JPH06321987A - ペプチド誘導体及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 細胞接着性蛋白質様の活性を充分に保持して
おり、簡便な手段で合成可能であり、血液中での安定性
の高い新規なペプチド誘導体を提供する。 【構成】 下記一般式（Ｉ）で表されるペプチド誘導体
またはその薬理学的に許容できる塩、及び該化合物を含
有する癌転移抑制剤。一般式（Ｉ） Ｚ＝Ｃ（［Ｘ］−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｙ）₂ （Ｉ） 一般式（Ｉ）中、［ ］は［ ］内の残基が存在しても
存在しなくてもよいことを表し、存在する場合ＸはＧｌ
ｕまたはＡｓｐ残基を表す。Ｙは−ＯＨあるいは−ＮＲ
¹Ｒ²を表す。ここでＲ¹及びＲ²は水素原子または炭素数
１〜８のアルキル基を表す。Ｒ¹及びＲ²は同一でも異な
っていてもよく、またこれら２つが連結して環を形成し
ていてもよい。Ｚは酸素原子または硫黄原子を表す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は特定の構成を有するペプ
チドの誘導体またはその薬学上許容可能な塩、及びそれ
らの用途に関するものである。

【０００２】

【従来技術】フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネク
チン等は細胞と結合組織との結合に関与し、また動物細
胞の細胞機能に関連した種々の生物活性を有する蛋白質
であり、細胞接着性蛋白質と総称される。例えばフィブ
ロネクチンは肝臓で生合成され、ヒト血漿中に約0.3 mg
/mlの濃度で存在する糖蛋白質である。

【０００３】フィブロネクチンはその１次構造が分子ク
ローニングを用いて決定されており（Koarnblihtt, A.
R. et al., EMBO Journal, 4巻, 2519 (1985)）、分子
量約２５０ＫのポリペプチドであるＡ鎖と約２４０Ｋの
Ｂ鎖がＣ末端附近でジスルフィド結合した２量体蛋白質
であることが明らかにされている。またラミニンについ
ても佐々木ら（Sasaki, M. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA., 81巻, 935 (1987), Sasaki, M. et al.,
J. Biol. Chem., 262巻, 17111 (1987)）によりその１
次構造が決定されている。ラミニンはＡ、Ｂ１、Ｂ２と
よばれる３本のポリペプチド鎖から構成されており、十
字架状の構造をとっていることが知られている。

【０００４】そしてその細胞接着性に関与する結合部位
の研究も行われ、フィブロネクチンの細胞接着に関与す
るコア配列はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）なるト
リペプチドであることが1984年に報告された（Pierschb
acher, M.D. et al., Nature309巻, 30 (1984)）。また
ラミニンの細胞接着部位のコア配列はＴｙｒ−Ｉｌｅ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）で表されるペン
タペプチドであることも解明されている（Graf, J. et
al., Cell 48巻, 989 (1987)）。

【０００５】これらフィブロネクチンやラミニンは、上
記コア配列を介して細胞のレセプターと結合することに
より各種の情報を細胞に伝達し、またヘパリン、コラー
ゲン、フィブリン等の生体高分子とも結合して細胞と結
合組織との接着、細胞の分化、増殖に関与しているもの
と考えられている。

【０００６】このように細胞接着性蛋白質は多様な生物
活性を有するため、その活性部位配列ペプチドを用いた
研究が精力的になされている。例えばフィブロネクチン
の細胞結合部のコア配列の利用としては、ポリマーにＲ
ＧＤ配列を有するペプチドを共有結合させ、人工臓器用
基体や動物細胞培養用基体として用いる方法（特開平1-
309682号公報、特開平1-305960号公報、WO 90/05036 A
特許）、ＲＧＤ配列を有するペプチドに疎水性領域を連
結することにより目的とするペプチドを固体表面に付着
させ、歯科用埋め込み剤や組織培養基体に利用する方法
（WO 90/11297A特許）、ＲＧＤ配列を有する種々の環状
及び鎖状オリゴペプチドまたはその類縁体を用いて血小
板凝集を阻害する方法あるいは血栓症を予防、治療する
方法（高分子学会予稿集第38巻、3149 (1989)、特開平2
-174797号公報、特開平3-118330号公報、特開平3-11833
1号公報、特開平3-118398号公報、特開平3-118397号公
報、特開平3-118333号公報、WO 91/01331特許、WO 91/0
7429特許、WO 91/15515特許、WO 92/00995特許）、ＲＧ
Ｄペプチドとヒアルロン酸を共有結合した化合物を用い
て血小板凝集を調節する方法（特開平4-134096号公
報）、ＲＧＤ配列を有するペプチドを細胞移動制御剤と
して用いる方法（特開平2-4716号公報）、ＲＧＤ配列を
有するペプチドを固定化した膜を細胞接着膜として用い
る方法（高分子学会予稿集第37巻、705 (1988)）、ＲＧ
ＤＳ配列を有するポリペプチドを体外血液用血小板保護
剤として用いる方法（特開昭64ー6217号公報）、ポリペ
プチド分子内に細胞接着活性を有するペプチドを付加す
ることにより人工機能性ポリペプチドとして利用する方
法（特開平3-34996号公報）等が開示されている。

