JPH0630798A

JPH0630798A - ヒトの性別決定法

Info

Publication number: JPH0630798A
Application number: JP5135167A
Authority: JP
Inventors: Rebecca Reynolds; レイノルズレベッカ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1992-05-15
Filing date: 1993-05-14
Publication date: 1994-02-08
Also published as: CA2096278A1; EP0569833A2

Abstract

(57)【要約】【構成】ヒト由来のＤＮＡ試料に基いてヒトの性を決
定する方法であって、（ａ）試料から生成物を次のプラ
イマー：ＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＡＧＣＴＧＡＣ
（配列番号：１）及びＴＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＴＧＣＣ
ＡＡＧＡＧ（配列番号：２）によるポリメラーゼ連鎖反
応法を用いて増幅し、（ｂ）前記生成物をＨａｅIII 制
限酵素により消化し、そして（ｃ）前記消化された生成
物を可視化する、段階を含んで成る方法。【効果】簡単で正確に極微量の試料を用いてヒトの性
を決定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は性決定方法並びにこの方
法において使用するための特異的プローブ及びプライマ
ーに関する。

【０００２】

【従来の技術】性の決定は、生物学的試料の法医学分
析、及び生体外受精に伴う性関連疾患の可能性を決定す
るための移植前胚の性別決定を含めて、多くの科学的過
程の重要な観点である。本発明の性決定分析は雄性の異
型（ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｉｃ)(ＸＹ）性に依存す
る。すなわち、例えば精巣決定因子（ｔｅｓｔｅｓ−ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｆａｃｔｏｒ)(ＴＤＦ）として
知られる性決定遺伝子は異型（ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈ
ｉｃ）個体のゲノムに位置すると信じられ、そして精巣
に分化するための両性発育可能性生殖腺原基（ｂｉｐｏ
ｔｅｎｔｉａｌｇｏｎｎｄａｌｐｒｉｍｏｒｄｉ
ｎ）を生じさせると信じられる〔Ｐａｇｅ，Ｄ．Ｃ．
ら、Ｃｅｌｌ５１，１０９１−１１０４（１９８
７）〕。従って、ＴＤＦは多くの既知の性決定試験のた
めの基礎である。

【０００３】他の性決定法は、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ−Ｓｍ
ｉｔｈ，Ｍ．Ａ．によりＢｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．２９
７，６３５−６３６（１９８８）に記載された「量／Ｘ
−不活性化」（ｄｏｓａｇｅ／Ｘ−ｉｎａｃｔｉｖａｔ
ｉｏｎ）モデルに基く。さらに詳しくは、この方法は、
Ｘ染色体上のＺＦＹ遺伝子及び関連遺伝子が機能的に相
互交換可能な蛋白質を生産するという前提に基いてい
る。すなわち、ＸＹ細胞は該遺伝子の２つの活性なコピ
ーを有するであろう。他方、ＸＸ細胞は「Ｘ−不活性
化」のために１つのみの活性なコピーを有するであろ
う。従って、該遺伝子の２つの活性なコピーを有する胚
は雄性として発達し、他方該遺伝子の１つの活性なコピ
ーを有するものは雌性として発達するであろう。

【０００４】この「量／Ｘ−不活性化」モデルはＳｃｈ
ｎｅｉｄｅｒ−Ｇａｄｉｃｋｅ，Ａ．ら〔Ｃｅｌｌ５
７，１２４７−１２５８（１９８９）〕により不定され
た。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−ＧａｄｉｃｋｅはＺＦＹ遺伝
子のヒトＸ相同染色体（Ｘｈｏｍｏｌｏｇ)(ＺＦＸと称
する）をクローン化し、そしてこのＸ染色体遺伝子がＺ
ＦＹ蛋白質のそれに密接に関連する亜鉛フィンガードメ
インを有する蛋白質をコードすることを見出した。ヒト
−ゲッ歯動物雑種細胞系の転写分析により、ＺＦＸは
「Ｘ−不活性化」をのがれることが見出された。

【０００５】他の性決定法は、ユニバーサルプライマー
（すなわち、多くの種、例えばヒト、ウシ、ヒツジ及び
ヤギに対して有用なプライマー）及びＰＣＲを用いて、
ＺＦＹ遺伝子及びＺＦＸ遺伝子に対応する雄性又は雌性
ゲノムＤＮＡから４４７塩基対（ｂｐ）又は４４５ｂｐ
の断片を増幅する〔Ａａｓｅｎ，Ｅ．及びＭｅｄｒａｎ
ｏ，Ｊ．Ｆ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８，１
２７９−１２８１（１９９０）〕。次に、該断片の制限
断片長多型（ＲＦＬＰ）分析が、制限酵素のパネル（Ａ
ｌｕＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨａｅIII,ＨｉｎｆＩ，Ｍｓｐ
Ｉ，ＰｓｔＩ，ＳａｃＩ及びＳａｌＩ）の消化に基く４
種における性間の特異的結合パターンを示した。ヒトに
おいて、ＲＦＬＰ分析が示したところによれば、ＺＦＸ
断片は雄性及び雌性の両者において４００ｂｐ及び４５
ｂｐの断片を生成する一個のＨａｅIII 部位を有してい
たが、ＺＦＹ断片は２つのＨａｅIII 部位を有し、３１
７ｂｐ，８４ｂｐ及び４６ｂｐの断片をもたらした。従
って、ヒト雄性試料は、４００，３１７，８４及び４６
／４５塩基対の４つの断片により同定される。

