JPH07118168A - ＩｇＥ産生抑制剤 - Google Patents
ＩｇＥ産生抑制剤Info
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- JPH07118168A JPH07118168A JP5261355A JP26135593A JPH07118168A JP H07118168 A JPH07118168 A JP H07118168A JP 5261355 A JP5261355 A JP 5261355A JP 26135593 A JP26135593 A JP 26135593A JP H07118168 A JPH07118168 A JP H07118168A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
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- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、ヒトＩｇＥとの結合が可能な蛋
白、具体的には高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖や
ヒトＩｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ
受容体α鎖可溶性断片を有効成分とするＩｇＥ産生抑制
剤である。 【効果】 本発明により、アレルギー反応をその根源に
おいて遮断する臨床上有用なＩｇＥ産生抑制剤が提供さ
れる。
白、具体的には高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖や
ヒトＩｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ
受容体α鎖可溶性断片を有効成分とするＩｇＥ産生抑制
剤である。 【効果】 本発明により、アレルギー反応をその根源に
おいて遮断する臨床上有用なＩｇＥ産生抑制剤が提供さ
れる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＩｇＥとの結合が
可能なペプチドの新規用途に関する。より詳細には、高
親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖（ＦｃεＲＩα）や
ヒトＩｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ
受容体α鎖可溶性断片（ｓＦｃεＲＩα）からなるＩｇ
Ｅ産生抑制剤に関する。
可能なペプチドの新規用途に関する。より詳細には、高
親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖（ＦｃεＲＩα）や
ヒトＩｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ
受容体α鎖可溶性断片（ｓＦｃεＲＩα）からなるＩｇ
Ｅ産生抑制剤に関する。
【０００２】
【従来技術】末梢リンパ系組織（脾臓、リンパ節）に存
在するＢ細胞は、表面に免疫グロブリン（Ｉｇ）を保有
しており、これが抗原特異的レセプターになっている。
Ｂ細胞は抗原の刺激により抗体産生細胞に分化するが、
このとき、ヘルパーＴ細胞の助けを必要とするもの（Ｔ
依存性抗体産生）としないもの（Ｔ非依存性抗体産生）
があり、おのおのの反応をひき起こす抗原の種類が異な
っており、これらに反応するＢ細胞もサブセットに分け
ることができると考えられる。Ｂ細胞が抗体産生細胞に
分化すると、例えば、ＩｇＥ抗体等が産生される。
在するＢ細胞は、表面に免疫グロブリン（Ｉｇ）を保有
しており、これが抗原特異的レセプターになっている。
Ｂ細胞は抗原の刺激により抗体産生細胞に分化するが、
このとき、ヘルパーＴ細胞の助けを必要とするもの（Ｔ
依存性抗体産生）としないもの（Ｔ非依存性抗体産生）
があり、おのおのの反応をひき起こす抗原の種類が異な
っており、これらに反応するＢ細胞もサブセットに分け
ることができると考えられる。Ｂ細胞が抗体産生細胞に
分化すると、例えば、ＩｇＥ抗体等が産生される。
【０００３】ヒトＩｇＥはアレルギー反応を担う免疫グ
ロブリンであり、抗ＩｇＥ血症として、気管支喘息、花
粉症、アトピー性皮膚炎、非アレルギー性の木村氏病、
その他の肺疾患に関連するもの、自己免疫疾患に関する
ものなどがあり、臨床上大きな問題となっている。
ロブリンであり、抗ＩｇＥ血症として、気管支喘息、花
粉症、アトピー性皮膚炎、非アレルギー性の木村氏病、
その他の肺疾患に関連するもの、自己免疫疾患に関する
ものなどがあり、臨床上大きな問題となっている。
【０００４】免疫グロブリンには、抗原結合部位を形成
するＦａｂ部分と対応する受容体と結合するＦｃ部分が
あり、ＩｇＥは肥満細胞や好塩基球とこのＦｃ部分で結
合するので、細胞親和性抗体（cytotrophic antibody）
と言われている。高親和性免疫グロブリンＥ受容体（Ｆ
ｃεＲＩ）は、肥満細胞、好塩基球などの細胞表面に発
現されており、高親和性（Ｋａ＝109 〜1010M -1）をも
ってＩｇＥのＦｃ部分と特異的に結合する糖蛋白分子で
ある。ＦｃεＲＩに結合したＩｇＥに、対応する多価抗
原が結合すると、細胞が活性化されて脱顆粒（degranul
ation ）が起こり、その結果、ヒスタミン、セトロニ
ン、ＳＲＳ−Ａ（スロー リアクティングサブスタンス
オブ アナフィラキシー，Slow Reacting Substance
of Anaphylaxis）などの生理活性物質が放出される。こ
れらは血管透過性の亢進、平滑筋収縮、粘液分泌亢進
等、いわゆるＩ型特有のアレルギー疾患をひき起こす。
するＦａｂ部分と対応する受容体と結合するＦｃ部分が
あり、ＩｇＥは肥満細胞や好塩基球とこのＦｃ部分で結
合するので、細胞親和性抗体（cytotrophic antibody）
と言われている。高親和性免疫グロブリンＥ受容体（Ｆ
ｃεＲＩ）は、肥満細胞、好塩基球などの細胞表面に発
現されており、高親和性（Ｋａ＝109 〜1010M -1）をも
ってＩｇＥのＦｃ部分と特異的に結合する糖蛋白分子で
ある。ＦｃεＲＩに結合したＩｇＥに、対応する多価抗
原が結合すると、細胞が活性化されて脱顆粒（degranul
ation ）が起こり、その結果、ヒスタミン、セトロニ
ン、ＳＲＳ−Ａ（スロー リアクティングサブスタンス
オブ アナフィラキシー，Slow Reacting Substance
of Anaphylaxis）などの生理活性物質が放出される。こ
れらは血管透過性の亢進、平滑筋収縮、粘液分泌亢進
等、いわゆるＩ型特有のアレルギー疾患をひき起こす。
【０００５】ＩｇＥの産生を抑制する物質としては尿素
変性抗原が知られている。尿素変性抗原は、サプレッサ
ーＴ細胞を増加させてヘルパーＴ細胞の機能を抑制し、
Ｂ細胞が抗体産生細胞に分化するのを阻害し、その結果
