JPH06220099A - 可溶性ｌｄｌリセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明はウイルス感染から哺乳動物を防御す
ることができる可溶性ＬＤＬリセプターに関し、このも
のはインターフェロンで処理した細胞または組換えＤＮ
Ａ法により単離される。 【構成】 ヒトＷＩＳＨ細胞をインターフェロンで処理
し、種々のクロマトグラフィー法（モノクローナル抗体
Ｃ７による親和性クロマトグラフィーを含む）により精
製することにより可溶性ＬＤＬリセプターが産生され
る。また、実質的に成熟ＬＤＬリセプターのアミノ酸残
基４から２９２に対応するアミノ酸配列を有する可溶性
ＬＤＬリセプターをコードするＤＮＡ分子よりなる発現
ベクターで形質転換される細胞株を培養することにり、
可溶性ＬＤＬリセプターを産生することができる。可溶
性ＬＤＬリセプター、そのムテイン、融合蛋白、それら
の塩、官能性誘導体および活性画分は、ウイルス感染か
ら哺乳動物を防御するための薬剤組成物の活性成分とし
て使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の技術分野】本発明は可溶性低比重リポ蛋白（Ｌ
ＤＬ）リセプター、その産生方法およびそれを含む薬剤
組成物に関する。

【０００２】

【発明の背景】インターフェロン（ＩＮＦ）は種々の細
胞に産生される融合蛋白であり、動物細胞において抗ウ
イルス状態を誘導する。インターフェロンには抗原性に
より区別される３つの大きな型（α、βおよびガンマ）
がある。ＩＮＦ−αとＩＮＦ−βはウイルスまたは核酸
により誘導される１６６または１６５個のアミノ酸残基
の関連する蛋白であり、種々の組織の細胞（免疫細胞を
含む）により産生される。ＩＮＦ−ガンマは１３０−１
４３個のアミノ酸残基の蛋白であり、マイトジェン（分
裂促進因子）により活性化されたＴ細胞や大きい顆粒性
リンパ球により産生される。ＩＦＮの産生は普通一過性
であり、誘導物質が消失するとまもなく停止する。これ
らに関する最近の総説は、テイラーとグロスバーグ（Ta
ylor S.L.and Grossberg S.E.）、Virus Research, 15,
1-26を参照。

【０００３】これらの３つの充分性状解析されたインタ
ーフェロンのほかに、部分的に性状解析されたインター
フェロン種がいくつか報告されている。１群のＩＮＦ−
α様（ＩＮＦ−αｌ）遺伝子および偽遺伝子（pseudoge
nes ）（クラスIIＩＮＦ−αまたはＩＦＮ−オメガとし
ても知られている）が発見され報告されている（レベル
（Revel, M. ）、「抗ウイルス薬剤とインターフェロ
ン：その活性の分子学的基礎」（"Antiviral Drugs and
Interferon : The Molecular Basis of their Activit
y"）、ベッカー（Y. Becker ）編、マルチヌスメイジョ
フ出版（MartinusMeijhof Publ.）、ボストン、357-434
；キャポン（Capon, D.J. ）ら、1985,Molec. Cell. B
iol., 5, 768-779 ；ハウプトマンとスワートリイ（Hau
ptmann,R. and Swertly, P. ）、1985, Nuc. Acid. Re
s., 13, 4739-4749）。これらは、約１７２個のアミノ
酸残基を有するウイルスで誘導されるインターフェロン
であり、リンパ球に産生されるヒトＩＮＦ−αの天然の
混合物中に存在する（アドルフ（Adolf, G.R. ）、199
0, Virology, 175, 410-417）。

【０００４】ヒト抹消血の単核球白血球をマイトジェン
で処理するとＩＮＦ−ガンマとＩＦＮ−δという名前の
新規ＩＦＮ−様物質（ウィルキンソンとモリス（Wilkin
sonM. and Morris, A. ）、1983, Biochem. Biophys. R
es. Comm. 111, 498-503 ）が産生された。ＩＦＮ−δ
は耐酸性であり、染色体２１のトリソミーを有するヒト
繊維芽細胞上でのみ活性がありＷＩＳＨ細胞上では活性
がなかった。これは上記の３つの既知のＩＦＮ型とは抗
原性が異なっていた。

【０００５】酸に不安定なアルファインターフェロンは
いくつかの文献に記載された。酸に不安定なアルファイ
ンターフェロンは、最近インフルエンザワクチンを受け
たヒトのリンパ球、インフルエンザウイルスでインビト
ロで刺激されたリンパ球の培養物で誘導された（ブラッ
クウィル（Blackwill, F.R. ）ら、1983, J. Exp. Me
d., 157, 1059-1063）。このタイプのＩＦＮは抗ＩＮＦ
−α血清で中和され、マンディンダーバー（Mandin Dar
by）ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞上で活性であった。この
ような酸に不安定なアルファ型のＩＦＮが全身性ループ
スエリトマドーデス患者の血清中に存在することが報告
された（クリペル（Klippel, J.H. ）ら、1985, Annals
Rhem. Disease, 44, 104-108 ）。酸に不安定なＩＮＦ
−αは、ヒトの抹消血リンパ球のセンダイウイルス誘導
によりＩＮＦ−αと同様に産生された（マツオカ（Mats
uoka, H ）ら、1985, J. Gen. Virol., 66, 2491-2494
）。酸に不安定なＩＮＦ−αは抹消血単核細胞の培養
により自発的に産生された（フィッシャーとルービンシ
ュタイン（Fischer, D.G. and Rubinsein, M. ）、198
3, Cellular Immunology, 81, 426-434）。

【０００６】ＩＦＮ−イプシロンと呼ばれる別のタイプ
のインターフェロンが、ウイルスに接触した上皮細胞か
ら産生された。これはＩＦＮ−βと一緒に産生された
が、上皮細胞上で活性があり、他の細胞では活性がなか
った（ジャービスとコソウスキー（Jarvis, A.P. and K
osowsky, D.I. ）、 1984、米国特許第4,614,651
号）。

【０００７】他のサイトカインの中で、ＴＮＦ、ＩＬ−
６およびＩＬ−１は抗ウイルス活性を示すと報告された
（メスタン（Mestan, J.）ら、1986, Nature, 323, 816
-819；ウォングとゲデル（Wong, G.H.W. and Goedell,
D.） 1986, Nature, 323, 819-822 ；ビリュー（Billia
u, A. ）、 1987, Antiviral Research, 8, 55-70 ）。
ＴＮＦは免疫細胞にのみ産生され、ＩＬ−１とＴＮＦは
ＩＮＦ−βの産生を誘導することにより抗ウイルス活性
を示すことが示唆された（ビリュー（Billiau,A. ）、
前述）。

【０００８】インターフェロンで誘導される蛋白がいく
つか同定されており、そのあるものはＩＦＮの抗ウイル
ス状態の誘導に有用であることが証明されている。最も
良く研究されているのは、（２’−５’）オリゴアデニ
レートシンセターゼである。これはＡＴＰを重合させて
ｐｐｐ（Ａ２’−５’ｐ）ｎＡ（ここでｎは好ましくは
２または３であるが、１５までの長さでもよい）にする
酵素である（ケールとブラウン（Kerr, I.M. and Brow
n, R.E.）、1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 2
56-260 ）。このようなオリゴマーは潜在型のリボヌク
レアーゼ（ＲＮＡＳＥ−Ｆ）（これはリボゾームＲＮＡ
やポリゾームを分解する）を活性化して、ウイルス合成
や細胞性蛋白合成を阻害する。別のＩＦＮに誘導される
細胞外酵素は２’−５’ホスホジエステラーゼであり、
これはｔＲＮＡのＣＣＡ末端を除去して蛋白合成を阻害
する（シュミット（Schmidt, A. ）ら、1979, Proc. Na
tl.Acad. Sci. USA, 76, 4788-4792 ）。ＩＦＮに誘導
される第３の公知の細胞外酵素は７０Ｋｄ蛋白キナーゼ
であり、これは開始因子（Initiaation Factor）ｅＩＦ
−２をリン酸化することにより、ｍＲＮＡの蛋白への翻
訳の開始を阻害する（オーツキ（Ohtsuki, K. ）ら、19
80, Nature, 287, 65-67）。他のＩＦＮに誘導される細
胞外蛋白には核ＩＦＮ−応答性因子（nuclear ＩＦＮ−
Responsive Factors）（ＩＲＦ−１とＩＲＦ−２）（こ
れはＩＦＮ−応答性遺伝子を制御する）；メタロチオネ
イン（metalothionein）（これは５６Ｋｄ蛋白である
が、ＩＦＮに誘導される抗ウイルス状態での役割は不明
である）；補体別経路のＢ因子そして齧歯類のＭｘ遺伝
子生成物（これはインフルエンザに対する耐性に関係し
ている）がある（テイラーとグロスバーグ（Taylor, I.
L. and Grossberg, S.E.）の総説、1990, Virus Resear
ch, 15, 1-26）。他のＩＦＮに誘導される細胞関連ポリ
ペプチドは、ＩＦＮ処理と［35Ｓ］メチオニンパルス後
の２−Ｄゲル上で同定されたが、これらの蛋白の構造や
機能はそれ以上性状解析されなかった（ウェイル（Wei
l, J.）ら、1983, Nature, 301, 437-439）。クラスＩ
およびIIのＭＨＣ抗原、ＩｇＧ、Ｆｃリセプターおよび
細胞骨格成分などの、ＩＦＮに誘導されるいくつかの細
胞表面蛋白が同定された（レベル（Revel, M. ）の総
説、1984、「抗ウイルス薬剤とインターフェロン：その
活性の分子学的基礎」（"Antiviral Drugs and Interfe
ron : The Molecular Basis of their Activity"）、ベ
ッカー（Y. Becker）編、357-434、マルチヌスメイジョ
フ出版（Martinus Meijhof Publ.）、ボストン）。