【０００７】更に近年、細胞接着性蛋白質は癌転移に関
与する生体分子としても注目されてきている。癌転移の
一連の段階では、癌細胞は種々の宿主細胞や生体高分子
と接触する。このときフィブロネクチンやラミニンのよ
うな細胞接着性分子が存在すると、該細胞は多細胞塊を
形成し、癌細胞の増殖や生存がより容易になる。ところ
が、たとえばフィブロネクチンの接着部位コア配列であ
るトリペプチドＲＧＤが共存すると、競争的に癌細胞上
のフィブロネクチンレセプターと結合するため細胞接着
がブロックされ、癌転移抑制作用を示すことが報告され
ている（Science 238巻, 467 (1986)）。

【０００８】しかしながらＲＧＤペプチドはそれ単独で
は細胞接着活性が充分でないため、効果の増強をはかる
目的で該配列を有するオリゴペプチド、環状オリゴペプ
チド、あるいはその繰返し配列を有するポリペプチドを
用いて癌転移を制御する方法（Int. J. Biol. Macromo
l., 11巻, 23 (1989)、同誌、11巻, 226 (1989)、Jpn.
J. Cancer Res., 60巻, 722, (1989)、特開平2-174798
号公報）、あるいは腫瘍再発を防止する方法（特開平2-
240020号公報）が開示されている。またフィブロネクチ
ン分子中の細胞接着ポリペプチドとヘパリン結合ポリペ
プチドを構成単位とするポリペプチドを用いて癌転移を
抑制する方法（特開平3-127742号公報）も報告されてい
る。

【０００９】一方、ラミニンの接着部位コア配列につい
ても検討が行われており、ＹＩＧＳＲ配列を有するペプ
チド誘導体やＹＩＧＳＲ繰返し配列を有するオリゴ（ポ
リ）ペプチドを用いて細胞接着や癌転移を制御する方法
（WO 88/06039特許、米国特許出願87-13919、米国特許
出願88-221982、欧州特許出願第0278781号公告、特開平
2-174798号公報、特開平3-2196号公報、Iwamoto, I. Sc
ience 238巻, 1132(1987) 、Graf, J. Biochemistry 26
巻, 6896 (1987)、Mayumi, T. et al., Biochem. Bioph
ys. Res. Commun., 174 巻, 1159 (1991)、Mayumi, T.
et al.,Peptide chemistry 145 (1991)、Tanaka, N.G.
et al., Cancer Res., 51巻, 903 (1991)、特表平3-506
039号公報）、ＹＩＧＳＲペプチドを固定化したエチレ
ン−アクリル酸共重合体を細胞接着膜として用いる方法
（Nakajima A. et al.,Polymer Journal 24巻、465 (19
92)）等が開示されている。これらの方法においては、
接着部位コア配列がラミニンへの細胞接着を阻害するこ
とによって所期の活性を示すものと考えられている。ま
たＹＩＧＳＲペプチド誘導体のコンフォメーション計算
を行い、ラミニンコアペプチドの立体構造と生物活性の
関係について述べた論文も報告されている（McKelvey,
D. R. et al., J. Protein Chem.,10巻、265 (1991))
。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】上述のようにラミニン
等の細胞接着性蛋白質の活性部位コア配列は様々な生物
活性を保持しているため、その応用価値は高いものと考
えられる。しかしながら該コア配列の細胞接着活性が充
分でないため、それらの癌転移抑制作用は実際の医療に
応用するためには満足できるものではなかった。また一
般に薬物が生体に投与されたのち薬効を維持するために
は、それ自体の生物活性の強さのみならず薬物の生体内
での安定性（例えば血流中での滞留時間や排泄される時
間など）が重要であることが知られている。細胞接着性
蛋白質の接着部位コア配列ペプチドも例外ではなく、そ
れ単独ではペプチド類に特有の速い代謝分解や排泄が起
こり、結果的に所望の効果が期待できない場合も生ず
る。そこで生体内での安定性を向上させるため従来技術
の項で説明したような種々の方法が報告されているが、
それらの化合物のなかには未だ生物活性が不充分であっ
たり、合成が困難なものも多い。またポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）等の高分子と該コア配列を連結する方
法や、該コア配列を直鎖状に繰返すことにより高分子量
化を行い、生体内での安定性を向上させる方法も試みら
れているが、これらの方法では目的物の構造や分子量を
特定して合成を行うことは極めて困難であり、この点で
更に有効な物質の開発が必要とされていた。