としてＩｇＥ抗体産生反応を低下させる作用を有するも
のである。このようなＩｇＥ産生抑制物質のその他の例
として、代表的には、トシル酸スプラタスト等が挙げら
れる。しかし、これらのＩｇＥ産生抑制物質には副作用
がある等の問題があり、実用化には到っていない。
変性抗原が知られている。尿素変性抗原は、サプレッサ
ーＴ細胞を増加させてヘルパーＴ細胞の機能を抑制し、
Ｂ細胞が抗体産生細胞に分化するのを阻害し、その結果
としてＩｇＥ抗体産生反応を低下させる作用を有するも
のである。このようなＩｇＥ産生抑制物質のその他の例
として、代表的には、トシル酸スプラタスト等が挙げら
れる。しかし、これらのＩｇＥ産生抑制物質には副作用
がある等の問題があり、実用化には到っていない。
【０００６】本発明者らは、Ｉ型特有のアレルギー疾患
の予防・治療剤として、Ｉ型アレルギー反応の発現機序
の発端である肥満細胞や好塩基球の細胞膜上で、高親和
性をもってＩｇＥのＦｃ部分と特異的に結合してＦｃε
ＲＩへのＩｇＥの結合を阻害するペプチドを開発した。
このペプチドは、ＩｇＥとの結合が可能であるが、この
ペプチドがＢ細胞に直接作用してＢ細胞におけるＩｇＥ
の産生を抑制する作用については、これまで知られてい
なかった。
の予防・治療剤として、Ｉ型アレルギー反応の発現機序
の発端である肥満細胞や好塩基球の細胞膜上で、高親和
性をもってＩｇＥのＦｃ部分と特異的に結合してＦｃε
ＲＩへのＩｇＥの結合を阻害するペプチドを開発した。
このペプチドは、ＩｇＥとの結合が可能であるが、この
ペプチドがＢ細胞に直接作用してＢ細胞におけるＩｇＥ
の産生を抑制する作用については、これまで知られてい
なかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｉｇ
Ｅの産生を抑制してＩ型特有のアレルギー反応をその根
源において遮断する、臨床上有用なＩｇＥ産生抑制剤を
提供することにある。
Ｅの産生を抑制してＩ型特有のアレルギー反応をその根
源において遮断する、臨床上有用なＩｇＥ産生抑制剤を
提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ヒトＩｇＥと
の結合が可能なペプチドを予防的に投与することによ
り、ＩｇＥの産生を抑制し、Ｉ型特有のアレルギー疾患
の発症を抑制することができること、又、この疾患が起
こってからでもヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドを
投与すればＩｇＥの産生が抑制されることによりその症
状が改善される可能性を見出した。
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ヒトＩｇＥと
の結合が可能なペプチドを予防的に投与することによ
り、ＩｇＥの産生を抑制し、Ｉ型特有のアレルギー疾患
の発症を抑制することができること、又、この疾患が起
こってからでもヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドを
投与すればＩｇＥの産生が抑制されることによりその症
状が改善される可能性を見出した。
【０００９】本発明は、かかる新知見に基づいて完成さ
れたものであり、ヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチド
を有効成分とするＩｇＥ産生抑制剤に関する。
れたものであり、ヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチド
を有効成分とするＩｇＥ産生抑制剤に関する。
【００１０】本発明において、ヒトＩｇＥとの結合が可
能なペプチドとは、ヒトＩｇＥに特異的に結合し、その
機能を阻害するペプチドをいう。具体的には、高親和性
免疫グロブリンＥ受容体α鎖（ＦｃεＲＩα）やヒトＩ
ｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ受容体
α鎖可溶性断片（ｓＦｃεＲＩα）を含むペプチドが挙
げられる。
能なペプチドとは、ヒトＩｇＥに特異的に結合し、その
機能を阻害するペプチドをいう。具体的には、高親和性
免疫グロブリンＥ受容体α鎖（ＦｃεＲＩα）やヒトＩ
ｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ受容体
α鎖可溶性断片（ｓＦｃεＲＩα）を含むペプチドが挙
げられる。
【００１１】ＦｃεＲＩはα鎖、β鎖及びジスルフィド
結合した２個のγ鎖のサブユニットから成る４量体構造
をした糖蛋白質であり、ＩｇＥとの高親和性結合にはα
鎖の細胞外領域のみが関与していることが明らかにされ
ている〔Blank. U et al., J. Biol. Chem., 266, 2639
（1991）〕。
結合した２個のγ鎖のサブユニットから成る４量体構造
をした糖蛋白質であり、ＩｇＥとの高親和性結合にはα
鎖の細胞外領域のみが関与していることが明らかにされ
ている〔Blank. U et al., J. Biol. Chem., 266, 2639
（1991）〕。
【００１２】ＦｃεＲＩαは上記ＦｃεＲＩのα鎖のこ
とであり、ｓＦｃεＲＩαはα鎖の細胞外領域に相当す
る。本発明に用いられるヒトＩｇＥとの結合が可能なペ
プチドは、少なくともα鎖の細胞外領域、即ちｓＦｃε
ＲＩαを含んでいればよいのであって、ＦｃεＲＩαを
用いても、ＦｃεＲＩ自体を用いてもなんら問題はな
い。また、遺伝子工学的手法により人工的に改変された
変異体やＤＤＳ化された誘導体、例えばアルブミンのコ
ンジュゲートであっても、ヒトＩｇＥとの結合が可能な
ものであれば用い得るが、特にｓＦｃεＲＩαが好まし
い。また、これらはヒト由来のものが好ましい。
とであり、ｓＦｃεＲＩαはα鎖の細胞外領域に相当す
る。本発明に用いられるヒトＩｇＥとの結合が可能なペ
プチドは、少なくともα鎖の細胞外領域、即ちｓＦｃε
ＲＩαを含んでいればよいのであって、ＦｃεＲＩαを
用いても、ＦｃεＲＩ自体を用いてもなんら問題はな
い。また、遺伝子工学的手法により人工的に改変された
変異体やＤＤＳ化された誘導体、例えばアルブミンのコ
ンジュゲートであっても、ヒトＩｇＥとの結合が可能な
ものであれば用い得るが、特にｓＦｃεＲＩαが好まし
い。また、これらはヒト由来のものが好ましい。
【００１３】ｓＦｃεＲＩαは細胞培養手法や遺伝子工
学的手法により製造が可能である。Ｂｌａｎｋ．Ｕらは
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞を用
いてｓＦｃεＲＩαを発現することに成功している（上
記文献）。
学的手法により製造が可能である。Ｂｌａｎｋ．Ｕらは
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞を用
いてｓＦｃεＲＩαを発現することに成功している（上
記文献）。
【００１４】本発明者らも、（１）動物細胞での発現を
制御できるプロモーターを上流部に付加したｓＦｃεＲ
Ｉα遺伝子及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを付
加したＤＨＦＲ遺伝子を組み込んでなるプラスミドを用
いて形質転換させた動物細胞、（２）動物細胞での発現
を制御できるプロモーターを上流部に付加したｓＦｃε
ＲＩα遺伝子をコードするＤＮＡを担持させたプラスミ
ド及びＵＫプロモーターを上流部に付加したＤＨＦＲを
コードするＤＮＡを担持させたプラスミドを同時に用い
て形質転換させた動物細胞、（３）上記（１）または
（２）の動物細胞を培養することによるｓＦｃεＲＩα
の大量製造方法を確立している（後記製造例参照）。
制御できるプロモーターを上流部に付加したｓＦｃεＲ
Ｉα遺伝子及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを付
加したＤＨＦＲ遺伝子を組み込んでなるプラスミドを用
いて形質転換させた動物細胞、（２）動物細胞での発現
を制御できるプロモーターを上流部に付加したｓＦｃε
ＲＩα遺伝子をコードするＤＮＡを担持させたプラスミ
ド及びＵＫプロモーターを上流部に付加したＤＨＦＲを
コードするＤＮＡを担持させたプラスミドを同時に用い
て形質転換させた動物細胞、（３）上記（１）または
（２）の動物細胞を培養することによるｓＦｃεＲＩα
の大量製造方法を確立している（後記製造例参照）。
【００１５】ｓＦｃεＲＩαの遺伝子工学的手法による
製造は上記動物細胞を用いる方法のほか大腸菌や酵母を
用いる方法で製造してもよい。
製造は上記動物細胞を用いる方法のほか大腸菌や酵母を
用いる方法で製造してもよい。
【００１６】本発明のヒトＩｇＥとの結合が可能なペプ
チドからなるＩｇＥ産生抑制剤は、気管支喘息、花粉
症、アトピー性皮膚炎、非アレルギー性の木村氏病、そ
の他の肺疾患に関連するもの、自己免疫疾患に関するも
の等の抗ＩｇＥ血症等の患者に対して、全身療法、局所
療法いずれにおいても適用可能である。
チドからなるＩｇＥ産生抑制剤は、気管支喘息、花粉
症、アトピー性皮膚炎、非アレルギー性の木村氏病、そ
の他の肺疾患に関連するもの、自己免疫疾患に関するも
の等の抗ＩｇＥ血症等の患者に対して、全身療法、局所
療法いずれにおいても適用可能である。
【００１７】全身療法における投与方法としては、例え
ば、注射用生理食塩水や注射用蒸留水に溶解して非経口
投与、好ましくは静脈内投与される。剤型としては、液
状製剤や凍結乾燥製剤が挙げられ、これらは公知の方法
で調製できる。
ば、注射用生理食塩水や注射用蒸留水に溶解して非経口
投与、好ましくは静脈内投与される。剤型としては、液
状製剤や凍結乾燥製剤が挙げられ、これらは公知の方法
で調製できる。
【００１８】局所療法における投与方法としては、皮膚
や粘膜（気管支粘膜、鼻粘膜、眼粘膜）などの局所に投
与できる剤型、例えば、スプレー剤、点眼剤、点鼻剤、
軟膏剤として投与される。具体的には、スプレー剤の場
合は、本発明に用いられるヒトＩｇＥとの結合が可能な
ペプチドを適切なる溶媒に溶解して公知の方法で調製
し、噴霧器に充填し、例えばエアロゾルとして通常の吸
入療法により投与される。点眼剤、点鼻剤は、注射用蒸
留水に有効成分としてヒトＩｇＥとの結合が可能なペプ
チドを溶解し、必要に応じ助剤として、緩衝液、等張化
剤、増粘剤、保存剤、安定剤、界面活性剤、防腐剤等を
加え、ｐＨを４〜９に調製することにより得られる。噴
霧用点鼻剤は例えば特開昭６３−１０１３１８号公報に
記載の方法で調製できる。
や粘膜（気管支粘膜、鼻粘膜、眼粘膜）などの局所に投
与できる剤型、例えば、スプレー剤、点眼剤、点鼻剤、
軟膏剤として投与される。具体的には、スプレー剤の場
合は、本発明に用いられるヒトＩｇＥとの結合が可能な
ペプチドを適切なる溶媒に溶解して公知の方法で調製
し、噴霧器に充填し、例えばエアロゾルとして通常の吸
入療法により投与される。点眼剤、点鼻剤は、注射用蒸
留水に有効成分としてヒトＩｇＥとの結合が可能なペプ
チドを溶解し、必要に応じ助剤として、緩衝液、等張化
剤、増粘剤、保存剤、安定剤、界面活性剤、防腐剤等を
加え、ｐＨを４〜９に調製することにより得られる。噴
霧用点鼻剤は例えば特開昭６３−１０１３１８号公報に
記載の方法で調製できる。
【００１９】軟膏剤としては、ゲル軟膏剤が好ましく、
例えばカルボキシビニルポリマーをゲル化剤とし、水酸
化ナトリウム等の塩基性増粘化剤を用いて増粘させて得
られるゲル基材に有効成分としてヒトＩｇＥとの結合が
可能なペプチドを混合し、必要に応じて助剤を加え、ｐ
Ｈを４〜９に調製することにより得られる。
例えばカルボキシビニルポリマーをゲル化剤とし、水酸
化ナトリウム等の塩基性増粘化剤を用いて増粘させて得
られるゲル基材に有効成分としてヒトＩｇＥとの結合が
可能なペプチドを混合し、必要に応じて助剤を加え、ｐ
Ｈを４〜９に調製することにより得られる。
【００２０】本剤は予防的にも、対症療法的にも用いる
ことができる。投与量は疾患の種類や、患者の状態等に
より異なるが、予防的には約１００μｇ／ｋｇ以上、対
症療法的には約５００μｇ／ｋｇ以上の投与が例示され
る。また、他剤との併用も可能である。
ことができる。投与量は疾患の種類や、患者の状態等に
より異なるが、予防的には約１００μｇ／ｋｇ以上、対
症療法的には約５００μｇ／ｋｇ以上の投与が例示され
る。また、他剤との併用も可能である。
【００２１】
【作用・効果】本発明のヒトＩｇＥとの結合が可能なペ
プチドは、Ｔ依存性抗体産生性及びＴ非依存性抗体産生
性のいずれのＢ細胞においても、活性化Ｂ細胞の膜型Ｉ
ｇＥと結合して細胞内に取り込まれることにより、特異
的にＩｇＥ抗体の産生を抑制してＩ型特有のアレルギー
反応をその根源において遮断する。本発明により、臨床
上有用なＩｇＥ産生抑制剤が提供される。
プチドは、Ｔ依存性抗体産生性及びＴ非依存性抗体産生
性のいずれのＢ細胞においても、活性化Ｂ細胞の膜型Ｉ
ｇＥと結合して細胞内に取り込まれることにより、特異
的にＩｇＥ抗体の産生を抑制してＩ型特有のアレルギー
反応をその根源において遮断する。本発明により、臨床
上有用なＩｇＥ産生抑制剤が提供される。
【００２２】
【実施例】本発明をより詳細に説明するために参考例、
実施例、試験例を挙げるが、本発明はこれらによって何
ら制限されるものではない。
実施例、試験例を挙げるが、本発明はこれらによって何
ら制限されるものではない。
【００２３】参考例 ｓＦｃεＲＩαの製造 [Ｉ] ＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１の構築 [動物細胞での発現を制御できるプロモーター（ＳＶ４
０）を上流部に付加したヒトｓＦｃεＲＩαをコードす
るＤＮＡを組み込んで構成されるプラスミドの構築]Bla
nk らの報告[Blank. U et al., J. Biol. Chem. 266,
2639 (1991)] に従い、プラスミドｐｋｏ[Doren, K.V.
et al., J. Virol, 50, 606, (1984)] にヒトＦｃεＲ
Ｉαのリーダー配列−ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子を組み
込んだプラスミドＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１（図１）を構築
した。尚、ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子をコードするＤＮ
Ａ配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列はNuclei
c Acids Research, Volume 16 Number 8, 3584 (1988)
に開示されている。
０）を上流部に付加したヒトｓＦｃεＲＩαをコードす
るＤＮＡを組み込んで構成されるプラスミドの構築]Bla
nk らの報告[Blank. U et al., J. Biol. Chem. 266,
2639 (1991)] に従い、プラスミドｐｋｏ[Doren, K.V.
et al., J. Virol, 50, 606, (1984)] にヒトＦｃεＲ
Ｉαのリーダー配列−ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子を組み
込んだプラスミドＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１（図１）を構築
した。尚、ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子をコードするＤＮ
Ａ配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列はNuclei
c Acids Research, Volume 16 Number 8, 3584 (1988)
に開示されている。
【００２４】[II] ｐＴＴ０６の構築 [ＵＫプロモーターを上流部に付加したＤＨＦＲをコー
ドするＤＮＡを組み込んで構成されるなるプラスミドの
構築]Biosci. Biotech. Biochem., 56 (4), 600-604, 1
992に従い、ＵＫプロモーター，DHFRｃＤＮＡ, ＳＶ４
０ポリＡ付加シグナルを含むプラスミドｐＴＴ０６を構
築した（図２参照）。
ドするＤＮＡを組み込んで構成されるなるプラスミドの
構築]Biosci. Biotech. Biochem., 56 (4), 600-604, 1
992に従い、ＵＫプロモーター，DHFRｃＤＮＡ, ＳＶ４
０ポリＡ付加シグナルを含むプラスミドｐＴＴ０６を構
築した（図２参照）。
【００２５】[III] 動物細胞への導入および高産生細
胞の樹立 (i) 材料； ・プラスミドＤＮＡ ＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１：ｐｋｏにヒトＦｃεＲＩαのリ
ーダー配列−ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子を組み込んだプ
ラスミド。 ｐＴＴ０６：ＵＫプロモーター（ウロキナーゼ遺伝子転
写開始点を含む上流約８００ｂｐの５’調節領域）に支
配されるＤＨＦＲ遺伝子発現ユニットからなるプラスミ
ド。 ・細胞； ＣＨＯ ＤＸＢ−１１細胞株（ＤＨＦＲ欠損株） G. Urlaub et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 77,
4216-4220 (1980)に記載の方法で調製、増殖させた。 ・メトトレキセート（ＭＴＸ）；Sigma 社製（＋）Amet
hopterinを0.14 M NaCl, 0.02 M HEPES （ナカライテス
ク）に溶解し、２mMストック液を調製した。これを培地
に、目的の濃度になるように添加し使用した。
胞の樹立 (i) 材料； ・プラスミドＤＮＡ ＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１：ｐｋｏにヒトＦｃεＲＩαのリ
ーダー配列−ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子を組み込んだプ
ラスミド。 ｐＴＴ０６：ＵＫプロモーター（ウロキナーゼ遺伝子転
写開始点を含む上流約８００ｂｐの５’調節領域）に支
配されるＤＨＦＲ遺伝子発現ユニットからなるプラスミ
ド。 ・細胞； ＣＨＯ ＤＸＢ−１１細胞株（ＤＨＦＲ欠損株） G. Urlaub et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 77,
4216-4220 (1980)に記載の方法で調製、増殖させた。 ・メトトレキセート（ＭＴＸ）；Sigma 社製（＋）Amet
hopterinを0.14 M NaCl, 0.02 M HEPES （ナカライテス
ク）に溶解し、２mMストック液を調製した。これを培地
に、目的の濃度になるように添加し使用した。
【００２６】(ii) 方法 ＤＮＡ導入およびトランスフェクタント上清のアッ
セイ α変法イーグルＭＥＭ，10％FCS で継代しているDHFR欠
損CHO DXB-11細胞をトリプシン(0.25%) 処理によりディ
ッシュからはがし、107 cell/ml となるよう Hanks液に
懸濁した。この懸濁液0.5 ml，５×106 個の細胞にプラ
スミドＤＮＡ（１μｇのｐＴＴ０６と４０μｇのＦｃε
ＲＩ／ｐＭＴ１）を同時にエレクトロポレーション法に
より導入した。α変法イーグルＭＥＭ（リボ核酸・デオ
キシリボ核酸含まず），10％ＦＣＳで培養後、生じたコ
ロニーを拾いあげて順次拡大し、これらトランスフェク
タントの培養上清中のヒトｓＦｃεＲＩα活性を以下の
に記載の方法に従い測定し、高い活性が見られた株に
ついてＭＴＸによるＤＮＡ増幅を行った。
セイ α変法イーグルＭＥＭ，10％FCS で継代しているDHFR欠
損CHO DXB-11細胞をトリプシン(0.25%) 処理によりディ
ッシュからはがし、107 cell/ml となるよう Hanks液に
懸濁した。この懸濁液0.5 ml，５×106 個の細胞にプラ
スミドＤＮＡ（１μｇのｐＴＴ０６と４０μｇのＦｃε
ＲＩ／ｐＭＴ１）を同時にエレクトロポレーション法に
より導入した。α変法イーグルＭＥＭ（リボ核酸・デオ
キシリボ核酸含まず），10％ＦＣＳで培養後、生じたコ
ロニーを拾いあげて順次拡大し、これらトランスフェク
タントの培養上清中のヒトｓＦｃεＲＩα活性を以下の
に記載の方法に従い測定し、高い活性が見られた株に
ついてＭＴＸによるＤＮＡ増幅を行った。
【００２７】 ヒトｓＦｃεＲＩαの定量 ヒトｓＦｃεＲＩαの濃度は、ラット好塩基球細胞株上
に存在するＦｃεＲＩへの 125Ｉ標識マウスＩｇＥの結
合阻害で測定した。以下にその材料と方法を示す。 （材料） ・細胞；ラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３は、10％
ＦＣＳ、100U/ml ペニシリンおよび100 μg/mlストレプ
トマイシンを含むイーグルＭＥＭ中で培養した。 ・ＩｇＥ；抗ジニトロフェニルマウスモノクローナルＩ
ｇＥ(Hi-DNP-E-26-82)、または抗トリニトロフェニル
（ＴＮＰ）マウスモノクローナルＩｇＥを用いた。抗Ｔ
ＮＰマウスモノクローナルＩｇＥは、マウスハイブリド
ーマＩＧＥＬｂ４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ１４１）の
培養上清またはマウス腹水より精製した。 ・ＩｇＥのヨード標識；バイオラッド社製Enzymobeads
