JPH07107975A

JPH07107975A - 核酸の精製方法及び装置

Info

Publication number: JPH07107975A
Application number: JP25396493A
Authority: JP
Inventors: Masaharu Kiyama; 政晴木山; Takeshi Fujita; 毅藤田
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1993-10-12
Filing date: 1993-10-12
Publication date: 1995-04-25

Abstract

(57)【要約】【目的】遺伝子解析方法におけるＰＣＲ増幅されたＤ
ＮＡを濃縮、精製及び遺伝子解析処理を行なう装置に関
し、特に生体試料中のＤＮＡの精製及び濃縮を高収率に
行なうこと。【構成】ＰＣＲ増幅を行なった反応液よりＰＣＲ増幅
により増幅されたＤＮＡを濃縮及び精製し、酵素反応を
行なう手段において、該反応液にイソプロピルアルコー
ルと塩化ナトリウムを混合し、次いで遠心加速度を与え
て、濃縮及び精製を行なう。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子解析方法におけ
るＰＣＲ増幅されたＤＮＡを濃縮、精製及び遺伝子解析
処理を行なう方法および装置に関し、特に生体試料中の
ＤＮＡの塩基配列を調べる前処理の技術に関する。

【０００２】

【従来の技術】微量な生体試料中の任意の塩基配列領域
を選択的に増幅する技術に、特開昭６１−２７４６９７
に示すＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲ
ｅａｃｔｉｎ）法がある。この技術は目的のＤＮＡ領域
を、目的領域を挾む両端の核酸断片を用いて、ＤＮＡポ
リメラーゼによる鋳型伸長反応を繰り返すことで約１０
⁶倍に増幅し、試料中にただ１つの標的部位でも増幅す
ることが出来る。一方核酸の塩基配列決定技術は、従来
Ｍ１３ファージに調べたいＤＮＡ断片を挿入し、大腸菌
の自己増殖を利用しＭ１３ファージの増幅を行ない、こ
れを鋳型としてサンガー法でシーケンス反応を行ない、
ゲル電気泳動法を用い塩基配列決定を行なっていた。

【０００３】しかしＰＣＲ増幅が発明されると、ＰＣＲ
増幅を応用してシーケンス反応の鋳型を調製することが
できるようになった。この方法をＰＣＲダイレクトシー
ケンス法と呼び、特に目的領域を挾む両端の核酸断片の
混入量を同量とせず、極端な非対称量とし、シーケンス
時の鋳型となる一本鎖ＤＮＡを得る方法は非対称ＰＣＲ
増幅と呼ばれ、これにはプロシーディングナショナル
アカデミーオブサイエンスオブユー．エス．エ
ー８５，（１９８８年）第７６５２頁から７６５９頁
（ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄ
ｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｏｆＵ．Ｓ．Ａ．８
５，（１９８８）ｐｐ７６５２−７６５６）の報告があ
る。

【０００４】この報告では、調べたい遺伝子領域の塩基
配列の決定を目的に、遺伝子領域の両端にそれぞれ相補
的な配列を持つ核酸断片（プライマ）によって、目的の
遺伝子領域をＰＣＲ増幅した後、膜分離を行ないＰＣＲ
増幅反応液から未反応のプライマ及びヌクレオチド三燐
酸を除去する精製と、増幅されたＤＮＡの濃縮を行なっ
ている。この膜分離法を説明すると、通常使用するプラ
イマの長さが、２０塩基から４０塩基でありその分子量
はほぼ１０，０００であり、一方ＰＣＲ増幅された二本
鎖ＤＮＡは２００から１，０００塩基対であり、分子量
約３００，０００である。よって一般的には図３に模式
的に示すように、分子量３０，０００の分画性能を持つ
限外ろ過フィルタ２３を０．５ｍｌ容量の容器２４に取
り付け、これにＰＣＲ反応後の反応液２５をいれ、容器
２４をはめあい容器２６に入れ、５０００×ｇの遠心加
速度２７を与えれば、ＰＣＲ増幅したＤＮＡ２８は限外
ろ過フィルタ２３を設けた容器２４に残り、プライマ及
びヌクレオチド三燐酸を含む反応液２９ははめあい容器
２６に落ちる。この容器２４に残ったＰＣＲ増幅したＤ
ＮＡを鋳型として、サンガー法により塩基配列を決定し
ている。プライマを分離する理由は、サンガー法におい
て、シーケンス反応時に用いるプライマと、ＰＣＲ増幅
に用いたプライマが共存すると、鋳型への結合反応が競
合しシーケンス反応を阻害するためであり、ヌクレオチ
ド三燐酸を分離する理由は、ＰＣＲ増幅時のヌクレオチ
ド三燐酸濃度は、シーケンス反応におけるヌクレオチド
三燐酸濃度よりも高濃度であるので、シーケンス反応時
の反応液組成が変化し、良好な塩基配列決定が行なうこ
とが出来なくなるためである。