【０００６】さらに、性染色体異数性（ａｎｅｕｐｌｏ
ｉｄｙ）のＰＣＲに基く診断は、Ｍｕｔｔｅｒ，Ｇ．
Ｌ．及びＰｏｍｐｏｎｉｏ，Ｒ．Ｊ．によりＮｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９，４２０３−
４２０７（１９９１）により記載されている。この方法
はＸ及びＹ染色体上の相同であるがしかし別々の遺伝子
に対して向けられた１つのプライマーを用い、そして性
染色体特異的制限断片長多形による４０６塩基対生成物
を生成させる。この方法は、Ｘ及びＹ染色体の両者が存
在する場合に性染色体平衡異常（ｉｍｂａｌａｎｃｅ）
を示す。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】性同定の既知の方法を
用いることにより、不明瞭で不正確な結果の機会が常に
存在する。本発明により解決しようとする課題は、現在
使用されているものよりも正確な性同定法を提供するこ
とである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の性決定法は、ヒ
トＸ及びＹ染色体の領域に対して特異的なプライマーに
よるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる。次に、
特異的多形制限部位を用いて雌性試料から雄性試料を区
別する。１つの態様においては、本発明はヒト由来のＤ
ＮＡ試料に基くヒトの性の決定方法に関し、この方法
は、（ａ）試料から生成物を、プライマーＲＲ１０：（CTGGAGAGCCACAAGCTGAC）（配列番号：１）、及びプライマーＲＲ１２：（TTGCTGTGGACTGCCAAGAG）（配列番号：２）によるＰＣＲを用いて増幅し；（ｂ）前記生成物をＨａｅIII 制限酵素を用いて消化
し；そして（ｃ）前記消化された生成物を可視化する；段階を含んで成る。約２０９ｂｐの生成物が増幅段階か
ら生ずる。次に、ＨａｅIII 消化により、試料が雌性か
らのものであれば約１７２ｂｐ及び３７ｂｐの断片が生
じ、そして試料が雄性からのものであれば約１７２ｂ
ｐ、約３７ｂｐ、約８８ｂｐ及び約８４ｂｐの断片が生
ずる。８８ｂｐ及び８４ｂｐの断片は、ゲル上で可視化
されれば、単一バンド又は二重バンドとして現われる。

【０００９】他の態様において、本発明の性決定方法
は、（ａ）ヒトＤＮＡ試料中の次のヌクレオチド配列： CTGGAGAGCC ACAAGCTGAC CAGCAAGGCA GAGAAGGCCA TTGAATGTGA TGAGTGTGGG AAGCATTTTT CTCATGCAGG GGCTTTGTTT ACTCACAAAA TGGTGCATAA GGAAAAAGGG GCCAACAAAA TGCACAAGTG TAAATTCTGT GAATATGAGA CAGCTGAACA GGGGTTATTG AATCGCCACC TCTTGGCAGT CCACAGCAA （配列番号：３）を有する２０９ｂｐ生成物を増幅し；（ｂ）前記生成物をＨａｅIII 制限酵素で消化し；そし
て前記消化された生成物を可視化する；段階を含んで成
る。この方法は、ＰＣＲに加えて他の増幅方法の使用を
期待している。この様な他の増幅方法の例にはリガーゼ
連鎖反応（ＬＣＲ）及びポリメラーゼ・リガーゼ連鎖反
応（ＰＬＣＲ）が含まれる。

【００１０】さらなる態様において、本発明は性決定の
ための逆ドットブロット方式において使用される。この
方式においては、増幅され標識された生成物の異る領域
への固定化されたプローブが試料中の雄性及び雌性ＤＮ
Ａの存在又は不存在を示し、又は混合された試料中の雄
性及び雌性ＤＮＡの相対比率を示す。

【００１１】

【具体的な説明】本発明の種々の対象、利点及び新規な
性質が次の詳細な説明から一層容易に明らかになるであ
ろう。本発明は、ヒトからのＤＮＡを含む生物学的試料
に基く、ヒトの性の決定方法に関する。本発明の理解を
促進するため、幾つかの用語を下に定義する。

【００１２】「遺伝子」なる用語は、回収可能な生物活
性ポリペプチド又は前駆体の生産のために必要な制限配
列及びコード配列を含むＤＮＡ配列を意味する。このポ
リペプチドは全長コード配列によりコードされてもよ
く、又はその生物活性（例えばその酵素活性）が保持さ
れる限りコード配列の任意の部分によりコードされてい
てもよい。

【００１３】用語「オリゴヌクレオチド」なる語は、こ
こで用いられる場合、２以上の、好ましくは３より多く
の、そして通常は１０より多くのデオキシリボヌクレオ
チド又はリボヌクレオチドから構成される分子として定
義される。正確なサイズは多くの因子に依存し、これは
今度はオリゴヌクレオチドの最終機能又は用途に依存す
る。オリゴヌクレオチドは合成されてもよく、又はクロ
ーニングによってもよい。

【００１４】「プライマー」なる用語は、ここで使用さ
れる場合、プライマー伸長が開始される条件下に置かれ
た際に合成の開始点として機能することができるオリゴ
ヌクレオチドを意味する。核酸鎖に対して相補的である
プライマー伸長生成物の合成は、増幅反応のために必要
な試薬、すなわち４種類の異るヌクレオチドトリホスフ
ェート及び熱安定性ポリメラーゼ酵素の存在下で、適当
な緩衝液中適当な温度において開始される。「緩衝液」
は補助因子（例えば二価金属イオン）及び塩（適当なイ
オン強度を与えるため）を含み、所望のpHに調整されて
いる。

【００１５】プライマーは、増幅の最大効率のためには
単本鎖であるが、それに代って二本鎖であってもよい。
二本鎖の場合、プライマーは伸長生成物の調製のために
使用される前に、その鎖を分離するためにまず処理され
る。プライマーは通常、オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドである。プライマーは、ポリメラーゼ酵素の存在下で
の伸長生成物の合成を開始する（ｐｒｉｍｅ）ために十
分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは
多くの因子、例えばプライマー源及び望まれる結果に依
存するであろう。また反応時間はプライマーのヌクレオ
チド配列に依存して、鋳型へのプライマーの適切なアニ
ーリングを保証するように調整されなければならない。
標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプラ
イマーは典型的には１５〜３５ヌクレオチドを含有す
る。短いプライマー分子は一般に、鋳型との十分に安定
な複合体を形成するために、より低い温度を要求する。

【００１６】プライマーは、鋳型の特定の配列の鎖に対
して「実質的に」相補的であるように選択される。プラ
イマーは、プライマー伸長が起こるために鋳型とハイブ
リダイズするのに十分に相補的でなければならない。プ
ライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要はな
い。例えば、非相補的核酸断片がプライマーの５′−末
端に取り付けられていて、プライマー配列の残りが鎖に
対して実質的に相補的であってもよい。プライマー配列
がハイブリダイズするのに十分に鋳型の配列に対する相
補性を有しそしてそれによってプライマーの伸長生成物
の合成のための鋳型プライマー複合体を形成する限り、
非相補的塩基又はより長い配列がプライマー中に散在し
ていてもよい。

【００１７】「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵
素」なる用語は、特定のヌクレオチド配列において又は
その近傍において二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素を意
味する。さらに、本発明は、好ましくは標識された形で
の前記プライマーＲＲ１０及びＲＲ１２それ自体、該プ
ライマーの診断的道具としての使用、並びに該オリゴヌ
クレオチド及び好ましくは増幅反応のために必要な試薬
を含んで成るキットに関する。

