21番 (56)参考文献 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ、Ｖｏｌ．17（1980），ｐａｇｅｓ 357−363

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ムラミル−ペプチドではないハプテンと、
    ムラミル−ペプチドとの共有結合体であって、この結合
    体のハプテン部分に対して免疫原作用を有するが、ムラ
    ミル−ペプチド部分に対してはそれを有さず、その分子
    量が5,000以下である免疫原性組成物。
  2. 【請求項２】分子量が3,000以下である特許請求の範囲
    １に記載の免疫原性組成物。
  3. 【請求項３】分子量が2,000以下である特許請求の範囲
    １に記載の免疫原性組成物。
  4. 【請求項４】抗体のあるいは特異細胞媒介反応の生体内
    生産により明示され、いずれもそれ自体に対して及び前
    記抗原と同じような構造要素を有する天然抗原に対して
    免疫原作用を有する特許請求の範囲第１項〜第３項のい
    ずれかに記載の免疫原性組成物。
  5. 【請求項５】ハプテンがペプチドまたはグリコペプチド
    である特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載
    の免疫原性組成物。
  6. 【請求項６】ハプテンがホルモンまたはそれらの部分か
    ら構成されている特許請求の範囲第１項〜第４項のいず
    れかに記載の免疫原性組成物。
  7. 【請求項７】ハプテンがLH−RHである特許請求の範囲第
    ６項に記載の免疫原性組成物。
  8. 【請求項８】結合体に発熱性がない程、充分に低い分子
    量を有する特許請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに
    記載の免疫原性組成物。
  9. 【請求項９】兎に100μg/kgの服用量で静脈内投与をし
    たとき、0.6℃の温度上昇を惹き起こさない特許請求の
    範囲第８項に記載の免疫原性組成物。
  10. 【請求項１０】兎に300μg/kgの服用量で静脈内投与を
    したとき、0.6℃の温度上昇を惹き起こさない特許請求
    の範囲第９項に記載の免疫原性組成物。
  11. 【請求項１１】兎に500μg/kgの服用量で静脈内投与を
    したとき、0.6℃の温度上昇を惹き起こさない特許請求
    の範囲第９項に記載の免疫原性組成物。
  12. 【請求項１２】ハプテン部分が、50未満のアミノアシル
    残基（β−hCGのＣ−端末エイコサペプチドを除く）を
    含有するペプチドである特許請求の範囲第１項〜第４項
    のいずれかに記載の免疫原性組成物。
  13. 【請求項１３】30未満のアミノアシル基を含有する特許
    請求の範囲第12項に記載の免疫原性組成物。
  14. 【請求項１４】20未満のアミノアシル基を含有する特許
    請求の範囲第12項に記載の免疫原性組成物。
  15. 【請求項１５】15未満のアミノアシル基を含有する特許
    請求の範囲第12項に記載の免疫原性組成物。
  16. 【請求項１６】ハプテンに接合されるムラミル−ペプチ
    ド部分が、下記一般式（Ｉ）を有するムラミル−ペプチ
    ドから誘導されたものである特許請求の範囲第１項〜第
    ４項のいずれかに記載の免疫原性組成物。 ここで、上記の各基は、ハプテンに共有結合的に結合し
    ていないときには以下の意味を有する：すなわち、 R5は遊離のカルボキシル基もしくはアミド基、または１
    〜10の炭素原子を有する脂肪族アルコールによりエステ
    ル化されたカルボキシル基、あるいはそれ自身遊離のカ
    ルボキシル基、アミド化されたカルボキシル基もしくは
    １〜10の炭素原子を有する脂肪族アルコールによるエス
    テル化されたカルボキシル基を有するアミノ酸により置
    換えされたカルボキシル基であり、 Ｒは水素またはメチル基であり、 R2はアセトアミドまたはグリコリル−アミド基であり、 R1はNH2,OH、または任意的にヒドロキシル，アミン、カ
    ルボキシアミド、スルホンアミド、エーテル、チオエー
    テル、エステルまたはチオエステル置換基を有し、アル
    キル、アリール、アリールアルキルまたはアルキルアリ
    ール基に相当するせいぜい10の炭素原子を有するラジカ
    ルで有り、 R4はヒドロキシルまたは１〜４の炭素原子を有するオキ
    シアシル基であり、 Ｘはアラニル、アルギニル、アスパラギル、アスパルチ
    ル、システイニル、グルタミニル、グルタミル、グリシ
    ル、ヒスチジル、ヒドロキシ−プロリル、イソロイシ
    ル、ロイシル、リシル、メチオニル、フエニアルアラニ
    ル、プロリル、セリル、スレオニル、トリプトフアニ
    ル、チロシル、バリル及びアミノブチルからなる群れの
    アミノアシル残基であり、 Ｚは下記一般式（II）を有し、ムラミン酸のＣ−６の位
    置を置換する基であり、 −R6−（R7）ｘ （II） ここで、ｘ＝０または１であり、 ｘ＝０のとき、 R6はヒドロキシルまたはアミノ基であり、 ｘ＝１のとき、 R6はヒドロキシルまたはアミノ基、カルボキシアミド、
