JPH07163373A - マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産 - Google Patents
マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産Info
- Publication number
- JPH07163373A JPH07163373A JP6241581A JP24158194A JPH07163373A JP H07163373 A JPH07163373 A JP H07163373A JP 6241581 A JP6241581 A JP 6241581A JP 24158194 A JP24158194 A JP 24158194A JP H07163373 A JPH07163373 A JP H07163373A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vector
- heterologous protein
- promoter
- restriction enzyme
- structural gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】特定のマルチクローニングベクターに種々の異
種蛋白質構造遺伝子を導入する特定の手法、およびそれ
によって異種蛋白質構造遺伝子が導入された発現ベクタ
ーを提供する。 【構成】異種蛋白質構造遺伝子を導入するための制限酵
素認識部位が−ＡＣＡＴＧＴ−であるベクターに異種蛋
白質構造遺伝子を導入して−ＡＣＡＴＧＮ−なる配列の
連結部分を形成し、この配列中のＡＴＧを異種蛋白質構
造遺伝子の翻訳開始部位とした、シゾサッカロミセス・
ポンベにおいて機能しうる発現ベクター。 【効果】ベクターを切断する制限酵素と異種蛋白質構造
遺伝子を含む遺伝子を切断する制限酵素の組合せを選択
して異種蛋白質構造遺伝子の種類に応じて翻訳開始コド
ンＡＴＧの次の塩基（Ｎ）をＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの任意の塩
基とし、これにより種々の異種蛋白質を高発現量で発現
させることができる。
種蛋白質構造遺伝子を導入する特定の手法、およびそれ
によって異種蛋白質構造遺伝子が導入された発現ベクタ
ーを提供する。 【構成】異種蛋白質構造遺伝子を導入するための制限酵
素認識部位が−ＡＣＡＴＧＴ−であるベクターに異種蛋
白質構造遺伝子を導入して−ＡＣＡＴＧＮ−なる配列の
連結部分を形成し、この配列中のＡＴＧを異種蛋白質構
造遺伝子の翻訳開始部位とした、シゾサッカロミセス・
ポンベにおいて機能しうる発現ベクター。 【効果】ベクターを切断する制限酵素と異種蛋白質構造
遺伝子を含む遺伝子を切断する制限酵素の組合せを選択
して異種蛋白質構造遺伝子の種類に応じて翻訳開始コド
ンＡＴＧの次の塩基（Ｎ）をＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの任意の塩
基とし、これにより種々の異種蛋白質を高発現量で発現
させることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、分裂酵母シゾサッカロ
ミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe 、以下
Ｓ．ｐｏｍｂｅという）による異種蛋白質の生産を可能
とするマルチクローニングベクター、それに異種蛋白質
遺伝子を導入した発現ベクター、その発現ベクターの構
築方法、その発現ベクターを保持したＳ．ｐｏｍｂｅ形
質転換体、およびその形質転換体を用いた異種蛋白質の
製造法に関する。本発明により種々の異種蛋白質の遺伝
子の発現を効率化し、産生するペプチドまたは蛋白質の
製造コストを低下させることができる。
ミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe 、以下
Ｓ．ｐｏｍｂｅという）による異種蛋白質の生産を可能
とするマルチクローニングベクター、それに異種蛋白質
遺伝子を導入した発現ベクター、その発現ベクターの構
築方法、その発現ベクターを保持したＳ．ｐｏｍｂｅ形
質転換体、およびその形質転換体を用いた異種蛋白質の
製造法に関する。本発明により種々の異種蛋白質の遺伝
子の発現を効率化し、産生するペプチドまたは蛋白質の
製造コストを低下させることができる。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子組換え技術を用いた異種蛋白質の
生産は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli、以下
Ｅ．ｃｏｌｉという）、サッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）、あるいはバチルス（Ba
cillus）属等の微生物、動物細胞（昆虫細胞を含む）、
植物細胞を用いて盛んに行われてきた。様々な生物由来
のポリペプチドが対象と考えられ、既に多くのものが工
業的に生産され、医薬品等に用いられている。
生産は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli、以下
Ｅ．ｃｏｌｉという）、サッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）、あるいはバチルス（Ba
cillus）属等の微生物、動物細胞（昆虫細胞を含む）、
植物細胞を用いて盛んに行われてきた。様々な生物由来
のポリペプチドが対象と考えられ、既に多くのものが工
業的に生産され、医薬品等に用いられている。
【０００３】しかし、原核生物を用いる方法では必ずし
も全てのポリペプチドに対して有効ではなく、真核生物
由来の蛋白質の複雑な翻訳後修飾あるいは天然体と同じ
立体構造を再現することは必ずしも容易ではない。実
際、原核細胞にて生産された生産物の構造および活性が
不均一であるために医薬品等への利用が拒まれているも
のも知られている(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,3428-34
32(1989)) 。またＥ．ｃｏｌｉには特有のエンドトキシ
ンが存在し、最終製品の夾雑物になる可能性がある。
も全てのポリペプチドに対して有効ではなく、真核生物
由来の蛋白質の複雑な翻訳後修飾あるいは天然体と同じ
立体構造を再現することは必ずしも容易ではない。実
際、原核細胞にて生産された生産物の構造および活性が
不均一であるために医薬品等への利用が拒まれているも
のも知られている(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,3428-34
32(1989)) 。またＥ．ｃｏｌｉには特有のエンドトキシ
ンが存在し、最終製品の夾雑物になる可能性がある。
【０００４】動物細胞や植物細胞を用いる方法は扱いが
微生物より難しく、培養にコストがかかり、得られる細
胞濃度が低いために、生産効率が悪い。このため異種蛋
白質、特に真核生物由来のポリペプチドを生産するため
に最も理想的な生物は、微生物でありかつ真核生物であ
る酵母が最もよいとされている。酵母は、培養方法も確
立しており、真核生物の遺伝情報を発現させるという点
でも都合がよい。さらに、従来より醗酵並びに食品工業
で用いられており、人体に関する安全性も確立され、ま
たエンドトキシンも含まないという特徴も有する。
微生物より難しく、培養にコストがかかり、得られる細
胞濃度が低いために、生産効率が悪い。このため異種蛋
白質、特に真核生物由来のポリペプチドを生産するため
に最も理想的な生物は、微生物でありかつ真核生物であ
る酵母が最もよいとされている。酵母は、培養方法も確
立しており、真核生物の遺伝情報を発現させるという点
でも都合がよい。さらに、従来より醗酵並びに食品工業
で用いられており、人体に関する安全性も確立され、ま
たエンドトキシンも含まないという特徴も有する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】酵母類のなかでもＳ．
ｐｏｍｂｅはサッカロミセス・セレビシエよりも動物細
胞に近い性質を持つと考えられている。このため、異種
蛋白質を発現させる宿主としてＳ．ｐｏｍｂｅを用いる
ことによって、動物細胞の場合と同様の、より天然体に
近い遺伝子産物が得られることが期待される。培養方法
も酵母類で共通の点が多く、他の酵母で知られている知
見を容易に応用しうる。したがって、微生物学の方法と
組換えＤＮＡ技術を用いて、Ｓ．ｐｏｍｂｅを用いた異
種蛋白質生産法を用いることが有利であるのは明白であ
る。
ｐｏｍｂｅはサッカロミセス・セレビシエよりも動物細
胞に近い性質を持つと考えられている。このため、異種
蛋白質を発現させる宿主としてＳ．ｐｏｍｂｅを用いる
ことによって、動物細胞の場合と同様の、より天然体に
近い遺伝子産物が得られることが期待される。培養方法
も酵母類で共通の点が多く、他の酵母で知られている知
見を容易に応用しうる。したがって、微生物学の方法と
組換えＤＮＡ技術を用いて、Ｓ．ｐｏｍｂｅを用いた異
種蛋白質生産法を用いることが有利であるのは明白であ
る。
【０００６】ところが、Ｓ．ｐｏｍｂｅを用いた遺伝子
組換えに関する研究はＥ．ｃｏｌｉやサッカロミセス・
セレビシエに比べてかなり遅れており、特に遺伝子発現
に関する研究は少ない。たとえば、特開昭６１−１８１
３９７号公報、特開平２−２８３２８８号公報、および
特開平４−６３５９６号公報等があるにすぎない。この
原因は強力なプロモータを持ち、菌体内に安定に存在
し、かつ遺伝子を導入するのに最適かつ簡便な発現ベク
ターが存在しないためである。
組換えに関する研究はＥ．ｃｏｌｉやサッカロミセス・
セレビシエに比べてかなり遅れており、特に遺伝子発現
に関する研究は少ない。たとえば、特開昭６１−１８１
３９７号公報、特開平２−２８３２８８号公報、および
特開平４−６３５９６号公報等があるにすぎない。この
原因は強力なプロモータを持ち、菌体内に安定に存在
し、かつ遺伝子を導入するのに最適かつ簡便な発現ベク
ターが存在しないためである。
【０００７】本発明者らは、上記問題を解決しうる発現
ベクターを提案した（特開平５−１５３８０号公報参
照）。しかし、この発現ベクターを用いて異種蛋白質遺
伝子を過不足なく発現するにはいまだ必ずしも充分とい
えるものではなく、発現ベクターのさらなる改良が求め
られている。
ベクターを提案した（特開平５−１５３８０号公報参
照）。しかし、この発現ベクターを用いて異種蛋白質遺
伝子を過不足なく発現するにはいまだ必ずしも充分とい
えるものではなく、発現ベクターのさらなる改良が求め
られている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は以上の点に鑑
み検討を行った結果、異種蛋白質遺伝子の翻訳開始部位
を制限酵素認識部位に改変することによって、目的とす
る異種蛋白質遺伝子を過不足なく発現することが可能な
発現ベクターを構築するに至った。本発明は、Ｓ．ｐｏ
ｍｂｅによる異種蛋白質の生産を可能とするマルチクロ
ーニングベクター、それに異種蛋白質遺伝子を導入した
発現ベクター、その発現ベクターの構築方法、その発現
ベクターを保持したＳ．ｐｏｍｂｅ形質転換体、および
その形質転換体を用いた異種蛋白質の製造法に関する、
下記の発明である。
み検討を行った結果、異種蛋白質遺伝子の翻訳開始部位
を制限酵素認識部位に改変することによって、目的とす
る異種蛋白質遺伝子を過不足なく発現することが可能な
発現ベクターを構築するに至った。本発明は、Ｓ．ｐｏ
ｍｂｅによる異種蛋白質の生産を可能とするマルチクロ
ーニングベクター、それに異種蛋白質遺伝子を導入した
発現ベクター、その発現ベクターの構築方法、その発現
ベクターを保持したＳ．ｐｏｍｂｅ形質転換体、および
その形質転換体を用いた異種蛋白質の製造法に関する、
下記の発明である。
【０００９】（１）真核細胞内において機能しうるプロ
モーター領域を有し、かつそのプロモーターによって支
配される異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのマルチ
クローニングサイトをそのプロモーター領域の下流に有
するベクターであり、そのベクターのマルチクローニン
グサイト先端部分における異種蛋白質構造遺伝子を導入
するための制限酵素認識部位が、５’側から−ＡＣＡＴ
ＧＴ−なる配列を有する制限酵素認識部位であることを
特徴とするマルチクローニングベクター。
モーター領域を有し、かつそのプロモーターによって支
配される異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのマルチ
クローニングサイトをそのプロモーター領域の下流に有
するベクターであり、そのベクターのマルチクローニン
グサイト先端部分における異種蛋白質構造遺伝子を導入
するための制限酵素認識部位が、５’側から−ＡＣＡＴ
ＧＴ−なる配列を有する制限酵素認識部位であることを
特徴とするマルチクローニングベクター。
【００１０】（２）真核細胞内において機能しうるプロ
モーター領域、およびそのプロモーター領域下流にその
プロモーターによって支配された異種蛋白質構造遺伝子
を有し、異種蛋白質構造遺伝子先端部分が５’側から−
ＡＣＡＴＧＮ−（Ｎは任意の塩基）なる配列を有し、こ
の配列におけるＡＴＧが異種蛋白質構造遺伝子の翻訳開
始部位であり、しかもこの配列がベクターに異種蛋白質
構造遺伝子が導入された際の制限酵素認識部位に由来す
る配列であることを特徴とする発現ベクター。
モーター領域、およびそのプロモーター領域下流にその
プロモーターによって支配された異種蛋白質構造遺伝子
を有し、異種蛋白質構造遺伝子先端部分が５’側から−
ＡＣＡＴＧＮ−（Ｎは任意の塩基）なる配列を有し、こ
の配列におけるＡＴＧが異種蛋白質構造遺伝子の翻訳開
始部位であり、しかもこの配列がベクターに異種蛋白質
構造遺伝子が導入された際の制限酵素認識部位に由来す
る配列であることを特徴とする発現ベクター。
【００１１】（３）真核細胞内において機能しうるプロ
モーター領域を有するベクターのプロモーター領域下流
にそのプロモーターによって支配される異種蛋白質構造
遺伝子を導入する方法において、５’側から−ＡＣＡＴ
ＧＴ−なる配列を有する制限酵素認識部位で切断したベ
クター末端に５’側から−Ｎ’ＣＡＴＧＮ−（Ｎは任意
の塩基、Ｎ’はＮに相補的な塩基）なる配列を有する制
限酵素認識部位で切断した異種蛋白質構造遺伝子の先端
を連結して−ＡＣＡＴＧＮ−なる配列の連結部分を形成
し、その連結部分のＡＴＧを異種蛋白質構造遺伝子の翻
訳開始部位とし、しかもベクター側の制限酵素認識切断
部末端と異種蛋白質構造遺伝子側の制限酵素認識切断部
先端の組合せによりＡＴＧの次の塩基をＡ、Ｔ、Ｇ、お
よびＣから選ばれる任意の塩基とすることを特徴とする
真核細胞内で発現しうる発現ベクターの構築方法。
モーター領域を有するベクターのプロモーター領域下流
にそのプロモーターによって支配される異種蛋白質構造
遺伝子を導入する方法において、５’側から−ＡＣＡＴ
ＧＴ−なる配列を有する制限酵素認識部位で切断したベ
クター末端に５’側から−Ｎ’ＣＡＴＧＮ−（Ｎは任意
の塩基、Ｎ’はＮに相補的な塩基）なる配列を有する制
限酵素認識部位で切断した異種蛋白質構造遺伝子の先端
を連結して−ＡＣＡＴＧＮ−なる配列の連結部分を形成
し、その連結部分のＡＴＧを異種蛋白質構造遺伝子の翻
訳開始部位とし、しかもベクター側の制限酵素認識切断
部末端と異種蛋白質構造遺伝子側の制限酵素認識切断部
先端の組合せによりＡＴＧの次の塩基をＡ、Ｔ、Ｇ、お
よびＣから選ばれる任意の塩基とすることを特徴とする
真核細胞内で発現しうる発現ベクターの構築方法。
【００１２】（４）上記の発現ベクターまたはその発現
ベクターと複製開始点を有する酵母ベクターとの組換え
体を保持するシゾサッカロミセス・ポンベからなる形質
転換体。
ベクターと複製開始点を有する酵母ベクターとの組換え
体を保持するシゾサッカロミセス・ポンベからなる形質