【００１８】前記のごとく、ヒトの生物学的試料の性決
定は法医学的調査において非常に重要である。本発明
は、既知の方法を超える多くの利点を有するこの様な性
決定方法に関する。本発明の利点は、Ｘ及びＹ染色体に
共通なＨａｅIII 部位並びにＹ染色体中にのみ存在する
ＨａｅIII 部位を用いての、ヒトＸ及びＹ亜鉛フィンガ
ー蛋白質の保存された領域の同定に由来する。この保存
された領域は比較的小さい領域（約２０９ｂｐ）であ
る。後で非常に詳細に説明するように、ＨａｅIII 制限
部位の存在はこの方法における非常に重要な因子であ
り、そしてそれ故に、この保存された領域を、ＨａｅII
I が存在する限り縮小又は拡大することができ、そして
ＨａｅIII 消化から生ずる断片は識別可能である。

【００１９】２０９ｂｐの保存された領域がＨａｅIII
制限酵素により消化される場合、これはＸ染色体からの
３７ｂｐ（ヌクレオチド１−３７）及び１７２ｂｐ（ヌ
クレオチド３８−２０９）の識別可能な断片をもたらす
であろう。保存された領域が雌性（ＸＸ）からであれ
ば、これら２つの断片のみが観察されるであろう。しか
しながら、保存された領域が雄性（ＸＹ）からのもので
あれば、ＨａｅIII 消化は１７２ｂｐ、３７ｂｐ、８８
ｂｐ及び８４ｂｐの識別可能な断片をもたらすであろ
う。

【００２０】Ｘ染色体は前記２０９ｂｐ上に単一のＨａ
ｅIII 制限部位を有し、従って前記保存された領域を１
７２ｂｐ及び３７ｂｐの断片に開裂させる。しかしなが
ら、Ｙ染色体は前記１７２ｂｐ断片中に追加のＨａｅII
I 制限部位を有し、従ってこの断片をさらに８８ｂｐ断
片及び８４ｂｐ断片に開裂させる。従って、本発明にお
ける雄性及び雌性生物学的試料の区別のための基礎は、
Ｙ染色体の保存された領域における追加のＨａｅIII 部
位である。

【００２１】本発明のために予想される最も一般的な用
途は法医学分析においてであり、この場合しばしば分析
されるべき試料は非常に少量である。従って、ＨａｅII
I 消化後に識別可能な断片を得るために十分な生成物
（保存された領域）を形成するために、増幅段階がしば
しば必要である。ヒトの生物学的試料のための適当な増
幅技法にはＰＣＲ，ＬＣＲ及びＰＬＣＲが含まれ、ＰＣ
Ｒが好ましい技法である。ＰＣＲは米国特許No. ４，６
８３，１９５及びNo. ４，６８３，２０２（両者を引用
により本明細書に組み入れる）に記載されている周知の
増幅技法である。要約すれば、ＰＣＲ増幅法は、次の段
階を含んで成る。

【００２２】（ａ）試料中の各核酸鎖を４種類の異るヌ
クレオシドトリホスフェート及び増幅されるべき各特定
の配列（この場合、２０７ｂｐの保存された領域）のた
めの２つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触せし
め、ここで各プライマーは、該特定の配列の異る鎖に実
質的に相補的であって、１つのプライマーから合成され
た伸長生成物がその相補体から分離されたときの他方の
プライマーの伸長生成物の合成のためのプライマーとし
て機能することができるように選択され、前記接触は相
補的核酸鎖への各プライマーのハイブリダイゼーション
を許容する温度において行われ；（ｂ）各核酸鎖を、段階（ａ）と同時に又はその後で、
特定の核酸配列の各鎖に相補的なプライマー伸長生成物
を形成するためにヌクレオシドトリホスフェートの結合
を可能にする熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと接触せし
め；（ｃ）段階（ｂ）からの混合物を、前記酵素の活性を促
進しそして増幅されるべき各異る鉛について、各核酸鎖
鋳型に相補的である各プライマーの伸長生成物を合成す
るが、しかし相補的鎖鋳型から各伸長生成物を分離する
ほどには高くない効果的な温度に保持し；（ｄ）段階（ｃ）からの混合物を、プライマー伸長生成
物をそれらがその上で合成された鋳型から分離して単鎖
分子を生成せしめるがしかし前記酵素を不可逆的に変性
させるほどには高くない有効温度において且つその様に
有効な時間にわたって加熱し；（ｅ）段階（ｄ）において生成した単離分子の各々への
プライマーのハイブリダイゼーションを促進するのに効
果的な時間及び効果的な温度において段階（ｄ）からの
混合物を冷却し；そして（ｆ）前記酵素の活性を促進しそして増幅されるべき各
異る配列について段階（ｄ）において生成した各核酸鋳
型に相補的である各プライマーの延長生成物を合成する
がしかし該相補鎖鋳型から各延長生成物を分離する程に
は高くない有効温度において段階（ｅ）からの混合物を
保持する。段階（ｅ）及び（ｆ）における有効時間及び
有効温度は、段階（ｅ）及び（ｆ）が同時に行う得るよ
うに一致していてもよい。段階（ｅ）及び（ｆ）は、所
望のレベルの増幅が得られるまで反復される。

【００２３】本発明において、ＰＣＲ法において使用さ
れる２つのプライマーは、である。

【００２４】ＲＲ１０及びＲＲ１２のごときオリゴヌク
レオチドプライマーは、例えばホスホトリエステル法又
はホスホジエステル法、あるいはこれらの自動化された
態様のごとき任意の適当な手段を用いて製造することが
できる。この様な１つの自動化された態様においては、
ジエチルホスホラミダイトが出発材料として使用され、
そしてこれはＢｅａｕｃａｙｅら、１９８１、Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ２２：１８５９−１
８６２により記載されているようにして合成することが
できる。修飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチド
を合成するための１つの方法は、米国特許No. ４，４５
８，０６６に記載されており、これを引用により本明細
書に組み入れる。また、生物学的起源から単離されたプ
ライマー（例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化物）か
ら単離されたプライマーを使用することもできる。