【０００５】膜分離を用いない方法には、細胞工学
８，６，（１９８９年）第５４５頁−第５５３頁に記載
のイソプロピルアルコールを用いる有機溶媒法がある。
これはＰＣＲ増幅後の反応液に、０．５倍量の４Ｍ酢酸
アンモニウムと２．５倍量のイソプロピルアルコールを
反応液に混合し、次いで１００００×ｇの遠心加速度を
与え、容器内に残ったＤＮＡを得る方法が記載されてい
る。またバイオテクニクス８，２，（１９９０年）第
１８４頁−第１８９頁（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
８，２，（１９９０）ｐｐ１８４−１８９）に記載の方
法は、上記の報告の塩を酢酸ナトリウムに変えて精製濃
縮を行なっている。一般的にＤＮＡの濃縮にはエタノー
ルを使用するが、エタノールでは核酸がすべて沈殿する
ため、プライマと増幅したＤＮＡを分離出来ない。これ
を解決するために前記両報告はイソプロピルアルコール
を用い精製濃縮を行なっている。その理由はイソプロピ
ルアルコールはエタノールよりも水との親和性が低く、
ＤＮＡの溶解度が高いため、短鎖の核酸は水成分に溶解
し、長鎖のＤＮＡは沈殿するためである。これにより短
鎖であるプライマと長鎖である増幅したＤＮＡを分離す
ることが出来る。

【０００６】また有機溶媒を用いない他の方法には、ゲ
ル電気泳動法を用いてＰＣＲの増幅産物を分離し、エチ
ジウムブロミド（ＥｔＢｒ）で染色し、目的のＤＮＡを
ゲルごと切り出して、次いでフェノール抽出して精製す
る方法がある。

【０００７】一方これら精製濃縮操作は操作者にとって
煩雑であり自動化が望まれているが、未だ発明されてい
ない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】塩基配列決定は、サン
ガー法等のシーケンス反応と、ポリアクリルアミドゲル
を用いた電気泳動からなり、シーケンス反応時における
鋳型ＤＮＡの量は、電気泳動時の検出感度に大きく影響
を与え、塩基配列決定結果の可否を大きく左右させる。
ＰＣＲ増幅によって充分な鋳型ＤＮＡの生成があって
も、精製濃縮の過程での鋳型ＤＮＡの損失が多いと充分
な結果が得られない。本発明の目的は、シーケンス反応
に最良な鋳型ＤＮＡを供給することにあり、これには精
製濃縮過程での鋳型の損失を低減する手段を設ける必要
がある。従来の精製濃縮方法において、膜分離法を用い
た場合回収率は低く、鋳型ＤＮＡの損失は免れない。こ
れは目的のＤＮＡが膜に吸着するためであると考えられ
る。一方ゲルを用いた精製方法では、ＰＣＲ増幅時に目
的のＤＮＡ以外の生成があっても、確実に目的のものだ
けをシーケンスの鋳型として得ることが出来る利点があ
るが、ゲルを準備する手間と切り出し及び精製の手間が
係り、容易に精製することが出来ない。またゲルを認識
するため用いるＥｔＢｒが、目的のＤＮＡに挿入され、
シーケンス反応に悪影響をおよぼす。