【００１１】そこで本発明者らは細胞接着性蛋白質であ
るラミニンの持つ種々の生物活性を充分に保持し、合成
も容易でかつ血液中での安定性の高い新規な化合物を求
めて鋭意検討を行った結果、公知のラミニンコア配列ペ
プチドに比べて癌転移抑制能が大きい新規なペプチド誘
導体を見出し、本発明を完成するに至った。従って本発
明の目的は、細胞接着性蛋白質様の活性を充分に保持し
ており、簡便な手段で合成可能であり、血液中での安定
性の高い新規なペプチド誘導体を提供することにある。
本発明はさらに癌転移抑制能の高い新規なペプチド誘導
体を提供することを目的とする。本発明はさらに上記ペ
プチド誘導体を含有してなる薬剤組成物の提供も目的と
する。

【００１２】

【課題を解決する手段】上記課題は、下記一般式（Ｉ）
で表されるペプチド誘導体またはその薬理学的に許容で
きる塩を見出したことにより達成された。一般式（Ｉ） Ｚ＝Ｃ（［Ｘ］−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｙ）₂ （Ｉ） ここでＴｙｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｒｇは、チ
ロシン、イソロイシン、グリシン、セリン、アルギニン
残基をそれぞれ表す。これらのアミノ酸残基（グリシン
は除く）はＤ-体、Ｌ-体、ラセミ体のいずれでもよい
が、好ましくはＬ-体である。

【００１３】一般式（Ｉ）中、Ｚは酸素原子または硫黄
原子を表す。［ ］は［ ］内の残基が存在しても存在
しなくてもよいことを表すが、本発明においては［ ］
内の残基は存在する方が好ましい。存在する場合、Ｘは
ＧｌｕまたはＡｓｐ残基を表す。なおＧｌｕ、Ａｓｐは
それぞれグルタミン酸、アスパラギン酸残基を表す。こ
れらのアミノ酸残基はＤ-体、Ｌ-体、ラセミ体のいずれ
でもよいが、好ましくはＬ-体である。

【００１４】Ｙは−ＯＨあるいは−ＮＲ¹Ｒ²を表す。こ
こでＲ¹及びＲ²は水素原子または炭素数１〜８のアルキ
ル基を表す。Ｒ¹及びＲ²は同一でも異なっていてもよい
が、炭素数が３または４以上である場合は分岐構造を有
していることが好ましい。またＲ¹及びＲ²が連結して環
を形成していてもよい。本発明における好ましいＹとし
ては、−ＮＨ₂、−ＮＨＣＨ₃、−ＮＨiＣ₃Ｈ₇、−Ｎ
（ＣＨ₃）₂、−Ｎ（ＣＨ₂）₄ 等を挙げることができる
が、なかでも−ＮＨＣＨ₃、−ＮＨiＣ₃Ｈ₇が特に好まし
い。

【００１５】本発明のペプチド誘導体は、［Ｘ］−Ｔｙ
ｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｙで表されるペ
プチドが、Ｎ末端側からカルボニル基あるいはチオカル
ボニル基の両端に共有結合してなる化合物であり、１分
子中に２個の［Ｘ］−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
−Ａｒｇ−Ｙで表されるペプチド配列を含んでいること
を特徴とする。従っていわゆるポリマー類とは異なり、
分子構造は明確である。本発明において、［Ｘ］−Ｔｙ
ｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｙで表されるペ
プチド配列を一般式（Ｉ）で表されるように誘導体化す
るのは、有効なペプチドの周辺を修飾することにより生
体内酵素等による分解から保護したり、また高分子量に
して徐放効果を付与することを意図したものである。