【０００９】培地に分泌される、ＩＦＮに誘導される別
の蛋白が文献に開示されており、例えばβ２−ミクログ
ロブリン（細胞表面のクラスＩＭＨＣ抗原）（ドレイ
（Dolei, A.F. ）ら、Antiviral Res., 1, 367-373）、
プラスミノーゲンアクチベーターおよびリンホトキシン
（ＩＦＮによりリンパ球中に誘導された）がある（ジョ
ーンズ（Jones, C.M. ）ら、1982, J. IFN. Res., 2, 3
77-386；ワラックとハーン（Wallach, D. and Hahn,
T.）、1983, Cellular Immunol., 76, 390-396）。ＩＮ
Ｆ−ガンマで処理された単球はＴＮＦを放出し、これは
全体的な抗ウイルス作用を増強した（ゲラード（Gerrar
d, T. ）ら、1989, J. IFN. Res., 2, 115-124）。ＩＮ
Ｆ−ガンマに誘導される分子量３０，０００（細胞外）
の蛋白と分子量２５，０００（細胞内）の蛋白が記載さ
れた（ルスター（Luster A.D. ）ら、1988、J. Biol. C
hem. 263, 12036-12043 ）が、その役割は求められなか
った。

【００１０】ＩＦＮに誘導される多くの蛋白が開示され
ているが、可溶性ＬＤＬリセプターに関連しているもの
は１つもない。これまでのところ別の蛋白としての可溶
性ＬＤＬリセプターの存在は開示されていない。全サイ
ズの低比重リポ蛋白リセプター（ＬＤＬＲ）は、膜貫通
型の糖蛋白であり、界面活性剤の非存在下では不溶性で
ある。これは８２２個のアミノ酸残基からなり、分子量
は１６４，０００である。その知られている唯一の役割
はＬＤＬとＶＬＤＬを内部化することである。その構造
は数個のドメインよりなり、そのいくつかは他の蛋白と
同じである。Ｎ−末端リガンド結合ドメインは２９２個
のアミノ酸残基よりなり、７つのシステインに富む不完
全リピート（cysteine-rich imperfect repeats ）で配
置されている。このドメインの後には、ＥＧＦ前駆体
（４００個のアミノ酸残基）に相同性の領域、２２個の
アミノ酸残基の単一の膜貫通型のドメインおよび５０個
のアミノ酸残基の細胞質ドメインがある（シュナイダー
（Schneider, W. J.）ら、J.Biol. Chem. 257, 2664-26
73, 1982；ヤマモト（Yamamoto, T.）ら、Cell 39,27-
38, 1984）。しかしＬＤＬリセプターの抗ウイルス性に
ついては全く言及されていない。

【００１１】

【発明の要約】ヒト繊維芽細胞または上皮細胞をインタ
ーフェロンで処理すると、抗ウイルス活性を示す蛋白が
産生され、細胞培養液の上清中に蓄積することがわかっ
た。この蛋白は均一になるまで精製され、ＬＤＬリセプ
ターの可溶性細胞外領域として同定された。

【００１２】従って本発明は、可溶性ＬＤＬリセプタ
ー、そのムテインおよび融合蛋白、それらの塩、官能性
誘導体および活性画分を与える。リセプター蛋白の抗ウ
イルス活性は、例えばＷＩＳＨ羊膜細胞と投与抗原（ch
allenge ）としての水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）よ
りなる系で測定することが便利である。

【００１３】本発明はまた、蛋白性不純物に対して均一
になるまで精製されているＬＤＬリセプターの細胞外部
分（７５０個のアミノ酸残基）に対応する可溶性ＬＤＬ
リセプターを与える。

【００１４】本発明は特に、少なくとも成熟ＬＤＬリセ
プターのリガンド結合ドメインよりなる（しかしこれに
限定されない）可溶性ＬＤＬリセプター、そしてさらに
詳しくは成熟ＬＤＬリセプターの少なくとも４から約２
９２個のアミノ酸残基に対応する可溶性ＬＤＬリセプタ
ーに関する。

【００１５】本発明はまた、実質的に図１０に示すアミ
ノ酸配列よりなる可溶性ＬＤＬリセプターに関する。

【００１６】別の面で本発明は、可溶性ＬＤＬリセプタ
ーの調製法、適当な細胞のインターフェロンによる処
理、上清からの可溶性ＬＤＬリセプターの単離およびそ
の精製に関する。

【００１７】さらに本発明は、上記蛋白またはその活性
ムテインまたは融合蛋白をコードする核酸配列よりなる
組換えＤＮＡ分子、それらを含む発現ベクターおよびこ
れで形質転換される宿主細胞、そして形質転換細胞を適
当な培地中で培養することよりなる、可溶性ＬＤＬリセ
プター、その活性ムテインまたは融合蛋白を産生するた
めの方法に関する。

【００１８】可溶性ＬＤＬリセプター、そのムテイン、
融合蛋白、それらの塩、官能性誘導体および活性画分
は、ウイルス感染から哺乳動物を保護するための薬剤組
成物の活性成分として使用される。

【００１９】

【図面の説明】図１は、添加されたインターフェロンで
はない抗ウイルス活性の存在の証拠を示す。ヒト羊膜Ｗ
ＩＳＨ細胞への水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の細胞
変性作用に対する種々のインターフェロンの防御作用
は、種々の条件下で測定される。測定は９６穴のプレー
ト中で行われ、各列はＩＦＮの連続２倍希釈系列であ
る。左から最初のカラムのＩＦＮの最終濃度は２５ＩＵ
／ｍｌである。上から列１：添加されたＩＮＦ−αと２
４時間後に添加されたＶＳＶ；列２：添加されたＩＮＦ
−α、２４時間後に洗浄された細胞、添加された新鮮な
ＩＮＦ−αと添加されたＶＳＶ；列３：添加されたＩＮ
Ｆ−α、２４時間後に添加された中和性抗ＩＮＦ−α抗
体、次に添加したＶＳＶ；列４から６と７から９は最初
の３つの例と同じものであるが、それぞれＩＮＦ−αと
抗ＩＮＦ−β抗体、およびＩＮＦ−ガンマと抗ＩＮＦ−
ガンマ抗体を使用した。

【００２０】図２は、ＴＳＫ−ＤＥＡＥ陰イオン交換カ
ラムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示
す。

【００２１】図３は、ハイドロキシアパタイトバイオゲ
ルＨＴＰカラムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パタ
ーンを示す。

【００２２】図４は、スーパーホーマンス（Superforma
nce ）ＴＭＡＥ−６５−Ｓ陰イオン交換ＨＰＬＣカラム
からの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。

【００２３】図５は、フェニルセファロース疎水性相互
作用カラムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターン
を示す。

【００２４】図６は、逆相アクアポア（Aquapore）ＲＰ
−３００ＨＰＬＣカラムからの蛋白と抗ウイルス活性の
溶出パターンを示す。

【００２５】図７は、逆相ＨＰＬＣカラムによる再クロ
マトグラフィーからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パタ
ーンを示す。

【００２６】図８は、精製操作の最後の工程で得られた
種々の画分のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示す。１
３％のアクリルアミドゲルが使用され、銀で染色した。
レーンは：１−７、限外濾過で濃縮されたＲＰ−３００
クロマトグラフィー（図７）からの画分１０−１６の一
部（４００μｌ）；８、対照試料緩衝液；９、左側に示
した分子量マーカー。

【００２７】図９は、スーパーローズ（Superose）１２
サイズ排除ＨＰＬＣカラムからの抗ウイルス活性の溶出
パターンを示す。

【００２８】図１０は、微量配列解析装置（microseque
ncer）の元々のアウトプットを示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ
（図７）の画分１０−１２（各０．４ｍｌ）をプール
し、限外濾過により濃縮し、得られた試料（１μｇ）を
蛋白微量配列解析にかけた。

【００２９】図１１は、図１０に示す蛋白微量配列解析
装置により得られた配列の探索のアウトプットを示す。

【００３０】図１２は、モノクローナル抗体Ｃ７カラム
で部分的に精製した可溶性ＬＤＬリセプターの免疫親和
性クロマトグラフィーからの種々の画分の抗ウイルス活
性を示す。バーは：load−カラムにのせたもの；effl.
−溶出液（非結合画分）；el.1-4−溶出１−４である。

【００３１】図１３は、免疫親和性クロマトグラフィー
（図１２に示されている）からの種々の画分のウェスタ
ンブロット解析を示す。蛋白はニトロセルロースに電気
ブロットされ、モノクローナル抗体Ｃ７および125Ｉ−
蛋白Ａで可視化した。レーンは：１、分子量マーカー；
２、load；３、非結合；４、洗浄；５、溶出２；６、溶
出３；７、モノクローナル抗体Ｃ７である。

【００３２】図１４は、種々のインターフェロンによる
ＷＩＳＨ細胞中の細胞表面ＬＤＬリセプターの投与量応
答誘導を示す。細胞は１９ インターフェロンとインキ
ュベートされ、培地に２％胎児牛血清を含む培地、細胞
表面ＬＤＬリセプターのレベルはモノクローナル抗体Ｃ
７と 125Ｉ−蛋白Ａにより測定した。

【００３３】

【好適な実施態様の詳細な説明】インターフェロンで処
理した細胞は培地中に、インターフェロンではない抗ウ
イルス活性を有する蛋白を分泌することが明らかになっ
た。この蛋白はすべての３つの型のヒトインターフェロ
ンに対する抗体（いずれもＮＩＨ標準物質であり中和性
モノクローナル抗体である）によっては中和されない。
この蛋白はＬＤＬリセプターの細胞外リガンド結合ドメ
インよりなることが同定された。

【００３４】この可溶性ＬＤＬリセプターは、任意のイ
ンターフェロンに対して応答して抗ウイルス状態に入る
哺乳動物細胞により培地中に分泌される。例としては、
羊水から得られる繊維芽細胞または上皮細胞がある（例
えばＵ細胞、ＷＩＳＨ細胞）。

