JPH06504759A - リポソーム含有ワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リポソーム含有ワクチン組成物 良五旦！景 隨亙盆互 本発明は一般的に、ワクチンに関するものであり、特に、ワクチンの有効性を増 大させ、中和抗体を産生ずるための方法と組成物を目的としている。

リポソームは、水溶液中で典型的にはリン脂質で成り、脂質二重層および封入さ れた水性空間からなる球状小胞である。

リポソームが形成される懸濁液の水層に化学的または生化学的物質を取り込むこ とにより、種々の生物学的活性物質を内側の空間に封入したリポソームを得るこ とができる。リポソームは、典型的には、その産生方法と脂質層の含量により直 径約２５ｎｍから約１μｍまでサイズが変化するため、種々の水溶性物質を運ぶ ベンセルとして用い得る。荷電した分子は一般的に脂肪二重層を貫通しないため 、また高分子は前述の層に緩慢にしか貫通しないため、リポソーム壁は、リポソ ームを投与した生物に封入物質の作用があまりに速すぎないように作用する。

リポソームは、抗原を有するリポソームを投与することにより、動物の免疫反応 を調節するために、以前から用いられてきた。この免疫反応は、宿主内において 病原体に対し、免疫を誘発する目的か、あるいは宿主外で用いられる抗体を産生 ずる目的で調節し得る。例えば、イムノアッセイおよび免疫学的治療において使 用するための広汎な種類の抗原決定部位に対する抗体を調製する能力を改善およ び変化させることに、興味が高まっている。特異的な抗原決定部位または化学構 造に結合する抗体特有の能力は、宿主内の特定部位に薬物、ラジオアイソトープ 、マーカーを到達させるため特に有用である。さらに、類似構造物の中から特定 構造を区別する抗体の能力は、診断において広く用いられることとなった。

宿主外でモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いるか、あるいは病原体 に対して宿主を守るために免疫反応を用いるかにかかわらず、最初の工程は、宿 主の免疫である。

以下で明らかなように、免疫に用いる組成物は、この組成物が宿主を守るために 用いられるか、またはモノクローナル抗体の産生に用いられるかにかかわらず、 本明細書では「ワクチン」と呼ぶ。通常は、あらかじめ決めたスケジュールに従 って、ワクチン組成物の免疫原の反復投与により宿主を過剰免疫する。アジュバ ントは、免疫反応を増強するために加えられる。種々のアジュバントには、アル ミニウムおよびカルシウム塩、乳化アジュバント、マイコバクテリアおよびコリ ネバクテリア等の細菌が含まれる。

モノクローナル抗体がめられる場合、特に特定的異所性部位に対する免疫反応を 増強することが望ましい。モノクローナル抗体の調製には、生母集団の現象を検 出する必要があるため、モノクローナル抗体産生において、目的とするβ−リン パ球集団を増強するすべての方法は重要であり得る。リポソームに抗原を結合す ることによる免疫原の製造を示す米国特許第４．５６５．６９６号を参照された い。

以後本明細書で述べる通り、本発明は、リポソームを含有するワクチン組成物の 調製を目的としている。このリポソーム、および詳細を以下に示す種々の他の成 分は、病原体由来のあるいは病原体関連する抗原の免疫原性を増大するためのア ジュバントとして作用する。

現在、米国で臨床使用のために承認されたアジュバントは、アルミニウム塩だけ である（ミョウバン）。これらのアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジフテリア、ポリ オ、狂犬病、インフルエンザを含む一部のワクチンについて有用であるが、他の ワクチン、特に、生体を守るために細胞性免疫の刺激を必要とする場合は有用で ない。ミョウバンは、百日咳およびチフスワクチンの有効性を改善することがで きず、アデノウィルスワクチンを若干改善するだけであると報告されている。ア ルミニウム塩が有する問題は、注射部位の肉芽腫誘発およびａｌｕｍ製剤のロフ ト間変動を含む。

完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）は、強力な免疫刺激剤であり、実験主成 分として多くの抗原とともに用いられている。ＣＦＡは、鉱物油、アルラセルＡ ｒ１ａｃｅｌ　Ａ等の乳化剤、囮ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ ｓ等のマイコバクテリア死菌からなる。

抗原水溶液をこれらの成分と混合し、油中水型乳剤を作製する。しかし、ＣＦＡ は、疼痛、膿瘍形成、発熱を含む重篤な副作用を引き起こし、ヒトまたは動物の ワクチンには使用できない。この副作用は、主に、ＣＦＡのマイコバクテリア成 分に対する患者の反応によるものである。

不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）は、細菌成分を除いたＣＦＡと類似し ている。米国での使用は許可されていないが、他の国々では、いくつかのタイプ のワクチンにおいてＩＦＡが有用である。ＩＦＡは、ヒトに用いるインフルエン ザおよびポリオワクチノおよび、狂犬病、イヌジステンパー、口蹄疫を含むいく つかの動物ワクチンに、首尾よく用いられてきた。実験により、ＩＦＡで用いら れる油および乳化剤がマウスにおいて腫瘍を形成し得ることが示され、このこと は、臨床使用には別のアジュバントの選択が好ましいであろうことを示している 。

ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）は、マイツバクチリア細胞壁複合体の最小単位で あり、ＣＦＡにみられるアジュバント活性を生じる（Ｅｌｌｏｕｚら、（１９７ ４）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｎ５．　Ｓ９　： １３１７を参照されたい）。広汎なアジュバント活性および副作用を示す多くの ＭＤＰ合成アナログが作られている（Ｃｈｅｄｉｄら＜１９７８）　ヒ四り杜植 １ム■：６３に概説されている）。ワクチンアジュバントとして特に有用な３つ のアナログは、ＭＤＰのトレオニル誘導体（Ｂｙａｒｓら　（１９８７）　Ｖａ ｃｃｉｎｅ　Ｌ　：　２２３を参照）、ＭＤＰのｎ−ブチル誘導体（Ｃｈｅｄｊ ｄら、（１９８２）　Ｉｎｆｅｃｔ、　ａｎｄ　ＩＩｌυニエ３５　：　４１７ を参照）、およびムラミルトリペプチドの親ｏｂｉａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａ ｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｓ　ｎｔｈｅＬｉｃ　Ｃｏｍ　ｏｕｎｄｓ、Ｙ、Ｙａｍ ａｗ＋ｕｒａ　ａｎｄ　Ｓ、Ｋｏｔａｎｉ編、Ｅｘｃｅｒｐｔａ　Ｍｅｄｉｃａ 、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｐ１６７を参照）である。これらの化合物は、体液性お よび細胞性免疫を効果的に刺激し、そして低レベルの毒性を示す。

１つの有望なＭＤＰの親脂性誘導体は、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル− Ｄ−イソグルタミニルーし一アラニンー２−［１，２−ジパルミトイル−５ｎ− グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリロキシ）］　エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ ）である。このムラミルペプチドは、リン脂質の尾部を有し、これにより、分子 の疎水性部分と脂性環境との会合が可能となり、一方ムラミルペプチドペプチド 部分は水性環境が会合する。このように、ＭＴＰ−ＰＥそのものが乳化剤として 作用し、安定な水中油型エマルジョンを生じる。

本発明者の研究所において、マウスによる実験により、ＭＴＰ−ＰＥは、単純ヘ ルペスウィルスｇＤ抗原に対する抗ＨＳＶ　ｇＤ抗体力価の刺激においてアジュ バントとして有効であることが示されており、この有効性はＭＴＰ−ＰＥおよび ｇＤを水溶液よりむしろ油（ＩＦＡ）に送達されることにより太き（改善された 。ＩＦＡは臨床使用が許可されていないため、ＭＴＰ−ＰＥおよび抗原のための 他の油送達システムも検討した。０．００８％ツイーン８ｏを含む４％スクワレ ンおよび）Ｉｓ’／　ｇＤのエマルジョンは、モルモットにおいて極めて良い結 果が得られた。この処方、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ（。

低油性）は、皮下注射用針を通して乳化したが、極めて不安定であった。それに もかかわらず、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯは、モルモットにおいて高い抗体力価を示し 、そして免疫したモルモｙ）のＨＳＶ感染において良好な保護作用を示した（　 ５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄ。

ｒら、（１９８８）　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　１４１　：　１７２０−１７２７ およびＴｅｃｈｎ。

１ｏ　ｔｅａｌ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｄｅｖｅｌｏ　ｍ ｅｎｔ　（１９８８）　Ｌａ５ｋｙら、編、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、 　ｐ４４５−４６９を参照されたい）　。ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ処方は、モルモッ トにおける酵母が産生じた旧Ｖエンベロープタンパク質に対する免疫反応を刺激 する上でも有効であった。ＥＬＩＳＡ抗体力価、およびウィルス中和抗体力価が 、ＭＴＰ−ＰＥにより高レベルに刺激された。しかし、同じ処方をヤギおよびヒ ヒ等の大動物において試験すると、この組成物は有効でなかった。ヒトおよび他 の大動物においては、抗原分子と共にさらにアジュバント製剤を用いる方が望ま しいことが、この予測可能性の欠除から明らかである。

次に、本発明者の実験は、代謝可能な油および乳化剤からなるアジュバント組成 物が、ここにおいて油および乳化剤は油の小滴のすべてが実質的に、直径１ミク ロン以下である水中油型エマルジョンの形態で存在する、ワクチンの有効性を増 加するための有効ななアジュバント組成物であることを示した。研究は、油の小 滴が有意により大きい油および乳化剤を含むアジュバント組成物に比べ、前述の アジュバント組成物の優位性を示した。これらのアジュバント組成は、別の特許 出願の主題である（米国特許出願第３５７．０３５号、１９８９年５月２５日出 願）。

それにもかかわらず、アジュバント製剤のさらなる改善が、望ましい。例えば、 増加した細胞性免疫反応および増加した体液性免疫反応に至る免疫原性組成物が 望ましい。

ｌ肌旦！１ 従って、ワクチン、特にサブユニットワクチンの免疫原性改善が、本発明の目的 である。

また、細胞性および体液性免疫反応が活性化されるワクチンを提供することが、 本発明の目的である。

本発明のこれらのおよびその他の目的は、抗原／リポソーム成分および水中油型 エマルジョンの２成分からなるワクチン製剤を提供することにより達成される。

一部の実施例において用いられたリポソームは、後述するような適切な条件下で リポソームが生物学的膜と融合することを意味するフシジェニックリポソームと して知られている。しかし、フシジェニックリポソームである必要ない。特に、 ムラミルペプチドおよび代謝可能な油を用いて水中油型の形態で形成された組成 物が有用である。ここで油小滴は実質的にサブミクロンサイズであり、そして最 終ワクチン組成物を形成するためにエマルジョンと組合されるリポソーム／抗原 成分は別に形成される。

゛　の　な！　日 図１は、異なるアジュバント製剤を用いて、ヤギに抗原ｇＤ２で免疫した後の、 平均抗体力価の経口変化を示すグラフである。

図２は、異なるｅｎｖ２−３アジユバント製剤を用いて、ヤギに抗原ｇＢ２で免 疫した後の、平均抗体力価の経口変化を示すグラフである。

図３は、異なるアジュバント製剤を用いて、アカゲザルに抗原ｅｎｖ２０３／ｓ ｆ２で免疫した後の、平均抗体力価の経時変化を示すグラフである。

図４は、異なるアジ二バント製剤を用いて、ウサギに抗原ｇＤ２で免疫した後の 、平均抗体力価の経口変化を示すグラフである。

図５は、マラリア抗原および異なるアジユバントで免疫した後、異種マラリア原 虫を投与した数群のサルにおける、蓄積性寄生虫血症を示すグラフである。

図６は、インフルエンザワクチンおよび異なるアジユバントで免疫した後、イン フルエンザウィルスを感染させたマウスにおけるＥＬＩＳＡ抗体力価（上図）お よび生存率（下図）を示す２つのグラフのセットである。

、　の　の８日 本発明のワクチン組成物の各成分は既知のものであるが、本発明のように組合せ ることはなかった。特に、このようなワクチン組成物が、成分を別々に用いて得 られた過去のレベルよりも、免疫原の効率を増大させることは、予測を越えた驚 きであった。

ワクチン組成物の各成分は、一般的におよび一部は詳細に、好適な実施例で本明 細書に記載されているが、すべての成分は、当該技術分野で周知のものであり、 リポソーム、ムラミルペプチド、代謝可能な油および乳化剤等、本明細書で用い られる用語は、これらの成分について記載および確認するために、当業者におい て公知である。

本発明の実施において、用いられたリポソームは、ホスファチジルエタノールア ミン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルコリン等のホフスファチジ ルエーテルおよびエステル；ジオレオイルグリセロサクシネート等のグリセリド ；セレブロシド；ガングリオシド；スフィンゴミエリン；コレステ・ロール等の ステロイド；その他の脂質を含む法尻な脂質物質から調製され得る。リポソーム 調製の詳細な説明については、米国特許第４．２３５，８７１　；　４．７６２ ．７２０　；　４，７３７．３２３　；　４、７８９．６３３　；　４．８６１ ，５９７　；および４，８７３，０８９号を参照されたい。

リポソームは上記の特許に示される通り、先行技術において公知であるので、リ ポソーム調製法そのものは、本発明の一部ではない。一般的に、リポソームは、 エタノール注入（３ａｔｚｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ユｉｏ　ｈ　ｓ、Ａｃｔａ 、２９８１０１５　（１９７３））　、エーテル注入（Ｄｅａｍｅｒら、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ａｃｔａ、　４４３：６２９（１９７６）およ び５ｃｈｉｅｒｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ａｃｔａ、　５ ４２：１３７　（１９７８）　）、洗浄剤除去（Ｒａｚｉｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ａｃ工２６５：２４１　（１９７２））　、溶媒蒸発（ Ｍａｔｓｕ＋ｗａｔｏら、Ｊ、　Ｃｏ目０１ｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ、 　６２１４９　（１９７７＞）　、水乳剤におけるクロロホルムから有機溶媒の 蒸発（ＲＥＶ’　ｓ）、（Ｓｚｏｋａ　Ｊｒ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７５：４１９４　（１９７８））　；核小孔ポ リカーボネート膜を介するＭＬＶ’ｓまたはＬＵＶ’　ｓの押出しく０１ｓｏｎ ら、Ｂｉｏｃｈｅｗ＋、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　ＡｃＬａ、　５５７９　（１９７ ９）；　リン脂質混合物の凍結および融解（Ｐｉｃｋ、幻五上■互１」工」■旦 ■」ユ」１止」１幻ルＬ１１常法により、リポソームはサイズによって分類し、 議論されるリポソームのタイプを示すために、３文字の略語を用いる。多層の小 胞は通常ｒＭＬＶＪと称される。単層の小さな小胞はｒｓＵＶＪと称され、単層 の大きな小胞はｒ　ＬＵＶＪと称される。