【００１６】本発明のペプチド誘導体中に存在するイオ
ン性基は、適当な対イオンと塩を形成していてもよい。
塩の状態でも本発明の化合物はその生物学的活性を充分
に維持する。ただしその塩は生理学的、薬理学的に許容
されるものであることが必要である。具体的には塩酸
塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩のような無機酸との塩、
酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の有機酸との塩、さらにナ
トリウム塩、カリウム塩等が挙げられるが、なかでも塩
酸塩、ナトリウム塩が特に好ましい。そのような塩への
変換は慣用手段により行うことができる。

【００１７】以下に本発明のペプチド誘導体の具体例を
示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。な
お該ペプチド誘導体のＣ末端が−ＯＨの場合は、該分野
の慣例によりその記載を省略する。またアミノ酸残基が
Ｄ−体の場合はD- と表記するが、天然型のＬ−体の場
合は特に表記していない。

【００１８】化合物１ Ｏ＝Ｃ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａ
ｒｇ−ＮＨｉＰｒ）₂ なおここで、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。

【００１９】次に本発明の化合物の合成法について説明
する。本発明のペプチド誘導体は、カルボニル基あるい
はチオカルボニル基の両端にペプチド鎖が結合した、い
わゆる尿素型化合物である。本発明のペプチド誘導体は
種々の方法でこれを合成することが可能であるが、まず
保護ペプチド部を合成ののちアミノ末端側の保護基を除
去し、これを尿素型化合物に誘導体化し、しかるのちに
保護基を除去することにより合成する方法が実用的かつ
有利である。まずペプチド部の合成方法としては、特に
限定しないが例えば固相法及び固相法を利用したペプチ
ド自動合成装置による合成法が挙げられる。固相法及び
固相法を利用したペプチド自動合成装置による合成法に
関しては、生化学実験講座・タンパク質の化学IV p.207
（日本生化学会編、東京化学同人）、続生化学実験講座
・タンパク質の化学（下） p.641（日本生化学会編、東
京化学同人）等に記載されている。

【００２０】本発明の化合物のペプチド部は、液相法に
よって合成することも可能である。すなわちＣ末端成分
となる保護アルギニンから出発し、Ｃ末端を修飾ののち
アルギニン残基のアミノ末端保護基を除去し、以下保護
アミノ酸を逐次縮合する方法である。また［Ｘ］−Ｔｙ
ｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ残基とＳｅｒ−Ａｒｇ残基の間でフ
ラグメント縮合を行う方法も有効である。なおここで
［Ｘ］は先に定義した内容と同義である。保護アミノ酸
あるいは保護ペプチドを縮合する方法としては、公知の
方法、例えば泉屋信夫ら編「ペプチド合成の基礎と実
験」（丸善）に記載の方法のなかから適宜選択すること
ができる。縮合反応には種々の方法が知られているが、
1-ヒドロキシベンゾトリアゾールとＤＣＣを用いるDCC-
Additive法、あるいはカルボニルジイミダゾールを用い
る縮合法が最も良い結果を与えた。

【００２１】以上の方法により合成したペプチド部はア
ミノ末端保護基を除去し、これを尿素型化合物に誘導体
化する。アミン化合物を尿素型化合物に変換する方法と
しては、例えば新実験化学講座１４ 有機化合物の合成
と反応(III) P.1628〜1644に記載の公知の方法のなかか
ら適宜選択することができるが、適当な不活性溶媒中、
カルボニルジイミダゾールあるいはチオカルボニルジイ
ミダゾールとアミノ末端側アミノ基のみ遊離の保護ペプ
チドを反応させる方法が最もよい結果を与えた。

【００２２】保護基の除去の条件は用いている保護基の
種類に依存する。通常用いられる方法は、加水素分解、
ＨＦ処理、トリフルオロメタンスルホン酸／チオアニソ
ール／m-クレゾール／トリフルオロ酢酸混合系処理等で
あるが、保護基の種類によってはさらにさまざまな方法
も可能であることは言うまでもない。目的とするペプチ
ド誘導体は脱保護ののち公知の方法、例えばイオン交換
クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなど
で精製することができる。