【００２５】ＰＣＲ法のために十分な試料が存在すれ
ば、プライマーＲＲ１０（配列番号：１）及びプライマ
ーＲＲ１２（配列番号：２）を用いるＰＣＲ増幅のヒト
生物学的試料への適用が、２０９ｂｐ生成物（配列番
号：３）をもたらす。現在、雄性の明瞭な確認を得るた
めには少なくとも０．５ngのＤＮＡを有することが好ま
しく、そして雌性の明瞭な確認を得るためには１〜２ng
のＤＮＡを有することが好ましい。ＤＮＡ試料のこの少
ない量は、幾つかの周知の性同定技法、例えばＡｋａｎ
ｅ，Ａ．らによりＦｅｖｅｎｓｉｃＳｃｉｅｎｃｅ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ４９，８１（１９９１）
において教示された性同定技法のために必要な２５０ng
を超えるＤＮＡ試料の要求と好都合に対比される。さら
に、小形の２０９ｂｐの生成物は非常に分解した法医学
試料によってさらに影響を受けないことが見出された
が、他方より長い生成物は分解した試料における損傷に
対してより感受性であろう。

【００２６】前記のごとく、ＬＣＲ及びＰＬＣＲのごと
き他の増幅法を本発明において使用することもできる。
要約すれば、リガーゼ連鎖反応は、隣接する複数のプラ
イマー、及び該プライマーがＤＮＡの相補鎖にハイブリ
ダイズした後に該プライマーを連結するための熱安定性
リガーゼを用いる（Ｌａｎｄｅｙｒｅｎ．Ｕ．ら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２４１，１０７７（１９８８）及びＢａｒ
ａｎｙ，Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，１８９（１９９１）を参照のこ
と。これらを引用により本明細書に組み入れる）。オリ
ゴヌクレオチド生成物は、第一のセット及び標的に相補
的な第二のセットの隣接するオリゴヌクレオチドの存在
下での連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応の熱循環により、
指数的に増幅される。好ましくは、適切なハイブリダイ
ゼーションのためにオリゴヌクレオチドは約２０〜２５
ヌクレオチドであるべきである。さらに、２つのオリゴ
ヌクレオチドの溶融温度又はその近傍で反応を行うこと
により連結の特異性が増強される。１サイクルの連結生
成物が連結の次のサイクルのための標的となるので、生
成物の指数的増幅が起こる。Ｂａｒａｎｇ，Ｆ．により
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
８８，１８９（１９９１）により教示されるように、適
当な熱安定性リガーゼはテルムス・アクアチクス（Ｔｈ
ｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＨＢ８株ＤＮＡのプ
ラスミドライブラリー（アメリカン・タイプ・カルチュ
アー・コレクションからＡＴＣＣ２７６３４として入手
できる）から単離することができる。連結用のオリゴヌ
クレオチドは前記のＰＣＲにおいて使用されるプライマ
ーと同様にして調製することができる。ＬＣＲの各サイ
クルは、標的ＤＮＡ試料及びＴ．アクアチクスのリガー
ゼの存在下での約９４℃にて約１分間、及びそれに続く
６５℃にて約４分間のオリゴヌクレオチドのインキュベ
ーションを含んで成る。一般に、２０〜３０サイクルが
本発明を用いる性決定のための十分な量のＤＮＡを生成
する。

【００２７】その名が示すように、ポリメラーゼ・リガ
ーゼ連鎖反応（ＰＬＣＲ）はＰＣＲの特徴とリガーゼ連
鎖反応（ＬＣＲ）の特徴を併せ持つ。ＰＬＣＲは一部対
応遺伝子特異的ＰＣＲの特異性を増加させるため技法と
して開発されたものであり、この方法においては、用い
られる低濃度のｄＮＴＰ（〜５μＭ）が増幅の程度を制
限した。ＰＬＣＲにおいては、ＤＮＡが変性され、隣接
しているのではなく相補的な４種類のオリゴヌクレオチ
ドプライマーがｄＮＴＰ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
及び熱安定性リガーゼと共に添加される。

【００２８】プライマーが標的ＤＮＡに非隣接的にアニ
ールし、そして熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが下流プラ
イマーの３′−末端への適切なｄＮＴＰの付加を生じさ
せ、非−隣接プライマー間のギャップを満たし、そして
プライマーを隣接させる。次に、熱安定性リガーゼが２
つの隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを連結す
る。

【００２９】任意の適当な技法を用いての増幅段階の
後、増幅された生成物（保存された領域）を単離し、そ
してＨａｅIII 消化にかける。ＨａｅIII 制限エンドヌ
クレアーゼはＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ
及び他の供給者から得ることができる。一般に、約１０
Ｕ／μｌの０．５μｌのＨａｅIII 酵素を用いて約５μ
ｌ〜約１０μｌのＰＣＲ生成物を消化する。消化は一般
に約３７℃にて２時間〜一夜行われる。ＨａｅIII 緩衝
液（やはり、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ
〔ＮＥＢ〕，ＢｅｒｅｒｌｙＭＡ，米国から入手可能
である）がしばしば消化段階において使用される。

【００３０】生成物の消化の後、消化プロフィールを決
定するために断片を可視化しなければならない。ゲル電
気泳動、等電点沈澱、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）、及びプライマーが蛍光標識により標識されて
いる場合には遺伝子スキャンナーを含めて、多くの技法
が利用可能である。ＨａｅIII 消化断片を可視化するた
めの好ましい方法は、アガロースゲル（好ましくは、３
％ＮｕＳｉｅｖｅ／１％アガロースゲル）又は９％アク
リルアミドゲルを用いてのゲル電気泳動による。９％ア
クリルアミドゲルの使用が最も好ましい方法である。Ｈ
ａｅIII 消化された生成物を約２μｌの試料染料負荷緩
衝液と混合し、そして次にこの混合物をゲルに負荷す
る。ゲルを１ＸＴＢＥ（０．０８９ＭＴｒｉｓ／硼
酸、２mMＥＤＴＡ）中で泳動させ、そして完全な生成物
の消化を示すために少なくとも１つの未消化の試料も泳
動させるべきである。

【００３１】図１に示すように、ＲＲ１０／ＲＲ１２増
幅生成物のゲル上での可視化が１７２ｂｐ及び３７ｂｐ
のバンドをもたらす。しかしながら、雄性由来の試料は
８８ｂｐ及び８４ｂｐに追加のバンドを有するであろ
う。これらのＹ−特異的消化生成物は、３％ＮｕＳｉｅ
ｖｅ／１％アガロースゲル上で単一バンドとして現わ
れ、そして９％アクリルアミドゲル上で二重バンド（ｄ
ｏｕｂｌｅｔ）として現われる。図１はアクリルアミド
ゲルを示し、そしてそれ故に雄性サンプルは８８／８４
ｂｐ二重バンドを示す。

