Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

JPH05244938A - 細胞及びその培養法 - Google Patents

細胞及びその培養法

Info

Publication number
JPH05244938A
JPH05244938A JP4009089A JP908992A JPH05244938A JP H05244938 A JPH05244938 A JP H05244938A JP 4009089 A JP4009089 A JP 4009089A JP 908992 A JP908992 A JP 908992A JP H05244938 A JPH05244938 A JP H05244938A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
temperature
polymer
cell culture
poly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP4009089A
Other languages
English (en)
Inventor
Mitsuo Okano
光夫 岡野
Noriko Yamada
則子 山田
Yasuhisa Sakurai
靖久 桜井
Hideaki Sakai
秀昭 坂井
智子 ▲吉▼野
Tomoko Yoshino
Koichi Nakamura
浩一 中村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TOKYO JIYOSHI IKA UNIV
Kao Corp
Original Assignee
TOKYO JIYOSHI IKA UNIV
Kao Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TOKYO JIYOSHI IKA UNIV, Kao Corp filed Critical TOKYO JIYOSHI IKA UNIV
Priority to JP4009089A priority Critical patent/JPH05244938A/ja
Publication of JPH05244938A publication Critical patent/JPH05244938A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 温度を変化させるだけという簡便な操作で不
純物等を全く混入させることなく高収率で培養細胞を組
織状で回収することができ且つ回収された培養細胞は何
等の損傷を受けてない細胞培養法を、提供する。 【構成】 水に対する臨界溶解温度(Ｔ)が０〜８０℃の
ポリマーを基材表面に被覆した細胞培養支持体上にて、
細胞を(Ｔ−１０)〜(Ｔ＋１０)℃にて培養することを、
特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞及びその培養法に
関する。より詳しくは本発明は、周囲温度を変化させる
だけで培養細胞を、高収率で、細胞を傷つけることなく
且つ薬品等の第３成分の混入若しくは汚染無しに容易に
細胞培養支持体から組織状として剥離回収出来る細胞培
養法に関する。本発明は又、そのような細胞培養法で得
られる細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、種々の目的により、生体内の細胞
を生体外で培養しようとする試みが活発に行なわれてい
る。その中で特に、生体外でも生体内と同様に立体的に
細胞を培養し、皮膚や肝細胞などの組織状細胞を得よう
とする試みは、生体外で細胞本来の機能を維持させよう
とする点、また、各種ハイブリッド型人工臓器、バイオ
シミュレーター、安全性評価用細胞等の開発の点から、
最近注目されている研究である。この組織状細胞を得る
方法としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニ
ン等の細胞付着付物質をスポンジ状に成型し、細胞を三
次元に培養する方法、また、プロテオグリカン等の細胞
非付着性物質上で培養する方法、さらに対象とする細胞
を肝細胞とした場合、ポリ−Ｎ−Ｐ−ビニルベンジル−
Ｄ−ラクトンアミド(ＰＶＬＡ)上を培養する方法等が開
発されており、また、これらの方法で得られた組織状細
胞自身の生化学的機能も高いことが確認されている。
【０００３】しかしながら、いずれの方法による組織状
細胞においても、基材から剥離させ更に高次の検討に供
するためには、トリプシンのような蛋白質分解酵素や化
学薬品を用いなければならず、細胞が変性し細胞本来の
機能が損なわれるという問題や、剥離の際には種々の人
工基質等が混入するという問題等があった。
【０００４】一方、本発明者らは、トリプシンのような
たんぱく分解酵素やキレート剤のＥＤＴＡ等による処理