【００２３】つぎに本発明のペプチド誘導体の作用及び
用途について説明する。本発明のペプチド誘導体は、ラ
ミニンの接着コア配列ペプチドであるＹＩＧＳＲと類似
の機構で悪性細胞上のラミニン受容体に作用し、ラミニ
ンへの結合を阻害することにより悪性細胞の接着、コロ
ニー化、破壊的浸食を阻止するものと考えられる。さら
に本発明のペプチド誘導体は１分子中にＹＩＧＳＲ配列
を２個有するため、悪性細胞上のフィブロネクチン受容
体に多点で作用し、またある程度の大きい分子量を有す
るため酵素分解や代謝によって排泄されにくく、そのた
め顕著な癌転移抑制活性を示すものと考えられる。本発
明のペプチド誘導体は、乳癌、表皮癌、筋線メラノーマ
（muscle line melanoma）、表皮線神経芽細胞腫xグリ
オマ（epidermal line neuroblastoma x glioma ）、軟
骨細胞、フィブロザルコーマを含め種々の細胞の接着及
び転移を阻止するのに有効である。

【００２４】さらに本発明のペプチド誘導体は、創傷治
癒作用等の広範な生物活性が認められた。また本発明の
ペプチド誘導体はマウスを用いて毒性試験を行ったとこ
ろ、毒性は全く認められなかった。

【００２５】本発明のペプチド誘導体またはその薬学上
許容可能な塩は、ペプチド系医薬に一般に使用されてい
る投与方法によって使用することができ、通常賦形剤を
含む薬物組成物として投与される。この薬物組成物はレ
ミントンの薬科学（Remington's Pharmaceutical Scien
ces, Merck, 16, (1980)）に開示されているように、知
られているどのような方法で製造してもよい。賦形剤と
しては蒸留水、生理食塩水、リン酸塩あるいは酢酸塩の
様な緩衝塩類を含有する緩衝液、浸透圧調節剤としての
塩化ナトリウムやショ糖、若しくはアスコルビン酸のよ
うな酸化防止剤、または許容し得るこれらの組合せがあ
る。

【００２６】このような薬物組成物は溶液、錠剤の様な
種々の形態とすることができる。投与形態としては経
口、経鼻、非経口（静脈注射、皮下注射、腹腔内投与な
ど）等のなかから適宜選択することができる。例えば生
理食塩水に溶解して注射用製剤としてもよく、あるいは
0.1規定程度の酢酸緩衝液に溶解したのち凍結乾燥剤と
してもよい。またリポソーム中に内包したマイクロカプ
セル剤あるいはミクロスフェアー等の形態で利用するこ
とも可能である。

【００２７】また本発明のペプチド誘導体は他の薬理作
用を有する化合物、より具体的には抗癌性化合物と併用
して使用することも可能であり、これらは本発明の範疇
に属するものである。本発明のペプチド誘導体と併用し
て使用することの可能な抗癌性化合物としては、癌化学
療法において通常用いられる公知の制癌剤のなかから適
宜選択する事が可能であるが、具体的にはアドリアマイ
シンやシスプラチン、マイトマイシン等を挙げることが
可能である。一般に従来の化学療法においては、制癌剤
の副作用による危険性は避けられない問題であることが
知られている。それゆえ本発明のペプチド誘導体との併
用投与により制癌剤の投与量を減らし、制癌剤による副
作用を軽減する事は非常に有用であると思われる。また
これは癌転移抑制効果をより向上させることをも意味す
る。本発明のペプチド誘導体は組成物中に0.1〜99 %
（重量）含有され、その投与量は１日あたり通常0.2 μ
g/kgから200 mg/kgの範囲であるが、患者の年齢、性
別、体重、症状、投与方法によって決定されるものであ
る。