【００３５】インターフェロンと異なり、可溶性ＬＤＬ
リセプターは細胞中に抗ウイルス状態を誘導しないが、
それ自身が抗ウイルス性である。すなわち可溶性ＬＤＬ
リセプターとウイルスで同時に処理された細胞は溶解し
ないが、ウイルスのみまたはウイルスとＩＮＦ−ガンマ
で同時に処理した細胞は感染し１２時間後に溶解する。
これはＩＮＦ−ガンマで処理した細胞が抗ウイルス状態
が確立されるには約１０時間かかるため、ＩＮＦ−ガン
マはウイルスに対する防御能を直ちには与えないことを
示している。これに対して可溶性ＬＤＬリセプターは細
胞に添加された時直ちに細胞を防御する。

【００３６】サイズ排除クロマトグラフィーで試験する
と、可溶性ＬＤＬリセプターの見かけの分子量は約４
０，０００である。

【００３７】可溶性ＬＤＬリセプターの産生のために
は、培養して増殖させた適当な細胞を適当な培地中でＩ
ＦＮで処理して、３７℃で数時間インキュベートする。
こうして産生された可溶性ＬＤＬリセプターは培地中に
分泌され、上清から単離される。適当な細胞とはインタ
ーフェロンに応答して抗ウイルス状態に入ることができ
る細胞である。ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−βおよびＩＮＦ−
ガンマでも同様の結果が得られたが、ＩＮＦ−ガンマは
可溶性ＬＤＬリセプターの抗ウイルス活性測定の条件下
（可溶性ＬＤＬリセプターの添加と培養細胞へのウイル
ス抗原投与を同時に行う）では抗ウイルス活性を示さな
いため、ＩＮＦ−ガンマが好ましい。

【００３８】本発明の好適な実施態様において、ヒトＷ
ＩＳＨ細胞は、血清代替物を補足したＭＥＭ中でＩＮＦ
−ガンマとともに処理され、次に３７℃でさらにインキ
ュベートされる。１７時間後に可溶性ＬＤＬリセプター
の最も高い力価が得られた。次に可溶性ＬＤＬリセプタ
ーを含有する細胞の上清を採取し公知の方法で濃縮する
（例えば限外濾過または半固体性ポリエチレングリコー
ル２０，０００に対する透析）。次に濃縮した上清をク
ロマトグラフィー法で精製する。

【００３９】好適な実施態様において、精製された可溶
性ＬＤＬリセプターは以下の工程よりなる方法により産
生される： ａ． ＷＩＳＨ細胞をコンフルーエントになるまで培養
し、無血清培地中で３０Ｕ／ｍｌのＩＮＦ−ガンマで細
胞を誘導し、１７時間後に細胞上清を集める； ｂ． 例えば分子量カットオフが約１０，０００の膜で
限外濾過して、上記上清を約３０倍濃縮する； ｃ． 工程（ｂ）の濃縮した上清を陰イオン交換クロマ
トグラフィーにかけて抗ウイルス性因子の部分精製活性
画分を得る； ｄ． 工程（ｃ）の部分精製画分をハイドロキシアパタ
イトのクロマトグラフィーにかけて抗ウイルス性因子の
部分精製画分を得る； ｅ． 工程（ｄ）の部分精製画分を陰イオンＨＰＬＣに
かけて抗ウイルス性因子の部分精製画分を得る； ｆ． 工程（ｅ）の部分精製画分を疎水性相互作用クロ
マトグラフィーにかけて抗ウイルス性因子の部分精製画
分を得る；そして ｇ． 工程（ｆ）の部分精製画分を大体中性のｐＨで逆
相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけて部
分精製抗ウイルス性因子を得る。次にこの工程を繰り返
して均一な抗ウイルス性因子（ヒトＷＩＳＨ細胞に対す
る水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）による細胞変性作用
を阻害する能力により規定される）を得る。

【００４０】工程（ｃ）のイオン交換クロマトグラフィ
ーはｐＨ約８でＴＳＫ−ＤＥＡＥカラム上で行い、塩濃
度を上昇させて溶出する。ハイドロキシアパタイトクロ
マトグラフィーは好ましくはバイオゲルＨＴＰカラム
（バイオラッド（BioRad）、米国）でｐＨ６．８で行
い、リン酸緩衝液で溶出する。陰イオン交換ＨＰＬＣは
好ましくは、スーパーホルマンス（Superformance ）Ｔ
ＭＡＥカラムでＴＳＫ−ＤＥＡＥと同様の方法で行う。
疎水性相互作用クロマトグラフィーは好ましくは、フェ
ニルセファロースカラムで塩濃度を減少させて溶出す
る。逆相ＨＰＬＣは好ましくはアクアポア（Aquapore）
ＲＰ３００カラムでｐＨ７．５で、アセトニトリルの濃
度勾配で行う。

【００４１】別の好適な実施態様において、可溶性ＬＤ
Ｌリセプターは上記実施態様の工程ａ、ｂおよびｃより
なる方法で精製し、次に可溶性ＬＤＬリセプターに対す
るモノクローナル抗体のカラムで免疫親和性クロマトグ
ラフィーを行う。

【００４２】モノクローナル抗体は好ましくはハイブリ
ドーマＣ７（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１６９１）より作成され
るものである。部分精製した可溶性ＬＤＬリセプターを
中性のｐＨでカラムにかけ、カラムを０．５ＭのＮａＣ
ｌで中性で洗浄し５０ｍＭのＮａ₂ ＣＯ₃ （ｐＨ１１）
により精製された状態で溶出され、直ちに中和される。

【００４３】好ましくはすべての精製操作においてクロ
マトグラフィーは蛋白濃度を追跡して行う（２８０ｎｍ
での吸光度、または代表的画分とフルオレスカミンとの
「オンライン」の反応の蛍光）。各画分の抗ウイルス活
性は、本明細書に記載の生物活性測定法に従ってＷＩＳ
Ｈ細胞中のＶＳＶ−誘導ＣＰＥ（細胞変性作用）の阻害
により求められる。

【００４４】本明細書において「ムテイン」（"mutein
s" ）という用語は、天然の可溶性ＬＤＬリセプターの
１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残
基により置換されているか、または１つまたはそれ以上
のアミノ酸残基が可溶性ＬＤＬリセプターの天然の配列
に添加されていて、得られる生成物の抗ウイルス活性を
大きく変えることのないものを意味する。これらのムテ
インは公知の合成法および／または部位特異的突然変異
誘発、または適当な任意の他の公知の方法により調製さ
れる。

【００４５】「融合蛋白」という用語は、可溶性ＬＤＬ
リセプターまたはムテインに他の蛋白が融合しており、
体内での滞在時間がより長いポリペプチドを意味する。
すなわち可溶性ＬＤＬリセプターは他の蛋白、ポリペプ
チドなど（例えば免疫グロブリンまたはその断片）に融
合される。

【００４６】本明細書において「塩」という用語は、可
溶性ＬＤＬリセプター、ムテインおよびこれらの融合蛋
白のカルボニル基の塩およびアミノ基の付加塩を意味す
る。カルボキシル基の塩は当該分野で公知の方法で作成
され、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、
第三鉄または亜鉛などの無機塩、および例えばアミン
（トリエチルアミン）、アルギニンまたはリジン、ピペ
リジン、プロカインなどとの有機塩がある。酸付加塩と
しては、例えば塩酸または硫酸のような鉱酸との塩、お
よび例えば酢酸またはシュウ酸のような有機酸との塩が
ある。

【００４７】本明細書において「官能性誘導体」とは、
可溶性ＬＤＬリセプターおよびその融合蛋白やムテイン
の誘導体（これらは当該分野で公知の方法により、Ｎ−
末端またはＣ−末端上の残基にある側鎖として存在する
官能基から調製される）を包含し、これらが薬剤として
許容されるものである限り、すなわち蛋白の活性を損な
わずこれらを含む組成物に有害な性質を与えることがな
い限り、これらは本発明に含まれる。これらの誘導体に
は例えばポリエチレングリコール側鎖があり、これは抗
原性部位を隠してしまい、体内での可溶性ＬＤＬリセプ
ターの滞在時間を延長する。他の誘導体としては、カル
ボキシル基の脂肪族エステル、アンモニウムまたは第１
級または第２級アミンとの反応によるカルボキシル基の
アミド、アシル部分（例えばアルカノイルまたはカルボ
キシルアロイル基）と形成されるアミノ酸残基の遊離ア
ミノ基のＮ−アシル誘導体、またはアシル部分と形成さ
れる遊離ヒドロキシ基（例えばセリンまたはスレオニン
残基）のＯ−アシル誘導体がある。「官能性誘導体」と
いう用語にはまた、決定された配列より長いかまたは短
いアミノ酸配列を有する蛋白（ただしこれらがウイルス
感染を阻害する能力を有する限り）が含まれる。

【００４８】可溶性ＬＤＬリセプター、その融合蛋白お
よびムテインの「活性画分」として、該蛋白分子自身ま
たは関連分子またはそこに結合した残基（例えば糖また
はリン酸塩残基、または蛋白分子または糖残基の凝集
物）のポリペプチド鎖の任意の断片または前駆体が、ウ
イルス感染を阻害する能力を有する限り、本発明に包含
される。

【００４９】本発明はまた、可溶性ＬＤＬリセプター、
融合蛋白、ムテインまたはこれらの活性画分をコードす
るヌクレオチド配列よりなるＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子
を有する複製可能な発現ビーイクル（vehicle ）、これ
で形質転換した宿主およびこのような形質転換宿主によ
り産生された蛋白に関する。「ＤＮＡ分子」という用語
は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびこれら
の組合せを含む。