【００３２】本発明は、２以上の個体からの混合試料の
ための非常に鋭敏な測定法である。特に、本発明は、雌
性ＤＮＡの量１０に対して雄性ＤＮＡが１の量で存在す
る混合物中の雄性ＤＮＡの検出を可能にする。しかしな
がら、予想されるように、雄性はＸ染色体も含有するの
で、同じ程度（すなわち１：１０）で雄性ＤＮＡ試料を
含有する雌性ＤＮＡは識別することができない。具体的
には、雌性ＤＮＡに対して５倍以上過剰の雄性ＤＮＡが
存在すれば、混合試料は非混合雄性ＤＮＡ試料と本質的
に同じようである。

【００３３】雌性及び雄性ＤＮＡの質量混合物は、８８
／８４ｂｐ二重バンドとそのもとになった１７２ｂｐ断
片の相対強度を注目することにより、雄性ＤＮＡ試料か
ら視覚的に識別され得る。未混合の雄性ＤＮＡ試料にお
いては、同数のＸ及びＹ染色体が存在し、従って１７２
ｂｐ断片強度と８８／８４ｂｐ二重バンドの強度とは匹
敵するはずである。同等の雌性及び雄性ＤＮＡを含有す
る混合物においては、１つのＹ染色体に対して３つのＸ
染色体が存在し、そしてそれ故に１７２ｂｐバンドは二
重バンドに比べて顕しく暗いであろう。これらの相違
は、蛍光標識されたプライマー、及び適当なスキャンナ
ー、例えばＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒを用いることによ
り、あるいは単にゲルの写真の陰性結果をスキャンニン
グすることにより定量化することができる。

【００３４】性を決定するために、増幅生成物を可視化
するための他の技法は逆ドットブロット分析である。こ
れは周囲の技法であり、この技法においては標識及び標
示体が増幅生成物に結合される。プローブ及び生成物が
相補的である場合、プローブと生成物はハイブリダイズ
し、そして所望の生成物の存在が生成物上の標示体及び
標識の活性化により示される。逆ロットブロット技法の
具体例はさらに詳細にＳａｉｋｉＲ．ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ８６，６２
３０−６２３４（１９８６）に説明されており、これを
引用により本明細書に組み入れる。

【００３５】一般に、プローブは、ターミナルトランス
フェラーゼを用いて又はプローブの化学合成の間に付加
されたポリ（ｄＴ）テイルにより、ナイロン膜のごとき
固体支持体上に固定化される。また、増幅された生成物
は一般にビオチン化され、そしてそれ故にアビジン−西
洋ワサビパーオキシダーゼ接合体と結合するであろう。
次に、西洋ワサビパーオキシダーゼが無色の色素を着色
沈澱物に変換し、試料中の目的生成物の存在を示す。

【００３６】本発明の好ましい態様においては、２０９
ｂｐのビオチン化増幅生成物をＰＣＲ法により生成せし
めるために、ビオチン化されたプライマーＲＲ１０及び
ＲＲ１２が使用される。次に、その生成物が３種類の固
定化されたプローブ、すなわち、（１）配列番号：３の
ヌクレオチド３０〜４８により示される生成物の領域に
対して相補的なヌクレオチド配列ＡＧＡＧＡＡＧＧＣＣ
ＡＴＴＧＡＡＴＧＴ（配列番号：４）を含んで成るＣプ
ローブ（Ｘ及びＹ染色体の両者に共通）、（２）配列番
号：３のヌクレオチド１１２−１３１（ここで、ヌクレ
オチド１２０はＡ残基であり、従ってＨａｅIII 部位の
欠失を示す）により示される生成物の領域に対して相補
的なヌクレオチド配列ＧＡＡＡＡＡＧＧＡＧＣＣＡＡＣ
ＡＡＡＡＴ（配列番号：５）を含んで成るＸプローブ、
及び（３）配列番号：３のヌクレオチド１１２−１３１
（ここで、１２０がＣ残基であり、従ってＨａｅIII 部
位の存在を示す）により示される生成物の領域に対して
相補的なヌクレオチド配列ＡＴＴＴＴＧＴＴＧＧＣＣＣ
ＣＴＴＴＴＴＣ（配列番号：６）を含んで成るＹプロー
ブに暴露される。配列番号：５で示されるＸプローブ及
び配列番号：６で示されるＹプローブは生成物の反対の
鎖にハイブリダイズする。

【００３７】次に、プローブをアビジン−西洋ワサビパ
ーオキシダーゼ及び無色の色素に暴露する。いずれかの
生成物が３つのプローブのいずれかにハイブリダイズし
ておれば、それらのプローブは、無色の色素の着色沈澱
への変換によって可視化される。図２に示すように、各
プローブ部位における沈澱の程度が観察者をして試料を
識別することを可能にする。すなわち、（１）雌性ＤＮＡのみが存在する；（２）雄性ＤＮＡのみが存在する；（３）雄性及び雌性ＤＮＡがおよそ質量で存在する；（４）雄性ＤＮＡに比べて雌性ＤＮＡが多く存在する；
及び（５）雌性ＤＮＡに比べて雄性ＤＮＡが多く存在する。

【００３８】本発明の性同定系は他の系に比べて多くの
利点を有する。第一に、生成物がＸ及びＹ両染色体から
作られる。幾つかの他の系はＹ特異的配列のみを使用
し、その結果Ｙ生成物の不存在は雌性ＤＮＡの存在以外
のなにかによることがあり得る。例えば、ＰＣＲ阻害物
が存在し、そのために偽の雌性同定をもたらすことであ
ろう。

【００３９】第二に、本発明においてはＸ及びＹ生成物
の両者を生成せしめるために同じプライマーが使用さ
れ、そしてそれらの増幅生成物は同じサイズである。他
の系は、異る増幅効率を有するであろう複数のプライマ
ー対を用い、あるいは異る長さの生成物を生成する一対
のプライマーを用い、小さい方の生成物の優先的増幅を
もたらすであろう。これらのタイプの系は不明瞭な結果
をもたらすであろう。

【００４０】第三に、本発明の標的配列（２０９ｂｐの
保存された領域）は各染色体上に単一コピーとして存在
し、Ｘ及びＹ配列の相対量を定量化することができる。
他の幾つかの系はシグナルを増強するためにＸ−及びＹ
−特異的反復配列内のプライマーを使用するが、反復配
列の数が可変的であり、そして定量化が不可能である。