【００２８】

【実施例】以下実施例によって本発明を更に詳細に説明
する。なお通常用いられる溶媒や試薬、保護基の表記に
は以下の略号を使用した。

【００２９】Ｂｏｃ ：t-ブトキシカルボニル Ｂｎ ：ベンジル ＡｃＯＥｔ ：酢酸エチル Ｍｔｓ ：メシチレンスルホニル ＨＯＢｔ ：1ーヒドロキシベンゾトリアゾール ＤＣＣ ：ジシクロヘキシルカルボジイミド ｉＰｒ ：イソプロピル ｉＰｒ₂ＮＥｔ ：ジイソプロピルエチルアミン ＤＭＦ ：ジメチルホルムアミド ＣＤＩ ：カルボニルジイミダゾール ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸 ＴＦＭＳＡ ：トリフルオロメタンスルホン酸

【００３０】実施例１ 化合物１の合成 化合物１の液相法による合成法について詳細に説明す
る。化合物１の合成経路を以下に示す。

【００３１】

【化１】

【００３２】

【化２】

【００３３】１） 中間体１の合成 Boc-Arg(Mts)-OH (25.0 g, 55 mmol)、イソプロピルア
ミン (3.25 g, 55 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール１水和物 (8.42 g, 55 mmol) をDMF (30 ml) 及び
塩化メチレン (30 ml)の混合溶媒に溶解し、氷冷しなが
らDCC (11.3 g, 55 mmol) を加えた。反応混合物を氷
冷下１時間、更に室温まで昇温しながら終夜撹拌した
後、セライト濾過して生成した沈殿を除去した。濾液を
適当量の酢酸エチルで希釈し、水、1 M クエン酸溶液、
5 % 炭酸ナトリウム溶液、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸
ナトリウムで乾燥ののち減圧濃縮して目的とする中間体
１を無色粉末として29.0 g（定量的）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 457.

【００３４】２） 中間体２の合成 中間体１ (25 g, 55 mmol) のジオキサン (50 ml) 溶液
に塩化水素／ジオキサン溶液 (4 M, 60 ml) を加え、反
応混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣
をエーテルから結晶化させて塩酸塩23.8 gを無色粉末と
して得た。一方Boc-Ser(Bn)-OH (15.93 g, 54 mmol)をD
MF (30 ml) に溶解し、このものに氷冷しながらCDI（8.
76 g, 54 mmol) のDMF (60 ml) 溶液を加えた。反応混
合物を氷冷しながら１時間撹拌したのち、上記操作によ
り得られた塩酸塩 (23.0g, 53.1 mmol)とジイソプロピ
ルエチルアミン (7.10 g, 55 mmol) のDMF (45 ml) 溶
液を加えた。反応混合物を氷冷下２時間、更に室温まで
昇温しながら終夜撹拌した後、減圧下溶媒を留去した。
残渣を適当量の酢酸エチルで希釈し、水、1 M クエン酸
溶液、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥ののち減圧濃縮し、目的とする中間体２を無
色粉末として36.14 g（定量的）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 675.

【００３５】３） 中間体３の合成 中間体２ (35.0 g, 52 mmol) のジオキサン (70 ml) 溶
液に塩化水素／ジオキサン溶液 (4 M, 70 ml) を加え、
反応混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を留去し、残
渣をエーテルから結晶化させて塩酸塩30.5 gを無色粉末
として得た。一方、Boc-Gly-OH (8.58 g, 49 mmol)をDM
F (30 ml) に溶解し、このものに氷冷しながらCDI（7.9
5 g, 49 mmol) のDMF (60 ml) 溶液を加えた。反応混合
物を氷冷しながら１時間撹拌したのち、上記操作により
得られた塩酸塩 (30.5 g,50.0 mmol) とジイソプロピル
エチルアミン (6.6 g, 51 mmol) のDMF (50 ml)溶液を
加えた。反応混合物を氷冷下２時間、更に室温まで昇温
しながら終夜撹拌した後、減圧下溶媒を留去した。残渣
を適当量の酢酸エチルで希釈し、水、1 Mクエン酸溶
液、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥ののち減圧濃縮し、目的とする中間体３を無色
粉末として34.87 g（98.8 %）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 732.