【００５０】組換え可溶性ＬＤＬリセプターの産生は別
の方法により行われる。１つの方法では、プラスミッド
ｐＬＤＬＲ−２（ヤマモト（Yamamoto）ら、前述）から
可溶性ＬＤＬリセプターの公知のｃＤＮＡを取る。この
ＤＮＡを適当なオリゴヌクレオチドで部位特異的突然変
異誘発をさせ、停止コドンとポリアデニル化コドンを成
熟ＬＤＬリセプターのコドン２９２の後ろに挿入する。
次にこの作成体を当該分野で公知の方法により適当に作
成された発現ベクターに挿入する（マニアチス（Maniat
is）らを参照、前述）。合成ＤＮＡリンカーまたは平滑
末端（blunt end ）結合法を用いて、ホモポリマーテー
リング法または制限結合法により、２本鎖ｃＤＮＡをプ
ラスミッドベクターに結合させる。ＤＮＡリガーゼを用
いてＤＮＡ分子を結合させ、アルカリ性ホスファターゼ
で処理して好ましくない結合を避ける。

【００５１】ＬＤＬリセプターのリガンド結合ドメイン
と、例えばＩｇＧ2 重鎖の定常領域よりなる融合蛋白の
産生は、以下のようにして行う：ｐＬＤＬＲのＤＮＡを
部位特異的突然変異誘発により、成熟ＬＤＬリセプター
のコドン２９２のすぐ後ろにユニークな（唯一の）制限
部位を導入する。ＩｇＧ2 重鎖の定常領域を有するプラ
スミッド（例えばｐＲＫＣＯ４2 Ｆｃ2 （ビルン（Byrn
R.A. ）ら、1990, Nature（ロンドン）344, 667-670）
を部位特異的突然変異誘発により、ＩｇＧ2 重鎖のＡｓ
ｐ２１６のできるだけ近くに、融合蛋白の段階で翻訳が
可能であるように、同じユニークな制限部位を導入す
る。５’の非翻訳配列を含みリーダーとＬＤＬリセプタ
ーの大体最初の２９５アミノ酸よりなるｄｓＤＮＡを、
突然変異したｐＬＤＬリセプターのＥｃｏＲＩとユニー
クな制限部位での消化により調製する。突然変異ｐＲＫ
ＣＯ４2 Ｆｃ2 は同様に消化されて、プラスミッドとＩ
ｇＧ1 を有する大きな断片を産生する。次にこの２つの
断片を結合して、ＬＤＬリセプターのＮ−末端の約２９
５個のアミノ酸とＩｇＧ2 重鎖（ヒンジ領域とＣＨ２お
よびＣＨ３ドメイン）のＣ−末端の約２２７個のアミノ
酸よりなるポリペプチドをコードする新しいプラスミッ
ドを作成する。ＥｃｏＲＩによる消化によりプラスミッ
ドから、融合蛋白をコードするＤＮＡを単離し、次に有
効な発現ベクターに挿入する。

【００５２】可溶性ＬＤＬリセプター、そのムテインま
たは融合蛋白を発現することを可能にするために、発現
ベクターは遺伝子発現と蛋白産生を可能にするように目
的の蛋白をコードするＤＮＡに結合した転写および翻訳
制御情報を有する特異的ヌクレオチド配列を含むべきで
ある。まず遺伝子が転写されるために、遺伝子の前にＲ
ＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーターがなければ
ならない（ここにポリメラーゼが結合し転写過程が開始
される）。このようなプロモーターは種々使用されてお
り、これらは異なる効率で作用する（強いプロモーター
および弱いプロモーター）。これらは原核細胞および有
核細胞で異なる。

【００５３】本発明で使用されるプロモーターは構成性
（例えばバクテリオファージラムダのｉｎｔプロモータ
ー、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａ遺
伝子、およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターな
ど）、または誘導性（例えばバクテリオファージラムダ
の主要な右プロモーターおよび左プロモーター（ＰL と
ＰR ）を含む原核プロモーター、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅ
ｃＡ、ｌａｃ２、ｏｍｐＦおよびｇａｌプロモーター、
またはｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーターなど）
でもよい（グリック（Glick, B.R. ）、1987、J. Ind.
Microbiol. 1:277-282）。

【００５４】原核細胞で高レベルの遺伝子発現を達成す
るためには、強いプロモーターを使用して多量のｍＲＮ
Ａを産生させる以外に、リボゾーム結合部位を用いてｍ
ＲＮＡが有効に翻訳されていることを確保することが必
要である。１つの例は、開始コドンから適当に位置して
おり、１６ＳＲＮＡの３’末端配列に相補的なシャイン
ダルガルノ配列（ＳＤ配列）である。

【００５５】原核宿主には、宿主の性質により異なる転
写および翻訳制御配列が使用される。これらはウイルス
（例えばアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サ
ルウイルスなど）由来であり、ここでは高レベルの発現
をする特定の遺伝子に関連した制御シグナルがある。例
としてはヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４
０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター
などがある。抑制と活性化を可能にする転写開始制御シ
グナルが選択され、こうして遺伝子の発現が制御され
る。

【００５６】本発明の可溶性ＬＤＬリセプターまたはそ
の断片またはムテインまたはこれらの融合蛋白をコード
するヌクレオチド配列、および機能的に結合した転写お
よび翻訳制御シグナルよりなるＤＮＡ分子は、目的の遺
伝子配列を宿主細胞染色体へ取り込むことができるベク
ターに挿入される。導入されたＤＮＡを染色体中へ安定
的に取り込む細胞を選択することができるように、発現
ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１つまたは
それ以上のマーカーを使用する。このマーカーは栄養素
要求性宿主（autotrophic host）に原栄養性（prototro
phy ）、殺生物剤（biocide ）耐性（例えば抗生物質、
銅などの重金属に対する耐性など）を与えることもでき
る。選択マーカーは発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接
結合しているかまたはコトランスフェクション（cotran
sfection）により細胞内へ導入される。１本鎖結合性蛋
白ｍＲＮＡの最適な合成のためには追加の要素も必要で
あり、これらの要素にはスプライスシグナル、および転
写プロモーター、エンハンサー、そして停止シグナルが
ある。このような要素を導入しているｃＤＮＡ発現ベク
ターには、オカヤマ（Okayama, H. ）, 1983, Mol. Ce
l. Biol. 3:280 に記載されたものがある。

【００５７】好適な実施態様において、導入されたＤＮ
Ａ分子は受容性宿主中で自律増殖が可能なプラスミッド
またはウイルスベクターに取り込まれる。特定のプラス
ミッドまたはウイルスベクターの選択に重要な因子は：
ベクターを含む受容性細胞が容易に認識され、ベクター
を含まない受容性細胞から容易に選択されること；特定
の宿主におけるベクターのコピー数が好ましいこと；そ
してベクターが異なる宿主細胞間を「往復」（"shuttl
e）できることが好ましい。

【００５８】好適な原核性ベクターには、大腸菌中で複
製が可能なもの（例えばｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐ
ＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４など）（マニアチス（Ma
niatis）ら、前述）；バシルス（Bacillus）のプラスミ
ッド（例えばｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７な
ど）（グリクザン（Gryczan, T. ）、「バシルスの分子
生物学」（"The Molecular Biology of the Bacill
i"）、アカデミックプレス、ニューヨーク(1982)、307-
322 ）；ｐＩＪ１０１などのストレプトミセス（Strept
omyces）のプラスミッド（ケンダル（Kendall, K.J. ）
ら、(1987) J. Bacteriol. 169:4177-4183）：φＣ３１
のようなストレプトミセス（Streptomyces）のバクテリ
オファージ（チャター（Chater, KF. ）ら、「アクチノ
ミセターレス生物学に関する第６回国際シンポジウム」
（"Sixth International Symposium onActinomycetales
Biology"）、アカデミアイカイド（Akademiai Kaido
）、ブダペスト（Budapest）、ハンガリー、(1986) 4
3-54 ）、およびシュードモナス（Pseudomonas ）のプ
ラスミッド（ジョン（John, J.F.）ら、(1986) Rev. In
fect. Dis. 8:693-704、およびツザキ（Tzaki, K.）(19
78) Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742）がある。

【００５９】好適な真核プラスミッドには、ＢＰＶ、バ
クシニア（vaccinia）、ＳＶ４０、２−ミクロンサーク
ル（2-micron circle ）など、またはこれらの誘導体が
ある。このようなプラスミッドは当該分野で公知である
（ボツスタイン（Botstein,D.）ら、(1982) Miami Wint
Symp. 19:265-274；ブローチ（Broach, JR. ）、「酵
母サッカロミセスの分子生物学：ライフサイクルと遺
伝」（"The Molecular Biology of the Yeast Saccharo
myces:Life Cycle and Inheritance）、コールドスプリ
ングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Labor
aory）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Ha
rbor）、ニューヨーク、445-470 (1981)；ブローチ（Br
oach, JR. ）、(1982) Cell 28:203-204；ボロン（Boll
on, D.P.）ら、(1980) J. Clin. Hematol. Oncol. 10:
39-48；マニアチス（Maniatis T.）、「細胞生物学：総
合論文、第３巻：遺伝子発現」（"Cell Biology: A Com
prehensive Treatise, Vol. 3: Gene Expression" ）、
アカデミックプレス（Adademic Press）、ニューヨー
ク、563-608(1980) ）。

【００６０】作成体を含むベクターまたはＤＮＡ配列が
発現のためにいったん調製されると、保存ベクターは任
意の種々の適当な手段により適当な宿主細胞に導入され
る（例えば形質転換、トランスフェクション、リポフェ
クション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレ
ーション（electroporation ）、リン酸カルシウム沈澱
法、直接微量注入（microinjectiion ）など）。