【０００９】一方有機溶媒を用いる方法は、特別な器具
を用いないことと操作が簡便であるため、容易に用いら
れるが、従来報告されている条件下では、回収率が７０
から５０％程度であり、回収量が低いという欠点があっ
た。

【００１０】一方これらの精製濃縮操作の自動化を考慮
した場合、簡便且つ高回収率のプロセスを提供しこれを
実行する装置の開発が急務である。上記の各操作を自動
化した場合、有機溶媒を用いる方法は最も操作が簡便で
あるので、自動化に適している。よって従来の有機溶媒
法について、高回収且つ塩基配列決定操作における良好
な結果が得られるよう改善することが本発明の課題であ
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記課題を達成するため
に、本発明者らは鋭意研究の結果、イソプロピルアルコ
ールを用いた有機溶媒法の、塩の種類と塩濃度を最適化
することによって、ＤＮＡの回収率が９０％以上となる
方法を発明するに至った。すなわち本発明を要約する
と、ＰＣＲ増幅を行なった反応液より、ＰＣＲ増幅され
特定配列を持つＤＮＡを濃縮及び精製する手段におい
て、該反応液にイソプロピルアルコールと塩化ナトリウ
ムを混合し、次いで遠心加速度を与えて、精製及び濃縮
を行なう方法が最もシーケンス反応の良好な結果が得ら
れる方法であることを見出すに至った。

【００１２】本発明を更に詳述する。本発明を適用し精
製されるべきＤＮＡは、ＰＣＲ増幅によって増幅された
生成物である。その塩基長は、１００塩基以上３０００
塩基以下であり、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡのいずれ
にも用いることが出来る。そのＰＣＲ増幅の反応条件は
論文等に記載されている条件で良く、一般的には終濃度
がそれぞれ１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０），５０ｍＭＫＣｌ，１．５ｍＭＭｇＣｌ₂，
０．０１％ゼラチン，０．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣ
ＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，２．５ｕｎｉｔ耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼと、所定量のプライマ及び鋳型ＤＮ
Ａである。鋳型ＤＮＡは抽出動物組織、菌体、培養細胞
などから得られた凍結、新鮮或はホルマリン等で固定し
た検体を、プロテアーゼによる蛋白質の分解し、フェノ
ール或はクロロフォルム抽出による除蛋白、エタノール
沈殿法による精製濃縮からなる抽出方法に従って得られ
たＤＮＡ、及び大腸菌内に移入されたプラスミドを変性
剤やリゾチームによって膜蛋白を可溶化し、アルカリ法
を用いて抽出されるＤＮＡである。

【００１３】上記の反応液をＰＣＲ増幅の温度サイクル
に保持し、増幅ＤＮＡを得ることが出来る。温度サイク
ルは、目的の領域の塩基配列や塩基長、及び鋳型ＤＮＡ
の量や純度によって最適な条件が変化するが、一般的に
は９４度１．５分、次いで、３７度から６０度１．５
分、次いで７０度から７５度を１分の温度サイクルを２
０から４０サイクル行なわれる。試薬はＧｅｎｅＡｍｐ
ＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（シータ
ス社）が良く使用されるが、これらの試薬に準拠する物
であれば、ＤＮＡポリメラーゼを含めメーカを問わず使
用可能である。また反応液量も、操作者の仕様に応じて
適宜変更することが出来、便宜上５０μｌから１００μ
ｌが一般的である。

【００１４】本発明の精製濃縮方法は以下の手順で行な
われる。上記方法によって増幅し産生したＤＮＡを含む
反応液を１．５ｍｌ容量の容器に移し、これに終濃度が
１Ｍとなる塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びイソプロピ
ルアルコールを５０％となるよう注入し、混合し、次い
で遠心加速度１００００×ｇを３０分間与える。この後
容器を１８０度反転し上清を捨てる（上清を捨てる操作
をデカンテーションという）。次いでこの容器に７０％
エタノールを静かに分注し、次いでデカンテーション
し、これらを２、３回繰り返す。次いで、遠心乾燥器と
負圧源によって容器内を乾燥させたのち、容器内のＤＮ
Ａを鋳型として常法によってシーケンス反応を行ない、
良好な塩基配列決定や各種の酵素処理を行なうことが出
来る。上記の各試薬の量は一例を述べたものであり、終
濃度として調製すべき試薬の量は、少なくとも０．５Ｍ
以上のＮａＣｌ及び５０％程度のイソプロピルアルコー
ルによって、本目的は達成される。