【００３６】４） 中間体４の合成 中間体３ (34.8 g, 47.7 mmol) の塩化メチレン (80 m
l) 溶液にトリフルオロ酢酸 (80 ml) を加え、反応混合
物を室温で１時間撹拌した。反応終了後溶媒を留去し、
残渣をエーテルから結晶化させてトリフルオロ酢酸塩3
4.6 g（97.4 %）を無色粉末として得た。一方、Boc-Ile
-OH (10.9 g, 47 mmol)をDMF (30 ml) に溶解し、この
ものに氷冷しながらCDI（7.62 g, 47 mmol) のDMF (60
ml) 溶液を加えた。反応混合物を氷冷しながら１時間撹
拌したのち、上記操作により得られたトリフルオロ酢酸
塩(34.6 g, 46.4 mmol) とジイソプロピルエチルアミン
(6.33 g, 48 mmol)のDMF (50 ml) 溶液を加えた。反応
混合物を氷冷下２時間、更に室温まで昇温しながら終夜
撹拌した後、減圧下溶媒を留去した。残渣を適当量の酢
酸エチルで希釈し、水、1 M クエン酸溶液、飽和重曹
水、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥のの
ち減圧濃縮し、目的とする中間体４を無色粉末として3
8.8 g（定量的）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 845.

【００３７】５） 中間体５の合成 中間体４ (38.8 g, 47.7 mmol) の塩化メチレン (60 m
l) 溶液にトリフルオロ酢酸 (60 ml) を加え、反応混合
物を室温で１時間撹拌した。反応終了後溶媒を留去し、
残渣をエーテルから結晶化させてトリフルオロ酢酸塩3
8.1 g（95.6 %）を無色粉末として得た。一方、Boc-Tyr
(Bn)-OH (16.5 g, 44.4 mmol)をDMF (35 ml) に溶解
し、このものに氷冷しながらCDI（7.30 g, 45 mmol) の
DMF (50 ml) 溶液を加えた。反応混合物を氷冷しながら
１時間撹拌したのち、上記操作により得られたトリフル
オロ酢酸塩 (38.1 g, 44.4 mmol) とジイソプロピルエ
チルアミン (5.94 g, 46 mmol)のDMF (50 ml) 溶液を加
えた。反応混合物を氷冷下２時間、更に室温まで昇温し
ながら終夜撹拌した後、減圧下溶媒を留去した。残渣を
酢酸エチルから再結晶し、目的とする中間体５を無色結
晶として36.51 g（75.0 %）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 1098.

【００３８】６） 中間体６の合成 中間体５ (15.25 g, 13.9 mmol) の塩化メチレン (30 m
l)溶液にトリフルオロ酢酸 (30 ml) を加え、反応混合
物を室温で１時間撹拌した。反応終了後溶媒を留去し、
残渣をエーテルから結晶化させてトリフルオロ酢酸塩1
5.5 g（定量的）を無色粉末として得た。一方、Boc-Asp
(Bn)-OH (4.52 g, 14.0 mmol)をDMF (15 ml) に溶解
し、このものに氷冷しながらCDI（2.27 g, 14.0 mmol)
のDMF (25 ml) 溶液を加えた。反応混合物を氷冷しなが
ら１時間撹拌したのち、上記操作により得られたトリフ
ルオロ酢酸塩 (15.5 g, 14.0 mmol) とジイソプロピル
エチルアミン (1.94 g, 15mmol)のDMF (35 ml) 溶液を
加えた。反応混合物を氷冷下２時間、更に室温まで昇温
しながら終夜撹拌した後、減圧下溶媒を留去した。残渣
を酢酸エチル／エーテル（１／１）から再結晶し、目的
とする中間体６を無色結晶として16.6 g（91.1 %）得
た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 1303.

【００３９】７）中間体７の合成 中間体６ (4.69 g, 3.6 mmol) の塩化メチレン (20 ml)
溶液にトリフルオロ酢酸 (20 ml)を加え、反応混合物を
室温で１時間撹拌した。反応終了後溶媒を留去し、残渣
をエーテルから結晶化させてトリフルオロ酢酸塩4.7 g
（定量的）を無色粉末として得た。得られたトリフルオ
ロ酢酸塩（1.36 g, 1.0 mmol）をジイソプロピルエチル
アミン (142 mg, 1.1 mmol)及びDMF（5 ml）からなる混
合溶媒に溶解し、CDI（84 mg, 0.5 mmol ）を加えた。
反応混合物を室温に２日間放置したのち減圧下溶媒を留
去した。残渣をエーテル／酢酸エチル（２／１）から結
晶化させて目的とする中間体７を1.32 g（定量的）得
た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 2399.