転換体。
【００１３】（５）上記の形質転換体を培養し、培養物
中に異種蛋白質を生成蓄積させ、これを採取することを
特徴とする異種蛋白質の製造法。
中に異種蛋白質を生成蓄積させ、これを採取することを
特徴とする異種蛋白質の製造法。
【００１４】Ｓ．ｐｏｍｂｅにおいて機能しうるマルチ
クローニングベクターに異種蛋白質構造遺伝子を導入す
るにあたり、異種蛋白質構造遺伝子を含む遺伝子とマル
チクローニングベクターをそれぞれ制限酵素で処理して
切断し、両者を連結（ライゲーション）して発現ベクタ
ーを構築する。本発明では、このとき、異種蛋白質構造
遺伝子を含む遺伝子とマルチクローニングベクターの制
限酵素認識部位はそれぞれＡＴＧを含み、切断後異種蛋
白質構造遺伝子を含む遺伝子の先端（５’末端）とマル
チクローニングベクターの末端（３’末端）を連結し、
いずれかの末端部分に存在するＡＴＧを異種蛋白質構造
遺伝子の翻訳開始部位とする。たとえば、異種蛋白質構
造遺伝子を含む遺伝子の先端がＡＴＧを含む場合、それ
に対応するマルチクローニングベクターの末端のアンチ
コード鎖部分にはＴＡＣを含む。逆に、マルチクローニ
ングベクターの末端がＡＴＧを含む場合、それに対応す
る異種蛋白質構造遺伝子を含む遺伝子の先端のアンチコ
ード鎖部分にはＴＡＣを含む。
クローニングベクターに異種蛋白質構造遺伝子を導入す
るにあたり、異種蛋白質構造遺伝子を含む遺伝子とマル
チクローニングベクターをそれぞれ制限酵素で処理して
切断し、両者を連結（ライゲーション）して発現ベクタ
ーを構築する。本発明では、このとき、異種蛋白質構造
遺伝子を含む遺伝子とマルチクローニングベクターの制
限酵素認識部位はそれぞれＡＴＧを含み、切断後異種蛋
白質構造遺伝子を含む遺伝子の先端（５’末端）とマル
チクローニングベクターの末端（３’末端）を連結し、
いずれかの末端部分に存在するＡＴＧを異種蛋白質構造
遺伝子の翻訳開始部位とする。たとえば、異種蛋白質構
造遺伝子を含む遺伝子の先端がＡＴＧを含む場合、それ
に対応するマルチクローニングベクターの末端のアンチ
コード鎖部分にはＴＡＣを含む。逆に、マルチクローニ
ングベクターの末端がＡＴＧを含む場合、それに対応す
る異種蛋白質構造遺伝子を含む遺伝子の先端のアンチコ
ード鎖部分にはＴＡＣを含む。
【００１５】種々の異種蛋白質構造遺伝子の導入を可能
とするためには、上記ＡＴＧの次の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、
Ｃのいずれであっても上記構築手段が適用できることが
好ましい。このため、マルチクローニングベクター側の
制限酵素認識切断部と異種蛋白質構造遺伝子側の制限酵
素認識切断部との組合せを選択して、ＡＴＧの次の塩基
をＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの任意のものとする手段の採用が好ま
しい。このような手段が適用できる、種々の異種蛋白質
構造遺伝子の導入が可能なマルチクローニングベクター
は、異種蛋白質構造遺伝子導入部位であるマルチクロー
ニングサイトを有する。
とするためには、上記ＡＴＧの次の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、
Ｃのいずれであっても上記構築手段が適用できることが
好ましい。このため、マルチクローニングベクター側の
制限酵素認識切断部と異種蛋白質構造遺伝子側の制限酵
素認識切断部との組合せを選択して、ＡＴＧの次の塩基
をＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの任意のものとする手段の採用が好ま
しい。このような手段が適用できる、種々の異種蛋白質
構造遺伝子の導入が可能なマルチクローニングベクター
は、異種蛋白質構造遺伝子導入部位であるマルチクロー
ニングサイトを有する。
【００１６】本発明におけるマルチクローニングベクタ
ーの異種蛋白質構造遺伝子導入部位となる制限酵素認識
部位は、５’側から−ＡＣＡＴＧＴ−なる制限酵素認識
部位である。この制限酵素認識部位を５’側から−Ａあ
るいは−ＡＣＡＴＧなる末端を形成する制限酵素で切断
し、その末端に対応する先端を有する異種蛋白質構造遺
伝子を連結する。このための制限酵素としては、Ａｆｌ
ＩＩＩまたはＮｓｐＩが用いられる。また、ベクター
側の連結部位に−ＡＣＡＴＧＴ−なる配列を形成するに
は、これ以外の種々の連結部位を有するベクターの改変
により（たとえばＰＣＲ法を用いて）行うことができ
る。
ーの異種蛋白質構造遺伝子導入部位となる制限酵素認識
部位は、５’側から−ＡＣＡＴＧＴ−なる制限酵素認識
部位である。この制限酵素認識部位を５’側から−Ａあ
るいは−ＡＣＡＴＧなる末端を形成する制限酵素で切断
し、その末端に対応する先端を有する異種蛋白質構造遺
伝子を連結する。このための制限酵素としては、Ａｆｌ
ＩＩＩまたはＮｓｐＩが用いられる。また、ベクター
側の連結部位に−ＡＣＡＴＧＴ−なる配列を形成するに
は、これ以外の種々の連結部位を有するベクターの改変
により（たとえばＰＣＲ法を用いて）行うことができ
る。
【００１７】ベクター側末端に対応する先端を有する異
種蛋白質構造遺伝子は、異種蛋白質構造遺伝子を含む遺
伝子より制限酵素で切り出されたもので、その制限酵素
は−Ａあるいは−ＡＣＡＴＧなるベクター側末端に対応
する先端を形成しうる制限酵素である。異種蛋白質構造
遺伝子を切断する制限酵素は、−Ｎ’ＣＡＴＧＮ−（Ｎ
は任意の塩基、Ｎ’はＮに相補的な塩基）なる制限酵素
認識部位を認識し、ＣＡＴＧＮ−あるいはＮ−なる先端
を形成する制限酵素である。このための制限酵素として
は、Ｎｃｏ Ｉ、Ｂｓｐ ＨＩ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ｎｓ
ｐ Ｉ、またはＳｐｈ Ｉが用いられる。この制限酵素
認識部位が異種蛋白質構造遺伝子の先端部分に存在しな
い場合は、たとえば部位特異的変異導入法やＰＣＲ法を
用いて異種蛋白質構造遺伝子の先端部分にこの制限酵素
認識部位を配置することができる。
種蛋白質構造遺伝子は、異種蛋白質構造遺伝子を含む遺
伝子より制限酵素で切り出されたもので、その制限酵素
は−Ａあるいは−ＡＣＡＴＧなるベクター側末端に対応
する先端を形成しうる制限酵素である。異種蛋白質構造
遺伝子を切断する制限酵素は、−Ｎ’ＣＡＴＧＮ−（Ｎ
は任意の塩基、Ｎ’はＮに相補的な塩基）なる制限酵素
認識部位を認識し、ＣＡＴＧＮ−あるいはＮ−なる先端
を形成する制限酵素である。このための制限酵素として
は、Ｎｃｏ Ｉ、Ｂｓｐ ＨＩ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ｎｓ
ｐ Ｉ、またはＳｐｈ Ｉが用いられる。この制限酵素
認識部位が異種蛋白質構造遺伝子の先端部分に存在しな
い場合は、たとえば部位特異的変異導入法やＰＣＲ法を
用いて異種蛋白質構造遺伝子の先端部分にこの制限酵素
認識部位を配置することができる。
【００１８】上記ベクター側末端−Ａと異種蛋白質構造
遺伝子側先端ＣＡＴＧＮ−の組合せ、または、上記ベク
ター側末端−ＡＣＡＴＧと異種蛋白質構造遺伝子側先端
Ｎ−の組合せ、を連結することにより、−ＡＣＡＴＧＮ
−なる連結部が形成される。その配列の内のＡＴＧが異
種蛋白質構造遺伝子の翻訳開始部位となる。しかもＡＴ
Ｇの次のＮは、上記したような制限酵素の組合せにより
任意のものとすることができ、これにより使用し得る異
種蛋白質構造遺伝子の制約が全くなくなる。このための
制限酵素の組合せとしては特に下記の組合せが好まし
い。
遺伝子側先端ＣＡＴＧＮ−の組合せ、または、上記ベク
ター側末端−ＡＣＡＴＧと異種蛋白質構造遺伝子側先端
Ｎ−の組合せ、を連結することにより、−ＡＣＡＴＧＮ
−なる連結部が形成される。その配列の内のＡＴＧが異
種蛋白質構造遺伝子の翻訳開始部位となる。しかもＡＴ
Ｇの次のＮは、上記したような制限酵素の組合せにより
任意のものとすることができ、これにより使用し得る異
種蛋白質構造遺伝子の制約が全くなくなる。このための
制限酵素の組合せとしては特に下記の組合せが好まし
い。
【００１９】ベクターを切断する制限酵素としてＡｆｌ
ＩＩＩまたはＮｓｐ Ｉを用い、異種蛋白質構造遺伝
子を含む遺伝子を切断する制限酵素としてＮｃｏ Ｉ、
Ｂｓｐ ＨＩ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ｎｓｐ Ｉ、またはＳ
ｐｈ Ｉを用い、これらを組合せてＡＴＧの次の塩基を
Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの任意のものとする手段の例を表１に示
す。これらの制限酵素はいずれも６塩基パリンドローム
配列を認識し、この認識部位のセンス鎖の５’端から１
番目と２番目の塩基の間または５番目と６番目の塩基の
間、および、アンチコード鎖の３’端から１番目と２番
目の塩基の間または５番目と６番目の塩基の間で切断す
る制限酵素の１種である。この場合、表１の連結後の構
造に示すように、連結部６塩基の配列は５’−ＡＣＡＴ
ＧＮ−３’からなり、組合せを選択することによりその
翻訳開始コドンＡＴＧの次のＮをＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの任意
の塩基とすることができる。なお、表１中においてもＮ
はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかを表す（ただし、表中のア
ンチコード鎖のＮはコード鎖のＮに対応するものを表す
ものとする）。
ＩＩＩまたはＮｓｐ Ｉを用い、異種蛋白質構造遺伝
子を含む遺伝子を切断する制限酵素としてＮｃｏ Ｉ、
Ｂｓｐ ＨＩ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ｎｓｐ Ｉ、またはＳ
ｐｈ Ｉを用い、これらを組合せてＡＴＧの次の塩基を
Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの任意のものとする手段の例を表１に示
す。これらの制限酵素はいずれも６塩基パリンドローム
配列を認識し、この認識部位のセンス鎖の５’端から１
番目と２番目の塩基の間または５番目と６番目の塩基の
間、および、アンチコード鎖の３’端から１番目と２番
目の塩基の間または５番目と６番目の塩基の間で切断す
る制限酵素の１種である。この場合、表１の連結後の構
造に示すように、連結部６塩基の配列は５’−ＡＣＡＴ
ＧＮ−３’からなり、組合せを選択することによりその
翻訳開始コドンＡＴＧの次のＮをＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの任意
の塩基とすることができる。なお、表１中においてもＮ
はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかを表す（ただし、表中のア
ンチコード鎖のＮはコード鎖のＮに対応するものを表す
ものとする）。
【００２０】
【表１】
【００２１】本発明のマルチクローニングベクターおよ
び発現ベクターは、導入される（あるいは導入された）
異種蛋白質構造遺伝子の発現を制御するプロモーター領
域を含む。このプロモーターはその下流に導入された前
記異種蛋白質構造遺伝子の発現を支配する。このプロモ
ーターは真核細胞内において機能しうるものであり、具
体的にはＳ．ｐｏｍｂｅ細胞内において機能しうる必要
がある。
び発現ベクターは、導入される（あるいは導入された）
異種蛋白質構造遺伝子の発現を制御するプロモーター領
域を含む。このプロモーターはその下流に導入された前
記異種蛋白質構造遺伝子の発現を支配する。このプロモ
ーターは真核細胞内において機能しうるものであり、具
体的にはＳ．ｐｏｍｂｅ細胞内において機能しうる必要
がある。
【００２２】上記プロモーターはＳ．ｐｏｍｂｅ内で機
能できるものであり、かつ導入された異種蛋白質構造遺
伝子の転写を促進するものである。このプロモーターと
しては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子
プロモーター、ヒトサイトメガロウィルス遺伝子プロモ
ーター、ヒトコリオニックゴナドロピンα遺伝子プロモ
ーター等がある。特に動物細胞ウィルス由来のプロモー
ターなどの転写を強力に促進するもの（R.Toyama et a
l.,FEBS Lett,268,217-221(1990) ）であることが好ま
しい。このような好ましいプロモーターとしては、動物
細胞ウィルス由来のプロモーター、特にヒトサイトメガ
ロウィルス遺伝子のプロモーターがある。
能できるものであり、かつ導入された異種蛋白質構造遺
伝子の転写を促進するものである。このプロモーターと
しては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子
プロモーター、ヒトサイトメガロウィルス遺伝子プロモ
ーター、ヒトコリオニックゴナドロピンα遺伝子プロモ
ーター等がある。特に動物細胞ウィルス由来のプロモー
ターなどの転写を強力に促進するもの（R.Toyama et a
l.,FEBS Lett,268,217-221(1990) ）であることが好ま
しい。このような好ましいプロモーターとしては、動物
細胞ウィルス由来のプロモーター、特にヒトサイトメガ
ロウィルス遺伝子のプロモーターがある。
【００２３】本発明のベクターは、さらに必要により、
抗生物質耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子、異種蛋白質
を細胞外に分泌させるためのシグナルペプチドコード遺
伝子、その他の種々の遺伝子を有していてもよい。ま
た、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞内で機能しうるプロモ
ーターや薬剤耐性遺伝子等を組み込んでシャトルベクタ
ーとすることもできる。
抗生物質耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子、異種蛋白質
を細胞外に分泌させるためのシグナルペプチドコード遺
伝子、その他の種々の遺伝子を有していてもよい。ま
た、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞内で機能しうるプロモ
ーターや薬剤耐性遺伝子等を組み込んでシャトルベクタ
ーとすることもできる。
【００２４】発現ベクターが細胞内で発現するためには
複製開始点を有することが必要である。しかし、上記本
発明のマルチクローニングベクターや発現ベクターは必
ずしも複製開始点を有している必要はない。複製開始点
は発現ベクター構築後に導入することができる。また、
複製開始点を有しない発現ベクターを細胞内に入れ込ん
だ後細胞内でその発現ベクターに自動的に複製開始点を
導入できる。これらの複製開始点導入手段は公知であ
る。たとえば酵母内で機能し得る複製開始点を有するベ
クター（以下酵母ベクターという）を本発明の発現ベク
ターに組み込むことができる（特開平５−１５３８０号
公報参照）。また、本発明の発現ベクターと酵母ベクタ
ーを１つの細胞内に入れ込み、細胞内で自動的に両者を
融合させることができる。このような複製開始点導入手
段を採用できることより、本発明の発現ベクターは複製
開始点を有していてもよく、有していなくてもよい。同
様に本発明のマルチクローニングベクターも複製開始点
を有していてもよく、有していなくてもよい。ただし、
いかなる場合でも細胞内で発現ベクターの発現が起こる
ためには、最終的にはベクターに複製開始点が必要であ
る。
複製開始点を有することが必要である。しかし、上記本
発明のマルチクローニングベクターや発現ベクターは必
ずしも複製開始点を有している必要はない。複製開始点
は発現ベクター構築後に導入することができる。また、
複製開始点を有しない発現ベクターを細胞内に入れ込ん
だ後細胞内でその発現ベクターに自動的に複製開始点を
導入できる。これらの複製開始点導入手段は公知であ
る。たとえば酵母内で機能し得る複製開始点を有するベ
クター（以下酵母ベクターという）を本発明の発現ベク