【００１５】また本発明を実行する自動化装置は、液体
を保持する容器をハンドリングする搬送機構と、液体を
分注する分注装置と、遠心分離機と、該搬送機構と該分
注機構と該遠心分離機をコントロールする制御機構とを
具備し、イソプロピルアルコールと塩化ナトリウム水溶
液をそれぞれ貯蔵する容器を具備し、該制御機構が上記
の精製濃縮プロセスを実行するよう構成されている。

【００１６】

【作用】従来法と比較して、酢酸アンモニウム或は酢酸
ナトリウムに変えて塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を使用
すれば、イオン強度が高くなり、ＰＣＲ増幅によって生
成したＤＮＡがより凝集しやすくなり、イソプロピルア
ルコール溶液中でより沈殿しやすくなり、回収率が向上
し、塩基配列決定においても良好な結果が得られる。

【００１７】また本発明を実行する自動装置を使用すれ
ば、省力化に貢献するだけでなく、良好な試料調製を再
現性良く行なうこと、及び多サンプルであっても処理可
能である。

【００１８】

【実施例】

実施例１本発明の一実施例を以下に示す。

【００１９】本実施例で採用した遺伝子前処理プロセス
のフローを図４に示す。本実施例は調べたいＤＮＡ領域
を持つ生体からＤＮＡを抽出する工程３０、次いで抽出
したＤＮＡから調べたいＤＮＡ領域を選択的に増幅する
ＰＣＲ増幅工程３１、次いで増幅したＤＮＡ領域を精製
濃縮する工程３２、次いで精製濃縮されたＤＮＡを塩基
配列決定できるようシーケンス反応する工程３３、次い
で電気泳動による塩基配列決定を行なう工程３４からな
る。本発明は本実施例では精製濃縮工程３２内に適用さ
れている。以下、各工程についてヒト白血球抗原（ＨＬ
Ａ）遺伝子のＤＱα領域の塩基配列決定を行なった場合
を用いて詳述する。

【００２０】１．生体からのＤＮＡの抽出工程生体試料からのＤＮＡの抽出精製プロセスについて説明
する。全血５０μｌで容量１．５ｍｌの容器に入れ、こ
れに蒸留水１ｍｌを加え、ボルテックスミキサにより混
合し溶血させ、１００００×ｇで１分間遠心分離した
後、上清をデカンテーションし沈殿物を得る。これに再
度蒸留水を加え、溶血、遠心分離、デカンテーションの
操作により沈殿物を得る。この沈殿物にＴＮＥバッファ
（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），１００ｍＭＮａＣｌ）９０
μｌ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム１０μｌ、１０ｍ
ｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（ＭＥＲＣＫ社）５μｌを加
え、５０℃で１時間インキュベートし、次いで溶液にフ
ェノール・クロロフォルム溶液（水飽和フェノール：水
飽和クロロフォルム（１／２４イソアミルアルコール添
加）＝１：１）１００μｌを加え、ボルテックスミキサ
によって混合を行い、その後１００００×ｇで１０分間
遠心分離し、水層部をピペットにより吸引し他の容器に
移す（フェノール・クロロフォルム抽出）。このフェノ
ール・クロロフォルム抽出を２回行った後、水層の３０
％（体積比）量の３ＭＮａＣｌ水溶液と水層量の２．
５倍量の９９．５％エタノールを加え、１００００×ｇ
で２０分間遠心分離を行う（エタノール沈殿）。この後
上清をデカンテーションし、容器底に沈殿したペレット
状のＤＮＡに対して静かに８０％エタノール水溶液を２
００μｌ加え、１００００×ｇで３分間遠心分離し、上
清をデカンテーションする（エタノールリンス）。この
後遠心乾燥器と負圧源であるアスピレータによって、容
器内の残ったエタノール水溶液を蒸発させＤＮＡを得
る。乾燥後ＤＮＡを１００μｌのＴＥバッファ（１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭＥＤＴ
Ａ）に溶解する。上記述べたＤＮＡの抽出方法は、一例
を示したものであり本方法以外には、ゲノミックアイ
ソレーションキット（ベーリンガーマンハイム社）を用
いる方法も可能であり、上記の方法に限定されない。

【００２１】２．ＰＣＲ増幅工程目的ＤＮＡのＰＣＲ増幅について説明する。ＰＣＲ反応
液は、５０ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．３），１．５ｍＭＭｇＣｌ₂，０．０１％
ゼラチン（終濃度）、及び各２０ｎｍｏｌのデオキシ
リボヌクレオチド三燐酸（ｄＮＴＰｓ：ｄＡＴＰ，ｄＣ
ＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、所定量（ここでは各２０
ｐｍｏｌ）の２種類のプライマを混合した。プライマの
配列は、プロシーディングナショナルアカデミー
オブサイエンスユー．エス．エー８５，（１９８
８）第７６５２頁−第７６５６頁（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅ
ｎｃｅｏｆＵ．Ｓ．Ａ．）８５，（１９８８年）ｐ
ｐ．７６５２−７６５６）に記載の、ＧＨ２６及びＧＨ
２７を合成し用いた。これに上記抽出したゲノムＤＮＡ
を１０μｌ（抽出量の１／１０量；約５０から１００ｎ
ｇ）加え、全量で１００μｌとした後、耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）を加える。次いで反
応液の蒸発防止のために鉱物油を６０μｌ程加える。こ
の反応液をサーマルサイクラー（シータス社）にて反応
させた。反応時間は、９４度１．５分、５５度１．５
分、７２度１．２分のサイクルを３０サイクル行なっ
た。

【００２２】次いで、シーケンス反応時に必要な一本鎖
の鋳型を調製するため、二回目のＰＣＲ増幅を行なっ
た。詳述すると、本実施例ではシーケンス時に蛍光式シ
ーケンサを用いたため、シーケンス時のプライマには蛍
光色素を付加したプライマを用いる必要がある。このプ
ライマの配列はＨＬＡの領域に相補的でないので、一回
目のＰＣＲ増幅後の二本鎖ＤＮＡを直接シーケンス反応
を行なうことは出来ない。よってこの二本鎖ＤＮＡにシ
ーケンス反応時に用いるプライマの配列を取り込ませる
必要があり、一回目の増幅に用いたプライマにシーケン
ス反応時に用いるプライマの配列を付加したプライマ
（アンカープライマ）を合成し二回目のＰＣＲ増幅を行
った。この方法は、クリニカルケミストリ３５，１
１（１９８９年）第２１９６頁−第２２０１頁（Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ３５，１１（１９８
９）ｐｐ２１９６−２２０１）に記載されている。アン
カープライマＧＨ２７ＵＮＩの配列を以下に示す。

【００２３】ＧＨ２７ＵＮＩ：５’−ＣＧＴＴＧＴＡＡ
ＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＧＴＡＧＣＡＧＣＧＧＴＡ
ＧＡＧＴＴＧ−３’ 二回目のＰＣＲ反応液の組成は、一回目のＰＣＲ増幅後
の反応液１μｌを入れ、ＧＨ２７ＵＮＩ１ｐｍｏｌ及
び、ＧＨ２６１０ｐｍｏｌを混入させ、他の組成は１
回目の組成と同じである。この反応液を９４度１分、５
７度１．５分、７２度１分の温度サイクルを１８サイク
ル反応させた。

【００２４】３．精製濃縮工程二回目のＰＣＲ増幅を行なった産物を精製濃縮した。反
応液から鉱物油を取り除き、反応液量１００μｌに対
し、５０μｌの３ＭＮａＣｌ水溶液を加え、これに１
５０μｌのイソプロピルアルコールを加え、混合かくは
ん後、卓上遠心機で１００００×ｇで３０分間遠心分離
する。この後、上清をデカンテーションし、ペレット状
のＤＮＡに対して前述のエタノールリンス操作を２回繰
り返して行う。次いで、遠心乾燥機とアスピレータで残
存した上清を乾燥後、１０μｌの滅菌脱イオン化蒸留水
に溶解する。本発明を従来法と比較するため、同様にＰ
ＣＲ増幅を行なった反応液に、本発明と同条件となるよ
うに酢酸アンモニウム水溶液とイソプロピルアルコール
を加え、同様の操作を行なった。

