JPH0712818A

JPH0712818A - 免疫学的検出方法

Info

Publication number: JPH0712818A
Application number: JP15505393A
Authority: JP
Inventors: Hiromi Iijima; 裕己飯島; Hirosato Okazaki; 宏悟岡崎; Takeo Yamagata; 武夫山県; Mitsuo Yamaki; 光男山木
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Resonac Corp
Priority date: 1993-06-25
Filing date: 1993-06-25
Publication date: 1995-01-17

Abstract

(57)【要約】【構成】ヒト体液検体中の抗原又は抗体の検出方法で
あって、前記抗原又は抗体に対応する抗体又は抗原を反
応させるに先立ち、予め検体をヒトリウマチ因子（Ｒ
Ｆ）の反応部位に結合能を有する動物由来抗体の十分量
で前処理して、検体中のヒトＲＦに起因する非特異的反
応を減少させることを特徴とする免疫学的検出方法。【効果】煩雑な抗体の調整を必要とせず、ＲＦの影響
の少ない特異的な免疫学的反応の検出ができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原又は抗体の免疫学
的検出方法に関する。更に詳しくは、抗原抗体反応を利
用し、ヒト体液中の抗原又は抗体を特異的に検出する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、医学や臨床検査の分野において、
ヒト体液検体中（血中、尿中）の種々の生体物質、例え
ば、血漿蛋白や種々の凝固線溶系の蛋白、ホルモンや薬
物、各種細菌、クラミジア、ウイルス等やこれらの抗体
等、数多くの項目の測定のために、抗原抗体反応に基づ
く免疫学的検出法広く用いられている。又、近年は、微
量化、迅速化、簡便化、自動化等の顧客のニーズに対応
した検出法や試薬の開発や改良がなされている。

【０００３】免疫学的検出法は、その抗原抗体反応を利
用するものであり、通常、抗原検出のためには、被検抗
原に対する抗体を、又、抗体検出のためには、被検抗体
に対する抗原を試薬に用いている。検出の手段により、
沈降反応、免疫比濁法、ラテックス免疫比濁法、酵素免
疫測定法、化学発光酵素免疫測定法、放射免疫測定法等
の様々な検出法が用いられている。

【０００４】又、各種抗体又は抗原を不溶性担体粒子に
支持（感作）し、これと検出すべきヒト体液成分中の被
検抗原又は被検抗体との凝集反応に基づく検査法が広く
利用されている。抗体又は抗原が支持（感作）されたラ
テックス粒子（感作ラテックス）と検体とをガラス板上
で混合し、検体中の抗原又は抗体と抗原抗体反応を起こ
させ、この凝集状態を肉眼で観察することにより検体中
の抗原又は抗体を半定量的に測定する方法や抗体又は抗
原を感作したラテックス粒子を使用し、ラテックスと検
体中の被検抗原又は被検抗体との反応凝集物を光学的に
測定する方法が提案され利用され普及している（特公昭
５８−１１５７５公報、特公昭６２−４３１３８公報、
特公昭６２−５５１０３公報）。最近は、専用の分析装
置を用いて抗原又は抗体を定量的に検出することも行わ
れている。

【０００５】更に、抗原又は抗体を不溶性担体に支持
（感作）し、これと検出すべき抗原又は抗体を反応さ
せ、洗浄後、酵素、蛍光物質、ビオチン等で標識した抗
体を反応させ、洗浄後それぞれの活性の強度又は酵素活
性を測定することにより、体液成分中の抗原又は抗体の
存在を試験する蛍光抗体法や酵素免疫測定法が広く用い
られてきた。又最近、酵素免疫測定法と化学発光を組み
合わせた化学発光酵素免疫測定法も用いられるようにな
っている。

【０００６】しかし、上記の免疫学的検出法では、しば
しば、非特異反応による測定誤差と誤判定を生じ臨床診
断上の問題となることがある。特に、ヒト検体中のリウ
マチ因子（以下ＲＦとする）等の非特異反応物質の存在
により大きく影響し、被検出物質の測定結果に大きな誤
差を生じていることが知られている。