ターに組み込むことができる（特開平５−１５３８０号
公報参照）。また、本発明の発現ベクターと酵母ベクタ
ーを１つの細胞内に入れ込み、細胞内で自動的に両者を
融合させることができる。このような複製開始点導入手
段を採用できることより、本発明の発現ベクターは複製
開始点を有していてもよく、有していなくてもよい。同
様に本発明のマルチクローニングベクターも複製開始点
を有していてもよく、有していなくてもよい。ただし、
いかなる場合でも細胞内で発現ベクターの発現が起こる
ためには、最終的にはベクターに複製開始点が必要であ
る。
【００２５】ベクターに抗生物質耐性遺伝子などの薬剤
耐性遺伝子を組み込むことはクローニングのためやマー
カーとして用いるために通常必須である。本発明のベク
ターにおいても抗生物質耐性遺伝子とその転写を促進す
るプロモーター（以下第２のプロモーターという）を有
していることが好ましい。この第２のプロモーターは、
前記異種蛋白質構造遺伝子の転写を促進するプロモータ
ーに比較してそれよりも転写促進活性の低いものである
ことが好ましい。しかもこの第２のプロモーターとして
は、動物細胞ウィルス由来のプロモーター、特にＳＶ４
０初期プロモーターが好ましい。この第２のプロモータ
ーに支配される抗生物質耐性遺伝子としては、通常のも
のであってよいが、特に本発明においてはネオマイシン
耐性遺伝子が好ましい。
耐性遺伝子を組み込むことはクローニングのためやマー
カーとして用いるために通常必須である。本発明のベク
ターにおいても抗生物質耐性遺伝子とその転写を促進す
るプロモーター（以下第２のプロモーターという）を有
していることが好ましい。この第２のプロモーターは、
前記異種蛋白質構造遺伝子の転写を促進するプロモータ
ーに比較してそれよりも転写促進活性の低いものである
ことが好ましい。しかもこの第２のプロモーターとして
は、動物細胞ウィルス由来のプロモーター、特にＳＶ４
０初期プロモーターが好ましい。この第２のプロモータ
ーに支配される抗生物質耐性遺伝子としては、通常のも
のであってよいが、特に本発明においてはネオマイシン
耐性遺伝子が好ましい。
【００２６】本発明においては、抗生物質耐性遺伝子を
有する発現ベクターを使用することによって異種蛋白質
発現量を増大させることが可能となる。このためには第
２のプロモーターは前記異種蛋白質構造遺伝子を支配す
るプロモーターよりも転写促進活性が低い必要がある。
たとえば上記のようなＳＶ４０初期プロモーターとそれ
によって支配されるネオマイシン耐性遺伝子とを有する
発現ベクターを保持するＳ．ｐｏｍｂｅを培養する場合
を例にとって説明する。このＳ．ｐｏｍｂｅ形質転換体
をＧ４１８（ネオマイシン）含有培地で培養すると、培
地中のＧ４１８濃度に依存して菌体内で発現ベクターの
コピー数が増す。したがって、Ｇ４１８濃度を高くする
ことにより菌体内で発現ベクターのコピー数を多くする
ことができ、その結果異種蛋白質発現量を増大させるこ
とができる。この際、第２のプロモーターの活性が異種
蛋白質構造遺伝子を支配するプロモーターよりも高活性
であると、発現ベクターのコピー数が少なくても充分な
ネオマイシン耐性蛋白質（酵素）が生産されるために発
現ベクターのコピー数を増やす必要がなくなり、目的と
する異種蛋白質発現量を増大させることができない。
有する発現ベクターを使用することによって異種蛋白質
発現量を増大させることが可能となる。このためには第
２のプロモーターは前記異種蛋白質構造遺伝子を支配す
るプロモーターよりも転写促進活性が低い必要がある。
たとえば上記のようなＳＶ４０初期プロモーターとそれ
によって支配されるネオマイシン耐性遺伝子とを有する
発現ベクターを保持するＳ．ｐｏｍｂｅを培養する場合
を例にとって説明する。このＳ．ｐｏｍｂｅ形質転換体
をＧ４１８（ネオマイシン）含有培地で培養すると、培
地中のＧ４１８濃度に依存して菌体内で発現ベクターの
コピー数が増す。したがって、Ｇ４１８濃度を高くする
ことにより菌体内で発現ベクターのコピー数を多くする
ことができ、その結果異種蛋白質発現量を増大させるこ
とができる。この際、第２のプロモーターの活性が異種
蛋白質構造遺伝子を支配するプロモーターよりも高活性
であると、発現ベクターのコピー数が少なくても充分な
ネオマイシン耐性蛋白質（酵素）が生産されるために発
現ベクターのコピー数を増やす必要がなくなり、目的と
する異種蛋白質発現量を増大させることができない。
【００２７】図４に本発明のマルチクローニングベクタ
ーの例として実施例で作成したｐＴＬ２Ｍの制限酵素切
断地図を示す。このｐＴＬ２Ｍは大略５，０００ｂｐ
（より正確には約５，０００±２００ｂｐ）の大きさ
で、ヒトサイトメガロウィルス遺伝子（ｈＣＭＶ）のプ
ロモーター領域、プロモーター領域とマルチクローニン
グサイト（ＭＣＳ）を連結する非翻訳領域（５’−ＵＴ
Ｒ）、および異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのＭ
ＣＳを時計回り方向にこの順に有する。ＭＣＳ先端に前
記した特定の制限酵素認識部位が存在する。一方さら
に、上記ｈＣＭＶプロモーター領域先端付近から反時計
方向回りに、ＳＶ４０プロモーター領域、およびネオマ
イシン耐性遺伝子（ＮｍR ）をこの順に有する。また、
さらにＮｍR の下流域に前記したように、Ｅ．ｃｏｌｉ
などの原核細胞内で機能しうる薬剤耐性遺伝子であるア
ンピシリン耐性遺伝子（ＡｐR ）を有し、また図示され
ているようにＳＶ４０ターミネーター（２か所）、原核
細胞内で機能する複製開始点（Ｏｒｉ）、および下流側
非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）を有する。
ーの例として実施例で作成したｐＴＬ２Ｍの制限酵素切
断地図を示す。このｐＴＬ２Ｍは大略５，０００ｂｐ
（より正確には約５，０００±２００ｂｐ）の大きさ
で、ヒトサイトメガロウィルス遺伝子（ｈＣＭＶ）のプ
ロモーター領域、プロモーター領域とマルチクローニン
グサイト（ＭＣＳ）を連結する非翻訳領域（５’−ＵＴ
Ｒ）、および異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのＭ
ＣＳを時計回り方向にこの順に有する。ＭＣＳ先端に前
記した特定の制限酵素認識部位が存在する。一方さら
に、上記ｈＣＭＶプロモーター領域先端付近から反時計
方向回りに、ＳＶ４０プロモーター領域、およびネオマ
イシン耐性遺伝子（ＮｍR ）をこの順に有する。また、
さらにＮｍR の下流域に前記したように、Ｅ．ｃｏｌｉ
などの原核細胞内で機能しうる薬剤耐性遺伝子であるア
ンピシリン耐性遺伝子（ＡｐR ）を有し、また図示され
ているようにＳＶ４０ターミネーター（２か所）、原核
細胞内で機能する複製開始点（Ｏｒｉ）、および下流側
非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）を有する。
【００２８】上記非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）は、プロ
モーター領域の末端（通常ＴＡＴＡなる配列）と翻訳開
始コドンＡＴＧの間に存在する配列である。この非翻訳
領域の長さが翻訳活性に影響することが少なくない。本
発明におけるベクターのこの部分の長さは２０〜２００
ｂｐであることが好ましい。より好ましくは３０〜１０
０ｂｐである。図示したｐＴＬ２Ｍでは約５６ｂｐであ
る。
モーター領域の末端（通常ＴＡＴＡなる配列）と翻訳開
始コドンＡＴＧの間に存在する配列である。この非翻訳
領域の長さが翻訳活性に影響することが少なくない。本
発明におけるベクターのこの部分の長さは２０〜２００
ｂｐであることが好ましい。より好ましくは３０〜１０
０ｂｐである。図示したｐＴＬ２Ｍでは約５６ｂｐであ
る。
【００２９】図示したｐＴＬ２Ｍ自体は真核細胞内で機
能し得る複製開始点を有していない。このｐＴＬ２Ｍを
使用するにあたっては真核細胞内で機能し得る複製開始
点を導入する必要がある。真核細胞内で機能し得る複製
開始点を有する配列やその配列を有するベクターは公知
であり、これを用いてｐＴＬ２Ｍに複製開始点を導入す
ることができる。Ｓ．ｐｏｍｂｅ細胞内で機能し得る複
製開始点を有す公知のベクターとしては、たとえばｐＡ
Ｕ５やｐＡＬ７がある（K.Okazaki et.al.,Nucleic Aci
ds Res.,18,6485-6489(1990)、K.Okayama et.al.,Molec
ular CellularBiol.,3,280-289(1983) ）。これら酵母
ベクターは自動複製配列（ａｒｓ）と安定化配列（ｓｔ
ｂ）を有し、さらに選択マーカーや抗生物質耐性遺伝子
を有する。この酵母ベクターをｐＴＬ２Ｍに組み込むこ
とにより、Ｓ．ｐｏｍｂｅ細胞内で複製し得るマルチク
ローニングベクターが得られる。同様に、マルチクロー
ニングベクターに異種蛋白質構造遺伝子を導入した発現
ベクターにこの酵母ベクターを組み込むことにより、
Ｓ．ｐｏｍｂｅ細胞内で複製し得る発現ベクターが得ら
れる。この酵母ベクターを組み込んで発現ベクターを構
築する方法については、上記文献のほか、本発明者らの
発明にかかわる特開平５−１５３８０号公報に記載され
ている。
能し得る複製開始点を有していない。このｐＴＬ２Ｍを
使用するにあたっては真核細胞内で機能し得る複製開始
点を導入する必要がある。真核細胞内で機能し得る複製
開始点を有する配列やその配列を有するベクターは公知
であり、これを用いてｐＴＬ２Ｍに複製開始点を導入す
ることができる。Ｓ．ｐｏｍｂｅ細胞内で機能し得る複
製開始点を有す公知のベクターとしては、たとえばｐＡ
Ｕ５やｐＡＬ７がある（K.Okazaki et.al.,Nucleic Aci
ds Res.,18,6485-6489(1990)、K.Okayama et.al.,Molec
ular CellularBiol.,3,280-289(1983) ）。これら酵母
ベクターは自動複製配列（ａｒｓ）と安定化配列（ｓｔ
ｂ）を有し、さらに選択マーカーや抗生物質耐性遺伝子
を有する。この酵母ベクターをｐＴＬ２Ｍに組み込むこ
とにより、Ｓ．ｐｏｍｂｅ細胞内で複製し得るマルチク
ローニングベクターが得られる。同様に、マルチクロー
ニングベクターに異種蛋白質構造遺伝子を導入した発現
ベクターにこの酵母ベクターを組み込むことにより、
Ｓ．ｐｏｍｂｅ細胞内で複製し得る発現ベクターが得ら
れる。この酵母ベクターを組み込んで発現ベクターを構
築する方法については、上記文献のほか、本発明者らの
発明にかかわる特開平５−１５３８０号公報に記載され
ている。
【００３０】一般に、大きなベクターを細胞に入れ込む
ことは困難なことが少なくない。上記ｐＴＬ２Ｍ自体比
較的大きなベクターであり、これに上記酵母ベクターを
組み込んで酵母細胞に入れ込むことは比較的困難であ
る。これを解決する手段としては上記酵母ベクター（通
常は制限酵素で切断した線状のＤＮＡを用いる）と本発
明のマルチクローニングベクターないし発現ベクターと
を別々に同一の細胞に入れ込む方法がある。この場合、
酵母ベクターは細胞内で自動的にマルチクローニングベ
クターないし発現ベクターに組み込まれ、上記したよう
な複製開始点を有するベクターが自動的に構築される。
後述実施例ではこの方法を用いてＳ．ｐｏｍｂｅの形質
転換を行った。
ことは困難なことが少なくない。上記ｐＴＬ２Ｍ自体比
較的大きなベクターであり、これに上記酵母ベクターを
組み込んで酵母細胞に入れ込むことは比較的困難であ
る。これを解決する手段としては上記酵母ベクター（通
常は制限酵素で切断した線状のＤＮＡを用いる）と本発
明のマルチクローニングベクターないし発現ベクターと
を別々に同一の細胞に入れ込む方法がある。この場合、
酵母ベクターは細胞内で自動的にマルチクローニングベ
クターないし発現ベクターに組み込まれ、上記したよう
な複製開始点を有するベクターが自動的に構築される。
後述実施例ではこの方法を用いてＳ．ｐｏｍｂｅの形質
転換を行った。
【００３１】マルチクローニングベクターおよび発現ベ
クターを構築するための一般的手法は公知であり、たと
えば文献「J.Sambrook et al., "Molecular Cloning 2n
d ed.", Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)
」に記載されている。本発明のマルチクローニングベ
クターおよび発現ベクターはこの一般的手法を用い前記
した方法で構築することができる。発現ベクターの宿主
として本発明で用いるＳ．ｐｏｍｂｅの菌株としては、
たとえばＡＴＣＣ ３８３９９（ｌｅｕ１−３２ｈ−）
またはＡＴＣＣ ３８４３６（ｕｒａ４−２９４ｈ−等
が挙げられ、これらは、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション(American Type CultureCollection)
から入手可能である。
クターを構築するための一般的手法は公知であり、たと
えば文献「J.Sambrook et al., "Molecular Cloning 2n
d ed.", Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)
」に記載されている。本発明のマルチクローニングベ
クターおよび発現ベクターはこの一般的手法を用い前記
した方法で構築することができる。発現ベクターの宿主
として本発明で用いるＳ．ｐｏｍｂｅの菌株としては、
たとえばＡＴＣＣ ３８３９９（ｌｅｕ１−３２ｈ−）
またはＡＴＣＣ ３８４３６（ｕｒａ４−２９４ｈ−等
が挙げられ、これらは、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション(American Type CultureCollection)
から入手可能である。
【００３２】発現ベクターを用いてＳ．ｐｏｍｂｅを形
質転換する方法は公知であり、たとえば酢酸リチウム法
（K.Okazaki et al.,Nucleic Acids Res.,18,6485-6489
(1990)) 等によって、Ｓ．ｐｏｍｂｅの形質転換体が得
られる。形質転換体を培養するための培地は公知であ
り、ＹＰＤ培地等の栄養培地（M.D.Rose et al.,"Metho
ds In Yeast Genetics",Cold Spring Harbor Laborator
y Press(1990))あるいはＭＢ培地等の最少培地（K.Okaz
aki et al.,Nucleic Acids Res.,18,6485-6489(1990))
等を用いることができる。形質転換体の培養は、通常１
６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で、８〜１６８時
間、好ましくは４８〜９６時間行う。振盪培養と静置培
養のいずれも可能であるが、必要に応じて撹拌や通気を
加えてもよい。
質転換する方法は公知であり、たとえば酢酸リチウム法
（K.Okazaki et al.,Nucleic Acids Res.,18,6485-6489
(1990)) 等によって、Ｓ．ｐｏｍｂｅの形質転換体が得
られる。形質転換体を培養するための培地は公知であ
り、ＹＰＤ培地等の栄養培地（M.D.Rose et al.,"Metho
ds In Yeast Genetics",Cold Spring Harbor Laborator
y Press(1990))あるいはＭＢ培地等の最少培地（K.Okaz
aki et al.,Nucleic Acids Res.,18,6485-6489(1990))
等を用いることができる。形質転換体の培養は、通常１
６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で、８〜１６８時
間、好ましくは４８〜９６時間行う。振盪培養と静置培
養のいずれも可能であるが、必要に応じて撹拌や通気を
加えてもよい。
【００３３】培養物中に産生した蛋白質の単離・精製法
としては、公知の、塩析または溶媒沈澱法等の溶解度の