【００２５】精製濃縮結果を図５及びゲル中で分離した
ＤＮＡの量を測定した結果を表１に示す。

【００２６】図５は、上記滅菌脱イオン化蒸留水１０μ
ｌに溶解したＤＮＡを１μｌと、電気泳動用色素（３０
％グリセロール、０．０１％キシレンシアノール、０．
０２％ブロモフェノールブルー）２μｌ、および滅菌脱
イオン化蒸留水９μｌを混合し、２％アガロースゲル
（宝酒造）に注入し、ミューピッド（アドバンス社）な
る電気泳動装置にて電気泳動した結果である。泳動条件
は１００Ｖ、４０分であり、泳動後１ｎｇ／ｍｌＥｔ
Ｂｒ液にゲルを１０分間染色し、紫外線を照射して、Ｅ
ｔＢｒの発光波長５９０ｎｍを観察した。マーカはｐＨ
Ｙ３００ＰＬＫの制限酵素ＨｉｎｄIIIの分解物とＨａ
ｅIII分解物、及びｐＨＹ３００ＰＬＫダイマープラス
ミドのＨａｅIII分解物とを混合したもので、総量０．
１μｇ混入し、図の左方にその塩基長を記載する。ゲル
にはそれぞれ、濃縮にＮａＣｌを使用したサンプル、酢
酸アンモニウムを使用したサンプル、またＰＣＲ増幅後
の未精製サンプルを１０％（計算上回収量１００％の精
製濃縮サンプルと同量）を泳動した。未精製サンプルを
泳動したレーンの下方に観察されるＤＮＡはプライマで
あるが、これ以外のＤＮＡではいずれもＤＮＡのバンド
は二本（非対称ＰＣＲ増幅によって一本鎖ＤＮＡと二本
鎖ＤＮＡが産生されたことを意味する）に見られ、マー
カの２６７塩基長と付近に位置し、目的のＤＮＡ領域
（２４２塩基長）と良く一致する。図のＤＮＡのバンド
の濃さの比較より、ＮａＣｌを使用したサンプル１が酢
酸アンモニウムを使用したサンプルよりも多くなってい
る。表１は図５のそれぞれのＤＮＡ量をマーカのＤＮＡ
量より算出した測定結果であるが、これより未精製サン
プルと比較し、塩化ナトリウムの回収率は９５％であ
り、酢酸アンモニウムの回収率は６８％であった。

【００２７】

【表１】

【００２８】４．シーケンス反応工程シーケンス反応のプロセスを説明する。

【００２９】精製濃縮したＰＣＲ産物をＴａｑシーケン
スキット（宝酒造）と、ＤＮＡシーケンサＳＱ３０００
（日立）を用いて塩基配列決定を行なった。シーケンス
反応方法はキット添付のプロトコルによりサイクルシー
ケンス法に従い行なった。シーケンス反応液の組成は、
上記の方法で精製濃縮された鋳型ＤＮＡ１０μｌ、１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、６ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂、２ｐｍｏｌ蛍光標識プライマ、１単位のＴａｑ
ポリメラーゼを加え全量を１５μｌとしたものであり、
次いで４本の容器に３．５μｌ分配し、各容器にそれぞ
れターミネーション溶液（所定量比で４種類のデオキシ
リボヌクレオチド三燐酸および各一種類のダイデオキシ
リボヌクレオチド三燐酸を混合したもの）を１μｌ加
え、鉱物油を適当量入れて、サーマルサイクラーにて、
９４度３０秒、６０度１分、７２度４５秒のサイクル
を、１５サイクル行なった。上記蛍光標識プライマは有
機合成薬品より購入し、その配列は以下の通りであり、
５’より３塩基内側の塩基にＦＩＴＣ（フルオレセイン
イソチオシアネイト）を結合させている。

