JPH05505611A - Ｈｉｖに対する予防接種のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）はヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）と同定さ れたレトロウィルスによって引き起こされる。いくつかの免疫学的異常がＡＩＤ Ｓに関して記述されており、これらにはＢ細胞機能の異常、異常な抗体応答、不 完全な単球細胞機能、サイトカイン産生の損傷、ナチュラルキラーおよび細胞障 害性細胞機能の低下、ならびに可溶性抗原を認識し、これに応答するリンパ細胞 の能力の欠陥が含まれる。ＡＩＤＳに伴う他の免疫学的異常も報告されている。

Ｔ４ヘルパー／インデューサーリンパ細胞集団の枯渇は、ＡＩＤＳ患者における 、より重要な免疫学的欠陥の１つである。

ＡＩＤＳに認められる深遠な免疫不全にもかかられず、免疫不全に寄与する機構 は明確には理解されていない。数種の仮定が存在する。許容されている１つの見 解は、免疫応答性の欠陥が、ヘルパーＴ細胞機能の損傷とその結果として起こる 正常な免疫応答に必要な細胞の枯渇をもたらす、ＨＩＶによるヘルパーＴ細胞の 感染によるというものである。インビトロおよびインビボ研究は、免疫応答にお いて補助細胞として必須の役割を果たすことが知られている単核細胞にもＨＩＶ が感染し得ることを示した。またＨＩＶは、感染細胞における正常なサイトカイ ン産生を妨害し、それにより例えばＩＬ−１およびＩＬ−２不全などの２次的免 疫不全をもたらすことによっても免疫不全をもたらし得る。ＨＩＶが誘発する免 疫不全のさらなる手段は、免疫応答を抑制し得る因子の産生からなる。これらの モデルはいずれも、複製ウィルスによる感染ではなくＨＩＶ自体の成分がＡＩＤ Ｓに伴う免疫学的異常に寄与しているか否かの疑問を解決しない。

ＨＩＶｅｎｖタンパク質は詳細に記述されており、いくつかのＨＩＶ株由来のｒ ｏｗ、　Ｓ、ら、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６１（２）　：５７０（１９８７ ））。ＨＩＶウィルス粒子は宿主細胞の外膜から誘導される膜もしくはエンベロ ープ（包膜）によって覆われている。この膜は、カルボキシル末端領域で膜二重 層に固定されたエンベロープ糖タンパク！（ｇｐ１６０）の集団を含有する。各 糖タンパク質は２つのセグメントを含有する。Ｎ末端セグメントは約１２０ｋＤ の相対分子量を有するがゆえにｇｐ１２０と呼ばれており、ウィルス粒子を取り 巻く水性環境中に突き出している。Ｃ末端セグメントはｇｐ４１と呼ばれており 、膜をまたいでいる。ｇｐ１２０とｇｐ４１は、タンパク質加水分解切断に対す る感受性が著しく高いペプチドを介して共有結合しティる（例えば、ＭｃＣｕｎ ｅら、ＥＰＯ出願第０３３５６３５号（優先日・８８年３月２８日）およびこの 文献に引用された文献を参照のこと）。

ＡＩＤＳワクチンを目指す研究方法はいくつか提案されており、それらには不活 化および減弱化したウィルスワクチン、ウィルス感染細胞からのサブユニットワ クチン、組換え法で生産されたウィルス抗原、合成ペプチドに基づくワクチン、 抗イデイオタイプワクチン、およびウィルス担体に基づ（ワクチンが含まれるが 、ウィルスを用いる抗原投与（チャレンジ）に対する保護を提供した予防接種の 研究は現在までのところ公表されていない。ＨＩＶワクチン開発に関するいくつ かの総説が刊行されている（例えば、Ｌａ５ｋｙ、Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉ ｅｗｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　９（３）：１５３−１７２（１９８９） 、Ｎｅｗｍａｒｋ、　Ｎａｔｕｒｅ　３３３：６９９（１９８８年１２月２３日 ２３）およびＦａｕｃｉら、　Ａ獅獅■ ｉｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１１０（５）：４ｌ−５０ （１９８９年３月１日）。

全（死滅または減弱）ウィルスの使用には、そのワクチンを製造する労働者の安 全性、ウィルスの不完全な不活化に由来する被接種者の危険性、あるいは減弱化 したウィルスの活性有毒型への復帰を含むいくつかの問題がある。ペプチドおよ びサブユニットワクチンは共にその天然型の立体配座で得ることが潜在的に困難 であり得、体液性応答しか引き出さず、おそらく細胞性免疫を引き出さないであ ろう。ＡＩＤＳワクチンの開発におけるもう１つの重要な困難性は、ＨＩＶの株 間の可変性ならびに同じ株での経時的可変性にある。

ＨｒＶゲノムによってコード化されているタンパク賀のうち、ワクチンの開発に 最も頻繁に使用される分子はウィルスの表面上に位置する。これらはウィルスの 付着ならびに細胞−細胞融合（レンジチウム形成）によるウィルスの蔓延を媒介 し、免疫攻撃に最も利用し易いウィルスタンパク賀である。最近ｇｌ）１２０は サブユニットワクチンの最良の候補と見なされている。その理由は、（ｉ）ｇｐ １２０はＣＤ４結合ドメインを保持し、ＨＩＶはこのＣＤ４結合ドメインによっ てその標的細胞に付着することが知られていること、（ｔｉ）ｇｐ１２０に対す る抗体がインビトロでＨＩＶの感染性を中和し得ること、（ｆｆｉ）ＨＩ　Ｖに 感染した個体の血清中に存在するインビトロ中和活性の大部分がｇｐ１２０アフ ィニティーカラムによって除去され得ること、および（ｔｖ）ｇｌ）１２０／ｇ ｌ）４１複合体が細胞−細胞融合によるＨＩＶの伝染に不可欠であると思われる ことである。

ＨＩＶｅｎｖを発現する組換えベクターによる数種の動物の予防接種は文献に記 述されている。これらの予防接種の試みは株特異的体液性免疫応答と共に細胞性 応答を引き出した（例えばＶａｎ　Ｅｅｎｄｅｎｂｕｒｕｇら、　ＡＩＤＳ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕ＋＊ａｎ　Ｒｅｔｒ。

ｖｉｒｕｓｅｓ　５（１）：４ｌ−５０（１９８９）　；　Ｈｕｅら、　Ｎａｔ ｕｒｅ　３２０：５３７−５４０（１９８６）　：　Ｃｈａ汲窒≠ｂ≠窒狽奄轣 B Ｎａｔｕｒｅ　３２０：５３５−５３７（１９８６）　；　Ｚａｒｌｉｎｇら、 　Ｎａｔｕｒｅ　３２３：３４４−３４６（１９８６）　；@Ｈｕｅら、Ｎａｔ ｕ ｒｅ　３２８ニア２ｌ−７２４（１９８７）　：　ｚａｇｕｒｙら、　Ｎａｔｕ ｒｅ　３２６：２４９−２５０（１９８７）　；　Ｚａｇｕ窒凾轣A　Ｎａｔｕ ｒｅ ３２２ニア２８−７３１（１９８８）を参照のこと）。

チンパンジーはＨＩＶに感染し得るヒト以外の唯一の霊長類であり、それゆえに チンパンジーはワクチン−抗原投与研究にとって最もヒトに近い動物モデルであ る。上述の免疫応答によって示唆される有望性にもかかわらず、公表されたワク チン研究はすべてＨＩＶによる感染からチンパンジーを保護することに失敗して いる（例えば、Ｈｕｅら、　Ｎａｔｕｒｅ　３２８ニア２ｌ−７２４（１９８７ Ｘワクシニアウィルス−ＨＩＶｅｎｖ組換えワクチン）、Ａｒｔｈｕｒら、Ｊ、 　Ｖｉｒｏｌ、　６３（１２）　＋５０４６−５０５３（１９８９）　（精製ｇ ｐ１２０）、Ｂｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　８５：５２００−５２０４（１９８８０組換えエンx ロープ糖タンパク質ｇｐ１２０）、およびＰｒ１ｎｃｅら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８５：６９４４−６９４８（１９８８Ｘ 精製ヒトＨＩｖ免疫グロブリン）を参照のこと）。

シミアン免疫不全ウィルス（Ｓ　Ｉ　Ｖ）は健康なアフリカザルに固有のレンチ ウィルスであり、ＳＩＶはＨＩＶに最も密接に関連する動物レンチウィルスであ る。

Ｌｅｔｖｉｎら、　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　８７．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂ　２０９−２１３（１９８７）は、不活化■■ ウィルスワクチンを用いてＳＩｖに対してマカクザルを免疫化しようと試みたが 失敗に終わったことを開示している。Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓら、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：６３５３−６３５７（１９ ８９）は、界面活性剤で破壊した全ウィルスＳＩＶワクチンによる免疫化によっ て６匹のマカクザルのうち２匹がＳＩＶに対して保護されたことを報告した。Ｍ ｕｒｐｈｅｙ−Ｃｏｒｂら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２９３−１２９７（１ ９８９）は、ホルマリンで不活化したＳＩｖ全ウィルスワクチンによる予防接種 によって９匹のアカゲザルのうち８匹がＳＩＶ抗原投与に対して保護されたこと を開示している。

したがって本発明の目的は、ＨＩＶ感染に対する保護的免疫応答を引き出し得る ワクチンを提供することにある。

本発明のさらなる目的は、そのようなＨＩＶワクチンの製造方法、ならびにＡＩ ＤＳの予防および治療のための適切な免疫化日程を提供することにある。

本発明の他の目的、性質および特徴は、以下の説明および請求の範囲を考究すれ ば明らかになるであろう。

発明の要約 本発明の目的は、ＨＩＶ感染を有するか、もしくはＨＩＶ感染を有する危険にあ るヒトまたはヒト以外の霊長票患者への投与に適したＨＩＶ抗原調製物を調製し 、ＨＩＶに対する保護的免疫応答を誘発するに足る量と免疫化日程に従って、こ れを投与することによって達成される。

本発明のワクチンは単独で、あるいは他のＨＩＶ抗原と組み合わせて、１回また は数回の免疫化投与で投与することができる。好ましい免疫化日程は、一般的に は比較的長期間の間隔をおいた頻繁でない免疫化、具体的には１〜２年もしくは それ以上の期間にわたって投与される３回以上の一連の接種であると記述される 。

本発明は具体的には、タンパク質加水分解開裂部位を有するが、その内部開裂の 開裂部位は、ＥＰ１８７０４１Ａに記述されているＨＩＶ株（一般にＩＩＩ　Ｂ として知られている）のｇｐ１２０のアミノ酸残基３１５〜３１６の間あるいは 他のＨＩＶ株の等価な領域に存在すると考えられる。

その種々の類縁体を含めて、患者試料中のＨＩＶ中和抗体についての診断的検定 にも有用である。

非開裂ｇｐ１２０およびｇｐ１６０の製造法を提供する。い（っかの態様として 、胎児ウシ（ｃａｌｆまたはｂｏｖｉｎｅ）血清の含有量が少ないかもしくは全 くない培地中で生育しだ補乳蔑細胞培養中でのｇｐ１２０の発現からなる発酵工 程を提供する。これらの発酵法は非開裂ＨＩＶｅｎｖポリペプチドを回収するた めの発現を促進する。本発明のワクチンの製造法をも開示する。

配位子に対するその親和性、エピトープ結合性、ならびにａ）ＣＤ４／ｇｌ）１ ２０結合を遮断する能力、ｂ）ＨＩＶウィルス粒子を中和する能力、Ｃ）インビ トロで逆転写酵素活性を減少させる能力、およびｄ）レンシチウム形成を阻害す る能力によって特徴づけられるモノクローナル抗体を提供する。特定の態様とし て、内部開裂部位を含有するｇｐ１２０の領域に特異的なモノクローナル抗体を 提供する。これらの抗体は患者あるいは患者試料中のＨＩＶ感染の存在に関する 診断手段として有用であり、また非開裂ｇｐ１２０あるいはｇｐ１６０のアフィ ニティー精製にも有用である。これらの抗体はＨＩＶに感染した患者を受動的に 免疫化する際にも有用である。

この開裂部位をまたぐエピトープに対する抗体は文献に記述されているが、現在 のところ著者間でＨＩＶｅｎｖ配列に関する番号付与系が多様であり混乱してい るので、アミノ酸３１５〜３１６を含む領域を指向するとして文献に記述されて いる抗体のすべてが、実際に本明細書に定義する開裂部位をまたいでいるわけで はなイコとに注意すべきである（例えば、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、Ｊ、　Ｖｉ ｒｏｌ、　６２：２１０７−２１４４（１９８８）　：　Ｅ　Ｐ　Ｏ出願番号Ｅ Ｐ３３９５０４　：　Ｒｕ５ｃｈｅら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳ`、　８５　：３１９８− ３２０２（１９８８）　：　Ｌｏｏｎｅｙら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：３５７ −３５９（１９８８）を参照のこと）。

ある種の態様として、Ｔ４細胞マーカーＣＤ４に対する組換えｇｐ１２０の結合 を少なくとも部分的に遮断し得る抗体を提供する。別の態様として、ＨＩＶＩ： 感染した細胞と非感染細胞との間のレンシチウム形成を少なくとも部分的に遮断 することができ、および／または、逆転写活性を少なくとも部分的に遮断するこ とができる抗体を提供する。

図面の簡単な説明 図１は、ＨＩＶ−１のＩＩＩ　Ｂ単離物由来のｇｐ１２０の模式図であり、１文 字コードで示したアミノ酸配列［配列番号１］と共に、ジスルフィドおよびグリ コジル化部位を示している。５個のジスルフィド結合ドメインにローマ数字を付 す。

Ｍｏｄｒｏｖら、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１：５−７Ｏ−５７８（１９８７） の５つの超可変領域を四角く囲み、■１〜ｖ５で示す。高マンノース型および／ またはノゾブリッド型オリゴ糖構造を含有するグリコジル化部位を枝別れしたＹ 記号で示し、複合型オリゴ糖構造を含有するグリコジル化部位をＶ型記号で示す 。開裂部位を矢印で示す。

図２は、（ａ）ＨＩＶ−１のＩＩＩＢ単離物由来の成熟）（ＩＶｅｎｖ糖タンパ ク質ｇｐ１２０の３文字コードで表したアミノ酸配列［配列番号１］、および（ ｂ）単純ヘルペスウィルスｇＤ１由来の組換え融合糖タンパク質（９ＡＡ　［配 列番号２コまたはＣＬ４４　［配列番号３］）のＮ末端配列部分のアミノ酸配列 を表す。９ＡＡおよびＣＬ４４構築物中のｇＤｌおよびｇｐ１２０セグメント間 の融合部位をそれぞれ（＊）および（＊＊）で記す。文字Ｔはｇｐ１２０セグメ ントについて認められたトリプシン切断を表し、それらのペプチドをその分子の Ｎ末端から出発して順番に並べである。子番号に続く小文字は他の予期しなかっ たタンパク質加水分解切断を示す。文字ＨはＣＬ４４の単純ヘルペスｇＤ１タン パク質部分について認められたトリプシン切断を表す。ペプチドＴ２’はＣＬ４ ４中の融合部位を含有する。ｇｐ１２０のシスティン残基を四角く囲み、潜在的 Ｎ−グリコジル化部位を対応するアスパラギン残基上の点で示す。

図３は、実施例１に記述する予防接種に使用するｒｇｐ１２０および５ｇｐＨ６ ０免疫原の組成物を表す。

図３Ａは、ＨＩＶ−１糖タンパク質前駆体ｇｐ１６０ならびに本研究で使用した ２種類の変種ｇｐ１６０誘導タンパク賀ｒｇｐ１２０およびＳｇｐ１６０の模式 図である。両タンパク質は野生型ｇｐ１６０とはそのアミノ末端が異なっている 。ｒｇｌ）１２０タンパク質ではｇｐ１６０のシグナル配列および３１残基が単 純ヘルペスウィルス１型糖タンパク質Ｄ（Ｈ３Ｖ−１ｇＤ）”のシグナル配列お よび成熟Ｎ末端由来の２５アミノ酸で置換されている。ｓｇｐ１６０タンパク質 では、ｇｐ１６０のシグナル配列および１２アミノ酸がＨ３Ｖ−１ｇＤのシグナ ル配列および成熟Ｎ末端由来の９アミノ酸で置換されている。さらに、アミノ酸 残基５０２〜５１１にわたる欠失によって、正常なｇｐ１２０／ｇｐ４１タンパ ク質加水分解プロセシング部位が除去されている。

図３Ｂは、精製したｒｇｐ１２０およびＳｇｐ１６０の還元条件下および非還元 条件下での銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥを表す。免疫アフィニティークロマトグラフ ィーおよびゲル透過クロマトグラフィーを用いて、雨組換え糖タンパク質を成長 調整細胞培養上清から、ｒｇｐ１２０については９９％以上の純度で、８９ｇ１ ６０については９５％以上の純度で精製した。非還元条件下でｒｇｐ１２０は５ ％未満の二量体を含有し、一方ｓｐｇ１６０は約５０％が二量体もしくはより高 次のオリゴマーであった。両タンパク質を、各分子のｇｐ１２０部分のＶ３領域 中のアルギニン残基３１５とアラニン残基３１６の間の内部タンパク質加水分解 切断にかけた。ｒｇｐ１２０ではこれによって７５ｋＤのＮ末端断片と５０ｋＤ のＣ末端断片が生成し、ｓｇｐ１６０では同じ切断によって共に約７５ｋＤの２ つの断片が得られる。５ＤＳ−ＰＡＧＥでは、システィン残基２９６と３３１と の間のジスルフィド結合ゆえに、還元条件下でのみこれらの断片が観測される。

このｒｇｐ１２０調製物の切断型含量は５％未満であったが、Ｓｇｐ１６０の約 ４０％は切断された。

図４は、本発明の抗体の、ＩＩＩ　Ｂ以外のＨＩＶ−１単離物との交差反応性を 表す免疫プロットの結果を示す。

図５は、Ｓｇｐ１６０に対する１０種類のモノクローナル抗体の分析を示すオー トラジオグラフである。３つの主要バンド、即ち、Ｓｇｐ１６０に対応する１４ ０ｋＤバンド、ｒｇｐ１２０に対応する１１０〜１２０ｋＤバンド、ならびにｇ ｐ１２０およびＳｇ＋）１６０のタンパク質加水分解産物を表す７５ｋＤバンド が、試験した血清の１以上によって特異的に免疫沈降することがわかる。

図６は、ＨＩＶ−１ワクチン候補で免疫化した動物におけるｒｇｐ１２０および ｓｇｐ１６０に対する抗体の生産を示す。チンパンジーを０週、４週、および３ ２週（矢印）の時点で、１投与あたり３００μｇのｒｇｐ１６０（ｘ−２４７お よびｘ−２６１）、ｒｇｐ１２０（Ｘ２６２およびｘ−２６５）または単純ヘル ペスウィルス糖タンパク質Ｄ（ｘ−２４６）で免疫化した。すべての免疫原を、 タンパク質ｌｌ１ｇあたり２ｍｇ当量のＡ１゛３を含有する水酸化アルミニウム 佐剤（アジュバント）中に組み込んだ。表示の時点で血液を採取し、特定のパネ ルについての説明のそれぞれで記述する検定法で、その血清をｒｇｐ１２０また はＳｇｐ１６０に対する抗体について分析した。３５週の時点ですべての動物に ４０ＴＣＩＤｓｏ単位のＨＩＶ−１を静脈内注射することにより抗原投与（チャ レンジ）した。口および■はｒｇｐ１２０で免疫化した動物、それぞれＸ２６２ およびＸ２６５を表す。

対照動物Ｘ２４６を△で表す。

図６Ａは、液相放射性免疫沈降検定法における１２Ｊ標識ｒｇｐ１２０の免疫沈 降によるｒｇｐ１２０に対する抗体の検出を表す。

図６Ｂは、市販（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）のＨＩＶ−１抗体検定キッ ト（ＥＬＩＳＡ）を用いるＨＩＶ−１タンパク質に対する抗体の検出を示す。測 定はキット製造者の指示に従って行った。

図７は、ＨＩＶ−１ワクチン候補で免疫化した動物から得た血清の免疫プロット 分析を示す。ｓ　ｇｐ　１６０（ｘ−２４７，ｘ−２６１）、ｒｇｐ１２０（ｘ −２６２゜ｘ−２６５）あるＬｌｔＨ３Ｖ−１ｇＤ（ｘ−２４６）で免疫化した チンパンジーから得た血清を希釈し、市販（Ｄｕｐｏｎｔ）の免疫プロットスト リップ（小片）と共にインキュベートした。このストリップを、ヤギ抗ヒトＩｇ Ｇに結合したアルカリ性ホスファターゼ（Ｃａｐｐｅｌ）と共にインキュベート し、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓか ら入手したホスファラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈａｒａｓｅ）基質系で展開した。表示 したデータは同じロットの検定ストリップを用いて同じ日に得た結果を表す。第 ３５週は抗原投与の時点を表す。ＨＩＶ−１感染個体から得た血清を陽性対照と した。

図８は、インビトロでＨＩＩＩ感染性を中和し、主要型特異的中和決定基（ＭＮ Ｄ）に結合する抗体を示す。口および■はｒｇｐ１２０で免疫化した動物、それ ぞれ２６２および２６５から得た血清を表す。Ｏおよび・はｒｓｇｐ１６０で免 疫化した動物、それぞれ２４７および２６１から得た血清を表す。△は対照動物 （ｘ　２４６）を表す。

図８Ａは、Ｒｏｂｅｒｔｏｓｏｎら、　Ｊ、　ｖｉｒｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ２０：１９５−２０２（１９８８）が記述したものと同様の中和検定法における 、ｒｇｐ１２０およびｓｇｐ１６０で免疫化したチンパンジーから得た血清中の インビトロ中和活性を示す。希釈した血清試料を１００　ＴＣＩＤ、。単位のウ ィルス（ＩＩＩＢ単離物）と共に２０℃で６０分間インキュベートした。この混 合物を５ｘｌＯ’ＭＴ４細胞を含有する細胞培養プレートに移し、７日間インキ ュベートした。ＭＴＴを生体染色剤として用いることによって、感染細胞のウィ ルス溶解を検出した。中和検定は１対行った。複製間の偏差は１希釈（２倍）未 満であった。ＨＩＶ−１感染チンパンジーおよび非感染チンパンジーから得た血 清をそれぞれ陽性対照および陰性対照として用い、これらはそれぞれ１：６４０ および＜１：１０の中和力価であった。

図８Ｂは、ＭＮＤと反応する抗体の相対濃度を決定するためのＥＬＩＳＡ検定の 結果を示す。このＥＬＩＳＡ検定では配列ＮＮＴＲＫＳＩＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰ ＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧ　［配列番号４コからなりＩ工より単離物のｇｐ１２０ のアミノ酸残基３０１〜３２４に対応する合成ペプチドを用いて２μｇ／＋ａｌ の濃度で微量滴定皿をコートした。４℃で終夜インキュベートした後、被覆ウェ ルを０１０５％トウーン２０を含有するリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し 、ＰＢＳ中の領８％ウシ血清アルブミンからなる遮断緩衝液で処理した。チンパ ンジー血清の各試料を１．１０から１：１０２４０までの範囲にわたって連続的 に希釈し、１００μｍを上記ウェル中室温で１５時間インキュベートした。次に 、００５％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳでウェルを４回洗浄した。ヤギ 抗ヒトＩｇＧと結合した標識西洋ワサビペルオキシダーゼを１時間インキュベー トし、そのプレートをＰＢＳ、０．０５％トリトンＸ−１００で４回洗浄した。

抗体結合は基質０−フェニレンジアミン・二塩酸塩を添加した後の変色によって 示された。この比色反応を２．５Ｍ　Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止させ、４９ ２ｎｍの吸光度をプレート読み取り分光光度計で測定した。

よびアミノ酸配列変種と共に、ヒト免疫不全ウィルスのエンベロープポリペプチ ドと定義される。本明細書で用いる場合、用語“ＨＩＶｅｎｖ”はｇｐ１２０お よび／または１６０のすべての形態（例えば断片、ｇｐ１６０／１２０もしくは それらの断片の他のペプチドとの融合物、および異なるグリコジル化を受けてい るえば、ＥＰ公開番号１８７０４１を参照のこと。以下、組換え細胞培養中で製 造されたｇｐ１２０をｒｇｌ）１２０と記載する。安全で経済的であるがゆえに 組換え合成が好ましいのであるが、化学合成によるペプチド製造およびウィルス 培養ムクローンから得られる。

本発明は、本明細書では“開裂部位”と称する内部切断部位を有するが、この部 位で開裂していないｇｐ１２０またはｇｐ１６０（好ましくはｇｐ１２０）に関 する。本明細書ではこれらのポリペプチドを“非開裂ＨＩＶｅｎｖ”と記載し、 またより具体的には“非開裂ｇｐ１２０“もしくは“非開裂ｇｐ１６０“と記載 する。この開裂部位はタンパク質加水分解切断に対して感受性の塩基性または二 塩基性残基である。

本明細書で使用する場合、用語“開裂部位”はｇｐ１２０とｇｐ４１を架橋する 切断部位を意味せず、そのかわりにＨＴＬＶ−工ＩＩＢのｇｐ１２０中のＡｒｇ −ＡｌａまたはＡｒｇ−Ｖａｌ残基間、あるいは現在米国およびアフリカで一般 的なＨＩＶ株ならびに８１７株中の同様の状況下にある残基間に位置するタンパ ク質加水分解開裂部位を意味する。５ｔｅｐｈｅｎｓら、　Ｎａｔｕｒｅ　３４ ３：２１９（１９９０）を参照のこと。

図１に矢印で示したように、この開裂部位は、シグナル配列または他の上流領域 を数えない場合、成熟ＨＩＶ−１ｇｐ１２０アミノ酸配列のアミノ酸残基２８５ 〜２８６の間に位置する。天然のＨＩ　Ｖ−ＩＩＩＢ　Ｎ末端シグナル配列を含 むｇｐ１２０配列については開裂部位が残基３１５〜３１６の間に認められ、開 裂部位が位置する残基を都合よく表示するために本明細書の全記述を通してこの 番号付与系を使用するが、本発明がこれらの特定の残基番号における開裂部位に 限定されないことは理解される。上流の欠失や挿入がウィルスゲノムおよびＨＩ Ｖｅｎｖの長さを変化させている他の株には同じヌクレオチドおよびアミノ酸残 基番号を適用できないであろうが、ｇｐ１２０のこの部分をコード化する領域は 本明細書の教示を参照することにより容易に同定される。また、変種シグナル配 列（例えば、後述のように断片化したシグナル配列もしくは異種シグナル配列と の融合によってもたらされるもの）はわずかに異なる番号付与法を導き得るが、 図１（＝矢印で示した位置を参考にして、すべての態様について開裂部位の位置 が認識される。

ュヱの脱グリコリル化または非グリコジル化誘導体、図１または図２の配列の相 同的アミノ酸配列変種、および非開裂ＨＩＶｅｎｖのインビトロで生成した相同 的変種および誘導体はすべて、そのような変化が開裂部位に干渉せず、図１また は図２のＨＩＶｅｎｖと共通の生物学的活性を発揮し得るという条件の下で、本 明細書で用いる用語としての非開裂ＨＩＶｅｎｖの範囲に包含される。

開裂ＨＩＶ且ユヱまたはＨＩＶ且ユヱ断片もしくは非開裂ＨＩＶ旦旦ヱまたはＨ ＩＶｅｎｖ断片の生物学的活性は、１）開裂または非開裂ＨＩＶｅｎｖの少なく とも１つのエピトープとの免疫学的交差反応性、あるいは２）開裂または非開裂 ＨＩＶｅｎｖと定性的に共通する少なくとも１つの接着もしくはエフェクター機 能を保持すること、のいずれかと定義される。ＨＩＶｅｎｖの定性的生物学的活 性の例には、ウィルス受容体ＣＤ４に対するｇｐ１２０の結合能力、およびｇｐ ４１と相互作用することによりウィルスと宿主細胞膜の融合を誘発するｇｐ１２ ０の能力が含まれる。

本明細書で用いられる免疫学的交差反応性とは、候補ポリペプチドが、既知の活 性類縁体に対して生じたポリクローナル抗血清とのこの反応性を有する開裂また は非開裂ＨＩＶｅｎｖの定性的生物学的活性を競争的に阻害し得ることを意味す る。このような抗血清は、従来の方法に従って、例えば完全フロインドアジュバ ント中の既知の活性類縁体をヤギまたはウサギの皮下に注射し、次いで不完全フ ロイントでブースター（追加免疫）腹腔内または皮下注射することによって調製 される。

現在のところ、本発明の非開裂ＨＩＶｅｎｖｇＩＩ製物は開裂ＨＩＶｅｎｖ断片 を本質的に含有しないことが好ましい。本質的に含有しないとは、その調製物の ５０％以上、より好ましくは６０〜７０％、さらにより好ましくは８０％、最も 好ましくは少なくとも９０％が開裂ＨＩＶｅｎｖ断片を含有しないことを意味す る。

ｇｐ１２０分子は６００００ダルトンのポリペプチド核からなり、Ｎ−結合型グ リコシル化による高度な修飾によって、その見かけ上の分子量が１２００００に 増大している（Ｌａｓｋｙら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：２０９−２１２（１９ ８６））。ｇｐ１２０のアミノ酸配列は、５つの超可変ドメインによって分断さ れた５つの比較的保存されたドメインを含有している（Ｍｏｄｒｏｗ、上述）。

超可変ドメインは高度なアミノ酸置換、挿入および欠失を含有する。これらのド メインにおける配列変化は種々のウィルス単離物由来のｇｐ１２０分子間に２５ ％までの総配列可変性をもたらす。この変化にもかかわらず、ｇＰ１２０のいく つかの構造的要素および機能的要素は高度に保存されている。これらには、ウィ ルス受容体ＣＤ４に結合するｇｐ１２０の能力、ｇｐ４１と相互作用してウィル スと宿主細胞膜の融合を誘発するｇｐ１２０の能力、ｇｌ）１２０−欠配列中に 存在する１８システイン残基の位置、ならびにｇｐ１２０配列中の約２３個のＮ −結合型グリコシル化部位のうち１３部位の位置が含まれる。

当業者は、突然変異誘発および断片変種を指揮するために、ｇｐ１２０内のジス ルフィド結合様式および該分子上の実際のオリゴ糖部分の位置を利用することが できる。本発明の変種は、ｅｎｖアミノ酸配列配列内裂部位以外の１以上の残基 が置換されている非開裂ＨＩＶｅｎヱ、！旦ヱ配列内の開裂部位以外の１以上の 残基の欠失体、および開裂部位内を除（いずれかの残基に隣接する１以上の残基 の挿入体を包含すると見なされる。

Ｌａ５ｋｙら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：２０９−２１２（１９８６）は、単純 ヘルペスウィルス１型糖タンパク質Ｄ（ｇＤｌ）のシグナルペプチドを用いる融 合物として、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）中でｇｐ１２０を発現さ せたことを記述している。本発明の実施には２種類のこのような融合タンパク質 の使用が好ましい。組換え塘タンパク質（ＣＬ　４４）は、ｇｐ１２０の残基３ １〜５０１に融合したｇＤｌの最初の２７残基を含有する４９８アミノ酸の融合 タンパク賃として発現する。この構築物は成熟ｇｐ１２０の最初のシスティン残 基を欠（。もう１つの好ましい組換え融合タンパク質（９ＡＡ）はｇｐ１２０の 残基４〜５０１に融合したｇＤｌの最初の９残基を含有する。これによって最初 のシスティン残基であるＣｙｓ−２４が回復する。カルボキシペプチダーゼ消化 を用いるＣＬ４４のカルボキシ末端分析は、グルタミン酸残基４７９がＣＨＯに よって分泌される完全にプロセシングされた分子のカルボキン末端であることを 示す（データ非開示）。これら２つの構築物のアミノ酸配列を図２に記載する。

本発明は非開裂ＨＩＶｅｎｖのアミノ酸配列変種をも包含する。アミノ酸配列変 種は、配位子または抗体に対する非開裂ＨＩＶｅｎｖの親和性を増大させたり、 非開裂ＨＩＶｅｎｖの安定性、精製および製造を促進したり、その血漿半減期を 変化させたり、医薬的効力を改善したり、非開裂ＨＩＶｅｎｖを医薬的に使用す る際の副作用の重篤度または出現を軽減させることを含む種々の目的をもって製 造される。以下の議論では、非開裂ＨＩＶｅｎｖのアミノ酸配列変種を選択され 得る変種の代表例として記載する。

非開裂）（ＩＶｅｎｖのアミノ酸配列変種は、挿入的変種、置換的変種、および 欠失的変種という３つの種類の１以上に属する。これらの変種は通常、非開裂Ｈ ＩＶｅｎｖをコード化するＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発に よって製造される。即ち、この部位特異的突然変異誘発によって変種をコード化 するＤＮＡを得た後、そのＤＮＡを組換え細胞培養中で発現させる。しかし、約 １００〜１５０アミノ酸残基までを有する断片はインビトロ合成によって便利に 製造される。以下の議論はあらゆる非開裂ＨＩＶｅｎｖに、その構造または機能 に適用可能な範囲で適用される。

非開裂ＨＩＶｅｎｖのアミノ酸配列変種は、天然もしくは天然に存在する対立し 定性的生物学的（例えば抗体結合）活性を発揮する。しかし抗体に対して結合で きない非開裂ＨＩＶｅ旦ヱ変種および誘導体であっても、（ａ）ＨＩＶｅ旦ヱも しくはＨＩＶｅｎｖに対する抗体の診断的検定における試薬として、（ｂ）既知 の方Ｖに対する抗体を生じさせるための免疫原として、もしくは免疫検定キット 成分標識のものは非開裂ＨＩＶｅｎｖ検定の標準として）、少なくとも１つのＨ ＩＶｅｎｖエピトープが活性な状態で残うている限り有用である。

アミノ酸配列変化を導入する部位は予め決定されるが、変異自体を予め決定する 必要はない。例えば、ある与えられた部位での変異の効果を最適化するために、 標的コドンにおいてランダム突然変異誘発もしくは飽和突然変異誘発（この場合 、考え得る２０残基すべてを挿入する）を行い、発現したＨＩＶｅｎＶ変種を望 ましい活性の最適な組み合わせについてスクリーニングする。このようなスクリ ーニングは当該技術分野の通常の技術に属する。

アミノ酸挿入は通常およそ１から１０アミノ酸残基までの程度であろう。置換は 典型的には単独の残基について導入する。欠失はおよそ１から３０残基の範囲で あろう。欠失または挿入を隣接する対で行うこと（即ち、２残基の欠失もしくは ２残基の挿入）が好ましい。置換、欠失、挿入、もしくはそれらのあらゆる組み 合わせを導入もしくは組み合わせることによって最終構築物に到達することは、 以下の議論より十分明らかになるであろう。

非開裂ＨＩＶｅ旦ヱの挿入的アミノ酸配列変種は、そのＨＩＶｅｎｖにとって異 種の１以上のアミノ酸残基が標的非開裂ＨＩＶｅｎｖ内の予定された部位中に導 入され、それが先夜の残基を転置させたものである。

一般に挿入的変種は、非開裂ＨＩＶｅｎｖのアミノ末端もしくはカルボキシル末 端に対する異種タンパク質またはポリペプチドの融合物である。このような変種 を、非開裂ＨＩＶｅ旦ヱとその非開裂ＨＩＶｅユヱの挿入位置に通常認められる 配列以外の配列を含有するポリペプチドとの融合物という。本発明には数群の融 合物が包含される。

本発明の新規ポリペプチドは診断あるいは既知の免疫アフィニティー技術による 抗体または配位子の精製において有用である。

非開裂ＨＩＶｅｎｖの望ましい融合物（免疫学的に活性であってもよいし、ある いは免疫学的に活性でなくてもよい）には、上述のように、成熟非開裂ＨＩＶｅ ｎｖと該結合パートナ−にとって異種のシグナル配列との融合物が含まれる。

シグナル配列融合物は、非開裂ＨＩＶｅ旦ヱの分泌をより能率的に指示するため に使用される。異種シグナルで天然型のＨＩＶ二旦Ｙシグナルを置換し、それに よって得られる融合物が認識される場合、即ち、宿主細胞によるプロセシングを 受け、宿主細胞によって切断される場合には、非開裂ＨＩＶｅｎｖが分泌される 。

シグナルは意図した宿主細胞に基づいて選択され、これらには細菌、酵母、補乳 類およびウィルス配列が含まれ得る。天然型ＨＩＶｅｎｖシグナルまたはヘルペ スｇＤ糖タンパク質シグナルが哺乳顕発現系での使用に適している。

非開裂ＨＩＶ且旦ヱまたは非開裂ＨＩＶｅユヱ断片と免疫原性のハプテンまたは 異種ポリペプチドとのＣ末端またはＮ末端融合物は、ＨＩＶ感染に対して患者を 免疫化するためのワクチン成分として有用である。ハプテンまたは異種ポリペプ チドとＴ細胞結合活性を保持する非開裂ＨＩＶｅｎｖまたはその活性断片との融 合物は、そのハプテンまたは異種ポリペプチドが標的表面受容体に結合し得る標 的細胞に対して細胞障害性Ｔ細胞を指向させる際に有用である。例えば、膜結合 性トラスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）は多くの固形（非造血）新生 物腫瘍の表面に存在する。ＴＧＦ−αを結合し得る抗体は知られており、これら を、例えば一般に知られている方法に従って共有結合架橋することによって、あ るいは組換え細胞培養中で非開裂ＨＩＶｅ旦ヱあるいは活性断片とのＮ末端また はＣ末端融合物として発現させることによって、非開裂ＨＩＶｅｎｖに結合させ ることができ、これを用いて非開裂ｇｐ１２０をＴＧＦ−αに誘導することがで きる。

融合を行う正確な部位は変化し得、特定のＨＩＶｅｎｖの部位はよ（知られてお り、その非開裂ＨＩＶｅｎｖの生物学的活性、分泌あるいは結合特性を最適化す るために選択し得る。特定の実施にとって最適な部位は日常的な実験により決定 されるであろう。

置換的変種は、図１または図２の配列中の（開裂部位の残基以外の）少なくとも １残基が除去されて、異なる残基がその場所に挿入されているものである。この ような置換は、非開裂ＨＩＶｅｎｖの特徴を精密に調節することを望む場合には 、一般に次の表１に従って行われる。

Ａｓｎ　ｇｉｎ；ｈｉｓ Ａｓｐ　ｇｌｕ Ｃｙｓ　ｓｅｒ＋ａｌａ Ｈｉｓ　ａｓｎ；ｇｉｎ ｌｌｅ　ｌｅｕ；ｖａｌ Ｌｅｕ　ｉｌｅ；ｖａｌ Ｌｙｓ　ａｒｇ；ｇｌｎ；ｇｌｕ Ｍｅｔ　Ｉｅｕ：１Ｉｅ Ｐｈｅ　ｍｅｔ：ｌｅｕ：ｔｙｒ Ｔｙｒ　ｔｒｐ；ｐｈｅ Ｖａｌ　ｔｉｅ：Ｉｅｕ 新規アミノ酸配列は活性中心類縁体（アミノ酸その他）と共に本発明の範囲に包 含される。

機能上の同一性あるいは免疫学的同一性の本質的な変化は、表１の置換よりも保 存性の低い置換を選択することによって、即ち、（ａ）置換領域中のポリペプチ ド骨格の構造、例えばンートまたはらせん配座、（ｂ）標的部位おける分子の電 荷あるいは疎水性、もしくは（Ｃ）側鎖の嵩高さ、の維持に対する影響がより有 意に異なる残基を選択することによって起こる。一般に非開裂ＨＩＶｅｎｖの性 質に最大の変化を生み出すと予想される置換は次の置換であろう＝（ａ）親水性 残基（例：セリンまたはスレオニン残基）で（を）疎水性残基（例：ロイシン、 イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、またはアラニン残基）を（に）置換 する、（ｂ）システィンまたはプロリンで（を）他の残基を（に）置換する、（ Ｃ）正荷電側鎖を有する残基（例：リジン、アルギニン、またはヒスチジン残基 ）で（を）負荷電残基（例：グルタミン酸またはアスパラギン酸残基）を（に） 置換する、あるいは（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（例：フェニルアラニン）で （を）側鎖を持たない残基（例ニゲリシン）を（に）置換する。

い（つかの欠失、挿入、および置換は、非開裂ＨＩＶｅｎｖ分子の特徴に根本的 な変化をもたらさないであろう。しかし、置換、欠失、あるいは挿入の正確な効 果を前以て予測することが困難な場合（例えば免疫エピトープを修飾する場合） には、日常的なスクリーニング検定法によってその効果が評価されることを当業 者は理解するであろう。例えば典型的な場合、変種は、非開裂ＨＩＶｅｎヱをコ ード化する核酸の部位特異的突然変異誘発、組換え細胞培養中での該変種核酸の 発現、ならびに任意の工程として、例えば（少な（とも１つの残存免疫エピトー プで該変種を吸着するための）ポリクローナル抗非開裂ＨＩＶｅｎｖカラムへの 免疫アフィニティー吸着による、その細胞培養からの精製、によって作成される 。

次いでその細胞溶解液もしくは精製した非開裂ＨＩＶｅｎｖ変種の活性を、望ま しい特徴に適したスクリーニング検定法でスクリーニングする。例えば、Ｔ細胞 結合に対する親和性などの非開裂ＨＩＶｅｎｖの免疫学的特徴の変化は競争型免 疫検定法によって測定される。非開裂）（ＩＶｅｎｖのインビボ機能についてよ り多くの知見が得られるようになれば、他の検定法もこのようなスクリーニング に有用になるであろう。酸化還元安定性、熱安定性、疎水性、タンパク質加水分 解減成に対する感受性、担体との凝集傾向、あるいは多量体への凝集傾向などの タンパク貢特性の変化は当業者のよく知る方法によって検定される。

非開裂ＨＩＶｅｎｖ変種のもう１つの種類は欠失的変種である。欠失は、（開裂 部位以外の）１以上のアミノ酸残基の、ＨＩＶｅｎｖ配列からの除去を特徴とす る。典型的には、非開裂ＨＩＶｅｎｖの生物学的活性に影響を与えるために欠失 を用いるのであるが、非開裂ＨＩＶｅｎｖの生物学的活性あるいは免疫交差反応 性を保存する欠失が適切である。

システィンあるいは他の不安定残基の欠失も、例えば非開裂ＨＩＶｅｎヱの酸化 安定性を増大させる際などに望ましいであろう。潜在的タンパク質加水分解部位 （例：　ＡｒｇＡｒｇ）の欠失もしくは置換は、これらの塩基性残基の１つを削 除するか、あるいはグルタミン残基またはヒスチジン残基で置換することによっ て達成される。

い（つかの変種が生物学的活性の減少もしくは喪失を示し得ることは理解される であろう。それでもこれらの変種は、それらがＨＩＶｅｎＶの免疫エピトープを 少なくとも１つ保持している限り、ＨＩＶｅｎｖについての免疫検定における標 準として有用である。

現在のところ、本発明の非開裂ＨＩＶｅｎｖ組成物の３次元構造が本明細書に記 述するそれらの機能にとって重要であると考えられる。したがって、請求の範囲 の組成物が形成する活性構造を模倣するすべての関連する構造類縁体は特に本発 明の範囲に包含される。

（以下余白） グリコジル化変種は非開裂ＨＩＶｅｎｖの範囲に包含される。これらには、グリ コジル化を完全に欠く変種（非グリコシル化体）および天然型より少なくとも１ つはグリコジル化された部位が少ない変種（脱グリコジル化体）ならびにグリコ ジル化が変化している変種が含まれる。脱グリコジル化および非グリコジル化ア ミノ酸配列変種、天然型の未改変ＨＩＶｅｎｖアミノ酸配列を有する脱グリコリ ル化および非グリコジル化非開裂ＨＩＶｅｎｖ、および他のグリコジル化変種が 包含される。例えば、置換もしくは欠失突然変異誘発を利用して非開裂ＨＩＶｅ ｎヱのＮ−結合型もしくは〇−結合型グリコリル化部位を除去する（例えば、（ 開裂部位でない）アスパラギン残基を除去するか、あるいは他の塩基性残基（リ ジンまたはヒスチジンなど）で置換する）。別法として、グリコジル化認識部位 を除去することによってグリコジル化を防止するために、アスパラギン残基に手 を加えることな（、グリコジル化部位を形成する隣接残基を置換または削除する 。

原核生物はポリペプチドにグリコジル化を導入する能力を有さないので、天然型 ＨＩＶｅｎｖのアミノ酸配列を宵する非グリコジル化非開裂ＨＩＶｅｎｖは組換 え原核細胞培養中で生産される。

グリコジル化変種は適切な宿主細胞を選択することによって、あるいはインビト ロ法によって製造される。例えば、酵母は哺乳類系とはかなり異なるグリコジル 化を導入する。さらに、ＨＩＶｅｎｖ抗原の供給源とは異なる種（例・ハムスタ ー、ネズミ、昆虫、ブタ、ウシまたはヒツジ）や異なる組織（例：肺、肝臓、リ ンパ系、間充織または表皮）由来の哺乳動物細胞も、例えばマンノースのレベル の上昇や、マンノース、フコース、ンアル酸、および哺乳類糖タンパク質中に典 型的に認められる他の糖類の比率の変化などによって特徴づけられる変化したグ リコジル化を導入するその能力について日常的にスクリーニングされる。非開裂 ＨＩＶｅｎｖのインビトロ・プロセシングは、典型的には、酵素的加水分解（例 ：ノイラミニダーゼ消化）によって達成される。

開裂部位を修飾しない非開裂ＨＩＶｅｎｖ分子の共有結合的修飾は本発明の範囲 に包含される。このような修飾は、回収したタンパク質の標的アミノ酸残基を、 選択した側鎖もしくは末端残基と反応し得る有機誘導体化試薬と反応させること によって、あるいは選択した組換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾の機構を利 用することによって、導入される。得られた共有結合的誘導体は、生物学的活性 、ＨＩＶｅｎｖの免疫検定、あるいは組換え非開裂ＨＩＶｅｎｖを免疫アフィニ ティー精製するための抗非開裂ＨＴＶｅユヱ抗体の調製にとって重要な残基を同 定することを目指す計画において有用である。例えばニンヒドリンとの反応後に タンパク質の生物学的活性が完全に失活する場合、それは少なくとも１つのアル ギニン残基もしくはりジン残基がその活性に極めて重要であることを示唆するも のであり、その後修飾されたアミノ酸残基を含有するペプチド断片を単離するこ とによって、選択した条件下で修飾された個々の残基を同定する。このような修 飾は当該技術分野における常法に属し、おびただしい実験を伴うことなく実行さ れる。

二官能性試薬による誘導体化は、非開裂ＨＩＶｅｎｖのポリペプチドとの分子間 集合体を調製する際、ならびにその配位子の検定あるいはアフィニティー精製で 用いるために非開裂ＨＩＶｅｎｖを水不溶性の支持マトリックスまたは表面に架 橋する際に有用である。さらに、鎖内架橋の研究は立体配置構造に関する直接的 情報を提供するであろう。一般に使用される架橋試薬には、スルフヒドリル試薬 、１．１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド 、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば４−アジドサリチル酸とのエ ステル）、ホモ三官能性イミドエステル（３，３°−ジチオビス（スクシンイミ ジル−プロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含む）、およびビ ス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが含まれる。

メチル−３−［（ｐ−アジド−フェニル）ジチオコブロビオイミデートなどの誘 導体化試薬は、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化中間体を与える。別法と して、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性水不溶性マトリックスおよび米国 特許第３９．５９０８０号、同第３９６９２８７号、同第３６９１０１６号、同 第４１９５１２８号、同第４２４７６４２号、同第４２２９５３７号、同第４０ ５５６３５号、および同第４３３０４４０号に記述された系反応性基質がタンパ ク質の固定化および架橋に使用され一般的には、ポリマーは、そのポリマーおよ びタンパク質の１以上のアミノ酸残基もしくは糖残基と反応する多官能性架橋試 薬を介して本発明のペプチドに共有結合される。しかし、誘導体化したポリマー を本ペプチドと反応させるか、あるいはその逆によって、ポリマーを直接的に架 橋することも本発明の範囲に包含される。アミノ基に対する共有結合は、シアヌ ル酸、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応性基（ＰＥＧアルコキシド＋ ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；　ＰＥＧ＋ＤＭＳＯおよび酢酸 無水物、あるいはＰＥＧ塩化物＋４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシ ト、スクシンイミジル活性エステル、活性化ジチオカーボネートＰＥＧ、２，４ ．５−トリクロロフェニルクロロホルメートまたはｐ−ニトロフェニルクロロホ ルメート活性化ＰＥＧ）に基づく既知の化学によって達成される。カルボキシル 基はカルボジイミドを用いてＰＥＧ−アミンをカップリングさせることにより誘 導体化される。

ある種の翻訳後誘導体化は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作 用の結果である。グルタミル残基およびアスパラギニル残基はしばしば翻訳後に 脱アミド化されて対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基に変換される 。あるいは、これらの残基は温和な酸性条件下で脱アミド化される。これらの残 基のどちらの形態も本発明の範囲に包含される。

他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基また はスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン 側鎖のα−アミン基のメチル化（Ｔ、　Ｅ、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　？ｒｏｔ ｅｉｎｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔ ｉｅｓ”（ｆ、　Ｅ［、Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、　、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃ ｉｓｃｏ）、　７９−８６頁（P９８３））、Ｎ末 端アミンのアセチル化、および場合により、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が含 か、もしくはｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーから容易に得られる。非開裂ＨＩＶｅ ｎヱをコード化するＤＮＡの合成的作成手段は、手動による場合も、自動化装置 による場合も、特に本明細書の教示に照らして、当業者に一般に知られている。

ポリヌクレオチド合成に関連する技術分野の現状の例として、Ｍａｎｉａｔｉｓ ら、“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ １９８S））および Ｂｏｒｖａｔｈら、“デオキシヌクレオシド３゛−ホスホルアミダイトを用いる 自動ＤＮＡ合成装置（原題：＾ｎ　Ａｕｔｏａ＋ａｔｅｄ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈ ｅｓｉｚｅｒ　Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ@３’ −Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ”、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ　１５４：３１３−３２６（１９８７）を挙げるこ■■ できる。

非開裂ＨＩＶｅｎｖをコード化するＤＮＡを得るための別法として、特定の動物 の細胞または組織から誘導したｃＤＮＡライブラリー中の相同的配列を含有する クローンを検出するために、ＨＩＶｅｎヱまたは非開裂ＨＩＶｅｎｖ断片のいず れかをコード化する標識したＤＮＡ（普通はおよそ２０ｂｐより大きく、通常は およそ５０ｂｐ）を用いてハイブリッド形成スクリーニングを行い、次いで全長 クローンを同定するために制限酵素分析および核酸配列決定によってそれらのク ローンを分析するだけでよい。全長クローンがそのライブラリー中に存在しない 場合には、適当な断片を種々のクローンから回収し、それらの断片に共通の制限 部位で連結することによって全長クローンを組み立てる。種々のイソタイプおよ び株由来のＨＩＶｅｎｖをコード化するＤＮＡは、そのような種の宿主から得た ライブラリーを、図１または図２の配列でプローブするか、あるいはその遺伝子 をインビトロで合成することによって得られる。

本発明に有用なベクターを構築する際に、ＤＮＡ配列のクローニングには一般に 原核生物を用いる。例えば大腸菌に１２２９４株（ＡＴＣＣ番号３１４４６）は 特に有用である。使用し得る他の微生物株には大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６ （ＡＴＣＣ番号３１５３７）が含まれる。これらの例は限定的なものではなく、 単なる例示である。別法としては、インビトロ・クローニング法（例：ポリメラ ーゼ連鎖反応）が適切である。

本発明のポリペプチドは組換え宿主培養中でＮ末端メチオニル類縁体として、あ るいはハイブリッド／部分にとって異種のポリペプチド（好ましくは、シグナル 配列もしくはハイブリッド／部分のＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリシ グナルをそのシグナルを認識する宿主と共に使用する。分泌先導（リーダー）が 宿主によって“認識”される場合、その宿主シグナルペプチダーゼは、目的の成 熟ばアルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、１ｐｐおよび熱安定性エンテ ロトキンンＩＩリーダーの群から選択される原核シグナルでそのシグナルを置換 する。

は酸性ホスファターゼ・リーダーで置換することができる。哺乳想細胞発現では 、非開裂哺乳類ＨＩＶｅｎｖについては天然型シグナルで十分であるが、他の哺 乳類分泌タンパク質シグナルも、ウィルス分泌リーダー（例えば、単純ヘルペス ｇＤシグナル）と同様に適当である。

非開裂ＨＩＶｅ旦ヱはいずれの宿主細胞中でも発現され得るが、哺乳類宿主中で 合成されることが好ましい。しかし、原核細胞、カビ、酵母、昆虫など由来の宿 主細胞も発現に利用できる。代表的原核生物はクローニングに適した株ならびに 大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、λ−２原栄養株、ＡＴＣＣ番号２７３２５）、セラチ ア・マルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）などの他の腸内 細菌属、パンラスおよび種々のシュードモナスである。宿生細胞が最小限のタン パク質加水分解酵素を分泌することが好ましい。

典型的な場合、発現ベクター中に連結された非開裂ＨＩＶｅｎｖコード化ＤＮＡ で発現宿主を形質転換する。通常このようなベクターは複製部位を保持する（た だし染色体組込みが起こる場合にはその必要はない）。また後述するように、発 現ベクターは形質転換された細胞に表現型選択を提供し得るマーカー配列をも含 有する。例えば大腸菌は、典型的には、大腸菌種から誘導されたプラスミドであ るＩ）　Ｂ　Ｒ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ　２：８５（１９７７）） を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンビンリンおよびテトラサイクリン 耐性のための遺伝子を含有しており、したがって、目的がクローニングであるが 発現であるかにかかわらず、形質転換された細胞を容易に同定するための手段を 提供する。また最適な発現ベクターは転写および翻訳の制御に有用な配列、例え ばプロモーターおよびシャイン・ダルガノ配列（原核細胞について）もしくはプ ロモーターおよびエンハンサ−（Ｉｌｉ乳類細胞について）をも含有するであろ う。プロモーターは誘導性であってもよいが、必ずしもその必要はなく、ＣＭＶ プロモーターのように哺乳類宿主にとって強力な構成的プロモーターでさえ宿主 細胞毒性を伴わずに非開裂ＨＩＶｅｎｖを生産し得る。発現ベクターが発現制御 、複製配列または選択遺伝子を含有する必要がないことも考えられるが、これら の配列の欠如は形質転換体の同定および高レベルのペプチド発現の達成を妨げる であろう。

原核宿主での使用に適したプロモーターの例にはβ−ラクタマーゼおよびラクト ースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、　Ｎａｔｕｒｅ　２７５：６１５（１９７ ８）　：　Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ　２８１：５４４（１９７９））、 アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅ ｄｄｅｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８：４０５７（１９８０ ）およびＥＰＯ出願公開番号３６７７６）およびｔａｃプロモーター（Ｌ　ｄｅ 　Ｂｏｅｒら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８ ０：２ｌ−２５（１９W３）） などのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし他の機能的細菌プロモータ ーも適当である。これらのヌクレオチド配列は一般に知られており、それを利用 することによって当業者は、必要な制限部位を供給するリンカ−またはアダプタ ーを用いて非開裂ＨＩＶｅｎｖをコード化するＤＮＡにそれらを機能的に連結す ることができる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅ１１２０：２６９（１９８０） ）。細菌系で使用するためのプロモーターは、非開裂ＨＩＶｅｎｖをコード化す るＤＮＡに機能的に連結されたシャイン・ダルガノ（Ｓ、Ｄ、）配列をも含有す るであろう。

原核生物に加えて、酵母や糸状菌などの真核微生物も満足できる結果を与える。

サツカロマイセス・セレビシェは最も一般的に使用される真核微生物であるが、 他の株のいくつかも一般に利用可能である。プラスミドＹＲｐ７は酵母における 良好な発現ベクターである（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、　Ｎａｔｕｒｅ　２ｇ２ ：３９（１９７９）　；　ＫｉｎｇｓＩＩｌａｎら、ｃｅｎｅ　７：１４１（１ ９７９）　；　Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ　１０：１５７（１９８０）） 。このプラスミドは、トリプトファン中で生育する能力が欠如した酵母の変異株 （例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰ　Ｅ　Ｐ　４−１　（Ｊｏｎｅｓ、　 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８５：１２（１９７７）））に選択マーカーを提供するｔｒ ｐ　ｌ遺伝子を既に含有している。したがって、酵母宿主細胞ゲノムの特徴とし てのｔｒｐｌ欠損の存在はトリプトファン非存在下での生育によって形質転換を 検出するために効果的な環境を提供する。

酵母宿主と共に使用するのに適した促進配列には、３−ホスホグリセレートキナ ーゼ（Ｈｉ　ｔｚｅｍａｎら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５５　：２ ０７３（１９８０））または他の糖分解酵素（ＨｅｓｓらB Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、　７：１４９（１９６１１１）　；　 Ｅｌｏｌｌａｎｄ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７：４X００（１９７ｇ） ）（例えば エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナー ゼ、ピルベートデカルポキ７ラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６ −リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ 、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、および グルコキナーゼなど）のプロモーターが含まれる。　−−生育条件によって転写 が制御されるという追加の利点を有する誘導プロモーターである他の酵母プロモ ーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ１酸性ホスファタ ーゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド− ３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース資化に寄与 する酵素群のプロモーター領域である。酵母発現での使用に適したベクターおよ びプロモーターについてはＲ，Ｈｉｔｚｅｍａｎら、欧州特許公開番号７３６５ ７Ａにさらに詳しく記述されている。

真核細胞のための発現制御配列は既知である。基本的にすべての真核遺伝子は、 転写が開始する部位のおよそ２５〜３０塩基上流にＡＴが豊富な領域を有してい る。多（の遺伝子の転写開始部位の７０〜８０塩基上流に認められるもう１つの 配列はＣＸＣＡＡＴ領域（Ｘはいずれのヌクレオチドでもよい）である。はとん どの真核遺伝子の３゛末端にはＡＡＴＡＡＡ配列が存在し、この配列は解読鎖の ３′末端にポリＡ尾を付加するためのシグナルであり得る。これらの配列はすべ て哺乳類発現ベクター中に挿入される。

哺乳類宿主細胞におけるベクターからの転写を制御するのに適したプロモーター は種々の供給源（例えばポリオーマウィルス、ＳＶ４０、アデノウィルス、ＭＭ Ｖ（ステロイド誘導性）、レトロウィルス（例・ＨＩＶのＬＴＲ）、Ｂ型肝炎ウ ィルスおよび最も好ましくはサイトメガロウィルスなどのウィルスのゲノム）ま たは異種哺乳類プロモーター（例：ベータアクチンプロモーター）から容易に得 られる。ＳＶ４０の初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウィルス複製起点 をも含有するＳＶ４０制限断片として便利に得られる。Ｆｉｅｒｓら、　Ｎａｔ ｕｒｅ、　２７３：１１３（１９７８）。ヒトサイトメガロウィルスの即時型初 期プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩ　Ｅ制限断片として便利に得られる。Ｇｒｅｅ ｎａｖａｙ、　Ｐ、　Ｊ、ら、Ｇｅｎｅ　１８：３５５−３６０（１９８２）。

ベクター中にエンハンサ−配列を挿入することによって増大する。エンハンサ− はＤＮＡのシス作用性要素であり、通常はおよそ１０〜３００ｂｐであって、プ ロモーターに作用してその転写を増大させる。エンハンサ−は配向および位！に 関して比較的非依存的であり、転写単位の５°側（Ｌａｉｍｉｎｓら、ＰＮＡＳ 　７８：９９３（１９８１））たイントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ、　Ｊ、　Ｌ、 ら、Ｃｅ１ｌ　３３ニア２９（１９８３））およびコード配列自体の中（Ｏｓｂ ｏｒｎｅ、　Ｔ、　Ｆ、ら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ、　４：１２９３（ １９８４））にも発見されている。現在、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスター ゼ、アルブミン、α−フェトプロティン、およ真核細胞ウィルス由来のエンハン サ−を利用するであろう。例には、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサ−（ ｂｐｌｏｏ〜２７０）、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサ−１ 複製起点の後期側のポリオーマエンハンサ−１およびアデノウィルスエンハンサ −が含まれる。

真核宿主細胞（酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒトまたは池の多細胞生物由来 の有核細胞）中で使用する発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を与え得る転写 の終止に必要な配列をも含有するであろう。これらの領域は、ハイブリッド免疫 グロブリンをコード化するｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化されたセグ メントとして転写される。この３′非翻訳領域には転写終止部位も含まれる。

発現ベクターは選択遺伝子（これは選択可能マーカーとも呼ばれる）を含有して もよい。哺乳類細胞に適した選択可能マーカーの例はジヒドロフオレートレダク ターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、あるいはネオマイシンである 。このような選択可能マーカーが成功裏に哺乳類宿主細胞内に導入されるならば 、形質転換されたその哺乳類宿主細胞は選択圧下におかれた場合に生き残ること ができる。選択方式には広く用いられている２つの異なる種類がある。第一の種 類は細胞の代謝、ならびに補足培地に依存せずに生育する能力を欠く変異細胞系 統の使用に基づいている。ＣＨＯＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞はそ の２例である。これらの細胞はチミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素を添 加しない条件下で生育する能力が欠如している。これらの細胞は完全なヌクレオ チド合成経路に必要ないくつかの遺伝子を欠（ので、補足培地中に欠失ヌクレオ チドを添加しない限り生存することができない。培地を補足するかわりに、無傷 のＤＨＦＲもしくはＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子が欠失している細胞中に導入 し、それによってその生育要求性を変化させることができる。ＤＨＦＲ遺伝子や ＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補足培地中で生存できない であろう。本発明における好ましい態様として、ＤＨＦＲ”であるＣＨ○細胞を ｇｐ１２０の組換え発現に利用する。

選択方式の第二の種類は優性選択、即ち、あらゆる細胞型で使用され、変異細胞 系統の使用を必要としない選択法である。この方法は典型的には宿主細胞の生育 を停止するための薬剤を使用する。異種遺伝子で成功裏に形質転換された細胞は 薬剤耐性を付与するタンパク質を発現し、それゆえにこの選択法に耐えることが できる。このような優性選択の例ではネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ、 　Ｍｏ１ｅｃ、　Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、　１：３２７（１９８２））、マイコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇ ａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　２０９：１４２２（１９８０））あるいはハイグロマ イシン（Ｓｕｇｄｅｎら」ｏｌ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　５：４１０−４１３（ １９８５））などの薬剤を使用する。上記の３例では、適切な薬剤、即ち、それ ぞれＧ４１８またはネオマイシン（ゲンタマイシン）、Ｘｇｐｔ（マイコフェノ ール酸）あるいはハイグロマイシンに対する耐性を獲得するために、真核細胞の 制御下で細菌遺伝子を利用する。

“増幅”とは細胞の染色体ＤＮＡ内の単離された領域の増大または複製をいう。

増幅は選択剤（例　ＤＨＦＲを不活化するメソトレキセー）（ＭＴＸ））を用い ることによって達成される。ＤＨＦＲ遺伝子の増幅もしくは継続的なコピーの生 産は、より大量のＭＴＸにもかかわらず生産されるより大量のＤＨＦＲをもたら す。常に大量のＭＴＸを培地に添加することにより、内因性ＤＨＦＲの存在にも かかわらず、増幅圧がかかる。目的の遺伝子の増幅は、目的のタンパク質をコー ド化するＤＮＡおよびＤＨＦＲ遺伝子または同時組込みを可能にする増幅遺伝子 を有するプラスミドで哺乳類宿主細胞を同時形質転換することによって達成する ことができる。常に大量のＭＴＸ濃度の存在下で生育できる細胞だけを選択する ことにより、細胞がより大量のＤＨＦＲを要求すること（この要求は選択遺伝子 の複製によって満たされる）を確実にする。目的の異種タンパク質をコード化す る遺伝子が選択遺伝子と同時に組み込まれている限り、この遺伝子の複製は目的 のタンパク質をコード化する遺伝子の複製を引き起こす。その結果、目的の異種 タンパク質をコード化する遺伝子のコピーの増大（即ち、遺伝子の増幅）がより 大量の目的タンパク質を発現させる。

非開裂ＨＩＶ且二ヱの発現に適した真核宿主細胞には、ＳＶ４０で形質転換され たサル腎臓ＣＶＩ系統（ＣＯ８−７，ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１）、ヒト胚腎臓 系統（２９３細胞または懸濁培養中での成長のためにサブクローン化された２９ ３細胞、　Ｇｒａｈａｍ、Ｆ、Ｌ、ら、　Ｊ、　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ、　３６： ５９（１９７７））、幼ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ　１０） 、チャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ。

ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、　ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）７７：４２１６（１９ ８０））、マウスセルトリ細胞（７Ｍ４．Ｍａｔｈｅｒ、　Ｊ、　Ｐ、　、　Ｂ ｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、　２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎臓細胞 （ＣＶＩ　ＡＴＣＣＣＣＬ　７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲ○− ７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）、ヒト頚部癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣ ＣＬ　２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ　３４）、バッファロー ラット肝臓細胞（ＢＲＬ　３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ　１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ １３８．ＡＴＣＣＣＣＬ　７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ　Ｇ２．ＨＢ　８０６ ５）、マウス乳腫瘍（ＭＭＴ　０６０５６２．ＡＴＣＣＣＣＬ５１）、およびＴ ＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ、　Ｊ、　Ｐ、ら、　Ａｎｎａｌｓ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　３８３：４４−６８（１９８２））が含まれる。

目的のコード化配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築には、標準 的な連結技術を用いる。単離したプラスミドもしくはＤＮＡ断片を切断し、加工 修復し、望ましい形態に再連結して必要なプラスミドを形成させる。

構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析には、そのライゲーシ ョン混合物を用いて大腸菌に１２２９４株（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し 、成功した形質転換体を、それが適当な場合には、アンピシリンもしくはテトラ サイクリン耐性によって選択する。その形質転換体からプラスミドを調製し、１ １ｅｓｓｉｎｇら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９：３０９（１ ９８１）の方法もしくはｌｌａｘａｍらｊｌｅｔｈｏｄｓ@ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５：４９９（１９８０）の方法で制限分析および／ま たは配列決定する。

宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換 体の選択あるいは目的の配列をコード化する遺伝子の増幅のために適当に改良し た従来の栄養培地中で培養する。温度、ｐＨなどの培養条件は発現のために選択 した宿主細胞について過去に使用されたものであり、当業者には理解されるで低 い（好ましくは０〜３％血清、より好ましくは約１％胎児ウシ血清または他の適 切な血清）培地中で細胞培養を生育させることが好ましい。

本明細書における宿生細胞は、インビトロ培養中の細胞と共に宿主動物内の細胞 をも包含する。

“形質転換”は、ＤＮＡが染色体外要素として、あるいは染色体組込みによって 、複製可能であるように生物中にＤＮＡを導入することを意味する。特に示さな い限り、本明細書で使用する宿主細胞の形質転換法はＧｒａｈａｍ、　Ｆおよび ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ。

Ａ、　、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６−４５７（１９７３）の方法である 。しかし、細胞中にＤＮＡを導入するための他の方法（例えば核注入またはプロ トプラスト融合など）も使用できる。

原核細胞または強固な細胞壁構築物を含有する細胞を用いる場合に好ましいトラ ンスフェクション法は、Ｃｏｈｅｎ、　Ｆ、　Ｎ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　６９　：２１１O（１９７２） に記述されているように塩化カルシウムを用いるカルシウム処理である。

“トランスフェクション”とは、なんらかのコード化配列が最終的に発現される か否かにかかわらず、宿主細胞中にＤＮＡを導入することを意味する。例えばＣ ａＰｏ、やエレクトロポレーションなど数多くのトランスフェクション法が当業 者に知られている。宿主細胞の形質転換はトランスフェクション成功の指標であ る。

本発明の新規ポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール沈殿、酸性抽 出、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ホス ホセルロースクロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、ヒ ドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含 む既知の方法によって組換え細胞培養から回収・精製される。例えばＥＰ１８７ ０４１に記述された精製法を参照のこと。さらに逆相ＨＰＬＣおよび非開裂ＨＩ ＶｅｎＶに対する配位子を用いるクロマトグラフィーも精製に有用である。現在 のところ、ゲル透過クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィー の使用が好ましく、標準的操作法によるカチオン交換および疎水相互作用クロマ トグラフィー（ＨＩ　Ｃ）がさらに好ましい。

任意の工程として、標準的な方法（Ｒａｙら、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒ ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　３０３：２２５−２２８（１９８４））によってアル デヒドシリカに共有結合させた非開裂ＨＩＶｅｎｖ−抗体のカラムを通過させ、 カラムを食塩溶液で洗浄し、溶出液を標準的な方法（例えば定量的アミノ酸分析 など）で分析することによって、非開裂ＨＩＶｅｎｖを回収・精製する。グリセ ロールで覆われた制御された多孔性ガラスに結合したモノクローナル抗体を用い る方法が本発明の実施にとって望ましい。任意の工程として、低濃度（およそ１ 〜５ｍＭ）のカルシウムイオンを精製の間存在させてもよい。

非開裂ＨＩＶｅ旦ｙをＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤の存在下で精製するこ とが好ましいであろう。

非開裂ＨＩＶｅｎｖを必要な補因子と共に医薬的に許容される滅菌等張製剤中に 入れ、これを任意に当該分野でよく知られている標準的な手段で投与する。製剤 は液体であることが好ましく、普通はｐＨ６，８〜７．６の非リン酸緩衝液を含 有する生理塩溶液であるか、あるいは凍結乾燥粉末であってもよい。

達部位、投与法および開業医の知る他の要因を考慮のうえ、良い医療に合致する 方法で確立されるであろう。

非開裂ＨＩＶｅｎヱは、望ましい純度の非開裂ＨＩＶｅｎヱを佐剤（アジュバン ト）または生理学的に許容される担体（即ち、使用する投与量および濃度におい て受容者にとって非毒性である担体）と混合することによって、投与のために調 製される。佐剤および担体は、それ自体は標的抗原と免疫エピトープを共有しな いが、標的抗原に対する免疫応答を刺激する物質である。通常これは、非開裂Ｈ ＩＶｅユヱを緩衝液、低分子量（およそ１０残基未満）のポリペプチド、タンパ ク質、アミノ酸、グルコースまたはデキストランを含む炭水化物、ＥＤＴＡなど のキレート剤、および他の賦形剤と混合することを必然的に伴うであろう。米国 特許第４９６３３５４号でのサイトカイン（腫瘍壊死因子およびインターフェロ ンガンマなと）および種々の毒性微生物物質（ミコバクテリア抽出物など）のよ うに、この目的には一般にフロインドアジュバント（鉱油乳液）が使用されてき た。抗原は佐剤と共に投与されることが望ましいが、最初の接種が佐剤と共に送 達される場合には、抗原による追加免疫が佐剤を必要としないこともある。担体 はしばしば佐剤として作用するが、担体が抗原を凝集させる水不溶性の巨大分子 粒状構造を含有する点で一般には佐剤と区別される。代表的担体には水酸化アル ミニウム、ラテックス粒子、ベントナイトおよびリポソームが含まれる。

本発明のワクチンの治療的投与の主要な経路は注射（筋肉内または皮下）である と想定され、静脈内送達またはカテーテルや他の外科チューブを通しての送達も 使用される。代替経路には錠剤など、液体製剤用の市販の噴霧器、および凍結乾 燥した受容体もしくはエアゾル化した受容体の吸入が含まれる。液体製剤は粉末 製剤から再構成した後に使用することができる。

本新規ポリペプチドを、微小球、リポソーム、他の微小粒状送達系あるいは血液 を含むいくつかの組織中に入れられる徐放性製剤を介して投与することもできる 。徐放性担体の好適例には成型物（例：座剤またはマイクロカプセル）の形態の 半透過性ポリマーマトリックスが含まれる。埋め込み可能またはマイクロカプセ ル徐放性マトリックスにはポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５ ８４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ・エチル−Ｌ−グルタメートの共重合体 （Ｕ、　Ｓｉｄｍａｎら、　ＢｉｏｐｏｌｙＩＩｌｅｒｓ　２２（１）　：５４ ７−５５６（１９８５））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）ま たはエチレンビニルアセテート（Ｒ，Ｌａｎｇｅｒら、　Ｊ、　Ｂｉｏｍｅｄ、 　Ｍａｔｅｒ、　Ｒｅｓ、　１５　：　１６７−２７７（１９８１）およびＲ， Ｌａｎｇｅｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｔｅｃｈ、　１２　：９ｇ−１０５（１９８２） ）が含まれる。非開裂ＨＩＶｅｎｖを含有するリポソームはよく知られた方法に よって調製される（ＤＥ　３２１８１２１　Ａ　；　Ｅｐｓｔｅｉｎら、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８２：３６８８−３６９２ （P９８５） ：　Ｈｖａｎｇら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、 　７７：４０３０−４０３４（１９８０）　；　Ｅ　Ｐ　５Q３２２　Ａ　； ＥＰ３６６７６Ａ；ＥＰ８８０４６Ａ；ＥＰ１４３９４９Ａ；ＥＰ１４２５４１ Ａ：日本国特許出願８３−１１８０８＋米国特許４４８５０４５および同４５４ ４５４５　；ＵＰ１０２３４２Ａ）。通常リポソームは小さい（およそ２００〜 ８００オングストローム）単層型であり、その脂質含量は約３０モル％コレステ ロール以上であって、その比率は本ポリペプチドの放出速度を最適に調節するよ うに選択される。

投与される非開裂ＨＩＶｅｎｖの予防接種投与量は、医師の技量の範囲内に十分 包含されるごと（、使用するワクチンの性質（例えばその結合活性およびインビ ボ血漿半減期）、製剤中の非開裂ＨＩＶｅｎｖの濃度、投与経路、投与の部位お よび速度、患者の臨床的耐性、患者を冒している病理学的状態などに依存するμ ｇの投与量が好ましいが、投与量は約１０μｇ〜１ｍｇの範囲であり得る。一連 の連続的接種の間に異なる投与量を使用する。開業医は最初の接種を投与した後 、与することができる。本ワクチンを用いて、ＨＩＶにさらされる危険があるで あろう個体、あるいはＨＩｖにさらされる危険がないであろう個体を予防接種し 、さらに、本ワクチンを血清反応陽性個体および過去にＨＩＶにさらされたこと のある個体に投与することが望ましい（例えば５ａｌｋ、Ｎａｔｕｒｅ　３２７ ：４７３−４７６（１９８７）および５ａｌｋら、５ｃｉｅｎｃｅ　１９５：８ ３４−８４７（１９７７）を参照のこと）。

一連の接種の１つとして投与することもできる。このような一連の接種にはＨＩ Ｖ抗原または他のワクチンの同じまたは異なる調製物による接種が含まれ得る。

選択した予防接種パラメーター（例えば投与量、投与日程、佐剤選択など）の妥 当性は、患者から血清の一部を採取し、免疫化プログラムの過程の間の抗体力価 を検定することによって決定される。別法として、後述の実施例１に記述する従 来法でＴ細胞の存在を監視することもできる。さらに、患者の臨床的状態を目的 の効果（例えば抗感染効果）について監視するであろう。予防接種が不十分であ る場合には患者をさらなる非開裂ＨＩＶ且ユヱ予防接種で追加免疫することがで き、免疫応答を強化すると期待される様式（例えば抗原量および／または佐剤の 増加、抗原と担体の錯化あるいは免疫原性タンパク質への結合、もしくは投与経 路の変更）で予防接種パラメーターを改良することができる。

本発明は、ＨＩＶ感染に対する保護的免疫応答を増大させるべく最適化された免 疫化日程にも関する。現在のところ、非開裂ＨＩＶｅｎｖで少なくとも３回は独 立した接種を行い、第２回の接種を第１回の接種の２週間以降、好ましくは３〜 ８週間後、より好ましくはおよそ４週間後に行うことが好ましい。第３回の接種 を第２回の“追加免疫”接種の数カ月以降、好ましくは第１固接種の少なくとも ５力月以降、より好ましくは第１固接種の６力月〜２年後、さらにより好ましく は第１固接種の８力月〜１年後に行うことが好ましい。患者の“免疫記憶”を増 大させるために第３回以降の定期的接種も望ましい。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、　Ｊ 、　工１ｆ６（ｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１６０（６）　：９６０−９６ ９（Ｄｅｃ、　１９８９）およびその参考文献を参照のこと。一般的に、比較的 長い間隔をおいた頻繁でない非開裂ＨＩＶｅｎｖによる免疫化のほうが、最大限 の抗体応答を引き出し、防御効果を引き出すうえで、頻繁な免疫化より好ましい 。

任意に、本発明のポリペプチドをＡＩＤＳまたはＡＲＣあるいは他のＨＩＶ関連 疾患および感染の治療に用いられる他の薬剤（例えばＡＺＴ、ＣＤ４、抗生物質 、インターフェロンなどの免疫変調因子、抗炎症剤、および抗腫瘍剤）と共に投 与することできる。

■倦 本発明は、後述の実施例２およびＡＴＣＣに寄託された抗体ハイブリドーマ（後 述）によって明示されるように、モノクローナル抗体にも関する。本発明に従う ことにより、非開裂ＨＩＶｅｎｖまたは抗原として活性で細胞表面に露出したそ の断片のエピトープ（例えばｇｐ１２０．ｇｐ４１から選択されるエピトープ） を特異的に結合するモノクローナル抗体が、抗原で誘導された（ａｎｔｉｇｅｎ −ｐｒｉｚｅｄ）免疫リンパ細胞と骨髄腫細胞との融合によって形成した連続的 継代ハイブリッド細胞系統から単離される。有利なことに、ＨＩＶｅｎヱおよび 非開裂ＨＩＶｅｎヱを結合する本発明のモノクローナル抗体は、細胞表面に露出 したこのタンパク質のドメインを結合する。

本発明の抗体は日常的なスクリーニングによって得られる。免疫毒素を含有する りシンＡ鎖としての細胞障害潜在能力についてモノクローナル抗体をスクリーニ ングするために検定を用いる。この検定法では細胞を試験抗体の希釈物で処理し 、次いでリシンＡ鎖に結合した第２抗体のＦａｂ断片で処理する（“間接検定法 ”）。

この間接検定法の細胞障害を、直接検定法にの検定法ではモノクローナル抗体を リシンＡ鎖に結合させる）の細胞障害と比較する。間接検定法は与えられたモツ クローナル抗体の免疫毒素としての効力を正確に予言し、それゆえに免疫毒素と して使用するためのモノクローナル抗体をスクリーニングする際に有用である（ ｖｉｔｅｔｔａら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：１０９８−１１０４（１９８７） およびＶｅｌｔｍａｎら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４V：５５５２ （１９ｇ？）をも参照のこと）。

モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられる 。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含有 する従来の抗体（ポリクローナル）調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体 は抗原上の単一の決定基に対して向けられる。モノクローナル抗体は抗原−抗体 結合を用いる診断的および分析的検定法の選択性および特異性を改善するのに有 用である。モノクローナル抗体の第２の利点は、それらがハイブリドーマ培養に よって合成され、他の免疫グロブリンが混入しないという点である。モノクロー ナル抗体を培養したハイブリドーマ細胞の上清から、もしくはハイブリドーマ細 胞をマウスに腹腔的接種することによって誘導した腹水から調製することができ る。

ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　 、　６　：５１１（１９７６）によって最初に記述されたハイブリドーマ技術は 、多くの特異的抗原に対するモノクローナル抗体を高レベルに分泌するハイブリ ッド細胞系統を作成するために広（適用されてきた。

本発明の特定の態様として、Ｂａ１ｂ／ｃあるいは好ましくはＣ５７ＢＬ／６な どのマウスをｇｐ１２０に対して免疫化し、非開裂ｇｐ１２０単離と共に前イン キュベートした場合に開裂ｇｐ１２０に対するその結合を阻害するクローン化抗 体についてスクリーニングすることによって抗体を得る。１０Ｆ６．１１Ｇ５、 および１０Ｄ８抗体はこのような抗体の例であるが、本明細書に記述する方法に よって同じ定性的活性を有する他の抗体を得ることができ、また上述のように、 開裂部位をまたぐ抗体は文献でも知られているので、上記の抗体に限られるわけ ではない。この文脈における“定性的”活性とは、抗体がＨＩＶｅｎＶの開裂部 位をまたぐ（ｓｐａｎ）エピトープに結合することを意味する。ｇｐ１２０のト リプンン消化は、１０Ｆ６．１１Ｇ５、および１０Ｄ８抗体が残基３０１〜３２ ４付近をまたぐペプチド、即ち開裂部位をまたぐペプチドに結合することを示し た。１０Ｆ６．１１Ｇ５、および１０Ｄ８以外でこれが可能なモノクローナル抗 体は、親和性、免疫グロブリンクラス、起源の種、あるいはｇｐ１２０エピトー プの相違にかかわらず、組換え細胞培養中で発現される抗体、あるいは１０Ｆ６ ．１１Ｇ５、および１０Ｄ８抗体の予定されたアミノ酸配列変種（例：　１０Ｆ ６．１１Ｇ５、および１０Ｄ８抗体の可変領域とヒト定常領域のキメラ）と同様 に、本発明の実施に有用である。

一般に、宿主動物あるいはそこから得られる培養抗体産生細胞の免疫化の方法お よび日程は、確立された従来の抗体刺激および生産技術と一致する。本出願人は 典型的にはマウスを試験モデルとして使用したが、ヒト対象を含むあらゆる哺乳 類対象あるいはそこから得られる抗体産生細胞も本発明の方法に従って操作する ことができ、それによってヒトを含む哺乳類ノゾブリッド細胞系統の作成の基礎 として機能するものと予期される。

免疫化の後、免疫リンパ系細胞を骨髄腫細胞と融合させることによって培養でき 無限に継代できるハイブリッド細胞系統を作成し、大量のモノクローナル抗体を 生産する。本発明の目的のために融合用に選択される免疫リンパ系細胞は、免疫 化した動物のリンパ節組織または膵臓組織のいずれかから採取したリンパ細胞お よびその正常に分化した子孫である。免疫膵臓細胞はマウス系に関してより高濃 度で便利な抗体産生細胞供給源を提供するので、本出願人は免疫膵臓細胞の使用 を好む。骨髄腫細胞は融合したハイブリッドの継続的増殖の基礎を提供する。

骨髄腫細胞は血漿細胞由来の腫瘍細胞である。

ある種の細胞を他の種の細胞と融合させることができる。しかし、免疫化した抗 体産生細胞の供給源と骨髄腫細胞の供給源が同じ種由来であることが好ましい。

ハイブリッド細胞系統を細胞培養培地中のインビトロ培養で維持することができ る。本発明の細胞系統をヒポキサンチン−アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ） 培地中の連続的継代細胞系統からなる組成物中で選択および／または維持するこ とができる。実際、一旦ハイブリドーマ細胞系統を樹立したら、それを種々の栄 養的に妥当な培地で維持することができる。さらに、ハイブリッド細胞系統を、 凍結および液体窒素下での貯蔵を含むいくつかの従来法のいずれでも貯蔵および 保存することができる。凍結した細胞系統を再生し、モノクローナル抗体の合成 および分泌の再開を伴って無限に培養することができる。分泌した抗体を、沈殿 、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの従 来法を用いて組織培養上清から回収する。本明細書に記述する抗体は、これまで にＩｇＧまたはＩｇＭを貯蔵した血漿から精製するために用いられきた場合と同 様に、これらの免疫グロブリンを精製するための従来法（例えばエタノール沈殿 法あるいはポリエチレングリコール沈殿法）によってもハイブリドーマ細胞培養 から回収される。精製した抗体を滅菌濾過し、任意の工程として、試験試料中の ＨＩＶの診断的検定で使用するために酵素やスピンラベルなどの検出可能なマー カーに結合させる。

本発明はマウスのモノクローナル抗体を用いて立証されるが、本発明はこれに限 定されるものではない。実際にヒトの抗体を使用することができ、またそれが好 ましいと判明することもあろう。このような抗体はヒトのハイブリドーマを用い ることによって得ることができる（Ｃｏｔｅら、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｓ’（＾ｌａｎ　Ｒ， Ｌｉ５ｓ）、　７７頁（１９８５））。実際、本発明に従って、適当な抗原特異 性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子を適当な生物学的活性（例えばヒトの補 体を活性化しＡＤＣＣを媒介する能力など）を有するヒト抗体分子由来の遺伝子 と接合することによるキメラ抗体を生産するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉ ｓｏｎら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　８１　：６８ ５１（１９８４）　；　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　R１２：６０ ４（１９８４）　； Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４５２（１９８５））を使用すること ができる。このような抗体も本発明の範囲に包含される。

細胞融合技術に代わるもう１つの代替法として、ＥＢＶ−不死化Ｂ細胞を用いて 本発明のモノクローナル抗体を生産する。組換えＤＮＡなど他のモノクローナル 抗体生産法も予期される。

免疫毒素 不発明は、免疫毒素（抗体と細胞毒性部分の複合体）などの本発明の抗体の免疫 化学的誘導体にも関する。本抗体は、天然の補体過程を通して溶解を誘発し、正 常に存在する抗体依存性細胞障害細胞と相互作用させるためにも用いられる。

任意の工程として、精製し滅菌濾過した抗体をＡＩＤＳ治療で使用するためにリ シンなどの細胞毒素に結合させる。ＥＰＯ出願０２７９６８８（１９８８年８月 ２４日公開）はＨＩＶ感染を治療するための免疫毒素の作成法とその使用法を例 示している。

ＨＩＶｅｎｖを特異的に結合し得る本発明の免疫毒素は、既に感染し新しいウィ ルスを活発に生産している細胞を殺すために用いられる。細胞の死滅は、感染細 胞上に発現されたウィルス外殻タンパク質に対する免疫毒素の結合によって達成 される。次いで免疫毒素が内在化され、その細胞を殺す。ウィルスゲノムをその ＤＮＡ中に組み込んでいるがウィルスタンパク賃を合成していない感染細胞（即 ち、ウィルスが潜伏性である細胞）は、それらがウィルスを合成し始めるまでは 、免疫毒素による死滅に対して感受性でないであろう。感染細胞に毒素を送達す るために、開裂部位をまたぐ本発明の抗体および／または本明細書に記述する他 の抗体を単独で用いるか、あるいは組み合わせて用いることができる。さらに、 毒素−抗体複合体は循環しているウィルスまたはウィルス外殻タンパク質に結合 することができ、それによってウィルスまたは外殻タンパク賀を内在化する細胞 の死滅を達成するであろう。本発明は、本明細書に記述する抗体を用いる高度に 選択的なＨＩＶ感染細胞破壊法を提供する。

本発明が特定の理論に束縛されることは望まないが、感染細胞表面上での標的抗 原の発現は一時的であると考えられる。抗体は抗原が存在する細胞表面上の部位 に到達し、これと相互作用することができなくてはならない。抗体が抗原と錯化 した後、エンドサイト−シスが起こって毒素をその細胞内に運搬する。

本発明の免疫毒素は、ＨＩＶウィルスに感染した単核細胞／マクロファージを殺 す際に特に有効である。Ｔ細胞からのウィルスの一時的生産とは対照的に、マク ロファージは高レベルのウィルスを長期間生産する。現在の療法はこれらの細胞 における新しいウィルスの生産の阻害には効果的でない。

ＨＩＶｅｎｖまたは非開裂ＨＩＶ且ユヱに特異的なモノクローナル抗体のすべて が高度に細胞障害性の免疫毒素を作るわけではないが、ある抗体の免疫毒素の一 部として機能する能力を予測するための検定は当該分野において日常的かつ一般 的に用いられている。使用する抗体が数棟（あるいは全て）のＨＩ　Ｖと交差反 応することが好ましい。

本免疫毒素の細胞毒性部分は細胞毒性薬剤、あるいは細菌、カビ、植物または動 物起源の酵素的に活性な毒素、あるいはそのような毒素の酵素的に活性な断片で あり得る。使用する酵素的に活性な毒素およびその断片はジフテリアＡ鎖、ジフ テリア毒素の非結合性活性断片、エキソトキノンＡ鎖（ンユードモナス・アエル ギノーゼ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファーサルシ ン、アレウリテス・ホルン（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ　ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、 ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（ｐｈ ｙｔｏｌａｃａ　ａｌＩｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、 およびＰＡＰ−３）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａ ｒａｎｔｉａ）阻害因子、クルンン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、サバオナリア ・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害因子 、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトケリン（ｎ＋ｉｔｏｇｅ１１ｉｎ）、レ ストリフトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍ ｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびトリコモセン類（ｔｒｉ ｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）である。もう１つの態様として、抗体をンスブラチンま たは５ＦＵなどの小分子抗癌薬に結合させる。モノクローナル抗体とこのような 細胞毒性部分の複合体は種々の二官能性タンパク質カップリング試薬を用いて作 成される。このような試薬の例は５ＰＤＰ、ＩＴ、ジメチルアジビミデートＨＣ Ｉなどのイミドエステルの二官能性誘導体、スペリン酸ジスクノンイミジルなど の活性エステル、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、ビス−（ｐ−アンドベ ンゾイル）ヘキサンジアミンなどのビス−アジド化合物、ビス−（ｐ−ジアゾニ ウムベンゾイル）−エチレンジアミンなどのビス−ジアゾニウム誘導体、トリレ ン２．６−ジイソシアネートなどのンイソンアスート、１．５−ジフルオロ−２ ，４−ジニトロベンゼンなどのビスー活性フッ素化合物である。毒素の溶解部分 を抗体のＦａｂ断片に結合することができる。

本明細書に議論するように免疫毒素を種々の方法で作成することができる。一般 的に知られている架橋試薬を用いて安定な複合体を得ることができる。

感染細胞表面に露出しているタンパク質のドメインを特異的に結合するモノクロ ーナル抗体をリジンＡ鎖に結合させることが有利である。そのリシンＡ鎖を脱グ リコジル化し、組換え法で生産することが最も有利である。リジン免疫毒素を作 成する有利な方法はＶｉｔｅｔｔａら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３８　：　１０９ ８（１９８７）に記述されている。

診断的目的のために感染したヒト細胞をインビトロで殺すために用いる場合、典 型的には本複合体を細胞培養培地に少なくとも約１０ｎＭの濃度で添加するであ ろう。インビトロ使用のための製剤および投与法は重要でない。通常は、培養ま たは潅流媒質と混和可能な水性製剤が用いられるであろう。細胞毒性は従来技術 によって読み取ることができる。

放射活性同位体（例：■、Ｙ、Ｐｒ）を抗体に結合させることによって感染細胞 を処理するための細胞毒性放射性医薬を作成することができる。α粒子放出同位 体の使用が有利である。本明細書で用いる場合、用語“細胞毒性部分”はこのよ うな同位体を包含するものとみなされる。

好ましい態様として、無関係なりリアランス機構（例えば肝臓）によるリジンＡ 鎖のクリアランスを減少させるために、リンンＡ鎖を脱グリコジル化するか、あ るいはオリゴ糖なしで生産する。もう１つの態様として、Ｂ鎖のガラクトース結 合性を遮断できる場合（“遮断リジン”）には全リジン（Ａ鎖＋Ｂ鎖）を抗体に 結合させる。

さらなる態様として、ＦａｂまたはＦ　（ａｂ’　）　２断片を用いて毒素−複 合体を作成する。それらの比較的小さいサイズゆえに、これらの断片は組織によ り良く浸透し、感染細胞に到達することができる。

もう１つの態様として、融合誘導性リポソームを細胞毒性薬剤で満たし、Ｈ１抗 体依存性細胞障害 て、（ｂ）その抗体分子が結合するＨＩＶウィルスに感染した細胞の溶解を媒介 し得るサブクラスまたはイソタイプに属する抗体の使用に基づく方法をも包含す る。

より具体的には、これらの抗体は、細胞表面タンパク質と錯化した時に、ナチュ ラルキラー細胞またはマクロファージなどのエフェクター細胞を活性化すること によって抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介し、および／または、血清補体 を活性化するサブクラスまたはイソタイプに属するべきである。

また本発明は、ＡＩＤＳ治療のためのこれらの抗体のその天然型での使用にも関 する。例えば、ＨＩＶ関連細胞表面抗原を結合するＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３マ ウス抗体をＡＩＤＳ治療のためにインビトロで使用することができる。実際、Ｈ ＩＶｅｎｖは感染した単核細胞およびＴ−リンパ細胞上に存在するので、本明細 書に開示する抗体およびそれらの治療的使用は一般的な適用可能性を有する。

抗体の生物学的活性はその抗体分子のＦｃ領域によってかなりの程度決定される ことが知られている（ｌＪＢｌａｎｕｅおよびＢｅｎａｃｅｒｒａｆ、ゴｅｘｔ ｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉａｕｏｕｎｏｌｏｇｙ−（第２版、　Ｖｉｌｌｉａ＋ｍｓ　 ＆　ＶｉＬｋｉｎｓ）、　２１８頁（１９８４））、これには白血球が達成する のと同様に抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力および補体を活性化 する能力が含まれる。異なるクラスおよびサブクラスの抗体はこの点で異なり、 本発明に従って望ましい生物学的活性を有するクラスの抗体を選択する。例えば 、ＩｇＧ３およびＩｇＧ２ａクラスのマウス免疫グロブリンは同族体抗原を発現 する標的細胞に結合した際に血清補体を活性化する能力を有する。

一般的に、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３サブクラスの抗体ならびに場合によってＩ ｇＧ１の抗体はＡＤＣＣを媒介することができ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａおよびＩ ｇＭサブクラスの抗体は血清補体を結合し活性化する。補体活性化は一般に少な （とも２つのＩｇＧ分子が標的細胞上で密接に近接して結合することを必要とす る。しかし、１ｇＭ分子は１つ結合するだけで血清補体を活性化する。

あらゆる特定の、抗体の補体活性化および／またはＡＤＣＣによる標的細胞の溶 解を媒介する能力を検定することができる。興味のある細胞をインビトロで生育 させ、標識し、その細胞培養に、抗原抗体錯体によって活性され得る免疫細胞ま たは血清補体のいずれかと組み合わせて抗体を添加する。溶解した細胞からの標 識の放出によって標的細胞の細胞溶解を検出する。実際、患者自身の血清を補体 および／または免疫細胞の供給源として用いることにより抗体をスクリーニング することができる。次に、インビトロ試験で補体を活性化し得るかもしくはＡＤ ＣＣを媒介し得る抗体を、その特定の患者中で治療的に用いることができる。

その抗体がＨＩＶｅｎｖエピトープを結合し、かつ、補体を活性化し得るかもし くはＡＤＣＣを媒介し得るのであれば、基本的にあらゆる起源の抗体をこの目的 に使用することができる。モノクローナル抗体は継続的で豊富な供給という利点 を提供する。実際、ｇｐ１６０でマウスを免疫化し、ＨＩＶｅｎｖに対する抗体 を産生ずるハイブリドーマを樹立し、ヒト補体の存在下で感染細胞を溶解し得る 抗体を産生ずるハイブリドーマを選択することによって、感染細胞と反応し、こ れを溶解し得る抗体の一部を迅速に確立することが可能である。

抗体の治療的および他の使用 治療のためにインビボで使用する場合、本発明の抗体は治療的有効量（即ち、Ｔ 細胞数を修復する量）で患者に投与される。これらは通常は非経口的に投与され るであろう。投与量および投与法は感染の程度、特定の免疫毒素の特徴（使用す る場合）、例えば、その治療的指標、患者、および患者の経緯などに依存するで あろう。脈管構造中の細胞を治療するためには静脈内に、また局所リンパ節を治 療するためには皮下および腹腔内に、本免疫毒素を１〜２週間にわたって継続的 に投与することが有利である。任意に、腫瘍壊死因子およびインターフェロンま たは他の免疫変調剤の複合サイクルなどの補助的治療の過程中にこの投与を行う 。

非経口投与のためには、医薬的に許容される非経口賦形剤と共に抗体を単位投与 注射可能列形（溶液、懸濁液、乳液）で製剤化するであろう。このような賦形剤 は本貫的に非毒性であり非治療的である。このような賦形剤の例は水、食塩水、 リンゲル溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。不 揮発性油およびオレイン酸エチルなどの非水性賦形剤も使用することができる。

リポソームを担体として使用することができる。賦形剤は、等張性や化学的安定 性を増大させる物質などの少量の添加物（例えば、緩衝剤および保存剤）を含有 してもよい。典型的には、このような賦形剤中に約１ｍｇ／ｍｌ〜Ｉ　Ｑｍｇ／ ｍｌの濃度で抗体を製剤化する。

本抗原は標的細胞に高度に特異的であり、正常細胞にはめったに出現しないので 、ＩｇＭ抗体の使用は現在のところ好ましくない。ＩｇＧ分子はより小さいがゆ えに、ＩｇＭより感染細胞に局在化する能力が高いであろう。

生体内での補体活性化が、炎症性応答の誘発およびマクロファージの活性化を含 む種々の生物学的効果を導くという証拠がある（ＵａｎａｎｕｅおよびＢｅｎｅ ｃｅｒｒａｆ、ゴｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（第２版、　 ｆｉｌｌｉａｍｓ　＆　ｆｉｌｋｉｎｓ）、　２１８頁（１９８４））。炎症に ■■ 血管拡張の増大は種々の抗Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ剤の感染細胞中に局在化する能力を増 大させる。したがって、本発明によって特定される型の抗原−抗体の組合せは数 多くの方法で治療的に使用することができる。さらに、精製した抗原（Ｈａｋｏ ｍｏｒｉ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍ＋ａｕｎｏ１．２：１０３（１９８４） ）またはそのような抗原に関連する抗イデイオタイプ抗体（Ｎｅｐｏｍら、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８１　：２８６４（１９８５） 　；　Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら、　Ｐｒ盾メA　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　８１：２１６（１９８４））を、ヒト患者における活性な免疫応答を誘発 するために使用することができるであろう。このような応答には、ヒトの補体を 活性化し、ＡＤＣＣを媒介し得る抗体の形成が含まれ、そのような機構によって 感染細胞の破壊がもたらされる。

を指向するポリクローナルまたはモノクローナル抗体と共に使用する。サンドイ ッチ検定法のいくつかの態様で使用するために、１０Ｆ６．１１Ｇ５、または１ ０Ｄ８、あるいはその等何物を、池のモノクローナル抗体で用いられる従来の方 法に従って、不溶化支持体に結合するか、もしくは検出可能な部分で標識する。

もう１つの態様として、それ自体は既に知られている方法を用いてＨＩＶｅｎｖ または非開裂ＨＩＶｅｎｖ結合を検出するために、１０Ｆ６．１１Ｇ５、または １０Ｄ８抗体を結合し得る標識した抗体（例えば標識したヤギ抗ネズミＩｇＧ） を使生産するために使用する。この方法は、以下の一般的工程からなる。第１に 、ＨＩＶｅｎｖの第１の調製物を開裂部位をまたぐＨＩＶｅｎｖエピトープを指 向すユヱから分離し、第３に該第２の調製物から非開裂ＨＩＶｅユヱを回収する 。これらの方法をアフィニティー精製およびアフィニティークロマトグラフィー のための標準的方法と共に使用する。またこれらの方法では上述のように水不溶 性支持体上に固定化した抗体を使用することもできる。モノクローナル抗体を固 定化するための既知の方法はすべてこの目的に使用することができる。

治療で使用する抗体組成物を製剤化し、その投与量を、治療すべき障害、個々の 患者の状態、該組成物の送達部位、投与法および開業医の知る他の因子を考慮の うえ、良い医療に合致する方法で確立する。本抗体組成物は、後述の投与用ポリ ペプチド調製の記述に従って投与のために調製される。

後述の実施例の理解を容易にするために、い（つかの頻繁に使用する方法および ／または用語について以下に説明する。

“プラスミド”は先行する小文字ｐおよび／またはそれに続く大文字および／ま たは数字によって指定される。本明細書における出発プラスミドは市販されてい るか、公的に無制限に利用できるか、もしくは利用可能なプラスミドから公表さ れた方法に従って構築することができる。さらに、記載したプラスミドと等価な プラスミドが当該技術分野で知られており、当業者には明らかであろう。

具体的には、これらのプラスミドが次の特徴のいくつかまたはすべてを有するこ とが好ましい。（１）最小数の宿主生物配列を保持すること：（２）望ましい宿 主中で安定であること：（３）望ましい宿主中で高コピー数で存在し得ること： （４）調節可能なプロモーターを保持すること：および（５）新規ＤＮＡ配列が 挿入されるプラスミドの部分とは独立した部分に選択可能な特性をコード化する 少なくとも１つのＤＮＡ配列を有すること。利用可能な文献と本明細書の教示を 考慮すれば、当業者は上記の規準を満たすためのプラスミドの改変を容易に行う ことができる。上述の特性を有し、それゆえに本発明での使用に適したさらなる クローニングベクターが現在存在し得、あるいは発見されるであろうこと、なら びにこれらのベクターも本発明の範囲に包含されると見なされることは理解され るべきである。

ＤＮＡの“消化”とは、そのＤＮＡ中の特定の配列にしか作用しない制限酵素に よるそのＤＮＡの触媒的切断をいう。本明細書で使用される種々の制限酵素は市 販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は当業者が知って いるであろう通りに使用した。分析的目的のためには、典型的には１μｇのプラ スミドまたはＤＮＡ断片を約２単位の酵素と共に約２０μｍの緩衝溶液中で使用 する。プラスミド構築用のＤＮＡ断片を単離する目的のためには、典型的にはよ り大きい体積中で５〜５０μｇのＤＮＡを２０〜２５０単位の酵素で消化する。

特定の制限酵素に適した緩衝液および基質量はその製造者によって指定される。

通常３７℃で約１時間のインキュベーション時間が用いられるが、これは供給者 の指示に従って変化し得る。消化後、その反応液をポリアクリルアミドゲル上で 直接電気泳動することにより、目的の断片を単離する。

切断した断片のサイズ分離はＧｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、ら、　Ｎｕｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、　８：４０５７（１９８０）に記述されている８％ポリアクリ ルアミドゲルを用いて行う。

“ＰＣＲ”（ポリメラーゼ連鎖反応）とはＤＮＡの断片を増幅する技術の一種で ある。増幅すべきＤＮＡ断片の３゛および５′末端（センスまたはアンチセンス 鎖チェック）に対応するオリゴヌクレオチドブライマーを適当な条件下で７％イ ブリッド形成させ、酵素Ｔａｑポリメラーゼまたはこれに等価な酵素を用いてプ ライマー間に位置するＤＮＡのコピーを合成する。

“脱リン酸化”とは、細菌アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理すること による末端５°リン酸基の除去を意味する。この操作はｌＤＮＡ断片の２つの制 限切断末端が“環化“もしくは閉環を形成してその制限部位における別のＤＮＡ 断片の挿入を妨害するのを防止する。脱リン酸化の操作法および試薬類は従来通 りである。Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ”、　１３３−１３４頁（１９８２）。ＢＡＰ調製物中に存在するすべてのエ キソヌクレアーゼの活性を抑制するために、ＢＡＰを用いる反応を５０ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ中６８℃で行う。反応を１時間行う。反応後、ＤＮＡ断片をゲル精製する 。

“オリゴヌクレオチドとは、化学的に合成し得る一本鎖ポリゾオキシヌクレオチ ドあるいは２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味する。このような合 成オリゴヌクレオチドは５°リン酸基を持たず、したがってキナーゼの存在下で ＡＴＰと共にリン酸塩を添加しないかぎり別のオリゴヌクレオチドに連結しない であろう。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていない断片には連結する であろう。

“連結”とは、２つの二本鎖核酸断片間にホスホジエステル結合が形成する過程 をいう（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、同上、１４６頁）。特に述べない限り、 既知の緩衝液と条件を用いて、約等モル量の連結すべきＤＮＡ断片０．５μｇあ たり１０単位の７４ＤＮＡリガーゼ（“リガーゼ”）で連結を行う。

“充填”あるいは“平滑化”とは、制限酵素で切断した核酸の付着末端中の一本 鎖末端を二本鎖に変換する操作をいう。これにより付着末端が除去され、平滑末 端が形成される。この方法は、１または数種の他の制限酵素でしか生成しない末 端と付着し得る制限切断末端を、あらゆる平滑切断制限エンドヌクレアーゼまた は他の充填した付着末端と適合する末端に変換するための汎用性のある手段であ る。

典型的な場合、１０ｍＭＭｇＣＬ、１１ジチオスレイトール、５０ｍＭＮａＣ１ 、ｌＱｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５（ｐＨ７，５）緩衝液中の標的ＤＮＡ２〜１５μｇを 約３７℃でＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片８単位および各２５０μ菫の４ 種のデオキシヌクレオシド三りン酸の存在下でインキュベートすることにより平 滑化を行う。

一般的には３０分後にこのインキっベーションを停止し、フェノールおよびクロ ロホルム抽出し、エタノール沈殿する。

本発明の教示を特定の課題または状況に適用することは本明細書に含まれる教示 を考慮すれば当業者の能力の範囲内であることは理解される。本発明の生産物の 例およびそれらの代表的単離方法、使用方法および製造方法を以下に記述するが 、これらが本発明を限定するものであると解釈してはならない。

材料の寄託 以下の培養はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク／ヨン（１２３０１Ｐａ ｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ、　ＵＳＡ）　（Ａ 　Ｔ　ＣＣ）に寄託されている。

株　Ａ　Ｔ　ＣＣ寄託番号　寄託日 ６Ｅ１０　ＣＲＬ　１０５１４　１９９０年７月２６日５Ｂ３　ＣＲＬ　１０５ １５　１９９０年７月２６日１３Ｈ８ＣＲＬ　１０５１０　１９９０年７月２６ 日１０Ｆ６　ＣＲＬ　１０５１２　１９９０年７月２６日１１Ｇ５　ＣＲＬ　１ ０５１１　１９９０年７月２６日これらの寄託は特許手続上の微生物の寄託の国 際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定に基づいてなされた ものである。これは寄託の日がら３０年間にわたり生存可能な培養の維持を保証 する。これらの生物は、ブダペスト条約の条件の下に、当該米国特許の発効、あ るいはいずれが最先であるかにかかわらず、米国または他国のいずれかの特許出 願の公開と同時になされる該培養の子孫の永久かつ無制限な公共の利用を保証し 、米国特許および商標局長官によって３５ＵＳＣ第１２２条およびそれに準する 長官規則（特に８８６０Ｇ６３８１：関する３７ＣＦＲ第１．１２条を含む）に 従ってその資格を有すると決定された者による該子孫の利用可能性を保証する、 ジエネンテク・インコーホレイテッドとＡＴＣＣ間の承諾に基づいて、ＡＴＣＣ によって利用可能とされるであろう。

欧州特許がめられている指定間に関しては、欧州特許の付与の告示が公表される まで、または出願が拒絶されもしくは取り下げられ、または取り下げられたとみ なされる日まで、寄託された微生物の試料は、その試料を要求する人により指定 された専門家に対し、て前記の試料を支給する場合にのみ利用可能である（規則 ２８（４）ＥＰＣ）。

本願の承継人は寄託されている培養が適切な条件下で培養した時に死滅するが、 失われるか、もしくは破壊されるはずである場合に、通知後直ちにそれらを生存 可能な切片または同じ培養と置換することに同意した。寄託した株の利用可能性 は、その特許法に従ってあらゆる政府の権力下に付与される権利に違反する本発 明の実施を許可するものであると理解されるべきでない。

上記の記述は、当業者による本発明の実施を可能にするに足ると見なされる。

寄託した態様は単に本発明の特定の側面を例示することを意図するものに過ぎず 、機能的に等価な構築物はすべて本発明の範囲に包含されるので、本発明は寄託 された構築物によってその範囲を限定されるべきではない。本明細書における材 料の寄託は、本明細書に記述した説明が、本発明の最善の様式を含む本発明のい ずれかの側面の実施を可能にするに足らないことを認めるものではなく、また請 求の範囲を記載された特定の例示に限定するものと理解すべきでもない。実際、 上述の説明に基けば、本明細書に示し説明したちの以外にも本発明の種々の変法 が当業者には明らかになるであろうし、それらも後述の請求の範囲に包含される 。

実施例 既存の文献によると、組換えｇｐｌ：２０　（ｒｇｐ１２０）で免疫されたチン パンジーは、ウィルス誘導タンパク質に対する体液性および細胞性免疫を獲得す るが、この製品によるワクチン接種ではインビボでのＨＩＶ−１ｇ染を予防でき ないことが報告されている（例、バーマンら（Ｂｅｒｍａｎ）Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５５２００−５２０４．１９８８　お よび前掲の文献）。驚いたことに、本発明者らの研究により、あるワクチンがそ の予防効果を与えることが分かった。

本研究に用いたタンパク質は哺乳類細胞培養で発現され、アルミナゲルに吸着さ れた精製組換えタンパク！製品である。

このｒｇｐ１２０タンパク質（図３Ａ）は、発現を促進するために、単純庖疹ウ ィルスの糖タンパクＤの短いＮ末端配列に融合させたＨＩＶ−１エンベロープ糖 タンパクのｇｐ１２０フラグメントからなる。ｓｐｇ１６０タンパク質は、タン パク質が哺乳類細胞から分泌されるよう、ｇｐ１６０の膜貫通領域と細胞質テイ ルとを欠失させた該タンパク質の変異体である。両タンパク質は真性のウィルス ｇｐ１２０と同様の方法でグリコジル化され、Ｈ’ＩＶ−１の細胞受容体である ＣＤ４と高い親和性で結合する。

この研究に用いた免疫原ｒｇｐ１２０およびｓｐｇ１８０は上記のごとく、各免 疫原に対する異なるモノクローナル抗体を用いてイムノアフィニティークロマト グラフィーで精製された。本研究に用いたｇｐ１２０と従来の研究に用いられて いたｇｐ１２０との主な相違は、本研究で用いたｇｌ）１２０は混在する不純物 を含まないことに加えてタンパク質加水分解酵素によって分解されていないこと である。従来の研究に用いられていたｇｐ１２０を調べた結果、組換え製品中の ｇｐ１２０の約５０％がアミノ酸３１５の位置で加水分解され、ＳＤＳ　ＰＡ’ ＧＥゲル上、５０ｋｄおよび７５ｋｄに移動するペプチドを含有することが分か った。本発明者らはこの加水分解の部位が主要な型特異的中和エピトープ（図１ におけるＩＶ）の中心に位置することを決定した。この研究で本発明者らは開裂 されていないｇｐ１２０を用いたが、使用したＳｇｐ１６０製品はこの位置で約 ５０％の加水分解を示した。

本研究では２頭のチンパンジーを１４０　１５０ｋｄｓｇｐ１６０タンパク質で 免疫化し、２頭のチンパンジーを１２０−１ｌ２０−１３０ｋｄｒタンパク質で 免疫化した。ブラシーボ・コントロール動物は、哺乳類細胞で発現され、ｒｇｐ １２０と同じ方法で精製［バーマンら（Ｂｅｒｍａｎ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２７ ７：１４９０−１４９２（１９８５）コシ、アルミナゲルに吸着させた同量の１ 型単純庖疹ウイルスの組換え糖タンパクＤ　（ｇＤ−Ｌ）で免疫化した。具体的 には、免疫化する動物あたり、タンパク質３００μｇの投与量となるよう抗原製 品１ｍｌで免疫化した。

全抗原をりん酸緩衝化食塩水（０，０１６Ｍ　ＰＯ，、ｐＨ６，２，０，１５Ｍ ＮａＣ１，０，００４Ｍ　ＫＣＩ）中、現在米国でワクチン製剤のアジュバント として認可されている唯一のアジュバントである水酸化アルミニウム（明ばん） アジュバントで製剤化した［バーマンら（Ｂｅｒｍａｎ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８５：５２００−５２０４　（１９８８） 　’（０，５ｍｇ／ａｌＡドリコ。

本発明者らが用いた免疫化スケジュールは既報のあらゆるＨＩＶまたはＳＩＶワ クチン試行とは異なるが、他の霊長動物における用量インターバル研究で良い結 果を与えることが示された、Ｂ型肝炎ウィルスワクチンに用いられた方法と同一 である〔アンダーソン（＾ｎｄｅｒｓｏｎ）、　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、ＤＩｓｅａ ｓｅｓ　１６０：９６０−９６９　（１９８９）コ。動物は開裂していないｒｇ ｐ１２０またはｓｇｐ１６０による１次免疫を受け（時間０）、４週問および３ ２週間後に追加免疫を受けた。試験製品および対照製品を２カ所に筋肉内投与し た（０．５ｍｌ／部位）。

２力月ごとに動物から血液試料を採取し、多くの分析手段で分析した。免疫学的 分析（例えばｇｐ１２０に対する抗体力価、リンパ球増殖分析等）の外、Ｔ細胞 サブセントのレベル、血清酵素濃度、および臨床化学を監視した。既に報告した ように、これらのタンパク質の接種によるリンパ球サブセット、リンパ球機能、 血清酵素濃度または血液化学の異常は認めなかった。このように、ｒｇｐ１２０ またはｓｇｐ１６０による免疫化による好ましくない副作用（例えば免疫抑制ま たは自己免疫）はこれらの研究では証明できなかった。

−次免疫の後、液相中放射性免疫沈降分析（ＲＩ　Ａ）または市販の（Ｇｅｎｅ ｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）　ＨＩ　Ｖ−１抗体試験（ＥＬＩＳＡ）ではなく、市販 （ＤｕｐｏｎｔまたはＢｉ。

ｒａｄ）のＨＩＶ−１イムノプロット分析によりて、ｒｇｐ１２０ではなくｓｇ ｐ１６０に対する低濃度の抗体が検出された（図６Ａ）。４週間後の２次免疫化 によってＥＬＩＳＡではなく、液相中放射性免疫沈降分析（ＲＩＰ）（図６Ａ） およびイムノプロット分析（データ図示せず）によって検出される、ＨＩＶ−１ 誘導免疫原である両物質に対する穏やかな体液性または細胞性免疫応答が惹起さ れた。３２週間後（２次免疫化から７力月後）の３次免疫化によって３種の抗体 試験で顕著な抗体力価の著しい上昇が起きた（図６および７）。最後の追加免疫 （３５週間後）から３週間後に採取した血清のイムノプロット分析によれば（図 ７）ｒｇｐ１２０を接種されたものはＨＩＶ−１ｇｐ１２０と強（反応し、ｇｐ １６０とはそれほど強く反応しないことが分かった。ｒｇｐ１６０を接種された 動物は意図した通り、ウィルス性ｇｐ１２０と同様、ウィルス性ｇｐ１６０およ びｇｐ４１と反応した。また、イムノプロットで、ｇｐ１２０のタンパク質加水 分解によって生成した生成物と反応性である抗体も明らかになった。ｒｇｐ１２ ０のリンパ細胞増殖促進能力から示唆されるように、この時期にｒｇｐ１２０お よび５ｇ１）１６０免疫化動物に細胞性免疫が検出されたが、対照動物には検出 されなかった（表２）。

３次免疫化の後に観察されたｒｇｐ１２０およびｓｇｐ１６０に対する抗体力価 の上昇は中和抗体の出現と一致している［ロバートソンら（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ）Ｊ、　Ｖｉｒ。

１、Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０：１９５−２０２（１９８８）コ　（図８Ａ）。最高 の中和力価の達成に必要な時間は追加免疫から２〜４週間の間で変化するが、ｒ ｇｐ１２０で免疫化された動物とＳｇｐ１６０で免疫化された動物に検出された インビトロ中和力価のピークの大きさには有意な差を認めなかった。各群の１頭 の動物は中和力価１：６４０を示したが、各群の残りの動物はピーク力価１　： 　３２０を示した。明らかに、これらの中和応答は、同様の感受性の中和分析に おいて、ｒｇｐ１２０に対する血清の中和活性が１５希釈にすぎなかった従来の 観察値（バーマンら、１９８８、前掲）よりもはるかに大きい。即ち、本研究で 用いた免疫原および免疫化の方法は従来観察された値の１−２桁大きい中和応答 をもたらした。

中和抗体の有意なレベルに基づき、本発明者らはこれら動物のウィルスチャレン ジを行った。５頭の動物全部が最終免疫化（３５週）の３週間後に、多くのチン パンジー感染研究［アーサーら（Ａｒｔｈｅｒ）ら、後掲およびプリンスら（Ｐ ｒｉｎｃｅ）前掲］に用いられたＨＩＶ−１のＩＩＩＢ単離体の標準接種物［ア ーサー（Ｄｒ、　Ｌ。

Ａｒｔｈｅｒ）　、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、 　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｅｌｅａ撃狽■A　Ｂｅｔｈ ｅ ｓｄａ　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　［ＩＳＡから提供］から導かれたウィルスの約４ ０組織培養感染量単位（ＴＣＩ　Ｄｓｏ）の静脈内注射を受けた。この単離体か らのエンベロープタンパク質のアミノ酸配列は上記ｒｇｐ１２０およびＳｇｐ１ ６０免疫原の生産に用いたもののアミノ酸配列と９８％同一であった。本研究に 用いたウィルス量は全チャレンジ動物について同一であり、約１０チノパンツー 感染量（ＣＩＤ５゜）に相当した。隔月ごとに動物から採血し、１組の分析にが けてウィルス感染を調べた。

ウィルスチャレンジの後、ｒｇｐ１２０免疫化動物における抗ｒｇｐ１２０抗体 応答の強さおよび長さは本研究の他の動物のそれらと顕著に異なっていた。ＲＩ Ａによって測定したこれら動物での抗ｇｐ１２０抗体の力価はウィルスチャレン ジの後も増加せず、むしろ基線よりも下降する傾向があった（表２）。対照的に 、ｓｐｇ１６０で免疫化された動物の抗ｇｐ１２０抗体の力価はウィルスチャレ ンジの後約７−８週問おだやかに下降した後、過免疫によって達成されるピーク よりも幾分高い力価にまで増加した後、中間の力価で横ばいになった。これらの 結果はｓｐｇ１６０免疫化動物はＨＩＶ−１チヤレンジでウィルス感染し、既往 免疫応答を誘導するに十分な量のウィルスタンパク質を生産したことを示唆して いる。ｒｇｐ１２０−免疫化動物における抗体力価の観察はチャレンジの後も増 大せず、実際に、経時的に消滅し、生産的な感染が起きなかったことを示唆して いる。チャレンジから１６週間後の対照動物にｒｇｐ１２０と反応性の抗体が検 出され、このことはこの動物がＨＩＶ−１に感染したことを意味する。

これらの血清を、市販のＨＩＶ−１抗体分析によってＥＬＩＳＡ分析した結果（ 図６Ｂ）、抗ｇｐ１２０ＲＩＡで検出される活性パターンと異なる活性パターン を示した。この分析では、ＨＩＶ−１に対する抗体は３次免疫化の後にのみ検出 され、ｒｇｐ１６０免疫化動物に存在する抗体応答の方がｒｇｐ１２０動物より も有意に大きかった。この相違は市販のＨＩＶ−１抗体分析は通常、ｇｐ４１よ りも少量のｇｐ１２０を含有していることを反映している。この分析で、ｓｐｇ １６０免疫化動物からの血清はｇｐ４１のみならずｇｐ１２０に対する抗体を含 有するので、強い反応を示した。対照動物はＨＩＶ−１チヤレンジ前のいかなる 時期にもＨＩＶ−１反応性抗体の徴候を示さなかった。ｒｇｐ１６０で免疫化し た動物の抗体力価はウィルスチャレンジの後約６−７週間下降した後、過免疫で 達したと同じレベルに達した後中間の値に下降した。これと対照的に、ｒｇｐ１ ２０免疫化動物にけるＥＬＩＳＡ力価は増加せず、むしろチャレンジ後７週間、 減少し続けた（表２、図６Ｂ）。この結果はｒｇｐ１２０免疫化動物ではＨＩＶ −１が、ＨＩＶ−１抗体分析に含まれるなんらかのウィルス性抗原に免疫応答を 引き起こすに十分な程、複製しなかったことを証明している。この分析では、チ ャレンジの時点で対照動物は陰性であったが、チャレンジ後１３週開目でウィル ス感染に対する応答が陽性になり、この動物がＨＩＶ−１感染したことを示して いる。

チンパンジー血清の免疫プロット分析の結果、ｒｇｐ１２０免疫化動物およびＳ ｇｐ１６０免疫化動物の血清にはＨＩＶ−１エンベープ糖タンパク質に対する抗 体が存在していたが、コアタンパク質に対する抗体は存在していないことが分か った（例、ｐ１７、ｐ２４、ｐ５５）。２頭のＳｇｐ１６０免疫化動物のＨＩＶ −１感染の血清学的証拠は最初、チャレンジから５週間後に、弱いｐ２４バンド が現れたことによって分かった（データ示さず）。ｐ１７およびｐ５５に対する 抗体は後日認められた（表２、図７）。まず、対照動物の血清におけるｐ２４に 対する抗体がチャレンジから９週間後に検出された（データ示さず）が、ｐ１７ 、ｐ５５およびｇｐ１２０に対する抗体は後日検出された。興味深いことに、Ｈ ＩＶ−１構造タンパク質（例、ｐ５５、ｐ２４およびｐ１７）に対する抗体応答 の強さは、対照に比較して、ｓｇｐ１６０免疫化動物ではるかに大きい（図７） 。ｒｇｐ１２０免疫化動物には、チャレンジの際にｇｐ１２０に対する抗体が、 存在していたが、チャレンジ後１３週目には大部分、消失していた（図７）。明 らかに、ｒｇｐ１２０で免疫化された動物は、チャレンジ後２６週目に、ｇｐ１ ２０以外のＨＩＶ−１コード化タンパク質のいずれにも血清変換しなかったので あり、このことはそれらがＨＩＶ−１感染に耐性であったことを意味する。

ＨＩＶ−１チヤレンジ後の中和抗体濃Ｉの変化は抗ｇｐ１２０カ価に見られる変 化と平行である（図６Ａおよび７）。即ち、３２週の免疫化によって高レベルの 中和抗体がｒｇｐ１２０およびｓｇｐ１６０免疫化動物に惹起され、それは３５ 週目のＨＩＶ−１チヤレンジの時まで維持されていた（表２）。ｒｇｐ免疫化動 物における中和力価はウィルスチャレンジの時までにピーク力価に達し、ｎは６ ０週目までに免疫化以前の血清レベルに達するまで着実に減少した。ｓｇｐ１６ ０免疫化動物における中和力価は数週間減少したが、チャレンジ後の７週目に、 おそらくウィルスタンパクの生産に応答して急速に上昇した。チャレンジから１ ３週間後までに、ｓｇｐ１６０動物の内の１頭は中和力価が１　：　１２８０に 達した。対照動物では、チャレンジ後１７週目まで、中和抗体は検出されなかっ た。

これら分析の結果はＨＩＶ−１がｒｇｌ）１２Ｑ免疫化動物では複製しなかった が、対照動物およびＳｇｐ１６０免疫化動物では複製したことを示している。

免疫化動物のいずれかから生存可能なウィルスが回収されるか否かを調べるため にウィルス共−培養研究を行った。チャレンジから６−７週間後に対照およびｓ ｇｐ１６０免疫化動物からＨＩＶ−１が回収され得た（表２）が、チャレンジの ６力月後までのどの時期にも、どのｒｇｌ）１２０免疫化動物からも回収されな かった。対照および２頭のＳｇｐ１６０免疫化動物がＨＩＶ−１感染しているこ とのさらなる証拠がＰＣＲ分析で得られ、該分析ではこれらの動物にプロウィル スＤＮＡが検出されたがｒｇｐ１２０免疫化動物では検出されなかった（表２） 。

これらの結果を合わせると、ｒｇｐ１２０による免疫化でこれら動物でのＨＩＶ −１感染を有意に遅らせるまたは完全に予防する防御免疫応答が惹起されたこと が分かる。

ｒｇｐ１２０およびＳｇｐ１６０免疫化チンパンジーに存在する中和抗体のレベ ルは最終的な追加免疫から４週間の間隔で、奉賀的に同一であったので、ｒｇｐ １２０免疫化動物のみがＨＩＶ−１感染から保護されたことは驚異的である。

これら２群の動物におけるＨＩＶ−１感染し易さにおける相違の原因の１つは、 実際のウィルスチャレンジの日に、Ｓｇｐ１６０免疫化動物はｒｇｐ１２０免疫 化動物の中和力価１：３２０および１：６４０よりもやや低い力価（即ち１．１ ６０）を示したことで説明される。もしもチャレンジの日に存在する抗体レベル が優先的に重要であれば、本発明者らの示したデータは、感染予防のためには力 価が＞１　：１６０である必要性を示唆している。結局、本発明者らは感染予防 にそのような明確な閾値はなく、他の因子も当然関与していると考える。

機能的に重要な特異エピトープに対する抗体が予防により関係しているか否かを 調べるためにさらに研究を行った。本発明者らはｇｐ１２０のＣＤ４への結合を 阻害することのできる抗体が重要な役割を果している可能性があると推論した。

本発明者らは既に［バーマンら（Ｂｅｒｍａｎ）　Ｊｊ’１ｒｏ１．６３：３４ ８９−３４９８　（１９８９）；およびラスキーら（Ｌａｓｋｙ）　Ｃｅ１ｌ　 ５０：９７５−９８５　（１９８７）］　ｒ　ｇ　ｐｌ　２０およびｓｇｐ１６ ０がこの相互作用を有効に中断する抗体を惹起することを示した。またチャレン ジの際の血清の分析はＨＩＶ−１誘導免疫原を有する動物すべてがＣＤ４結合を 遮断（ブロッキング）する抗体を有し、遮断力価は感染の予防または中和力価と 関連していなかった（表２）。本発明者らはまた、中和抗体の亜集団（サブポピ ユレーション）がｒｇｐ１２０およびＳｇｐ１６０処置動物における予防の相違 に関与している可能性を考慮した。これらの研究で本発明者らは主要な型−特異 的中和決定基（ＭＮＤ）を含有することが知られているｇｐ１２０のＶ３領域内 のペプチドと反応性の抗体に対する血清を分析した［マツンタら（Ｍａｔｓｕｓ ｈｉｔａ）　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２：２１０４−２１１４（１９８８）コ　。

このエピトープに対する抗体は、マツンタ（前掲）記載のごと（、合成ＭＮＤペ プチド、ＲＰ１３５を導入しＥＬＩ　ＳＡを用いて検出した。ｒｇｐ１２０およ びＳｇｐ１６０免疫化動物からの血清を比較し、本発明者らはＭＮＤペプチドと 結合する抗体は２つの動物群で著しく異なることを見いだした（表２、図８Ｂ） 。

チャレンジの時点では、Ｓｇｐ１６０で免疫化された動物に比べてｒｇｐ１２゜ で免疫化された動物におけるＭＮＤに対する抗体の量は約１０倍であった。特に 興味深いのは、ＲＩＡで最低の抗ｇｐ１２０力価を示した１頭の動物が、ＭＮＤ に対して最高の力価を有し、感染から保護されたことである。即ち、予防とＭＮ Ｄに対する抗体レベルとの関係は中和抗体と予防との関係よりも強いと思われる 。

ＭＮＤに対する抗体の生成の相違は２つの製品におけるタンパク質加水分解プロ セシングの量の相違（図３）（即ち、ｓｇｐｌａｏは４％、ｒｇｐ１２０は５％ ）、とりわけ開裂部位に関し、この場合３１２位のアルギニン残基がＭＮＤを含 むジスルフィド結合内に位置することによるかもしれない。ｒｇｐ１２０および ｓｇｐ１６０のタンパク質加水分解生成物はＣＤ４と高い親和性で結合し得る［ バーマン（Ｂｅｒｍａｎ）およびグレゴリ−（Ｇｒｅｇｏｒｙ）、未公開文献］ ので、この位置におけるタンパク質加水分解はこれらいずれにも主要な立体配座 の変化をもたらさないことが注目される。ＲＩＡ力価およびＨＩＶ−１抗体力価 についてと同様、本発明者らはこのエピトープに対する抗体の濃度は最後の免疫 化（３２週目）の後すぐにｒｇｐ１２０動物で最高値となり、基線の値まで減少 し続けた。ｓｇｐ１６０免疫化動物の抗体は最後の注射の直後にピークに達し、 数週間減少し続けた後、増大しチャレンジから２５週以上陽性を維持した。ＭＮ Ｄに対する抗体は対照動物ではチャレンジの１５週後に認めた。

この研究で重要な他の結果は、インビトロでＨＩＶ−１感染を中和し得る、少な くとも２つの抗体群があるということである。１つの群はｒｇｐ１２０に対して 惹起され、おそら＜ＭＮＤに向けられたものである。第２の群はｓｇｐ１６０に よる免疫化で惹起されＭＮＤ以外の部位に向けられたものである。インビボでの 予防はＭＮＤに対する抗体の存在に依存するとの仮説はｒｇｐ１２０免疫化動物 におけるデータで支持されているが、本発明者はＳｇｐ１６０免疫化動物におけ る予防の欠如はＭＮＤに対する抗体が低レベルであることによるか否かを確信す ることはできなかった。他の説明として、これも本発明者らのデータに一致した 説明であるが、Ｓｇｐ１６０によってＭＮＤ以外の部位に対して惹起された中和 抗体は実際、インビボ予防を与えることができるが、ある因子がそれらの予防に 対して干渉または廃棄効果を与えるということである。インビトロでウィルス感 染を阻害するよりも促進するＨＩＶ−１抗体の報告が幾つかある［ホムシーら（ Ｉｌｏｍｓｙ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：１３５７−１３５９（１９８９）： 　ロビンソンら（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）　Ｌａｎｃｅｔ　１jア９ Ｏ−７９４（１９８８）コ。ｓｇｐ１６０には含有されているがｒｇｐ１２０に は含有されていない促進エピトープは、本発明者らの予防に対する観察に関連す るかもしれない。この可能性は、ＨＩＶ−１コアタンパク質への血清変換が、対 照動物（Ｘ−２４６）でチャレンジから１１週後であるが、それよりもｓｇｐ１ ６０（ｘ−２４７およびｘ−２６１）で免疫化された動物の方が速く（チャレン ジから５週後）、免疫プロット分析で観察した免疫応答の強さは後者の動物にお いて対照動物よりもはるかに大きい（表２）という観察結果と一致し得る。最近 、２つの異なる促進エピトープがＳｇｐ１６０に存在するがｒｇｐ１２０には存 在しない、ｇｐ４１領域にマツピング（位置付け）された（ロビンソンら（Ｒｏ ｂｉｎｓｏｎ）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ　（印刷中））。

ｒｇｐ１２０によるＨＩＶ−１感染からの保護に失敗した本発明者らの以前の研 究（Ｂｅｒｍａｎら前掲）に比べてｒｇｐ１２０に関する本研究の成功には幾つ かの要因が関与する。著しい相違の１つは、動物を最適な免疫化に従って免疫し た点である。他の重要な相違は先の研究で用いたｒｇｐ１２０は純度わずか５０ ％であり、５０％が開裂していたのに対し、本研究で用いたｒｇｐ１２０の開裂 率は５％未満であった点である（図３）。第３の相違点は、以前の研究では動物 をＨＩ〜’−１の１００ＴＣＩＤ５０単位（２５ＣＩＤ５Ｇ）にチャレンジさせ たが、本研究ではウィルスの４０ＴＣＩＤ、。単位（ＩＯＣＩＤ、。）にチャレ ンジさせた。最後に、本研究と従来の研究の相違は実験計画にある。チンパンジ ーの入手可能性によって治療群の大きさが数頭に制限されるので、チンパンジー 有効性研究での統計学的な有意性の表示が制限される。即ち、負の結果の説明が できず、本発明者らは以前の研究で用いたｒｇｐ１２０、あるいは本研究で用い たｓｇｐ１６０が何らかの有意な保護免疫を付与するか否かをはっきりと見分け る二とができなかったのである。

本出願は知り得る限り、チンパンジーのＨＩＶ−１感染の予防に成功したＡＩＤ Ｓワクチン候補の最初の報告である。重要なことは、本明細書に記載の組換えサ ブユニットワクチンが単一の精製タンパク質であって、完全に非感染性の物質か らなり、それがヒトに用いるためのアジ二バント中で有効であるということであ る。

表２　ＨＩＶ−１感染の前および後のチンパンジーの免疫学的およびウィルス学 的特性 Ｉ・　ウィルスチャレンジ時（３５週）の特性１＋＊＝　−麿話ト　−蹴ツー Ｍ２ＡｊＬにムユｘ２ｊｒＡ　ｘ２ｍにｕ１ユ、　抗　−ｇｐｘ２０　力価　４ ．３　４−３　４．８　３．９２、ｔｏ４１に対Ｔる抗体 コ＋　ＨＩＶ−１ｍＩＳＡ　＜２４００　６４００　２５．６００　３２００　 ４００４、＋ａ１２０に対する増殖　＄　ｄｈ　ｄｌ　＋Ｈ５、中和力価　°（ １０ユ６０　１６０　３２０　６４０６−　Ｃ１）４ブＯ＊２ング抗体　（ユ　 ２．２　２．５　２−５　１．７？、　′ｕｃ　−ＫＮＤ　力　ａ　（１０１４ ５１４９４９１８４４エエ、ＨＩＶ−１チヤレンジ後の特性 ｚ、ＭＩＶ−＋の８１回（Ｄ共培１２　６　６　７　−　−２、抗−ｐ２４に対 する時間（ｊ）　！Ｉ　Ｓ　Ｓ　−−！、　ｏ＋７に対Ｔる時間（週）　ユコ　 Ｓ　Ｓ　−−４、択フ（５３遍） ｌ　ＭＸＶ−１１！！ＪＳＡ力価　（Ｓｏｉり　８００　３２００　６４００　 ｃ４００　＜４００６、　中和力価（６０週）　ｎｏ　８０　ａロ　（１０（ユ ロ７、＋ｇｏ＋２０１：ＮＴ！Ｉｔ殖ｒｇｐ１２０　−　中＊　−−４６０週） ８、抗　−９ｐユ２０　力価　（６３週）　−３，２２，９−−表２の説明 本：　ｇｐ１２０に対する抗体力価は液相ＲＩＡで測定した：示したデータは最 終点の希釈滴定のｌｏｇ値で示されている（図６Ａの説明参照）。ｇｐ４１に対 する抗体の存在およびｐ２４およびｐ１７に対する抗体の出現は連続的に採血し 市販のウェスタンプロットストリップ（ｆｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　５ｔｒｉｐ ）　（Ｄｕｐｏｎｔ、Ｂｉｏｒａｄ）によるイムノプロット分析で測定した。ｇ ｐ１２０のＣＤ４への結合を阻害する抗体は既述の方法で測定した：データは最 終点希釈滴定のｌｏｇ値で示されている。

ＨＩＶ−ＩＥＬＩＳＡＥＬＩＳＡ法ＨＩＶ−１抗体分析キットを用いて測定した （図６の説明参照）。ＨＩＶ−１の共培養およびｒｇｐ１２０に対するチンパン ジーリンパ球の増殖は既述の方法で行った。インビトロ中和抗体の測定はロバー トソンら（前掲）の方法で行った（図８の説明参照）。抗ＭＮＤ力価は既述のご と＜ＥＬＩＳＡ分析で測定した。ＰＣＲ反応性はケロッグおよびケオツクの方法 を用いて調べた口Ｋｅｌｌｏｇ　ａｎｄ　Ｋｖｏｋ、　ｉｎ　ＰＣＲＰｒｏｔｏ ｃｏｌｓ（Ｉｎｎｉｓ　ｅｔ　ａｌ、ｅｄｓ）　３３７−３４７　（Ａｃａｄｅ ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９９０）　ｏ簡単に述べると、 凍結リンパ球をｐｃＲ溶解バッファー内で処理し、ＤＮＡをファノールークロロ ホルム抽出し、エタノール沈澱した。ＤＮＡ試料（１５０，０００−３００，０ ００細胞に匹敵する量）を５Ｋ６８および５Ｋ６９プライマーを用いて４０サイ クルのＰＣＲに付した。試料を２５ｍＭＮａＣ１に調節し、溶液中、５５℃で０ ．５　ｐＭのガンマ標識［３”Ｐ］−ＡＴＰで末端標識したプライマー５Ｋ７０ とハイブリダイズさせた。試料をＴＢＥバッファー中、１０％アクリルアミドミ ニゲルで分離させた。次いでゲルを乾燥し、これを用いてＸ−線フイルムに露光 させた。陽性の対照ＤＮＡをｇｐ１６０を発現しているトランスフェクトされた ＣＨ○細胞から調製した。ベータグロブリンに対するプローブを用い、ＤＮＡ試 料の増幅の可能性を試験した。

試料は標識されたプライマーが１４１塩基対のバンドとハイブリダイズすればＨ ＩＶ−１陽性とみなした。

１、　モノクローナル抗体の生成および特性化ラスキーらの方法［Ｌａ５ｋｙ、 　５ｃｉｅｎｃｅ　２２３：　２０９　（１９８６）コに従って組換えｇｐ１２ ０およびｇｐ１６０の可溶化型をチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）　細 胞で発現させ、既述のごと＜Ｄ５３１およびＤ６８３．Ｄｃ、ｇの増殖調節細胞 培養培地（ｇｒｏｗｔｈ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ 　ｍｅｄｉｕｍ）からアフィニティークロマトグラフィーで精製した。組換えｇ ｌ）１６０の可溶化型（ｓｇｐ１６０または５８３ＤＣ，７）は２つの欠失を有 する。最初の１０アミノ酸欠失はｇｐ１２０／４１切断部位を含み、東２の欠失 は疎水性膜貫通および細胞質テイル部位の欠失を含んでいた。ＥＬＩＳＡ分析の ために、ｇｐ４１のアミノ末端から１００アミノ酸に融合したＴｒｐＥ遺伝子の アミノ末端断片からなるｇｐ４１融合タンパク質（ＬＥ４１）を既述のごと（大 腸菌内で発現させ、精製した。ｒｇｐ１２０および５ｇ１）１６０を尿素および ＥＤＴＡを含有するＴｒｉｓ−ＨＣＩバッファー内へ透析することにより還元お よびカルボキシメチル化されたｒｇｐ１２０およびｓｇｐ１６０を調製した。最 終濃度がｌ□＋Ｍになるようにジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加え、タンパク 質を室温で４時間撹拌した。最終濃度が２５ｍＭになるようにヨード酢酸を加え 、試料を重炭酸アンモニウムバッファーに透析した。

これらのタンパク質を用いて１．０Ｈｇ／ｍｌでＥＬＩ　ＳＡプレートをコート し、通常のＥＬＩＳＡ法によって精製モノクローナル抗体をスクリーニングした 。

ＨＩ　Ｖｅｎｖタンパクの可溶化型の両者をアフィニティー精製し、モノクロー ナル抗体（Ｍａｂ）の製造のために、これを用いて市販のＢａ１ｂ／ｃマウスを 免疫化した。各マウスにｒｇｐ１２０またはｓｇｐ１６０　（６８３△Ｃ１７） の２０ｔｔｇを腹腔内（ｉ、ｐ、　）または静脈内（ｉ、ｖ、）接種し融合の３ 日前にブースター処理した。融合のために抗血清が最高のマウスを選択した。５ ０％ポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫ラインＮＰ３ｘ６３−Ａｇ８ ．６５３を膵臓細胞と４：１の比率で融合させたが、他の市販の骨髄腫セルライ ンも確立された方法で用いることができる。ヒボキサンチンおよびアザセリンを 補充した培地での増殖に関してハイブリッドを選択した。陽性の親上清を、個々 のウェルを固相酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によりスクリーニングするこ とで同定した。

反応性のウェルをエキスバンド（拡張）し、制限希釈法でクローニングし、ｌ＼ イブリドーマ細胞をプリスチンープライムＢａ１ｂ／　ｃマウスに注射した。腹 水を採取し、プールしプロティンＡカラムクロマトグラフィーで精製した。

６８３ＤＣ，７に対するモノクローナル抗体を産生ずる１０個の安定な細胞株お よび１１個の細胞株が幾つかの融合で生産された。これらはまず、固相ＥＬＩＳ Ａで組換えｇｐ１２０／ｇｌ）１６０との結合能力に関してスクリーニングされ た。１７個のＭＡｂがｇｐ１２０と反応し、他は分子のｇｐ４１部分と反応した 。

固相ＥＬＩＳＡは以下のようにして行われた。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレ ートを１．　Ｏｕ　ｇ／＠１の組換えｓｇｐ１６０、ｒｇｐ１２０、またはＬＥ ４１で被覆した。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ　（ウシ血清アルブミン／リン酸−緩 衝化食塩水）でブロッキングした後、ＥＬＩＳＡの標準的な手法で精製抗体１０ ０μｍを濃度１０μｌ／ｍｌで試験した。

以後の分析は１１２０のＣＤ４への結合の相対的な強度を滴定し、相対的な親和 性を決定するために行った。精製抗体をｒｇｐ１２０またはｓｇｐ１２０に対し て滴定し、最大０．　Ｄ、の１／２を滴定曲線から計算した（結果は示されてい ない）。

加えて、可溶性抗原と結合するより親和性の高い抗体を選択するために抗原捕獲 分析を用いた。ヤギ抗マウスＩｇＧ０．５μｇでグイナテツク（Ｄｙｎａｔｅｃ ｈ）ポリスチレンリムーバブルストリップを被覆し、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで プロ・ソキングした。ストリップを洗浄し、精製抗体１００μｍを濃度１０μｇ ／ｍｌで加え３７℃で２時間インキュベートした。スト１月ノブを洗浄し、ｌ” ！ｌ−６８３△Ｃ，７のｌＱ’ｃ、ｐ、　ｍ、　／ウェルで室温で２時間標識し た。最後にウェルを洗浄し、切り離し、ガンマカウンターで計数した（結果は示 さず）。

１９個のＭＡｂはＩｇＧ１アイソタイプであったが残る２個はＩｇＧ２ａであっ た。アイソタイプをＺｙｍｅｄ　（Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、 　ＣＡ、　ＵＳＡ）から入手可能な１ｌｏｎ。

Ａｂ−ＩＤ　ＥＩＡキットを用い、業者によるアイソタイプ決定のプロトコール １こ従つて決定した。プレートをｇｐ１６０　（１，０Ｈｇ／ｍｌ）で被覆した 。

２　モノクローナル抗体のエピトープマツピング上記のＭＡｂでｇｐ１６０上に 約１１個のエピトープが明らかにされた。一般に、これらの結果は様々なエピト ープマツピング法の結果と一致している。ウェスタンデータ、還元およびカルボ キシメチル化（ＲＣＭ）ｇｐ１６０／１２０によるＥＬＩＳＡ分析、およびラム ダｇｔｌｌマツピングに基づいて、抗体の大部分は線状エピトープと結合すると 思われる。１個の抗体６Ｅ１０は立体配座のエピトープと結合するらしいが、こ れも、ウェスタンプロット分析で幾つかの反応性を有する。方法および結果を以 下に示す。

１、　ウェスタンイムノプロット：天然に存在するｇｐ１２０のタンパク質加水 分解的切断で３つの主要なポリペプチドが分離される。それらはｇｐ１２０を構 成する７５．０００ダルトンのＮ−末端バンドと５５，０００ダルトンのＣ−末 端バンドである。さらに５５，０００ダルトンのＣ−末端バンドの切断で３５゜ ０００ダルトンのＣ００Ｈ−末端バンドが得られる。これらのｇｐ１２０のタン パク質加水分解的切断フラグメントを用いるモノクローナル抗体のウェスタンプ ロット分析は、エピトープの初期マツピングに有用であった。

２、　エピトープ交差競合ＥＬＩＳＡ：ｇｐ１２０および１６０タンパク質の両 者の上にあるエピトープ結合部位に対するＭＡｂの競合能力を試験した。ＥＬＩ ＳＡ？イクロタイタープレートをＳｇｐ１６０またはｒｇｐ１２０で１．Ｏｕｇ ／ｍｌで被覆した。ＢＳＡ／ＰＢＳでプロプキングした後、精製ＭＡｂを１００ μｇ／Ｉ１１となるように加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄せずに 、さらに１時間、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させた抗体各５０μｍを加 えた。

プレートを洗浄し、基賀を加え、４９０ｎｍで測定した。

３、　ラムダｇｔｌｌマツピング ベータガラクトシダーゼと融合した、無作為に発現されたｇｐ１６０前駆体の部 分からなるライブラリーを構築した。簡単に述べると、３．５ｋｂＨＴＬＶ−Ｉ 　Ｉ　ＩＢｇｐ１６０領域を漸増量のＤＮＡ５ｅＩで処理しくＰＣＴ公開ＷＯ９ ０１０７５７２．１９９０年７月１２日発行の公報に記載）　、ＤＮＡポリメラ ーゼのフレノウフラグメントおよび４個のデオキシヌクレオチドトリホスフェー トで平滑末端化し、ＥｃｏＲＩオリゴヌクレオチドリンカーと結合させた。原料 を５％アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ゲルの１００−１１００ｂｐ領域を 単離した。この領域のＤＮＡを溶離し、１μｇのラムダｇｔｌｌＥｃｏＲＩ−切 断ファージアームに結合させた。結合したＤＮＡをインビトロでパッケージング し、Ｅ。

ｃｏｌｉ　１０８８内で増幅した。ライブラリーは１．６ｘｌＯ’の別個のファ ージからなっていた。

ライブラリーを、約４ｘｌＯ３のファージをＥ、　ｃｏｌｉＹ　１０９０細胞上 に、ブレーティングすることでスクリーニングした。プラークが発達したのち、 イソプロピルチオガラクトンドに浸したニトロセルロースフィルターをプレート の上に置き、−夜インキユベートした。フィルターをブロックし、ＭＡｂと一緒 にインキュベートした。ヤギ抗マウス抗体と結合した西洋ワサビペルオキシダー ゼを用い、発色検出した。

陽性反応を示すファージをプラーク精製し、ＤＮＡを単離した。２末鎖ラムダＤ ＮＡ配列決定を以下のベータガラクトシダーゼ遺伝子特異的オリゴヌクレオチド プライマｍ： ５′−Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ａ　ＣＡ　ＣＣＡ　Ｇ　Ａ　ＣＣＡ　Ａ　ＣＴ　Ｇ　Ｇ　Ｔ 　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇへ３゛（逆またはカルボキン末端） ５”　−ＡＴＧＧＧＧＡＴＴＧＧＴＧＣ；ＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧ− ３’（順またはアミノ末端） およびフレノウＤＮＡポリメラーゼとジデオキシヌクレトチドを用いて５０℃で 行った。観察したＤＮＡ配列は挿入されたｇｐ１２０フラグメントと同格であっ た。

４、　ペプチド：ｇｐ１２０の様々な領域からのペプチドを合成するか、様々な 消化物のアフィニティー精製を行って単離した。ペプチドをニトロセルロースに スポツトし、様々なモノクローナル抗体と反応させた。モノクローナル抗体とポ リペプチドとの反応性を調べるのに、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤ ギ抗マウスＩｇＧまたはヨウ素化プロティンＡをプローブに用いた。

５、ＲＣＭ１６０／１２０：ＭＡｂが線状または立体的なエピトープのいずれと 反応するかを調べるために、還元されたカルボキシメチル化（ＲＣＭ）ｇｐ１６ ０／１２０に対するＥＬＩＳＡ分析でスクリーニングした。６８３△Ｃ，７およ びｒｇｐ１２０を尿素およびＥＤＴＡ含有Ｔｒｉｓ／ＨＣＩに透析した。翌日、 ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を最終量１０ｍＭになるように加え、タンパク質 を室温で４時間混合した。ヨード酢酸を最終量２５ｍＭになるように加え、試料 を暗所で３０分間混合した。ＤＴＴを最終量が１００ｍＭとなるように加え、試 料を炭酸水素アンモニウムに透析した。タンパク質を用いてＥＬＩＳＡプレート を１．０μｇ／１１で被覆し、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールでＭＡｂをスク リーニングした。

エピトープマツピングの結果を以下の表３にまとめて示す。

（以下余白） 表３＊ エロｆ＋８　１２０に、７５ｋ　Ａ　３０ｉ−３２４１３Ｈ８１２０に、７５ｋ 　Ｆ（Ｄ／！ｌ　４ユ０−４５３　４１２−４５７１４Ｆ１２　１６０に、４１ ｋ　！（Ｄ／Ｃ１木下線を引いたＭ、Ａｂはｇｐ１２０に対して惹起されたもの である。他のすべては６８３△Ｃ，７（ｇｐ１６０）に対して惹起されたもので ある。

これらの抗体の特異性を詳しく調べるために、モしてｇｌ）１２０またはｇｐ１ ６０に対する優先的な反応性がＥＬＩ　ＳＡ分析における人工産物に対する特異 性を表す可能性をコントロールするために、これら抗体の結合を液相放射性免疫 沈降分析（ＲＩ　Ｐ）で研究した。これらの実験のために、ｒｇｐ１２０および ｓｇｐ１６０をＣｓ５５］−メチオニンで代謝的に標識した。両タンパク質を混 合し、モノクローナル抗体と反応させた。次いで生成した抗体−抗原複合体をグ ルタルアルデヒド固定化Ｓ、　ａｕｒｅｕｓに吸収させ、特異的に免疫沈降する タンパク質を既述のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。図５はｓｇｐ １６０に対する１０個のモノクローナル抗体を分析したオートラジオグラフであ る。試験した１またはそれ以上の血清によって特異的に沈降する３個の主要なバ ンド、ｓｇｐ１６０に対応する１４０ｋＤバンド、ｒｇｐ１２０に対応する１１ ０−１２０ｋＤバンド、およびｇｐ１２０およびｓｇｐ１６０のタンパク加水分 解産物を表す７５ｋＤバンドの存在が認められる。上記の先の研究で、細胞培養 で生産された組換えｇｐ１２０およびＳｇｐ１６０はしばしばアミノ酸残基３１ ５−３１６の間で開裂していることが示された。ｇｐ１２０の場合、この残基で の加水分解はアミノ末端７５ｋＤフラグメントとカルボキシ末端５０ｋＤフラグ メントを与え、後者はさらに小さいフラグメントに加水分解される。Ｓｇｐ１６ ０は、この残基における加水分解で７５ｋＤ移動性の２７ラグメント（ｇｌ）７ ５ａおよびｇｐ７５ｂ）を与える。表１および表２の結果と図４との比較で、Ｒ ＩＰデータはＥＬＩＳＡデータと極めて良く対応しており、モノクローナル抗体 ９Ｅ３．１０Ｃ１，１４Ｆ１２、および１５Ｇ７は皆、専らｇｐ１６０と反応す ることが分かる。この結果はこれらの抗体がｇｐ４１上のエピトープまたはｇｐ ４１およびｇｐ１２０の相互作用に依存しているエピトープと反応することを示 唆している。従って、観察された選択性をＥＬＩＳＡ一式に含まれる人工産物に 帰することはできない。

３　モノクローナル抗体の機能 ６個のモノクローナル抗体がｇｐ１２０のＣＤ４受容体への結合を阻害した。

これら６個の内、３個は、インビトロでの逆転写活性の減少で示されるようにＨ ＩＶピリオン中和能を有した。他の３個のモノクローナル抗体もインビトロ逆転 写酵素分析で感染性ピリオンを中和した。分析の方法は以下の通りである。

１、ＣＤ４／ｇｐ１２０結合：ＣＤ４／ｇｐ１２０ブロッキング（妨害）活性を 測定するための液相ＥＬＩＳＡ分析でモノクローナル抗体を試験した。ＥＬＩＳ ＡマイクロタイタープレートをＣＤ４　（ＬｉＯ２，５）に対する抗体で１．０ １μｇ／１１で被覆した。別の反応プレートで、ｇｐ１６０または１２０抗体を 可溶性ｒｇｐ１２０と一緒に４℃で１夜インキユベートした。室温で１時間、可 溶性ＣＤ４を加え、得られた複合体をＬｉＯ２，５−被覆プレートに移した。ブ ロッキングされていないＣＤ４を西洋ワサビと結合した抗ＣＤ４抗体（Ｌｅｕ３ ａ−ＥＩＲＰ）で検出した。ＣＤ４／１２０結合部位がｇｐ１６０／１２０抗体 でブロッキングされれば可溶性ＣＤ４はプレートと結合しベルオキシダーゼ結合 物によって検出されるであろう。

２、　シンンチア（Ｓｙｎｃｙｔｉａ）阻害分析：モノクローナル抗体の、ＨＩ Ｖ　（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）感染細胞とのシンジチア形成阻害能力を既知の方法で試験 した。

３、逆転写分析：逆転写（ＲＴ）分析で、モノクローナル抗体のインビトロでの ＨＩＶ中和を試験した。この分析で様々な希釈度の抗血清をＨＩＶ−１のＩＩＩ Ｂ単離体のストック溶液と一緒にインキュベートした。次いで、既に文献に記載 したようにＨ９細胞の培養に抗体−処理ウィルスを添加し、７日間の培養の後、 逆転写酵素特異的チミジン取り込みを測定した。この分析で、試験した１０個の 抗体の内４個がＨＩＶ−１感染性を阻害することが分かった。感染したＣＤ４＋ Ｔ−リンパ球培養における逆転写酵素活性の大きい減少程度はモノクローナル抗 体によるウィルスの中和を示している。陽性の結果は最小限１０倍希釈（約５０ −１００μｇ／ｍｌ）で５０％以上のＲＴ阻害のあることを示している。

これらの分析の結果を表４に示す。

轟土ヱ ４　シンジチア　アッセイ ＊：下線を引いたＭＡｂはｇｐ１２０に対して惹起された。他のすべては６８３ △Ｃ，７（ｇｐ１６０）に対して惹起された。

４　考察 ｇｐ１６０の１１の異なるエピトープを規定する２１個のモノクローナル抗体の 内、利用可能な分析に基づいてｇＥ１２０のｍ能的なエピトープであると同定さ れた。これら抗体の６個がｇｐ１２０／ＣＤ４相互作用を阻害した。これら６個 の３．３個の抗ｒ１１１２０ＭＡｂおよび１個の抗６８３△Ｃ７ＭＡｂが、ＣＤ ４結合に重要と考えられる（ラスキーら、前掲）ｇｐ１２０上のある領域に結合 した。他の２個の阻害抗体６Ｅ１０および５Ｂ３（これらは６８３△Ｃ，７ｉ： 対して惹起されたものだが）は、以前に報告されたＣＤ４結合領域と配列上近接 していｔい領域に結合するようである。これらが立体的に阻害するのか、あるい は七〇Ｚんら６％の相互作用を介して阻害するのかは明らかでないＣ６Ｅ１０お よび５Ｂ３に対する興味は、逆転写分析で示された、それらのウィルス中和能力 によってさらに強められた。これらの抗体が感染性に重要なｇｌ）１２０の他の 領域を規定する可能性もある。

これもまた６８３△Ｃ，７に対した惹起された１０Ｄ８および１０Ｆ６抗体は先 の公開文献［マツシタら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２（６）：２１０７−２１１４． １９８８１でＲＰ−１３５と命名された２４アミノ酸領域（アミノ酸３０１−３ ２４）に結合した。シンジチア阻害分析のデータはＲＰ−１３５領域に対する抗 体に関する他の報告と一致した。この領域がどのようにして中和に関与している かは正確には分かっていないが、それがｇｐ１２０／ＣＤ４結合部位の外側にあ ることは知られている。さらに重要なことに、この領域は内部ｇｐ１２０開裂部 位（アミノ酸３１５−３１６）にまたがっている。この領域に対するこれらの、 または他の抗体は非開裂ｇｐ１２０製品が必要な時、ｇｐ１２０を切り分けるの に用いられる。

その他のｇｐ１２０上の、他のモノクローナル抗体が結合したエピトープは種々 の単離体の間で高度に保存されているが、これらの領域にはなんらの機能も帰属 されていない。幾つかのｒｇｐ１２０およびｓｇｐ１６０ＭＡｂは同じエピトー プに結合するようであるが、Ｓｇｐ１６０に対して惹起されたもののみが機能的 な活性を示す。これは、６８３△Ｃ，７分岐が中和ＭＡｂの生成に必須の立体配 座を保存することを示唆している。

本研究では、ＨＩＶ−１のＩＩＩＢ単離体に対して惹起された抗体と他の単離体 との交差反応性を研究した。ｇｐ１２０の配列は多くのＨＩＶ−１単離体に関し て決定されているので交差反応性データはエピトープマツピングに有用であろう 。これらの研究のために、ｇｐ１２０の真性のｇｐ１２０の終止配列の近くにス トップコドンを挿入するためにＨＩＶ−１の５個の分岐単離体のφ■遺伝子を突 然変異させた。哺乳類細胞での発現を促進するために、既述のごとく、シグナル 配列を欠失させ、１型単純性泡疹ウイルスの糖タンパク質りのシグナル配列と置 き換えた。これら単離体とｓｇｐ１６０に対して惹起されたモノクローナル抗体 の反応性を、ニトロセルロースと結合させた部分精製エンベロープ糖タンパク質 を用いるドツトプロット分析、および放射性免疫沈降法の２方法で測定した。

真性ＨＩＶ−１誘導ウィルスタンパクとモノクーナル抗体との反応性の測定のた めに、デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）から購入したイムノプロットストリップを用い た。これらの研究で、腹水Ｌｏａｆをブロッキングバッファーで３履ｌに希釈し 、ニトロセルロースストリップと一緒に室温で１時間インキュベートした。次い で、ストリップをブロッキングバッファー３！１１で３回洗浄した後、アルカリ ホスファターゼ結合アフィニティー精製ヤギ抗マウスイムノグロブリンの１００ ０倍希釈と一緒に１時間インキュベートした。次いで、ストリップを３回洗浄し 、カーレガ−（Ｋｉｒｌｅｇａａｒ）およびベリー（Ｐｅｒｒｙ）から購入可能 なホスファターゼ発色キットを用いて染色した。結果を図４に示す。

図４から明らかなように、モノクローナル１３Ｈ８および５Ｂ３は試験した単離 体のすべてと反応し得た。同一の分析を既述のｇｐ１２０に対する多（のモノク ローナル抗体について行った。これらの研究で他の抗体６Ｄ８が試験したすべて の単離体と反応することが分かった。

これらのモノクローナル抗体が細胞毒性物賃と結合し得るか否かを研究し、それ を免疫毒性コンジュゲートとして用いることの可能性を研究するために、ｇｐ１ ２０に対する抗体を高レベルで含有するヒト血清の存在下、ｅｎｖ糖タンパク質 へのこれらの抗体の結合能力を測定した。ｇｐ１２０に対するモノクローナル抗 体がＨＩＶ−１に感染した個体の血清に存在する抗体によって阻害されるか否か を確認するために、競合結合分析を行った。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレー トをｇｐ１６０によって１μｇ／１１１で被覆し、ブロックし、洗浄した。正常 なヒト血清を１：１０または１　：　１００で加え、ＨＩＶ−１感染個体からの 血清の活性画分を１００μｇ／ｍｌで加えた。血清を１時間予備インキュベーシ ョンし、次いで、種々の濃度の精製モノクローナル抗体を１００μｇ／＋Ｉｌで 加えた。１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、抗体をＣＡＭ− ＨＲＰで検出した。

本発明者らはモノクローナル抗体が希釈されていないヒト血清の存在下でも結合 し得ることを発見した。この結果はかなり驚（べきことであり、いずれのモノク ローナル抗体もヒト血清に存在する抗体が認識するエピトープと異なるエピトー プに向けられたものであるか、いずれかの特定のエピトープに対するモノクロー ナル抗体の濃度および／または親和性が、ヒトポリクローナル血清における特定 に任意のエピトープに対する抗体の濃度および／または親和性よりもはるかに大 きいことを示唆している。このように、これらのモノクローナル抗体は受動的に 移動され高濃度のヒト血清の存在下でＨＩＶ−１糖タンパク質と結合すると予測 される。

実施例３　非開裂ｇｐ１２０の組換え細胞培養を通しての結合実質上、開裂した ｇｐ１２０フラグメントを含まない、非開裂ｅｎｖポリペプチド（本実施例では ｒｇｐ１２０）を与える組換え細胞培養法が開発された。現在行われている細胞 培養最適化の方法は文献に記載されている［Ｍａｔｈｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　１ｎｚｙ＋ａｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、、　１８５．　ｃｈａｐｔｅｒ　４ ３．５６７−５７７　（１９９０）］。

チャイニーズハムスターの卵巣細胞をＨＩＶエンベロープ遺伝子発現プラスミド （ＣＨＯＤＨＦＲ＋）　（Ｌａｓｋｙ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２３：　２０９． 　（１９８６））を本実施例で用いるｒｇｐ１２０の製造に用いた。最初のスト ックスピナー（ｉｎｉｔｉａｌ　５ｔｏｃｋ　５ｐｉｎｎｅｒ）培養を約３．１ １ｘｌＯ’細胞／ｍｌで開始し、低グルコース（３，２ｇ／ｌ）、７．５％ディ アフィルターしたラン胎仔血清、および１０ｍＭメソトレキセート３．７１ｍ１ を含有する選択培地１．５Ｌ内で培養した。培養物を３７℃（３〇−４１℃）イ ンキュベーターのマグネティックスターラー（４０−５０ｒｐｍ）上に保持した 。４日後、培養物の密度が約１５．０ｘｌＯ’細胞／ｍｌに達した（約９８％の 生存率）。このストックスピナー培養物の約８００１ｍｌを上記同様、選択培地 約７２ＱＱ＋ａｌを含有するローラーボトルに入れた。ローラーボトルを約０、 ３　ｒ　ｐｍ、３７℃（３６−４０℃）のローラーラックの上に４日装置いた。

ＣＨＯ等［例えばハナバイオロジカル（Ｉｌｌａｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ）　ＣＨＯ培地コの組換えタンパク質の発現のための細胞増殖にしばしば用いら れるように設計された市販の培地である、ダルベツコの改良イーグル培地（Ｄｕ ｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）また はハム（Ｈａｍ’　ｓ）のＦ１２／ＤＭＥＧＨＴ培地が適する。

４日後、選択培地をローラーボトルから流し出し、ボトルをすすぎ、高グルコー ス（４，３ｇ／ＩＬメソトレキセート（上記と同様）および１％ウシ胎仔血清を 含有する約３００ｍ１の選択培地を満たした。通常、この段階では血清をＯ−３ ％、より好ましくは１％含有する培地内で、低血清濃度で細胞培養を行うことが 好ましい。滅菌ピペットを用いてローラーボトルに１００％ＣＯ２を２−４ｐｓ １で約１−３秒間ガス充填した後、ローラーラック上（約領３ｒｐｍ）に３７℃ （３６−４０℃）で置いた。

培養物を約３日後に収穫した。収穫のためにローラーボトルから培地を流し出し 、オートクレーブ処理した５、０ミクロンのＭｉｌｌｉｐｏｒｅおよび０．４５ ミクロンの５ａｒｔｏｒｉｕｓフイルターでろ過し、アジ化すトリウム０．２ｇ を加え、収穫物を２−８℃で保存した。ローラーボトルに３００１１１１の非選 択培地を追加し、培地をさらに３日間、上記と同様にインキュベーションし上記 と同様に第２回の収穫を行った。

収穫した物質を限外濾過して濃縮した後、ラスキーら（１９８６、前掲）が記載 した方法でアフィニティークロマトグラフィーで精製した。さらに、ゲル透過ク ロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー等の精製法をさらに行った が、陽イオン交換クロマトグラフィー、および上記の標準的な手法による疎水性 相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を行うことが好ましい。

以上でモノクローナル抗体、特に１０Ｆ６．６Ｅ１０．１０Ｄ８および１１Ｇ５ 、を用いる精製方法を開示し、さらに公開された方法を用いてグリセロール−被 覆調整多孔性ガラスと結合したモノクローナル抗体をも実施した。

配列表 （１）　一般的情報 （ｉ）　特許出願人：ジエネンテク、インコーポレイテ、ノド（ｉｉ）　発明の 名称：ＨＩＶに対する予防接種のための方法および組成物（ｉｉｉ）　配列の数 ：４ （ｉｖ）　連絡先・ （Ａ）　名宛人：ジェネンテク、インコーポレイテッド（Ｂ）　通り・ポイント ・サン・ブルーノ・ブールバード４６０番（Ｃ）　市、サウス・サン・フランシ スコ（Ｄ）　州：カリフォルニア （Ｅ）　国：アメリカ合衆国 （Ｆ）　ＺＩＰ：９４０８０ （Ｖ）　コンピューター解読書式 （Ａ）　媒体型＋５．２５インチ、３６０Ｋｂフロ・ンピーディスク（Ｂ）　コ ンピューター：ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）　オペレーティング・シス＋１−：ＰＣ− ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ５（Ｄ）　ソフトウェア：　Ｐａｔｉｎ　（ジエネンテク） （ｖｉ）　本出願のデータ。

（Ａ）　出願番号： （Ｂ）　出願日： ＜Ｃ＞　分類： （ｖｉｉ）　優先権主張出願のデータ：（Ａ）　出願番号：Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、０ ７１５０４．　７８５（Ｂ）　出願日・１９９０年４月３日 （ｖｉｉｉ）　弁理士／代理人情報 （Ａ）　氏名ニアドラ−、キヤロライン・アール（Ｂ）　登録番号・３２．３２ ４ （Ｃ）　参＠／Ｗ理番号：６３３ （１ｘ）　電話連絡先情報： （４へ）１話番号・４１５／２２６−２６１４（Ｂ）　ファックス番号：４１３ ／９＋２−９８８１（Ｃン　テレックス：　９１０／３７１−７１６８（２）　 配列番号１の情報・ （２）　配列の特徴 （Ａ）　長さ・４７９アミノ酸 （Ｂ）　型、アミノ酸 （Ｃ）　トポフジー：ｙＬ鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号１： Ｃ１ｕ　Ｐｒｏ　工１ｅ　ｐｒｏ　ｒ１＠　ＨＬｓ　τｙｒ　Ｃｙｓ　ｋｌａ　 Ｐｒｏ　Ａｌａ　ＧＬｙ　ｐｈｅ　Ａ１１ｌ　Ｘ１鎗Ｃｙｓ　Ｊｕｎ　：ｕｅａ 　＠ｏｒ　Ｊｑｇ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｊｕｎ　ＪＬｓｎ〒ｈｒ　−Ｌｙ ｓ　ＧＬｎ工１・３０５　コ１０　３ユ５ Ｊｖｓｐ　Ｓａｇ　Ｌｙｓ　ＴＡｕ　ｌｒｇ　（：ｌｕ　Ｇｉｎ　ｐｈｅ　Ｇｌ ｙ＾−ｎ　ｋａｎＬＹ−τ駄工１−工１・Ｐｈ＠　Ｌｙｅ　Ｇｉｎ　！＠ｒ　ｊ ＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　＾ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　２１ｍ　９ｍエ　テｈｒ　１ １Ｌｍ　ｍａｒ３コＳ　３４０　３４５ Ｐｂｍ　ｋｓｎ　ｃｙｍ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｈ＠Ｐｈｓ　？ｙｒ　Ｃ ’ｙｍ　ｋｓｎ　ｍａｔτｈｒＧ工ｎ−ｕコＳｏ　３１８　３６０ ＬｙＩＩ　Ｇｉｎ　ｐｈｅ　工１＠　入ａｎ　Ｍ＠ｔ　Ｔｒｐ　ＧＬｎ　Ｇｌｕ 　Ｖａ！　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　入ユａ　ｇｅｔ　Ｔｙｒ３９５　４００　４０！１ ｃｌｙ　Ｌａｕ　Ｌ＠ｕ　Ｌ＠ｕ　Ｔｈｒ　入ｘ９　＾１ｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 ＾ａｎ　＾−ｎ　Ｍｎ　＾ｓｎ　Ｇｌｕ　５ｅｘａ２５　４３０　４３５ （２）　配列番号２の情報・ （１）　配列の特徴 （Ａ）　長さ・９アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー・ｉ！＃Ｊｌ状 （ｘｉ）　配列：配列番号２： （２）　配列番号３の情報。

（ｉ）　配列の特徴 （、へ）　長さ、２７アミノ酸 （Ｂ）　型。アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー　〇！鎖状 （ｘｉ）　配列、配列番号３： Ｌｙｓ　？ｙｒ　入１ａ　Ｌａｕ　入１龜　＾ｓｐ　入１ａ　ｓａｔ　Ｌａｕ　 ＬＹ＠　Ｍ鱈　ｋｌａ　入ｓｐ　Ｐｒｏ　入−ｎλ　Ｓ　１０　ユ５ （２）　配列番号４の情報 （ｌン　配列の特徴 （、八）　長さ：２８アミノ酸 （Ｂ）　型・アミノ酸 （Ｃ）　トポロン−゛直鎖状 （ｘｌ）　配列・配列番号４： ＾ａｌ’ｌ　Ａｓｎτｈｒ　Ａｒｇ　ＬＹ＠　！ｓｒ　Ｘ１ｍ　Ａ９　Ｌｙｅ　 Ｓｅｘ　２１ｍ　ｂｇ工Ｌし　Ｇｉｎ　Ａｒ９ユ　Ｓ　ユロ　ユ５ ＦＩＧ、　１ 細胞外ドゝイン　細胞質ドメイン ｇｐｌ　６０（ｗｔ） ｇｐ１６０ 、ｏｓｇｐ１６０　ｒｇｐ１２０　ｒｇｐ１２０　ｓｇｐ１６０Ｄ ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、　５ 時　（週） ２６　鵬　１１ｊＧ！ａ　Ｉし１０−　〇ＦＩＧ、　８Ａ ＦＩＧ、　８Ｂ 要約書 内部開裂部位で加水分解的に切断されていない非開裂ＨＩＶｅｎｖポリペプチド 、ならびにその製造法および使用法を提供する。モノクローナル抗体をも提供す る。

一一−ａ−ｍ　ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０２２５０

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．非開裂ＨＩＶｅｎｖおよび医薬的に許容される賦形剤からなる滅菌組成物の 治療的有効投与量を個体に投与することからなるＡＩＤＳの予防または治療方法 。
2. ２．該非開裂ＨＩＶｅｎｖが全長ｇｐ１２０またはその断片からなる第１項の方 法。
3. ３．該非開裂ＨＩＶｅｎｖが全長ｇｐ１６０またはその断片からなる第１項の方 法。
4. ４．ＨＩＶに対する暴露または暴露の危険後に該組成物を個体に投与する第１項 の方法。
5. ５．一系列の接種の１つとして該組成物を投与する第１項の方法。
6. ６．該系列が第１項の組成物とは異なる少なくとも１つのＨＩＶ抗原による接種 を含む第５項の方法。
7. ７．ＨＩＶに対するワクチンの製造における非開裂ＨＩＶｅｎｖの使用。
8. ８．医薬的に許容される担体中の非開裂ＨＩＶｅｎｖからなるＨＩＶワクチン。
9. ９．該非開裂ＨＩＶｅｎｖ内の開裂部位以外のアミノ酸残基が置換されているか 、欠失しているか、あるいは別のアミノ酸残基の隣接する挿入を有する第８項の ワクチン。
10. １０．１および３０Ｎ−末端アミノ酸残基の間からなる断片が欠失している第９ 項のワクチン。
11. １１．開裂ＨＩＶｅｎｖ断片を本質的に含有しない非開裂ＨＩＶｅｎｖ調製物。
12. １２．少なくとも５０％が開裂ＨＩＶｅｎｖ断片を含有しない第１１項の調製物 。
13. １３．非開裂ｇｐ１２０を含有する組成物。
14. １４．非開裂ｇｐ１６０を含有する組成物。
15. １５．次の操作： ａ．ＨＩＶｅｎｖの第１の調製物を、第２の（抗体結合非開裂ＨＩＶｅｎｖ）調 製物の形成を可能とするに足る時間、開裂部位をまたくＨＩＶｅｎｖエピトープ を指向する抗体と接触させる； ｂ．上記第２の調製物を抗体の結合していないあらゆるＨＩＶｅｎｖから分離す る； ｃ．該第２の調製物から非開裂ＨＩＶｅｎｖを回収する；からなる非開裂ＨＩＶ ｅｎｖの製造方法。
16. １６．開裂部位をまたぐＨＩＶｅｎｖエピトープを指向する抗体を担体マトリッ クス上に結合し、ＨＩＶｅｎｖおよび非開裂ＨＩＶｅｎｖを含有する溶液をその カラムに通し、非開裂ＨＩＶｅｎｖを上記マトリックス結合抗体に選択的に吸着 させ、吸着した抗体−非開裂ＨＩＶｅｎｖマトリックスを洗浄することによって 、非吸着物資を除去し、非開裂ＨＩＶｅｎｖを溶出させるアフィニティークロマ トグラフィーからなる非開裂ＨＩＶｅｎｖの単離方法。
17. １７．非開裟ＨＩＶｅｎｖをコード化するＤＮＡで形質転換された非開裂ＨＩＶ ｅｎｖの複製および発現に適した哺乳類細胞を低血清培地中で生育させ、非開裂 ＨＩＶｅｎｖを回収することからなる非開裂ＨＩＶｅｎｖの製造方法。
18. １８．該培地が約０〜３％血清を含有する第１７項の方法。
19. １９．６Ｅ１０、１３Ｈ８、１１Ｇ５、１０Ｆ６、１０Ｄ８および６Ｄ８からな る群から選択されるモノクローナル抗体の特徴を有する抗体。
20. ２０．モノクローナル抗体５Ｂ３、５Ｂ６、５Ｃ２、６Ｄ８、６Ｅ１０、７Ｆ１ １、７Ｇ１１、９Ｅ３、１０Ｃ１、１０Ｄ８、１０Ｆ６、１１Ｇ５、１３Ｈ８、 １４Ｆ１２、および１５Ｇ７からなる群から選択される、検出可能なマーカーま たは水不溶性マトリックスに共有結合したモノクローナル抗体。
21. ２１．モノクローナル抗体５Ｂ３、５Ｂ６、５Ｃ２、６Ｄ８、６Ｅ１０、７Ｆ１ １、７Ｇ１１、９Ｅ３、１０Ｃ１、１０Ｄ８、１０Ｆ６、１１Ｇ５、１３Ｈ８、 １４Ｆ１２、および１５Ｇ７からなる群から選択される、滅菌された医薬的に許 容される賦形剤中のモノクローナル抗体から構成される、患者への投与に適した 組成物。
22. ２２．該モノクローナル抗体が毒素に結合している第２１項の組成物。
23. ２３．ＨＩＶ感染を有するか、もしくはＨＩＶ感染を有する危険にある患者に第 ２１項の組成物の治療的に許容される投与量を投与することからなる方法。
24. ２４．該組成物を一組の少なくとも３回の連続的接種において投与し、第１回の 接種後、２〜８週間の期間内に第２回の接種を行い、該第２回の接種後、該第１ 回の接種後５ヵ月〜２年の期間内に第３回の接種を行う第１項の方法。
25. ２５．該組成物中の非開裂ＨＩＶｅｎｖの投与量が約１０μｇ〜１ｍｇである第 １項の方法。