差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電気泳動
法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマト
グラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方
法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を
利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用
する方法等が挙げられる。
としては、公知の、塩析または溶媒沈澱法等の溶解度の
差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電気泳動
法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマト
グラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方
法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を
利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用
する方法等が挙げられる。
【００３４】単離・精製した蛋白質の確認方法として
は、公知の、ウエスタンブロッティング法または活性測
定法等が挙げられる。また精製された蛋白質は、アミノ
酸分析、アミノ末端分析、一次構造解析などによりその
構造を明らかにすることができる。
は、公知の、ウエスタンブロッティング法または活性測
定法等が挙げられる。また精製された蛋白質は、アミノ
酸分析、アミノ末端分析、一次構造解析などによりその
構造を明らかにすることができる。
【００３５】
【実施例】以下実施例によって、本発明をより具体的に
説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその
技術範囲が限定されるものではない。
説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその
技術範囲が限定されるものではない。
【００３６】なお、以下において、実施例１は本発明ベ
クター構築の元となるベクターｐＲＬ２Ｍの作製を示
し、実施例２はそのｐＲＬ２Ｍを使用した異種蛋白質構
造遺伝子導入前のベクターｐＴＬ２Ｍの作製を示す。こ
のベクターｐＴＬ２Ｍは本発明のマルチクローニングベ
クターであり、以下の実施例はこのベクターｐＴＬ２Ｍ
に種々の異種蛋白質構造遺伝子を導入してその発現を試
験した例である。また、実施例３はこのベクターｐＴＬ
２Ｍを含むＳ．ｐｏｍｂｅ形質転換体の製造を示し、実
施例４はこの形質転換体細胞抽出液の調製（コントロー
ル用）を示す。実施例５では特にヒトリポコルチンＩの
生産について種々の試験を行った例を示す。
クター構築の元となるベクターｐＲＬ２Ｍの作製を示
し、実施例２はそのｐＲＬ２Ｍを使用した異種蛋白質構
造遺伝子導入前のベクターｐＴＬ２Ｍの作製を示す。こ
のベクターｐＴＬ２Ｍは本発明のマルチクローニングベ
クターであり、以下の実施例はこのベクターｐＴＬ２Ｍ
に種々の異種蛋白質構造遺伝子を導入してその発現を試
験した例である。また、実施例３はこのベクターｐＴＬ
２Ｍを含むＳ．ｐｏｍｂｅ形質転換体の製造を示し、実
施例４はこの形質転換体細胞抽出液の調製（コントロー
ル用）を示す。実施例５では特にヒトリポコルチンＩの
生産について種々の試験を行った例を示す。
【００３７】［実施例１］ ［ベクターｐＲＬ２Ｍの作製］公知の方法で調製したプ
ラスミドｐｃＤ４Ｂ（特開平５−１５３８０号公報参
照）を制限酵素Ｓａｃ Ｉで消化後、末端をＴ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼで平滑化し、さらに制限酵素Ｂａｍ Ｈ
Ｉで消化した後、フェノール抽出およびエタノール沈殿
によって核酸分画を回収した。さらにアガロースゲル電
気泳動後、ガラスビーズ法（旭硝子（株）製「ＤＮＡ
ＰＲＥＰ」（商品名）使用、以下同様）によって約４５
００塩基対に相当するＤＮＡを精製した。
ラスミドｐｃＤ４Ｂ（特開平５−１５３８０号公報参
照）を制限酵素Ｓａｃ Ｉで消化後、末端をＴ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼで平滑化し、さらに制限酵素Ｂａｍ Ｈ
Ｉで消化した後、フェノール抽出およびエタノール沈殿
によって核酸分画を回収した。さらにアガロースゲル電
気泳動後、ガラスビーズ法（旭硝子（株）製「ＤＮＡ
ＰＲＥＰ」（商品名）使用、以下同様）によって約４５
００塩基対に相当するＤＮＡを精製した。
【００３８】別に、やはり公知の方法で調製した、ヒト
リポコルチンＩ遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むベクターｐｃ
Ｄ４ｌｉｐｏＩ（特開平５−１５３８０号公報参照）を
制限酵素Ｘｍｎ ＩおよびＢａｍ ＨＩで消化した後、
フェノール抽出およびエタノール沈澱によって核酸分画
を回収した。さらにアガロースゲル電気泳動後、ガラス
ビーズ法によって約１３００塩基対に相当するＤＮＡを
精製した。
リポコルチンＩ遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むベクターｐｃ
Ｄ４ｌｉｐｏＩ（特開平５−１５３８０号公報参照）を
制限酵素Ｘｍｎ ＩおよびＢａｍ ＨＩで消化した後、
フェノール抽出およびエタノール沈澱によって核酸分画
を回収した。さらにアガロースゲル電気泳動後、ガラス
ビーズ法によって約１３００塩基対に相当するＤＮＡを
精製した。
【００３９】両ＤＮＡを、ライゲーションキット（宝酒
造（株）販売）でライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５
（東洋紡（株）販売）を形質転換した。得られた形質転
換体よりベクターを調製し、目的とするベクターｐＲＬ
２Ｌ（図１）を持った形質転換体をスクリーニングし
た。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から
目的のベクターであることを確認した。
造（株）販売）でライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５
（東洋紡（株）販売）を形質転換した。得られた形質転
換体よりベクターを調製し、目的とするベクターｐＲＬ
２Ｌ（図１）を持った形質転換体をスクリーニングし
た。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から
目的のベクターであることを確認した。
【００４０】このリポコルチンＩ発現ベクターｐＲＬ２
Ｌを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消
化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロー
スゲル電気泳動により約５０００塩基対に相当するバン
ドを切り出し、ガラスビーズ法で精製した。別に、公知
のプラスミドｐＵＣ１９を制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよび
Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化し、フェノール抽出、エタノー
ル沈澱の後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動より約６
０塩基対に相当するバンドを切り出し、ゲルから抽出精
製した。
Ｌを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消
化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロー
スゲル電気泳動により約５０００塩基対に相当するバン
ドを切り出し、ガラスビーズ法で精製した。別に、公知
のプラスミドｐＵＣ１９を制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよび
Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化し、フェノール抽出、エタノー
ル沈澱の後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動より約６
０塩基対に相当するバンドを切り出し、ゲルから抽出精
製した。
【００４１】これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＲＬ
２Ｍ（図２）をスクリーニングした。部分塩基配列の確
認および制限酵素地図の作製から目的のベクターである
ことを確認した。
大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＲＬ
２Ｍ（図２）をスクリーニングした。部分塩基配列の確
認および制限酵素地図の作製から目的のベクターである
ことを確認した。
【００４２】［実施例２］ ［ベクターｐＴＬ２Ｍの作製］ｐＲＬ２Ｍをテンプレー
トとし、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-TTGACTAG
TTATTAATAGTA-3' およびオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド 5'-CTAGAATTCACATGTTTGAAAAAGTGTCTTTATC-3' を合成
プライマーとして、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ
によって目的断片を増幅した。制限酵素Ｓｐｅ Ｉおよ
びＥｃｏ ＲＩで末端を調節し、フェノール抽出、エタ
ノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動により約６０
０塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法
で精製した。
トとし、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-TTGACTAG
TTATTAATAGTA-3' およびオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド 5'-CTAGAATTCACATGTTTGAAAAAGTGTCTTTATC-3' を合成
プライマーとして、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ
によって目的断片を増幅した。制限酵素Ｓｐｅ Ｉおよ
びＥｃｏ ＲＩで末端を調節し、フェノール抽出、エタ
ノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動により約６０
０塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法
で精製した。
【００４３】別に、ｐＲＬ２Ｍを制限酵素Ｓｐｅ Ｉお
よびＥｃｏ ＲＩで消化し、フェノール抽出、エタノー
ル沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約４５００塩
基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で精
製した。これら両者の断片をライゲーションの後、大腸
菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ２Ｍ
（図３）をスクリーニングした。部分塩基配列の確認お
よび制限酵素切断地図の作製から目的のベクターである
ことを確認した。ｐＴＬ２Ｍの制限酵素切断地図を図４
に示す。
よびＥｃｏ ＲＩで消化し、フェノール抽出、エタノー
ル沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約４５００塩
基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で精
製した。これら両者の断片をライゲーションの後、大腸
菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ２Ｍ
（図３）をスクリーニングした。部分塩基配列の確認お
よび制限酵素切断地図の作製から目的のベクターである
ことを確認した。ｐＴＬ２Ｍの制限酵素切断地図を図４
に示す。
【００４４】［実施例３］ ［ｐＴＬ２Ｍの酵母への導入］Ｓ．ｐｏｍｂｅのロイシ
ン要求性株、ＡＴＣＣ ３８３９９（ｌｅｕ１−３２ｈ
−）を最少培地で０．８×１０7 細胞数／ｍｌになるま
で生育させた。集菌、洗菌後１０9 細胞数／ｍｌになる
ように０．１モル酢酸リチウム（ｐＨ５．０）に懸濁
し、３０℃で６０分間インキュベートした。その後、上
記懸濁液１００μｌにｐＡＬ７をＰｓｔ Ｉで切断した
ＤＮＡの１μｇ、実施例１で得たベクターｐＴＬ２Ｍの
２μｇをＴＥ（ＥＤＴＡを含んだトリスバッファー）１
５μｌに溶かして加え、５０％ＰＥＧ４０００を２９０
μｌ加えよく混合したのち３０℃で６０分間、４３℃で
１５分間、室温で１０分間の順にインキュベートした。
遠心によりＰＥＧ４０００を除去し、培養液１ｍｌに懸
濁した。
ン要求性株、ＡＴＣＣ ３８３９９（ｌｅｕ１−３２ｈ
−）を最少培地で０．８×１０7 細胞数／ｍｌになるま
で生育させた。集菌、洗菌後１０9 細胞数／ｍｌになる
ように０．１モル酢酸リチウム（ｐＨ５．０）に懸濁
し、３０℃で６０分間インキュベートした。その後、上
記懸濁液１００μｌにｐＡＬ７をＰｓｔ Ｉで切断した
ＤＮＡの１μｇ、実施例１で得たベクターｐＴＬ２Ｍの
２μｇをＴＥ（ＥＤＴＡを含んだトリスバッファー）１
５μｌに溶かして加え、５０％ＰＥＧ４０００を２９０
μｌ加えよく混合したのち３０℃で６０分間、４３℃で
１５分間、室温で１０分間の順にインキュベートした。
遠心によりＰＥＧ４０００を除去し、培養液１ｍｌに懸
濁した。
【００４５】このうち１００μｌを分取し、９００μｌ
の培養液を加えて、３２℃、３０分間インキュベートし
た。うち３００μｌを最少寒天培地にスプレッドした。
３２℃で３日間インキュベートし、形質転換体をＧ４１
８を含むプレートに移し、さらに３２℃で５日間培養し
た。得られたものは、目的とする形質転換体であった。
の培養液を加えて、３２℃、３０分間インキュベートし
た。うち３００μｌを最少寒天培地にスプレッドした。
３２℃で３日間インキュベートし、形質転換体をＧ４１
８を含むプレートに移し、さらに３２℃で５日間培養し
た。得られたものは、目的とする形質転換体であった。
【００４６】［実施例４］ ［形質転換体の培養および細胞抽出液の調製］実施例３
で得た形質転換体を２％グルコース、１％イースト抽出
液、２％ペプトン、およびＧ４１８を２００μｇ／ｍｌ
を含む液体培地５０ｍｌで３２℃、３日間培養した。そ
の培養液から１０8 細胞程度の菌体を集菌、洗菌し、５
０ミリモルトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、
超音波破砕を行った。遠心によって細胞抽出液（上清）
を得た。この細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＴＥＦＣＯ社製 ４〜２０％ポリアクリ
ルアミドゲル、以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）にて行う
解析の陰性対象（コントロール）として以下の実施例に
ついて用いた。
で得た形質転換体を２％グルコース、１％イースト抽出
液、２％ペプトン、およびＧ４１８を２００μｇ／ｍｌ
を含む液体培地５０ｍｌで３２℃、３日間培養した。そ
の培養液から１０8 細胞程度の菌体を集菌、洗菌し、５
０ミリモルトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、
超音波破砕を行った。遠心によって細胞抽出液（上清）
を得た。この細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＴＥＦＣＯ社製 ４〜２０％ポリアクリ
ルアミドゲル、以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）にて行う
解析の陰性対象（コントロール）として以下の実施例に
ついて用いた。
【００４７】［実施例５］ ［ヒトリポコルチンＩの発現］公知（特開平５−１５３
８０号公報参照）のリポコルチンＩｃＤＮＡ全長をベク
ターｐｃＤ４ｌｉｐｏＩをテンプレートとし、オリゴデ
オキシリボヌクレオチド 5'ーATGCCATGGCAATGGTATCAGAAT
T-3'およびオリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-AGCCAG
TATACACTCCGCTA-3' を合成プライマーとして、Ｔａｑポ
リメラーゼを用いたＰＣＲによって目的断片を増幅し
た。制限酵素Ｎｃｏ ＩおよびＢａｍ ＨＩで末端を調
節し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロー
スゲル電気泳動により約１４００塩基対に相当するバン
ドを切り出し、ガラスビーズ法で精製した。
８０号公報参照）のリポコルチンＩｃＤＮＡ全長をベク
ターｐｃＤ４ｌｉｐｏＩをテンプレートとし、オリゴデ
オキシリボヌクレオチド 5'ーATGCCATGGCAATGGTATCAGAAT
T-3'およびオリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-AGCCAG
TATACACTCCGCTA-3' を合成プライマーとして、Ｔａｑポ
リメラーゼを用いたＰＣＲによって目的断片を増幅し
た。制限酵素Ｎｃｏ ＩおよびＢａｍ ＨＩで末端を調
節し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロー
スゲル電気泳動により約１４００塩基対に相当するバン
ドを切り出し、ガラスビーズ法で精製した。
【００４８】別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素Ａｆｌ ＩＩ
ＩおよびＢａｍ ＨＩで消化し、フェノール抽出、エタ
ノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５００
０塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法
で精製した。これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ
２Ｌ（図５）をスクリーニングした。部分塩基配列の確
認および制限酵素地図の作製から目的のベクターである
ことを確認した。
ＩおよびＢａｍ ＨＩで消化し、フェノール抽出、エタ
ノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５００
０塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法
で精製した。これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ
２Ｌ（図５）をスクリーニングした。部分塩基配列の確
認および制限酵素地図の作製から目的のベクターである
ことを確認した。
【００４９】実施例３と同様にＳ．ｐｏｍｂｅを形質転
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。この際
細胞抽出液にプロテアーゼ（１２マイクルモルＰＭＳ
Ｆ、２５マイクロモル ロイペプチン、５マイクロモル
Ｅ−６４）を存在させておく。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて調
べたところ、分子量３６，０００の位置にコントロール
ｐＴＬ２Ｍを導入した酵母抽出液には見られないバンド
が確認され、抗ヒトリポコルチンＩ抗体（ウサギ）を用
いてウエスタンブロットを行なったところ、このバンド
のみが特異的に染色された（図６）。図６はヒトリポコ
ルチンＩの発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図およびウ
エスタンブロット観察図であり、図における１〜４は下
記のものを表す。
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。この際
細胞抽出液にプロテアーゼ（１２マイクルモルＰＭＳ
Ｆ、２５マイクロモル ロイペプチン、５マイクロモル
Ｅ−６４）を存在させておく。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて調
べたところ、分子量３６，０００の位置にコントロール
ｐＴＬ２Ｍを導入した酵母抽出液には見られないバンド
が確認され、抗ヒトリポコルチンＩ抗体（ウサギ）を用
いてウエスタンブロットを行なったところ、このバンド
のみが特異的に染色された（図６）。図６はヒトリポコ
ルチンＩの発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図およびウ
エスタンブロット観察図であり、図における１〜４は下
記のものを表す。
【００５０】１；Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｐＴＬ２Ｍ）細胞抽
出液、 ２；Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｐＴＬ２Ｌ）細胞抽出液、 ３；Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｐＴＬ２Ｍ）細胞抽出液、 ４；Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｐＴＬ２Ｌ）細胞抽出液。
出液、 ２；Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｐＴＬ２Ｌ）細胞抽出液、 ３；Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｐＴＬ２Ｍ）細胞抽出液、 ４；Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｐＴＬ２Ｌ）細胞抽出液。
【００５１】また、 125Ｉ−プロテインＡを二次抗体と
してウエスタンブロットを行い、天然体のリポコルチン
Ｉを標準として定量をしたところ、発現されたリポコル
チンは全可溶性蛋白質の５０ｗｔ％を占めていることが
わかった。
してウエスタンブロットを行い、天然体のリポコルチン
Ｉを標準として定量をしたところ、発現されたリポコル
チンは全可溶性蛋白質の５０ｗｔ％を占めていることが
わかった。
【００５２】［分裂酵母で発現したヒトリポコルチンＩ
の精製］上記で得た粗抽出液をヒトリポコルチンＩのカ
ルシウム結合型のみを認識するモノクローナル抗体をリ
ガンドとしたアフィニテイーカラムに１ミリモル塩化カ
ルシウム、５０ミリモルトリス塩酸（ｐＨ７．５）、
０．１５モル塩化ナトリウムにて吸着させ２ミリモルＥ
ＧＴＡ、５０ミリモルトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．
１５モル塩化ナトリウムにて溶出させることにより、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一なバンドをなす組換えヒト
リポコルチンＩを得た（図７）。図７はヒトリポコルチ
ンＩの精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図であり、図に
おけるＡおよびＢは下記のものを表す。
の精製］上記で得た粗抽出液をヒトリポコルチンＩのカ
ルシウム結合型のみを認識するモノクローナル抗体をリ
ガンドとしたアフィニテイーカラムに１ミリモル塩化カ
ルシウム、５０ミリモルトリス塩酸（ｐＨ７．５）、
０．１５モル塩化ナトリウムにて吸着させ２ミリモルＥ
ＧＴＡ、５０ミリモルトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．
１５モル塩化ナトリウムにて溶出させることにより、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一なバンドをなす組換えヒト
リポコルチンＩを得た（図７）。図７はヒトリポコルチ
ンＩの精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図であり、図に
おけるＡおよびＢは下記のものを表す。
【００５３】Ａ；Ｓ．ｐｏｍｂｅ（ｐＴＬ２Ｌ）粗抽出
液、 Ｂ；精製ヒトリポコルチンＩ。
液、 Ｂ；精製ヒトリポコルチンＩ。
【００５４】［ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）阻害活
性］上記実施例にて精製した組換えヒトリポコルチンＩ
によるＰＬＡ２阻害活性をB.Rothhut らの方法(B.Rothh
ut,et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.117,878-884(19
83))にて測定した。すなわち、トリチウムを含むオレイ
ン酸で標識した大腸菌を基質として、ハチ毒ＰＬＡ２の
活性に対するヒトリポコルチンＩの阻害活性を調べた。
この結果を図８に示した。この結果より、ヒト胎盤由来
リポコルチンＩの示す阻害活性と、阻害の程度、阻害様
式が一致していることがわかった。図８は蛋白質量とＰ
ＬＡ２の活性の関係を示すグラフである。
性］上記実施例にて精製した組換えヒトリポコルチンＩ
によるＰＬＡ２阻害活性をB.Rothhut らの方法(B.Rothh
ut,et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.117,878-884(19
83))にて測定した。すなわち、トリチウムを含むオレイ
ン酸で標識した大腸菌を基質として、ハチ毒ＰＬＡ２の
活性に対するヒトリポコルチンＩの阻害活性を調べた。
この結果を図８に示した。この結果より、ヒト胎盤由来
リポコルチンＩの示す阻害活性と、阻害の程度、阻害様
式が一致していることがわかった。図８は蛋白質量とＰ
ＬＡ２の活性の関係を示すグラフである。
【００５５】［F-アクチンとの結合能］上記実施例で得
た精製ヒトリポコルチンＩが、カルシウム存在下にてＦ
−アクチンに結合するかどうかをH.Hayashi らの方法
(H.Hayashi et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.146,91
2-919(1987)) にて検討した。ヒト胎盤由来リポコルチ
ンＩと同様、１ミリモルカルシウム存在下にて５０ｗｔ
％のヒトリポコルチンＩがＦ−アクチンと結合し、１ミ
リモルＥＧＴＡ存在下では全く結合は見られなかった
（図９）。図９はアクチン結合活性を示すＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ観察図であり、図における１〜４は以下のものを示
す。
た精製ヒトリポコルチンＩが、カルシウム存在下にてＦ
−アクチンに結合するかどうかをH.Hayashi らの方法
(H.Hayashi et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.146,91
2-919(1987)) にて検討した。ヒト胎盤由来リポコルチ
ンＩと同様、１ミリモルカルシウム存在下にて５０ｗｔ
％のヒトリポコルチンＩがＦ−アクチンと結合し、１ミ
リモルＥＧＴＡ存在下では全く結合は見られなかった
（図９）。図９はアクチン結合活性を示すＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ観察図であり、図における１〜４は以下のものを示
す。
【００５６】１；１ミリモルＥＧＴＡ存在下の遠心残
渣、 ２；１ミリモルＥＧＴＡ存在下の遠心上清、 ３；１ミリモル塩化カルシウム存在下の遠心残渣、 ４；１ミリモル塩化カルシウム存在下の遠心上清。
渣、 ２；１ミリモルＥＧＴＡ存在下の遠心上清、 ３；１ミリモル塩化カルシウム存在下の遠心残渣、 ４；１ミリモル塩化カルシウム存在下の遠心上清。
【００５７】［アミノ酸組成］上記実施例で得た組換え
ヒトリポコルチンＩのアミノ酸組成をアミノ酸分析機
（ＪＥＯＬ ＪＬＣ−３６０）により分析した。その結
果を表２に示す。ＤＮＡ塩基配列から予想される組成と
一致していることがわかった。
ヒトリポコルチンＩのアミノ酸組成をアミノ酸分析機
（ＪＥＯＬ ＪＬＣ−３６０）により分析した。その結
果を表２に示す。ＤＮＡ塩基配列から予想される組成と
一致していることがわかった。
【００５８】
【表２】
【００５９】［アミノ末端アミノ酸配列］上記実施例で
得た組換えヒトリポコルチンＩのアミノ末端からのアミ
ノ酸配列の決定を気相法シークエンサー（ＳＨＩＭＡＤ
ＺＵ ＰＳＱ−１）にて行ったが、ＰＴＨ−アミノ酸は
検出されなかった。そこで組換えヒトリポコルチンＩを
Ｖ８プロテアーゼ（ベーリンガー社）により完全分解
し、ＯＤＳ Ｃ１８カラム（ＨＰＬＣ）にて各フラグメ
ントを分取し、各フラグメントのアミノ酸組成を調べる
ことによりアミノ末端フラグメントを選んだ。次に、そ
のペプチドにアシルアミノ酸遊離酵素を作用させた。そ
の結果を図１０に表す。
得た組換えヒトリポコルチンＩのアミノ末端からのアミ
ノ酸配列の決定を気相法シークエンサー（ＳＨＩＭＡＤ
ＺＵ ＰＳＱ−１）にて行ったが、ＰＴＨ−アミノ酸は
検出されなかった。そこで組換えヒトリポコルチンＩを
Ｖ８プロテアーゼ（ベーリンガー社）により完全分解
し、ＯＤＳ Ｃ１８カラム（ＨＰＬＣ）にて各フラグメ
ントを分取し、各フラグメントのアミノ酸組成を調べる
ことによりアミノ末端フラグメントを選んだ。次に、そ
のペプチドにアシルアミノ酸遊離酵素を作用させた。そ
の結果を図１０に表す。
【００６０】図１０はＨＰＬＣによる溶出量を表すグラ
フであり、図１０ａはアミノ末端フラグメントの溶出量
を表すグラフであり、図１０ｂはそのアミノ末端フラグ
メントにアシルアミノ酸遊離酵素を作用させた後のフラ
グメントの溶出量を表すグラフである。図１０ｂに示す
ように溶出時間の早いところにピークがあらわれ、また
アミノ末端フラグメントの溶出位置は移動した。
フであり、図１０ａはアミノ末端フラグメントの溶出量
を表すグラフであり、図１０ｂはそのアミノ末端フラグ
メントにアシルアミノ酸遊離酵素を作用させた後のフラ
グメントの溶出量を表すグラフである。図１０ｂに示す
ように溶出時間の早いところにピークがあらわれ、また
アミノ末端フラグメントの溶出位置は移動した。
【００６１】前者のピークを分取し加水分解してアミノ
酸組成を調べたところAla であり、またアセチルAla を
ＨＰＬＣにて溶出させると、図１０ｂのようにこのピー
クと一致する。また後者のピークをシークエンサーにて
解析するとMet-Val-Ser-Gluであることがわかった。し
たがって、組換えヒトリポコルチンＩのアミノ末端アミ
ノ酸配列は天然体と同様Acetyl-Ala-Met-Val-Ser-Gluで
あると考えられる。
酸組成を調べたところAla であり、またアセチルAla を
ＨＰＬＣにて溶出させると、図１０ｂのようにこのピー
クと一致する。また後者のピークをシークエンサーにて
解析するとMet-Val-Ser-Gluであることがわかった。し
たがって、組換えヒトリポコルチンＩのアミノ末端アミ
ノ酸配列は天然体と同様Acetyl-Ala-Met-Val-Ser-Gluで
あると考えられる。
【００６２】［ヒトリポコルチンＩ発現ベクターのコピ
ー数の確認］実施例で作製した形質転換体を培養し、５
×１０7 個の細胞を得た。培地中のＧ４１８濃度を各々
０、２５、５０、１００、２００μｇ／ｍｌの５種類に