【００３０】５’−ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧ
ＣＣＡＧＴ−３’ ５．電気泳動による塩基配列決定シーケンス反応終了後、反応液４．５μｌを採取し、２
μｌのキット添付のストップ溶液と混合して、ＤＮＡシ
ーケンサのゲルにロードした。電気泳動は、４．５％ポ
リアクリルアミドとホウ酸バッファを混合し重合させた
ゲルを用い、泳動条件は６５Ｖ／ｃｍで３００分泳動を
行ない、塩基配列決定を行なった。結果を図６に示す。
図はＡ（アデニン）の泳動状態を、上記の精製濃縮方法
で、塩の違いを検討したサンプルについて調べた結果で
ある。図６（ａ）のパターンは塩化ナトリウムを使用し
た鋳型ＤＮＡで、図６（ｂ）のパターンは酢酸アンモニ
ウムを使用した鋳型ＤＮＡである。縦軸は蛍光強度を示
し、横軸は泳動時間を示す。図よりＮａＣｌを使用した
サンプルが、酢酸アンモニウムを使用したサンプルより
も、強い蛍光強度が測定されている。図中１２２分に位
置する蛍光ピークを両者で比較すると、ＮａＣｌを使用
したサンプルの蛍光強度を１としたときの、酢酸アンモ
ニウムを使用したサンプルの強度比は０．６５であっ
た。これに対し精製濃縮後の両者のＤＮＡ回収量の比較
（表１）では、０．７であったことより考察すれば、Ｎ
ａＣｌを用いた場合、シーケンス反応においても何らか
の助長効果があるか、或は酢酸アンモニウムはシーケン
ス反応を阻害する効果があることが示唆される。本実施
例では、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用したサイクル
シーケンス反応について記したが、Ｔ７ＤＮＡポリメラ
ーゼなど、他の酵素を用いてのシーケンシング反応も同
様の結果であった。

【００３１】実施例２本発明の精製濃縮操作を実行する自動化装置の一実施例
の概略を図１に示す。本実施例の機構を説明すると、本
装置は筐体１内に分注機構２、遠心分離機３、搬送機構
４、及び制御機構４が構成され、液体を保持する容器６
は、４本単位にバケット７内に保持される。

【００３２】分注操作を説明する。分注機構２は、ター
ンテーブル８と試薬９を保持する試薬ボトル１０と、圧
力タンク１１、試薬切り替え弁１２、電磁弁１３、送気
チューブ１４、送液チューブ１５ａ〜ｃからなる。送気
チューブ１４は試薬ボトル１０と（図面奥向きに）圧力
タンク１１と連結し、圧力タンク１１内の正圧で、恒に
圧力が掛かっている。送液チューブ１５ａはその一端が
試薬ボトル１０内の試薬９に浸漬され、もう一端は試薬
切り替え弁１２を連結し、試薬切り替え弁１２は、電磁
弁１３に送液チューブ１５ｂで連結され、送液チューブ
１５ｃの一端は電磁弁１３に連結され、もう一端は開放
され、その開放口の下方に容器６が設置されている。バ
ケット７は搬送機構４によりターンテーブル８に設置さ
れ、ターンテーブル８はモータ１６の駆動により中心軸
８ａを中心に回転し、位置決めできる。分注操作は次の
ように行なわれる。ターンテーブル８上の容器６の一つ
を、開放口の下方に位置させた後、電磁弁１３を指定時
間開放すれば、試薬切り替え弁１２で指定されている試
薬９が、圧力タンク１１内の圧力によって、送液チュー
ブ１５ａ、試薬切り替え弁１２、送液チューブ１５ｂ、
電磁弁１３、送液チューブ１５ｃを介して、容器６内に
分注することが出来る。なお試薬ボトル１０は、４個設
置されそれぞれにイソプロピルアルコール、塩化ナトリ
ウム、７０％エタノール、滅菌脱イオン化蒸留水が、所
定量保持され、試薬切り替え弁１２によって、選択する
ことが出来る。