【００４１】本発明の幾つかの態様における小さい欠点
は、性を決定するために増幅の後に制限消化段階が必要
であるが他の幾つかの系は増幅後ゲル上で直接にタイプ
分けできることである。しかしながらこの欠点は、本発
明を逆ブロット方式で使用することにより克服される。
従って、本発明を、既存のタイプ分けストリップ、例え
ばＲｏｃｈｅＡｍｐｒｉｔｙｐｅ^TMＨＬＡＤＱα Ｆ
ｏｒｅｎｓｉｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄＴｙｐｉｎｇＫｉｔ中に存在するそれに加
え、次に直接タイプ分けが行われる。

【００４２】本発明において使用されるプライマー対
（ＲＲ１０及びＲＲ１２）はＤＱα条件下で働き、そし
て単にプライマーをビオチン化しそしてそれらをＲｏｃ
ｈｅＡｍｐｌｉｔｙｐｅ^TMＤＱαプレミックスに添加す
ることにより、ＤＱαと同時増幅され得る。要約すれ
ば、上に詳細に説明したように、（又は対照ドットは、
Ｘ及びＹ染色体に共通のＨａｅIII 部位を含有する領域
又は配列番号：３上の任意の他の非−多形性領域に対す
るプローブを有するであろう。Ｘドット及びＹドットは
多形性ＨａｅIII 部位領域に対して相補的なプローブを
有するであろう。

【００４３】雌性ＤＮＡ試料から生じたＰＣＲ生成物は
Ｃドット及びＸドットとのみハイブリダイズし、そして
同じ強度のドットをもたらすであろう。これに対して、
雄性試料から生じたＰＣＲ生成物はＣドット、Ｘドット
及びＹドットにハイブリダイズするであろう。Ｘドット
及びＹドットは同じ強度であり、そしてＣドットは同じ
条件下で半分暗いであろう。

【００４４】これらの相対強度が達成され得るから、ド
ットパターンのこれらのタイプを提供する混合試料を未
混合試料から区別することが可能である。さらに、雌性
及び雄性ＤＮＡの質量を含有する混合物（Ｘ：Ｙが３：
１であるから）を他の混合物から区別することができ
る。ＤＱα Ａｍｐｌｉｔｙｐｅ^TM系において本発明を
用いる追加の利点は、混合されたケースワーク試料をよ
り大きな信頼性をもって識別することができることであ
る。さらに詳しくは、同じＤＱαタイプが内皮細胞（雌
性）画分及び性的暴行の証拠から単離された粒子画分の
両者に現われる幾つかの例が存在する。しかしながら、
本発明の使用者は、内皮細胞画分のタイプ分けに使用さ
れたのと同じストリップ上にＹ染色体ドットが現われれ
ば、雄性ＤＮＡが両画分に存在するという主張を合法的
に行うことができる。さらに、犠牲者及び攻撃者がＤＱ
αタイプを共有する場合、Ｙ染色体ドットが存在すれ
ば、精子画分中のタイプを攻撃者に帰属させることがで
きる。

【００４５】

【実施例】次の実施例は例示のみのために提供され、そ
して本発明の範囲を限定することを意図するものではな
い。特にことわらない限り、固体混合物中の固体、液体
中の液体、及び液体中の固体について与えられる％は、
それぞれ重量／重量、容量／容量、及び重量／容量基準
による。さらに、特にことわらない限り、記載される試
薬及び装置の供給者は強制的であることを意味しない。
当業者は、類似の試薬及び装置を他の供給者から選択す
ることができる。

【００４６】実施例１．ＲＲ１０／ＲＲ１２プライマー
対によるＰＣＲを用いる性同定測定次のプロトコールは、Ｘ及びＹ染色体の特定のｚｆｘ及
びｚｆｙ領域のＰＣＲ増幅のための段階並びに生物学的
試料提供者の性の決定のために使用された制限酵素診断
測定を記載する。すべての一般的及びＰＣＲ−特異的試
料取扱法が用いられる。

【００４７】Ｉ．ＰＣＲ増幅各５０mlの増幅反応混合物は次のものを含んだ。５μｌ１０Ｘ反応混合物０．５μｌ１０μＭＲＲ１０（配列番号：１）０．５μｌ１０μＭＲＲ１２（配列番号：２）これらをプレミックスし、そして６μｌを各チューブに
加える。

【００４８】４４μｌＤＮＡ試料＋水（１５μｌ以下
のＣｈｅｌｅｘ抽出されたＤＮＡ）必要とされる１０Ｘ
反応混合物の体積が決定された（例えば、２０反応／１
０μｌ１０Ｘ反応混合物）。各測定のための新鮮な混合
物を、１００μｌ１０Ｘ反応混合物について次の処方に
従って調製した（成分の比率を維示しながら全体積を増
加又は減少させることができる）：μｌ２５蒸留水２５２ＭＫＣｌ２５０．１ＭＭｇＣｌ₂ １０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５）１０１８．８mM ｄＭＴＰ（それぞれ）５ＴａｑｕＤＮＡポリメラーゼ（５０／ml）１００増幅反応混合物には、ＤＮＡ試料を除くすべての成分が
提供された。２滴の鉱油を添加し、そして次に油を通し
てＤＮＡ試料を加えた。陰性対照反応（ＤＮＡを添加し
ない）も用意した。

【００４９】試料は次の様にして増幅した。３２サイクル：９４℃ １分間６０℃ １分間７２℃ １分間＋７２℃にて１０分間 II. 制限酵素消化１２μｌずつのＨａｅIII 消化反応混合物は次のものを
含有した。

【００５０】１０μｌＲＲ１０／ＲＲ１２ＰＣＲ生
成物＋水（５〜１０μｌのＰＣＲ生成物）１．２μｌ１０×ＨａｅIII 緩衝液（ＮＥＢ）０．３μｌ水０．５μｌＨａｅIII （１０Ｕ／μｌ；ＮＥＢ）上記３者をプレミックスし、そして２μｌを各反応混合
物に加えた。

【００５１】すべての成分を０．５mlチューブ中表示さ
れたＰＣＲ生成分領域に入れた。次に、消化反応混合物
を３７℃にて一夜インキュベートした。 III.ゲル上での可視化チューブを短時間回転させて液を集め、そして次に２μ
ｌの試料色素負荷緩衝液を加えた。完全な反応混合物を
９％アクリルアミドゲル上に負荷した（泳動ブロムフェ
ノールブルー（ＢＰＢ）色素原点から１０cm）。ゲルを
１×ＴＢＥ中で泳動させた。完全な生成物消化を示すた
め、１つの未切断試料をこのゲル上に含めた。