対して行った以外は、培養方法は実施例４と同じ方法で
行った。ガラスビーズ、ＳＤＳおよびフェノールを用い
て菌体を破砕し、全ＤＮＡを抽出した。制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化した後、０．８％
アガロースゲル電気泳動後、ナイロンメンブレンに転写
し、ヒトリポコルチンＩ遺伝子のＥｃｏ ＲＩ−Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼ
ーションを行った。この結果を図１１に示す。図１１は
Ｇ４１８濃度とｐＴＬ２Ｌのコピー数と関係を示すグラ
フである。図に示すように、培地中のＧ４１８濃度に依
存して菌体内のベクターコピー数が増加し、最大２００
コピー程度まで上昇することがわかった。
ー数の確認］実施例で作製した形質転換体を培養し、５
×１０7 個の細胞を得た。培地中のＧ４１８濃度を各々
０、２５、５０、１００、２００μｇ／ｍｌの５種類に
対して行った以外は、培養方法は実施例４と同じ方法で
行った。ガラスビーズ、ＳＤＳおよびフェノールを用い
て菌体を破砕し、全ＤＮＡを抽出した。制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化した後、０．８％
アガロースゲル電気泳動後、ナイロンメンブレンに転写
し、ヒトリポコルチンＩ遺伝子のＥｃｏ ＲＩ−Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼ
ーションを行った。この結果を図１１に示す。図１１は
Ｇ４１８濃度とｐＴＬ２Ｌのコピー数と関係を示すグラ
フである。図に示すように、培地中のＧ４１８濃度に依
存して菌体内のベクターコピー数が増加し、最大２００
コピー程度まで上昇することがわかった。
【００６３】［実施例６］ ［ラットアルギナーゼの発現］熊本大学医学部森正敬教
授より供与を受けた、ラット肝臓アルギナーゼｃＤＮＡ
全長を含むベクターｐＡＲＧｒ−２［S.Kawamoto et a
l.,Biochem. Biophis.Res.Commun.,136,955-961(1986)
］より、インサートを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＰ
ｓｔ Ｉで切り出し、市販のベクターであるブルースク
リプトのＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ Ｉ部位にサブクローニン
グした。
授より供与を受けた、ラット肝臓アルギナーゼｃＤＮＡ
全長を含むベクターｐＡＲＧｒ−２［S.Kawamoto et a
l.,Biochem. Biophis.Res.Commun.,136,955-961(1986)
］より、インサートを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＰ
ｓｔ Ｉで切り出し、市販のベクターであるブルースク
リプトのＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ Ｉ部位にサブクローニン
グした。
【００６４】このベクターをテンプレートとし、オリゴ
デオキシリボヌクレオチド 5'-GACTCATGAGCTCCAAGCCAAA
GCC-3'およびオリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-TTCC
CAGTCACGACGTTGTA-3' を合成プライマーとして、Ｔａｑ
ポリメラーゼを用いたＰＣＲによって目的断片を増幅し
た。制限酵素Ｂｓｐ ＨＩおよびＸｂａ Ｉで末端を調
節し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロー
スゲル電気泳動により約１３００塩基対に相当するバン
ドを切り出し、ガラスビーズ法で精製した。
デオキシリボヌクレオチド 5'-GACTCATGAGCTCCAAGCCAAA
GCC-3'およびオリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-TTCC
CAGTCACGACGTTGTA-3' を合成プライマーとして、Ｔａｑ
ポリメラーゼを用いたＰＣＲによって目的断片を増幅し
た。制限酵素Ｂｓｐ ＨＩおよびＸｂａ Ｉで末端を調
節し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロー
スゲル電気泳動により約１３００塩基対に相当するバン
ドを切り出し、ガラスビーズ法で精製した。
【００６５】別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素Ａｆｌ ＩＩ
ＩおよびＸｂａ Ｉで消化し、フェノール抽出、エタノ
ール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５０００
塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で
精製した。これら両者の断片をライゲーションの後、大
腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ２
Ｒ（図１２）をスクリーニングした。部分塩基配列の確
認および制限酵素地図の作製から目的のベクターである
ことを確認した。
ＩおよびＸｂａ Ｉで消化し、フェノール抽出、エタノ
ール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５０００
塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で
精製した。これら両者の断片をライゲーションの後、大
腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ２
Ｒ（図１２）をスクリーニングした。部分塩基配列の確
認および制限酵素地図の作製から目的のベクターである
ことを確認した。
【００６６】実施例３と同様にＳ．ｐｏｍｂｅを形質転
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ラットアル
ギナーゼに相当する分子量３５，０００付近の位置にコ
ントロールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバンドが検
出できた。その発現量は、デンシトメーターにて測定し
たところ全菌体蛋白質の３０〜５０ｗｔ％であった。ま
た、ラットアルギナーゼ特異的な抗体を用いてウエスタ
ンブロッティングを行い、ラットアルギナーゼであるこ
とを確認した。
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ラットアル
ギナーゼに相当する分子量３５，０００付近の位置にコ
ントロールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバンドが検
出できた。その発現量は、デンシトメーターにて測定し
たところ全菌体蛋白質の３０〜５０ｗｔ％であった。ま
た、ラットアルギナーゼ特異的な抗体を用いてウエスタ
ンブロッティングを行い、ラットアルギナーゼであるこ
とを確認した。
【００６７】［実施例７］ ［ヒトＩＬ−６の発現］ヒトＩＬ−６ｃＤＮＡ全長を含
む公知のベクターｐＵＣ１９をテンプレートとし、オリ
ゴデオキシリボヌクレオチド 5'-ATCGCATGCCAGTACCCCCA
GGAGAAGA-3' およびオリゴデオキシリボヌクレオチド
5'-TGAAAATCTTCTCTCATCCG-3' を合成プライマーとし
て、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲによって目的断
片を増幅した。制限酵素Ｓｐｈ ＩおよびＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩで末端を調節し、フェノール抽出、エタノール沈澱
の後、アガロースゲル電気泳動により約１０００塩基対
に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で精製し
た。
む公知のベクターｐＵＣ１９をテンプレートとし、オリ
ゴデオキシリボヌクレオチド 5'-ATCGCATGCCAGTACCCCCA
GGAGAAGA-3' およびオリゴデオキシリボヌクレオチド
5'-TGAAAATCTTCTCTCATCCG-3' を合成プライマーとし
て、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲによって目的断
片を増幅した。制限酵素Ｓｐｈ ＩおよびＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩで末端を調節し、フェノール抽出、エタノール沈澱
の後、アガロースゲル電気泳動により約１０００塩基対
に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で精製し
た。
【００６８】別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素Ａｆｌ ＩＩ
ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、フェノール抽出、
エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５
０００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビー
ズ法で精製した。これら両者の断片をライゲーションの
後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐ
ＴＬ２６ｍ（図１３）をスクリーニングした。部分塩基
配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクタ
ーであることを確認した。
ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、フェノール抽出、
エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５
０００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビー
ズ法で精製した。これら両者の断片をライゲーションの
後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐ
ＴＬ２６ｍ（図１３）をスクリーニングした。部分塩基
配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクタ
ーであることを確認した。
【００６９】実施例３と同様にＳ．ｐｏｍｂｅを形質転
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ヒトＩＬ−
６に相当する分子量２１，０００付近の位置にコントロ
ールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバンドが検出でき
た。その発現量は、デンシトメーターにて測定したとこ
ろ全菌体蛋白質の10wt% 程度であった。また、ヒトＩＬ
−６特異的な抗体を用いてウエスタンブロッティングを
行い、ヒトＩＬ−６であることを確認した。
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ヒトＩＬ−
６に相当する分子量２１，０００付近の位置にコントロ
ールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバンドが検出でき
た。その発現量は、デンシトメーターにて測定したとこ
ろ全菌体蛋白質の10wt% 程度であった。また、ヒトＩＬ
−６特異的な抗体を用いてウエスタンブロッティングを
行い、ヒトＩＬ−６であることを確認した。
【００７０】［実施例８］ ［ラットＮＤＰキナーゼα体の発現］東京都老人研究所
木村成道博士より供与を受けた、ラットＮＤＰキナーゼ
α体ｃＤＮＡ全長を含むベクターｐＮＤＰＫαを制限酵
素Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フェノー
ル抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動
により約６００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガ
ラスビーズ法で精製した。別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素
Ａｆｌ ＩＩＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、フェ
ノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気
泳動より約５０００塩基対に相当するバンドを切り出
し、ガラスビーズ法で精製した。
木村成道博士より供与を受けた、ラットＮＤＰキナーゼ
α体ｃＤＮＡ全長を含むベクターｐＮＤＰＫαを制限酵
素Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フェノー
ル抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動
により約６００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガ
ラスビーズ法で精製した。別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素
Ａｆｌ ＩＩＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、フェ
ノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気
泳動より約５０００塩基対に相当するバンドを切り出
し、ガラスビーズ法で精製した。
【００７１】これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ
２−Ｎα（図１４）をスクリーニングした。部分塩基配
列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクター
であることを確認した。
大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ
２−Ｎα（図１４）をスクリーニングした。部分塩基配
列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクター
であることを確認した。
【００７２】実施例３と同様にＳ．ｐｏｍｂｅを形質転
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ラットＮＤ
Ｐキナーゼα体に相当する分子量１７，０００付近の位
置にコントロールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバン
ドが検出できた。その発現量は、デンシトメーターにて
測定したところ全菌体蛋白質の３０〜５０ｗｔ％であっ
た。また、ラットＮＤＰキナーゼα体特異的な抗体を用
いてウエスタンブロッティングを行い、ラットＮＤＰキ
ナーゼα体であることを確認した。
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ラットＮＤ
Ｐキナーゼα体に相当する分子量１７，０００付近の位
置にコントロールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバン
ドが検出できた。その発現量は、デンシトメーターにて
測定したところ全菌体蛋白質の３０〜５０ｗｔ％であっ
た。また、ラットＮＤＰキナーゼα体特異的な抗体を用