【０００７】この解決方法としては、ＲＦ等非特異反応
物質の抗体との反応が、抗体分子のＦｃ部分で起こるこ
とが知られていることより、抗原検出の場合は、不溶性
担体に支持する抗体として、酵素（ペプシンやパパイン
等）により限定分解し非特異反応部位であるＦｃ部分を
実質的に含まないＦ（ａｂ′）₂抗体、Ｆａｂ′抗体、
Ｆａｂ抗体を使用する方法（特公昭６３−３８６６８号
公報他）が、ヒト検体中のＲＦ等の影響の解決方法とし
て提案されている。又、別の解決方法として、検体中の
非特異反応物質を、動物（ヒト、ウサギ、ヤギ等）の変
性γ−グロブリンでマスクする方法が特公昭６１−９４
２号等により提案されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかし、Ｆｃ部分を実
質的に含まないＦ（ａｂ′）₂抗体、Ｆａｂ′抗体、Ｆ
ａｂ抗体を使用する方法（特公昭６３−３８６６８号公
報他）は、この様な抗体の調整や精製のために、抗体の
酵素分解やカラムクロマトグラフィー等による煩雑な操
作と多くの時間を必要となる。又、それによって作られ
る試薬はかなり高価なものとなるという問題があった。

【０００９】又、検体中の非特異反応物質を、動物（ヒ
ト、ウサギ、ヤギ等）の熱変性γ−グロブリンでマスク
する方法（特公昭６１−６４２号公報等）では、Ｆｃ部
分を実質的に含まない抗体を用いる方法に比べ、γ−グ
ロブリンの酵素分解等による調整や精製も必要としない
で、試薬化も容易で安価な利点を有する、しかし、非特
異反応の影響を完全に回避するのは困難であり、効果が
期待できないという問題を有していた。本発明は、これ
らの課題を解決し、煩雑な抗体の調整を必要とせず、特
異的且つ効果的な免疫学的検出方法に関するものであ
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、ヒト
体液検体中の抗原又は抗体の検出方法であって、前記抗
原又は抗体と免疫学的反応を生じる抗体又は抗原を反応
させるに先立ち、予め検体をヒトリウマチ因子（ＲＦ）
の反応部位に結合能を有する動物由来抗体の十分量で前
処理して、検体中のヒトＲＦに起因する非特異的反応を
減少させることを特徴とする免疫学的検出方法に関す
る。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１１】『ヒトＲＦの反応部位に結合能を有する動
物由来抗体』とは、ヒトＲＦの反応（結合）部位、即
ち、ＲＦのＦａｂ部分に結合できる動物由来の抗体であ
る。動物由来の抗体として、一般に、ヤギ、ウサギ、ヒ
ツジ、ニワトリ、マウス、ウシ、ウマ、サル等の動物か
ら公知の方法に従って得られるポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体などが使用できる。上記動物にヒトＲ
Ｆを免疫してえられた抗ヒトＲＦ抗体は、抗原検査及び
抗体検査の両方に使用できる。又、抗原検査の場合は、
ヒト免疫グロブリンのＦａｂ部分に対し向けられた動物
由来の抗体で、例えば、抗ヒト免疫グロブリンＦａｂ抗
体や、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆａｂ特異的）、抗ヒトＩｇ
Ａ抗体（Ｆａｂ特異的）、抗ヒトＩｇＭ抗体（Ｆａｂ特
異的）等の単独物又は混合物が使用できる。

【００１２】本発明の方法における、検出する抗原又は
抗体の反応に先立った前処理に使用される反応媒体とし
ては、水性媒体、好ましくは生理的なＮａＣｌ濃度
（０．１〜０．２Ｍ／ｌ）とｐＨ（６〜９）の緩衝液が
使用され、一般に、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、グリ
シン緩衝液、トリス〔トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン〕塩酸緩衝液、アンモニア緩衝液等が用いられ
る。これらの緩衝液には、引き続き行われる検出する抗
原又は抗体の反応を妨害しない範囲で、適宜、安定化
剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤等の添加物を選択
し含有させることが出来る。

【００１３】又、前処理における反応媒体中、反応を短
時間で完結させるため、通常の抗原抗体反応と同様に、
適宜、適当量の抗原抗体反応の反応促進剤を添加し含有
させることもできる。抗原抗体反応の反応促進剤として
は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピ
ロリドン（ＰＶＰ）、ポリリジン等が用いられる。