【００４０】８） 化合物１の合成 中間体７ (1.3 g, 0.5 mmol)のトリフルオロ酢酸 (7 m
l) 溶液に、トリフルオロメタンスルホン酸 (6 g)、チ
オアニソール (4 ml)、m-クレゾール (3.5 ml)、トリフ
ルオロ酢酸 (18 ml)からなる混合溶液を氷冷しながら加
え、反応混合物を氷冷下２時間撹拌した。反応液をエー
テル (800 ml) に滴下して１時間ゆっくり撹拌した。沈
殿した粗生成物を少量の水にとかし、常法によりイオン
交換クロマトグラフィー（アンバーライトIRA-400、対
イオンOAc^-）により精製、凍結乾燥して目的とする化合
物１を無色粉末として440 mg（58.9 %）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 1495.

【００４１】実施例２ メラノーマ細胞を用いた実験的
肺転移モデル系による癌転移抑制作用に関する検討 本発明のペプチド誘導体の癌転移抑制作用について、実
験的肺転移モデル系によって検討した。実施例に記載し
た本発明の化合物１と、比較例として特開平3-2196号公
報に記載のAc-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NH₂を用いた。これ
らのペプチド（本発明の化合物１の場合は500 μg、Ac-
Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NH₂の場合は1000μg）と非常に転
移性の強い癌細胞であるB16-BL6メラノーマ細胞（対数
増殖期のもの5 x 10⁴個）を各々PBS中で混合し、これを
１群５匹のC57BL/6の雌マウスに尾静脈注射により投与
した。投与後14日目にマウスを屠殺、解剖し、肺に転移
した癌のコロニー数を計測して対照のPBS投与群と比較
した。その結果を以下の表１に示す。

【００４２】

【表１】 表１ ───────────────────────────────── 投与化合物 肺への転移数 平均±SD (範囲) ───────────────────────────────── ＰＢＳ（未処理） 238±84 (116-334) Ac-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NH₂ 155±72 (83-247) 化合物１ 76±30 (31-105)* ───────────────────────────────── * t-検定で未処理区と比較して P<0.01

【００４３】この結果によれば、公知のペプチドである
Ac-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NH₂は、マウス１匹あたり1000
μgの投与量で転位数の減少は見られたものの、未処理
区と比較して危険率 5 %で有意と判断される癌転移抑制
効果は認められなかった。これに対し本発明の化合物１
を投与した場合には、マウス１匹あたり500 μgの投与
量でも肺への癌転移は顕著に抑制された。これは本発明
の重要な目的の１つである、修飾による活性の増強が目
論見通り達成されていることを示している。従って本発
明のペプチド誘導体の癌転移抑制効果、及びその有用
性、優位性は明白である。

【００４４】以上実施例により本発明を特定の例に関し
て説明したが、限定して解釈されるべきではない。本発
明の本質及び範囲から逸脱しない種々の変更や修正が可
能であることは明らかである。そしてそのような発明は
本発明に含まれると考える。

【００４５】

【発明の効果】以上説明したように、本発明のペプチド
誘導体は細胞接着性蛋白質であるラミニンのコア配列ペ
プチドと比較して癌転移抑制作用が大きく、毒性の問題
もほとんど無い。またその構造は単純であるため合成も
容易であり、医薬として価値の高いものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 済木 育夫 北海道札幌市厚別区厚別北３条西５丁目12 −６ (72)発明者 東 市郎 北海道札幌市南区真駒内上町５丁目３−２

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（Ｉ）で表されるペプチド誘
   導体またはその薬理学的に許容できる塩。一般式（Ｉ） Ｚ＝Ｃ（［Ｘ］−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｙ）₂ （Ｉ） 一般式（Ｉ）中、［ ］は［ ］内の残基が存在しても
   存在しなくてもよいことを表し、存在する場合ＸはＧｌ
   ｕまたはＡｓｐ残基を表す。Ｙは−ＯＨあるいは−ＮＲ
   ¹Ｒ²を表す。ここでＲ¹及びＲ²は水素原子または炭素数
   １〜８のアルキル基を表す。Ｒ¹及びＲ²は同一でも異な
   っていてもよく、またこれら２つが連結して環を形成し
   ていてもよい。Ｚは酸素原子または硫黄原子を表す。
2. 【請求項２】 薬学上許容できる賦形剤及び請求項１に
   記載のペプチド誘導体またはその薬学上許容できる塩を
   有効成分として含有してなる、癌転移抑制剤。