【００６１】本発明で使用される宿主細胞は原核性でも
真核性でもよい。好適な原核宿主細胞は大腸菌（E.col
i）、バシルス（Bacillus）、ストレプトミセス（Strep
tomyces）、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Ser
ratia）などの細菌である。最も好適な原核宿主は大腸
菌である。特に関係がある細菌宿主は大腸菌Ｋ１２株２
９４（ＡＴＣＣ ３１４４６）、大腸菌Ｘ１７７６（Ａ
ＴＣＣ ３１５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ- 、ラム
ダ- 、原栄養性（ＡＴＣＣ ２７３２５））、および他
の腸内細菌（サルモネラティフィムリウム（Salmonella
typhimurium）またはセラチアナルセサンス（Serratia
narcescens ）、および種々のシュードモナス（Pseudo
monas ）種である。このような条件下ではこの蛋白はグ
リコシル化されない。原核宿主はレプリコンや発現プラ
スミッド中の調節配列と融和性でなければならない。

【００６２】しかし可溶性ＬＤＬリセプターはシステイ
ンに富む蛋白であるため、原核宿主より真核宿主が好ま
しい。哺乳動物細胞は翻訳後に蛋白に対して正しい折り
畳み（folding ）、正しいジスルフィド結合形成および
正しい部位でのグリコシル化などの修飾を可能にするた
め、好適な真核宿主は哺乳動物細胞（例えばヒト、サ
ル、マウスおよびチャイニーズハムスターオバリー（Ｃ
ＨＯ）細胞）である。また酵母細胞や昆虫細胞は翻訳後
のペプチド修飾（高マンノースグリコシル化を含む）が
可能である。酵母や昆虫細胞での目的の蛋白の産生に使
用される強いプロモーター配列や高コピー数のプラスミ
ッドを用いる、多くの組換えＤＮＡ戦略が存在する。酵
母細胞はクローン化哺乳動物遺伝子上のリーダー配列を
認識し、リーダー配列を有するペプチドを分泌する。

【００６３】ベクターの導入の後には、宿主細胞はベク
ター含有細胞の増殖を選択する選択培地中で増殖され
る。クローン化遺伝子配列が発現されると、可溶性ＬＤ
Ｌリセプター、融合蛋白、またはムテインまたはこれら
の断片が産生される。次に発現された蛋白は単離され、
抽出、沈澱、クロマトグラフィー、電気泳動など、また
はカラム中のゲルマトリックスに固定化された抗可溶性
ＬＤＬリセプターモノクローナル抗体（例えばハイブリ
ドーマＣ７，ゲルシーゲル（Belsiege U. ）ら、J. Bio
l. Chem., 256, 11923-11931, 1981）を用いる親和性ク
ロマトグラフィーなどの通常の方法などの任意の従来法
により精製される。上記組換え可溶性ＬＤＬリセプター
を含む粗調製物をカラムに通すと、可溶性ＬＤＬリセプ
ターは特異的抗体によりカラムに結合し、不純物はカラ
ムを通過する。洗浄後高ｐＨ（例えばｐＨ１１）でゲル
から蛋白を溶出する。

【００６４】可溶性ＬＤＬリセプター、そのムテイン、
融合蛋白およびこれらの塩、官能性誘導体、およびこれ
らの活性画分は、哺乳動物においてウイルス疾患の治療
に有効である。

【００６５】本発明は、単独の活性成分としてまたは他
の抗ウイルス剤（例えばインターフェロン）とともに、
薬剤として許容される担体、本発明の可溶性ＬＤＬリセ
プター、その活性ムテイン、融合蛋白およびこれらの
塩、官能性誘導体、およびこれらの活性画分よりなる薬
剤組成物に関する。これらの組成物はウイルス疾患に対
して使用される。投与法は同様の薬剤に対して使用され
る任意の方法でよく、治療すべき症状に依存する（例え
ば全身性のウイルス血症の場合は静脈内または筋肉内ま
たは皮下、また局所感染の場合は局所注射または局所投
与、または連続的な注入など）。

【００６６】本発明の薬剤は、可溶性ＬＤＬリセプタ
ー、その誘導体を単独または他の抗ウイルス剤と組合せ
て、薬剤として許容される担体、安定剤および賦形剤を
混合し、投与型（例えば投与バイアル中で凍結乾燥）
で、投与用に調製される。投与すべき活性化合物の量
は、投与経路、治療すべき疾患および患者の状態に依存
する。例えば局所投与は、体重に対して全身性のウイル
ス血症の場合の静脈内注入より少量の蛋白でよい。

【００６７】以下の非限定例により本発明を例示する。

【００６８】例 例１：可溶性ＬＤＬリセプターの抗ウイルス活性の予備
的同定 ＩＦＮで誘導した細胞の上清中の未知の抗ウイルス因子
の存在は種々の実験で証明された。

【００６９】抗ウイルス作用は、ヒトＷＩＳＨ細胞と抗
原投与としてのＶＳＶを用いるウイルス細胞変性作用
（ＣＰＥ）測定法（ルービンスアイン（Rubinstein, S
）ら、(1981) J. Virol. 37:755-758 ）により測定し
た。最初の試験はＩＮＦ−α、ＩＮＦ−βおよびＩＮＦ
−ガンマを用いて行い、３つのすべてのＩＦＮに対して
同様の結果が得られた。

【００７０】図１に示した実験（表１に要約されてい
る）では、ヒト羊膜ＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣ ＣＣＣＬ−
２５）を９６穴マイクロタイタープレートに接種した。
数時間後１０％胎児牛血清を補足したＭＥＭ（最小基本
培地）中のＩＮＦ−α、ＩＮＦ−βおよびＩＮＦ−ガン
マの５０Ｕ／ｍｌから始まる連続２倍希釈系列を、（上
から）それぞれ１−３、４−６および７−９列の細胞の
モノレーヤーに添加し、細胞を３７℃で一晩インキュベ
ートした。列１、５および９の培地は取らなかった。列
２、６および１０の培地を吸引し、細胞モノレーヤーを
１回洗浄し、新鮮な培地を加えた。列３、７および１１
では培地を各ＩＦＮの新鮮な希釈物で置換し、それぞれ
列４、８および１２ではＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β（ＮＩ
Ｈ標準物質）に対する中和性抗体およびＩＮＦ−ガンマ
に対する中和性抗体（モノクローナル抗体１６６．５、
ノビック（Novick）ら、(1983) EMBO 3(2), 1527）を加
えた。増殖培地中のＶＳＶをすべてウェル（穴）に添加
した。感染した培養物をさらに一晩インキュベートし、
次にウイルス細胞変性作用の程度を目視により評価でき
るようにクリスタルバイオレットで染色した。

【表１】 表１：ＩＦＮ作用における抗ウイルス因子の役割 図１ 処理(1) ５０％ＣＰＥ 単位／ml(2) 活性％ の列 の希釈倍率 ──────────────────────────────────── １ ＩＮＦ−α 24 時間、標準測定法 400 1000 100 ２ ＩＮＦ−α 24 時間 洗浄 100 250 25 ３ ＩＮＦ−α 24 時間、ＩＦＮを置換 200 250 25 ４ ＩＮＦ−α 24 時間、中和 300 375 37 ５ ＩＮＦ−β 24 時間、標準測定法 400 1000 100 ６ ＩＮＦ−β 24 時間、洗浄 200 500 50 ７ ＩＮＦ−β 24 時間、ＩＦＮを置換 400 1000 100 ８ ＩＮＦ−β 24 時間、中和 400 1000 100 ９ ＩＮＦ−γ 24 時間、標準測定法 800 1000 100 １０ ＩＮＦ−γ 24 時間、洗浄 200 250 25 １１ ＩＮＦ−γ 24 時間、ＩＦＮを置換 400 500 50 １２ ＩＮＦ−γ 24 時間、中和 800 1000 100 ──────────────────────────────────── (1) 標準測定法では、９６穴マイクロタイタープレート
中のＷＩＳＨ細胞のモノレーヤーに、（列１、５および
９）ＩＦＮを連続２倍希釈系列で加えた（図１の右から
左）。２４時間後にＶＳＶを加え、１８時間後細胞を固
定し染色した。他の場合は、ＶＳＶの抗原投与の直前
に、洗浄（列２、６および１０）、新鮮な培地中のＩＦ
Ｎで置換（列３、７および１１）または抗ＩＦＮ中和性
抗体の添加（列４、８および１２）を行った。 (2) ＩＦＮ標準物質（列１、５および９）の力価を１０
００Ｕ／ｍｌとした。

【００７１】まず５０％ＣＰＥを与えたＮＩＨ標準物質
ＩＦＮ（列１、５および９）の希釈率を求めた。図１の
列２、６および１０に示すように、２４時間後とＶＳＶ
抗原投与の直前に洗浄すると、３つのすべてのＩＦＮの
力価が有意に低下した。ＩＦＮの新鮮な希釈物で培地を
置換するとＩＮＦ−α（列３）とＩＮＦ−ガンマ（列
１）による防御のレベルが低下したが、ＩＮＦ−β（列
７）では低下しなかった。ＩＦＮに２４時間接触させた
後に増殖培地に中和性抗ＩＦＮ抗体を添加すると、ＩＮ
Ｆ−α（列４）の活性にはほんのわずかの影響した与え
ず、ＩＮＦ−βとＩＮＦ−ガンマ（それぞれ列８と１
２）の活性には全く影響を与えなかった。

【００７２】ＩＦＮは特異的細胞表面リセプターとの相
互作用の後に細胞内に抗ウイルス状態を誘導するため、
抗ウイルス状態が確立したらこれらを除去しても細胞は
ウイルスに対して防御され続ける。従って抗ウイルス状
態の確立の後にＩＦＮを除去しても見かけのＩＦＮの力
価は変化しないと考えられる。しかし上記の実験ではウ
イルスを抗原投与（列２、６および１０）する前に培地
を置換すると、特定のＩＦＮ試料の見かけの抗ウイルス
力価は、有意に低かった。培地を新鮮なＩＦＮで置換し
た場合も、ＩＮＦ−α（列３）とＩＮＦ−ガンマ（列１
１）では防御のレベルは、置換しない場合よりも低かっ
た。従って培地はウイルス感染から細胞を防御する非イ
ンターフェロン成分を有していた。

【００７３】ＩＦＮの添加後に細胞をインキュベート
し、増殖培地を置換することなくウイルス抗原投与の前
に抗ＩＦＮ中和抗体を添加すると、ＩＮＦ−αの抗ウイ
ルス活性のみわずかに低下した（列４）がＩＮＦ−βま
たはＩＮＦ−ガンマ（それぞれ列８と１２）の活性は低
下しなかった。これらの結果は、ＩＦＮ含有培地を除去
した時観察された活性の低下はＩＦＮ分子の除去による
のではなく、むしろ充分な抗ウイルス防御能を与えるの
に必要な他の分子の除去によることを示唆している。

【００７４】ＩＦＮのＣＰＥ低下測定法においてインビ
トロで、培地中の抗ウイルス活性の増強が証明された。
ＩＦＮ抗ウイルス活性においてインビボでも活性細胞外
成分がある役割を果たしている可能性がある。分泌され
た成分が連続的に除去されている全身性の疾患でＩＦＮ
を使用するとき、このような因子の投与はＩＦＮの作用
を大いに増強するかも知れない。

【００７５】例２：抗ウイルス蛋白の産生と精製

【００７６】２．１ 粗抗ウイルス蛋白の産生 スピナーフラスコ中のフィブラセルディスク（Fibracel
l discs ）（ステリリン（Sterilin）、英国）上で、１
０％胎児牛血清（ＦＣＳ）を補足したＭＥＭよりなる培
地中で、コンフルーエントになるまでヒト羊膜細胞ＷＩ
ＳＨ（ＡＴＣＣＣＣＬ−２５）を増殖させた。コンフル
ーエントのところで培地を捨て、ディスクを無血清ＭＥ
Ｍで数回洗浄した。次に細胞を、蛋白を含まない血清代
替物ＡＤＣ−１（１：５０、バイオロジカルインダスト
リーズ（Biological Industries）、ベイトヘメック（B
eit Haemek ）、イスラエル）、ヘペス２０ｍＭ、イン
スリン０．２μｇ／ｍｌおよびＩＮＦ−ガンマ（３０Ｕ
／ｍｌ）を補足したＭＥＭ（１．３リットル）中でイン
キュベートした。３７℃で１７時間インキュベートを続
けた。次に培地を集め、遠心分離し（５０００×ｇ、１
５分）、上清を集め、使用するまで短時間（２４時間ま
で）４℃で無菌条件下で保存したか、または−２０℃に
保存した。蛋白を含まない培地とＩＮＦ−ガンマをさら
に加えることにより、培養細胞を産生のために連続的に
使用することができた。

【００７７】２．２ 粗抗ウイルス因子の濃縮 抗ウイルス性因子はポリエチレングリコール２０，００
０に対して透析するか、または限外濾過により濃縮する
ことができる。上記工程２．１の粗細胞上清（１．５リ
ットル）を分子量カットオフが１０，０００のポリスル
ホン膜（ＰＴＧＣミニタンプレート）を用いてミニタン
（Minitan ）装置（ミリポア（Millipore ）、米国）中
で限外濾過して約３０倍濃縮した。粗保持物（retentat
e ）をホウ酸ナトリウム緩衝液、２０ｍＭ、ｐＨ８（緩
衝液Ａ）で洗浄し、容量を約５０ｍｌにした。この物質
を直ちに使用するかまたは使用するまで−２０℃に保存
した。

【００７８】 ２．３ ＴＳＫ−ＤＥＡＥでのクロマトグラフィー ＴＳＫ−ＤＥＡＥカラム（２．５×３３ｃｍ、トーソー
（Tosoh ）、日本）を緩衝液Ａで平衡化させた。上記の
ミニタン工程２．２からの濃縮抗ウイルス性因子を、流
速８ｍｌ／分でカラムにかけた。次にカラムを緩衝液Ａ
で洗浄し、緩衝液Ａ中の５０、１００、２００および５
００ｍＭのＮａＣｌで段階的に溶出した。１２ｍｌの画
分を集め生物測定法をで測定した。カラムを２８０ｎｍ
の吸光度により追跡した（図２）。２００ｍＭのＮａＣ
ｌで溶出した蛋白のピークは、中和性の抗ＩＮＦ−ガン
マモノクローナル抗体Ｎｏ．１６６−５の存在下で試験
した時抗ウイルス活性を有していた。これを集め、ＹＭ
−１０膜（分子量カットオフ１０，０００、アミコン
（Amicon）、米国）の限外濾過により約２０ｍｌの容量
に濃縮した。この物質を使用するまで−２０℃に保存し
た。

【００７９】 ２．４ ハイドロキシアパタイトのクロマトグラフィー ハイドロキシアパタイトバイオゲルＴＨＰカラム（２．
５×４ｃｍ、バイオラッド（BioRad）、米国）を水で平
衡化させた。工程２．３の濃縮した０．２ＭのＮａＣｌ
の蛋白ピーク（１６６ｍｇ）を、流速２ｍｌ／分でバイ
オゲルＨＴＰカラムにかけた。カラムを水で洗浄し、１
５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で溶出した。２
ｍｌの画分を集め、抗ウイルス活性を試験した。カラム
を２８０ｎｍの吸光度で追跡した（図３）。抗ウイルス
活性は１５ｍＭのリン酸ナトリウム溶出液中で見いださ
れ、これを集め限外濾過により濃縮した。

【００８０】２．５ 陰イオン交換ＨＰＬＣ 陰イオン交換ＨＰＬＣカラム（スーパーホルマンス（Su
performance ）−ＴＭＡＥ−６５０Ｓ、イー・メルク
（E. Merck）、ドイツ）を緩衝液Ａであらかじめ平衡化
させた。工程２．４からの７３ｍｇの蛋白を含有する濃
縮したプールを遠心分離（１０，０００×ｇ、５分）
し、上清を流速１ｍｌ／分でカラムにかけた。カラムを
緩衝液Ａで洗浄し、次に緩衝液Ａ中の５０、１００、２
００および５００ｍＭのＮａＣｌで段階的に溶出した。
２．５ｍｌの画分を集め、抗ウイルス活性を測定した。
カラムを２８０ｎｍの吸光度で追跡した（図４）。活性
は２００ｍＭのＮａＣｌ画分で溶出した。この画分を集
め使用するまで−２０℃で保存した。

【００８１】 ２．６ 疎水性相互作用クロマトグラフィー フェニルセファロースカラム（１．５×６．５ｃｍ、フ
ァルマシア（Pharmacia ）、スエーデン）を緩衝液Ａ中
の１．５ＭのＮａＣｌで平衡化させた。工程２．５の２
００ｍＭのリン酸ナトリウムの蛋白ピーク（１０ｍｇ）
を１．５ＭのＮａＣｌにし、フェニルセファロースカラ
ムにかけた（１ｍｌ／分）。カラムを緩衝液Ａ中１．５
ＭのＮａＣｌで洗浄し、非結合ピークを集めた。カラム
を緩衝液Ａ中の１ＭのＮａＣｌ、緩衝液Ａおよび ＣＨ
3 ＣＮ／５０％緩衝液Ａで段階的に溶出した。抗ウイル
ス活性は非結合画分（１．５ＭのＮａＣｌ）で得られ
た。カラムを２８０ｎｍで追跡した（図５）。

【００８２】２．７ 逆相ＨＰＬＣ 工程２．６の非結合のプールした画分（１．２ｍｇ）
を、２０ｍＭヘペス緩衝液ｐＨ７．５であらかじめ平衡
化したアクアポアＲＰ３００ＲＰ−ＨＰＬＣカラム
（４．６×３０ｍｍ）にかけた。カラムを洗浄し、同じ
緩衝液中のアセトニトリル勾配により流速０．５ｍｌ／
分で溶出した。１ｍｌの画分を集め、抗ウイルス活性を
試験した。抗ウイルス活性は１４％アセトニトリルで溶
出し、蛋白ピークに関連していた。しかしこのピークは
隣接するピークから完全に分離はしなかった（図６）。
カラムはフルオレスカミンを基礎とするカラム後の反応
系により追跡した（スタインとモシェラ（Stein S. and
Moschera J.）、1981, Methodsin Enzymology, 79:7-1
6）。

【００８３】活性画分（５６μｇ）をプールし、２０ｍ
Ｍヘペス緩衝液ｐＨ７．５で２倍希釈し、アクアポアＲ
Ｐ３００カラムで再クロマトグラフィーをした（図
７）。各画分の少量（４００μｌ）を限外濾過により濃
縮し、ドデシル硫酸ナトリウムとβ−メルカプトエタノ
ールの存在下でポリアクリルアミド（１３％）ゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。蛋白バンドは銀染
色により目視できるようにした。レーンは：レーン１−
７、ＨＰＬＣの１０−１６の画分；レーン８、対照試料
緩衝液；レーン９、左側に示した分子量マーカー（図
８）。

【００８４】例３：抗ウイルス性因子の性状解析

【００８５】３．１ 抗ウイルス活性の生物測定法 この測定法は、ＩＦＮ活性を測定するために使用される
細胞変性作用（ＣＰＥ）阻害測定法に類似している（ル
ービンスタイン（Rubinstein S. ）ら、(1981)J. Viro
l. 37:755-758 ）。抗ウイルス活性はヒトＩＮＦ−βの
ＮＩＨ標準物質に対して較正されている。これはまたＩ
ＮＦ−α標準物質でも較正してあるが、ＩＮＦ−ガンマ
（これはこれらの測定条件下ではウイルスから細胞を防
御しない）では較正していない。以下の方法が使用され
る：

【００８６】９６穴平底プレート中で１０％ＦＣＳを補
足したＭＥＭの１００μｌ中で４５，０００細胞／ウェ
ルを接種して、コンフルーエントなモノレーヤーのＷＩ
ＳＨ細胞を第１日目に調製する。プレートを５％ＣＯ2
中で３７℃でインキュベートする。第２日目に抗ウイル
ス性因子の試料を別のプレート中で連続２倍希釈をする
（１００μｌ）。１０００Ｕ／ｍｌのＩＮＦ−ガンマを
中和するのに充分な中和性モノクローナル抗ＩＮＦ−ガ
ンマ抗体（１６６−５）を各ウェルに加え、溶液をＷＩ
ＳＨ細胞とともにプレートに移し、次に直ちに適当な量
（下記）の保存ＶＳＶ（５０μｌ）で抗原投与する。プ
レートを３７℃で一晩インキュベートした。測定は標準
物質ＩＮＦ−βで較正されている。第３日目に、ウイル
ス抗原投与の約２０時間後に対照ウェル中の細胞変性作
用を顕微鏡で観察する。これが８０％以上の場合、プレ
ートの水を切ってモノレーヤーをクリスタルバイオレッ
ト（７０％メタノール水溶液中で０．５％）で染色し、
多量の水道水で洗浄し、顕微鏡下で観察して終点を求め
る。この測定のためのＶＳＶの適当な量は、測定条件下
で標準ＩＮＦ−βの連続２倍希釈に加えられた場合、２
０−２４時間のインキュベート後約３−６Ｕ／ｍｌのＩ
ＮＦ−β希釈で５０％ＣＰＥを与える、保存ＶＳＶの希
釈率である。

【００８７】３．２ 抗ウイルス性因子は蛋白である 抗ウイルス性因子が蛋白であることを証明するために３
つの実験を行った。 ａ． 分子量＞１０，０００。抗ウイルス活性はＰＥＧ
２０，０００に対する透析およびカットオフ１０，００
０ダルトンの膜の限外濾過により濃縮できることは、こ
の抗ウイルス性因子が巨大分子であることを示してい
る。

【００８８】ｂ． 熱に対する不安定性。モノ（Mono）
Ｑ陰イオン交換工程（例２の工程２．５と同じ）からの
活性画分を、１００℃の浴中で１０分加熱し抗ウイルス
活性を試験した。この処理の後には活性は認められなか
った。表２を参照。

【００８９】ｃ． トリプシン感受性。モノ（Mono）Ｑ
陰イオン交換工程からの活性画分を蛋白：酵素比５：１
で、ＴＰＣＫ−処理したトリプシン（ワーシントン（Wo
rthington ））で室温でインキュベートした。対照画分
はトリプシンなしで同様に保存し、対照トリプシンを同
様にして作成した。抗ウイルス活性の６６％はトリプシ
ン処理により失われたため、抗ウイルス性因子はトリプ
シン感受性であると結論された。

【００９０】ｄ． 抗ウイルス性因子はインターフェロ
ンではない。インターフェロンは細胞内に、インターフ
ェロンの除去後も続く抗ウイルス状態を誘導する蛋白で
あると規定される。細胞をモノＱ工程からの抗ウイルス
性因子含有培地と２４時間インキュベートし、培地を除
去し、細胞を洗浄してＶＳＶで抗原投与した。従って抗
ウイルス性因子はインターフェロンではなく、その作用
機構はインターフェロンのものとは異なると結論され
た。

【００９１】ｅ． 抗ウイルス性因子はおそらく分解性
酵素ではない。抗ウイルス性因子の作用部位と作用様式
はいまだに未知である。これらの問題を明らかにするた
めに、異なるウイルスでさらに試験が必要である。この
因子がウイルスを分解する酵素（例えば蛋白分解性酵
素）であるか否かを試験するために、１つの簡単な実験
を行った。この目的のためにＶＳＶを、この因子の連続
２倍希釈系列と３７℃で異なる時間インキュベートし
た。次にウシＭＤＢＫ細胞をウェルに加え、ＣＰＥの程
度を求めた。ＶＳＶは抗ウイルス性因子の添加の直後に
細胞と混合された時、または抗ウイルス性因子と３７℃
で５時間あらかじめインキュベートされた時、ＶＳＶは
同定度のＣＰＥを与えることが見いだされた。従って抗
ウイルス性因子はおそらくウイルス分解性酵素ではない
と結論された。

【表２】 表２：抗ウイルス性因子の熱とトリプシンに対する感受性 試料 活性 Ｕ／ｍｌ ％ 保存（モノＱ）抗ウイルス性因子、一晩、室温 ７５ １００ 保存抗ウイルス性因子＋トリプシン、一晩、室温 ２５ ３３ 保存抗ウイルス性因子（モノＱ）、室温、１０分 ６５ １００ 保存抗ウイルス性因子、１００℃、１０分 ０ ０

【００９２】３．３ 抗ウイルス性因子のサイズ排除ク
ロマトグラフィー ＴＳＫ−ＤＥＡＥ工程からの抗ウイルス性因子（０．４
ｍｌ）を、ほとんど生理的条件下でリン酸緩衝化生理食
塩水中でサイズ排除カラム（スーパーローズ１２、１×
３０ｃｍ、ファルマシア（Pharmacia ））で分画した。
カラムをあらかじめ平衡化し、流速０．５ｍｌ／分でリ
ン酸緩衝化生理食塩水で溶出した。１ｍｌの画分を集
め、各画分について抗ウイルス活性を測定した。カラム
を２８０ｎｍで追跡した（図９）。カラムは分子量マー
カーとしてのウシ血清アルブミン（６７Ｋ）とカルボニ
ックアンヒドラーゼ（carbonic anhydrase）（３０Ｋ）
で較正した。抗ウイルス活性は見かけの分子量４０，０
００のピークで溶出することが見いだされた。しかしこ
のピークは広めであった。

【００９３】３．４ 抗ウイルス性因子の種特異性 抗ウイルス性因子はヒトＷＩＳＨ細胞上で活性であるこ
とが見いだされた。これはまたウシＭＤＢＫ細胞および
齧歯類Ｌ細胞上で活性があることが見いだされた。従っ
てこの因子は種特異性はないと結論された。

【００９４】 ３．５ 蛋白配列解析と抗ウイルス性因子の同定 最後のＲＰ−ＨＰＬＣ工程（例２の２．７を参照）から
の画分１０−１２の少量（４００μｌ）をプールし、限
外濾過で濃縮し、濃縮物（０．５μｇ）をモデル４７５
蛋白微量配列解析装置（アプライドバイオシルテムズ
（Applied Biosystems）、米国）で微量配列解析をし
た。この系で同定した得られたＮ−末端１５個のアミノ
酸残基の配列を図１０に示す。サイクル１０のアミノ酸
は同定しなかったが、サイクル３のＰｒｏはあまり自信
がなく同定した（ピコモル比で示されている）。

【００９５】得られたアミノ酸配列をＮＢＲＦ蛋白デー
タバンクと比較し、前駆体ＬＤＬリセプターの残基２５
（成熟ＬＤＬリセプターの残基４）から始まるヒト低比
重リポ蛋白（ＬＤＬ）リセプターのＮ−末端配列と１０
０％同じであった。サイクル３、１０および１５のアミ
ノ酸は、予備的修飾なしには同定できないシステイン残
基であるため、配列解析装置では正しく同定されなかっ
た。単離されたリセプターと公知のＬＤＬリセプターの
同一性を図１１にしめす。

【００９６】分子量の推定のために用いた２つの方法に
よれば、本発明の可溶性抗ウイルス性蛋白の分子量は２
９，０００または４０，０００である。従って抗ウイル
ス性蛋白はＬＤＬリセプターのＮ−末端システインの豊
富なドメインに対応すると結論された。エッサー（Esse
r ）（エッサー（Esser V.）ら、(1988), J. Biol. Che
m. 263, 13282-13290 ）によれば、２９２個のアミノ酸
残基のシステインに富むＮ−末端ドメインは、ＬＤＬリ
セプターのリガンド結合ドメインであり、その計算され
た分子量はグリコシル化の程度により約３３，０００−
３８，０００である。