【００１４】本発明に使用する上記の『ヒトＲＦの反応
部位に結合能を有する動物由来抗体』は、上記の反応媒
体に溶解され、その使用量は非特異的反応を減少させる
のに十分な量が必要であり、使用する抗体の力価や検出
方法により、適宜、至適濃度を選択しなければならな
い。一般的には、検体中のヒトＲＦ活性を充分に抑制で
きる量で、多い分には効果的には問題ないが試薬のコス
トがかかり経済性を損なう。少な過ぎると、高濃度のヒ
トＲＦ活性を充分に抑制できなくなり、本発明の効果を
充分に発揮出来なくなる。

【００１５】本発明の方法における、目的とする検体中
の抗原又は抗体の反応の検出は、周知の方法により行う
ことができる。反応系は、検体とその反応の相手（対応
する抗体又は抗原を含む試薬）を共に可溶性の液相系と
する場合と、その反応の相手（対応する抗体又は抗原）
が実質的に不溶性の担体粒子に支持（感作）された固相
系とする二つの場合に大別される。本発明の方法を用い
ることができる検出の対象物（被検出物）としては、Ｒ
Ｆ以外のヒト検体中（血中、尿中）の種々の生体物質、
例えば、血漿蛋白や種々の凝固線溶系の蛋白、ホルモン
や薬物、各種細菌、クラミジア、ウイルス等やこれらの
抗体が挙げられ、勿論、これ以外にも、抗原、抗体にな
りえるものが適用できる。

【００１６】一例として、固相系の不溶性担体粒子を用
いる凝集反応の場合について説明するが、当然、本発明
は、これに限定されるものではない。固相系の不溶性担
体粒子としては、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン
共重合体のような有機高分子のラテックスやシリカ、ア
ルミナのような無機酸化物等が用いられる。その平均粒
径は、通常０．０５〜１．０μｍの範囲が用いられる。
目視により結果を判定する場合は、比較的大きい粒子
（０．７μｍ以上）が好ましい。光学的装置を用いる検
出法に於いては、比較的小さい粒子（０．５μｍ以下）
の使用が好ましく、担体の粒径が大きすぎると免疫学的
反応前の試薬自体の光学的強度が高すぎて測定が困難と
なりやすく、小さすぎると感度が低くなる傾向にある。
抗原又は抗体の支持（感作）は周知の方法により行うこ
とができる。

【００１７】被検出物と免疫学的反応を生じる抗体又は
抗原で感作された不溶性担体粒子は、免疫学的反応時ま
で媒体分散液として保持されるが、その際は、媒体中に
０．１〜１．０重量％の濃度になるように分散しておく
のが保存の面で好ましく、一般的に使用しやすい。また
この媒体中に適宜、牛血清アルブミン、ＮａＣｌ等の添
加剤を溶解させてもよい。また、感作された不溶性担体
粒子は、免疫学的反応時には、媒体中に適宜の濃度で分
散され使用されるが、光学的強度測定の容易さから濃度
が０．５重量％以下になるようにして使用されるのが好
ましく、感度の点から０．０１重量％以上が好ましい。
この際には、前記媒体中、必要に応じ牛血清アルブミ
ン、ＮａＣｌ等を溶解した液（希釈液）を液量調整のた
めに使用してもよい。

【００１８】次に、実際の定量の方法について詳述す
る。まず、検出しようとする抗原又は抗体を含む検体と
予め『ヒトＲＦの反応（結合）部位に結合能を有する動
物由来抗体』を含有する液体媒体中とを混合後撹拌し、
混合後５秒〜１５分間インキュベーションした後、検出
しようとする抗原又は抗体と免疫学的反応を生じる抗体
又は抗原を感作した不溶性担体粒子の媒体分散液を混合
撹拌し免疫学的反応をさせ、混合後少なくとも２点以上
の時点の光学的強度を測定するか、又は該免疫学的反応
前の光学的強度Ａ１を測定後、次に上記の検出しようと
する抗原又は抗体と免疫学的反応を生じる抗体又は抗原
を感作した不溶性担体粒子の媒体分散液を混合撹拌し免
疫反応させ、混合後５秒〜１５分間インキュベーション
した後、光学的強度Ａ２を測定する。この反応は２０〜
４０℃で行うのが好ましく、反応は恒温にするのが好ま
しい。反応時の温度がこの範囲を外れると抗原−抗体反
応が不安定になりやすい。更に、この反応はそれぞれ混
合後５秒〜１５分間行われるのが好ましいが、特に１０
秒〜５分間行われるのが好ましい。５秒未満では上記反
応が不十分となりやすく、１５分を超えると迅速の利点
を損なう。