いてウエスタンブロッティングを行い、ラットＮＤＰキ
ナーゼα体であることを確認した。
【００７３】［実施例９］ ［ラットＮＤＰキナーゼβ体の発現］東京都老人研究所
木村成道博士より供与を受けた、ラットＮＤＰキナーゼ
β体ｃＤＮＡ全長を含むベクターｐＮＤＰＫβを制限酵
素Ｎｃｏ ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、フェノール抽
出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動によ
り約７００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラス
ビーズ法で精製した。
木村成道博士より供与を受けた、ラットＮＤＰキナーゼ
β体ｃＤＮＡ全長を含むベクターｐＮＤＰＫβを制限酵
素Ｎｃｏ ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、フェノール抽
出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動によ
り約７００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラス
ビーズ法で精製した。
【００７４】別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素Ａｆｌ ＩＩ
ＩおよびＥｃｏ ＲＩで消化し、フェノール抽出、エタ
ノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５００
０塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法
で精製した。これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ
２−Ｎβ（図１５）をスクリーニングした。部分塩基配
列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクター
であることを確認した。
ＩおよびＥｃｏ ＲＩで消化し、フェノール抽出、エタ
ノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５００
０塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法
で精製した。これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐＴＬ
２−Ｎβ（図１５）をスクリーニングした。部分塩基配
列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクター
であることを確認した。
【００７５】実施例３と同様にＳ．ｐｏｍｂｅを形質転
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ラットＮＤ
Ｐキナーゼβ体に相当する分子量１７，０００付近の位
置にコントロールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバン
ドが検出できた。その発現量は、デンシトメーターにて
測定したところ全菌体蛋白質の３０〜５０ｗｔ％であっ
た。また、ラットＮＤＰキナーゼβ体特異的な抗体を用
いてウエスタンブロッティングを行い、ラットＮＤＰキ
ナーゼβ体であることを確認した。
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ラットＮＤ
Ｐキナーゼβ体に相当する分子量１７，０００付近の位
置にコントロールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバン
ドが検出できた。その発現量は、デンシトメーターにて
測定したところ全菌体蛋白質の３０〜５０ｗｔ％であっ
た。また、ラットＮＤＰキナーゼβ体特異的な抗体を用
いてウエスタンブロッティングを行い、ラットＮＤＰキ
ナーゼβ体であることを確認した。
【００７６】［実施例１０］ ［ヒト血清アルブミンの発現］国立予防衛生研究所遺伝
子バンクより供与を受けた、ヒト血清アルブミンｃＤＮ
Ａを含むベクターｐＩＬＭＡＬＢ５をテンプレートと
し、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-AGACCATGGATG
CACACAAGAGTGAGGT-3' およびオリゴデオキシリボヌクレ
オチド 5'-CAGGAAACAGCTATGACCAT-3' を合成プライマー
として、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲによって目
的断片を増幅した。制限酵素Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで末端を調節し、フェノール抽出、エタノール
沈澱の後、アガロースゲル電気泳動により約１８００塩
基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で精
製した。
子バンクより供与を受けた、ヒト血清アルブミンｃＤＮ
Ａを含むベクターｐＩＬＭＡＬＢ５をテンプレートと
し、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-AGACCATGGATG
CACACAAGAGTGAGGT-3' およびオリゴデオキシリボヌクレ
オチド 5'-CAGGAAACAGCTATGACCAT-3' を合成プライマー
として、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲによって目
的断片を増幅した。制限酵素Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで末端を調節し、フェノール抽出、エタノール
沈澱の後、アガロースゲル電気泳動により約１８００塩
基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で精
製した。
【００７７】別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素Ａｆｌ ＩＩ
ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、フェノール抽出、
エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５
０００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビー
ズ法で精製した。これら両者の断片をライゲーションの
後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐ
ＴＬ２Ｂｍ（図１６）をスクリーニングした。部分塩基
配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクタ
ーであることを確認した。
ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、フェノール抽出、
エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約５
０００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビー
ズ法で精製した。これら両者の断片をライゲーションの
後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターｐ
ＴＬ２Ｂｍ（図１６）をスクリーニングした。部分塩基
配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクタ
ーであることを確認した。
【００７８】実施例３と同様にＳ．ｐｏｍｂｅを形質転
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ヒト血清ア
ルブミンに相当する分子量６９，０００付近の位置にコ
ントロールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバンドが検
出できた。その発現量は、デンシトメーターにて測定し
たところ全菌体蛋白質の３０ｗｔ％程度であった。ま
た、ヒト血清アルブミン特異的な抗体を用いてウエスタ
ンブロッティングを行い、ヒト血清アルブミンであるこ
とを確認した。
換し、実施例４と同様に細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって発現を確認したところ、ヒト血清ア
ルブミンに相当する分子量６９，０００付近の位置にコ
ントロールｐＴＬ２Ｍには見られない明瞭なバンドが検
出できた。その発現量は、デンシトメーターにて測定し
たところ全菌体蛋白質の３０ｗｔ％程度であった。ま
た、ヒト血清アルブミン特異的な抗体を用いてウエスタ
ンブロッティングを行い、ヒト血清アルブミンであるこ
とを確認した。
【００７９】
【発明の効果】本発明では、あらゆる蛋白質を高発現量
で発現することができるため、異種蛋白質生産の効率を
大幅に上昇させることが可能である。また上述のヒトリ
ポコルチンＩの場合に見られるようにその発現量は菌体
蛋白質の５０ｗｔ％を占め、その分子量、アミノ酸組
成、アミノ末端近傍のアミノ酸配列、などがヒト胎盤由
来リポコルチンＩ(Nature 320,77-81(1986))における各
々と同一であり、またＰＬＡ２阻害活性の程度やアクチ
ンとの結合能などについても上記天然型と同様であるこ
とから、本発明により分裂酵母を用いて天然型とほぼ同
一と思われる蛋白質をきわめて効率よく得られることが
可能となった。
で発現することができるため、異種蛋白質生産の効率を
大幅に上昇させることが可能である。また上述のヒトリ
ポコルチンＩの場合に見られるようにその発現量は菌体
蛋白質の５０ｗｔ％を占め、その分子量、アミノ酸組
成、アミノ末端近傍のアミノ酸配列、などがヒト胎盤由
来リポコルチンＩ(Nature 320,77-81(1986))における各
々と同一であり、またＰＬＡ２阻害活性の程度やアクチ
ンとの結合能などについても上記天然型と同様であるこ
とから、本発明により分裂酵母を用いて天然型とほぼ同
一と思われる蛋白質をきわめて効率よく得られることが
可能となった。
【図１】ベクターｐＲＬ２Ｌの構成図
【図２】ベクターｐＲＬ２Ｍの構成図
【図３】ベクターｐＴＬ２Ｍの構成図
【図４】ベクターｐＴＬ２Ｍの制限酵素切断地図
【図５】発現ベクターｐＴＬ２Ｌの構成図
【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット観
察図
察図
【図７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図
【図８】ＰＬＡ２阻害活性を示すグラフ
【図９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図
【図１０】ＨＰＬＣ溶出を示すグラフ
【図１１】ｐＴＬ２Ｌのコピー数の変化を示すグラフ
【図１２】発現ベクターｐＴＬ２Ｒの構成図
【図１３】発現ベクターｐＴＬ２６ｍの構成図
【図１４】発現ベクターｐＴＬ２−Ｎαの構成図
【図１５】発現ベクターｐＴＬ２−Ｎβの構成図
【図１６】発現ベクターｐＴＬ２Ｂｍの構成図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (14)
- 【請求項１】真核細胞内において機能しうるプロモータ
ー領域を有し、かつそのプロモーターによって支配され
る異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのマルチクロー
ニングサイトをそのプロモーター領域の下流に有するベ
クターであり、そのベクターのマルチクローニングサイ
ト先端部分における異種蛋白質構造遺伝子を導入するた
めの制限酵素認識部位が、５’側から−ＡＣＡＴＧＴ−
なる配列を有する制限酵素認識部位であることを特徴と
するマルチクローニングベクター。 - 【請求項２】ベクターがさらに第２のプロモーター領域
とその第２のプロモーターによって支配される抗生物質
耐性遺伝子を有し、かつ第２のプロモーターの転写促進
活性が第１のプロモーターの転写促進活性よりも低い、
請求項１のマルチクローニングベクター。 - 【請求項３】真核細胞内において機能しうるプロモータ
ー領域、およびそのプロモーター領域下流にそのプロモ
ーターによって支配された異種蛋白質構造遺伝子を有
し、異種蛋白質構造遺伝子先端部分が５’側から−ＡＣ
ＡＴＧＮ−（Ｎは任意の塩基）なる配列を有し、この配
列におけるＡＴＧが異種蛋白質構造遺伝子の翻訳開始部
位であり、しかもこの配列がベクターに異種蛋白質構造
遺伝子が導入された際の制限酵素認識部位に由来する配
列であることを特徴とする発現ベクター。 - 【請求項４】−ＡＣＡＴＧＮ−なる配列が、−Ａなるベ
クター側末端とＣＡＴＧＮ−なる異種蛋白質構造遺伝子
側先端との連結によって、または、−ＡＣＡＴＧなるベ
クター側末端とＮ−なる異種蛋白質構造遺伝子側先端と
の連結によって、形成された配列である、請求項３の発
現ベクター。 - 【請求項５】プロモーター末端と異種蛋白質構造遺伝子
の翻訳開始部位との間に非翻訳領域を有し、その非翻訳
領域の長さが２０〜２００ｂｐである、請求項３または
４の発現ベクター。 - 【請求項６】ベクターがさらに第２のプロモーター領域
とその第２のプロモーターによって支配される抗生物質
耐性遺伝子を有し、かつ第２のプロモーターの転写促進
活性が第１のプロモーターの転写促進活性よりも低い、
請求項３、４または５の発現ベクター。 - 【請求項７】真核細胞内において機能しうるプロモータ
ー領域を有するベクターのプロモーター領域下流にその
プロモーターによって支配される異種蛋白質構造遺伝子
を導入する方法において、５’側から−ＡＣＡＴＧＴ−
なる配列を有する制限酵素認識部位で切断したベクター
末端に５’側から−Ｎ’ＣＡＴＧＮ−（Ｎは任意の塩
基、Ｎ’はＮに相補的な塩基）なる配列を有する制限酵
素認識部位で切断した異種蛋白質構造遺伝子の先端を連
結して−ＡＣＡＴＧＮ−なる配列の連結部分を形成し、
その連結部分のＡＴＧを異種蛋白質構造遺伝子の翻訳開
始部位とし、しかもベクター側の制限酵素認識切断部末
端と異種蛋白質構造遺伝子側の制限酵素認識切断部先端
の組合せによりＡＴＧの次の塩基をＡ、Ｔ、Ｇ、および
Ｃから選ばれる任意の塩基とすることを特徴とする真核
細胞内で発現しうる発現ベクターの構築方法。 - 【請求項８】ベクター側制限酵素認識部位を切断する制
限酵素がＡｆｌ ＩＩＩまたはＮｓｐ Ｉであり、異種
蛋白質構造遺伝子側制限酵素認識部位を切断する制限酵
素がＮｃｏ Ｉ、Ｂｓｐ ＨＩ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ｎｓ
ｐ Ｉ、またはＳｐｈ Ｉである、請求項７の発現ベク
ターの構築方法。 - 【請求項９】ベクターがさらに第２のプロモーター領域
とその第２のプロモーターによって支配される抗生物質
耐性遺伝子を有し、かつ第２のプロモーターの転写促進
活性が第１のプロモーターの転写促進活性よりも低い、
請求項７または８の発現ベクターの構築方法。 - 【請求項１０】複製開始点を有しない請求項３、４、５
または６の発現ベクターを複製開始点を有する酵母ベク
ターと人為的にあるいは酵母内で自動的に組換えて複製
開始点を有する発現ベクターを構築する、発現ベクター
の構築方法。 - 【請求項１１】請求項３、４、５または６の発現ベクタ
ーまたはその発現ベクターと複製開始点を有する酵母ベ
クターとの組換え体を保持するシゾサッカロミセス・ポ
ンベからなる形質転換体。 - 【請求項１２】請求項１１の形質転換体を培養し、培養
物中に異種蛋白質を生成蓄積させ、これを採取すること
を特徴とする異種蛋白質の製造法。 - 【請求項１３】請求項１１の形質転換体が、請求項６の
発現ベクターまたはその発現ベクターと複製開始点を有
