JPH05507208A - 線虫ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 線虫ワクチン 技術分野 本発明は、寄生性線虫による感染に対し防衛的免疫を付与する抗原に関する。

本発明はまた、寄生性線虫による感染に対し防衛的免疫を付与するワクチンおよ び寄生性線虫による感染に対し受動免疫を付与する抗体に関する。

背景技術 線虫（ｎｅｍａ−細線；　ｏｉｄｅｓ−類似の）は、角度で覆われた細長い、紡 錘状のまたはサック様の胴体を有する分節を持たない回虫であり、自然界に実質 的に遍在しており、土壌、水および植物に生息しており、広範囲な動物および植 物の寄生虫病に大きな関わりを持っている。

哺乳類の回虫寄生虫は、線形動物門に属している。回虫には、鉤虫（例えば、Ｎ ｅｃａｔｏｒ　ａｍｅｒｊｃａｎｕｓおよびＡｎｃｙｌｏｓｔｏＩｌｌａ　ｄｕ ｏｄｅｎａｌｅ　）　、回虫（例えば、普通の回虫であるＡｓａａｒｉｓ　Ｉｕ ｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）　、鞭虫（例えば、Ｔｒｉｃｈｕｒｌｓ　ｔｒｉｃｂｉ ｕｒａ　）　、および蜆虫または線虫（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ　ｖｅｒ ｗｉｃｕｌａｒｕｓ　）並びにＳｔｒＯｎｇ３’１ＯｉｄｅＳｓｔｅｒｃｏｒａ ｌｉｓ　５Ｔｒｉｃｈｊｎｅｌｌａ　５ｐｉｒａ’ｌｉｓ　（ヒトおよびブタ他 の重要な回虫寄生虫には、ＡｎＣＹＩＯ５ｔＯＭａ　Ｃ１１ｎｌｎｕｒｎ　（ヒ トの感染症）　、ＳｔｒｏｎｇｙＩｕｓ　ｖｕＩｇａｒｌｓ　（ウマの感染症） 、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ　ｒｒｔｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙ＋ ｕｓｃｏ１ｕｂｒｌｆｏｒｍｉｓ　、　Ｏｓｔｅｒｔａｇｌａ　ｃｉｒｅｕｍｃ ｌｎｃｔａ　（ヒ１ソジおよびヤギの感染症）　１．ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ　ｏ ｓｔｅｒｔａｇｔ、Ｈａｅｙｉｏｎａｈｕｓ　ｐｌａｃｅｌ　（ウシの感染症） 　、Ａｓｃａｒｉｓ　５ｕｕａ＋（ブタの感染症）　、Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ　 １ｅｏｎｉａまたはＵｎｃｊｎａｒｉａ　５ｔｅｎｏｃｅｐｈａｌａ　（イヌの 感染症）　、Ｔｏｘｏｃａｒａ種（ヒトの循環系感染症）およびＤｉｒｏｆｌｌ ａｒｉａ　１ｓｓｉｔｉｓ（ネコおよびイヌの循環系感染症）がある。

症状がない場合でも、寄生虫感染症は宿主動物にとって多くの点で有害であり、 例えば宿主から食物を奪い、器官を傷付けたり導管を塞いだりし、宿主に有害な 物質を合成することがあり、他の生物の侵入路を設けることがある。他の場合に は、宿主が食物のために飼育された種であることがあり、寄生虫は食べられるこ とによって伝染して、接種動物に感染することがある。このような寄生虫は、そ れを見つけたならばできるだけ速やかに除去するのが極めて望ましい。

更に一般的には、このような感染症は無症状ではない。

哺乳類の嬬虫、特に寄生性線虫による感染症は、具体的には家畜やベット、例え ば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコおよびトリ、特に家禽の、大 きな経済的損失の一因である。これらの動物は、定期的に駆虫薬で処理してこれ らの感染症を抑制しておかなければならず、さもないとこの病気は貧血、下痢、 脱水、食欲の喪失を引き起こし、死に至らしめることさえある。

嬬虫惑染症の蔓延を防止する現在利用可能な唯一の手段は駆虫薬を使用すること によるものであるが、これらの化合物は処理の時点で存在する寄生虫に対して有 効なだけである。それ故、動物は常に感染に暴露されているので、処理は頻繁で あるかまたは継続的でなければならず、例えばＤｉｒｏｆｉｌａｒｉａ　ｔ＋ｎ １ｔｉｓまたはイヌ糸状虫の増殖を防止するには、−年のほとんど毎日または一 日おきにジエチルカルバマシンによる駆虫薬処理を行う必要がある。。これは経 費が掛かりまた手間の掛かるやり方である。駆虫薬を広範囲に亙って使用するた め、寄生虫が耐性を現わすことがあり、したがって新規で一層強力な種類の薬剤 を開発しなければならない。別の方法が望ましいのは明らかである。

寄生性線虫に対するワクチンが開発されれば、嬬虫感染症の予防または治療のた めの化学的処理に固有の欠点の多くが解決されるであろう。この保護は確かに長 く継続するであろうし、予防接種を受けた動物だけに作用し、残留物の毒性およ び持続性の問題は極めて少なくなりまたは回避されるであろう。

したがって、寄生性線虫を用いてこのようなワクチンを開発する試みがなされた が、不運にもそれらの試みの成功は限定されたものであり、材料利用可能性およ びワクチン安定性のような要因によってその大規模な使用は不可能となっている 。

これらの以前の試みは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ８８１００２３９（Ｗ０８ ９１００１６３）号及びＰＣＴ／ＡＵ８９１００４１６　（ＷＯ９０１０３４３ ３号明細書に記載されている。

バイオテクノロジー、特に組換えＤＮＡ技術の細菌の進歩により、ヒトおよび家 畜の経済的に重要な寄生虫の範囲に対して商業上実行可能なワクチンを生産する 機会が現実的に提供されている。この方法によれば、粗製の寄生虫製剤を用いて 死ワクチンの効力の欠如を説明するために提起された問題点の多くは解決するこ とになる。

例えば、組換えＤＮＡ技術によって生産されたワクチンは、寄生性線虫種の粗製 エキス中に見出される免疫抑制剤または免疫調節剤を含まないであろう。しかし ながら、最初に抗原を同定する必要がある。一旦同定され、特性決定がなされて しまえば、組換えＤＮＡ技術を用いて防御用エピトープを含むタンパク質または このタンパク質の一部を合成する微生物を構成し、組換え生物によって合成され る生成物をワクチンに用いて、動物を寄生虫による感染から保護することができ るであろう。

ＰＣＴ／ＡＵ８８１００２３９号明細書には、線虫トロボミオシンであることが しめされている組換えＤＮＡ由来の抗原は、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏ ｒｔｕｓによる攻撃に対してヒツジで５０％が保護されることが明らかにされて いる。

ＰＣＴ／ＡＵ８９１００４１８号明細書では、成虫のＴｒｌｃｈｓｔｒｏｎｇｙ ｌｕｓｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｌｓからの排泄性／分泌性抗原は予防接種したモ ルモットに保護を与えることが示されている。この明細書で後で明らかにされる 理由により、これらの抗原は本明細書で同定された抗原とは異なるものであり、 この新規な抗原は、脱硝（ｅｘｓｈｅａｔｈ■ｅｎｔ）及びイン・ビトロでのイ ンキュベーションの後の第三段階の幼虫の排泄／分泌液体中に見出される。

本明細書で用いられるＦアジュバント」という用語は、免疫組成物に対する免疫 された宿主の免疫応答を高めるのに用いられる薬剤を表わす。

本明細書で用いられる「非経口」という用語は、皮下注射、腹腔内または筋肉内 注射または輸液技法を包含する。

「相同体」という用語は、タンパク質同士の機能が関係していることが明らかな 程度に第一のタンパク質またはＤＮＡ配列に構造が関係しているタンパク質をフ ードするタンパク質またはＤＮＡ配列を表わす。本発明の文脈において、本発明 の抗原をコードする１１．　Ｃ０ｎｔＯｒｔｕＳ由来のＤＮＡをＤＮＡのハイブ リダイゼーション実験に用ることができる。これらの関連したＤＮＡセグメント は、アミノ酸配列においてもＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓから単離された防御抗原に 関連している寄生性線虫の他の種における抗原をコードする。関連したタンパク 質は、他の種の寄生虫による寄生から動物を保護するのに有効な免疫原として作 用すると主張されている。これらの関連したＤＮＡ配列は相同遺伝子と呼ばれ、 関連したタンパク質は相同抗原と呼ばれる。この相同性は、アミノ酸配列水準で は２０個のアミノ酸に亙り少なくとも７０％であり、ＤＮＡ水準では６０ヌクレ オチドに亙って少なくとも５０％である。また、本発明の文脈において、防御抗 原は、「遺伝子類」の−員であって、コード用ポリヌクレオチドおよび遺伝子生 成物は、６０個のヌクレオチドについては５０％または２０個のアミノ酸につい ては７０％程度の相同性をそれぞれ本発明のコード遺伝子および防御抗原と分担 することは明らかである。これらの関連した遺伝子および遺伝子生成物も、本発 明の相同体である。本発明の相同体は、以下に記載するようにイン・ビトロで生 成させてもよい。

本発明の抗原の文ｍける「由来の」という用語は、抗原を発現する寄生性線虫の 生活段階から単離によって得られる抗原並びに寄生性線虫の生活段階から調製さ れる抗原をコードするヌクレオチド配列、例えばゲノムＤＮ　Ａ　、　ｍ　ＲＮ 　Ａ　Ｓｍ　ＲＮ　Ａから合成されるｃＤＮＡ、および抗原コード配列に対応す る配列を有するように作成された合成ヌクレオチドの複製および発現によって得 られる抗原を包含することを意味する。

これは、線虫または抗原の組換え形態を発現するセルラインによって発現される 抗原の既知のアミノ酸配列に基づいて作成される合成ペプチドを包含することも 意味する。

開示 可能ならば、「新規な」または「隠された」抗原、すなわち有効であり且つ防御 用の免疫原として作用することができるが天然に存在する免疫には関与しない寄 生虫の成分を同定することが好ましい。これらの成分を同定するには、宿主を寄 生虫からのエキスで予防接種し、幾らかの防御を示す画分を同定し、タンパク質 化学の手法を用いてこの防御成分を再分画し、これらの小画分を動物に予防接種 し、これらの小画分を同定し、この方法で防御し、純粋な寄生虫成分を用いて動 物に予防接種し防御するまで継続する必要がある。

可能なかぎり、天然の宿主をこのような実験に用いるべきである。実験室のモデ ル動物は寄生虫の天然の宿主ではないので、これらの動物は天然の宿主では不可 能な機構によって寄生虫を拒絶することができるものと思われる。したがって、 実験室動物を特定の寄生虫から保護する抗原でも寄生虫の天然の宿主では効果が ないことがある可能性がある。天然の宿主が寄生虫に対して非常にゆっくりと免 疫を現わす状況では、これは一層可能性が高い。

本研究において特性決定される抗原は、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓｃｏｎｔｏｒｔｕ ｓ由来のものであるが、ヒトや家畜に感染することが知られている他の種の寄生 性線虫由来の同様なまたは関連の抗原である「相同体ｊを同定することができ、 これらの関連抗原は線虫の種による寄生に対して有効なワクチンを提供すること が認められている。寄生虫の種およびそれらが感染することがある宿主には、例 えばヒトの丁ｒｊｃｈｊｎｓｌｌａ　５ｐｉｒａｌｉｓまたはＡｎｃｙｌｏｓｔ ｏｏ＋ａ　ｃａｎｊｎｕｍ感染症、ヒツジのＴｒｆｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ 　ｃｏｌｕｂｒｆｆｏｒｓ＋ｆｓ感染症、ヤギのＨａｅＩＩｌｏｎｃｈｕｓ　ｃ ｏｎｔｏｒｔｕｓ感染症、ウシのｏｓｔｅｒｔａｇｉａ　ｏｓｔｅｒｔａｇ＋感 染症、ブタのＡｓｃａｒｉｓ　ｓｕｕｍまたはＴｒｉｃｈｊｎｅｌｌａ　５ｐｉ ｒａｌｉｓ感染症、ネコのＴｏｘａｓｃａｒｉｓＩｅｏｎｊｎａまたはｕｎｃｉ ｎａｒｔａ　５ｔｅｎｏｃｅｐｈａｌａ感染症およびイヌの＾ｎｃｙｌｏｓｔｏ ｍａ　ｃａｎｆｎｕＩｍまたはＴｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｖｕｌｐｆｓ感染症、並び にＴｏｘｏｃａｒａ種の幼虫によるヒトの循環器系およびＤｉｒｏｒｉｌａｒｆ ａ　Ｌｍｍｉｔｉｓによるイヌの循環器系の感染症或いはこれらの動物および他 の種の動物の循環器系、尿生殖器系、呼吸器系、皮膚および皮下組織の感染症が 挙げられる。このリストは決して完全なものではないことに留意すべきである。