【００５２】ＲＲ１０／ＲＲ１２増幅試料はＨａｅIII
消化の後、１７２ｂｐ及び３７ｂｐのバンド並びに８８
〜８４ｂｐの二重バンドを示した。従って、この試料は
雄性からのものであると結論された。実施例２．雌性及び雄性ＤＮＡの混合物を含有する試料
の測定雌性及び雄性ＤＮＡの混合物を測定するために実施例１
の方法を用いた。雌性対雄性ＤＮＡ及び雄性対雌性ＤＮ
Ａの下記の比率を試験した。

【００５３】１：１２．５：１５：１１０：１２０：１５０：１１００：１各比率についてのＤＮＡの全量は、別々の実験において
５ng及び５０ngであった。９％アクリルアミドゲル上で
の可視化（図３及び図４を参照のこと）の後、雌性ＤＮ
Ａの量１０に対して雄性ＤＮＡ成分が１の量で存在する
点まで、８８／８４ｂｐ二重バンドの存在により雄性Ｄ
ＮＡの存在が検出され得たことが見出された。

【００５４】実施例３．雌性ＤＮＡと混合された雄性試
料の測定周知の常法を用いてＲＲ１０（配列番号：１）及びＲＲ
１２（配列番号：２）を蛍光標識する。次に、これらの
蛍光標識されたプライマーを、実施例１に記載したＰＣ
Ｒ増幅プロトコールにおいて、混合された雄性ＤＮＡ及
び雌性ＤＮＡ試料に加える。増幅された生成物の制限酵
素消化も実施例１に記載した方法に従って行う。消化さ
れた蛍光標識された生成物を遺伝子スキャンナーにより
可視化し、そして８８／８４ｂｐ二重バンドと１７２ｂ
ｐ断片の量を定量し、雄性ＤＮＡの量４に対して雌性Ｄ
ＮＡが１の量で存在することが示される。

【００５５】実施例４．逆ドットブロット性決定分析ヒトＤＮＡ試料の望ましい２０９ｂｐ保存領域を、ＲＲ
１０及びＲＲ１２プライマーがビオチン化されている点
を除き実施例１に説明したようにして増幅する。Ｉｎｎ
ｉｓ，Ｍ．Ａ．らにより「ＲＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）に記載されている方法を用
いてプライマーをビオチン化する。具体的には、１mlの
４Ｍ塩化リチウムを約０．８μｍｏｌのプライマーに加
える。混合物を短時間音波処理し、そして次に１．５ml
のエッペンドルフチューブに移し、そしてマイクロフュ
ージ中で約２分間回転させる。上清を０．４５μｍのシ
リンジフィルターを通して１２mlのシラン処理ガラスネ
ジ栓付チューブに入れる。次に、冷純アルコールとアセ
トンの１：１混合物５mlを、前記濾過された上清と混合
し、そしてフリーザー中で１時間冷却する。この混合物
を４０００ｘｇにて１０〜１５分間遠心し、そして上清
を捨てる。スルホ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエス
テルを用いて、１mlの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（pH７．６）中に溶解したＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃ
ａｌＣｏ．からの７５μｍｏｌのＬＣ−ＮＨＳ−ビオ
チンの溶液を前記ペレットに加える。混合物を撹拌して
ペレットを溶解し、そして溶液を一夜静置する。次に、
２０mlの０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡ
Ａ)(pH７．４）により前平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ^TM
Ｇ−２５カラムの頂部に反応混合物をピペット輸送する
ことにより過剰のビオチンを除去する。次に、カラムに
１．５mlの０．１ＭＴＥＡＡを適用した後に溶出液を集
める。次に、保護カートリッジ（ＡｌｌｔｅｃｈＡｓ
ｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ
ＩＬ，米国）を有するＰＲＰ−１カラム（７×３０５m
m、ＴｈｅＨａｍｉｌｔｏｎＣｏ．，ＲｅｎｏＮ
Ｖ，米国）を用い、２ml／分の流速で次の２種類の溶
剤：溶剤Ａ：５％アセトニトリルを含有する０．ＭＴＥＡ
Ａ（pH７．４）溶剤Ｂ：アセトニトリルを用いる高圧液体クロマトグラフィーにより精製する。

【００５６】ＨＰＬＣのためのグラジエントは、平衡化のために３０分間、３０分間にわたり５→１０％溶剤Ｂ、及び１０分間にわたる１０→５０％溶剤Ｂである。未修飾プライマーの後に約２５分間で大きなピ
ークとして溶出するビオチン化プライマーを検出するた
めに２６０nmにおける紫外線照射を用いる。

【００５７】Ｘ及びＹ染色体生成物を、固定化されたプ
ローブを含有するナイロン膜ストリップ上で、ＤＱαと
同じ条件下で可視化する。これらのハイブリダイゼーシ
ョン技法及び条件は当業界において良く知られており、
そしてＲｏｃｈｅＡｍｐｌｉｔｙｐｅ^TMＨＬＡＤＱα
ＦｏｒｅｎｓｉｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃｕｔｉ
ｏｎａｎｄＴｙｐｉｎｇＫｉｔの製品カタログ中
に教示されている。具体的には、増幅された生成物を、
５５℃にて約２０分間の５０〜９０rpm での振とう水浴
中でのインキュベーションによりプローブストリップに
ハイブリダイズさせる。次に、発色液をプローブストリ
ップに適用して、プローブにハイブリダイズしている生
成物可視化を生じさせる。有用な発色溶液は、プローブ
ストリップ剤、１０ml クエン酸緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウ
ム、pH５．０）１０ml ３％過酸化水素、及び０．５ml 色原体溶液、を含んで成る。

【００５８】クエン酸緩衝液は、８００mlの脱イオン水
に１８．４ｇのクエン酸三ナトリウム・二水和物を溶解
することにより調製する。約６ｇのクエン酸・一水和物
の添加によりpHを５．０に調製し、そして脱イオン水の
添加により緩衝液の最終体積を約１ｌに調整する。３０
mlの室温の１００％エタノールを６０mgの室温の３，
３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）粉
末に徐々に添加することにより、適当な色原体溶液を調
製する。次に、この混合物を３０分間回転振とう機上で
振とうすることによりＴＭＢを溶解せしめる。この溶液
を２〜８℃にて貯蔵し、そして溶解後４ケ月間安定であ
る。