【００９７】例４：抗ウイルス性因子の免疫親和性クロ
マトグラフィー 抗ウイルス性因子とｓＬＤＬＲの最も直接的な証明は、
モノクローナル抗体Ｃ７カラムでの粗抗ウイルス性蛋白
の親和性クロマトグラフィーにより得られた。この抗体
はウシおよびヒトＬＤＬＲのリガンド結合ドメインに対
するものである。（バイシーゲル（Beisiegel, U. ）
ら、(1981) J. Biol. Chem., 256, 11923-11931 ）。ハ
イブリドーマＣ７（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１６９１）をマウ
スで腹水として増殖させ、硫酸アンモニウム分画法によ
り免疫グロブリンを単離した。Ｃ７免疫グロブリン（１
９ｍｇ）を１ｍｌのアガロースに結合させた。ＴＳＫ−
ＤＥＡＥ工程（"load"（「のせた量」）、１４ｍｌ、３
７．８ｍｇ蛋白、２８００単位）の２００ｍＭのＮａＣ
ｌ画分からの部分精製したＡＶＨを、このカラムにかけ
た。溶出液（"effl." ）を集め、カラムをリン酸緩衝化
生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．５Ｍの食塩７０ｍｌで洗
浄し（"wash"）、次にＰＢＳ（３０ｍｌ）で洗浄した。
次にカラムを５０ｍＭのＮａ2ＣＯ3（ｐＨ１１）で溶出
し（el.2およびel.3）、回収率は３２％であった（図１
２）。溶出した画分の蛋白の量は０．１５ｍｇであり、
精製の程度は８３であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色
により多くのバンドが得られた。しかしモノクローナル
抗体Ｃ７のウェスタンブロット（ゲルは非還元条件下）
では（図１３）、load画分、effluent画分そしてwash画
分にもリセプターは検出されなかった（それぞれレーン
２、３および４）。しかしel.2とel.3では（レーン５と
６）可溶性ＬＤＬリセプターの２８Ｋのバンドが得られ
た。またel.2とel.3では弱い４０Ｋバンドと１００Ｋバ
ンド（これらはおそらくＬＤＬリセプターの大きな細胞
外断片であろう）を含む高分子量バンドが見られた。２
００Ｋの近くの強いバンドはＣ７試料（レーン７）と同
一であったため、おそらくカラムから漏れたモノクロー
ナル抗体Ｃ７であり、蛋白Ａと反応したのであろう。 例５：インターフェロンによる細胞表面ＬＤＬＲの誘導 可溶性ＬＤＬリセプターも細胞表面リセプターも同じ遺
伝子を有するため、インターフェロンが可溶性ＬＤＬリ
セプターを誘導する能力は、これが細胞表面ＬＤＬリセ
プターも誘導することができることを示唆する。完全な
サイズのＬＤＬリセプターを誘導することができるか否
かを試験するために、コンフルーエントにまで増殖させ
たＷＩＳＨ細胞を、２％胎児牛血清を含む培地中で種々
のインターフェロンと培養した。細胞を洗浄し、モノク
ローナル抗体Ｃ７と４℃で２時間インキュベートし、洗
浄し、 125Ｉ−蛋白Ａ（約８０，０００ｄｐｍ）と４℃
で２時間インキュベートし、トリプシンで集め計測し
た。経時変化の実験ではＩＮＦ−ガンマ（１００Ｕ／ｍ
ｌ）によるＬＤＬリセプターの最大の誘導は５時間と２
３時間の間で起きた。次にＷＩＳＨ細胞を異なるインタ
ーフェロンと１９時間培養して用量応答試験を行った。
その結果ＩＮＦ−ガンマはＬＤＬリセプターの最も強力
な誘導体であり、最大の誘導は１０−５０Ｕ／ｍｌで見
られた。ＩＮＦ−αはより弱い誘導体であり、ＩＮＦ−
βは全くＬＤＬリセプターを誘導体しなかった（図１
４）。蛋白合成阻害剤シクロヘキシミドの存在下ではＬ
ＤＬリセプターの誘導もその基礎レベルも消失してい
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】添加されたインターフェロンではない抗ウイル
ス活性の存在の証拠を示す。

【図２】ＴＳＫ−ＤＥＡＥ陰イオン交換カラムからの蛋
白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。

【図３】ハイドロキシアパタイトバイオゲルＨＴＰカラ
ムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。

【図４】スーパーホーマンス（Superformance ）ＴＭＡ
Ｅ−６５−Ｓ陰イオン交換ＨＰＬＣカラムからの蛋白と
抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。

【図５】フェニルセファロース疎水性相互作用カラムか
らの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。

【図６】逆相アクアポア（Aquapore）ＲＰ−３００ＨＰ
ＬＣカラムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターン
を示す。

【図７】逆相ＨＰＬＣカラムによる再クロマトグラフィ
ーからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。

【図８】精製操作の最後の工程で得られた種々の画分の
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示す。１３％のアクリ
ルアミドゲルが使用され、銀で染色した。レーンは：１
−７、限外濾過で濃縮されたＲＰ−３００クロマトグラ
フィー（図７）からの画分１０−１６の一部（４００μ
ｌ）；８、対照試料緩衝液；９、左側に示した分子量マ
ーカー。

【図９】スーパーローズ（Superose）１２サイズ排除Ｈ
ＰＬＣカラムからの抗ウイルス活性の溶出パターンを示
す。

【図１０】微量配列解析装置（microsequencer）の元々
のアウトプットを示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（図７）の画分
１０−１２（各０．４ｍｌ）をプールし、限外濾過によ
り濃縮し、得られた試料（１μｇ）を蛋白微量配列解析
にかけた。

【図１１】図１０に示す蛋白微量配列解析装置により得
られた配列の探索のアウトプットを示す。

【図１２】モノクローナル抗体Ｃ７カラムで部分的に精
製した可溶性ＬＤＬリセプターの免疫親和性クロマトグ
ラフィーからの種々の画分の抗ウイルス活性を示す。バ
ーは：load−カラムにのせたもの；effl.−溶出液（非
結合画分）；el.1-4−溶出１−４である。

【図１３】免疫親和性クロマトグラフィー（図１２に示
されている）からの種々の画分のウェスタンブロット解
析を示す。蛋白はニトロセルロースに電気ブロットさ
れ、モノクローナル抗体Ｃ７および125Ｉ−蛋白Ａで可
視化した。レーンは：１、分子量マーカー；２、load；
３、非結合；４、洗浄；５、溶出２；６、溶出３；７、
モノクローナル抗体Ｃ７である。

【図１４】種々のインターフェロンによるＷＩＳＨ細胞
中の細胞表面ＬＤＬリセプターの投与量応答誘導を示
す。細胞は１９ インターフェロンとインキュベートさ
れ、培地に２％胎児牛血清を含む培地、細胞表面ＬＤＬ
リセプターのレベルはモノクローナル抗体Ｃ７と 125Ｉ
−蛋白Ａにより測定した。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ａ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ナサン タル イスラエル国レホボト，エイセンバーグ ストリート 31

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 可溶性ＬＤＬリセプター蛋白、そのムテ
   インと融合蛋白、それらの塩、官能性誘導体および活性
   画分。
2. 【請求項２】 蛋白性不純物に対して均一になるまで精
   製されている、請求項１に記載の可溶性ＬＤＬリセプタ
   ー。
3. 【請求項３】 実質的に成熟ＬＤＬリセプターの細胞外
   ドメインよりなる、請求項１または２に記載の可溶性Ｌ
   ＤＬリセプター。
4. 【請求項４】 実質的に成熟ＬＤＬリセプターのリガン
   ド結合ドメインよりなる、請求項１または２に記載の可
   溶性ＬＤＬリセプター。
5. 【請求項５】 実質的に成熟ＬＤＬリセプターのアミノ
   酸残基４から約２９２に対応するアミノ酸配列を有す
   る、前記請求項のいずれか１項に記載の可溶性ＬＤＬリ
   セプター。
6. 【請求項６】 実質的に図１０に示すアミノ酸配列を含
   む、前記請求項のいずれか１項に記載の可溶性ＬＤＬリ
   セプター。
7. 【請求項７】 適当な細胞のインターフェロンによる処
   理、その上清からの可溶性ＬＤＬリセプターの単離およ
   びそれらの精製よりなる、前記請求項のいずれか１項に
   記載の可溶性ＬＤＬリセプターの調製法。
8. 【請求項８】 使用される細胞はインターフェロンに応
   答して抗ウイルス状態に入ることができるものである、
   請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 インターフェロンはインターフェロン−
   ガンマである、請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 以下の工程よりなる請求項７に記載の
    方法： ａ） インターフェロンに応答して抗ウイルス状態に入
    ることができる細胞をコンフルーエントになるまで増殖
    させて； ｂ） 細胞をインターフェロンで誘導し； ｃ） 培養上清を採取し； ｄ） 上清を濃縮し； ｅ） 工程ｄ）の濃縮した上清を陰イオン交換クロマト
    グラフィーにかけて； ｆ） 工程ｅ）で得られた画分をハイドロキシアパタイ
    トのクロマトグラフィーにかけて； ｇ） 工程ｆ）で得られた画分を陰イオンＨＰＬＣにか
    けて； ｈ） 工程ｇ）で得られた画分を疎水性相互作用クロマ
    トグラフィーにかけて； ｉ） 工程ｈ）で得られた画分を逆相ＨＰＬＣにかけ
    て； ｋ） 工程ｉ）を繰り返して均一になるまで精製された
    可溶性ＬＤＬリセプターを得る。
11. 【請求項１１】 １つまたはそれ以上のクロマトグラフ
    ィー工程は、抗ＬＤＬリセプターモノクローナル抗体カ
    ラムの免疫親和性クロマトグラフィーで置換される、請
    求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 モノクローナル抗体はＣ７（ＡＴＣ
    Ｃ、ＣＲＬ１６９１）であり、可溶性リセプターは高い
    ｐＨで溶出される、請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 ヒトＷＩＳＨ細胞が使用される請求項
    １０に記載の方法。
14. 【請求項１４】 実質的に成熟ＬＤＬリセプターのリガ
    ンド結合ドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配
    列を有する可溶性ＬＤＬリセプターをコードするＤＮＡ
    分子。
15. 【請求項１５】 実質的に成熟ＬＤＬリセプターのアミ
    ノ酸残基４から２９２に対応するアミノ酸配列を有する
    可溶性ＬＤＬリセプターをコードする、請求項１４に記
    載のＤＮＡ分子。
16. 【請求項１６】 図１０のアミノ酸配列を含む可溶性Ｌ
    ＤＬリセプターをコードする、請求項１４に記載のＤＮ
    Ａ分子。
17. 【請求項１７】 請求項１１から１３までのいずれか１
    項に記載のＤＮＡ分子にハイブリダイズし、可溶性ＬＤ
    ＬリセプターをコードするＤＮＡ分子。
18. 【請求項１８】 請求項１４から１７までのいずれか１
    項に記載のＤＮＡ分子よりなる発現ベクター。
19. 【請求項１９】 請求項１８に記載の発現ベクターで形
    質転換される細胞株。
20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の形質転換細胞株を
    培養し、培地から可溶性ＬＤＬリセプターを回収するこ
    とよりなる、組換え可溶性ＬＤＬリセプターの産生方
    法。
21. 【請求項２１】 随時薬剤として許容される担体を一緒
    に含む、可溶性ＬＤＬリセプター、そのムテインおよび
    融合蛋白、それらの塩、官能性誘導体および活性画分よ
    りなる薬剤組成物。
22. 【請求項２２】 別の抗ウイルス剤をさらに含む、請求
    項２１に記載の薬剤組成物。
23. 【請求項２３】 別の抗ウイルス剤はインターフェロン
    である、請求項２２に記載の薬剤組成物。