を施さずに環境温度を変化させるだけで、培養・増殖さ
せた細胞を、支持体表面から剥離・回収することが可能
な細胞培養支持体材料を以前に提案している(特開平２
−２１１８６５号公報)。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は人工基材上
に、組織状細胞を形成させ、且つ、細胞の機能を損なう
ことなく剥離・回収させることを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、以上のよ
うな点に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、先に提案した細
胞培養支持体において、所定量のポリマーもしくはコポ
リマーが被覆された細胞培養支持体を利用し、且つ、細
胞を培養する温度を所定範囲内とすることにより、細胞
を組織状態で培養することが可能となり、しかも温度を
変化させるだけで、その組織状細胞を剥離・回収するこ
とが可能であり、さらにその剥離した細胞はその機能を
保持していることを見い出し、本発明に至った。
【０００７】即ち本発明は、水に対する臨界溶解温度
(以下、単に「Ｔ」と云うことがある。)が０〜８０℃の
ポリマーを５〜８０μg／cm2の被覆量で基材表面に被覆
した細胞培養支持体上にて、細胞を(Ｔ−１０)〜(Ｔ＋
１０)℃にて培養することを特徴とする組織状細胞の培
養法を提供する。
【０００８】本発明に使用する細胞培養支持体は、基材
表面上が適当なポリマーで被覆される。そのような適当
なポリマーは、Ｔが０〜８０℃、好ましくは０〜５０°
を有する(尚 「臨界溶解温度」とは、２層分離している２
種の物質が或る温度になると互いに完全溶解し均一層と
なるその温度のことを言う。特に、温度を上げて完全溶
解に達する場合の温度を「上限臨界溶解温度」、温度を下
げて完全溶解する場合の温度を「下限臨界溶解温度」と言
うことがある)。Ｔが８０℃を越えると細胞が死滅する
可能性があるので好ましくない。またＴが０℃より低い
と、一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細
胞が死滅してしまうため好ましくない。そのような好適
なポリマーとしては、例えば特開平２−２１１８６５号
公報に記載のポリマーが挙げられる(これを参照により
ここに導入し、その開示とする)。具体的には適当なポ
リマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソ,プロピルアク
リルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアク
リルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタ
クリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチル
アクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒド
ロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ
−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３
５℃）、及びポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ
＝３２℃)、等が挙げられる。その他のポリマーとして
は、例えばポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ
−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプ
ロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタ
クリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポ
リ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリメチルビニルエ
ーテル等が挙げられる。そのようなポリマーは、例えば
モノマーの単独重合体がＴ＝０〜８０℃を有するような
モノマーの単独若しくは共重合により調製される。モノ
マーとしては例えば、(メタ)アクリルアミド化合物、Ｎ
−(若しくはＮ,Ｎ−ジ)アルキル置換(メタ)アクリルア
ミド誘導体、環状基を有する(メタ)アクリルアミド誘導
体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの
１種以上を使用してよい。又、増殖細胞の種類によって
Ｔを調節する必要がある場合や、被覆物質と細胞培養支
持体との相互作用を高める必要が生じた場合や、細胞支
持体の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場
合などには、上記以外の他のモノマー類を更に加えて共
重合してよい。更に本発明に使用する上記ポリマーとそ
の他のポリマーとのグラフトまたはブロック共重合体、
あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を
用いてもよい。また、ポリマー本来の性質が損なわれな
い範囲で架橋することも可能である。
【０００９】本発明に使用する細胞培養支持体は、基材
上に上記ポリマーを被覆して得られる。ポリマーの被覆
量は、５〜８０μg／cm2、好ましくは６〜４０μg／cm2
である。ポリマー被覆量が８０μg／cm2を超過すると細
胞は細胞培養支持体表面上に付着せず、逆に被覆量が５
μg／cm2未満だと細胞は単層の状態で培養され組織状と
ならず、又培養細胞を支持体から剥離回収するのも困難
となる。このようなポリマー被覆量は、例えばフーリエ
変換赤外分光計全反射法(FT-IR-ATR法)、被覆部若しく
は非被覆部の染色や蛍光物質の染色による分析、更に接
触角測定等による表面分析を単独或は併用して求めるこ
とが出来る。
【００１０】被覆を施される上記基材の材質は、通常細
胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレ
ン、ポリメチルメタクリレート等の高分子化合物、ある
いはセラミックス、金属等が挙げられる。尚、基材表面
はオゾン処理、プラズマ処理、スパッタリング等の処理
技術を用いて親水化を施されたものでも良い。形状は、
ペトリディッシュに限定されることはなく、プレート、
ファイバー、(多孔質)粒子、また、一般に細胞培養等に
用いられる容器の形状(フラスコ等)を付与されていても
構わない。
【００１１】基材へのポリマーの被覆方法は、後述する
ような化学的方法、物理的方法、を単独でまたは併
用して行うことができる。被覆時に前記モノマーを使用
する場合、そのモノマーは気体、液体、固体いずれの状
態でも良い。また、ポリマーを使用する場合にはおいて
も、そのポリマーは、液体、固体状態のいずれの状態で
も良い。これらのものを化学的な反応によって結合さ
せる場合、電子線照射(ＥＢ)、γ線照射、紫外線照射、
プラズマ処理、コロナ処理、さらに基材と被覆材料が適
当な反応性官能基を有する場合はラジカル及びイオン反
応等の一般に用いられる有機反応、を用いることができ
る。物理的な相互作用による方法としては、被覆材料
単独または基材との相溶性の良いマトリックスを媒体と
し、塗布、混練等の物理的吸着を用いる方法等がある
が、これらに限られるわけではない。
【００１２】本発明の細胞培養法は、上記のようにして
得られた細胞培養支持体上にて行われる。本発明の細胞
培養法に適用される細胞としては特に限定されないが、
例えばウシ大動脈血管内皮細胞、ウシ肝実質細胞、ラッ
ト肝実質細胞、ラット線維芽細胞、ヒト血管内皮細胞、
ヒトケラチノサイト等が挙げられる。このような細胞
は、当業者に周知の方法で入手し得る。培養温度は、
(Ｔ−１０)℃〜(Ｔ＋１０)℃であり、好ましくは(Ｔ−
５)℃〜(Ｔ＋５)℃、より好ましくは(Ｔ−４℃)〜(Ｔ＋
４℃)である。更に好ましくは培養温度は、Ｔが上限臨
界溶解温度の場合はその温度以下であり、又Ｔが下限臨
界溶解温度の場合はその温度以上である。基材上に被覆
されるポリマーが下限臨界溶解温度を有し培養温度が
(Ｔ＋１０)℃より高い場合、又はポリマーが上限臨界溶
解温度を有し培養温度が(Ｔ−１０)℃より低い場合、培
養細胞は単層状となり組織状として回収することが出来
ない。又、基材上に被覆されるポリマーが下限臨界溶解
温度を有し培養温度が(Ｔ−１０)℃より低い場合、又は
ポリマーが上限臨界溶解温度を有し培養温度が(Ｔ＋１
０)℃より高い場合は、細胞は支持体上に付着せず培養
が困難となる。具体的には、被覆ポリマーが例えば前記
ポリ−Ｎ−イソ,プロピルアクリルアミドである場合の
培養温度は２４〜３５℃、ポリマーがポリ−Ｎ−ｎ−プ
ロピルアクリルアミドである場合の培養温度は１７〜２
４℃、ポリマーがポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルア
ミドである場合の培養温度は２４〜３０℃、ポリマーが
ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミドの場合の培養
温度は３１〜３８℃、ポリマーがポリ−Ｎ−テトラヒド
ロフルフリルアクリルアミドの場合の培養温度は２４〜
３１℃、ポリマーがポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリル
メタクリルアミドの場合の培養温度は３１〜３８℃、ポ
リマーがポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミドの場合