【００１９】又、光学的強度とは、吸収度又は散乱光強
度を意味するが吸光度の方が好ましい。測定波長は、通
常４００〜１２００nmの範囲から適宜選択される。測定
波長が１２００nmを超えると、感度が低下する傾向にあ
り、測定波長が４００nm未満であると媒体分散液自体の
光学的強度が大きくなり、測定範囲が狭くなる。

【００２０】

【実施例】以下に、実施例より本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれによって限定されるものではな
い。実施例１血清中のＣＲＰの検出抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス試薬を用いて本発明の
効果を確認した。１）試薬等の調整ａ．リン酸緩衝液（ＰＢＳ）りん酸二ナトリウム（二水和物）、りん酸一ナトリウム
（二水和物）、塩化ナトリウムより、０．０２Ｍリン
酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（以下、ＰＢＳと
略する）を調整（ｐＨ７．３）した。ｂ．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ上記、ＰＢＳに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を１％（ｗ
／ｖ）になるように溶解し調整した。ｃ．前処理用希釈液（前処理検討の対照用液）上記、１％ＢＳＡ−ＰＢＳの１５ml中に、ポリエチレン
グリコール６０００の０．４５ｇ（最終濃度３ｗ／ｖ
％）を含有する緩衝液。ｄ．前処理用抗ヒトＲＦ抗体液１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．３）の１５ml中に、抗ヒ
トＲＦ抗体８．３mg（マウス由来モノクロナル抗ＲＦ、
ＩｇＭ画分；ＢＩＯＤＥＳＩＧＮＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯ
ＮＡＬ社）及びポリエチレングリコール６０００の０．
４５ｇ（最終濃度３ｗ／ｖ％）を含有する緩衝液。ｅ．前処理用抗ヒト免疫グロブリンＦａｂ抗体液１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．３）の１５ml中に、抗ヒ
ト免疫グロブリンＦａｂ抗体１１．１mg（ヤギ由来ポリ
クロナル抗ヒトＦａｂ、ＩｇＧ画分；ＩＮＣＳＴＡＲ
ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）及びポリエチレングリコール
６０００の０．４５ｇ（最終濃度３ｗ／ｖ％）を含有す
る緩衝液。ｆ．前処理用抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ抗体混合液１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．３）の１５ml中に、抗ヒ
トＩｇＧ抗血清８．１mg（ヤギ由来ポリクロナル抗ヒト
ＩｇＧ抗体、ＩｇＧとして；オリエンタル酵母）、抗ヒ
トＩｇＡ抗血清２．４mg（ヤギ由来ポリクロナル抗ヒト
ＩｇＧ抗体、ＩｇＧとして；オリエンタル酵母）、抗ヒ
トＩｇＭ抗血清０．４mg（ヤギ由来ポリクロナル抗ヒト
ＩｇＤ抗体、ＩｇＧとして；オリエンタル酵母及びポリ
エチレングリコール６０００の０．４５ｇ（最終濃度３
ｗ／ｖ％）を含有する緩衝液。

【００２１】ｇ．抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス試薬ヒトＣＲＰを家兎に免疫し得られた抗ヒトＣＲＰ抗血清
から硫安塩析法及びイオン交換法クロマト（ＤＥＡＥ３
２）法により、ＩｇＧ画分抗体を得、ＰＢＳに対し透析
した抗ヒトＣＲＰ抗体液（１mg／ml）の５mlと１０％ラ
テックス粒子（日本合成ゴム（株）社；０．１２μｍ；
ＳＦＬ２０１Ａ−４）懸濁液の５mlとを混合し１２０分
間反応させ、反応後１５０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間
冷却遠心分離し次いで１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液に分散さ
せ上清を冷却遠心分離により除去（未吸着の抗ヒトＣＲ
Ｐ抗体）し、沈渣ペレットのラテックスを１％ＢＳＡ−
ＰＢＳ溶液に懸濁し抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックスと
した。ｈ．抗ヒトＣＲＰ−Ｆ（ａｂ′）₂抗体感作ラテックス
試薬上記ｇ．により得られたＩｇＧ画分抗体を得、Ａ．Ｎｉ
ｓｏｎｏｆｆら、Arch.Biochem.Biophys.,89,230(1960)
の変法によりペプシン消化し、ｓｈｅｐｈａｃｒｙｌＳ
−２００ＨＲ（ファルマシア社）のゲル濾過により精製
した抗ヒトＣＲＰ−Ｆ（ａｂ′）₂抗体液（１mg／ml）
の５mlと１０％ラテックス粒子（日本合成ゴム（株）
社；０．１２μｍ；ＳＦＬ２０１Ａ−４）懸濁液の５ml
とを混合し１２０分間反応させ、反応後１５０００ｒ．
ｐ．ｍ．、３０分間冷却遠心分離し次いで１％ＢＳＡ−
ＰＢＳ溶液に分散させ上清を冷却遠心分離により除去
（未吸着の抗ヒトＣＲＰ抗体）し、沈渣ペレットのラテ
ックスを１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液に懸濁し抗ヒトＣＲＰ
抗体感作ラテックスとした。

【００２２】２）血清中のＣＲＰ測定（自動分析装置）高いＲＦ測定値を示す患者検体６例につき、日立７１５
０形自動分析装置（（株）日立製作所製）により測定し
た。分析条件は、以下の通りである。検体１５μｌを各
前処理用の検討液毎に（上記ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）の
４試薬）２５０μｌを反応セル中に分注撹拌し５分間恒
温（３７℃反応）後、各反応セル中に抗ヒトＣＲＰ抗体
感作ラテックス試薬の２５０μｌを分注撹拌後約１分と
約５分目の吸光度（波長５７０nm）差を自動的に測定し
た。予め、各前処理検討の測定系毎に既知濃度の標準品
０．００、０．２５、０．５０、１．００、２．００mg
／dlの計５濃度につき測定し、ＣＲＰ濃度と反応の吸光
度差との関係（検量曲線）を調べた。同様に被検検体の
反応の吸光度差を求め上記検量曲線からＣＲＰ濃度を検
定値として求めた。結果を表１に示した。

【００２３】

【表１】以上の結果は、前処理なしの対照系に比較し、明らかに
検体Ｎｏ．４及び６の偽陽性が前処理によって陰性化し
非特異的反応を減少させていることを示している。

【００２４】

【発明の効果】本発明の検出方法によれば、煩雑な抗体
の調整を必要とせず、ＲＦの影響の少ない特異的な免疫
学的反応の検出ができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山木光男茨城県日立市東町四丁目13番１号日立化成工業株式会社医薬品研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト体液検体中の抗原又は抗体の検出方
法であって、前記抗原又は抗体と免疫学的反応を生じる
抗体又は抗原を反応させるに先立ち、予め検体をヒトリ
ウマチ因子（ＲＦ）の反応部位に結合能を有する動物由
来抗体の十分量で前処理して、検体中のヒトＲＦに起因
する非特異的反応を減少させることを特徴とする免疫学
的検出方法。
【請求項２】動物由来抗体として抗ヒトＲＦ抗体を用
いる請求項１記載の免疫学的検出方法。
【請求項３】動物由来抗体として抗ヒト免疫グロブリ
ンＦａｂ抗体を用いる請求項１記載の免疫学的検出方
法。
【請求項４】動物由来抗体として抗ヒトＩｇＧ抗体、
抗ヒトＩｇＡ抗体及び／又は抗ヒトＩｇＭ抗体を用いる
請求項１記載の免疫学的検出方法。
【請求項５】検体中の抗原又は抗体に対応する抗体又
は抗原が不溶性担体粒子に支持されており、検出方法が
その反応により生じる凝集の度合を光学的強度から求め
ることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の免
疫学的検出方法。
【請求項６】光学的強度が吸光度である請求項７記載
の免疫学的検出方法。