本発明者らは、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの脱硝した第三段階幼虫を培地中でイン キュベーション行ったときに放出される防御を与えることができるこれらの成分 は精製され、分子レベルで特性決定されている。

本発明者らは、寄生性線虫による感染に対する防御免疫は免疫感作によって誘導 することができることを見出した。

本発明の第一の態様によれば、第一の種の寄生性線虫由来の実質的に精製された 抗原であって、宿主動物に投与すると、第二の寄生性線虫種による侵襲からこの 宿主動物を防御することができるものであって、第−及び第二の寄生性線虫種は 同一または異なるものであってもよく、還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥによって 測定した見掛けの分子量が４０ｋＤであることを特徴とする、抗原が提供される 。

典型的には、純度は９０％を上回る。この準どの水準は、アミノ酸配列決定にお いて用いられる製剤の清浄さに関して説明される。

典型的には、第−及び第二のの寄生性線虫種は、Ｔｒｉｃｈｌｎｅｌｌａ　５Ａ ｎｃｙｌｏｓｔｏｒＡａ　ＳＳｔｒｏｎｇｙｌｕｓ。

ＴｒｌｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙＩｕｓ、　ＨａｅＩｌ＋ｏｎｃｈｕｓ、　Ｏｓｔｅ ｒｔａｇｊａ、Ａｓｃａｒｉｓ　。

ｒｏｘａｓｃａｒｉｓ、　ｕｎｃｉｎａｒｔａ　５Ｔｒｉｃｈｕｒｆｓ　、　Ｄ ｌｃｔｙｃａｕｌｕｓ　。

Ｄｉｒｏｆｌｌａｒｉａ　、　Ｔｏｘｏｃａｒａ、、Ｎｅｃａｔｏｒ　５Ｅｎｔ ｅｒｏｂｉｕｓ。

Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ及びｖｕｃｈｅｒｅｒｉａ属、具体的にはＴｒｉｃ ｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ及びＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ属の種から選択される。

このような種の例には、丁ｒｆｃｈｆｎｅｌ［ａ　５ｐｆｒａｌｌｓ。

＾ｎｃｙ＋ｏｓｔｏｓａ　ｅａｎｌｕ１％Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒ ｌｓ　ＳＴｒｌｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓｃｏｌｕｂｒｌｆｏｒｍｌｓ　ＳＨ ａｅｗｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ、　Ｏｓｔｅｒｔａｇｆａｏｓｔｅｒ ｔａｇｌ　ｓ＾５ｃａｒｉｓ　５ｕｕｓ＋、　Ｄｉｃｔｙｃａｕｌｕｓ　ｖｉｖ ｉｐａｒｕｓ　。

Ｔｏｘａｓｃａｒｌｓ　Ｉｅｏｎｉｎａ。

Ｕｎｃｌｎａｒｌａ　５ｔｅｎｏｃｅｐｈａｌａ、　Ｔｒｌｃｈｕｒｌｓ　ｖｕ ｌｐｉｓ。

ＤｉｒｏｆＩＩａｒｌａ　１１ｍ１ｔｉｓ　、ＴＯＸＯｅａｒａ種の幼虫、Ｎｅ ｃａｔｏｒａｍｅｒｉａａｎｕｓ、＾ｎｃｙ＋ｏｓｔｏ＊ａ　ｄｕｏｄｅｎａｌ ｅ　、ＡｓｃａｒｉｓＩｕｍｂｒｉｃｏｔｄｅｓ、　Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｔｒ ｌｃｈｉｕｒａ　、　ＥｎｔｅｒｏｂｔｕｓｖｅｒＩＩｌｊｃｕｌａｒｕｓ　、 　Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ　５ｔｅｒｃｏｒａｌｉｓおよびＷｕｃｈｅｒｅ ｒｊａ　ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、特にＴｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙ＋ｕｓｃｏｌｕ ｂｒｉｆｏｒｍｊｓ及びＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓがある。

本発明の第二の態様によれば、第一の態様の抗原の相同体であって、これを宿主 動物に投与すると寄生性線虫種による感染から宿主を防御することができること を特徴とする、相同体が提供される。典型的には、この相同体は、本発明の抗原 のアミノ酸配列に対して２０アミノ酸に亙って少なくとも７０％相同である。

本発明の第三の態様によれば、本発明の抗原または相同体をコードするポリヌク レオチド分子が提供される。

好ましくは、このポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡ分子である。本発明によるＤ ＮＡ分子にはｃＤＮＡ分子がある。

本発明の第四の態様によれば、第三の態様のＤＮＡ分子とベクターＤＮＡとを有 して成る組換えＤＮＡ分子が提供される。

典型的には、ベクターＤＮＡ分子は、プラスミド、ファージまたはウィルスＤＮ Ａから成っている。

本発明による好ましいベクターには、λｇｔｌｌ、ｐＵＲ２９０、ｐＵＲ２９１ ＳｐＵＲ２９２、ｐＵＫ２７０．ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＺｉｐＮｅｏｓＳＶ４ ０を基材とするベクター、λｇｔｌＯ１ＥＭＢＬベクター、ｐＢＲ３２７、ｐＢ Ｒ３２９またはｐａｒ遺伝子座を含むｐＢＲ３２９、バキュロウィルス、または ワクシニアウィルスがある。

本発明の第五の態様によれば、第四の態様の少なくとも一つの組換えＤＮＡ分子 で形質転換した形質転換宿主が提供される。

典型的には、この宿主は、細菌、酵母、他の黴類、昆虫、植物および噛軌類の細 胞ラインから選択される。

好ましい宿主は、大腸菌に１２誘導体である。

本発明の第六の態様によれば、本発明の抗原または相同体を有する第五の態様の 形質転換した宿主の発現生成物が提供される。

この発現生成物は、融合生成物であってもよい。

本発明の第七の態様によれば、本発明の抗原、相同体または発現生成物の総てま たは部分に対応する合成ポリペプチドであって、宿主動物に投与するとき、寄生 性線虫による宿主動物の侵襲に対して防御免疫を誘導することができる合成ポリ ペプチドが提供される。

本発明の合成ポリペプチドは、本発明の抗原、相同体、及び発現生成物の既知の 配列に基づいてペプチド合成の標準的手法によって調製される。

本発明の第への態様によれば１、第一の態様の少なくとも１種類の本発明の抗原 、相同体、発現生成物および／または合成ポリペプチドの有効量を製薬上および ／または獣医学上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバント と共に含んで成るワクチンが提供される。本発明のワクチンはまた、本発明の抗 原、相同体、発現生成物および／または合成ポリペプチドを模造することによっ て寄生性線虫による感染から宿主を防御することができる少なくとも１種類の抗 −イディオタイプ抗体を含むこともできる。この活性成分に、製薬上および／ま たは獣医学上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを添 加してもよい。

或いはまた、このワクチンは、第五の態様の形質転換した宿主を製薬上および／ または獣医学上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントと 共に含む全細胞ワクチンであってもよい。この細胞は、生細胞であっても、死細 胞であってもよい。形質転換した細胞には、予防接種を行う宿主の粘膜に投与す る発現生成物を発現することができるもの、例えば細胞表面融合生成物がある。

典型的には、本発明のワクチンは、予防接種した宿主に、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌ ａ　、　Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ＳＳｔｒｏｎｇｙｌｕｓ。

Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙ＋ｕｓＳＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ、　ｏｓｔｅｒｔａ ｇｔａ、　Ａｓｃａｒｉｓ　５ＴｏｘａｓｃａｒｉｓＳＵｎｃｉｎａｒｉａ　５ Ｔｒｌｃｈｕｒｉｓ　５Ｄｉｃｔｙｃａｕｌｕｓ　。

Ｄｉｒｏｆｌｌａｒｆａ　、　Ｔｏｘｏｃａｒａ、　Ｎｅｃａｔｏｒ　５Ｅｎｔ ｅｒｏｂ１ｕｓ。

ＳｔｒＯｎｇ３’１Ｏ１ｄｅＳ及びＷｕｃｈｅｒｅｒｉａ属、具体的にはＴｒｉ ｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙ［ｕｓ及びＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ属の種のような寄生性線 虫による感染に対して防御免疫を誘導する。このような種の例には、ヒトのＴｒ ｉｃｈｆｎｅｌｌａ　５ｐｉｒａＩｉＳまたはＡｎｃｙｌｏｓｔｏｒａａ　ｃａ ｎｉｕｍｓウマのＳｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ｓヒ゛ンジ及びヤ ギの丁ｒｊｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ、ヒツジ 及びヤギのＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｅｏｎｔｏｒｔｕｓ、ウシのＯｓｔｅｒｔａ ｇｉａ　ｏｓｔｅｒｔａｇｌ、ブタのＡｓｃａｒｉｓ　ｓｕｕｍまたはＴｒｉｃ ｈｉｅｌｌａ　５ｐｉｒａｌｉｓ　、ネコのＴｏｘａｓｃａｒｉｓ　１ｅｏｎｉ ｎａまたＴｏｘｏｃａｒａ種の幼虫、或いはＮｅｃａｔｏｒ　ａｍｅｒｊｃａｎ ｕｓ。

Ｄｉｃｔｙｃａｕｌｕｓ　ｖｉｖｉｐａｒｕｓ　、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ｄ ｕｏｄｅｎａｌｅ　％＾５ｃａｒｆｓ　ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、　Ｔｒｉｃ ｈｕｒｌｓ　ｔｒｉｃｈｉｕｒａ　。

Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ　ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｕｓ　、　Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｌ ｄｅｓＳｔｅｒｃＯｒａｌ　ｉｓおよびＷｕｃｈｅｒｅｒｉａ　ｂａｎｃｒｏｆ ｔｉ、特にＴｒｌｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒｌｆｏｒｍｌｓ及 びｕａｅｓｏｎｃｈｕｓｅｏｎｔｏｒｔｕｓによる感染がある。

本発明の第九の態様によれば、本発明の抗原、相同体、発現生成物、合成ポリペ プチドまたはワクチンに対して生じる抗体が提供される。

本発明の抗体には多クローン性及び単クローン性抗体があり、抗体調製の標準的 手法にしたがって調製される。

本発明の策士の態様によれば、第九の態様の少なくとも１種類の抗体と製薬上お よび／または獣医学上許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤とを含んで 成る抗体組成物が提供される。

本発明の策士−の態様によれば、本発明の抗原、相同体、発現生成物または合成 ポリペプチド及び本発明の抗体を含んで成る診断用キットが提供される。

本発明の第十三の態様によれば、第六の態様の発現生成物の生合成法であって、 第五の態様の形質転換宿主を提供し、適当な条件下で宿主を培養して発現生成物 を発現させ、形質転換宿主から発現生成物を収集することから成る方法が提供さ れる。

本発明の第十三の態様によれば、寄生性線虫種による侵襲から宿主を防御する方 法であって、少なくとも１種類の本発明の抗原、相同体、発現生成物、合成ポリ ペプチドおよび／またはワクチンを宿主に予防接種することから成る方法が提供 される。

本発明の第土日の態様によれば、第四の態様の組換えＤＮＡ分子の調製法であっ て、第三の態様のＤＮＡ分子をベクターＤＮＡに挿入することから成る方法が提 供される。

本発明の第十三の態様によれば、第五の態様の形質転換宿主の調製法であって、 宿主を形質転換に適合させ、コンピテント宿主を提供し、このコンピテント宿主 を第四の態様の組換えＤＮＡ分子で形質転換することから成る方法が提供される 。

本発明の策士六の態様によれば、第九の態様の抗体の調製であって、免疫応答性 宿主を、少なくとも１種類の本発明の抗原、相同体、発現生成物、合成ポリペプ チドおよび／またはワクチンで免疫感作することから成る方法が提供される。

本発明の策士七の態様によれば、第への態様のワクチンの調製法であって、少な くとも１種類の本発明の抗原、相同体、発現生成物、合成ポリペプチドおよび／ または形質転換宿主および／またはアンチイディオタイプ抗体の有効量を、製薬 上および／または獣医学上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジ ュバントと混合することから成る方法が提供される。

本発明の策士への態様によれば、策士の態様の抗体組成物の調製法であって、第 九の態様の抗体の有効量を製薬上および／または獣医学上許容可能な担体、希釈 剤、および／または賦形剤と混合することによって提供される。

本発明の策士九の態様によれば、寄生性線虫の種に対して宿主を受動的に予防接 種する方法であって、第九の態様の抗体または策士の態様の抗体組成物を宿主に 投与することから成る方法が提供される。

アミノ酸およびヌクレオチド配列の変化は、特定のタンパク質およびこのタンパ ク質をコードする遺伝子（類）の異なる対立型の間で起こることができることが 認められている。更に、一旦特定の遺伝子またはタンパク質の配列が知られると 、熟練した当事者であれば、利用可能な手法を用いてこれらの配列を操作して、 それらを得られた特異的な配列から変化させて、関連している遺伝子またはタン パク質と同様に機能し続ける遺伝子またはタンパク質を提供することができるで あろう。これらの分子を本明細書では「相同体」と呼び、これも本発明に包含さ れるものとする。

これに関して、「相同体」は、基本的な機能的属性、すなわち本発明の抗原の防 御活性を保持するポリペプチドであり、これは本発明の抗原と相同である。この 説明のために、２つの配列の間の「相同性」は、第一の配列の誘導を第二の配列 から示唆している同一性には及ばなに亙って約７０％を上回る同一性を示すとき には、このポリペプチドは本発明や抗原に「相同」である。このような配列の比 較は既知のアルゴリズム、例えばリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）とピアソン（Ｐｅ ａｒｓｏｎ）　、５ｃｉｅｎｃｅ、　２２７．１４３５（１９８５）に記載のア ルゴリズムであって、コンピューターによって容易に実現されるものによって行 うことができる。

相同体は、本発明によれば、従来の特定部位の突然変異誘発によって生産するこ とができ、この方法は、生成するポリペプチドを生物学的に不活性にすることな く修飾することができる分子の残基を日常的に同定する一つの方法である。［１ コ所望なヌクレオチド置換（突然変異）を含む配列を有するオリゴヌクレオチド の合成、［ｉｉ］このオリゴヌクレオチドの、本発明の抗原をコードする構造配 列を有する鋳型へのハイブリダイゼーション、および［０１］　Ｔ４ＤＮＡポリ メラーゼを使用するオリゴヌクレオチドのプライマーとしての拡張から成るオリ ゴヌクレオチドの突然変異誘発は、特定の変化の抗原構造配列への影響を決定す るのに容易に利用できるので好ましい。

それは相対的に費用が掛かるので、別の既知の直接突然変Ｒ誘発法の法が有利に なることがある。

本発明の抗原相同体のもう一つの例は、抗原の一部に対応するまたは天然の分子 と一致することはない抗原の一部からなり且つ本発明の抗原の防御活性を示す分 子である。

本発明の他の相同体は、防御活性を保持する抗原の断片である。同様に、本発明 の範囲内には、（１）抗原のアミノ酸配列の一部に対応し、（１１）抗原の活性 を保持する合成ポリペプチドがある。このような合成ポリペプチドは、好ましく は長さが６〜３０アミノ残基である。

基準（ｉ）に適合する合成ポリペプチドが基準（ｉｆ）も満足するかどうかは、 適当な宿主で防御活性を測定することによって日常的に決定することができる。

本発明は、寄生性線虫による侵襲に対して哺乳類の宿主を防御する方法であって 、哺乳類の宿主に、少なくとも１種類の本発明の抗原、相同体、発現生成物、合 成ポリペプチドおよび／またはワクチンを予防接種することから成る方法を提供 するものである。本発明のワクチンは、標準的手法を用いて配合することができ る。

単一投与形態を生成するために担体と結合できる抗原、相同体、発現生成物およ び／または合成ポリペプチドの量は、予防する侵襲、治療を行う宿主及び投与の 特定の様式によって変化するであろう。

任意の特定の宿主に対する特異的な投与量水準も、用いられる特異的な抗原、相 同体、発現生成物および／または合成ポリペプチド、年齢、体重、全般的な健康 、性別、食餌、投与回数、投与経路、排出速度、薬物の併用なとの各種の要因に よって変化する。

本発明のワクチンは、非経口的にまたは粘膜経路により潜在的に、所望により通 常の毒性のない製薬上および／または獣医学上許容可能な担体、希釈剤、アジュ バントおよび／または賦形剤を含む投与単位処方で投与する　′ことかできる。

または湿潤剤および懸濁剤を用いて配合することができる。無菌の注射可能な製 剤は、毒性のない非経口投与可能な希釈剤または溶媒の無菌の注射可能な溶液ま たは懸濁液、例えば１，３−ブタンジオールの溶液であってもよい。用いること ができる許容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル溶液および等張塩化 ナトリウム溶液がある。更に、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁い不揮発性 油を用いることができる。更に、オレイン酸のような脂肪酸も、゛注射用製剤に 用いられる。

現在のところ、ミョウバンは、ヒトでの使用に唯一登録されているアジュバント であるが、ヒトでの使用の他のアジュバントについて実験研究が行われており、 これらの他のアジュバントが本発明によるヒト予防接種用の組成物の調製に用い るのに好適であることが期待されている。

動物の予防接種に好適なアジュバントには、フロイントの完全または不完全アジ ュバント（家畜への使用は不適）、マルコール（Ｍａｒｃｏｌ）　５２　：モン タニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）８８８（マルコールはエツゾ（Ｅｓｓｏ）の商標 である。モンタニドは５ＥＰＰＩＣ，パリの商標である）、スクアランまたはス クアレン、アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ）６５　（ビーナツツ油、マンニド モノオレエートおよびモノステアリン酸アルミニウムを含有）のような油性エマ ルジョン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウムおよび ミョウバンのような鉱質ゲル、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リソ レシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムプロミド、Ｎ、Ｎ−ジオクタデ シル−Ｎ’　、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン、メトキ シヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオールのような洗浄剤、ピ ラン、デキストランスルフェート、ポリアクリル酸およびカーボボールのような ポリアニオン、ムラミルジペプチド、ジメチルグリジン、タフトシンおよびトレ ハロースジミコレートのようなペプチドおよびアミノ酸が挙げられるか、これら に限定されない。本発明の抗原、前駆体、発現生成物および／または合成ポリペ プチドは、リポソームまたは他の微小担体中に組み入れた後または多糖類、タン パク質またはポリマーに結合させた後またはフィール（Ｑｕｔ　ｌ）　−Ａと配 合して「イスコニス（Ｉｓｃｏｃｎｓ）Ｊ　（免疫刺激錯体（Ｉｍｉｕｎｏｓｔ ｆｍｕｌａｔｌｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）　）を形成して、の一体重な膜タン パク質とから成る抱合体がある。

（ＰＣＴ／ＡＵ８７１００１０７を参照されたい）。

投与経路、投与量並びに注射の頻度は総て、当該技術分野における通常の技術を 用いて最適にすることができる因子である。典型的には、最初の予防接種がら数 週間後に１回以上の「ブースターＪ予防接種を行い、その真の効果は、細胞およ び体液での強力な免疫応答の生産である。

図面の簡単な説明 図１は、Ｃｆ、ＣｆＬＬ−１ｃｆＬＬ＋（ＭＭ）及びＣｆ　ＬＬ　（ＳＤＳ／Ｈ ＯＡｃ）　画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

図２は、４０ｋＤの抗原をコードするｃＤＮＡクローニングｐＢＴＡ９８３の配 列を示す。

図３は、サザンプロットが示されており、他の種の線虫に、４０ｋＤ遺伝子に関 連した遺伝子があることを示している。

図４は、ウェスターンプロットが示されており、組換え抗原は、元の４０ｋＤ抗 原の部分に対する抗血清と反応することを示している。

図５は、ウェスターンプロットが示されており、イヌの心糸状虫り、　１ｇｍ１ ｔｉｓにはＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ由来の４０ｋＩ抗原に関連している抗原があ ることを示している。

発明を実施する最良の方法 本発明の組換えＤＮＡ分子及び形質転換宿主を分子」物学の標準的な手法を用い て得た。

本発明の発現生成物は、特定の宿主細胞に好適な標埠的条件下で本発明の形質転 換宿主細胞を培養し、標準的手法により培養物から発現生成物を分離することに よって得られる。この発現生成物は、不純な形態で用いてもよく、または発現生 成物を生産するのに好適な標準的手法によって精製してもよい。

好適な場合には、全細胞をワクチンに用いてもよい。

本発明の合成ポリペプチドは、本発明の抗原、相同体または発現生成物の既知の 配列に基づいて化学的ペプチド合成の標準的手法によって調製される。

本発明の相同体、発現生成物、合成ポリペプチド、アンチイディオタイプ抗体及 びワクチンは、例に記載の方法で容易に分析され、本発明の抗原の防御効果を保 持するするかどうかを決定することができる。

組換えＤＮＡ手法を用いて、本明細書に記載の防御抗原または相同体を多量に提 供することができる。防御抗原または防御抗原の前駆体または相同体をコードす るＤＮＡセグメントを任意の数の組換えプラスミド系に挿入して、この分子を多 量に合成できるようにすることがＤ　できる。組換え系には、大腸菌、酵母及び バキュロウィルス系及びワクシニアのようなウィルスがある。組換え・　生物は 、醗酵槽中で多、量に成長させることができ、組換主　え抗原は標準的方法、例 えば、尿素及びＤＴＴまたはメルカプトエタノールのような還元剤を含む溶液中 での可―　溶化、還元し、酸化したグルタチオンのような試薬の存内　右下での 再生、イオン交換、濾過および／またはゲル浸透クロマトグラフィによる精製、 最後に濾過によって殺ｂ　菌し、油状物のような多数のアジュバントの任意のも の１　でアジュバント化によって精製することができる。

本発明のワクチンは、少なくとも１種類の本発明の抗原、相同体、発現生成物、 合成ポリペプチドおよび／まＫ　たは形質転換宿主および／またはアンチイディ オタイプ抗体を、製薬上および／または獣医学上許容可能な担体、賦形剤および ／またはアジュバントと、製薬および／または獣医学的調製の標準的方法を用い て混合、好ましくは均質に混合することによって調製される。

単一投与形態を生成するのに要する抗原、相同体、発現生成物、合成ポリペプチ ドおよび／または形質転換宿主および／またはアンチイディオタイプ抗体の量は 、予防接種を行う感染症、治療する宿主、及び投与の特定の様式によって変化す る。任意の特定の宿主に対する特異的な投向量水準は、用いた抗原、相同体、発 現生成物および／または合成ポリペプチドの活性、宿主の年齢、体重、全般的な 健康、性別及び食餌、投与回数、投与経路、排泄速度及び薬物の配合のような各 種の因子によって変化する。

ワクチンは、通常の毒性のない製薬上および／または獣医学上許容可能な担体、 希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを所望により含む単位投与配合物で 非経口的に投与してもよい。

抗体は、適当な宿主において標準的な予防接種法を用いて精製させる。宿主を、 本発明の抗原、相同体、発現生成物、合成ポリペプチドおよび／ま゛たはワクチ ンで予防接種するのである。

アンチイディオタイプは、本発明の抗原、発現生成物、相同体および／または合 成ポリペプチドを適当な宿主に予防接種し、生成する抗体を用いて第一の予防接 種において生じた抗体の抗原結合領域に対して抗体を生じさせることによって生 成される。

抗体組成物は、抗体を、製薬上および／または獣医学上許容可能な担体、希釈剤 および／または賦形剤と、製薬調製の標準的方法を用いて混合、好ましくは均質 に混合することによって調製される。

単一投与形態を生成するのに要する抗体の量は、治療を行う感染症、治療する宿 主、及び投与の特定の様式によって変化する。任意の特定の宿主に対する特異的 な投与量水準は、用いた抗体の活性、患者の年齢、体重、全般的な健康、性別及 び食餌、投与回数、投与経路、排泄速度、薬物の配合及び治療を行う感染症の重 さのような各種の因子によって変化する。

抗体組成物は、通常の毒性のない製薬上および／または獣医学上許容可能な担体 、希釈剤および／または賦形剤を所望により含む単位投与配合物で非経口的に投 与して、宿主を線虫の感染から受動的に防御することができる。

診断キットは、発現生成物、抗体、抗原、合成ポリペプチドまたは相同体を、検 出を行う物質（類）に対して好適な濃度で、製薬上および／または獣医学上許容 可能な担体、希釈剤および／または賦形剤と配合することによって調製される。

検出を行う物質の既知の濃度の陽性のコントロール標準も同様に調製される。陰 性の標準は、担体、希釈剤および／または賦形剤のみから成っている。

本発明を下記の例に関して更に説明するが、これらの例は本発明の範囲を制限す るものではない。

例１ 感染力を有するＨ、　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの幼虫から培養液の調製ＪＪ、　ｃｏ ｎｔｏｒｔｕｓに感染したヒツジの糞便から幼虫を培養し、使用前１０℃で２週 間保管した。この時点で、２５マイクロｍのメツシュの篩を通して移した約２× １０７の幼虫を集め、洗浄した。次に幼虫を２０１ホウ酸緩衝液中で懸濁させて 脱硝し、４０％ＣＯ２−６０％Ｎ２を４０℃で通気した。脱硝液は、グツフナ− 漏斗上で洗浄して除去し、幼虫をベルマナイズ（Ｂａｅｒ層ａｎｌｚｅｄ）　し て鞘を除去した。虫を、ペニシリン（２００単位／１）及びストレプトマイシン （２００マイクロｇ／観１）を服務ＧＫＮ培地（ＧＩＢＣＯ）で洗浄し、同じ培 地で、ローラーボトル培養中に（約２００，０００個の虫／ｍ１）３７℃で７２ 〜１４４時間インキユベーシッンした。虫の生命力を目視で観察したところ、大 まかには〉９５％が生きており、３０〜４０％は第四段階へと成長していた。

幼虫を遠心分離により除去し、上澄液をアミコンＹＭ−１０メンプランを用いて 限外濾過により１０倍に濃縮した。保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を「培養液」 呼ぶ。

例２ 培養液によるモルモットの予防接種 培養液を、例１に記載したのと同じ感染性の幼虫から調製した。この物質を用い て、オドンネル（０°Ｄｏｎｎｅｌ　ｌ）ら（１９８５年）の方法を用いて、モ ルモットの腹腔内に接種した。２１日後にモルモットに１０００匹のＨ，ｃｏｎ ｔｏｒｔｕｓＬ　３幼虫（脱硝）を感染させ、攻撃開始から５日後に層殺して虫 の数を数えた。培養液はそれぞれの実験では、実験番号２７７の７２〜１４４時 間の培養液の場合を除き、極めて有意に防御された（寄生の６４〜９０％の減少 ）０〜７２時間培養時間が最適であったので、それぞれの次の実験で用いた。

表１ ＨｃＬ３培養液によるモルモットの防御実験　群　培養時間　注入量　ｎ　虫数 　防御番号　（時間）　（μｇ）、　（１） ２７３　フントトル　−８７１７±２７６　−接種物　０−７２　５０　８　１ ２４±７８８３２７７　コントロール　−８８４９±１９２　−接種物　０−７ ２　５０　８　３０３±１９７　６４接種物　７２−１４４　５０　５　８０８ ±１３９５２７９　プツトロール　−　１０　１．０３７±１０３　−接種物　 ０−４８　５０　５　２４４±１３８　７７接種物　４ｇ−１２０５０５１２９ ±４５８８２８５　コントクール　−５６１２±２６４　−接種物　０−７２　 ５０　５　８３±３７９０表１の脚注 接種物は培養液と共に腹腔内に注入した。動物を、２１日目に１０００匹の幼虫 で攻撃し、攻撃開始から５日目に層殺して虫の数を数えた。

培養液を、アミコンＹＭ−３０メンプラン上で限外濾過により２０倍に濃縮し、 保持物をトリス−緩衝食塩水（ＴＢ　Ｓ　；　２０ｗＭトリス、１５０１ＭＮａ ＣＩ、ｐＨ７，２）に対して透析した。濃縮培養液を、予めグルタルアルデヒド で架橋しておいたレンチルレクチンセファロース−４Ｂ（ファルマシア）でイン キュベーションした。

（シーア（Ｓｃｈｅｒ）ら、１９８９年）。スラッジを４℃で一晩混合した後、 遠心分離を行いビーズ除去し、３×１５ｇｔＴ　Ｂ　Ｓで洗浄した。特異的に結 合した糖タンパク質を、ＴＢＳ中０．２Ｍメチル−Ｄ−マンノシドでビーズを室 温で２時間インキュベーションすることによって溶出し、ＬＬ＋（ＭＭ）と表わ す。更に強力に結合している物質は、次に０，２％５ＤＳ１０．１Ｍ酢酸で溶出 し、２ＭトリスｐＨ８，８で中和し、これをＬＬ　（ＳＤＳ／　ＨＯＡ　ｃ　） と表わした。還元条件で５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したところ（図１）、Ｌ Ｌ　画分はいずれも見掛けの分量が約４０ｋＤの主バンドを含んでいた。

例４ レンチルレクチンで分画した培養液によるモルモットの予防接種 レンチルレクチン吸収による培養液から調製した物質を用いて、モルモットの腹 腔内に接種した。種として４０ｋＤ抗原を含むＬＬ　（ＭＭ）及びＬＬ　（ＳＤ Ｓ／ＨＯＡｃ）画分は、続いてモルモットをＩｌ、　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓで攻撃 したところ極めて有意な防御を生じた（表２）。しを引き出すことができること は明らかである。非結合（ＬＬ−）画分も防御性であったが、これはレンチルレ クチンビーズに結合していない幾らかの４０ｋＤ物質の存在によるものと思われ る。

表２ モルモット（７）ＹＭ−３０ｍ縮培養液（Ｃｆ　（Ｙ’Ｍ−３０）］及びこれか らレンチルレクチン吸収により誘導される画分の防御性 実験　群　抗原　注」　ｎ　虫数　防御番号　（μｇ）　（Ｕ ３０１　コントロール　−５３１１±１４２　−接種物　Ｃｆ（ＹＭ−３０＞　 ２５０　５　４９±６０８４接種物　Ｌｌ、”−２００５９６±８８７２接種物 　ＬＬ”（ＭＭ）　５０　５　５０±４８８５３１．８　フントロール　−６４ ６８±１２９　−接種物　Ｃｒ１４０　５　１３Ｂ＋１１５　７１接種物　ＬＬ −１００５８２±３８８２接種物　しＬ電ＭＭ）　５（１５７２±６６８５接種 物　Ｌｌ、”　５０　５　２１±１０９６（ＳＤＳ　／　ＨＯＡｃ） 表２の脚注 接種物は関連抗原と共に腹腔内に注入した。動物を、２１１日目１０００匹の幼 虫で攻撃し、攻撃開始から５日目に屠殺して虫の数を数えた。

例５ ４０ｋＤ抗原のエンドプロテイナーゼＩｙｓ−Ｃによる消化、ペプチドの分離及 びペプチドのアミノ酸配列の決定 例３に記載の方法で精製した４０ｋＤの抗原的２５μｇを、５−Ｎジチオスレイ トール及び８Ｍ尿素を含む０．２Ｍ）リス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８，５３と混合 した後、４２℃で３０分間インキユベーシッンした。次いで、溶液を室温まで冷 却し、ヨード酢酸ナトリウムを最終濃度１５−Ｈまで加えた。暗所で３５分間放 置した後、冷メタノールを９：１（メタノール：試料、容量／容量）の比率で加 えた。試料を一２０℃に一晩保存し、遠心分離し、上澄液を吸引して、沈澱を乾 燥した。

沈澱を２Ｍ尿素ｐＨ８，５を含む０．　ＩＭ　トリス−ＨＣｌ緩衝液４５μｌに 溶解した後エンドＬｙｓ−Ｃ（１００μｇ／ｍ１）４μｍを加えた。３７℃で５ 時間後、更に酵素を４μｌを加え、消化を更に１５時間継続した。

消化物にトリフルオロ酢酸を最終濃度１％まで加えて酸性にし、バイダック（Ｖ ｙｄａｃ）　Ｃ−４カラムに０．１％トリフルオロ酢酸中でただちに加えた。ペ プチドは０．１％トリフルオロ酢酸中５〜６０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル／水 の線形グラディエンドで溶出した。必要であれば、ペプチドは同じ溶媒系でアク アボア（＾ｑｕａｐｏｒｅ）　ＲＰ−３００Ｃ−８カートリツジを用いて再クロ マトグラフィを行った。ペプチドを集めてアプライド・バイオシステニス４７０ Ａアミノ酸シーケンサ−に直ちに入れた。

得られたペプチド配列を表３に示す。

表３ ４ＱｋＤ抗原から誘導されるアミノ酸配列ＩＫ＋　’　（０１２Ｐ　Ｎ　Ｔ　Ｐ 　Ｌ　Ｇ　Ｐ　Ｋ（Ｋｌ’　（Ｌ）２Ｓ　ＬＭ、Ｇ　ＮＡＹＲＴＬＡ　（Ｄ）２ （Ｘ）５（Ｇ）’　Ｖ　Ｆ　（Ｘ）５Ｙ　ＩＰｌ’Ｐ（ｖ）３ （ＫＩ”ＥＮ）２　ｆ刈５　ＥＴＳＥＰＰＰＤＥＦ　（Ｘ）’　（Ｇ）’Ｑ）　 （Ｘ）５　（Ｇｌ’更に、未消化の４ＱｋＤ抗原［ＬＬ　（ＭＭ）］を配列決定 して、アミノ末端配列を決定した。

Ａ　Ｋ　ＫＮＹＥ？ＳＥＰＰＰＤＥＦＭ　ｆＸｌ’ＱｒＸＧ丁丁！（（Ｘ１５Ｐ ＥＫ（Ｄｌ　３（Ｔｌ　’　［１’　（Ｋｌ　’注： ペプチドの評価に当たっては次の仮定を行った。番号１〜５は前記の配列におけ る肩数字を表わす。

１、リジン（Ｋ）はＥｎｄｏＬｙｓ−Ｃの特異性に基づいてそれぞれのペプチド について決定された最初のアミノ酸に優先するものと仮定した。

２、この位置は多数のアミノ酸を含んでいたが、最もモル比が高いものを挙げた 。不確定性は括弧に示した。

３、　２μ以上のアミノ酸が検出された。

４、これらのアミノ酸は、予想よりも低いモル比で検出されたが正しいものと考 えた。

５、Ｘで示された位置に確信を持って帰結し得るアミノ酸を見出すことができな かった。

（ａ）　オリゴヌクレオチドの合成 例５に記載のアミノ酸配列から、４０ｋＤの抗原をコードする遺伝子（類）を同 定するためのｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いる ことができるオリゴヌクレオチドを設計することができた。

更に、このオリゴヌクレオチドはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキ（Ｓ ａｉｋｉ）ら、１９８８年）におけるオリゴ（ｄＴ）と共に用いて、４０ｋＤタ ンパク質をコ−ドするＤＮＡを特異的に増幅することができた。

下記の多縮重ブライ？　−（ｍｕｌｔｉｐｌｙ−ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉｇ ＋ｅｒｓ）　（Ａ　１４０／　３０１、Ａ１４０／３０２及びＡ　１４０／３０ ３）を、アプライド・ノ（イオシステム・モデル３８０Ａ自動化ＤＮＡ合成装置 で設計して合成した。必要なアミノ酸配列をコードするのに必要なヌクレオチド に追加のヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５′末端上に含まれた。これら の配列は、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａｌの部位をコードして、ＰＣＲで増幅 したＤＮＡの適当なベクターへのクローニングたすける。ＰＣＲで用いられるた め、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ制限部位を含むオリゴ（ｄＴ）プライマーも合成し た。

（１））　ＲＮＡ単離及びｃＤＮＡライブラリーの構築総ＲＮＡを、ファルマシ アから購入したＲＮＡ抽出キット（カタログ番号ＸＹ−０１６−００−０１）を 用０てＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓｌ　ｇ　（湿重量）から単離した。脱硝した（ｅ ｘｓｈｅａｔｈｅｄ）　Ｌ　３ステージの寄生虫を感染させて力１ら１５日後に 、ヒツジの皺胃から幼虫を得て、液体窒素中で手早く凍結した後−７０℃で保存 した。ＲＮＡを抽出するため、凍結した虫を液体窒素下で微粉砕し、７＋ｇｌの 抽出溶液（グアニジンチオシアネート、Ｎ−ラウリルザルコシン及びＥＤＴＡを 含む緩衝した水性溶液；２５℃における密度−１，１５ｇ／ｉｔ）に加え、１３ Ｘ５１ｍｍのポリアロマ−チューブ中２Ｘ１．２５ｍ１のＣ５ＴＦＡ（ＣｓＴＦ Ａを含む緩衝した水性溶液；２５℃における密度−１，５１ｇ／ｍｌ）のクッシ ョンに重層した。このクラティエントラ、Ｌ８−７０べ・ツクマン（Ｂｅｃｋｍ ａｎ）超遠心機で５Ｗ５０．１０−ターを用いて３１．００Ｏｒｐｍで、１５℃ で１６時間遠心分離した。遠心分離の後、ＲＮＡのベレットをＴＥ緩衝液（１０ ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解し、−２５℃でエタ ノールから再沈澱した。次に、沈降したＲＮＡを再度ＴＥに溶解し、オリゴ−（ ｄＴ）−セルロースカラム（ファルマシアｍ　ＲＮ　Ａ精製キ・ット、カタログ 番号ＸＹ−０１２−００−０２）中で、製造業老によって露己載された方法で遠 心分離することによって更１こ精製した。

得られる精製したポリ（Ａ）　＋ＲＮＡを、フアルマシアｃＤＮＡ合成キット（ カタログ番号ＸＹ−００３−００−０３）を用いてｃＤＮＡライブラリーを構築 するのに用いた。簡単に説明すれば、３２５ｍｇの総ＲＮＡから精製したポリア デニル化ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライムドｃＤＮＡ合成のための鋳型として 用い、モロニーのネズミ白血病ウィルス逆転写酵素（ＭｏｌｏｎｅｙＭｕｒｉｎ ｅ　ＬｅｕｋａｅＩＩＩａ　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ ｔａｓｅ）テ処理した。第二の鎖ｃＤＮＡの合成は、ＲＮアーゼＨおよび大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて行った。次に、２水路ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラ ーゼのフレノウフラグメントで処理し、）：ｃｏＲＩ／Ｎｏ　ｔ　Ｉアダプター に連結した。次いで、ｃＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでインキュベー ションして、これをホスホリル化して、ＥｃｏＲＩで消化して脱ホスホリル化し たラムダｇｔｌＯアームに連結し、イン・ビトロで感染性のバクテリオファージ 粒子中に包装した。ラムダｇｔｌＯアーム及び包装ミックスは、プロメガ（Ｐｒ ｏＩｌｅｇａ）　（プロトクローン・ラムダｇｔｌｏシステム及びバッカジーン ・システム）から得た。用いた方法は製造業者によって指示された通りであった 。包装されたｃＤＮＡを大腸菌Ｃ６００Ｈｆｌに移し、１０　ｍＭＭ　ｇ　Ｓ　 ０４を含むルリア（Ｌｕｒｉａ）トップ寒天を用いてルリア寒天プレート上で培 養した。

総数で６Ｘ１０７１）ｒｕが得られ、その内の９８％が組換体であった。平均イ ンサートの大きさは２．０ｋｂｐであった。

（Ｃ）　組換えライブラリーのスクリーニング用のＤＮＡプローブの調製 ４０ｋＤの抗原特異性の二本鎖ＤＮＡプローブを、ＰＣＲを用いて調製した。用 いた方法はサイキ（Ｓａｉｋｌ）ら簿たクローン化した形態のＴａｑポリメラー ゼを用いた。２ｍｇの総ＲＮＡを、６μｍの水中で１１００ｎのオリゴ（ｄ、Ｔ ）ＰＣＲプライマーに、７０℃で５分間加熱した後、室温まで放冷することによ ってアニールした。

アニールしたＲＮＡ−オリゴ（ｄＴ）を、次に５０ｆｆ１ＭトリスーＨＣｌ　（ ｐＨ８，３）　、７５ｓ＋ＭＫＣＬ　１０ｍＭＭｇＣ１２，５ｄスペルミジン、 １０■ＭＤＴＴ、１単位のＲＮアシンの存在下にて、最終容積が２５μｌて２０ ０単位の逆転写酵素（ＢＲＬ）と共に、３７℃で１時間インキュベーションした 。逆転写酵素を省いた同様な反応を、ＰＣＲのネガティブコントロールとして用 いた。

ＰＣＲは、前記のようにして製造したｃＤＮＡ上で行った。反応混合物は、１ｍ ｇの総ＲＮＡ５Ａ１４０／３０１、Ａ１４０／３０２またはＡ１４０／３０Ｂの 一方をそれぞれ１μＭ及びｌμＭオリゴ（ｄＴ）ＰＣＲプライマー、それぞれの ｄＮＴＰを２００ｃｚＭ、５０５ＭＫＣｌ、１０５Ｍトリス−ＨＣ１（ｐＨ９， ０）　、２ｍＮＭｇＣＩ　２．０．０１％ゼラチン、０．０１％トライトンＸ− １００及びＴａｑポリメラーゼ２単位として総容量を１００μｍとしてものから 合成された第一の鎖状ｃＤＮＡを含んでいた。増幅は２５サイクルに亙って行い 、それぞれのサイクルは９４℃での１分間の変性、４０℃での２分間のアニーリ ング、及び７２℃での３分間の拡張から成っていた。

それぞれのＰＣＲ反応の試料を、反応終了時に０．８％アガロースゲル上で分析 した。

プライマーＡ　１４０／３０１とオリゴ（ｄＴ）を含む反応では、約７００ｂｐ の独特なバンドが観察された。

数個の他のバンドが存在したが、これらのバンドはオリゴ（ｄＴ）のみを用いた 反応でも見られた。プライマーＡ１１２／３０２を用いたときには、約７００ｂ ｐのバンドは見られなかった。逆転写酵素を省いたネガティブコントロール反応 では、バンドは見られなかった。

特異的な７００ｂｐＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル上で精 製し、通常の手法（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２年）を用いて ｐＵｃ１９に連結し、ジデオキシ連鎖停止法（アメルシャム・マイクロタイター ・プレート・シーフェンシング・キット（＾ｍｅｒｓｈａｍ　Ｍｉｃｒｏｔｉｔ ｒｅ　Ｐｌａｔｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｒｎｇ　Ｋｊｔ）、カタログ番号ＲＰＮ１５ ９０）を用いて配列決定した。クローンの両端の配列分析から、５′末端にはプ ライマーＡ　１４０／３０３及び３′末端にはポリ（Ａ）ストレ・ソチの配列が 含まれていることが確かめられた。５′末端からのクローニングへのＤＮＡ配列 の翻訳は。前に得られており且つ例５に記載した成熟タンパク質のアミノ末端配 列との相同性を示していた。このクローンの配列から、４０ｋＤ抗原をコードす る配列を含むことが判ったので、ＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩで消化し、インサ ートを精製して（ｂ）に記載したｃＤＮＡライブラリーに１１イブリダイゼーシ ヨンさせるのに用いた。

約１０５のプラーク形成単位を、２　Ｘ　１０５ｅｐｍ　／ｍｌのプローブ、５ ＸＳＳＰＥ、５ｘデンノ翫−ト溶液、０、　５％（重量／容量’）ＳＤＳ及び２ ０μｇ／ｍｌの剪断し、変性したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で５５℃でライブ ラリーのニトロセルロースフィルター複製のハイブリダイゼーシヨンによってス クリーニングした。フィルターを６０℃で０．５ＸＳＳＣで洗浄した後、０，１ ％ＳＤＳ及びオートラジオグラフィ処理を行ったところ、２３個の陽性プラーク が同定された。これらのうち、１９個を次の精製及び分析に用いた。ＮｏｔＩイ ンサートを精製したファージＤＮＡから単離し、ｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　５　Ｚ（＋） （プロメガ）にサブクローンして更に分析をｉテつた。これらのクローンの一つ ｐＢＴＡ９８３の配列を、図２に示す。６５７個のヌクレオチドとその後の翻訳 終止コドンＴＡＡの連続的な転写読み取り枠がある。

この転写読取り枠は５′末端にメチオニン開始コドンを持たないので、このクロ ーンは完全なコドン領域を表わすものではない。しかしながら、ヌクレオチド配 列から予測されるアミノ末端配列は精製した培養液抗原から得たアミノ酸配列と 相同であることは明らかである。更に、この配列のアミノ酸Ｎ−末端は疎水性で あり、これはリーダー配列に特徴的なものであり、またその様なリーダー配列を 有するシグナルペプチダーゼの潜在的開裂認識部位がある。それ故、ｃＤＮＡク ローンは抗原の多くをコードするものと思われる。

数種類の他のｃＤＮＡクローンに就いてのＤＮＡ配列も決定され、関連した遺伝 子の群があるのは明らかである。同じｃＤＮＡライブラリーから単離された他の ｃＤＮＡクローンから予測されたアミノ末端配列は元のタンパク質から得られる 配列及びクローンｐＢＴＡ９８３のｃＤＮＡ配列から分岐する。ＤＮＡ配列の残 りの多くはこれらのクローンの中に保存されて、アミノ酸水準で約２０％の変動 である。この抗原のＮ−末端は超可変であり、ｃＤＮＡ分子は遺伝子群に属する ものと思われる。

これは、図３に示されるサザンプロットによっても支持される。レーン２は、ｐ ＢＴＡ９８３由来のＮｏｔｌフラグメントを有するＩｌ、　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ Ｄ　Ｎ　Ａプローブで得られるハイブリダイゼーションパターンを示している。

約１０７０ｂｐのバンドは強くハイブリダイゼーシヨンを行っていると同時に、 低い強度でハイブリダイゼーションしている数本の他のバンドがあり、多くの関 連した遺伝子の存在を示唆している。

例７ 大腸菌における４０ｋＤ抗原の発現 多くの系を用いて組換え４０ｋＤ抗原、例えば、哺乳類細胞、バキュロウィルス 感染の昆虫細胞、酵母または細菌を発現させることができる。例えば、遺伝子は 、大腸菌で発現した。ｐＢＴＡ９８３からのｃＤＮＡフラグメントを７００ｂｐ ＢａｍＨＩ／Ｓａ　ｌ　Ｉフラグメントとして（疎水性シグナル配列をコードす るセグメントなしで）単離され、大腸菌発現ベクターｐＢＴＡ７２１にサブクロ ーニングした。４２℃での熱衝撃で発現を誘導したところ、ベクターによってコ ードされるＮ−末端アミノ酸を有する４０ｋＤタンパク質に融合したものが生成 した。融合タンパク質の見掛けの分子量は約２９ｋＤであって、大腸菌によって グリコジル化されないことから予測された通りであった。この融合タンパク質は 、ウェスターンプロットでの培養液に対して生じたウサギ血清と反応した（図４ ）。

このような融合タンパク質は当業界に知られている標準的なによって細菌細胞か ら精製することができ、（スルフィドリル結合交換を促進する）還元型及び酸化 型グルタチオンのような試薬の存在下での再生段階に続くものと思われ、組換え 抗原は好適なアジュバント注で配合′され、も散られて、ヒツジのような標的動 物での防御免疫応答を刺激した。

バキュロウィルスの発現系によって、昆虫細胞中に真核タンパク質を元の形に近 い形態で産生させることができる（ルッコウ（Ｌｕｃｋｏｗ）及びサマース（Ｓ ｕｍｍｅｒｓ）、１９８８年）。このようなタンパク質が培養上澄液に分泌され ると、その精製は促進されることがある。この例では、４０ｋＤ抗原をコードす るｃＤＮＡを４０ｋＤ抗原の産生と組換えバキュロウィルスで感染した昆虫細胞 の培養上澄液にそれを分泌することができるやり方で操作することができる手段 を説明する。

下記の特徴を有するオリゴヌクレオチド（５’　−ＣＡＡＡＴ　ＧＧＡＴＣＣＴ ＡＴＡＡＡＴ　ＡＴＧ　ＣＧＴ　ＧＧＣＡＴＣＧＣＴ　ＴＴＧ　ＴＴＣＧＴＡＣ ＴＡ　ＡＣＧ　ＡＴＴ　ＣＴＧ−３’）を作成した。

ＢａｍＨＩ制限部位、バキュロウィルス由来のポリヘトリン遺伝子の開始メチオ ニンの直ぐ上流に見られる７ヌクレオチド（サマース（Ｓｕｍｍｅｒｓ）及びス ミス（Ｓｗｉｔｈ）、１９８７年）、ダニＢｏｏｐｈｆｌｕｓ　ｍ１ｃｒｏｐｌ ｕｓからの８ｍ８６遺伝子からのリーダー配列の最初６個の疎水性アミノ酸をコ ードする１８個のヌクレオチド、及びｐＢＴＡ９８３のｃＤＮＡクローンの最初 の６個のアミノ酸をコードする１８個のヌクレオチド（図２）。

市販のプライマー（Ｓｐ６、プロメガ）と共に、このオリゴヌクレオチドＰＣＲ 反応に用いて、ハイブリッドＢ　ｍ　８６　／　４０　ｋ　Ｄ分泌シグナルを含 む４０ｋＤ物質をコードするＤＮＡ分子を生成させた。ＰＣＲ反応に用いたプラ スミドはｐＧＥＭ５Ｚｆ　（＋）（プロメガ）のＮｏｔ１部位に挿入された４０ ｋＤのｃＤＮＡフラグメントを有し、５′末端はＴ７プロモーターに隣接する４ ０ｋＤコード鎮を有している。

ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ　（４０ｋＤコード領域では位置８３ で切断）で消化した（図２参照）。１０４ｂｐフラグメントを、低融点アガロー スゲルから精製し、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断したｐＳｐ７２（プロメガ） 中にヌクレオチド位置８３以降からの４０ｋＤ抗原をコードする６９５ｂｐＥｃ ｏＲＩ／’Ｐｓ　ｔＩフラグメントを用いて３方連結でサブクローニングした。

適当な大腸菌宿主を形質転換した後、数種類のクローンからのプラスミドＤＮＡ を単離し、ＰＣＲ増幅中に導入される任意の誤差について配列決定を行うことに よってスクリーニングした。精確な配列を有するクローンを選択し、ハイブリッ ド８ｍ８６／４０ｋＤ分泌シグナルを有する４０ｋＤ抗原をコードするＢａｒｒ ＋ＨＩ／Ｐｓｔｒフラグメントを単離し、バキュロウィルストランスファーベク ターにサブクローニングした（ルックナラとサマース、１９８８年）。

組換えバキュロウィルスを、プラークハイブリダイゼーション及び目視スクリー ニング法の組み合わせを用いてプラーク精製し、昆虫細胞を感染させるのに用い た（サマースとスミス、１９８７年）。４０ｋＤ抗原は培養上澄液から精製した 。

亘ユ バキュロウィルス／Ｓｆ９細胞によって発現される組換え４０ｋＤの精製 分泌した４０ｋＤ抗原を含むＳｆ９細胞の培地を、アミコン５ＩＹ３０スパイラ ルカートリツジを用いて１０倍に濃縮した。保持物をレンチルレクチン−セファ ロース４Ｂ、４℃で一晩インキユベーションした。結合物質は０．２Ｍメチル− Ｄ−マンノシドで特異的に溶出した。

非結合物質をカラムを通してリサイクルし、纏めた結合画分を２倍に濃縮し、セ ファクリルＳ−３００ＨＲカラム上でゲル濾過に付した。分泌した４０ｋＤ抗原 を含む画分を透析し、Ｑ−セファロース高流速カラムを通過させ、これを線形グ ラディエンド０＝０．３Ｍ　ＮａＣｌグラディエンドで再溶解した。精製した４ ０ｋＤは、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びｒマシフル−Ｒ−２５０染色により、少なくと も９０％の純度であると判断した。

ｆｌｌｏ 精製した組換え４０ｋＤによるモルモットの予防接種バキュロウィルス／Ｓｆ９ 培地から精製した組換え４０　ｋ、　Ｄ抗原を用いて、例２に記載したのと同様 にしてモルモットを予防接種した。組換え４０ｋＤ抗原は、元の４０ｋＤ抗原を 用いる実験に使用したのと同じ両を注入すると有意な防御を与えた（例４）。

実験　群　注入量　ｎ　虫の数　保護（％）番号　（ｊｇ） ３５７　コントロール　−−１２７０１±２０８　−−［１！　４０　８　３ｇ ｓ＋ｔｓｚ　４５接種物を抗原と共に腹腔内に注入した。２８日後に動物に線虫 の攻撃を加えさせ、攻撃から５日目に屠殺した虫の数を数えた。

例１１ 他の種の寄生性線虫に存在する防御抗原の遺伝子に関連した相同遺伝子 ＤＮＡハイブリダイゼーション（またはサザンプロット分析）を標準的な手法を 用いて行い（マニアチスら、１９８２年）寄生性線虫の他の種がＨ，ｃｏｎｔｏ ｒｔｕｓ防御抗原をコードする「相同な」遺伝子を有するかどうかを決定した（ 図３）。例６に記載したｃＤＮＡクローンｐＢＴＡ９８３のＥｃｏＲＩイノサー トを他の多数の種の寄生性線虫から単離されたＤＮＡに対するハイブリダイゼー ションプローブとして用いた。相同の種、すなわちＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓから 単離したＤＮＡにおける数個の制限フラグメントに強くハイブリダイゼーション すると同時に、このプローブはＤｉｒｏｆｉｌａｒｉａ　ｆａｍｉｔｉｓ及びＴ ｒｌｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒｌｔｏｒｍｉｓから単離したＤ ＮＡにおける特異的な制限フラグメントにもハイブリダイゼーションした。

これらのプロットを緊縮（ａｔ　ａ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）洗浄したところ、 相同性の水準は少なくとも５０％であった。

これは、これらの他の種の寄生性線虫の防御抗原、数行すれば総ての種の寄生性 線虫の防御抗原をコードする遺伝子と密接に関係した遺伝子があることを示して いる。

これらの遺伝子は、標準的な分子生物学的手法を用いて単離することができ、他 の種の寄生性線虫からの関連したまたは相同の抗原を合成する組換え生物を作成 することができた。本発明者らは、これらの関連した抗原は他の種の寄生虫によ る感染に対して予防接種した動物に防御を与える有効な免疫原として働くものと 考えている。

更に、広範囲の寄生性線虫から単離した関連した抗原を単離し、広範囲なこれら の線虫の侵襲に対して動物を有効な防御免疫原を与えて防御することができた。

この方法がうまくゆくことは既に示されている（国際出願第ＰＣＴ／Ａ０８８１ ００２３９号明細書）。この特許出願明細書には、モルモットをＴ、　Ｃｏｌｕ ｂｒｌｆｏｒｍｉｓによる攻撃感染から防御する抗原の能力に基づいてＴ、　Ｃ ０１ｔＪｂｒｉｆ’０ｒｌｆＳのホモゲネートからこの抗原を精製する方法が記 載されている。この抗原に就いてのアミノ酸配列情報が決定され、この遺伝子に より組換えＤＮＡライブラリーから単離される抗原をコードすることができる。

次に、Ｔ、　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓをコードするＤＮＡをハイブリダイゼ ーションプローブとして用いて、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓからの「相同」遺伝子 をコードする組換え生物を同定した。次に、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ抗原を合成 する組換え生物を構築し、この抗原を用いてヒツジ及びモルモットの予防接種及 び攻撃試験を行った。ｔＬ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ組換え抗原は旧ｃｏｎｔｏｒｔ ｕｓによる感染から予防接種したヒツジを防御し、Ｔ、　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒ ｓ＋ｉｓによる攻撃感染からモルモットを防御した。

このことは、前記のハイブリダイゼーション実験において示されたＤＮＡ配列の 相同性を仮定すると、ある種の寄生性線虫由来の防御抗原をコードするクローン 化したＤＮＡ配列を用いて、他の種の寄生性線虫由来の相同遺伝子生成物をコー ドするクローンを同定し、相同遺伝子を発現する組換え生物を設計し、これをワ クチンに使用して、寄生性線虫の他の種から防御することが可能であることを示 している。ここに提供された結果の自然な拡張は本発明のＤＮＡ配列でこれを行 うことであると考えられる。

相同遺伝子のヌクレオチド配列及び相同抗原のアミノ酸配列は、第一の標的種の 物と同一でないことがあるが、少なくとも６０塩基対の長さに亙って少なくとも ５０％だけ関連付けられ、好ましくはこの関係はこの同じ領域に亙って７０％以 上であり、アミノ酸水準では２０個のアミノ酸に亙って少なくとも７０％が相同 であることを理解すべきである。大抵の場合には、この相同性の程度は、２つの 遺伝子またはタンパク質の関連性を明確に同定するのに十分である。

例１２ ４０ｋＤ抗原及びＤｉｒｏｆ’ｆｌａｒｆａ　ｆ＠ｍ１ｔｉｓタンパク質に対す る抗体の間の免疫学的交差反応性 ４０ｋＤで予防接種したヒツジの抗血清を用いて、Ｄ。

１＋ｕ＋１ｔｉｓの成虫及び感染性のＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの幼虫からの抽出 物（レンチルレクチンセファ０−ス４Ｂからの結合及び特異性溶出によって予め 濃度を高めておく）のウェスターンプロットを用いてプローブした。セイヨウワ サビ−ペルオキシダーゼに抱合した第二の抗体で展開したところ、それぞれの種 からの２種の抗原は反応性であった。４０ｋＤの主バンドは両方で検出され、小 さなバンドは５５〜６８ｋＤの範囲にあった。分子量が極めて似ている抗原も、 同じウェスターンプロット上で行った培の種由来の２種類の抗原は反応性である ことを示した。

この結果は、ＤＮＡハイブリダイゼーション手法を用いて、４０ｋＤ抗原に関連 したタンパク質はり、　ｌ園ａ＋１ｔｉｓ中に存在し、発現するという他の観察 を支持する。

これまでに記載された製造及び精製技法は、実験室規模で行われる。本発明の抗 原の商業的生産のために、形質転換宿主の大規模な醗酵が必要である。

大規模醗酵は標準的な手法によって行われ、選択される特定の手法は、抗原の生 産に用いられる形質転換宿主に好適である。

微生物の寄託 プラスミドｐＢＴＡ９８３を含む大腸菌ＪＭ１０９であるＢＴＡ２１４７株を、 １９９２年１月２９日にブダペスト条約の規定によりオーストラリアン・ガバメ ント・アナリティカル・ラボラトリーズ（＾ｕｓｔｒａｌｉ２ＨＧｏｖｅｒｎｍ ｅｎｔ　Ａｎａｌｙｔｊｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｆｅｓ）　１、スアキン書 ストリート、ビンプル２０７３、ニュー・サウス・ウェールズ、オーストラリア に、登録番号Ｎ９２／４３８９で寄託した。

大腸菌ＪＭ１０９、ＢＴＡ２１４７株の遺伝子型は：ＪＭ１０９株、遺伝子型： ｅｎｄＡｌ、ｒｅｃＡｌ、ｇｙ　ｒＡ９６、ｔｈ　ｉ、ｂｓｄＲ１７（ｒｋ　、 ｍｋ＋）ｔｅｌＡｌ、５ｕｐＥ４４Ｓ　λ−− Δ　（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、　［Ｆ’　、ｔ　ｒａＤ３６、ｐｒｏＡＢＳ　１ ａｃｌ　２６Ｍ１５］。

ｐＢＴＡ９８３はｐＧＥＭ５Ｚ　ｆ　（＋）ｍ　（プロメガ、マジソン、ライス コンシン、米国）であり、胃腸線虫Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ からの抗原性タンパク質の一部をコードする７７６塩基対のＮｏｔｌインサート を含む。

産業上の利用 本発明は寄生性線虫による侵襲から哺乳類宿主を防御するのに好適な抗原、ワク チン及び抗体を提供するのに有用である。

文献 マニアチス、ティー　（Ｍａｎｉａｔｌｓ、　Ｔ）　、フリッチ、イーエフ（Ｆ ｒ１．ｔｓｃｈ、　ＥＦ）及びサンプルツク、ジエイ（Ｓａａｌｂｒｏｏｋ、　 Ｊ）　（監修）（１９８２年）分子クローニングニア・ラボラトリ−・マニュア ル・シーエスエイチ・ラボラトリ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｌｎｇ：　 Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌＣＳＨＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コール ド・スプリングｍ　７％　−／（−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ） 。

オドンネル、アイジェイ（０°Ｄｏｎｎｅｌ！、　ＩＪ）　、デイニーン、ジェ イケイ（Ｄｆｎｅｅｎ、　ＪＫ）ロスウェル、テイエルダブリュ（Ｒｏｔｈｗｅ ｌ　Ｉ　、ＴＬＷ）及びマーシャル、アールシー（Ｍａｒｓｈａｌ　Ｉ　。

ＲＣ）（１９８５年）「感染し、高免疫ヒツジ及び高及び低応答モルモットから の血清を用０るイムノプロ、スト１こおけるＴｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ 　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒＩＩｉｓの抗原及び防御免疫原のプローブの試み（、Ａ ｔｔｅＩｌｐｔｓ　ｔｏ　ｐｒｏｂｅ　ｔｈｅａｎｔｉｇｅｎｓ　ａｎｄ　ｐｒ ｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｉＩＩｕｎｏｇｅｎｓ　ｏｆＴｒｌｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌ ｕｓ　ｃｈｌｕｂｒｊｆｏｒｍ！ｓ　ｉｎ　ｉａｕ＊ｕｎｏｂｌｏｔ　ｖｆｔｈ ｓｅｒａ　ｆｒｏｍ　１ｎｆｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ　５ ｈｅｅｐ　、ａｎｄ　ｈｉｇｈａｎｄ　ｌｏｗ　ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ　ｇｕｉｎ ｅａ　ｐｉｇｓ）　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ。

、１５．１２９−１３８ サイキ、アールケイ（Ｓａｉｋｉ、　ＲＫ）　、ゲルファント、ディーエイチ（ Ｇｅｌｆａｎｄ、　ＤＨ）　、ストツフエルス（Ｓｔｏｆｒｅｌｓ）、シャーフ ・エスジエイ（Ｓｃｈｅｒ４．　！１ｉＪ）、ヒグチ、アール（！ｌｉｇｕ’ｃ ｈｉ、　Ｒ）、ホーン、ジ−ティー　（Ｈｏｒｎ、　ＧＴ）、ムリス、ケイビー （Ｍｕｌｌｌｓ　ＫＢ）及びエールリッヒ、エイチェイ（Ｅｒｌｉｃｈ　Ｈ＾） （１９８８年）、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼによる特定プライマーのＤＮＡ の増幅（Ｐｒｉｍｅｒｔｔｒｅｃｔｅｄ　ａｍｐｒｔｆｌｃａｔｉｏｎ　ｏｒ　 ＤＮＡ　ｗｉｔｈ　ａ　ｔｈａｒｍｏｓｔａｂｌｅＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓ ｅ）　、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９．４８７−４９１　。

シーア、エムジー（Ｓｃｈｅｒ、　ＭＧ）　、レスネック、ダブリュジー（Ｒｅ ｓｎｅｃｋ　ＷＧ）及びブｏ−）ホ・アールシエイ（ＢｌｏｃｈＲＪ）（１９８ ９年）　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ、　１７７゜１８８ −１７１゜ サマース、エムディー（ＳｕｍＩＩｅｒｓ　ＭＤ）、スミス、ジーエフ（Ｓｍｉ ｔｈ　ＧＰ）　（１９８７年）　Ｔｅｘａｓ　ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＥｘｐ ｅｒｉａ＋ｅｎｔａｌ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５ ゜ラックノウ・ケイエイ（Ｌｕｃｋｎｏｖ　Ｖ＾）及びサマースエムデイ−（Ｓ ｕｎ＋ｍｅｒｓ　ＭＤ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６．４７−５５゜ラン ド・ケイエヌ（Ｒａｎｄ　ＫＮ）ムーア、ティー　（Ｍｏｏｒｅ　Ｔ）、スリス カンシャ・エイ（Ｓｒｉｓｋａｎｔｈａ　Ａ）ら、（１９８９年）Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８６．９８５７−９８１１゜図１　レンチル レクチンクロマトグラフィによるＬ３−Ｌ４培養液の分画 レーン１：　ＨｃＬ３−Ｌ４培養液； レーン２：　ＬＬ−未結合画分； レーン３：　メチル−Ｄ−マンノシドで溶出したＬＬ＋画分； レーン４：　ＳＤＳ／ＨＯＡｃで溶出したＬＬ＋画分；レーン５：　バイオ−ラ ドの低分子量標準。

旦ヱ 禦カＺジＺ五で釈Ｚ漕３次テζＺ復Ｉジ１応疋シ面仄ひで五Ｚ刀Ｚ５Ｉ乙ズＬＩ Ｉ％Ｉ　ＭｒＩＴｙｔ　ｊａｒ　（７ｓシ＋ｕ　ｋＬａ　Ｇｌｕ　ｚｙｍ　ｔｙ ｒ　ａｓｓ　ＮＪゴＶａｎ　Ｌ瞳ｕ　ｅｙｉ　ＡＪＩＩ@Ｇｌｎ　ＧＬａ ２８０２１９１９＠Ｊ０７３１６！２５ば仄７：ｅＸＦで凋ズこテ硲仄ＷＷＸ） ご已〒賀テにでζズＦｒζグζズでズ人工ａＰｒｏＣｖｕムｙ８ＰｅａＶａｌＧ ｌｙＦｙｔＡＪＩＩＬａｕ、５ｅｔＳａｔｕｓＰｅａＬａｕ＾ユ１講」１＾ユ１ ３３４３４コ３５２３６Ｌコア０コア９デてクズデ３賀３賀Ｚまフごコ２；うζ が改＝ド〒１で刀ご：ズで汝仄Ｐｈ＊　Ｇｌｕ　Ｌａｕτ：；’　？ｉ　Ｇｌｙ 　Ａｓ＋ｓ　ｌｉｅ　Ｊｕｐ　ｔｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｈａ　！λ−んｔａ 　Ｇｉｕτ■窒f工Ｙ ３８＠　３タフ　４０６　４１５　４２４　４３３ごでジで双２で凋Ｚ；ツクご １Ｊ双＝ｍ　票ｘｍつ仄に阿でビ賀＝侃が５でｖａＬ　Ｔｙｔ　ｊｅＨｌｔｏ　 ＡＪＩＩ　Ｐｈ＠ｊｕｐ　Ｔｙｔ　Ｔｈｒ　ｖａｌ　Ｆ−τｈｒＧ工ｎ　Ｋｍ　 ｖａｌ　Ｓａｔ　Ｇｌｙ　sｙｔ にηで双汀ＦＫを＝Ｒ２で豪ア＝呪Ｚジ１ヌに刀１つ；工に５ご七Ｚに、ａ　ｖ ａＬ　Ｓａｔ　ｌ１ｅ　Ｑｌｙ　Ｃｙｍτｈｒ　Ｊｕｐデｈ＝　Ｃｙｓ　Ｔ７ｔ 　Ｇ工ＹムｙｓＧ↓ｎ　Ｇｉｎ　ｕｈ　Ｔｙｔ　■凾■ 侃スデで′ｃｘｘ引テ賀に巧に扁双テ５７禦次ＺＴｆ？Ｚ巧でμにＶクズ渉ズ； ＝Ａｉａ　）ｈｅ　Ｇｌｕ　ＶＡｌ）１τｂｔ　Ａ１１ｌ　ｌｕゴ〒ｈｅ　ｔｙ ｔ　Ｐｈａ　ＧＬｙ　Ｎ！　！１豐ｑｃ　Ｇｉｕ　ｊｕ１Ｇｌ■ ５６０５５９５６８Ｓフ７５８６５９５資＝次汗で仄セが蔦に面１ご面Ｚ責Ｚで 双３５１で盃２釈＝双石ＲＺＳ＠ｒＧ↓ｙＰｔｏＣｙｓ１４１フ＾工１１Ａ１ｐ ＳＥＥＪｕｐＣｙｓτｈｅτｈｅ〒ｙｔＰτｏＧｌｙｍａｒ丁ｈｒＣｙｓ６０４ ６１３６ス！６３Ｌ６４０６４９フチＴｆ６７ｆ２ズフ１ζ仄５Ｗ汀艶で刀＝工 でズ万Ｚ疋テでで＝資だξて刀ゴ入ＪｎＭ！：フ　Ａｉａ　Ａｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌ ａｕ　Ｃｙｓ　ＶＡｌ　ＬＹＳ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｉａ　Ｔｈｒ　Ｐｔａ　Ｌ ａｕ　Ｃｙｘ@ｐｒｏ　Ｌ、ｙｓ サザンブロゾト ｐＢＴＡ９８３のＮｏｔｌインサートでプローブしたサザンブσットであり、ｌ １ａｅ＊ｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓのＨｃ４０ｋＤａ遺伝子及び他の２ 種類の寄生性線虫の相同遺伝子のゲノム構造を示している。

レーン１．１ｌａｅ＠ｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓＤ　Ｎ　Ａ％　Ｈｉ　 ｎ　ｆ　Ｉ消化物； ２、　Ｔｒｌｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｏｕｂｒ１４ｏｒｍｉｓ　Ｄ ＮＡ。

Ｈｉｎｆｌ消化物： ３、　Ｄｉｒｏｆ！１ａｒｌａ　ｌ５ｍ１ｔｌｓ　ＤＮＡ、　Ｈｉ　ｎ　ｆ　Ｉ 消化物； ４、ｐＢＴＡ、９８３プラスミドＤＮＡ。

Ｈｉｎｆ　Ｉ消化物。

図４ 大腸菌に発現した４ＱｋＤａの抗原のウェスターンプロット 試料は１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行った後、ニト ロセルロースフィルター上で電気泳動的にプロットした。このフィルターをＨ， ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ培養液に対して生じたウサギ血清でプローブした。発色には プロメガ・プロトプロット・アルカリホスファターゼ系（製品番号Ｗ３９３０） を用いた。

レーン１　未誘導コントロール、不溶性画分レーン２１７時間後誘導、不溶性画 分 レーン３　未誘導コントロール、可溶性画分レーン４１７時間後誘導、可溶性画 分 レーン５　予め染色したバイオラド製５ＤＳＰＡＧＥ標準 図５：　Ｈｃ４０ｋＤの抗原とり、　ｉ＋ｎｍｔＬｔｓからの抽出物に対する抗 血清間の交差反応性を示すウェスターンプロット レーンＳ　ＢＲＬ製高分子量標準 レーしＩ　Ｄ、　１ｍｍ１ｔｉｓ抽出物レーン２　Ｆｌ、　ｅｏｎｔｏｒｔｕｓ 抽出物特表千５−５０７２０８　（１Ｂ） 要約書 第−の種の寄生性線虫由来の実質的に精製された抗原であって、宿主動物に投与 すると、第二の種の寄生性線虫による侵襲からこの宿主動物を防御することがで きるものであって、第−及び第二の種の寄生性線虫は同一または異なるものであ ってもよく、還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した見掛けの分子量が ４０ｋＤであることを特徴とする、抗原。

補正書の写しく翻訳文）提出書（曲法第１８４条の７１１１１項）

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．第一の種の寄生性線虫由来の実質的に精製された抗原であって、宿主動物に 投与すると、第二の種の寄生性線虫による侵襲からこの宿主動物を防御すること ができるものであって、第一及び第二の種の寄生性線虫は同一または異なるもの であってもよく、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した見掛けの分子 量が４０ｋＤであることを特徴とする、抗原。
2. ２．純度が９０％を上回る、請求の範囲第１項に記載の抗原。
3. ３．第一及び第二の種の寄生性線虫は、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ、Ａｎｃｙｌｏ ｓｔｏｍａ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ、Ｈａ ｅｍｏｎｃｈｕｓ、Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ、Ａｓｏａｒｉｓ、Ｔｏｘａｓｃａｒ ｉｓ、Ｕｎｃｉｎａｒｉａ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ、Ｄｉｃｔｙｃａｕ１ｕｓ、Ｄ ｉｒｏｆｉｌａｒｉａ、Ｔｏｘｏｃａｒａ、Ｎｅｃａｔｏｒ、Ｅｎｔｅｒｏｂｉ ｕｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ及びＷｕｃｈｅｒｅｒｉａ属から選択される 、請求の範囲第１または２項に記載の抗原。
4. ４．第一及び第二の種の線虫がＴｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓ、Ａｎ ｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ｃａｎｉｕｍ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ 、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒｉｒｏｒｍｊｓ、Ｈａｅｍ ｏｎｃｈｕｓｃｏｎｔｏｒｔｕｓ、Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ　ｏｓｔｅｒｔａｇｉ 、Ａｓｃａｒｉｓ　ｓｕｕｍ、Ｄｉｃｔｙｃａｕ１ｕｓ　ｖｉｖｉｐａｒｕｓ、 Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ　ｌｅｏｎｉｎａ、Ｕｎｃｉｎａｒｉａ　ｓｔｅｎｏｃｅ ｐｈａｉａ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｖｕｌｐｉｓ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ　ｉ ｍｍｉｔｉｓ、Ｔｏｘｏｃａｒａ種の幼虫、Ｎｅｃａｔｏｒａｍｅｒｉｃａｎｕ ｓ、Ａｎｃｙｉｏｓｔｏｍａ　ｄｕｏｄｅｎａｌｅ、Ａｓｃａｒｉｓｌｕｍｂｒ ｉｃｏｉｄｅｓ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｔｒｉｃｈｉｕｒａ、Ｅｎｔｅｒｏｂｉ ｕｓｖｅｒｍｉｃｕｉａｒｕｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ　ｓｔｅｒｃｏｒ ａｌｉｓおよびＷｕｃｈｅｒｅｒｉａ　ｂａｎｃｒｏｆｔｌから選択される、請 求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の抗原。
5. ５．第一及び第二の種の線虫がＨａｅｍｏｎｃｈｕｓｃｏｎｔｏｒｔｕｓである 、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の抗原。
6. ６．実質的に天然に存在するままの抗原を除外する抗原であって、図２に示され るアミノ酸配列または図２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１３〜２１９をグ リコシル化または非グリコシル化した形で有することを特徴とする、抗原。
7. ７．実質的にＮ末端配列 【配列があります】 を有する、請求の範囲第６項に記載の抗原。
8. ８．宿主動物に投与することにより、この宿主動物を寄生性の線虫の種による侵 襲から防御することができる、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の抗 原の相同体。
9. ９．請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の抗原または請求の範囲第８項 に記載の相同体をコードするポリヌクレオチド分子。
10. １０．ポリヌクレオチド分子がＤＮＡ分子である、請求の範囲第９項に記載のポ リヌクレオチド分子。
11. １１．ポリヌクレオチド分子がｃＤＮＡ分子である、請求の範囲第１０項に記載 のポリヌクレオチド分子。
12. １２．天然に存在するままのＤＮＡ分子を除くＤＮＡ分子であり、実質的に図２ に示されるヌクレオチド配列または図２に示される配列の塩基８〜６６７または 図２に示される配列の塩基４４〜６６４を含んで成るＤＮＡ分子。
13. １３．請求の範囲第１０または１１項に記載のＤＮＡ分子及びベクターＤＮＡを 含んで成る組換えＤＮＡ分子。
14. １４．ベクターＤＮＡがプラスミド、ウイルス性およびコスミドＤＮＡから選択 される、請求の範囲第１３項に記載の組換えＤＮＡ分子。
15. １５．ベクターＤＮＡが、ｐＧＥＭ５Ｚｆ（＋）、ｐＢＴＡ７２１、λｇｔ１１ 、ｐＵＲ２９０、ｐＵＲ２９１、ｐＵＲ２９２、ｐＵＫ２７０、ｐＵＣ８、ｐＵ Ｃ９、ｐＺｉｐＮｅｏ、ＳＶ４０を基材としたベクター、λｇｔ１０、ＥＭＢＬ ベクター、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２９、またはｐａｒ遺伝 子座を含むｐＢＲ３２９、バキュロウイルス、またはワタシニアウイルスから選 択される、請求の範囲第１３項または１４項に記載の組換えＤＮＡ分子。
16. １６．前記に定義のｐＢＴＡ９８３。
17. １７．請求の範囲第１３〜１６項のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組換 えＤＮＡ分子で形質転換した、形質転換宿主。
18. １８．宿主が、細菌、酵母、他の微、昆虫、植物及び哺乳類細胞ラインから選択 される、請求の範囲第１７項に記載の形質転換宿主。
19. １９．宿主が大腸菌Ｋ１２誘導体である、請求の範囲第１７または１８項に記載 の形質転換宿主。
20. ２０．前記定義のＢＴＡ２１４７。
21. ２１．発現生成物が、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の抗原または 請求の範囲第８項に記載の相同体を含んで成る、請求の範囲第１７〜２０項のい ずれか１項に記載の形質転換宿主の発現生成物。
22. ２２．前記の発現生成物が融合生成物である、請求の範囲第２１項に記載の発現 生成物。
23. ２３．請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の抗原、請求の範囲第８項に 記載の相同体または請求の範囲第２１項または第２２項に記載の発現生成物の総 てまたは一部に対応する合成ポリペプチドであって、宿主動物に投与するとき、 寄生性線虫種による侵襲に対して宿主動物を防御することができる、合成ポリペ プチド。
24. ２４．請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の抗原、 請求の範囲第８項に記載の相同体、請求の範囲第２１項または２２項に記載の発 現生成物、 請求の範囲第２３項に記載の合成ポリペプチド、請求の範囲第１７〜２０項のい ずれか１項に記載の形質転換宿主、および／または 請求の範囲第３９項に記載のアンチイディオタイプ抗体の少なくとも一つと、 製薬上および／または獣医学上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／または アジュバントとを、含んで成るワクチン組成物。
25. ２５．請求の範囲第１７〜２０項のいずれか１項に記載の少なくとも１つの生き ているまたは死んだ形質転換宿主を含んで成る、請求の範囲第２４項に記載のワ クチン。
26. ２６．少なくとも１種類の、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の抗原 、請求の範囲第８項に記載の相同体、請求の範囲第２１項または２２項に記載の 発現生成物、請求の範囲第２３項に記載の合成ポリペプチド、および／または請 求の範囲第２４または２５項に記載のワクチンに対して生じる抗体。
27. ２７．前記の抗体が多クローン性抗体である、請求の範囲第２６項に記載の抗体 。
28. ２８．前記の抗体が単クローン性抗体である、請求の範囲第２６項に記載の抗体 。
29. ２９．少なくとも１種類の請求の範囲第２６〜２８項のいずれか１項に記載の抗 体と、製薬上および／または獣医学上許容可能な担体、希釈剤および／または賦 形剤とを含んで成る抗体組成物。
30. ３０．請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の抗原、 請求の範囲第８項に記載の相同体、 請求の範囲第２１または２２項に記載の発現生成物または 請求の範囲第２３項に記載の合成ポリペプチド、および／または 請求の範囲第２６〜２８項のいずれか１項に記載の抗体の試料を含んで成る、診 断用キット。
31. ３１．請求の範囲第２１項または２２項に記載の発現生成物の生合成法であり、 請求の範囲第１７〜２０項のいずれか１項に記載の形質転換宿主を提供し、発現 生成物を発現させるのに好適な条件下で形質転換宿主を培養し、形質転換宿主か らの発現生成物を集めることを特徴とする方法。
32. ３２．寄生性の線虫種による侵襲から宿主を防御する方法であって、少なくとも １種類の 請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の抗原、請求の範囲第８項に記載の 相同体、請求の範囲第２１項または２２項に記載の発現生成物、 請求の範囲第２３項に記載の合成ポリペプチド、および／または 請求の範囲第２４項または２５項に記載のワクチンを借主に予防接種することを 特徴とする方法。
33. ３３．請求の範囲第１３〜１６項のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子を調 製する方法であって、請求の範囲第１０項または１１項に記載のＤＮＡをベクタ ーＤＮＡに挿入することを特徴とする、方法。
34. ３４．請求の範囲第１７〜２０項のいずれか１項に記載の形質転換宿主を調製す る方法であって、宿主を形質転換に適うようにしてコンピテント宿主を設け、こ のコンピテント宿主を請求の範囲第１３〜１６項のいずれか１項に記載の組換え ＤＮＡ分子で形質転換することを特徴とする方法。
35. ３５．請求の範囲第２６項または２７項に記載の抗体を調製する方法であって、 免疫応答性宿主を、少なくとも１種類の 請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の抗原、請求の範囲第８項に記載の 相同体、 請求の範囲第２１項または２２項に記載の発現生成物、請求の範囲第２３項に記 載の合成ポリペプチド、および／または 請求の範囲第２４項または２５項に記載のワクチン、を用いて免疫感作すること を特徴とする、方法。
36. ３６．請求の範囲第２４または２５項に記載のワクチンを調製する方法であって 、少なくとも１種類の請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の抗原、請求 の範囲第８項に記載の相同体、 請求の範囲第２１項または２２項に記載の発現生成物、請求の範囲第２３項に記 載の合成ポリペプチド、請求の範囲第１７〜２０項のいずれか１項に記載の形質 転換宿主、および／または 請求の範囲第３９項に記載のワクチンの有効量を、製薬上および／または獣医学 上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントと混合すること を特徴とする、方法。
37. ３７．請求の範囲第２９項に記載の抗体組成物を調製する方法であって、少なく とも１種類の請求の範囲第２６〜２８項のいずれか１項に記載の抗体の有効量を 、製薬上および／または獣医学上許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤 と混合することを特徴とする、方法。
38. ３８．寄生性線虫の種に対して宿主を受動的に予防接種する方法であって、少な くとも１種類の請求の範囲第２６〜２８項のいずれか１項に記載の抗体および／ または請求の範囲第２９項に記載の抗体組成物を宿主に投与することを特徴とす る、方法。
39. ３９．請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の抗原の一部に対応し、寄生 性線虫の種による侵襲に対してアンチイディオタイプ抗体で免疫した宿主を防御 することができるアンチイディオタイプ抗体。