これらの略称名には、時々、リポソームの化学成分が続くことがある。既知のリ ポソームの名称および型の要約については、Ｐａｐａｈａｄ　ｊｏｐｏｕ　ｌｏ ｓ、　Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　、　３０８　：　ｌ　 （１９７８）およびυ」ニレ」１ジ」皇九−ヱ加」工、　１４：２５０（１９７ ９＞を参照されたい。

生物学的活性物質（免疫原として有用な物質を含む）を細胞へ送達するうえで有 用であると提案したリポソームの種類は、フシジェニックリポソームとして知ら れている物質を包含する。これらは、ｐＨ感受性リポソームであり、生理的条件 における適切な変化に際し、凝集し、安定でなくなり、そして生物膜と融合する 。このようなリポソームは、種々の生理的現象を利用するために、典型的にはｐ Ｈ感受性に、典型的には酸感受性とされる。例えば、エンドサイト−シスは、負 に電荷したリポソームが哺乳類細胞により陥入される主な経路であることが示さ れている。エンドサイト−シスにより、すポソームがエンドソームまたはライリ ゾームの酸性環境におかれる。これらのオルガネラの環境が、生体の血流中の生 理条件に比べ酸性であるため、リポソームの内容物を細胞環境へ放出するのに、 ｐＨの変化を用い得る。抗原を直接細胞質内に放出すると、抗原の１型反応が起 こり得、それによって細胞媒介性免疫反応が刺激される。フシジェニックリポソ ームの例については、米国特許第４．７８９，６３３および４．８７３．０８９ 号を参照されたい。

一般的に、フシジェニックリポソームは、宿主の血流中で存在ｐＨにおいて電気 的に中性であるが、エンドソームまたはライリゾーム中で存在ｐＨ（典型的には 、ｐＨ６，５未満）において電荷している脂質分子を用いて調製する。適切な脂 質の例としては、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびバルミトイル ホモシスティンが含まれる。前述のフシジェニックリポソームは、典型的には、 二重層（すなわち、ＰＥ）の平面に対し垂直である有効断面領域が、頭部分にお いては疎水部分のそれより小さい、脂質分子を部分的に含む。さらに、フシジェ ニックリポソームは、前述の脂質分子（例、オレイン酸、ジオレオイルグリセロ ールサクシネート）の頭部分と水素結合できる脂質分子も含む。水素結合が生じ ると、二重層の有効表面積が縮小され、融合可能な準安定性の二重層となる。

この形態は、別の融合可能な二重層と密接に並ぶと六角形の第■相に容易に転位 し得、２つの膜が融合する。

融合の開始は、ｐＨにより調節し得、ｐＨにより頭部分間の水素結合の数が決定 される（すなわち、ｐＨ感受性フシジェニックリポソーム）。あるいは、融合は 、温度により調節することができ；融合可能な二重層はラメラα相、あるいは液 晶状態にある必要がある。Ｔｍ以下では、これらはゲル状であり得、あるいはラ メラβ相であり得、融合し得ない。温度をＴｍ以上に上げると、融合を誘導し得 る。

しかし、フシジェニックリポソームは、本発明の一部の実施例にすぎず、リポソ ームは以前に多くの形態で知られていることを強調しなければならない。フシジ ェニックリポソームを記載した刊行物の典型的な例については、Ｃｏｎｎｏｒ　 ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、（１９８４）　８１ ：１７１５−１７１８Ｈ５ｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ 　Ｓｃｉ　Ｕ、Ｓ、Ａ、（１９８０）？？＋４４２−４４６Ｈ５ｃｈｅｎｌｖａ ｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ａｃｔａ、　（１９８１）　６４９： ６３３−６４１；　５ｃｈｅｎｌｖａｎら、Ｃｈｅｍ、ｈ　ｓ、Ｌｉ　ｉｄｓ　 （１９８１）　２８：１６５−１８０：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら、Ｊ、Ｂｏｉｌ 、Ｃｈｅｍ、（１９８３）　２５８：３４９−３４１５ＨＹａｔｖｉｎら。

５ｃｉｅｎｃｅ（１９８０）２１０：１２５３−１２５５；　Ｄｕｚｇｕｎｅｓ 　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ（１９８５）　２４：３０９１−３０９８：　Ｓ Ｌｒａｕｂｉｎｇｅｒ、Ｒｅｃｅ　ｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｔａｒｅｔｉｎ 　ｏｆ　Ｄｒｕ　ｓ　（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ！１ｍ）　ｐｐ、２９７−３１ ５．　Ｐ１ｅｎｕ＋ｓ　Ｐｒｅｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅ ｒら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、（１９８５）１７９：１４８−１５４を参照された い。リポソーム、その性質およびその調製法に関する一般的情報については、Ｌ ｉ　ｏｓｏｍｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　（Ｇｒｅｇ。

ｒｉａｄｉｓ編）　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌｏｒｉ ｄａ（１９８３）を参照されたい。リポソーム組成物、その調製、および免疫原 として抗原を有するリポソームの使用の多くの異なる側面を記載した刊行物リス トを含む、免疫学的アジュバントとしてのリポソーム使用の最近の総説について は、虹姐旺Ｕ牡ｓ　１ｍ肚凹旦■」工ＬＬＬ（１９９０）　１１・８９−９７を 参照されたい。

本発明は、フシジェニックリポソームおよび非フシジェニックリポソームの両者 を用いて、多くのリポソーム組成物を用いて実施した。本明細書中のこれらのお よび他の実施例において、以下の略語を用いる。ＰＥ、ホスファチジルエタノー ルアミン、　ＧＳ、ジオレオイルグリセロールサクシネート；ＣＨＯＬ。

コレステロール：ＯＡ、オレイン酸：ＰＣ，ホスファチジルコリン、およびＰＳ 、ホスファチジルセリン。好適なフシジェニックリポソーム組成物は、ホスファ チジルエタノールアミンおよびノオレオイルグリセロールサクン不−トを８：２ のモル比で含む；この組成物をＰＥ／ＧＳ（８：２）で略す。ＰＥ／ＧＳ／ＣＨ ＯＬ（８：２：ｌ）も、好適なフシジェニックリポソーム組成物である。非フシ ジェニックリポソーム組成物には、ＰＣ／ＰＳ（７：３）およびＰＣ／ＰＳ／Ｃ ＨＯＬ（７：３・１）が含まれる。

本発明の全体のワクチン製剤は、前述の通り、２つの主成分を含む：抗原／リポ ソーム成分および油エマルジョンである。

従って、本明細書に示すリポソームは、免疫反応を誘導するために用いられる抗 原を含む第一の組成物の形で調製され、この第一の成分は、第二の成分（エマル ジョン）と配合され本発明の組成物を形成する。

本明細書で用いられる抗原という用語は、動物の血流中に外来物質が入った場合 、このような動物の組織に近づくことにより、特定的抗体の形成を刺激し、イン ビボおよびインビトロでこのような抗体と特異的に反応するすべての物質をいう （タンパク質、タンパク質−多糖類、タンパク質−リポ多糖、多糖類、リポ多糖 、ウィルスサブユニット、ウィルス本体を含む）。さらに、抗原は、抗原レセプ ターを有するＴリンパ球の増殖を刺激し、そしていわゆる細胞媒介性免疫の一連 の反応を開始するためにリンパ球と反応し得る。

ハブテンは、この定義の範囲内に含まれる。ハブテンは、その免疫学的特異性を 決定づける抗原分子または抗原複合体の一部分である。一般的に、ハブテンは、 天然に生ずる抗原ではペプチドまたは多糖類である。人工的な抗原は、アルサニ ル酸（ａｒｓａｎｉｌｉｃ　ａｃｉｄ）誘導体等の低分子量物質であり得る。

ハブテンは、インビボまたはインビトロにおいて、ハブテンの抗原型（例えば、 免疫原物質と結合したハブテン）により誘発された抗体またはＴリンパ球と、特 異的に反応し得る。言い換えれば、抗原決定基、抗原決定基群とハブテン基（ｈ ａｐｔｅｎｊｃ　ｇｒｏｕｐｉｎｇ）である。

本発明のワクチン製剤は、抗原の有効量を用い得る。すなわち、アジュバントと 組み合わせてウィルスあるいは他の病原体に、その後接触しても生体を保護する ように特異的および十分な免疫反応を生体に起こし得る抗原量を含み得る。

抗原は、同技術分野で公知の方法により産生じ得、あるいは市販物を購入し得る 。本発明の範囲内の抗原は、不活性化ウィルス粒子の全部、単離されたウィルス タンパク質、およびタンパク質サブユニット（遺伝子操作技術により産生された タンパク等）を含む。本発明のワクチンは、多くの病原体に対して哺乳動物を免 疫するため、および診断用途の抗体形成を誘発するために用い得る。

本発明のリポソーム含有組成物に取込まれる抗原の例は、遺伝子操作されたチャ イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細１１ａから分泌された組換えタンパク質、 および単純ヘルペスウィルス由来の組換えタンパク質であるＨＳＶ　ｒｇＤ２と よばれる組換えタンパク質を含む。このタンパク質は切断される通常のアンカー 領域を有し、組織培養培地中に分泌されるグリコジル化タンパク質を与える。リ ポソーム中に用いられるＨＳＶｇＤ２は、ＣＨＯ培地中から純度９０％以上で精 製された。）ＩＳＶ　ｒｇＢ２は、上記ＨＳＶ　ｇＤ２と同様、ＣＨＯ細胞中に 産生される、十分にグリコジル化された分泌タンパクである。Ｉ（ＩＶ　ｇｐ１ ２０は、上記）ＩＳＶ　ｇＤ２について記載したのと同様の方法により産生され る十分にグリコジル化されたヒト免疫欠損ウィルスタンパク質である。旧Ｖ　Ｒ Ｔ６は、ＨＩＭ逆転写酵素の組換え体であるが、遺伝子操作にヨル１匹崩立ｎμ ｍ工旺江匡且において産生される。このタンパク質は、生体内逆転写酵素のＣ末 端を欠く。ＨＩＶタンパク質、および多くの異なる市販インフルエンザワクチン の両者は、本発明の実施において使用するため、リポゾーム中に取り込まれる。

血清ｌは、■旦胚史ｊコニ匡１仏已メロシイトタンバク質の組換え型であり、江 ｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ士題巨匡並により遺伝子操作で産生される。このタンパ ク質は、生体内メロゾイト抗原のＮ末端２６２個のアミノ酸のみを含む。ＨＡタ イワンは、インフルエンザ＾／タイワン／ｌ／８６型（ＨＩＮＩ）の血球凝集素 であり、市販のインフルエンザワクチン用に、Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓによりニ ワトリ卵において培養する。合成の１１個のアミノ酸からなるペプチド、Ｈ−１ １ｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈ　ｒ−Ｖａ　ｌ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｓｅ　ｒ−Ｓｅｒ −Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−ＯＨは、天然の）ＩＳＶ　ｇＢ２において同定さ れたＴ−細胞エピトープに相当しくＨａｎｋｅ、　Ｔ、ら、（１９９１）　：　 Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ　６５：１１７７−１１８６〉、また用いられる。

本発明の組成物と共に用いるため、他の多くの抗原が特定的に予期される。これ らは、遺伝子操作された旧Ｖタンパク質である旧Ｖ−ｅｎｖ　２−３；ｆａｌｃ 、２．３．等の種々のマラリアウィルス；ｌ１ｅｒＯ：血清Ｎ；およびｖｉｖａ ｘ　１．２．および３が含まれる。ｇＢおよびｇＨと呼ばれるタンパク質を含む サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）タンパク質も、種々のＣ型肝炎ウィルス（ＨＣ Ｖ）タンパク質と共に予期される。これらの抗原についてより詳細な記載、およ びこれらのおよび池の抗原について詳細に記載されている多（の刊行物のリスト については、１９８９年５月２５日に出願された米国特許出願第３５７．０３５ を参照されたい。さらに、対応するＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９０１０２９５４． １９９０年５月２４日出願、ｒＡｄｊｕｖａｎｔ　Ｆ。

ｒＩｌｇｕｌａｔｉｏｎ　Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ　ａ　Ｓｕｂｍｉｅｒｏｎ　Ｏ ｉｌ　Ｄｒｏｐｌｅｔ　ＥｍｕｌｓｉｏｎＪも参照されたい。

一般的に、本発明は、ワクチン開発に適切なすべての天然または組換えタンパク 質、またはサブユニ、トタンバク質、およびＢ−細胞およびＴ−細胞エピトープ を包含するペプチドとともに用い得る。非タンパク質性抗原（例として、炭水化 物、糖脂質）もまた用い得る。

本発明に採用し得る個々のおよびすべての抗原について、特定のガイダンスを提 供する、単回投与指示を指定することはできない。抗原の有効量は、同技術分野 において理解されているように、その持っている活性と純度による関数であり得 る。典型的な値は、本発明組成物の種々の成分の相対量を記載する節において、 論議される。

本発明のエマルジョン成分は、ムラミルペプチドおよび代謝可能な油の水中油型 エマルジョンを包含する。懸濁した油小滴はすべての適切な大きさであり得、そ して後述の通り、サブミクロンサイズの油小滴が好適ではあるが、必ずしも、ワ クチンの有効性を高めるために実質的にサブミクロンである必要はない。ムラミ ルペプチドは、アジュバント組成物中の免疫刺激剤として機能し、そしてまた乳 化作用を持つため、別の乳化剤を必要としない。にもかかわらず、本発明のエマ ルジョン成分は、好ましくは、１つあるいは以上の乳化剤を含む。

本発明の組成物には、すべての免疫反応刺激性のムラミルペプチド（グリコペプ チドとしても知られている）が使用し得る。多（の好適なムラミルペプチドを、 以下に示す。

乳化剤／免疫刺激剤の配合剤の例としては、上記の５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａ ｄｏｒらの２件の刊行物に記載されている親指性ムラミルペプチドがある。これ らの物質は、免疫刺激基として作用する塩基性Ｎ−アセチルムラミルペプチド（ 親水性部分）を包含し、得られる化合物に界面活性作用を与える親脂性部分も有 する。このような化合物および、他のタイプの両親媒性免疫刺激剤が、免疫刺激 剤および乳化剤として作用し、そして本発明の実施において好ましい。さらに、 両親媒性免疫刺激物質と、両親媒性でない第二の免疫刺激物質としを併用して本 発明を実施することもできる。例として、親脂性ムラミルペプチドと本質的に置 換されていない（すなわち本質的に親水性）ムラミルジペプチドの併用であり得 る。