法を用いた。0.2 Ｍリン酸緩衝液 (pH7.2) 50 μｌ、マ
ウスモノクローナルＩｇＥ（2.14mg/ml) 10 μｌ、Enzy
mobeads 試薬50μｌ、Ｎａ 125Ｉ25μｌ（95MBq)、１％
β−Ｄグルコース水溶液25μｌを混和し、室温で15〜20
分間反応させた。150 μｌの10mg／ml チロシン、10％
グリセリンおよび0.1 ％キシレンシアノールを含むリン
酸緩衝生理的食塩水と混和した後、ＰＤ−１０カラム
（ファルマシア製）を用いたゲル濾過法にて蛋白を回収
した。 （方法） ＩｇＥ結合アッセイ； (1) ＣＨＯ細胞は、10％FCS 添加α変法イーグルＭＥ
Ｍ（リボ核酸・デオキシリボ核酸含まず）で維持するの
で、この培養液で希釈したサンプルを調製した（125-25
0 μｌ) 。 (2) ３％牛血清アルブミンおよび0.1 ％ NaN3 添加ダ
ルベッコリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ／３％ ＢＳ
Ａ）で希釈した 125Ｉ標識ＩｇＥを(1) のサンプルに添
加した。総体積は500 μｌで、 125Ｉ標識ＩｇＥの濃度
は100ng/mlである。この混合物を室温で３〜６時間イン
キュベートした。 (3) ＰＢＳ／３％ ＢＳＡ中に懸濁したＲＢＬ−２Ｈ
３細胞（３〜８×107 /ml)50 μｌを添加し、氷中で１
〜２時間インキュベートした。また、標識ＩｇＥの細胞
への非特異的吸着を調べるための非標識ＩｇＥ添加群で
は、前もって150μｌのＲＢＬ−２Ｈ３細胞懸濁液と15
μｌの2.1mg/ml非標識ＩｇＥを混和しておき、この混合
液55μｌを(2) の混合液に添加した。 (4) 1000rpm, ５分間遠心により細胞を沈澱させ、上清
を捨てた。 (5) 細胞を、ＰＢＳ／３％ ＢＳＡにて一度洗浄した
のち、結合した放射活性をガンマカウンターにて測定し
た。 (6) 添加物なしの放射活性として10% FCS 添加α変法
イーグルＭＥＭ（リボ核酸・デオキシリボ核酸含まず）
を加えた際のcpm を用い、以下の式に従い結合阻害率を
測定した。
に存在するＦｃεＲＩへの 125Ｉ標識マウスＩｇＥの結
合阻害で測定した。以下にその材料と方法を示す。 （材料） ・細胞；ラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３は、10％
ＦＣＳ、100U/ml ペニシリンおよび100 μg/mlストレプ
トマイシンを含むイーグルＭＥＭ中で培養した。 ・ＩｇＥ；抗ジニトロフェニルマウスモノクローナルＩ
ｇＥ(Hi-DNP-E-26-82)、または抗トリニトロフェニル
（ＴＮＰ）マウスモノクローナルＩｇＥを用いた。抗Ｔ
ＮＰマウスモノクローナルＩｇＥは、マウスハイブリド
ーマＩＧＥＬｂ４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ１４１）の
培養上清またはマウス腹水より精製した。 ・ＩｇＥのヨード標識；バイオラッド社製Enzymobeads
法を用いた。0.2 Ｍリン酸緩衝液 (pH7.2) 50 μｌ、マ
ウスモノクローナルＩｇＥ（2.14mg/ml) 10 μｌ、Enzy
mobeads 試薬50μｌ、Ｎａ 125Ｉ25μｌ（95MBq)、１％
β−Ｄグルコース水溶液25μｌを混和し、室温で15〜20
分間反応させた。150 μｌの10mg／ml チロシン、10％
グリセリンおよび0.1 ％キシレンシアノールを含むリン
酸緩衝生理的食塩水と混和した後、ＰＤ−１０カラム
（ファルマシア製）を用いたゲル濾過法にて蛋白を回収
した。 （方法） ＩｇＥ結合アッセイ； (1) ＣＨＯ細胞は、10％FCS 添加α変法イーグルＭＥ
Ｍ（リボ核酸・デオキシリボ核酸含まず）で維持するの
で、この培養液で希釈したサンプルを調製した（125-25
0 μｌ) 。 (2) ３％牛血清アルブミンおよび0.1 ％ NaN3 添加ダ
ルベッコリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ／３％ ＢＳ
Ａ）で希釈した 125Ｉ標識ＩｇＥを(1) のサンプルに添
加した。総体積は500 μｌで、 125Ｉ標識ＩｇＥの濃度
は100ng/mlである。この混合物を室温で３〜６時間イン
キュベートした。 (3) ＰＢＳ／３％ ＢＳＡ中に懸濁したＲＢＬ−２Ｈ
３細胞（３〜８×107 /ml)50 μｌを添加し、氷中で１
〜２時間インキュベートした。また、標識ＩｇＥの細胞
への非特異的吸着を調べるための非標識ＩｇＥ添加群で
は、前もって150μｌのＲＢＬ−２Ｈ３細胞懸濁液と15
μｌの2.1mg/ml非標識ＩｇＥを混和しておき、この混合
液55μｌを(2) の混合液に添加した。 (4) 1000rpm, ５分間遠心により細胞を沈澱させ、上清
を捨てた。 (5) 細胞を、ＰＢＳ／３％ ＢＳＡにて一度洗浄した
のち、結合した放射活性をガンマカウンターにて測定し
た。 (6) 添加物なしの放射活性として10% FCS 添加α変法
イーグルＭＥＭ（リボ核酸・デオキシリボ核酸含まず）
を加えた際のcpm を用い、以下の式に従い結合阻害率を
測定した。
【００２８】
【数１】
【００２９】 ＭＴＸによる導入遺伝子の増幅 で得られたヒトｓＦｃεＲＩα産生株を、５〜10×10
5 cells/dishとなるように10nM MTX含有選択培地８〜10
ml入り10cmディッシュに植え込んだ。約３日毎に培地交
換を行い、２〜４週間培養を続けていると充分な細胞数
の10nM MTX耐性細胞が得られるので、次の段階のＭＴＸ
濃度の培地に継代した。このように10nMMTX濃度からス
タートして50nM, 100nM, 200nM, 500nM,１μＭ，２μ
Ｍ，４μＭ，10μＭと順次ＭＴＸ濃度を上げて遺伝子増
幅を行った。
5 cells/dishとなるように10nM MTX含有選択培地８〜10
ml入り10cmディッシュに植え込んだ。約３日毎に培地交
換を行い、２〜４週間培養を続けていると充分な細胞数
の10nM MTX耐性細胞が得られるので、次の段階のＭＴＸ
濃度の培地に継代した。このように10nMMTX濃度からス
タートして50nM, 100nM, 200nM, 500nM,１μＭ，２μ
Ｍ，４μＭ，10μＭと順次ＭＴＸ濃度を上げて遺伝子増
幅を行った。
【００３０】 ヒトｓＦｃεＲＩα産生株のクローニ
ング でMTX の増幅を行ったヒトｓＦｃεＲＩα産生株のう
ちの幾つかについて限界希釈法によるクローニングを行
った。すなわち、各濃度のMTX 耐性細胞を10%FCSおよび
２〜10μM MTX を含むα変法イーグルＭＥＭ（リボ核酸
・デオキシリボ核酸含まず）中で培養し、96ウェルプレ
ートに播種した。増殖が観察されたウェルより細胞を回
収して24ウェルプレート、さらに10cmディッシュへ順次
拡大し、コンフルエントになった段階での上清中のヒト
ｓＦｃεＲＩα産生量を調べた。
ング でMTX の増幅を行ったヒトｓＦｃεＲＩα産生株のう
ちの幾つかについて限界希釈法によるクローニングを行
った。すなわち、各濃度のMTX 耐性細胞を10%FCSおよび
２〜10μM MTX を含むα変法イーグルＭＥＭ（リボ核酸
・デオキシリボ核酸含まず）中で培養し、96ウェルプレ
ートに播種した。増殖が観察されたウェルより細胞を回
収して24ウェルプレート、さらに10cmディッシュへ順次
拡大し、コンフルエントになった段階での上清中のヒト
ｓＦｃεＲＩα産生量を調べた。
【００３１】[IV] ヒトｓＦｃεＲＩαの精製 ヒトｓＦｃεＲＩαを比較的高く産生していたクローン
細胞株の培養上清983ml に、1/20容積の1mM Tris, pH8.
0 および10mMベンザミジン、10mMエチレンジアミン４酢
酸、0.02％アジ化ナトリウムを添加し、0.22μm のフィ
ルターで濾過した試料をＩｇＥ Sepharose 4Bカラム
〔マウスハイブリドーマIGELb4（ATCC No.TIB141)培養
上清から精製した抗トリニトロフェニルＩｇＥ10mgを0.
1M炭酸水素ナトリウム中で活性化CH Sepharose (Pharma
cia) 1g に結合させたもの〕を用いて精製した。カラム
を0.02％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄後、カラ
ムに結合した蛋白を0.2M酢酸、0.2M塩化ナトリウム、0.
02％アジ化ナトリウム、pH2.8 で溶出した。得られた精
製ヒトｓＦｃεＲＩαを10mM重炭酸アンモニウムに対し
て透析した後、200 μｌをSpeedVacで乾燥させ、ＳＤＳ
電気泳動で調べると、クーマジーブルー染色で還元およ
び非還元両方の条件下で分子量５０ｋＤａ付近に明確な
バンドが検出され、このバンド以外の蛋白は検出されな
かった。この蛋白はラジオイムノアッセイで放射性標識
ＩｇＥの好塩基球細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞；前出）へ
の結合を阻害する活性を有していた。かかる精製ヒトＦ
ｃεＲＩαの濃度は、Bradford法 [Bradford, M.M., An
al. Biochem. 72, 248(1976)] によって定量した。
細胞株の培養上清983ml に、1/20容積の1mM Tris, pH8.
0 および10mMベンザミジン、10mMエチレンジアミン４酢
酸、0.02％アジ化ナトリウムを添加し、0.22μm のフィ
ルターで濾過した試料をＩｇＥ Sepharose 4Bカラム
〔マウスハイブリドーマIGELb4（ATCC No.TIB141)培養
上清から精製した抗トリニトロフェニルＩｇＥ10mgを0.
1M炭酸水素ナトリウム中で活性化CH Sepharose (Pharma
cia) 1g に結合させたもの〕を用いて精製した。カラム
を0.02％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄後、カラ
ムに結合した蛋白を0.2M酢酸、0.2M塩化ナトリウム、0.
02％アジ化ナトリウム、pH2.8 で溶出した。得られた精
製ヒトｓＦｃεＲＩαを10mM重炭酸アンモニウムに対し
て透析した後、200 μｌをSpeedVacで乾燥させ、ＳＤＳ
電気泳動で調べると、クーマジーブルー染色で還元およ
び非還元両方の条件下で分子量５０ｋＤａ付近に明確な
バンドが検出され、このバンド以外の蛋白は検出されな
かった。この蛋白はラジオイムノアッセイで放射性標識
ＩｇＥの好塩基球細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞；前出）へ
の結合を阻害する活性を有していた。かかる精製ヒトＦ
ｃεＲＩαの濃度は、Bradford法 [Bradford, M.M., An
al. Biochem. 72, 248(1976)] によって定量した。
【００３２】実施例１ 注射剤およびスプレー剤用組成
物 精製ヒトｓＦｃεＲＩα１００ｍｇ及びブドウ糖１００
ｍｇを注射用蒸留水に溶解し、ヒトｓＦｃεＲＩαの濃
度が２ｍｇ／ｍｌになるように調製した。これを０．４
５μｍのメンブランフィルターで濾過後、濾液を無菌的
に５ｍｌバイアル瓶に分注し、チッソガスを充填した
後、密封して静脈内注射剤（スプレー剤用組成物）とし
た。
物 精製ヒトｓＦｃεＲＩα１００ｍｇ及びブドウ糖１００
ｍｇを注射用蒸留水に溶解し、ヒトｓＦｃεＲＩαの濃
度が２ｍｇ／ｍｌになるように調製した。これを０．４
５μｍのメンブランフィルターで濾過後、濾液を無菌的
に５ｍｌバイアル瓶に分注し、チッソガスを充填した
後、密封して静脈内注射剤（スプレー剤用組成物）とし
た。
【００３３】実施例２ 点眼剤 精製ヒトｓＦｃεＲＩα５００ｍｇ、ソルビトール５０
ｇおよびパラオキシ安息香酸メチル２０ｍｇを注射用蒸
留水に溶解し、リン酸緩衝液にてｐＨを６．５に調整
し、全量を１０００ｍｌとした。これを０．４５μｍの
メンブランフィルターで濾過後、濾液を無菌的に点眼瓶
に分注し、点眼剤とした。
ｇおよびパラオキシ安息香酸メチル２０ｍｇを注射用蒸
留水に溶解し、リン酸緩衝液にてｐＨを６．５に調整
し、全量を１０００ｍｌとした。これを０．４５μｍの
メンブランフィルターで濾過後、濾液を無菌的に点眼瓶
に分注し、点眼剤とした。
【００３４】実施例３ 点鼻剤 実施例２と同様にして点鼻剤を調製した。
【００３５】実施例４ 軟膏剤 カルボキシビニルポリマー（グッドリッチ社製、カーボ
ポール９４０）２％水溶液２５．０重量部に水酸化ナト
リウム２％水溶液２５重量部を攪拌しながら徐々に加
え、さらに攪拌してゲル状とした。これに精製ヒトｓＦ
ｃεＲＩα２重量部を適当量の精製水に溶かして加え、
さらに精製水を加え全量を１００重量部とし、均一に攪
拌して軟膏剤とした。
ポール９４０）２％水溶液２５．０重量部に水酸化ナト
リウム２％水溶液２５重量部を攪拌しながら徐々に加
え、さらに攪拌してゲル状とした。これに精製ヒトｓＦ
ｃεＲＩα２重量部を適当量の精製水に溶かして加え、
さらに精製水を加え全量を１００重量部とし、均一に攪
拌して軟膏剤とした。
【００３６】試験例１ 精製ヒトｓＦｃεＲＩαによる
ＩｇＥ産生の抑制試験 （方法）健康成人の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を酸性
バッファー（ｐＨ４．０）で処理した後、ペトリディッ
シュを用いて付着性の単球を除去した。さらに、ヒツジ
赤血球を用いたロゼット法および抗ＣＤ３モノクローナ
ル抗体を用いたパンニング法によりＢ細胞を分離精製し
た。インターロイキン４（ＩＬ−４，１００Ｕ／ｍｌ）
あるいはポークウィードマイトゲン（ＰＷＭ，０．１μ
ｇ／ｍｌ）を用いてＰＢＭＣを、またＩＬ−４＋抗ＣＤ
４０モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）あるいはＩＬ
−４＋ハイドロコーチゾン（ＨＣ，１μＭ）を用いてＢ