    スルホンアミドエーテルもしくはチオエーテル、エステ
    ルもしくはチオエステルであり、 R7はそのとき−CH2,−CH＝CH,−Ｓ−，−CO−またはNH
    基、−CH2−，−CH＝CH−，またはNH基の鎖であり、該
    基は任意的にアリール基により、またはカルボキシル、
    アミノ、スルホヒドリルもしくはヒドロキシル基によ
    り、またはカルボキシル、アミノ、スルホヒドリルもし
    くはヒドロキシル基により、または５以下の炭素原子を
    有するアルキル基により、または８以下の炭素原子を有
    するアルキルアリール、アリールアルキル基により、ま
    たは６以下の炭素原子及び１または２の酸素、窒素もし
    くはイオウ原子を有する複素環基により置換されている
    ものであり、上記アルキルアリールまたはアリールアル
    キル基はさらに任意にカルボニル基を含有し、または任
    意的にカルボキシル、アミノ、スルホヒドリルもしくは
    ヒドロキシル基により置換されているものであり、また
    前記複素環基はそれ自身任意的に５以下の炭素原子を有
    するアルキル基、カルボキシル、アミノ、スルホヒドリ
    ルもしくはヒドロキシル基により置換されているもので
    あり、 また前記R7基はそれにも拘らずｎ−デシル炭素水素鎖の
    長さを越えない長さを有するものであり、 Ｙは遊離のもしくはアミド化されたカルボキシル基、ま
    たは10以下の炭素原子を有するエステル基またはアミノ
    酸好ましくはリシン、オルニチン、グルタミン酸、アス
    パラギン酸もしくはチロシンからなる三官能アミノ酸に
    より置換されたエステル基、すなわちカルボキシル基及
    びアミノ基の他にさらにカルボキシルアミノもしくはヒ
    ドロキシル基を含有するエステル基、またはＹは下記一
    般式（III）に相当する基である。 −R8−（R9）ｘ （III） ここで、ｘは０または１であり、またR8はｘが０のとき
    にはアミドもしくはエステル結合であり、ｘが０でない
    ときは、R8はカルボキシアミド、エステルもしくはチオ
    エステル基であり、R9はそのときR7と同じである。
  17. 【請求項１７】Ｘがグリシル、セリル、バリル、ロイシ
    ル、アミノブチル残基、またはさらに好ましくはアラニ
    ルである特許請求の範囲第16項に記載の免疫原性組成
    物。
  18. 【請求項１８】ｘが０であり、Ｚがヒドロキシルまたは
    アミノ官能基である特許請求の範囲第16項に記載の免疫
    原性組成物。
  19. 【請求項１９】ｘ＝１であり、 R6がカルボキシアミド結合またはスルホンアミドエーテ
    ルもしくはチオエーテル、エステルもしくはチオエステ
    ルであり、また R7が下記に示すような基の一つを表わすものである特に
    第16項に記載の免疫原性組成物。 −（CH2）ｎ−COOH,特にｎ＝1,2,3または４ −（CH2）ｎ−NH2,特にｎ＝1,2,3または４ 特にｎ＝1,2,3または４ −（CH2）ｎ−C6H5−NH2,特にｎ＝０または１ −（CH2）ｎ−SH,特にｎ＝２
  20. 【請求項２０】R5基が１〜５の炭素原子を有するアルコ
    ールによりエステル化されたカルボキシル官能基であ
    り、またＹが−CHNH2基である特許請求の範囲第16項に
    記載の免疫原性組成物。
  21. 【請求項２１】ムラミル−ペプチド部分の基Ｒがメチル
    基である特許請求の範囲第18項に記載の免疫原性組成
    物。
  22. 【請求項２２】ムラミル−ペプチド部分の基Ｚがスクシ
    ニル基である特許請求の範囲第16項に記載の免疫原性組
    成物。
  23. 【請求項２３】R1,R4及びR6がヒドロキシル基、R2がア
    セトアミド基、Ｒがメチル基、Ｘがアラニル基、R5がカ
    ルボキシアミド基または１〜５の炭素原子を有するエス
    テル基、Ｙがカルボキシアミド官能基である特許請求の
    範囲第16項に記載の免疫原性組成物。
  24. 【請求項２４】ムラミル−ペプチド部分が下記のムラミ
    ル−ペプチドの一つから選択される特許請求の範囲第16
    項に記載の免疫原性組成物。 Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグル
    タミン、 Ｎ−アセチル−ムラミンＬ−アラニル−Ｄ−グルタミン
    のα−ｎ−ブチルエステル、 上記二つのムラミル−ペプチドの６−ｏ−スクシニエル
    化誘導体、 Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミ
    ン酸のモノ−α−またはγ−エステルもしくはジエステ
    ル（ここでエステル基は１〜５の炭素原子を有するもの
    である）。
  25. 【請求項２５】Ｙがリシル基を含むものである特許請求
    の範囲第16項に記載の免疫原性組成物。
  26. 【請求項２６】ムラミル−ペプチド部分が−アセチル−
    ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−
    リシンから誘導されたものである特許請求の範囲第17項
    に記載の免疫原性組成物。
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