本発明の好適な免疫反応刺激性ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチルムラミル−し −アラニル−Ｄ−イソグルタミンの関連化合物群および一般的銹導体であり、こ れらについては、Ｅｌｌｏｕｚら（１９７４）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＆Ｂｉｏ　ｈ 　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍ、　５９：１３１７により、ｊｉ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ ｓｉｓにおいて、免疫学的アジュバント活性を持つ最小の有効単位であると決定 され、フロイントの完全アジユバントのマイコバクテリア成分である多くのジペ プチドおよびポリペプチド置換されたムラミン酸誘導体がその後開発され、免疫 刺激作用を有することが見いだされた。

これらのムラミルペプチドは、多様な化合物群であるが、一般的に、以下の構造 式１により表すことができる。

（以下余白） ただし、ビラン環のＯＨ基は、水素、アルキル基、アシル基あるいはその類似基 で置換されるか、特に６位の酸素は、窒素を含む置換基により置換され得る。２ −アミ７基は、アシル基または他のアミドである。ラクチル側鎖は、修飾され、 例えば、エチルまたはその他の２位がアルキル置換されたものである。ペプチド 部分はジペプチドまたはポリペプチドであり、さらにその誘導体でもよい。ビラ ノンル化合物のフラノシルアナログも、免疫増強作用を有し、本発明において有 用である。

本発明において使用し得るムラミルペプチドは、米国特許第４．２３５．７７１ 号および第４．１８６．１９４号に記載された通り、メソーα、ε−ジアミノビ メリノ酸と結合したジサッカライドおよびテトラサツカライドである。

本発明の実施において使用し得る別の免疫反応刺激性ムラミルペプチドは、米国 特許第４，０９４．９７１　；　４．１０１．５３６　；　４，１５３゜６８４ ；４．２３５．７７１　、４．３２３．５５９　：　４．３２７．０ｇ５　、４ ．１８５．０８９　；　４．０８２゜７３６、４，３６９．１７８；　４，３１ ４，９９８；　４，０１１２，７３５および４，１８６．１９４号に開示されて いる。これらの特許におけるムラミルペプチドの開示は、ここに引用文献として 、全部詳細に記載したと同様、明細書の一部分といえる。日本国特許Ｊ５４０７ ９−２２２７、Ｊ５４０７９−２２８、Ｊ５４１２０６−６９６に示される化合 物も、本発明の実施に有用である。

これらの化合物の調製法は、開示され、同業者に周知である。調製工程の例は、 米国特許第４．０８２．７３６および４，０８２．７３５号に記載されている。

さらに、同様の調製工程は、前のパラグラフで引用した米国特許において見出さ れるであろう。

好ましいムラミルペプチドは、以下の構造式■を有する。

ここで、Ｒは１〜２２個の炭素原子を含む非置換または置換アルキルラジカル、 あるいは６〜ｌＯ個の炭素原子を含む非置換または置換アリルラジカルを表わし 、 Ｒ１およびＲ２は、同一あるいは異なる、水素または１〜２２個の炭素原子を含 むアシルラジカルを表わし、Ｒ３は、水素または１〜２２個の炭素原子のアルキ ル基または７〜１０個の炭素原子のアリル基を表わし、Ｒ４は、水素または１〜 ７個の炭素原子のアルキル基を表わし、ｎは、０または１であり、 Ｘおよび２は、それぞれ独立して、アラニル、バリル、ロイシル、インロイシル 、α−アミノブチリル、トレオニル、メチオニル、システィンニル、グルタミル 、グルタミニル、イングルタミル、イソグルタミンル、アスパルチル、フェニル アラニル、チロシル、リシル、オリンチニル、アルギニル、ヒスチジル、アスパ ルチル、プロリル、ヒドロキシブロリル、セリル、またはグリンル基を表わし、 Ｒ５は、エステル化またはアミデート化されてもよいアミノ酸末端のカルボキシ ル基を表わし、そしてＹは、−ＮＨＣＨＲ６Ｃ）１２ＣＨ２Ｃｏ−を表わすが、 ここでＲ６は、エステル化またはアミデート化されてもよいカルボキシル基を表 わす。

エステル化またはアミデート化されてもよいカルボキシル基とは、カルボキシル 基そのもの、または、Ｃ，−Ｃ，アルカノールでエステル化したカルボキシル基 、例えばメタノール、エタノール、プロパツール、ブタノール、カルバモイル基 等であり、又はその窒素原子が、非置換あるいはＣ，−Ｃ７アルキル、特にＣ， −Ｃ４アルキル、アリル、特にフェニル、アリルアルキル、特にベンジル基でモ ノ置換またはジ置換されたカルバモイル基である。このカルバモイル基は、アル キリデンラジカル、例えばブチリデン、またはペンチリデンラジカルで置換され てもよい。さらに、カルバモイル基Ｒ５は、窒素原子のカルバモイルメチル基で 置換してもよい。

特に、好ましい化合物は、構造式Ｈにおいて、ＲおよびＲ１が同−又は異なる、 水素あるいは１〜２２個の炭素原子を含むアシルラジカルであり　Ｒ２がメチル 基で、Ｒ３が水素で、ＸがＬ−アラニル基で、ＹがＤ−イソグルタミニル基、ｎ がＯの化合物である。

ムラミルペプチドの別の好ましい基は、構造式■において、ＲおよびＲ１が水素 あるいは１〜２２個の炭素原子を含むアシル基で、Ｒ２がメチル基で　Ｒ３が水 素で、Ｒ４がメチル基またはブチル基で、ＸがＬ−バリル、Ｌ−セリル、Ｌ−ア ラニル、Ｌ−トレオニル、Ｌ−α−アミノブチリル基である化合物である。

特別の例は、以下の化合物を含む。

Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−α−アミノブチリル−Ｄ−イソグルタミン、 ６−０−ステアロイル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−α−アミノブチリル−Ｄ− イソグルタミン、 Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−）レオニル−〇−イソグルタミン、Ｎ−アセチルム ラミル−Ｌ−バリル−Ｄ〜イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニ ル−Ｄ−グルタミンｎ−ブチルエステル、 Ｎ−アセチル−デスメチル−〇−ムラミルーＬ−アラニルーＯ−イングルタミン 、 Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン、Ｎ−アセチルムラミル −し−セリル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチル（ブチルムラミル）−り一α −アミノブチルーＤ−イソグルタミン、 Ｎ−アセチル（ブチルムラミル）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンである。

免疫刺激性ムラミルペプチドの有効量は、抗原と共に投与した場合の抗体力価が 、ムラミルペプチドを併用投与しない場合の抗体力価より増加する作用を有する 量である。予測される通り、各ムラミルペプチドは、他のムラミルペプチドとは 異なる有効用量範囲が考えられる。従って、単回用量範囲は、本発明の範囲内で 考えられる各ムラミルペプチドにおいて、正確にあてはまるというわけではない 。しかし、一般的に、ムラミルペプチドはワクチン中ｏ、ｏｏｔ〜５％　（Ｗ／ Ｖ）が好ましい。より好ましくは、０．０１〜３％（Ｗ／Ｖ）である。

上記免疫刺激性ムラミルペプチドのほとんどは、本質的に親水性である。従って 、これらは、別々の乳化剤を使用することが考えられる（前述の通り、これらは 免疫刺激剤でもある）。たまに、上記化合物が親脂性を有することもあり、その ような化合物は、その糖部分に脂肪酸置換基および／またはアリル置換基、特に 、１４〜２２個の炭素原子を含む１個以上のアシル置換基を１個以上含み、特に 、このようなアシル置換基を１個以上含む化合物である。しかし、ペプチド部分 のカルボキシレート基または側鎖に脂質部分を結合させたムラミルペプチドにお いても、親脂性を得ることができる。特に、末端カルボキンレート基を介してペ プチド部分と結合する１つ以上の脂質基を有する化合物は、好ましい化合物群を 示す。

この結合は、直接１４〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸アルコールと末端カルボ キシレートとの間でエステル結合を形成させるかあるいは、二官能性結合基、例 えばエタノールアミンを用いて、エステルまたはアミド結合を介して脂質とカル ボキシレートを結合することにより、直接的に容易に得ることができる。本発明 のこの具体化例において特に好ましいものは、リン脂質であり、容易に結合可能 な官能基を提供するリン酸基である。ジアシルフォスフォグリセリドは、容易に 結合可能なリン脂質等を提供する。フォスファチジルエタノールアミンは容易に 結合可能な、生体内に存在する化合物であり、アミド結合によりペプチド部分の 末端カルボキンレートに容易に結合する。他の脂質として、アシルグリセロール 、フォスファチジルフリン、フォスファチジルセリン、フォスファチジールイノ シトール、フォスファチジルグリセロール、カルシオリビン、スフィンゴミエリ ンが含まれる。

多くの好ましい媒性免疫刺激性を複数有するペプチドは、以下の構造式■に示さ れる。

こコテ、Ｒ，Ｒ１−Ｒ’、Ｘ、　ＹＳＺ、　ｎｌ；Ｌ、前述の通りである。Ｌは ここに示した脂質部分を示す。

要約すると、分子のムラミン酸部分とペプチド部分は、共に親水性部分を提供す る。分子内には親脂性部分もあり、一般的に、この親脂性は長鎖炭水化物、特に 脂肪酸として示される。この脂肪酸または他の炭水化物を含有するラジカルは、 糖のヒドロキシル基に結合し得、あるいは、例えば直接ペプチド部分に存在する 遊離アミノ酸と脂肪酸との反応により、あるいは、例えばヒドロキシルアミンの ような結合基を介して、ペプチドのカルボ牛シル基とリン酸基等の脂質中の官を 基との間に結合に形成することにより、分子のペプチド部分に直接結合すること ができる。リン脂質部分は、特に、親脂性ムラミルペプチドを形成するうえで好 ましい。好ましい化合物群には、ムラミルペプチドおよびトリペプチドが含まれ これらは、ヒドロキシアルキルアミン部分によりリン脂質部分の結合している。

例として、特に好ましい化合物は、Ｃ４ｂａ−Ｇｅｉｇｙ、　Ｌｔｄ、、　Ｂａ ５ａ１．　スイスにより製造された、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ −イソグルタミニルーし一アラニンー２−［１，２−ジパルミトイル−３ｎ−グ リセロ−３−（ヒドロキシフオスフォリルオキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−Ｐ Ｅと略す）である。

本発明に用いられた別の成分は、代謝可能で非毒性の油で、その１つは好ましく は、６〜３０個の炭素原子を有するアルカン、アルケン、アルキン、および対応 する酸とアルコール、そのエーテルとエステル、さらにその混合物を含むがこれ らに限定されるわけではない。この油は、植物性油、魚油、動物性油、または合 成油で、アジュバントの投与される対照となる生体内で代謝され、かつその対象 生体内で非毒性であればよい。対象物とは、動物であり、典型的には哺乳動物、 好ましくはヒトである。鉱油および同様の有毒なる石油留出油は、本発明から特 に除く。

本発明の油成分は、長鎖アルカン、アルケル、もしくはアルキン、またはその酸 誘導体もしくはアルコール誘導体のいずれでもよく、それらは遊離酸、塩、また はエステルとして存在し得る。エステルとしては、トリグリセリド、および１゜ ２−プロパンジオールまたは同様のポリヒドロキシアルコールのエステルのよう な、モノエステル、ジエステル、もしくはトリエステルとして存在し得る。アル コールは、例えば酢酸、プロパン酸、クエン酸等のモノまたはポリの官能酸を用 いてアンル化し得る。油であり前述した池の基準を満たしている長鎖アルコール 由来のエーテルもまた使用し得る。

個々のアルカン、アルケン、またはアルキン成分、およびその酸またはアルコー ル誘導体は一般に、６から３０の炭素原子を有している。これら成分は直鎖構造 または枝分れ鎖構造をしている。それは完全飽和であるか、または１つ以上の二 重結合または三重結合を有し得る。モノまたはポリエステル、またはエステル結 合・スの油の場合は、個々の脂肪酸または脂肪アルコール成分に適用される炭素 数６から３０の限定は、全炭素数ではない。

人工池を含む、代謝し得る油であれば本発明に用いられ得るが、動物、魚、また は植物源由来の油が好ましい。油を、それが投与される宿主により代謝される必 要がある。さもなければ、その油成分は膿瘍、肉芽腫、または癌腫さえも形成し 、または、それが獣医術の実務で用いられるなら、代謝されない油が消費者の心 身に害を及ぼすかもしれないため、予防接種した鳥および動物の肉がヒトの消費 に適合し得ない。

植物油の供給源としては堅果、種および穀物が挙げられる。

落花生油、大豆油、ヤシ油、およびオリーブ油が最も容易に利用可能な堅果油の 例である。種油としては紅花油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油等が挙げられる。

穀物群の中では、トウモロコシ油が最も容易に利用可能であるが、コムギ、オー トムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギのような他の穀類もまた用いられ得 る。

植物油を得る技術は開発されており、また公知である。これら、および他の同様 な油の組成物は、例えばＭｅｒｃｋインデックスおよび食物、栄養物、および食 品工学における供給源物質に見いだし得る。

グリセロールおよび１．２−プロパンジオールの、６から１０の炭素原子を有す る脂肪酸エステルは、種油においては自然に生じないものであるが、堅果油およ び種油から得た適切な物質の加水分解、分離、およびエステル化により調製し得 る。

これらの製品はＮＥＯＢＥ噸の商標名でＰＶＯＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉ ｎｃ、、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　４ １６　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　５ｔｒｅｅｔＳＢ。

ｏｎｇｏｎ、　ＮＪ等から市販されている。

多くの動物源からの油は、本発明のアジュバントおよびワクチンに採用され得る 。動物油および脂肪は、トリグリセリドであり、魚または植物からの油よりも高 い飽和度を有するため、体温付近では通常固体である。しかし、脂肪酸は、遊離 脂肪酸を提供する部分的または完全なトリグリセリド鹸化により、動物脂肪から 得ることができる。哺乳類の乳からの脂肪および油は、代謝可能であり、本発明 の実施に用いられ得る。動物源から精油を得るために必要である分離、精製、お よび鹸化等の方法は当業者に周知である。

はとんどの魚は容易に回収し得る代謝可能な油を含有している。例えば、タラ肝 油、サメ肝油、および鯨蝋のような鯨油が、本発明で用いられ得る魚油の一例で ある。枝分れ鎖部の多くは、５−炭素イソブレン単位で生化学的に合成され、一 般にテルペノイドと称される。サメ肝油は、スクアレン、２．６、ｌ０１１５． １９．２３−へキサメチル−２，６，１Ｏ１１４，１８，２２−テトラコサへキ サエン（ｔｅｔｒａｃｏｓａｈｅｘａｅｎｅ）として知られる、本発明において 特に好適である、枝分れ鎖の不飽和テルペノイドを含有する。スクアレンが飽和 してできるスクアランもまた特に好適な油である。スクアランおよびスクアレン を含む魚油は市販されており容易に入手可能であるが、また当業者に公知の方法 からも得られる。

これらのアジュバントおよびワクチン製剤の油成分は０．５から１５容積％であ り、好ましくは１から１２容積％である。最も好ましくは１から４容積％の油が 用いられる。

これらのアジュバント組成物の水分は一般に生理食塩水であるが、好適な実施態 様では、純水である。これらの組成物は非経口投与されるものであるため、組成 物と体液のイオン濃度が異なるために生じる、投与後の膨れまたは組成物の急速 な吸収を防ぐために、ワクチンとして用いられる最終緩衝溶液は、好適には、そ の浸透圧、すなわち重量オスモル濃度が正常な体液と本質的に同等であるように 作られる。通常な生理的条件に適合するｐＨを維持するために、生理的食塩水を 緩衝剤で処理することもまた好ましい。さらにある場合には、グリコペプチドの ような特定の組成物成分の安定性を確保するため、ｐＨを特定レベルに維持する 必要がある。

生理的に受容可能であればどのような緩衝液をも本発明に用いられ得るが、リン 酸緩衝溶液が好ましい。クエン酸塩、酢酸塩、トリス（ｔｒｉｓ）　、重炭酸塩 、または炭酸塩のような他の受容可能な緩衝液がリン酸緩衝溶液の代わりに用い られ得る。水成分のｐＨは好ましくは６．０から８．０の間である。

しかし、アジュバントがミクｏ７以下の粒子からなる水中油型エマルジョンとし て調整されるなら、純水がエマルシコン形成時のエマルジョンの水成分として好 ましい。塩分の濃度を上昇せしめると、所望の小さい水滴サイズを得ることがよ り困難となる。最終ワクチン製剤がアジュバントから調製される場合には、抗原 物質が、所望のワクチン組成物を提供するために、適切な重量オスモル濃度で緩 衝液に添加され得る。

これらの組成物に採用される水分の量は、組成物の値を均一にするために必要な 量である。すなわち、１００％にするに十分な水分の量が、組成物を一定容量に するために上述した池の成分と混合される。

多くの乳化剤および懸濁剤が一般に薬学サイエンスにおいて用いられている。こ れらには樹木からの樹脂、植物性タンパク質、並びにアルギン酸塩およびセルロ ースのような糖をベースにしたポリマー、等の天然誘導される物質が含まれる。

特定のオキシポリマー、または炭素骨格の上に水酸基または他の親水性置換基を 有するポリマー、例えばポビドン（ｐｏｖｆｄｏｎｅ）　、ポリビニルアルコー ル、およびグリコールエーテルをベースのモノおよびポリ官能化合物は、界面活 性剤活性を有する。長鎖脂肪酸由来化合物が実質的に本発明に用いられ得る乳化 剤および懸濁剤の第３の群を形成する。前出の界面活性剤はどれもそれらが無毒 性である限り有用である。

本発明に従い用いられ得る適切な乳化剤（界面活性剤または洗浄剤にも当てはま る）の例としては以下が挙げられる：１、ナトリウム、カリウム、アンモニウム 、および高級脂肪酸（ＣＩｌｌ−Ｃ２２）のアルカノールアンモニウム塩のよう な水溶性石鹸、そして特にナトリウムおよびカリウムの獣脂、並びにココヤシ石 鹸。

２、約８から２２の炭素原子、およびスルホン酸および硫酸エステルラジカルか らなる群から選択されるラジカルを含有するアルキルラジカルをその分子構造に 有する有機物の硫酸反応産物の水溶性塩に代表され得る、アニオン合成非石鹸洗 浄剤。これらの例を以下に挙げる：獣脂またはヤシ油から誘導されたナトリウム またはカリウムアルキル硫酸塩；ナトリウムまたはカリウムアルキルベンゼンス ルホン酸塩；ナトリウムアルキルグリセリルエーテルスルホン酸塩；ナトリウム ヤシ油脂肪酸モノグリセリドスルホン酸塩および硫酸塩；１モル以上の高級アル コールおよび約１から６モルのエチレンオキシドの反応産物の硫酸エステルのナ トリウム塩またはカリウム塩：１分子当りエチレンオキシドを１からＩＯ単位有 しており、そしてアルキルラジカルが８から１２炭素原子を含有している、ナト リウムまたはカリウムアルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルホン酸 塩；イセチオン（ｉｓｅｔｈｉｏｎｉｃ）酸でエステル化され、水酸化ナトリウ ムで中和された脂肪酸の反応産物；メチルタウリンの脂肪酸アミドのナトリウム 塩またはカリウム塩；および５０３−スルホン化ｃ、　＠−Ｃ２４α−オレフィ ンのナトリウム塩およびカリウム塩。

３、アルキレンオキシド基と有機疎水性化合物の縮合により作製された非イオン 合成洗浄剤。典型的疎水性基には、プロピレンオキシドとプロピレングリコール との縮合産物、アルキルフェノール、プロピレンオキシドとエチレンジアミンの 縮合産物、８から２２の炭素原子を有する高級アルコール、および脂肪酸のアミ ドが含まれる。

４、半極性特性を有する、酸化アミン、酸化ホスフィンおよびスルホキシドのよ うな非イオン洗浄剤。長鎖第三級アミンオキシドの例としては、ジメチルドデン ルアミ／オキシドおよびビス−（２−ヒドロキシエチル）ドデシルアミンが挙げ られる。ホスフィンオキシトの例は、１９６７年２月１５日発行の米国特許第３ ．３０４．２６３号に記載されており、ジメチルドデシルホスフィンオ牛ンドお よびジメチル−（２−ヒドロキシエチル）ホスフィンオキシトが挙げられる。

５、Ｒ，−３ｏ−Ｒ２の式（式中Ｒ２およびＲ２は置換された、または置換され ていないアルキルラジカルであり、Ｒ２は約１０がら約２８の炭素原子を含有し 、Ｒ２は１から３の炭素原子を含有する）に相当するような、長鎖スルホキシド 。これらのスルホキシドの例としては、ドデシルメチルスルホキシドおよび３− ヒドロキシトリデンルメチルスルホキシドが挙げられる。

６．３−トデンルアミノブロビオン酸ナトリウムおよびナトリウム３−ドデ／ル アミ／プロパンスルホン酸ナトリウムのような、両性合成洗浄剤。

７、　３−（Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−へ牛すデシルアンモニオ）プロパン−１− スルホン酸ナトリウム、および３−（Ｎ、Ｎ−ジメチルートヘキサデシルアンモ ニオ）−２−ヒドロキシ−プロパン−１−スルホン酸ナトリウムのような両性イ オン合成洗浄剤。

さらに、以下に挙げる全てのタイプの乳化剤が本発明の組成物に用いられ得る： （ａ）脂肪酸、ロジン酸、およびトール油の石鹸（すなわちアルカリ塩）；（ｂ ）アルキルアレーンスルホン酸塩；（Ｃ）枝分れ鎖および直鎖の両方の疎水性基 、並びに第一級および第二級硫酸基を持つ界面活性剤を含む、アルキル硫酸塩； （ｄ）脂肪アンル化メチルタウリンおよび硫酸脂肪モノグリセリドのような、疎 水性および親水性基間の中間結合を含有する、硫酸塩およびスルホノ酸塩；（ｅ ）ポリエチレンクリコ−ルｃｏ　長ｍ　酸エステル、とりわけトール浦エステル ；（ｆ）フルキルフェノールのポリエチレングリコールエーテル；　（ｇ）長鎖 アルコールおよびメルカプタンのポリエチレングリコールエーテル；（ｈ）脂肪 アシルジェタノールアミド；およヒ（＋）エチレンオキシドおよびプロピレンオ キシドのブロック共重合物。界面活性剤は複数の方法で分類され得るので、ここ で述べる界面活性剤の多くのクラスが前述した界面活性剤のクラスと重複する。

特に設計された、また生物学的状況に通常用いられる、乳化剤は多くある。例え ば、多くの生物学的洗浄剤（界面活性剤）がＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏｍｐａｎｙの１９８７　Ｃａｔａｌｏｇ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａ ｎｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓの３１０−３１６頁等に挙げられて いる。

そのような界面活性剤は４つの基本タイプ、アニオン、カチオン、両性イオン、 および非イオンに区分される：アニオン洗浄剤の例としては、アルギン酸、カプ リル酸、コール酸、■−デカンスルホン酸、デオキシコール酸、１−ドデカンス ルホン酸、Ｎ−ラウロイルサルコンン、およびタウロコール酸が挙げられる。カ チオン洗浄剤としては、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコ ニウム、ベンジルジメチルへキサデフル３ｇ化アンモニウム、塩化セチルピリジ ニウム、塩化メチルベンゼトニウム、および４−ピコリンドデシル硫酸塩が挙げ られる。両性洗浄剤の例としては、３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメ チルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸＃ｍ”通常ＣＨＡＰＳと略される） 　、３−［（コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオコー２−ヒドロ半／ −１−プロパンスルホン酸塩（通常ＣＨＡＰＳＯと略される）、Ｎ−ドデシル− Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、およびリン− α−ホスファチジルコリンが挙げられる。非イオン洗浄剤の例としては、デカノ イル−Ｎ−メチルグルカミド、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、ｎ −ドデンルβ−Ｄ−グルコピラノシド、高級アルコールのエチレンオキシド縮合 物（例：　Ｌｕｂｒｏｌの商標名で販売）、脂肪酸のポリオキシエチレンエーテ ル（とりわけＣｌ２−Ｃ２１１の脂肪酸）、ポリオキンエチレンソルビタン脂肪 酸エーテル（例：　Ｔｗｅｅｎの商標名で販売）、およびソルビタン脂肪酸エー テル（例：　５ｐａｎの商標名で販売）が挙げられる。

界面活性剤のとりわけ有用な群はソルビタンをベースにした非イオンの界面活性 剤である。これらの界面活性剤は、脂肪酸の１以上の当量と反応する１、４−ソ ルビタンを与える、ソルビトールを脱水することにより調製される。脂肪酸置換 された成分は、エチレンオキシドと反応し得、界面活性剤の第２の群を与え得る 。

脂肪酸置換されたソルビタン界面活性剤は１．４−ソルビタンをラウリン酸、パ ルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、または同様の長鎖脂肪酸のような脂肪 酸と反応させて、１．４−ソルピタ／モノエステル、１．４−ノルビタンセスキ エステル、または１．４−ソルビタントリエステルを与えることにより作製され る。これらの界面活性剤の通常名としては、例えばソルビタンモノラウリン酸塩 、ソルビタンモノバルミチン酸塩、ソルビタンモノステアリン酸塩、ソルビタン モノオレイン酸塩、ソルビタンモノオレイン酸塩、およびノルビタントリ′オレ イン酸塩が挙げられる。これらの界面活性剤はＳＰＡ＠またはＡＲｔ、ＡｃＥ昨 メ名前で市販されており、通常種々のモノエステル、ジエステル、およびトリエ ステル置換されたソルビタン間を識別する多くの文字が付けられている。

５ＰＡＮりおよびＡＲＬＡＣＥ＠界面活性剤は親水性であり、一般に油に可溶性 であるか、または分散し得る。それらはほとんどの有機溶剤にも可溶である。水 中では、それらは一般に不溶性であるが分散し得る。一般にこれらの界面活性剤 の親水性−親脂性バランス（■ＬＢ）数は１．８から８．６の間である。そのよ うな界面活性剤は容易に当業者に公知の手段で作製し得るか、または例えばＩｃ Ｉ　Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ　Ｉｎｃ、、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＢからＡＴＬ ＡＳ■という商標名で市販されている。

界面活性剤の関連群はポリオキシエチレンソルビタンモノエステルおよびポリオ キシエチレンソルビタントリエステルを包含する。これらの物質はエチレンオキ シドを１．４−ソルビタンモノエステルまたは１．４−ソルビタントリエステル に添加することにより調製される。ポリオキシエチレンの添加は親脂性のソルビ タンモノエステルまたはソルビタントリエステル界面活性剤を、一般に水に可溶 性であるかまたは分散性に、また有機溶液に種々の度合いに可溶である、親水性 界面活性剤に転化する。

これらの物質はＴＷＥＥ＠の商標名で市販されており、水中油型エマルジョンお よびディスパージョンを調製するために、または油を可溶化し、無水軟膏を水可 溶性または洗浄可能にするのに有用である。ＴＷＥＥ略界面活性剤は、エマルジ ョンの安定性を促進するために、関連するソルビタンモノエステルまたはソルビ タントリエステル界面活性剤と組み合わせ得る。

ＴＷＥＥ昭解面活性剤は、例えば商標名ＡＴＬＡ３１Ｅ界面活性剤としてＩｃＩ 　Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ　Ｉｎｃ、、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥのような、多 くの製造業者から市販されている。

単独で、または５ＰＡＮ欧ＡＲＬＡＣＥ■、およびｒｗＥＥ藤専面活性剤と組み 合わせて用いられ得る非イオン界面活性剤の第３の群は、エチレンオキシドと長 鎖脂肪酸との反応により作製されるポリオキシエチレン脂肪酸である。このタイ プで最も入手が容易である界面活性剤はＭＹＲ＄商標名で販売されており、ステ アリン酸のポリオキシエチレン誘導体である。ＭＹＲａＶ面活性剤は親水性であ り、ＴＷＥＥ℃界面活性剤と同様に水中に可溶であるかまたは分散し得る。ＭＹ Ｒ店界面活性剤は、エマルシコンを形成する際に、ＴＷＥＥＱ面活性剤またはＴ 　Ｗ　Ｅ　Ｅ　ｍ　Ｓ　Ｐ　Ａ　Ｎ■もしくはＡＲＬＡＣＥＱ面活性剤の混面相 性剤レンドされ得る。

ＭＹＲ＠ＦＦ面活性剤は当業者に公知の方法で作製し得るか、またはＩＣＩ　Ａ ｍｅｒｉｃａ″ｓ　Ｉｎｃ、から市販されている。

ポリオキシエチレンをベースにした非イオン界面活性剤の第４の群は、ラウリル 、アセチル、ステアリル、およびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシ エチレン脂肪酸エーテルである。これらの物質はエチレンオキシドを高級アルコ ールに添加することにより上述のように調製される。これらの界面活性剤の市販 者はａＲｔ珈ある。ＢＲＩ＠界面活性剤は、界面活性剤中のポリオキシエチレン 成分の大きさによって、親水性または親脂性であり得る。これらの化合物の調製 は当業者に公知である一方、それらはまた、ＩＣＩ　Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ　Ｉｎ ｃ。

のような販売元から容易に入手可能である。

本発明の実施に用いられる可能性を有する他の非イオン界面活性剤としては、ポ リオキシエチレン、ポリオール脂肪酸エステル、ボーリオキシエチレンエーテル 、ポリオキシプロピレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンを含有する蜜蝋誘導 体、ポリオキンエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド 、およびグリセロール脂肪酸エステルまたは他のポリオキシエチレン酸アルコー ルまたは１２−２２の炭素原子の長鎖脂肪酸のエーテル誘導体が挙げられる。

本発明のアジュバントおよびワクチン製剤は、多相系にし向けられているので、 ）ＩＬＢ値が約７から１６の範囲にある、エマルシコン形成非イオン界面活性剤 を選択することが好ましい。

この値は、ＴＷＥＥ＠界面活性剤のような単一の非イオン界面活性剤を使用する か、または以下のような界面活性剤をブレンドして用いることにより得られる： ソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステル、もしくはソルビタントリエス テルをベースにした界面活性剤；ソルビタンエステルポリオキンエチレン脂肪酸 ；ポリオキ／エチレン羊毛間由来の界面活性剤と組み合わせたソルビタンエステ ル；高ＨＬＢ値のポリオキシエチレン脂肪エーテル界面活性剤と組み合わせたソ ルビタンエステル界面活性剤；またはポリエチレン脂肪エーテル界面活性剤もし くはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸。

本発明の実施においてエマルシコンを安定化する非イオン界面活性剤として使用 するには、単一の非イオン界面活性剤の使用がより好ましく、最も好ましいのは ＴＷＥＥＮ界面活性剤の使用である。ＴＷＥＥＮ　８０と称される、さもなけれ ばｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０またはポリオキシエチレン２０ソルビタンモノ オレアートとして知られる界面活性剤が前述の界面活性剤の中で最も好ましい。

適切な水中油型エマルジョンは通常、０．０２％から２．５重量％（ｖ／ｗ）で 界面活性剤を有すると効果的である。０．０５％から１％が好ましいが、０．０ １から０．５％が特に好ましい。

本発明の水中油型エマルシコンが達成される方法は本発明の実施において重要で はない。そのようなエマルジョンが得られる１つの方法は、Ｍｉｅｒｏｆｌｕｉ ｄＩｃｓ、　Ｎｅｗｔｏｎｓ　ＭＡから入手可能のモデル番号１１０Ｙのような 、市販されている乳化器の使用である。他の市販されている乳化器の例としては 、Ｇａｕｌｉｎ　Ｍｏｄｅｌ　３０ＣＤ　（Ｇａｕｌｉｎ、　Ｉｎｃ、、Ｅｖｅ ｒｅｔｔ、　ＭＡ）およびＲａｔｎｎｉｅ　Ｍｉｎｌａｂ　Ｔｙｐｅ　８．３０ Ｈ（Ｍｉｃｒｏ　Ａｔｏｍｉｚｅｒ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄａｉｒｙ、　Ｉｎｃ 、、ｎｕｄｓｏｎ、　Ｗｌ）が挙げられる。これらの乳化器は、高圧で液体を小 さい孔に強制的に通すことによって得られる高ぜん断力の原理により作用する。

本発明の使用はそのような乳化器の使用を排除するものでないが、それらの使用 は本発明を実施するにあたり必要とされるものでも好ましいとされるものでもな い。ミクロン以下の粒子からなる油滴が所望でないのなら、低せん断力を生じさ せる他の装置（注射針を通しての製剤の簡潔な通過を含む）を用い得る。

油滴サイズは、油に対する洗浄剤の割合（割合を増加すると油滴サイズは減少す る）、操作圧（操作圧を増加すると油滴サイズは減少する）、温度（温度を上昇 すると油滴サイズは減少する）を変化させること、および両親媒性の免疫刺激剤 を添加すること（そのような薬剤を添加すると油滴サイズは減少する）により変 化させ得る。実際の１Ｅｌｌｉサイズは、特定の洗浄剤、油、および免疫刺激剤 （もし用いられるなら）、並びに選択された特定の操作条件によって変化する。

油層サイズは、市販されているＣｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製造の Ｓｕｂ−Ｍｉｃｒｏｎ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　（Ｍｏｄｅｌ　 Ｎ４ＭＤ）のようなサイジング器具を用いることにより変化させ得る。

エマルジョン成分は、ワクチンに用いられるリポソーム／抗原成分と結合させる 前に上述の材料から調製される。リポソームのリン脂質および池の成分は簡単に エマルジョンに取り込まれ、乳化剤として機能するため、リポソームはエマルジ ョン成分の存在下で調製され得ない。

本発明のエマルジョン成分は安定であるため、リポソーム／抗原およびエマルジ ョンは、ａ合、攪拌、または＠盪させるだけで結合され得る。２つの成分の混合 物を素早く小さい開口（皮下注射針のような）に通すような他の技術によって、 容易に有用なワクチン組成物が提供される。

本発明の組成物の種々の成分は様々な割合で存在し得る。

リポソーム／抗原およびエマルジョン成分は典型的には１：１０から１０：ｌの 容積比率で用いられ得る。容易に調製され、簡単に識別するためｌ：３から３＝ １の容積比率が好ましく、約１：ｌの容積比率がさらに好ましい。しかし、特定 の抗原がリポソームに取り込まれるのが困難であり、またその免疫原性が低いと いった場合のように、抗原組成物が比較的多く必要とされるときのような、特定 の目的においては他の比率の方が適切である。

リポソームは一般に、最終濃度が１１当り約０．５から５０＋＊ｇの脂質にする ために、脂質懸濁液１ｍｌ当り約１から１ｏＯａＨの脂質で調製される。より好 ましくは、リポソームは１１当り約３から３０ｍｇの脂質で調製され、さらに好 ましくは１ｍｌ当り約１０ｔａＨの脂質で調製される。

抗原量は一般に、注入され得る最終組成物の目的の投与量および容積を基準にし て選択される。例えば、もしｌＯマイクログラムの抗原が目的の免疫原性反応を 誘導することが知られており、そしてもし１ｍｌが免疫される動物の注入量とし て正常であるなら、ワクチン組成物は本明細書に記載したガイドラインを用いて 最終ワクチン組成物の１１が１０マイクログラムの抗原を含有するように調製さ れる。抗原は典型的には約１から５００μｇ／＋ｌの濃度で、より一般的にはｌ Ｏから５０μｇ／ａｌの濃度で投与される。しかしこれらは一般的なガイドライ ンにすぎず、抗原の特定の量は前述のように免疫原性反応に基づいて調整されね ばならない。

同様の方法で、ムラミルトリペプチドＣもし用いられるなら）の量が標準投与量 および最終ワクチン組成物を提供するように調製する。そのような標準投与量は 典型的には約１から約２５００μｇ／ｍｌであり、好ましくは約１０から２５０ μｇ／ｍ＋である。

エマルジョンとの混合を確実にするため、サイズは通常エマルジョンの粒子サイ ズに適合するように選択される。例えば、ミクロン以下の粒子からなるエマルジ ョンに用いられるなら、直径が２００から４５０μＭの範囲であるリポソームが 調整される。単層膜のリポソームが特に好ましい。

少な（ともある抗原はそこに取り込まれることにより、またはリポソーム表面に 結合することにより、リポソームと結合する。また本発明の組成物において、リ ポソームと結合しないで抗原が存在することも可能である。この抗原はエマルジ ョンを最初に調製する時エマルジョンに存在し得る。または抗原は、典型的には リポソームと結合し、そして外部にある液相を含有しているリポソーム組成物か ら解離し得る。

本発明を一般的に説明してきたが、本発明を以下に実施例を用いて詳細に説明す ることにより、より理解されるであろう。なお以下に述べる実施例は説明のため のものであり、特にその旨記載しない限り本発明を限定するものではない。

（以下余白） 実１１匹 ｌ：　Ｄ２の１ポソームとの　・　Ａ 抗原がリポソームにより細胞へ送達されるための必要条件である、抗原のリポソ ームとの結合を示すための研究を行った。

兆ｌ！コしＬ丑ＬＬ ＰＣ／ＰＳ　（７：３）よりなるリポソームをオクチルグルコシド透析および逆 相エバボレーシロン（ＲＥＶ）の両方により調製した。

１００μｇ／ｍｌのｇＤ２を、安定なヨウ素化されたｇＤ２をマーカーとして使 用して追跡した。液体クロマトグラフィーにより結合していないｇＤ２からリポ ソームを分離することにより、ｇＤ２の１７％が透析リポソームと結合し、また ３３％のｇＤ２がＲＥＶリポソームと結合することが分かった。ｇＤ２と結合し たリポソームのいずれもトリプシン消化に対しては感応せず、これによりｇＤ２ がこのベシクルの外表面上には存在しないことが示された。リポソーム（２ｍＭ の脂質）を０．４から２１１ＭのＴｒｉ　ｔｏｔｆ’　Ｘ−１００と一晩イ離は 進み、これはリポソームの透過性化の向上と一致した。

この方法では残留オクチルグルコシドが不足するため、ＲＥＶリポソームの方が 洗剤の透過性化に対、して幾分強い抵抗を示した。

フシジェニック ζ ＰＥ／ＧＳ　（８：２）よりなるリポソームをオクチルグルコシド透析により調 製した。この脂質組成物はＲＥＶによる方法には適合しないため、この調製方法 に対してはＰＥ１０Ａ　（８：２）を使用した。フハク酸グリセロールをオレイ ン酸に置換することにより、ＲＥＶによる安定したＬＵＶが産生される。透析リ ポソームとは３９％のｇＤ２が結合し、ＲＥＶリポソームとは７２％が結合した （表１）。結合したｇＤ２のうち約５０％をトリプシン消化により透析リポソー ムから除去し、これにより外部から接近可能にした。

フシジェニック透析リポソームは、非フシジェニックの形態より容易にＴｒ　ｉ 　ｔｏｎωによって透過性化した。オレイン酸を含有するＲＥＶリポソームは、 トリプシンまたはＴｒｉｔｏｎ＠のいずれかにより処理されると、はとんどの標 識化ｇＤ２を失った。これは、ｇＤ２のこれらのベシクルとの結合についての有 用な情報を提供することより、２０モル％の脂肪酸を含有するベシクル調製物の 内因的な漏出性を示す。

ｇＤ２を予め形成したＰＥ／ＧＳ／ＣＩ（ＯＬ　（８：２：２）透析リポソーム によりインキユベートした結果、ｇＤ２はリポソームとは全く結合しなかった。

（以下余白） ２　：　ＲＴ６のリポソームとの　・　４実施例１に述べた方法と同様の方法で 、遺伝子工学により得られた旧Ｖ逆転写酵素分子ＲＴ６のリポソームとの結合を 測定した。ＲＴ６は２９％がＰＣ／ＰＳ　（７：３）　？ｒ析リポソームと、お よび７３％がＰＥ／ＧＳ　（８：２）透析リポソームと結合する。ＲＴ６のヨウ 素標識化が低いと、トリプシンの消化およびＴｒｉｔｏ。Ｏの透過性化効果が不 確かになった。

３：　２０のリポソームとの　、　ム 同様の方法で、ＨＩＶ　ｇｐ１２０ノＰｃ／ＰＳ　（７：３）透析リポソームと の結合は８％、およびＰＥ／ＧＳ　（８：２）透析リポソームとの結合は１１％ であることが測定され、これらはｇＤ２およびＲＴ６に対して観察された結合レ ベルよりはるかに低かった。ゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムにより、リポソー ムフラクションと単一遺伝性ｇｐｔ２ｏとの間にｇｌ）１２０に富んだピークが 存在することが分かった。このピークは恐ら＜ｇｐ１２０およびオクチルグルコ シドの混合ミセルである。トリプシンの消化およびＴｒｉｔｏＪの透過性化によ り、ｇｐ　ｉ　ｚｏが両方のリポソーム調製物の中に被包され、共に外部からは 接近し得ないことが示される。

ｇＰ１２０のフシジェニックリポソームとの結合は、凍結融解濾過法によりリポ ソームを調製することにより増強した。抗原の結合はベレット化されたリポソー ムのタンパク質分析により測定した。

ａｐ１２０を、予め形成した凍結融解濾過（ＦＴＰ）された、ＰＣ／ＰＳ　（７ ：３）またはＰＥ／ＧＳ／ＣＨＯＬ　（８：２：２）組成物のいずれかのりポソ ームによりインキユベートすると、結合は行われなかった。

（以下余白） ４：アラ１ア　′１の１ポソームとの　Ａマラリア血清ｌタンパク質のＰＣ／Ｐ Ｓ　（７：３）リポソームとの結合については、透析リポソームでは６７％、　 ＦＴＰリポソームでは９５％であった。予め形成したリポソームに添加した血清 １の７５ｚがＦＴＦヘシク／ｌ／と結合した。血清１　（ＤＰＥ／ＧＳ／ＣＨＯ Ｌ　（ＩＩ：２：２）リポソームとの結合については、透析リポソームでは６５ ％、ＦＴＰリポソームでは８７％であった。血清ｌは９１％が予め形成された透 析リポソームと結合した。結合していないタンパク質は遠心分離によりリポソー ムから分離した。　リポソームペレットのタンパク質アッセイにより、抗原結合 を測定した。

５：インフルエンザＨ１の１ポソームとの　・含 ＨＡタイワンは６９％がＤＰＰＣ／ＤＭＰＧ　（８：２）透析リポソームと結合 した。ＨＡタイワンは７８％がＰＥ／ＧＳ／Ｃｌ０Ｌ　（８：２：２）透析リポ ソームと結合し、また８０％が予め形成されたベシクルと結合した。

結合は血清ｌに対して述べたように測定した。

６：　Ｓｖ　２ペプチドのｆポソーム　の　・　ムＨＳＶ　ｇＢ２ヘプチドは、 ４０％がＰＣ／ＰＳ　（７：３）　ＦＴＦリボンームと結合し、これは血清１に 対して述べたように測定した。

７：　２の１ポソームとの　・　４ ＨＳＢ　ｇＢ２は２４％が、透析により調製されたＰＥ／ＧＳ／ＣＨＯＬ　（８ ：２：２）リポソームと結合した。ｇＢ２の結合は、リポソームがＦＴＰにより 調製される場合は８４％であった。タンパク質の結合は、結合していないｇＢ２ を遠心分離により除去し、リポソームペレ・ツトと結合したｇＢ２を捕獲ＥＬＩ ＳＡにより測定することにより決定した。

８：　の　°みおよび　についてのインビトロにお６る　六 本発明の組成物を使用して、抗原の細胞内での結末を調べる研究を行った。

ＦＩＴＣ−デキストランに負荷されたリポソームの、マウスおよびヒトマクロフ ァージによる取込みを示す最初の実験は一貫して成功であった。逆相エバポレー ジ璽ンによりおよび高圧排出により調製したリポソームは共に良好に取り込まれ る。

使用した非フシジェニック脂質組成物は、モル比７：３のＰＣ／ＰＳおよび９： １のＰＣ／ホスファチジルグリセロールであった。フシジェニック脂質組成物は ４：４：２のＰＥ／ＣＨＯＬ１０Ａ、または８：２のＰＥ１０Ａのいずれかであ った。フシジェニックリポソームを形成するためには、水相は最初はｐＨ１ｏで ある。ｐＨ７，４でゲル濾過することにより外部容量を変換すると、位相差顕微 鏡およびエビ蛍光顕微鏡による検査によれば、リポソームは少くとも２日間は安 定である。

非フシジェニックリポソームをマクロファージにより１８時間パルスすることに より、細胞内部に明るい斑点性蛍光が生じる。パルスチェイス実験により、リポ ソームは最初はシトシルの周辺に存在し、次に核周囲領域に移動するのが分かる 。

これはエンドソームの取込みおよびその後のりンソームへの細胞内移動と一致す る。脂質：　ＭＴＰ−ＰＥのモル比２５０：１でＭＴＰ−ＰＥを二分子層に取り 込んでも、この取込み速度論に影響はない。

フシジェニックリポソームに同様の実験を行った結果、明るい斑点性蛍光と暗い 分散性蛍光が混在した。パルスチェイス実験により斑点性蛍光は完全に排除され なかったため、エンドソーム融合の効率は１００％より小さいことが示唆される 。

さらに、リポソームの滴定実験により融合は効力を失い得ることが示される。す なわち、１０４個の細胞／Ｃ冒２あたり１００μｇを越えるリン脂質により、い くつかの暗い分散性蛍光を伴う高度に負荷された斑点性蛍光が生じ、一方、１０ ′個の細胞／ｃ１２あたり１０μｇより少ないリン脂質によっては、分散性蛍光 が圧倒的であった。リン酸脂質：　ＭＴＰ−ＰＥのモル比が１０００：１．５０ ０：ｌ、および２５０：１のＭＴＰ−ＰＥを取り込んだ結果、分散性および斑点 性蛍光は共に極めて僅かのレベルであり、この効果は１０００：１以下で最も顕 著であった。遊離ＦＩＴＣ−デキストランはこれらの条件下では飲食作用により 取り込まれなかった。これは飲食作用の抑制が表面効果ではなく、ＭＴＰ−ＰＥ がシトシルに入る結果であることを強く示唆する。ＦＩＴＣ−ｇＤ２を負荷した リポソームによる予備実験により、ｇＤ２がこの方法によりマクロファージに容 易に送達されることが分かる。

９：マクロファージの　°み Ａｍｅｒｉｃａｌ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎからのヒ ト単核細胞状の細胞株であるＵ９３７細胞によるＦＩＴＣ−デキストラン負荷リ ポソームの取込みを、−次マクロファージ培養物による前述の取込み実験と比較 した。未分化のＵ９３７細胞はリポソームまたは遊離Ｆ　ｌＴｃ−デキストラン のいずれに対しても食作用を行わなかった。細胞をフォーポル−ミリスティック −アセテートにより分化し、非フシジェニックＰＣ／ＰＧ　（８：２）リポソー ムにより１８時間インキュベートする場合、エンドソームまたはリソソームへの デキストランの取込みを示す斑点性蛍光が得られた。

フシジェニックＰＥ／ＧＳ　（８：２）リポソームによるインキュベーションに より、デキストランの細胞形質への送達を示す均一の分散性蛍光が生じた。リポ ソームでのＭＴＰ−ＰＥの取込みは食作用に影響を与えなかった。これらの結果 は実際のマクロファージにおいて観察されるものに類似しているが、２つの細胞 型の間の主要な相違点は取込みの速度である。すなわち、可視量の蛍光を得るた めには、分化Ｕ９３７細胞はマクロファージの約１０倍の脂質を必要とする。マ クロファージにとっては食作用自体が活性化シグナルである。Ｕ９３７細胞は食 作用により活性化され得ない。

２５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡにより５日間成熟させたＵ９３７細胞を、可溶性ｇＤ２ 、ｇＤ２を含む非フシジェニックＰＣリポソーム、およびｇＤ２を含むフシジェ ニックＰＥリポソームと一晩インキコベートした。

分子内ｇＤ２の存在を、マウス−αｇＤ　Ｍａｂに結合されたＦＩＴＣ−ヤギ− αマウスＡｂの蛍光抗体法により評価した。

可溶性ｇＤ２はいずれのリポソーム調製物よりも蛍光レベルが低く、またＰＥリ ポソームはＰＣリポソームより蛍光レベルが高いことが分かった。とりわけ、細 胞のインキュページ言ンが１０％の血清の存在下で行われる場合も非存在下で行 われる場合も、同じパターンの取込みが観察されたが、蛍光度は血清の存在下の 場合の方が幾分高かった。可溶性ｇＤ２とインキユベートされた細胞は、低レベ ルの分散性蛍光を示した。いずれのリポソーム調製物とインキュベートされた細 胞においても、散在的に斑点性蛍光を有するが圧倒的に分散性蛍光を示した。

これらの結果は、分散性蛍光はフシジェニックリポソームに関連し、斑点性蛍光 は非フシジェニックリポソームにおいて観察された、ＦＩＴＣ−デキストラン負 荷のリポソームによる前述の実験とは対照をなす。ｇＤ２はｐＨには感応しない フシジェニックタンパク質であるため、両タイプのリポソームの細胞との融合を 誘導し得、分散性蛍光を生じさせる。

上記の実験により、ｇＤ２はリポソーム内容物の分子内局在性を変更し得ること が示唆された。これを試験するために、Ｕ９３７細胞をｇＤ２とＦＩＴＣ−デキ ストランまたはｇＤ２とＲＴ６により調製されたリポソームと一晩インキュベー トした。エビ蛍光顕微鏡検査により、ＰＣ／ＰＳリポソームはＦ　ＩＴＣ−デキ ストランおよびＲＴ６の両方に対して斑点性パターンの蛍光を生じることが分か った。ＰＥ／ＧＳリポソームの場合には、ＦＩＴＣ−デキストランおよびＲＴ６ の両方に対して分散性蛍光が観察された。このような状況の下では、ｇＤ２はリ ポソーム内容物の局在性を変更し得ない。

１０：’ポソーム　エマルジョン　ム　のヤギの　２に５Ｌゑ逸ＪＬＬ性 これらのデータにより、特定のエマルジョンに対しては、抗原をエマルジョンと の混合前にリポソームと結合させれば、より高い抗体力価が得られることが分か る。フシジェニックまたは非フシジェニックリポソームにより引き出される抗体 の力価は、エマルジョンと混合するとほぼ等価である。

この実験において、ｇＤ２抗原と配合した、ＭＰ７９／１５０１　（１０％スク アレン（ｖ／ｖ）　；　１％Ｔｗｅｅρ８０　（ｖ／ｖ）　；　５％　Ｔｅｔｒ ｏｎｉｃＱ　１５０１　（ポリオキシエチレンーポリオキシプロピレンブロ・ツ クポリマー）（ｖ／ｖ）　；　４００μｇ／ｍｌのＭＴＰ−ＰＥ）と命名された ＭＴＰ−ＰＥを含有する水中油のエマルジョンよりなる組成物を、免疫原性につ いて試験した。次にこの組成物をＭＰ７９／１５０１とフゾジエニ・ツクリポソ ームとの配合物と比較した。このリポソーム−ｇＤ２混合物を３週問おきに３回 、動物を免疫させるために使用した。表３に示すように、この配合したエマルジ ョン−リポソームによる免疫は高度な抗体反応を示した。２回の免疫の後、リポ ソームおよびエマルジョンヲ与えた群は、Ｍ７９／１５０１エマルシコン単独の 場合より約３倍高い、７２５８の平均力価を示した。この反応は群内では一貫し ており、標準誤差は僅か１０％であった。

３度目の免疫の後、群内の全ての動物は１個体をｐぞ（１てカジプンとの配合は 免疫反応に著しい増加をもたらした。

（以下余白） １２：　Ｄ２の１ポソーム　の　Ａがヤギにお；る瞥ポソーム　エマルシコン　 Ａ　の　に　するｔこの実験では、以下のアジュバント： １、　ＭＦ７９／１２１　（１０％スクアレン、１％Ｔｗｅｅｎ　８０．５％Ｐ ｌｕｒｏｎｉｃ　Ｌ　１２１．４００ｕ　ｇ／ｍｌのＭＴＰ−ＰＥ）　；　２． 　ｇＤ２の５０％がリポソームと結合し、またｇＤ２の５０％がこの製剤の水相 において遊離するように、ＬＰＧ　（ＰＣ／ＰＳ（７：３）透析リポソーム）と 配合したＭＦ７９／１２１；　３．　１００％のｇＤ２がリポソームと結合する ようにＬＰＧと配合したＭＦ７９／Ｌ１２１　；の１つを用いてヤギを２５μｇ のｇＤ２および１００μｇのＭＴＰ−ＰＥで４週問おきに３回免疫した。図１に 示すように、抗体力価の増加はリポソームと結合した抗原の増加と相関する。５ 体の動物よりなる群に対する抗体力価の幾何平均を表５に示す。向上したＡｂ力 価は、４回目の免疫後生くとも６週間は持続した。

（以下余白） １１：ヤギにお喜るエマルシコン　１ポソームのＤ２の　ム　が　に　える この実験では、いくつかのエマルジョン、リポソーム／エマルジョン配合物、お よびリポソーム単独と配合したｇＤ２（２５μｇ）によりヤギを免疫した。試験 したリポソーム／エマルジョン配合物は、ＰＥ／ＧＳリポソームおよび２ｘ　Ｍ Ｐ５９、ＰＥ／ＧＳリポソームおよびＭＦ７９１５％　Ｔｅｔｒｏｎｉｃ＠１５ ０１、ならびにＰＣ／ＰＳリポソームおよびＭＰ７９１５％Ｔｅｔｒｏｎｉβ１ ５０１であった。この実験における対照群はミョウバンおよび２ｘ　ＭＦ５９を 含有していた。すべてのＭＴＰ−ＰＥ投与量は１００μｇであった。リポソーム エマルジョン配合物は、約５０％の抗原をリポソーム中に被包し、５０％を溶液 中で遊離した。すべてのＭＴＰ−ＰＥがリポソーム／エマルショア配合物におい てはエマルジョン相であった。リポソーム単独の群では、ＭＴＰ−ＰＥを外部か らリポソームに添加した。動物を３週問おきに３回免疫し、各免疫の１４日後に 、抗ｇＤ２抗体力価を測定した（結果を表４に示す）。

ＭＦ７９／Ｓ％１５０１とＰＥ／ＧＳリポソームとの配合物（フシジェニックＬ ＵＶ）は、ＭＦ５９エマルジ曹ン単独の場合よりはるかに高い抗ｇＤ２力価を示 した。これらの結果により、ＰＥ／ＧＳリポソームの２ｘ　ＭＦ５９との配合物 はＭＦ７９１５％１５０１と配合したＰＥ／ＧＳリポソームはど良好な性能を示 さないことが分かる。ＰＥ／ＧＳリポソームは２ｘ　ＭＦ５９の性能を向上させ る。ＰＥ／ＧＳリポソーム単独の場合は抗ｇＤ２抗体反応が非常に弱い。ＰＣ／ ＰＳリポソームのＭＦ７９１５％１５０１との配合物は、ＭＰ？９／Ｓ％１５０ １と配合したＰＥ／ＧＳリポソームと等しい性能を示す（３回の免疫後の平均力 価は６９４６対４６５３）＠（以下余白） １３：　Ｂ２の１ボソームとの　Ａがヤギの１ポソームエマルジヨン　ム　の　 に　える この実験では、以下のアジュバント： １、実施例１２で定義したＭＰ？９／１２１；　２．　ｇＢ２の５０％がリポソ ームと結合し、５０％が溶液において遊離するように、ＬＰＥ　（ＰＥ／ＧＳ／ ＣＨＯＬ　（８：２：２）　ＦＴＰリポソーム）と配合したＭＰ７９／１２１； 　３．１００％のｇＢ２がリポソームと結合するようにＬＰＥと配合したＭＰ７ ９／Ｌ１２１；の１つを用いて、ヤギを５．２５、または１００μｇのｇＢ２お よび１００μｇのＭＴＰ−ＰＥで４週問おきに３回免疫した。

２５μｇ　ｇＢ２投与の群についてリポソームと抗原との結合の効果を図２に示 す。この場合も、免疫原性はリポソームと抗原との結合が増加すると増加する。

各動物群に対する抗体力価の幾何平均上標準誤差を表６に示す。

（以下余白） １４：アカゲザルにおＣる、−ｇＩｌ！□１２Ｑ□モ用いたリポソーム／菅　ロ 　Ｎ　φ　ロ　ｉ　―　Φ　− エマルジョン　八　の この実験においては、３匹のアカゲザルを１群とした複数の群を、４週問おきに ３回免疫し、そして３回目の免疫から１４週間後に１回免疫感作した。実験期間 を通して２週間毎に動物から採血した。１つの群には、ｇｐ１２０／ＳＦ２を含 むＬＰＥ　ＦＴＦリポソームと配合したＭＦ７１／１５０１　（１（１％スクア レン、ＬＸ　Ｔｗｅｅｎ８０．５％Ｔｅｔｒｏｎｉｃ　１５０１．４００　ｇｇ ／ｍｌ　ＭＴＰ−ＰＥ）を投与した。他の２つの群には、２％ＭＦ５９　（１０ ％スクアレン、１％　Ｔｖｅｅｎ　８０．１％５ｐａｎ　８５．４００　ｕ　ｇ ／ｍｌ　ＭＴＰ−ＰＥ）か、ＳＡＦエマルジョン（１０％スクアレン、５％Ｐｌ ｕｒｏｎｉｃ　Ｌ１２１．０．４％　ＴＷｅｅｎ　８Ｇ、５００　μｇ／ｍｌ　 ＭＤＰ）か、のいずれかを投与した。図３は、ＭＰ７９／１５（ｌおよびリポソ ームが、他の２つのエマルジョン製剤よりも常に高値の力価をもたらしたという ことを示している。表７に、実験を通じての、個々の動物の力価と各群の力価の 平均値を挙げる。

（以下余白） 彬　− りｒ 表１ １５：ウサギにおする　Ｄ２　Ａ　の　に・る　１ポソーム　たはエマルシヨン 　みムわせたＭＴＰ−ＰＥの処泉 ウサギを、４週問おきに３回、１ｏμｇ　ｇＤ２および１００μｇＭＴＰ−ＰＥ により免疫した。この実験の、２回目の免疫後２週間までの結果を図４および表 ８に示す。表８の群２と３とを比較することにより、エマルシコンＭＦ５９（５ ％スクアＬ／：／、０．５％Ｔｗｅｅｎ　８０、Ｏ，Ｓ％５ｐａｎ　８５．４０ ０　ｔｔ　ｇ／ｍｌ　ＭＴＰ−ＰＥ）を、ＬＰＥと共に調製したｇＤ２と配合す ることによっても、免疫原性が向上するということが示される。ＭＴＰ−ＰＥを 、群３におけるようにエマルジョン中に含ませること、または、群４におけるよ うにリポソーム中に含ませることは、免疫原性において大幅な変化をもたらさな かった。群６をＬＰＨにより１回免疫し、その後、ＭＦ５９により２回追加免疫 した。群７においては、順序を逆にして、まず動物にＭＦ５９を投与し、その後 、ＬＰＨにより２回免疫した。明らかに、まずエマルジョンを投与し、その後、 リポソームにより追加免疫する方が、その逆よりも高値の免疫原性をもたらす。

前述のヤギｇＢ２実験（実施例１３、表６、群８）により、動物にまずリポソー ムを投与し、その後、エマルシコンで追加免疫した場合は、応答が悪いというこ とが確認さ８４４回目抗体力価およびその後の疾病からの保護状況を表つ’７− １”／ｇＤ２　’ｙｚ　ＭＴＰ−ＰＥ　ｆ）紐ド卒わ也２−ＭＦ５９　１４４１ Ｂ＋２６９８　２００７６４＋３２４８８５−　ＭＰ５Ｂ／ＬＰＥ　６３３０＋ ９０３　６８０６９＋８１２７−ｇＤ２を１回につき１０μｇ投与。

−ＭＴＰ−ＰＥを１回につき１００μｇ投与；群５にはＭＰＴ−ＰＥを投与しな い。

一１群につき動物５体。

１６：アオ　スＡｏｔｕｓザルにお書る　マチ１ア　′　ｌのに・　る　エマル ジョン　「ポソーム　ム　のアオタスザルを、４週問おきに３回、１００μｇの 血清１により免疫した。１回目の免疫から８４日後に、動物から採血し、熱帯熱 マラリア原虫（■ｕ赳坦Ｊゴ１匡ｌ旺ｕ）（Ｄ　ホンデュラス株で感染させた。

続いて、疾病とパラサイテミアとの両方に関して、サルをモニターした。

９に示す。群１には、フロインドアジュバントのみを投与し、抗原は投与しなか った。群２には、フロインドアジュバントおよび血清１を投与した。群３および ４には、血清１および、それぞれ、ＭＦ５９かＬＰＥを含むＭＦ５９かのいずれ かを投与した。配合物製剤は、エマルシコン単独の場合に比べて、Ａｂ力価の５ 倍の増加をもたらした。両方の群において、３匹の動物のうち１匹が疾病から保 護された。図５は、各々の累積的バラサイテミアスコアーを示す。配合物を投与 された群４のバラサイテミアスコアーは、ＭＦ５９を投与された群３の、はとん ど１０分の１であった。

（以下余白） 表エ アオタスザルに対するパナマ血清１の投与実験＃２アオタスザルの、血清１に対 する抗血清のＥＬＩＳＡ力価群番号：（１）対照ＦＣＡ／ＦＩＡ （２）血清Ｉ　ＦＣＡ／ＦＩＡ （３）血清Ｉ　ＭＦ５９．２ （４）血清１フツジエニツクリポソーム／ＭＦ５９．２７：マウスインフルエン ザ　モデルにおζる　エマルシコン　１ポンーム　ム　の この実験は、異種ウィルス感染におけるアジュバント製剤の効力をテストするた めに考案された。マウスを、４週問おきに２回、９μｇＨＡ抗原および４０μｇ ＭＴＰ−ＰＥにより免疫した。

動物の群を表１０に定義する。群１には、アジユバントを含まないＨＡを投与し た。群２には、ＭＦ５９を投与した。群３は、ＭＦ７フ（１０％スクアレン、５ ％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｌ１２１．１％Ｔｖｅｅｎ　８０．４００μｇ／ｍｌ　Ｍ ＴＰ−ＰＥ）により１回免疫し、その後、ＭＦＳ９により２回目の免疫を行った 。群４は、ＭＴＰ−ＰＥを欠いたＭＦ７？およびＭＴＰ−ＰＥを含むＬＰＥを含 有する配合物製剤により１回免疫し、ＭＦ５８、およびＭＴＰ−ＰＥを含むＬＰ Ｅにより２回目の免疫を行った。群５には、ＭＴＰ−ＰＥを含むＬＰＥを投与し た。群６は、免疫を行わなかった。

表１０の抗体力価は、ウィルス感染の直前の５５日目のものである。最高値の力 価は、配合物製剤を投与された群４において得られた。図６は、すべての群に関 する相対的Ａｂ力価を示す。

５６日目に、マウスに、インフルエンザＡ／ホンコンＩ）／１３７６ｇ（ＨＩＮ ｌ）を鼻腔から感染させた。疾病に関して動物を毎日モニターした。毎日の生存 記録を表１１に示す。感染後１４日目の生存率を、図６の下欄に示す。配合物製 剤の場合は１００％の生存率を示し、次に高い生存率を示したのは９０％生存率 を示したＭＰ７７であった。アジユバントを含まないＨＡワクチンは、免疫しな かった群が３０％の生存率であったのに対し４０％の生存率を示した。

（以下余白） 紐 マウス／インフルエンザ ＩＸ　ＭＦ５Ｂ　＋　ＬＰＥ　＋　ＭＴＰ−ＰＥｎ；１０ ＭＴＰ−ＰＥの１回の投与量冨４０μＢＨＡ＝各々、Ａ／タイクン／１／８６、 Ａ／シャンハイ／１１／１１７、およびＢ／ヤマグタ／１６／８ｇを３０μｇ／ ｍｌ含むＰａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓインフルエンザワクチン９μｇ （以下余白） 穢　Ｏ口Ｏロ　ロ０ １８：Ｉポソーム　エマルジョン　八　のエマルジョン粒子とリポソームとの混 合物の物理的安定性を評価するために、ＦＩＴＣ−デキストランを含むＰＥ１０ Ｓ　（８：　２）／ＭＴＰ−ＰＥ（ＰＬ／ＭＴＰ−Ｐｇ、　２０：１）透析リポ ソームを調製した。外部ＦＩＴＣ−デキストランを、ゲル濾過により除去し、リ ポソームをＭＰ７９７１５０１　（１０％スクアレン／１％Ｔｖｅｅｎ　８０／ 　５％Ｔｅｔｒｏｎｉｃ　１５０１／４００μｇ／ｍｌ　ＭＴＰ−ＰＥ）と混合 した。光学顕微鏡による観察により、エマルジョン粒子とリポソームのいずれも が凝集も癒着もしていないということが示された。リポソームの構造的完全性は さらに、暗い背景に対して蛍光球体を観察することにより確認された。４℃で３ 力月貯蔵した後、外見に変化はなかった。

１９：Ｉポソームおよびエマルジョンの抗原を含むリポソーム（表面吸着または 二分子層に一体化することにより包含または混合される）とエマルジョンとの配 合物を生存能力のある薬学的物質とするために、安定した貯蔵条件および貯蔵形 態を研究する。アジユバントおよび抗原の安定性を高めるために、３つの異なる 投与形態を設計する：１）２−ｓ℃で貯蔵可能な、２つのバイアルまたは単一の バイアル内における、液体の、リポソーム懸濁液−エマルジョン配合物。２＞５ −１０℃で貯蔵可能な、２つの別々のバイアルまたは単一のバイアル内における 、凍結した、リポソーム−エマルシリン配合物。３）　２−８℃または環境温度 で貯蔵可能な、・２つの別々のバイアルまたは単一のバイアル内における、凍結 乾燥した、リポソーム−エマルシコン。

脂質成分およびタンパク質抗原の安定性を同上させるために、これらの製剤に対 して、少し酸性のｐＨ（≧５．０−≦７．０゜好ましくは６．５）を選択する。

以下の糖またはポリヒドロキシ系化合物およびアミノ酸のリストから凍結保護剤 （凍結乾燥または凍結に対する）を選択する：デキストロース、マンニトール、 ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、グリセロール、デキス トラン、マルトース、マルトデキストリン、グリシン、アラニン、プロリン、ア ルギニン、およびリシン。いくつかの製剤においては、糖およびアミノ酸の組み 合わせ、例えば、スクロース−マンニトール（スクロース５−８駕ｖ／ｖ、マン ニトール２．５−１駕ｖ／ｖ）　；スクロース−グリシン（スクロース８％Ｗ／ Ｖ、グリシン６０　ｍｍ）を用いる。これらの賦形剤はまた、等張化剤としても 作用した。すなわち生理学的重量オスモル濃度を与えた。緩衝剤は、リン酸塩（ ５−５ＯｍＭ）、クエン酸塩、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、酢酸塩、マ レイン酸塩、アスコルビン酸塩、トロメタミン、および類似の緩衝剤から成る群 から選択される。

リポソームの場合は、凍結保護剤および緩衝剤が、ａ）水の内部および外部に含 まれるか、またはｂ）外部から添加されるのみか、である。後者の場合は、任意 の緩衝剤または塩（例えばＮａＣＩ）が内部を浸透圧平衡に几、外部の塩を遠心 分離および洗浄の反復により除去する。その後、リポソームを、本発明の賦形剤 混合物に懸濁する。典型的には、エマルジョンを水中で調製し、上記の媒体中に 懸濁する。糖／アミノ酸／緩衝剤混合物に加えて、増粘剤もまたいくつかの製剤 に添加する。一般に、これらのポリマー物質は、粒子を被覆し、ポリマー物質が なければ凝集、融合、または癒着という結果になる接触を防止すると考えられて いる。使用するポリマーは、ポリエチレングリコール３００．４００．１４５０ 、および３１５０、ポリビニルピロリドン、硫酸デキストラン、カルボキシメチ ルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびアルギン酸を含む。ポリエ チレングリコール１４５０が好まれ、製剤中に１％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含まれて いる（典型的な成分のリストに関しては表１２を参照のこと）。

リポソームは、最適には上記に挙げた賦形剤に加えて、酸化防止剤として１モル パーセントのビタミンＥまたはｄｉ　α−トコフェロールをも含んでいた。この ことは、界面活性剤中の不飽和脂肪酸を酸化から保護し、それにより、抗原の分 解に触媒作用を及ぼし得る。このようにして製剤されたリポソームを、異なる割 合、例えばに１０から１０：１　（ｖ／ｖ）でエマルジョンと、上記のように混 合するが、便宜上１：１　（ｖ／ｖ）が好ましい。この混合物は、治療用の投与 量中に、適量の抗原および免疫促進剤を含む。

所望の組成物を得るために、多くの他の技術を使用し得る。

例えば、ＧａｕｔｈｉｅｒおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ　（ＥＰ０２１１２５７＞は 、２段階工程でリン脂質エマルジョンを凍結乾燥させた：第１の段階は、スプレ ー凍結、すなわち、予備生成したエマルジョンを、≦−２０℃でクロロフルオロ カーボンまたは類似の適合溶媒に、スプレーすること、および、凍結粒子（すで に凍結保護剤を含んでいた）を収集することを包含し、第２段階は、粒子を凍結 乾燥させることを包含していた。得られた粉体または固形物、一般には糖を大過 剰に含んでいるが、これを再水和することにより、０．４８−０．７マイクロン の範囲の粒径を有する、水中油型エマルジョンを生成した。この方法は、煩わし く、ある特定の治療には適用し得ない大粒のエマルジョン滴を生成する。上記特 定の治療とは、例えば、粒子が注入部位に存在し、リンパ腺または適切な解剖学 上の部位にゆっくりと流出することがめられる場合である。このように、本発明 の一つの局面は、さらに成長することなくサイズが維持され得るというような貯 蔵の利点を提供する適切な媒体中で、小さい、１ミクロン以下のサイズのリポソ ーム（≦０．４μ）およびエマル２９２粒子を生成することである。本発明の他 の局面は、ワクチンのような意図する適用に適する、≦０．４μの平均直径を有 する粒子に容易に再構成され得る、凍結乾燥リポソーム／エマルジョン配合物を 調製することである。

以下に、上記に示した動物において、より高い免疫原性を供給するワクチンとし て有用な、抗原含有リポソーム／エマルシコン配合物の、いくつかの異なる投与 形態を実施例により説明する。

１、゛　の　盲ホソーム　エマルシコン　ムスクロース−クエン酸塩（１０％ｖ ／ｖ、　１０ｍＭ）または、このセクシランで述べた、抗原含有賦形剤の任意の 他の配合物中で、リポソームを調製する。透析、ダイアフィルトレージ目ンまた は遠心分離（好適には遠心分離）のような適切な技術により、いずれの結合して いないタンパク質をも除去する。抗原を除いてリポソームの内部と同一の賦形剤 を含む媒体中に、リポソームを懸濁する。リポソームの別のセットにおいては（ 好適ではないが）、生理食塩水（０，９駕ｖ／ｖ）またはＰＢＳ中で、抗原を含 む小胞を調製し、洗浄により結合していないタンパク質を除去した後、凍結保護 剤／増粘剤および緩衝剤、例えば、スクロース、ＰＥＧ　１４５０、またはクエ ン酸塩中に、リポソームを懸濁する。典型的にはホモジナイゼーシ１ンにより水 中で処理されるエマルジョンを、リポソームに合う賦形剤混合物により、生理的 重量オスモル濃度に調整した。小胞およびエマルジョンを等量で配合し、２−８ ℃で冷蔵庫中で貯蔵する。長時間の分析により、どちらの粒子（リポソームおよ びエマルジョン）によっても、リポソーム内容物の損失はなく、サイズも保持さ れていることが示される。

２　した　１ボソーム　エマルジョン　４スクロース（８％Ｗ／Ｖ）／マンニト ール（１駕ｖ／ｖ）、タンパク質抗原を含むリン酸塩１０ｍＭ／ＰＥＧ　１４５ ０（１駕ｖ／ｖ）中でリポソーム（フソジェニ、りまたはそれ以外）を調整し、 ポリカーボネートフィルターを通して排出することにより、平均粒径を０．１− ０．４μに減少させる。過剰の抗原を、遠心分離により除去し、ペレット化され た小胞を同一の緩衝剤賦形剤混合液中に再懸濁する。その後、リポソームを微小 流動体化エマルジョン（≦０．４μ）と配合し、冷蔵庫中で≦−１０℃まで凍結 させる。−晩貯蔵した後、製剤をゆっくりと環境温度まで解凍する。あるいは、 リポソームとエマルジョンとを別々に凍結、解凍および混合するか、または、動 物に投与する前に、２−８℃のリポソームを、凍結−解凍および配合することに より処理したエマルジョンと混合する。両方の微粒子物質共、凍結−解凍サイク ルの間、その物理的完全性を保持する。このように、これらの物質は、単一のバ イアルまたは２つのバイアルのパッケージ内に貯蔵されることにより、ヒトへの 投与のための貯蔵上の便宜を提供すると考えられている。単一の凍結保護剤とし て含まれる特定のサツカライド（例えばマンニトール、ラクトース）は、リポソ ームおよびエマルジョンの物理的構造を保持することを補助しないということが わかっている。

しかし、グリセロール＜２−２０％冒／Ｖ、好適には２％）、プロリン（ＯＪＭ ）、アルギニン（０，３Ｍ）、スクロース−マンニトール（スクロース８％Ｗ／ Ｖ、マンニトール１％！／Ｖ）スクロース−ｇｔｙｔり＋ｔアルギニン（スクロ ース８％Ｗ／Ｖ、グリシンまたはアルギニン６０■Ｍ）、アミノ酸混合物（プロ リン、グリシン、アラニン；各１００■Ｍ）のような凍結保護剤はすべて、凍結 −解凍工程中に適切な凍結保護を供給し、このことは、ワクチン製剤での適用が 可能であるということを示唆している。内部に抗原およびＰＢＳ、生理食塩水ま たはリン酸塩のような賦形剤を含み、外相に凍結保護剤／緩衝剤／（増粘剤）を 含むリポソームはまた、意図する適用のために、同一の凍結保護剤配合物中でエ マルジョンと混合し得る。

３、シた　１ポソーム　エマルジョン 合物 安定した貯蔵形態として、この配合物は非常に好適である。

なぜなら、脂質およびタンパク質に化学的不安定性をもたらす水の大部分が排除 されているからである。さらに、一般に凍結保護剤として使用される炭水化物お よびアミノ酸は、微生物の成長にとって良い支持媒体である。以下に、乾燥ワク チン製剤を生成するための凍結乾燥に使用される設計を記載する。

表１２に挙げたような、適切な凍結保護剤／緩衝剤／（増粘剤）に懸濁された抗 原含有リポソームを、同一の媒体中で微小流動体化エマルジョンと混合し、固形 物が崩壊する温度より低い温度で凍結乾燥することにより、２４−７２時間（好 適には２４時間）でその賦形剤配合物を得る。例えばスクロース１０駕ｖ／ｖ、 クエン酸塩１０■Ｍを含む、１つの実施態様においては、１回目の乾燥を一４０ ℃で開始し、良好な真空（１０−１００！クロン、好適には５０ミクロン）下で 温度を次第に＝ｌＯ℃まで上昇させる。

１回目の乾燥工程の終了後、シェルフの温度を、次第に環境温度まで上昇させ（ １時間に１０−２０℃）、この温度でさらに２−１０時間（好適には４時間）、 または、乾燥した生成物中の水分レベルが１−３％にまで低下するまで、真空中 に放置する。この方式の他の改変は、リポソームおよびエマルジョンを別々に乾 燥させること、および再構成された懸濁液を混合することを含み、それにより所 望の製剤を供給する。いずれの場合も、凍結乾燥固形物は、容認可能な物理的外 見を有し、注入可能なワクチン製剤を供給するために容易に再構成される。

凍結乾燥された単一、または２バイアル製剤は、低水分含有によって、脂質成分 およびタンパク質抗原にとって、容認可能な安定性を有する。製剤は、２−８℃ または環境温度で貯蔵し得る。

表Ｕ ４　に　される　１　および　の　ム スクロース゛（１０％ｖ／ｖ） スクロース（８駕ｖ／ｖ）、マンニトール（１駕ｖ／ｖ）デクストロース（５駕 ｖ／ｖ） スクロース（９駕ｖ／ｖ）、ＰＥＧ　４００．１４５Ｇまたは３３５０　（Ｈｖ ／ｖ）スクロース（９駕ｖ／ｖ）、加水分解ゼラチン（１駕ｖ／ｖ）スクロース （９％Ｖ／Ｖ）、ゼラチン（魚の皮、ウシまたはブタ１％ｖ／ｖ） スクロース（９駕ｖ／ｖ）、Ｐｏｖｌｄｏｎｅ　１００００または４０００Ｇ（ １駕ｖ／ｖ）グリシン、アラニンまたはプロリン（０，３Ｍ　ｐＨ６−６，５） スクロース（９％Ｖ／Ｖ）カルボキシメチルセルロースリセロール（２−２０駕 ｗ／ｖ） ４　さらに、リン酸塩またはクエン酸塩緩衝剤が１０■Ｍの濃度で使用され、抗 原に安定性を供給する。

°　ラクトース、トレハロース、マルトースなどの他の糖が適切な重量で置換さ れ、等価の生理的重量オスモル濃度を提供する。

個々の刊行物または特許出願が、引用された部分において明確にそして個々に参 考のため援用されていることが示すされているように、本明細書において引用し たすべての刊行物および特許出願が、参考として援用されている。

上記の発明を、明白な理解のために、例示および実施例により、ある程度詳細に 説明してきたが、本発明の教示内容に鑑みて、添付の請求の範囲の意図または範 囲を逸脱することな（、変更および改変をし得るということが、当業者には自明 である。

ＦＩＧ、　Ｉ ＦＩＧ、　２ 時閉（遇） −ｏ−ｇｒｌ　５ＹＮＴＥＸ　ＭＤＰ −ｅ−ｇｒ２　ＭＦ７９／１５０１リホＣシームＦＩＧ、　３ 日Ｇ、６Ａ ＦＩＧ、　６８ 補正書の写しく翻訳文）提出書く特許法第１８４条の８）平成４年１２月２５日 ｈヨ

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．（１）リポソーム内またはリポソーム表面上に含まれる、免疫を刺激する量 の抗原物質；および（２）該リポソームを取り囲む連続相に、ムラミルペプチド および代謝可能な油を含む水中油型エマルジョンを含むワクチン組成物。
2. ２．前記抗原物質が前記連続相にも存在する、請求項１に記載の組成物。
3. ３．前記リポソームがフゾジェニックリポソームを含む、請求項１に記載の組成 物。
4. ４．前記リポソームおよび前記エマルジョンが、１：１０から１０：１の容量比 で存在する、請求項１に記載の組成物。
5. ５．前記リポソームおよび前記エマルジョンが、実質的に同一サイズの分布範囲 を占有する粒子として存在する、請求項１に記載の組成物。
6. ６．前記粒子の直径が、実質的にすべて１ミクロン未満である、請求項４に記載 の組成物。
7. ７．前記ムラミルペプチドが以下の式の化合物であり、（Ｉ）▲数式、化学式、 表等があります▼ここで、Ｒが、ＨまたはＣＯＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２および Ｒ３が独立してＨまたは脂質部分を示し、Ｒ４が水素またはアルキルであり、 ＸおよびＺが独立して、アラニル、バリル、ロイシル、イソロイシル、α−アミ ノブチリル、トレオニル、メチオニル、システイニル、グルタミル、イソグルタ ミル、グルタミニル、イソグリタミニル、アスパルチル、フェニルアラニル、チ ロシル、トリプトファニル、リシル、オルニチニル、アルギニル、ヒスチジル、 アスパリンギニル、プロリル、ヒドロキシプロピル、セリル、およびグリシルか らなる群から選択されるアミノシル部分を示し、 ｎが０または１であり、 Ｙが−ＮＨＣＨＲ５ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−であり、ここでＲ５が必要に応じてエス テル化またはアミデート化カルボキシル基を示し、そしてしがＯＨ、ＮＲ６Ｒ７ であり、ここでＲ６およびＲ７が独立してＨまたは低級アルキル基、または脂質 部分を示す、請求項１に記載の組成物
8. ８．前記ムラミルペプチドがムラミルジペプチドまたはムラミルトリペプチドで ある、請求項６に記載の組成物。
9. ９．前記ムラミルペプチドが、ヒドロキシアルキルアミン部分を介してリン脂質 部分に連結されているムラミルジペプチドおよびムラミルトリペプチドからなる 群から選択される、請求項７に記載の組成物。
10. １０．前記ムラミルペプチドが、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イ ソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセ ロ−３−（ヒドロキシホスホリロキシ））エチルアミドである、請求項４に記載 の組成物。
11. １１．前記油が動物油である、請求項５に記載の組成物。
12. １２．前記油がスタアレンである、請求項６に記載の組成物。
13. １３．前記組成物が別の乳化剤をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
14. １４．前記組成物が、１５容量％までの前記油を含む、請求項８に記載の組成物 。
15. １５．前記別の乳化剤が、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンソルビタン モノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステルもしくはポリオキシエ チレンソルビタントリエステル、ポリオキシエチレン脂肪酸、ポリオキシエチレ ン脂肪酸エーテル、およびその組合せからなる群から選択される、請求項９に記 載の組成物。
16. １６．前記別の乳化剤が、ポリオキシエチレンソルビタン２０モノオレエート、 スパン８５ソルビタントリオレエート、およびその組合せからなる群から選択さ れる、請求項１０に記載の組成物。
17. １７．前記組成物が、２．５重量％までの前記別の乳化剤を含む、請求項１１に 記載の組成物。
18. １８．前記抗原物質が、ウイルス粒子またはサブユニットである、請求項１に記 載の組成物。
19. １９．前記抗原物質が、ウイルス分子抗原である、請求項１に記載の組成物。
20. ２０．前記抗原物質が、ＨＳＶ　ｒｇＤ２、ＨＩＶ　ｇｐ１２０、ＨＩＶ　ＲＴ ６、ＨＳ　ｇＢ−２、マラリア血清１、およびインフルエンザワクチン抗原から なる遺伝子操作されたタンパク質の群から選択される、請求項１４に記載の組成 物。
21. ２１．宿主動物における免疫応答を刺激する方法であって、該動物に、リポソー ムと組み合わせて保護抗原を投与する工程を包含し、ここで、該リポソームおよ び該抗原または抗原類が、水中油型エマルジョンを含む連続水相の存在下で投与 され、該エマルジョンが、ムラミルペプチドおよび代謝可能な油を含む、方法。
22. ２２．前記抗原物質が前記連続相にも存在する、請求項１に記載の方法。
23. ２３．前記リポソームが、フゾジニックリポソームを含む、請求項１に記載の方 法。
24. ２４．前記リポソームおよび前記エマルジョンが、１：１０から１０：１の容量 比で存在する、請求項１に記載の方法。
25. ２５．前記リポソームおよび前記エマルジョンが、実質的に同一サイズの分布範 囲を占有する粒子として存在する、請求項１に記載の方法。
26. ２６．前記粒子の直径が、実質的にすべて１ミクロン未満である、請求項４に記 載の方法。
27. ２７．前記ムラミルペプチドが、以下の式の化合物であり、（Ｉ）▲数式、化学 式、表等があります▼ここで、Ｒが、ＨまたはＣＯＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２お よびＲ３が独立してＨまたは脂質部分を示し、Ｒ４が水素またはアルキルであり 、 ＸおよびＺが独立して、アラニル、バリル、ロイシル、イソロイシル、α−アミ ノブチリル、トレオニル、メチオニル、システイニル、グルタミル、イソグルタ ミル、グルタミニル、イソグルタミニル、アスパルチル、フェニルアラニル、チ ロシル、トリプトファニル、リシル、オルニチニル、アルギニル、ヒスチジル、 アスパリンギニル、プロリル、ヒドロキシプロピル、セリル、およびグリシルか らなる群から選択されるアミノシル部分を示し、 ｎが０または１であり、 Ｙが−ＮＨＣＨＲ５ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−であり、ここでＲ５が必要に応じてエス テル化またはアミデート化カルボキシル基を示し、そしてＬがＯＨ、ＮＲ６Ｒ７ であり、ここでＲ６およびＲ７が独立してＨまたは低級アルキル基、または脂質 部分を示す、請求項１６に記載の方法。
28. ２８．前記ムラミルペプチドが、ムラミルジペプチドまたはムラミルトリペプチ ドまたはその混合物である、請求項１７に記載の方法。
29. ２９．前記ムラミルペプチドが、ヒドロキシアルキルアミン部分を介してリン脂 質部分に連結されているムラミルジペプチドおよびムラミルトリペプチドからな る群から選択される構成成分を含む、請求項１８に記載の方法。
30. ３０．前記ムラミルペプチドが、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イ ソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセ ロ−３−（ヒドロキシホスホルロキシ））エチルアミドである、請求項１９に記 載の方法。
31. ３１．前記油がスクアレンである、請求項２０に記載の方法。
32. ３２．前記油がスタアランである、請求項２１に記載の方法。
33. ３３．前記連続水相が、別の乳化剤をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
34. ３４．前記別の乳化剤が、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンソルビタン モノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステルもしくはポリオキシエ チレンソルビタントリエステル、ポリオキシエチレン脂肪酸、ポリオキシエチレ ン脂肪酸エーテル、およびその組合せからなる群から選択される、請求項２３に 記載の方法。