細胞をそれぞれ１４日間刺激した。培養上清中の各免疫
グロブリンはアイソタイプ特異的な固相サンドイッチＲ
ＩＡ法により測定した。なお、ＩｇＥの測定には、精製
ヒトｓＦｃεＲＩαの添加によって濃度依存的な抑制作
用を示さない２種類の抗ＩｇＥモノクローナル抗体を用
いた。
ＩｇＥ産生の抑制試験 （方法）健康成人の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を酸性
バッファー（ｐＨ４．０）で処理した後、ペトリディッ
シュを用いて付着性の単球を除去した。さらに、ヒツジ
赤血球を用いたロゼット法および抗ＣＤ３モノクローナ
ル抗体を用いたパンニング法によりＢ細胞を分離精製し
た。インターロイキン４（ＩＬ−４，１００Ｕ／ｍｌ）
あるいはポークウィードマイトゲン（ＰＷＭ，０．１μ
ｇ／ｍｌ）を用いてＰＢＭＣを、またＩＬ−４＋抗ＣＤ
４０モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）あるいはＩＬ
−４＋ハイドロコーチゾン（ＨＣ，１μＭ）を用いてＢ
細胞をそれぞれ１４日間刺激した。培養上清中の各免疫
グロブリンはアイソタイプ特異的な固相サンドイッチＲ
ＩＡ法により測定した。なお、ＩｇＥの測定には、精製
ヒトｓＦｃεＲＩαの添加によって濃度依存的な抑制作
用を示さない２種類の抗ＩｇＥモノクローナル抗体を用
いた。
【００３７】ＣεｍＲＮＡの発現については、Ｂ細胞を
ＩＬ−４で３日間、あるいはＩＬ−４＋抗ＣＤ４０モノ
クローナル抗体で１０日間刺激した後、各細胞から総Ｒ
ＮＡを抽出し、Ｃε２−Ｃε４に特異的なｃＤＮＡプロ
ーブを用いてノーザンブロット解析を行った。また、Ｂ
細胞表面の各種マーカーは蛍光活性化細胞選択装置（Ｆ
ＡＣＳ）により解析した。尚、精製ヒトｓＦｃεＲＩα
のＩｇＥ結合実験にはＩｇＥと結合しない抗ｓＦｃεＲ
Ｉαモノクローナル抗体を用いた。
ＩＬ−４で３日間、あるいはＩＬ−４＋抗ＣＤ４０モノ
クローナル抗体で１０日間刺激した後、各細胞から総Ｒ
ＮＡを抽出し、Ｃε２−Ｃε４に特異的なｃＤＮＡプロ
ーブを用いてノーザンブロット解析を行った。また、Ｂ
細胞表面の各種マーカーは蛍光活性化細胞選択装置（Ｆ
ＡＣＳ）により解析した。尚、精製ヒトｓＦｃεＲＩα
のＩｇＥ結合実験にはＩｇＥと結合しない抗ｓＦｃεＲ
Ｉαモノクローナル抗体を用いた。
【００３８】（結果）ＩＬ−４で刺激したＰＢＭＣ、お
よびＩＬ−４＋抗ＣＤ４０モノクローナル抗体あるいは
ＩＬ−４＋ＨＣで刺激したＢ細胞からのＩｇＥ産生はい
ずれも１〜１００ｎｇ／ｍｌの精製ｓＦｃεＲＩαによ
って濃度依存的に抑制され、特に１０ｎｇ／ｍｌと１０
０ｎｇ／ｍｌの精製ｓＦｃεＲＩαによるＩｇＥ産生の
抑制は統計学的に有意（ｐ＜０．０５，ｐａｉｒｅｄ
ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図３）。精製ｓＦｃεＲＩα
はＴ細胞依存的、非依存的ないずれの系によるＩｇＥ産
生も抑制するので、その標的細胞はＢ細胞であることが
示された。実際、ＩＬ−４＋抗ＣＤ４０モノクローナル
抗体の刺激による分泌型ＣεｍＲＮＡ（２．２ｋｂ）の
発現は１０〜１００ｎｇ／ｍｌの精製ｓＦｃεＲＩαに
よって抑制されたが、ＩＬ−４単独刺激によるgermline
ＣεｍＲＮＡ（１．８ｋｂ）の発現には影響が認められ
なかった（図４）。
よびＩＬ−４＋抗ＣＤ４０モノクローナル抗体あるいは
ＩＬ−４＋ＨＣで刺激したＢ細胞からのＩｇＥ産生はい
ずれも１〜１００ｎｇ／ｍｌの精製ｓＦｃεＲＩαによ
って濃度依存的に抑制され、特に１０ｎｇ／ｍｌと１０
０ｎｇ／ｍｌの精製ｓＦｃεＲＩαによるＩｇＥ産生の
抑制は統計学的に有意（ｐ＜０．０５，ｐａｉｒｅｄ
ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図３）。精製ｓＦｃεＲＩα
はＴ細胞依存的、非依存的ないずれの系によるＩｇＥ産
生も抑制するので、その標的細胞はＢ細胞であることが
示された。実際、ＩＬ−４＋抗ＣＤ４０モノクローナル
抗体の刺激による分泌型ＣεｍＲＮＡ（２．２ｋｂ）の
発現は１０〜１００ｎｇ／ｍｌの精製ｓＦｃεＲＩαに
よって抑制されたが、ＩＬ−４単独刺激によるgermline
ＣεｍＲＮＡ（１．８ｋｂ）の発現には影響が認められ
なかった（図４）。
【００３９】さらに、精製ヒトｓＦｃεＲＩαは、ＩＬ
−４刺激したＢ細胞表面各種マーカー、すなわち、低親
和性ＩｇＥレセプターであるＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２
３）、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩｇＭ及びＩＬ−４レ
セプター等の発現には影響を与えず、また可溶化ＣＤ２
３（ｓＣＤ２３）の遊離も抑制しなかった。また、精製
ヒトｓＦｃεＲＩαは、抗ＣＤ２３モノクローナル抗体
によるＢ細胞におけるＩｇＥ産生の抑制にも影響を与え
なかった。しかし、２９ｋｄのｓＣＤ２３によって増強
されたＢ細胞におけるＩｇＥ産生は、精製ヒトｓＦｃε
ＲＩαにより、増強前のＩｇＥ産生量以下にまで抑制さ
れた。また、精製ヒトｓＦｃεＲＩαは健康成人のＴ細
胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および単球に結合せず、ＩｇＥ非
産生性のＢ細胞株（ＲＰＭＩ１７８８、ＲＰＭＩ８８６
６、Daudi など) とも結合しないが、ＩｇＥ産生性ヒト
ミエローマ細胞（Ｕ２６６）とは結合し、またこの結合
は過剰のＩｇＥによって解除された。
−４刺激したＢ細胞表面各種マーカー、すなわち、低親
和性ＩｇＥレセプターであるＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２
３）、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩｇＭ及びＩＬ−４レ
セプター等の発現には影響を与えず、また可溶化ＣＤ２
３（ｓＣＤ２３）の遊離も抑制しなかった。また、精製
ヒトｓＦｃεＲＩαは、抗ＣＤ２３モノクローナル抗体
によるＢ細胞におけるＩｇＥ産生の抑制にも影響を与え
なかった。しかし、２９ｋｄのｓＣＤ２３によって増強