する酵母ベクターとの組換え体を保持するシゾサッカロ
ミセス・ポンベからなる、請求項１２の製造法。 - 【請求項１４】発現ベクターが有する抗生物質耐性遺伝
子に対応する抗生物質を含有する培養液中で形質転換体
を培養する、請求項１３の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24158194A JP3689920B2 (ja) | 1993-10-05 | 1994-10-05 | マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24931093 | 1993-10-05 | ||
| JP5-249310 | 1993-10-05 | ||
| JP24158194A JP3689920B2 (ja) | 1993-10-05 | 1994-10-05 | マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07163373A true JPH07163373A (ja) | 1995-06-27 |
| JP3689920B2 JP3689920B2 (ja) | 2005-08-31 |
Family
ID=26535338
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24158194A Expired - Lifetime JP3689920B2 (ja) | 1993-10-05 | 1994-10-05 | マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3689920B2 (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010038802A1 (ja) | 2008-10-01 | 2010-04-08 | 旭硝子株式会社 | 宿主、形質転換体およびその製造方法、ならびにｏ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法 |
| EP2182060A1 (en) | 2005-08-03 | 2010-05-05 | Asahi Glass Company, Limited | Transformed yeast host cells and method of producing foreign protein |
| WO2010087344A1 (ja) | 2009-01-27 | 2010-08-05 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法および形質転換体、ならびに異種蛋白質の製造方法 |
| US7790450B2 (en) | 2005-08-29 | 2010-09-07 | Asahi Glass Company, Limited | Expression vector, a transformant carrying the same and a method for producing heterologous protein |
| WO2011021629A1 (ja) | 2009-08-21 | 2011-02-24 | 旭硝子株式会社 | 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 |
| WO2012060389A1 (ja) | 2010-11-05 | 2012-05-10 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体およびその製造方法 |
| WO2012128260A1 (ja) | 2011-03-24 | 2012-09-27 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体、該形質転換体の製造方法、β－グルコシダーゼの製造方法、およびセルロースの分解方法 |
| WO2013111754A1 (ja) | 2012-01-23 | 2013-08-01 | 旭硝子株式会社 | 発現ベクターおよび蛋白質の製造方法 |
| WO2014030644A1 (ja) | 2012-08-20 | 2014-02-27 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス・ポンベ変異体の形質転換体、およびクローニングベクター |
| WO2015076393A1 (ja) | 2013-11-22 | 2015-05-28 | 旭硝子株式会社 | 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 |
-
1994
- 1994-10-05 JP JP24158194A patent/JP3689920B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2182060A1 (en) | 2005-08-03 | 2010-05-05 | Asahi Glass Company, Limited | Transformed yeast host cells and method of producing foreign protein |
| US8329448B2 (en) | 2005-08-03 | 2012-12-11 | Asahi Glass Company, Limited | Yeast host, transformant and method for producing heterologous proteins |
| US7790450B2 (en) | 2005-08-29 | 2010-09-07 | Asahi Glass Company, Limited | Expression vector, a transformant carrying the same and a method for producing heterologous protein |
| WO2010038802A1 (ja) | 2008-10-01 | 2010-04-08 | 旭硝子株式会社 | 宿主、形質転換体およびその製造方法、ならびにｏ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法 |
| WO2010087344A1 (ja) | 2009-01-27 | 2010-08-05 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法および形質転換体、ならびに異種蛋白質の製造方法 |
| US9284561B2 (en) | 2009-08-21 | 2016-03-15 | Asahi Glass Company, Limited | Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid |
| WO2011021629A1 (ja) | 2009-08-21 | 2011-02-24 | 旭硝子株式会社 | 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 |
| WO2012060389A1 (ja) | 2010-11-05 | 2012-05-10 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体およびその製造方法 |
| WO2012128260A1 (ja) | 2011-03-24 | 2012-09-27 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体、該形質転換体の製造方法、β－グルコシダーゼの製造方法、およびセルロースの分解方法 |
| WO2013111754A1 (ja) | 2012-01-23 | 2013-08-01 | 旭硝子株式会社 | 発現ベクターおよび蛋白質の製造方法 |
| WO2014030644A1 (ja) | 2012-08-20 | 2014-02-27 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス・ポンベ変異体の形質転換体、およびクローニングベクター |
| US9765347B2 (en) | 2012-08-20 | 2017-09-19 | Asahi Glass Company, Limited | Transformant of Schizosaccharomyces pombe mutant and cloning vector |
| WO2015076393A1 (ja) | 2013-11-22 | 2015-05-28 | 旭硝子株式会社 | 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3689920B2 (ja) | 2005-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3730256B2 (ja) | 分泌シグナル遺伝子およびそれを有する発現ベクター | |
| US8124379B2 (en) | Signal peptide for producing a polypeptide | |
| AU2005254734B9 (en) | Production of polypeptides by improved secretion | |
| WO2008128701A2 (en) | Yeast expression systems | |
| JP3689920B2 (ja) | マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産 | |
| US10174304B2 (en) | Expression vector and method for producing protein | |
| EP1002095B1 (en) | Improved protein expression strains | |
| JP2776085B2 (ja) | ベクター | |
| US20240262876A1 (en) | Recombinant vaccine against helminths in pichia pastoris and methods for producing and purifying proteins for use as vaccines against helminths | |
| WO1995009914A1 (fr) | Vecteur de multiclonage, vecteur d'expression, et production d'une proteine exogene au moyen dudit vecteur d'expression | |
| JP3914389B2 (ja) | 熱誘導可能プロモーター | |
| JPH10234375A (ja) | マルチクローニングベクター | |
| EP1732940B1 (en) | METHOD FOR CONSTRUCTION AND USE OF <i>KLUYVEROMYCES LACTIS</i> PROMOTER VARIANTS IN <i>K.LACTIS</i> THAT SUBSTANTIALLY LACK <i>E. COLI</i> TRANSCRIPTIONAL CAPABILITY | |
| EP0498827B1 (en) | Improved plasmid vectors for cellular slime moulds of the genus dictyostelium | |
| JPH0638771A (ja) | ヒトプロテインジスルフィドイソメラーゼ遺伝子の発現方法および該遺伝子との共発現によるポリペプチドの製造方法 | |
| AU781876B2 (en) | Beta-hexosaminidase, DNA sequence from ciliates for coding the same and use thereof | |
| EP1841862B1 (en) | A ubp1 protease mutant,and its coding sequence, their applications and heterogonous protein expression system | |
| US20080227154A1 (en) | Protein Expression | |
| KR100278109B1 (ko) | 인간 혈장 알부민 발현벡터를 함유한 형질전환 효모 사카로마이세스 세레비시에를 이용한 인간 혈장 알부민의 제조 방법 | |
| JP2002537795A (ja) | ハンセヌラポリモルパ変異体及びそれらを利用する組換え蛋白質の製造方法 | |
| JPH10113174A (ja) | ヒトシトクロムｐ−４５０とヒトシトクロムｐ−４５０還元酵素の同時製造方法 | |
| JPS63152982A (ja) | 新規ｄｎａおよびその用途 | |
| CN117586415A (zh) | 一种重组Ulp1融合蛋白酶及其制备方法 | |
| Liua et al. | Improved secretory production of glucoamylase in Pichia pastoris by combination of genetic manipulationsq | |
| WO2007101028A2 (en) | Method to produce enzymatically active recombinant endonucleases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050111 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050524 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050606 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080624 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090624 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090624 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100624 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100624 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110624 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120624 Year of fee payment: 7 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120624 Year of fee payment: 7 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120624 Year of fee payment: 7 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130624 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130624 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140624 Year of fee payment: 9 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |