JPH069374A - リポソ−ム製剤およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 膜の相転移温度が４０〜４５℃のスモ−ル・
ユニラメラ・ベシクルであるリポソ−ム（平均粒子径
０．１μｍ以下）内に、温血動物の生体液浸透圧よりも
２．０〜５．０倍高張の薬物含有液を封入してなるリポ
ソ−ム製剤。 【効果】 本発明のリポソーム製剤は、粒子径が小さい
ため高い血中濃度の維持が可能であり、かつ温度感受性
に優れていることから、癌の温熱療法と抗腫瘍剤との併
用に有利に利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医薬の分野で有用な薬
物を封入して成るリポソーム製剤、及びその製造法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】癌病巣部へのターゲッティング治療を指
向した、様々な特徴を有するリポソーム製剤がドラッグ
デリバリーシステムとして開発されつつある。その一つ
として知られている温度感受性リポソーム製剤は、癌の
温熱療法（適当な装置を用いて病巣部を局所的に加温す
る（４３℃前後）ことにより、癌細胞のみに特異的に障
害を与える治療法）との併用により化学療法剤の効果を
増強できる。その報告例として （１）Ｊ．Ｎ．Ｗｅｉ
ｎｓｔｅｉｎ， Ｒ．Ｌ．Ｍａｇｉｎ， Ｍ．Ｂ．Ｙａ
ｔｖｉｎ ａｎｄ Ｄ．Ｓ．Ｚａｈａｒｋｏ， Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ， ２０４，１８８（１９７９）， （２）
Ｊ．Ｎ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ， Ｒ．Ｌ．Ｍａｇｉｎ，
Ｒ．Ｌ．Ｃｙｓｙｋ ａｎｄ Ｄ．Ｓ．Ｚａｈａｒｋ
ｏ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４０，１３８８（１
９８０）， （３）Ｍ．Ｂ．Ｙａｔｖｉｎ， Ｔ．Ｃ．
Ｃｒｅｅ， Ｉ．Ｍ．Ｔｅｇｍｏ−Ｌａｒｓｓｏｎ ａ
ｎｄＪ．Ｊ．Ｇｉｐｐ， Ｓｔｒａｈｌｅｎｔｈｅｒａ
ｐｉｅ １６０，７３２（１９８４）などが挙げられ
る。

【０００３】リポソーム製剤は静脈内に投与された後、
血流に乗って癌病巣部に到達する。癌病巣部が加温され
ている場合その部分に分布する温度感受性リポソームの
みが、正常体温との温度差を感知することにより崩壊し
内包した薬物を局所的に放出する。このリポソームは加
温されていない正常組織中では安定であり薬物を放出し
ないので、副作用の軽減が期待できる。このように温度
感受性リポソーム製剤は、化学療法剤のターゲッティン
グ効果を高め得る製剤である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前述のように、温度感
受性リポソーム製剤を癌の温熱療法に適用することは有
用と考えられる。従来のリポソーム製剤はラージ・ユニ
ラメラ・ベシクル（ＬＵＶ；一般に直径０．１〜２．０
μｍ）が利用されているが、二つの欠点が考えられる。
その一つは、静脈内に投与されたＬＵＶは肝臓や脾臓な
どの細網内皮系組織に取り込まれ易い性質をもつため、
ＬＵＶに封入された化学療法剤（一般に副作用を有する
とされている）が正常な組織に悪影響を及ぼす可能性が
懸念されることである。今一つは、ＬＵＶは細網内皮系
組織に取り込まれ易いため血中濃度を維持することが難
しく、癌病巣部へのタ−ゲッティング効率が低くなるこ
とである。温度感受性リポソームの作用原理に基づく
と、できる限り高く血中濃度を保つことが重要であり、
さらにＡ．Ｇａｂｉｚｏｎらが指摘するように（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ８５，６９４９
（１９８８））循環血液中に長く留まるリポソーム製剤
は、受動的に癌病巣部に集積し易い性質をもつことも知
られており、より高いターゲッティングの相乗効果が期
待される。

【０００５】これらの問題を解決する手がかりとして、
リポソームの粒子径を小さくすれば細網内皮系組織に取
り込まれ難くなり、血中濃度を高く保てることが知られ
ている。この報告例としては、（１）Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉ
ａｎｏ ａｎｄ Ｄ．Ｓｔａｍｐ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．， ６３，６
５１（１９７５）， （２）Ｔ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ ａｎ
ｄ Ｊ．Ｍ．Ｅｖｅｒｅｓｔ， Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．， ２２６，５３９（１９８
３）， （３）Ｙ．Ｓａｔｏ， Ｈ．Ｋｉｗａｄａ ａ
ｎｄ Ｙ．Ｋａｔｏ， Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌ
ｌ．， ３４，４２４４（１９８６），（４）Ｒ．Ｍ．
Ａｂｒａ ａｎｄ Ｃ．Ａ．Ｈｕｎｔ， Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ， ６６６，４９３（１
９８１）， （５）Ｈ．Ｋｉｗａｄａ，Ｓ．Ｏｂａｒ
ａ，Ｈ．Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ ａｎｄ Ｙ．Ｋａｔｏ，
Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．， ３２，１２４
９（１９８６）， （６）Ｃ．Ａ．Ｈｕｎｔ， Ｙ．
Ｍ．Ｒｕｓｔｕｍ， Ｅ．Ｍａｙｈｅｗ ａｎｄ Ｄ．
Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ， Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔ
ａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．，７，１２４（１９７９），
（７）Ｙ．Ｅ．Ｒａｈｍａｎ， Ｅ．Ａ．Ｃｅｒｎｙ，
Ｋ．Ｒ．Ｐａｔｅｌ， Ｅ．Ｈ．Ｌａｕ ａｎｄ
Ｂ．Ｊ．Ｗｒｉｇｈｔ， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．， ３
１，２０６１（１９８２）などが挙げられる。しかし、
リポソームの粒子径を小さくすると温度感受性が極端に
低下するとされている。この報告例としては、（１）Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．，５７，２４１（１
９８９）， （２）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ． Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ， ３，２２３（１９８６），（３）小川泰
亮、戸口始、癌と化学療法，１７，１１２７（１９９
０）などが挙げられる。従って現在リポソームの粒子径
が小さく、血中濃度が維持できるような、しかも優れた
温度感受性を有するリポソーム製剤の開発が望まれてい
る。

【０００６】本発明は、細網内皮系組織への取り込みが
少なく、血中濃度が維持できるような粒子径の小さいス
モール・ユニラメラ・ベシクル（ＳＵＶ；直径０．１μ
ｍ以下）から成り、しかも温度感受性に優れたリポソー
ム製剤の調製を狙ったものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記の状況に鑑み、発明
者らは粒子径が小さくても温度感受性に優れたリポソー
ムを製造するために、リポソーム膜組成の選択及びリポ
ソーム内に封入される薬液の浸透圧調整の面から種々の
検討を行い、本発明を完成したものである。すなわち本
発明は、リポソーム膜の相転移温度が４０〜４５℃であ
り、しかも３７℃では安定であるＳＵＶ内に、温血動物
の生体液浸透圧よりも２．０〜５．０倍高張の薬物含有
液を封入して成るリポソーム製剤とその製造法に関す
る。

【０００８】はじめに、本発明のリポソーム製剤を構成
する膜の組成について説明する。本発明においては、リ
ポソーム膜の構成材料及びその構成比は温熱療法の温度
で相転移を引き起こすように、すなわち膜の相転移温度
が４０〜４５℃、好ましくは４０〜４３℃となるように
選択される。この膜の材料としてはアシル基が飽和アシ
ル基である各種のリン脂質を、単独あるいは組み合せて
用いるのが有利である。グリセロリン脂質の２つの飽和
アシル基は高級飽和脂肪酸由来のアシル基であり、通常
炭素数１２〜２０の飽和アシル基、好ましくは炭素数１
４〜１８の飽和アシル基を有するものが利用できる。こ
のようなリン脂質としては例えば卵黄レシチンや大豆レ
シチンを水素添加して得られる水素添加レシチンや、ラ
ウリル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルな
どの組み合せから成る、全合成または半合成により得ら
れるフォスファチジルコリンなどが利用できる。また封
入する薬物の種類によっては、アシル基が飽和アシル基
であるフォスファチジルグリセロールなどを使用するこ
ともできる。具体的には、全合成または半合成により得
られるフォスファチジルコリンが有利に用いられ、この
うち膜の相転移温度が温熱療法の温度に近いことから、
飽和アシル基の炭素数が１６のジパルミトイルフォスフ
ァチジルコリン（ＤＰＰＣ；相転移温度４１．４℃）、
または炭素数１８のジステアロイルフォスファチジルコ
リン（ＤＳＰＣ；相転移温度５４．９℃）が好ましく用
いられる。

【０００９】調製したリポソーム膜の相転移温度は、併
用されている飽和リン脂質の重量比例配分より求められ
る相転移温度に近いと報告されているが、本発明で用い
た平均粒子径が小さいリポソームの場合、同重量比例配
分の一般的なリポソームの相転移温度より約１〜４℃低
くなる特徴がある。この様な温度差が認められること
は、本発明のリポソームが従来利用されているものと異
なる証明の一つと考えられる。 本発明に用いた飽和リ
ン脂質の併用例としては、ＤＰＰＣとＤＳＰＣのモル比
（ＤＰＰＣ／ＤＳＰＣ）が９０／１０〜５０／５０の範
囲になるように用い、好ましくは８５／１５〜６５／３
５の範囲になるように用いるのが有利である。

【００１０】本発明のリポソーム製剤には、温度感受性
を著しく損なうものでなければ膜安定化剤、電荷調整剤
を用いることもできる。また同様に、温度感受性を著し
く損なうものでなければ肝臓、脾臓などの細網内皮系組
織による取り込みをさらに抑制するための工夫（例え
ば、ポリエチレングリコールのような水溶性高分子また
はＧＭ１などのガングリオシドによる被覆）も施すこと
ができる。

【００１１】次に、本発明においてリポソーム内に封入
される薬物含有液について説明を加える。リポソーム内
に封入される薬物含有液浸透圧は、温血動物の生体液浸
透圧よりも２．０〜５．０倍高張、好ましくは２．５〜
４．５倍高張になるように調整される。この液は薬物の
溶解度を考慮し、薬物単独で上記浸透圧に達しめること
もできるが、必要であれば適当な浸透圧調整剤を用いる
ことができる。本浸透圧調整剤としては、水可溶性で温
血動物が生理的に許容し得るものであれば特に制限なく
用いることができ、塩類（塩化ナトリウムなど）、糖類
（ショ糖など）、アミノ酸類（グリシンなど）などが好
ましく用いられる。

【００１２】本発明において使用される薬物は、温熱療
法と組み合せて相乗効果が期待される薬物であって、リ
ポソーム内に封入してターゲッティング効果を上げるこ
とを目的とするものが選ばれる。このような薬物の具体
例としては、抗腫瘍剤が好ましい対象薬物となる。具体
的な例としては、シスプラチン、カルボプラチン、テト
ラプラチン、イプロプラチンなどの金属錯体、アドリア
マイシン、アンサマイトシンあるいはその誘導体、ブレ
オマイシン、Ａｒａ−Ｃ、ダウノマイシンなどの制癌抗
生物質、５−ＦＵ、メトトレキサートなどの代謝拮抗
剤、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵなどのアルキル化剤、メルファ
ラン、ミトキサントロンなどのその他の制癌剤等が挙げ
られる。この中でとりわけ高いターゲッティング効果が
期待される薬物として、シスプラチンが有用と考えられ
る。これに関する報告は、（１）阿岸鉄三編集 “標的
治療”第一版、（株）日本メディカルセンター，東京，
Ｐ．１６５（１９８９）（２）小川泰亮、戸口始、癌と
化学療法，１７，１１２７（１９９０）、等が挙げられ
る。

【００１３】本発明に用いたリポソームはＳＵＶである
ため、薬物の保持容積が小さくなりリン脂質の相対量は
増加するが、一般に原料のリン脂質は毒性が低いことが
知られており、また投与液中のリポソームの密度を調整
することにより必要な投与量を得ることができる。

【００１４】本発明のリポソーム製剤の製造法について
以下に説明する。

【００１５】リポソームの製造法に関しては、ＳＵＶを
製造する方法であれば、公知の技術である超音波法、フ
レンチプレス法、イクストゥルージョン法等を適用し得
る。例えば本発明に用いた超音波法では、先ず前述のよ
うな飽和アシル基を有するリン脂質を単独または複数混
合したものにクロロホルムなどの有機溶媒を加えて充分
撹拌した後、溶媒を留去しリン脂質の薄膜を形成する。
この薄膜を充分乾燥させ、薬物を含有する調製用溶液を
添加して強く撹拌することによりマルチラメラ・ベシク
ルを製造し、更に窒素気流下で超音波処理を行いＳＵＶ
を得る。このようにして得られたリポソーム製剤は一般
に、封入されなかった（フリーの）薬物と分離する必要
がある。薬物を除く方法は、一般にゲル濾過法または透
析法が適用されるが、電荷を有する薬物と同種の電荷を
持たないＳＵＶを分離する場合、イオン交換樹脂を用い
る方法が好ましい。

【００１６】本発明のリポソームは、温熱療法を適応で
きる癌疾患であれば、特に制限されることなく適用する
ことができ、またヒトに限らず、担癌動物に適用するこ
とも可能である。

【００１７】

【実施例】以下に蛍光物質を封入した実施例、比較例及
び試験例を示し本発明を更に詳細に説明するが、本発明
は実施例及び試験例に限定されるものではない。

【００１８】実施例１ ＤＰＰＣ ２１マイクロモルとＤＳＰＣ ９マイクロモ
ルのクロロホルム溶液３ｍｌを５０ｍｌのナシ型フラス
コに入れ、十分に混合した後、溶媒のクロロホルムを留
去し、上記リン脂質の薄膜を形成する。この薄膜を十分
乾燥させ、０．０９４Ｍカルセイン−０．２００Ｍショ
糖（ｐＨ７．４）溶液（浸透圧２．０倍）２ｍｌを添加
して、強く撹拌することによりマルチラメラ・ベシクル
を製造する。さらにプル−ブ型超音波発生装置（ＢＲＡ
ＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ 社製Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒ
ｕｐｔｏｒ １８５）を用いて、窒素気流下、３０分間
超音波処理を行いＳＵＶを得る。次にリポソーム内に封
入した液と等しい浸透圧を有する塩化ナトリウム・リン
酸緩衝液（ｐＨ７．４）で飽和したジエチルアミノエチ
ル セファデックス Ａ−２５カラムを通すことによ
り、リポソーム内に封入されなかったカルセインを吸着
させ除去する。

【００１９】製造したＳＵＶの粒子径の測定は光散乱法
（ＮＩＣＯＭＰ ｍｏｄｅｌ ３７０）により行い、平
均粒子径０．１０μｍ以下という結果を得た。

【００２０】実施例２ リポソーム内に封入する溶液として０．０９４Ｍカルセ
イン−０．４００Ｍショ糖溶液（ｐＨ７．４）を用い
て、それ以外は実施例１と同じ方法でリポソーム製剤を
製造し、温度感受性試験を行った。なお本液の浸透圧は
３．０倍であり、製造したリポソームの平均粒子径は
０．１０μｍ以下であった。

【００２１】実施例３ リポソーム内に封入する溶液として０．０９４Ｍカルセ
イン−０．５６０Ｍショ糖溶液（ｐＨ７．４）を用い
て、それ以外は実施例１と同じ方法でリポソーム製剤を
製造し、温度感受性試験を行った。なお本液の浸透圧は
４．０倍であり、製造したリポソームの平均粒子径は以
上０．１０μｍ以下であった。

【００２２】実施例４ リポソーム内に封入する溶液として０．０９４Ｍカルセ
イン−０．７０５Ｍショ糖溶液（ｐＨ７．４）を用い
て、それ以外は実施例１と同じ方法でリポソーム製剤を
製造し、温度感受性試験を行った。なお本液の浸透圧は
５．０倍であり、製造したリポソームの平均粒子径は
０．１０μｍ以下であった。

【００２３】実施例５ ＤＰＰＣ ４２マイクロモルとＤＳＰＣ １８マイクロ
モルのクロロホルム溶液３ｍｌを５０ｍｌのナシ型フラ
スコに入れ、十分混合した後、溶媒のクロロホルムを留
去し、リン脂質の薄膜を形成する。この薄膜を十分乾燥
させ、０．２％シスプラチン（ＣＤＤＰ）−０．９％塩
化ナトリウム−０．２３０Ｍショ糖溶液（ｐＨ５．０，
浸透圧２．０倍）４ｍｌを添加して強く撹拌することに
よりマルチラメラ・ベシクルを製造する。さらにプルー
ブ型超音波発生装置（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥ
Ｒ社製Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ １８５）を用い
て、窒素気流下、３０分間超音波処理を行いＳＵＶを得
る。次にリポソーム内に封入した液と等しい浸透圧を有
する塩化ナトリウム・リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で飽
和したスルフォプロピル セファデクス Ｃ−２５カラ
ムを通すことにより、リポソーム内に封入されなかった
ＣＤＤＰを除去する。

【００２４】製造したＳＵＶの粒子径の測定は光散乱法
（ＮＩＣＯＭＰ ｍｏｄｅｌ ３７０）により行ない、
平均粒子径０．１０μｍ以下という結果を得た。

【００２５】実施例６ リポソーム内に封入する溶液として、０．２％ＣＤＤＰ
−０．９％塩化ナトリウム−０．４３９Ｍショ糖溶液
（ｐＨ５．０）を用いて、それ以外は実施例５と同じ方
法でリポソーム製剤を製造し、温度感受性試験を行っ
た。なお本液の浸透圧は３．０倍であり、製造したリポ
ソームの平均粒子径は０．１０μｍ以下であった。

【００２６】実施例７ リポソーム内に封入する溶液として、０．２％ＣＤＤＰ
−０．９％塩化ナトリウム−０．６２０Ｍショ糖溶液
（ｐＨ５．０）を用いて、それ以外は実施例５と同じ方
法でリポソーム製剤を製造し、温度感受性試験を行っ
た。なお本液の浸透圧は４．０倍であり、製造したリポ
ソームの平均粒子径は０．１０μｍ以下であった。

【００２７】実施例８ ＤＰＰＣ ４８マイクロモルとＤＳＰＣ １２マイクロ
モルを用いた以外は、実施例５と同様の方法により、平
均粒子径０．１０μｍ以下、浸透圧２．０倍のリポソー
ム製剤を得た。

【００２８】実施例９ ＤＰＰＣ ４８マイクロモルとＤＳＰＣ １２マイクロ
モルを用い、リポソーム内に封入する溶液として０．２
％ＣＤＤＰ−０．９％塩化ナトリウム−０．４３９Ｍシ
ョ糖溶液（ｐＨ５．０）を用いて、それ以外は実施例５
と同じ方法で製造し、平均粒子径０．１μｍ以下、浸透
圧３．０倍のリポソーム製剤を得た。

【００２９】実施例１０ ＤＰＰＣ ４８マイクロモルとＤＳＰＣ １２マイクロ
モルを用い、リポソーム内に封入する溶液として０．２
％ＣＤＤＰ−０．９％塩化ナトリウム−０．６２０Ｍシ
ョ糖溶液（ｐＨ５．０）を用いて、それ以外は実施例５
と同じ方法で製造し、平均粒子径０．１μｍ以下、浸透
圧４．０倍のリポソーム製剤を得た。

【００３０】

【比較例】

比較例１ リポソーム内に封入する溶液として０．０９４Ｍカルセ
イン溶液（ｐＨ７．４）を用いて、それ以外は実施例１
と同じ方法でリポソーム製剤を製造し、温度感受性試験
を行った。なお本液の浸透圧は１．１倍であり、製造し
たリポソームの平均粒子径は０．１０μｍ以下であっ
た。

【００３１】比較例２ リポソーム内に封入する溶液として０．２％ＣＤＤＰ−
０．９％塩化ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）を用いて、
それ以外は実施例５と同じ方法でリポソーム製剤を製造
し、温度感受性試験を行った。なお本液の浸透圧は１．
０倍であり、製造したリポソームの平均粒子径は０．１
０μｍ以下であった。

【００３２】比較例３ ＤＰＰＣ ４８マイクロモルとＤＳＰＣ １２マイクロ
モルを用い、リポソーム内に封入する溶液として０．２
％ＣＤＤＰ−０．９％塩化ナトリウム溶液（ｐＨ５．
０）を用いて、それ以外は実施例５と同じ方法でリポソ
ーム製剤を製造し、温度感受性試験を行った。製造した
リポソームの平均粒子径は０．１０μｍ以下であった。

【００３３】

【試験例】

試験例１ 実施例１〜４及び比較例により得られたリポソーム製剤
について、カルセインを用いて温度感受性試験を行っ
た。

【００３４】製造したリポソーム液は、内包する薬物の
濃度が全液に対し１６７μＭになるように希釈して、イ
ンビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の温度感受性試験に供し
た。インビトロの温度感受性試験は以下の要領で行っ
た。すなわちＣｒｊ：ＣＤ−１の雌マウスから採取した
血液０．５ｍｌを、３７℃、４１℃、４３℃の恒温槽に
入れ５分間プレインキュベーションを行った。５０μｌ
のリポソーム液添加時を０分とし、２、５、１０、１
５、２０、３０分間インキュベーションを行った後に１
０μｌのリポソームと血液の混合液を採取し、蛍光測定
用の緩衝液（０．３５Ｍショ糖−０．０１Ｍ ＥＤＴＡ
−０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ８．５）１．２
ｍｌに入れた。その後直ちに１４００ｇで１０分間遠心
を行い血球成分を除去した。上清０．９ｍｌの蛍光量を
測定した後（蛍光量Ａ）、１０％トライトンＸ１００溶
液を０．１ｍｌ添加しリポソームを完全に破壊してカル
セインを放出させ、蛍光量を測定した（蛍光量Ｂ）。薬
物の放出率は式１により求めた。

【００３５】 放出率＝｛１−（０．９×Ａ／Ｂ）／自己消光値｝×１００ （１） ただし自己消光値は血液を添加する前の緩衝液中での値
を表しており、同様に０．９ｍｌの蛍光量を測定した後
に１０％トライトンＸ１００溶液を０．１ｍｌ添加して
測定した蛍光量の比から求められる。

【００３６】各温度におけるインキュベーション１５分
後の放出率をまとめた（表１）。また、実施例３のリポ
ソーム製剤を代表例として放出率の経時的変化を示した
（図１）。図中、−□−は３７℃、−●−は４１℃、−
○−は４３℃における放出率を示す。

【００３７】

【表１】 表１より浸透圧が２．０倍より小さいと３７℃における
膜の安定性が極端に悪く内部の薬物が放出されてしまう
が、これは封入液の浸透圧を上げることにより改善され
ることがわかる。しかも４３℃における薬物の放出率が
変わらずに良好であることからも、本発明のリポソーム
は温熱療法との併用に有用であることが示される。更
に、４１℃における薬物放出率も同様に高く、また図１
に示すようにリポソームは添加後速やかに崩壊すること
からも、本発明で開発したリポソーム製剤が温度感受性
に優れていることがわかる。

【００３８】試験例２ 実施例５〜１０及び比較例２，３により得られたリポソ
ーム製剤について、シスプラチンを用いて温度感受性試
験を行った。

【００３９】製造したリポソーム液は、内包する薬物の
濃度が全液にたいして４００μＭになるように希釈し
て、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の温度感受性試験
に供した。インビトロの温度感受性試験は以下の要領で
行った。すなわち、Ｃｒｊ：ＣＤ−１の雌マウスから採
取した血液０．５８２ｍｌを３７℃の恒温槽に入れ、５
分間プレインキュベーションを行った。１００μｌのリ
ポソーム液を添加した時を０分とし、２、５、１０、１
５、２０、３０分間インキュベーションを行った後、６
０μｌのリポソームと血液の混合液を採取し、リポソー
ム内液と等しい浸透圧の塩化ナトリウム・リン酸緩衝液
（ｐＨ５．０）０．１５ｍｌに入れた。その後直ちに１
４００ｇで１０分間遠心を行い血球成分を除去した。上
清５０μｌを試験管に取り（Ｔ試料）、残りの上清をセ
ントリコン１００（グレースジャパン（株）アミコン事
業部）に入れ、１７０ｇで２０分間遠心を行い、リポソ
ームを除去した濾液を得た。濾液の５０μｌを採取して
試験管に移した（Ｆ試料）。Ｆ試料とＴ試料のそれぞれ
に濃硝酸液０．２ｍｌを加え、１４０℃で２時間加熱し
た。さらに約３０％の過酸化水素水０．２ｍｌを加え１
４０℃で３０分間加熱して灰化を行い、無色透明の試料
液を得た。液量を測定した後、原子吸光分光光度計
（（株）日立製作所、Ｚ−９０００形）を用いてＦ試料
とＴ試料中の白金定量を行った。３７℃におけるシスプ
ラチン放出率（Ｒ₃₇）は式２より算出した。

【００４０】Ｒ₃₇＝ＰｔＦ／ＰｔＴ （２） ただし、ＰｔＦはＦ試料中の白金量を、ＰｔＴはＴ試料
中の白金量を表している。

【００４１】４１℃と４３℃のインキュベーション試験
は、リポソームと血液の混合液の採取時間を１、２、
４、７、１０、１５分後に変更して行い、それ以外はす
べて上記の方法に従った。４１℃と４３℃でのシスプラ
チン放出率は式３より算出した。

【００４２】 Ｒ₄₁（またはＲ₄₃）＝ＰｔＦ／ＰｔＴ／０．７７ （３） ただし、値０．７７は補正値であり、リポソームに封入
していない遊離のシスプラチン液を同条件、同手順のイ
ンキュベーション試験を行うことにより得た数値であ
る。

【００４３】各温度におけるインキュベーション１５分
後の放出率をまとめた（表２および３）。

【００４４】表２および３より浸透圧が１．０倍の薬液
を内包するリポソームは３７℃でかなりの薬物が漏れて
いることがわかる。しかも４１℃と４３℃では薬物をあ
まり放出せず、温度感受性が著しく劣るリポソームと言
える。これに対して、高張液を内包するリポソームは３
７℃での薬物の漏れが浸透圧比に比例して改善され、し
かも４１℃と４３℃における薬物放出性も良くなること
がわかる。

【００４５】

【表２】

【００４６】

【表３】 試験例３ Ｓ−１８０細胞を７週令のＣｒｊ：ＣＤ−１雌マウスの
左足部筋肉内に移植して、９日目に癌の直径（癌が増殖
した左足の直径から正常の右足の直径を差し引いた値）
が０．５３ｃｍとなった担癌マウス２０匹を５群に分け
て本試験に用いた。なお、癌の直径の変動係数は４．０
％であり、癌の大きさが揃ったマウスを用いた。温熱治
療は以下の方法で行った。すなわち、癌組織の皮膚表面
に被覆熱電対を貼り付けて皮膚の温度信号を温度調節計
に送り、直流定電圧定電流電源の出力を制御することに
よって、癌組織全体に巻き付けたコードヒーターを加熱
した。本法により、４２．５±０．１℃の精度で加温す
ることができた。

【００４７】ＣＤＤＰ封入ＳＵＶは実施例８の方法で作
成したものを、ＣＤＤＰ濃度が４００μＭになるように
調整して投与液とした。ＣＤＤＰ水溶液は、日本化薬
（株）のランダ注を生理食塩水（大塚生食注）で希釈し
て、ＣＤＤＰ濃度を４００μＭに合わせて用いた。な
お、ＣＤＤＰの投与量は１．５ｍｇ／ｋｇ、尾静脈内投
与直後から加温を始め、癌組織の皮膚表面温度が４２．
５℃に到ってから４０分間加温を続けた。治療は移植後
９日目、１３日目、１７日目の計３回行った。

【００４８】図２中の−●−はＣＤＤＰ封入ＳＵＶを静
注して温熱治療を併用した群、−□−はＣＤＤＰ封入Ｓ
ＵＶを静注して温熱治療を行わなかった群、−△−はＣ
ＤＤＰ水溶液を静注して温熱治療を行った群、−◎−は
温熱治療のみを行った群、−○−は無処置群を示してい
る。図２から明らかなように本発明のＣＤＤＰ封入ＳＵ
Ｖを投与して温熱治療を行った群（−●−）には抗腫瘍
効果が認められ、その効果はＣＤＤＰ水溶液を投与して
温熱治療を行った群（−△−）よりも明らかに大きかっ
た。全マウスが生存していた、最終治療日から２０日経
過時の平均腫瘍直径は、コントロール群に対して−●−
群が５８％、−△−群が９１％であった。

【００４９】

【発明の効果】本発明のリポソーム製剤は、粒子径が小
さいため高い血中濃度の維持が可能であり、かつ温度感
受性に優れていることから、癌の温熱療法と抗腫瘍剤と
の併用に有利に利用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図は、実施例３で作成したリポソーム製剤
に封入したカルセインの、各温度における放出率の経時
的変化を示したものである。

【図２】第２図は、実施例８のＣＤＤＰを封入するリポ
ソーム製剤をマウスに投与したときの抗腫瘍効果を対照
群と比較して示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 船田 諭 埼玉県大里郡妻沼町大字西城810番地 萬 有製薬株式会社開発研究所内 (72)発明者 井上 公雄 埼玉県大里郡妻沼町大字西城810番地 萬 有製薬株式会社開発研究所内 (72)発明者 石丸 末明 埼玉県大里郡妻沼町大字西城810番地 萬 有製薬株式会社開発研究所内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】膜の相転移温度が４０〜４５℃のスモール
   ・ユニラメラ・ベシクルであるリポソーム（平均粒子径
   ０．１μｍ以下）内に、温血動物の生体液浸透圧よりも
   ２．０〜５．０倍高張の薬物含有液を封入して成るリポ
   ソーム製剤。
2. 【請求項２】アシル基が飽和アシル基であるリン脂質を
   リポソーム膜の主構成成分とする請求項１記載の製剤。
3. 【請求項３】２．５〜４．５倍高張の薬物含有液を封入
   して成ることを特徴とする請求項１または２記載のリポ
   ソーム製剤。
4. 【請求項４】薬物が抗腫瘍剤である請求項１，２または
   ３記載の製剤。
5. 【請求項５】浸透圧が温血動物の生体液浸透圧よりも
   ２．０〜５．０倍高張の薬物含有液を封入し、膜の相転
   移温度が４０〜４５℃のスモール・ユニラメラ・ベシク
   ルであるリポソーム（平均粒子径０．１μｍ以下）を形
   成せしめることを特徴とするリポソーム製剤の製造法。
6. 【請求項６】アシル基が飽和アシル基であるリン脂質を
   主剤としてリポソーム膜を構成させることを特徴とする
   請求項５記載のリポソーム製剤の製造法。
7. 【請求項７】薬物が抗腫瘍剤であることを特徴とする請
   求項５または６記載のリポソーム製剤の製造法。