【００３３】遠心操作を説明する。遠心分離機３は、バ
ケット７を４個保持することが出来るロータ１７を具備
し、ロータ１７はモータ１８に連結されている。バケッ
ト７はロータ１７の鋼線１９に引っ掛かっており、矢印
２０方向にスイングすることが出来る。モータ１８は低
速回転できロータ１７の位置決めを行なうことが出来、
搬送機構４によるバケット７の設置時に所定の位置にバ
ケット７を設置することが出来る。またバケット７を設
置後、モータ１８の回転を正転と逆転させると、バケッ
ト７をスイングすることより、容器６内の液体を混合す
ることが出来る。またこの遠心分離機３は高速回転し、
容器６内の液体を遠心分離することが出来る。

【００３４】容器の搬送方法を説明する。ターンテーブ
ル８及び遠心分離機３の所定の位置にあるバケット７は
ハンド２１に保持され、矢印２２方向に移動し、所定の
位置に搬送することが出来る。なおこのハンド２１はバ
ケット７を保持し、バケット７を１８０度反転すること
が出来、廃棄口２３上で、バケット７を反転すれば、容
器６内の液体をデカンテーションすることが可能であ
る。

【００３５】本装置の駆動方法を説明する。分注機構
２、遠心分離機３、搬送機構４は制御機構５によって精
製濃縮操作をシーケンシャルに実行することが出来る。
本装置における精製濃縮操作手順を図２に示す。

【００３６】なお上記実施例は、ヒト遺伝子領域の塩基
配列決定の場合について述べたが、本発明の適用範囲は
これにとどまるものでなく、生体試料は動植物、及びウ
イルス真菌を問わず用いることが可能であり、ＰＣＲ増
幅から塩基配列決定のプロセスにおいて様々に適用され
ることは言うまでもなく、本発明はこれらの実施例によ
って何等限定されるものではない。

【００３７】

【発明の効果】本発明によれば、ＰＣＲ増幅を行なった
反応液より、ＰＣＲ増幅によって生成したＤＮＡを精製
及び濃縮を高収率行ない、且つ塩基配列決定や各種酵素
反応において、良好な結果を得ることが可能である。ま
た本発明を実行する自動装置を使用すれば、省力化に貢
献するだけでなく、良好な試料調製を再現性良く行なう
こと、及び多サンプルであっても処理可能であるので、
研究開発分野或は、多数検体試料を扱う必要のある臨床
検査や食料品検査等の検査分野において、迅速且つ簡便
に遺伝子解析を行なうことが出来その有用性は極めて高
い発明である。

【００３８】

【図面の簡単な説明】

【図１】本実施例の装置構成図である。

【図２】本実施例の装置が実行するプロセスのフローチ
ャートである。

【図３】本発明の従来技術の膜分離法を示す図である。

【図４】本発明の実施例を示すフローチャートである。

【図５】本発明の精製濃縮処理の結果を示す図である。

【図６】本発明の実施例を塩基配列決定で比較した図で
ある。

【符号の説明】

１：筐体２：分注機構３：遠心分離機４：搬送機
構５：制御機構６：容器７：バケット８：ター
ンテーブル

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＰＣＲ増幅を行なった反応液よりＰＣＲ増
幅により増幅されたＤＮＡを濃縮及び精製し、酵素反応
を行なう方法において、該反応液にイソプロピルアルコ
ールと塩化ナトリウムを混合し、次いで遠心加速度を与
えて濃縮及び精製を行なうことを特徴とする遺伝子精製
方法。
【請求項２】ＰＣＲ増幅を行なった反応液を保持する容
器をハンドリングする搬送機構と液体を分注する分注装
置と、遠心分離機と、該搬送機構と該分注機構と該遠心
分離機をコントロールする制御機構とを具備する遺伝子
解析装置において、イソプロピルアルコールと塩化ナト
リウム水溶液をそれぞれ貯蔵する容器を具備し、前記反
応液にイソプロピルアルコールと塩化ナトリウムを混合
し、次いで遠心加速度を与えて濃縮及び精製を行なう工
程を前記制御機構により実行すべく構成されていること
を特徴とする遺伝子解析装置。