されたＢ細胞におけるＩｇＥ産生は、精製ヒトｓＦｃε
ＲＩαにより、増強前のＩｇＥ産生量以下にまで抑制さ
れた。また、精製ヒトｓＦｃεＲＩαは健康成人のＴ細
胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および単球に結合せず、ＩｇＥ非
産生性のＢ細胞株（ＲＰＭＩ１７８８、ＲＰＭＩ８８６
６、Daudi など) とも結合しないが、ＩｇＥ産生性ヒト
ミエローマ細胞（Ｕ２６６）とは結合し、またこの結合
は過剰のＩｇＥによって解除された。
【００４０】一方、ＰＷＭで刺激したＰＢＭＣからのＩ
ｇＥ，ＩｇＭおよびＩｇＡ産生は１〜１００ｎｇ／ｍｌ
の精製ｓＦｃεＲＩαによって抑制されなかった（図
５）。以上の結果から、精製ｓＦｃεＲＩαはＩｇＥク
ラス特異的に抗体産生を抑制する新規分子であることが
示された。
ｇＥ，ＩｇＭおよびＩｇＡ産生は１〜１００ｎｇ／ｍｌ
の精製ｓＦｃεＲＩαによって抑制されなかった（図
５）。以上の結果から、精製ｓＦｃεＲＩαはＩｇＥク
ラス特異的に抗体産生を抑制する新規分子であることが
示された。
【図１】プラスミドＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１の構造を示
す。
す。
【図２】プラスミドｐＴＴ０６の調製工程を示す。
【図３】ＩＬ−４、ＩＬ−４＋抗ＣＤ４０モノクローナ
ル抗体、あるいはＩＬ−４＋ＨＣで刺激したヒトリンパ
球における、精製ｓＦｃεＲＩαによるＩｇＥ産生への
影響を示す。
ル抗体、あるいはＩＬ−４＋ＨＣで刺激したヒトリンパ
球における、精製ｓＦｃεＲＩαによるＩｇＥ産生への
影響を示す。
【図４】培養Ｂ細胞における、精製ｓＦｃεＲＩαによ
るＣεｍＲＮＡの発現への影響を示す。
るＣεｍＲＮＡの発現への影響を示す。
【図５】ＰＷＭで刺激したＰＢＭＣにおける、精製ｓＦ
ｃεＲＩαによるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ産生への影響
を示す。
ｃεＲＩαによるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ産生への影響
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 9/08 Ｕ 9/12 Ｌ Ｈ 38/00 ＡＢＢ ＡＢＦ (72)発明者 平間 稔 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 奥村 康 千葉県千葉市中央区松波１−14−９
Claims (10)
- 【請求項１】 ヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドを
有効成分として含有することを特徴とするＩｇＥ産生抑
制剤。 - 【請求項２】 ヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドが
高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖を含むペプチドで
ある請求項１記載のＩｇＥ産生抑制剤。 - 【請求項３】 高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖が
ヒト由来である請求項２記載のＩｇＥ産生抑制剤。 - 【請求項４】 ヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドが
高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖の可溶性断片を含
むペプチドである請求項１記載のＩｇＥ産生抑制剤。 - 【請求項５】 高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖の
可溶性断片がヒト由来である請求項４記載のＩｇＥ産生
抑制剤。 - 【請求項６】 剤型が注射剤である請求項１〜５記載の
ＩｇＥ産生抑制剤。 - 【請求項７】 剤型がスプレー剤である請求項１〜５記
載のＩｇＥ産生抑制剤。 - 【請求項８】 剤型が点眼剤である請求項１〜５記載の
ＩｇＥ産生抑制剤。 - 【請求項９】 剤型が点鼻剤である請求項１〜５記載の
ＩｇＥ産生抑制剤。 - 【請求項１０】 剤型が軟膏剤である請求項１〜５記載
のＩｇＥ産生抑制剤。
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|---|---|---|---|
| JP5261355A JPH07118168A (ja) | 1993-10-19 | 1993-10-19 | ＩｇＥ産生抑制剤 |
| US08/238,027 US5874404A (en) | 1992-08-04 | 1994-05-03 | Immunoglobulin E receptor α-chain inhibits IgE production and secondary allergic responses |
| KR1019940026595A KR950010909A (ko) | 1993-10-09 | 1994-10-18 | 면역글로불린 e 생성 억제용 조성물 |
| EP94116396A EP0648499B1 (en) | 1993-10-19 | 1994-10-18 | Composition for inhibiting IgE production |
| DE69426639T DE69426639T2 (de) | 1993-10-19 | 1994-10-18 | Zusammensetzung zur Hemmung der IgE Produktion |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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-
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|---|---|---|---|---|
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