【００５９】以上の記載は、当業者が本発明を実施する
のに十分であると考えられる。ここに記載した態様に加
えて、当業者は種々の変更を行うことができよう。

【００６０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）由来：ホモ・サピエンス配列 CTGGAGAGCC ACAAGCTGAC 20

【００６１】配列番号：２配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）由来：ホモ・サピエンス配列 TTGCTGTGGA CTGCCAAGAG 20

【００６２】配列番号：３配列の長さ：２０９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）由来：ホモ・サピエンス配列 CTGGAGAGCC ACAAGCTGAC CAGCAAGGCA GAGAAGGCCA TTGAATGTGA TGAGTGTGGG 60 AAGCATTTTT CTCATGCAGG GGCTTTGTTT ACTCACAAAA TGGTGCATAA GGAAAAAGGG 120 GCCAACAAAA TGCACAAGTG TAAATTCTGT GAATATGAGA CAGCTGAACA GGGGTTATTG 180 AATCGCCACC TCTTGGCAGT CCACAGCAA 209

【００６３】配列番号：４配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）由来：ホモ・サピエンス配列 AGAGAAGGCC ATTGAATGT 19

【００６４】配列番号：５配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）由来：ホモ・サピエンス配列 GAAAAAGGAG CCAACAAAAT 20 配列番号：６配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）由来：ホモ・サピエンス配列 ATTTTGTTGG CCCCTTTTTC 20

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＺＦＸ／ＺＦＹ生成物のＨａｅIII 消化
のアクリルアミドゲルの写真であり、電気泳動の結果を
示す図面に代る写真である。

【図２】図２は種々の混合されたＤＮＡ試料並びに混合
されていない雄性及び雌性ＤＮＡ試料の逆ドットブロッ
ト図である。

【図３】図３は雄性及び雌性ＤＮＡの混合された試料の
ＨａｅIII 消化のアクリルアミドゲルの写真であり、電
気泳動の結果を示す図面に代る写真である。

【図４】図４は雄性及び雌性ＤＮＡの混合された試料の
ＨａｅIII 消化のアクリルアミドゲルの写真であり、電
気泳動の結果を示す図面に代る写真である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト由来のＤＮＡ試料に基いてヒトの性
を決定する方法であって、（ａ）試料から生成物を次のプライマー： CTGGAGAGCCACAAGCTGAC （配列番号：１）；及び TTGCTGTGGACTGCCAAGAG （配列番号：２）；によるポリメラーゼ連鎖反応法を用いて増幅し；（ｂ）前記生成物をＨａｅIII 制限酵素により消化し；
そして（ｃ）前記消化された生成物を可視化する；段階を含んで成る方法。
【請求項２】前記増幅された生成物が約２０９塩基対
の生成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記増幅された生成物が次のヌクレオチ
ド配列： CTGGAGAGCC ACAAGCTGAC CAGCAAGGCA GAGAAGGCCA TTGAATGTGA TGAGTGTGGG AAGCATTTTT CTCATGCAGG GGCTTTGTTT ACTCACAAAA TGGTGCATAA GGAAAAAGGG GCCAACAAAA TGCACAAGTG TAAATTCTGT GAATATGAGA CAGCTGAACA GGGGTTATTG AATCGCCACC TCTTGGCAGT CCACAGCAA （配列番号：３）を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記可視化をアクリルアミドゲル上で行
う、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記ゲルが約８８塩基対及び８４塩基対
の二重バンドを示し、これによって雄性ＤＮＡの存在を
示す、請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記可視化をアガロースゲル上で行う、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記ゲルが約８８〜８４塩基対の単一バ
ンドを示し、これにより雄性ＤＮＡの存在を示す、請求
項６に記載の方法。
【請求項８】ヒト由来のＤＮＡ試料に基いてヒトの性
を決定する方法であって、（ａ）配列番号：３により示される２０９塩基対の生成
物を試料から増幅し；（ｂ）前記生成物をＨａｅIII 制限酵素により消化し；
そして（ｃ）前記消化された生成物を可視化する；段階を含ん
で成る方法。
【請求項９】前記増幅段階をリガーゼ連鎖反応法を用
いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記増幅段階をポリメラーゼリガーゼ
連鎖反応法を用いて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】前記可視化をアクリルアミドゲル上で
行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】前記可視化をアガロースゲル上で行
う、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】前記ゲルが約８８〜８４塩基対の単一
バンドを示し、これによって雄性ＤＮＡの存在を示す、
請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】ヒトＤＮＡ試料の性を決定する方法で
あって、（ａ）配列番号：１及び配列番号：２で示される標識さ
れたプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応法を用いて
試料から生成物を増幅し；（ｂ）前記増幅された生成物を３種類のプローブに暴露
し、ここで１つのプローブは雌性試料及び雄性試料に共
通な生成物の領域に対して相補的であり、他の１つのプ
ローブはＸ染色体上のみに見出される生成物の領域に対
して相補的であり、そして他の１つのプローブはＹ染色
体上のみに見出される生成物の領域に対して相補的であ
り；そして（ｃ）前記プローブとハイブリダイズする生成物を可視
化する；段階を含んで成る方法。
【請求項１５】前記３種類のプローブがそれぞれ： AGAGAAGGCC ATTGAATGT （配列番号：４）； GAAAAAGGAG CCAACAAAAT （配列番号：５）；及び ATTTTGTTGG CCCCTTTTTC （配列番号：６）；である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】前記生成物が配列番号：３で表される
請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】前記プライマーがビオチンで標識され
ており、そして前記可視化段階がアビジン・西洋ワサビ
パーオキシダーゼ結合体、及び該西洋ワサビパーオキシ
ダーゼにより着色沈澱物に転換される無色の色素への、
ハイブリダイズした生成物の暴露を含んで成る、請求項
１４に記載の方法。
【請求項１８】配列番号：１で示されるオリゴヌクレ
オチドプライマー。
【請求項１９】配列番号：２で示されるオリゴヌクレ
オチドプライマー。
【請求項２０】プライマーが標識されている、請求項
１８又は１９項に記載のオリゴヌクレオチドプライマ
ー。
【請求項２１】前記標識がビオチンである、請求項２
０に記載のプライマー。
【請求項２２】診断の道具としての請求項１８〜２０
のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】ヒト由来のＤＮＡ試料に基いてヒトの
性を決定するための試験キットであって、請求項１８〜
２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドプライ
マーを含んで成るキット。
【請求項２４】増幅反応に必要な試薬をさらに含んで
成る、請求項２３に記載のキット。