の培養温度は２４〜３５℃が、それぞれ好ましい。その
他の培養条件は特に限定されず、当分野に於いて通常行
われる条件下に培養を行ってよい。例えば培地として
は、ウシ胎児血清(FCS)等の血清が添加されているもの
でもよいし、或は無血清培地でもよい。
【００１３】上記培養後、培養細胞を細胞培養支持体か
ら剥離させ回収するには、周囲温度を前記ポリマーの上
限臨界溶解温度に対し、＋１０℃以上もしくは下限臨界
溶解温度に対し、−１０℃以下に変化させるだけで良
く、細胞を培養していた培養液中においてもその他の等
張液中においても可能であり、目的に合わせて選択する
ことができる。その際、培養細胞を効率的に且つ容易に
剥離させる目的で、細胞培養支持体を軽くたたいたり揺
らしたり、更にはピペット等を使用して培地を撹拌する
などしてもよい。
【００１４】
【作用】以下本発明の作用を、被覆ポリマー調製用モノ
マーとしてＮ−イソプロピルアクリルアミド、及び支持
体基材として細胞培養用ペトリディッシュ材料として一
般に用いられるポリスチレンを用いた場合を例にとっ
て、より具体的に説明する。
【００１５】細胞培養支持体は、例えば上記ポリスチレ
ン基材上でＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーを
イソプロピルアルコール溶液として被覆し、その後電子
線照射(ＥＢ)により重合させて、得られる。その結果、
ポリスチレン基材上には生成ポリマー、即ちポリ−Ｎ−
イソプロピルアクリルアミドが被覆される。尚このよう
なポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは水溶液中で
約３２℃に下限臨界溶解温度を有する。そして下限臨界
溶解温度である３２℃以上ではこのポリマーはその占有
体積が小さくなりポリマー中の水分子を排除して、支持
体表面は疎水性を示す。しかし、逆に３２℃以下ではポ
リマーの占有体積は大きくなりポリマー中の水分子の占
める体積分率が上昇し、支持体表面は親水性を示すよう
になる。従って温度を制御するだけで、細胞培養支持体
表面の親水・疎水性は調整され、細胞の支持体への接着
性が変化する。そのため、温度を変化させるだけで培養
・増殖後の細胞を破壊することなく細胞培養支持体から
容易に剥離、回収することが可能となるものと考えられ
る。
【００１６】上記のような性質を持った細胞培養支持体
上で正常肝細胞を播種しポリ−Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミドの下限臨界温度３２℃に対し、上記範囲の培養
温度域で培養すると、正常な肝実質細胞は一般的な接着
性細胞に見られるような支持体全体に単層に伸展するの
ではなく、スフェロイド(組織状態)を形成する。又、血
管内皮細胞を同様な方法で培養すると、管腔組織(組織
状態)を形成する。このようにして得られた組織状細胞
を支持体から剥離するには、培養液の温度を上記ポリマ
ーの下限臨界温度に対し、上記範囲の培養温度域以下に
するだけで高収率に、組織状態を維持したまま、細胞本
来の機能を損なわずに、第３成分の混入なく、回収出来
る。
【００１７】
【発明の効果】本発明により、周囲温度を変化させるだ
けで培養細胞を、組織状で、高収率で、傷つけることな
く且つ薬品等の第３成分の混入若しくは汚染無しに容易
に細胞培養支持体から剥離回収出来る。
【００１８】
【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】実施例１、２、３、４ 細胞培養支持体基材として、ベクトン・ディキンソン・
ラブウェア(ＢectonＤickinson Ｌabware)社製ファル
コン(ＦＡＬＣＯＮ)３００２ペトリディッシュを用い、
培養する細胞としてはラット肝実質細胞を採用した。Ｎ
−イソプロピルアクリルアミドを表−１に示す各濃度の
イソプロピルアルコール溶液として、ペトリディッシュ
上に、０.１ml添加後、電子線を３０Ｍrad照射すること
により、ペトリディッシュ表面上に、ポリ−Ｎ−イソプ
ロピルアクリルアミドを被覆した。電子線照射後、イオ
ン交換水により、ペトリディッシュを洗浄し、残存モノ
マー及び遊離ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを
取り除き、クリーンベンチ内で乾燥し、さらに、エチレ
ンオキサイド(ＥＯ)ガス滅菌さらに十分に脱気を行なう
ことにより、細胞培養支持体材料を得た。
【００２０】得られた細胞培養支持体表面上の被覆量
は、フーリエ変換赤外分光計全反射法(ＦＴ−ＩＲ−Ａ
ＴＲ法)を用い、基材に由来する１０２８cm-1k吸収に対
する被覆物であるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ドに由来するアミドＩＩ(１５４０cm-1)の比を算出する
方法により求めた。その際、検量線は既知量のＮ−イソ
プロピルアクリルアミドホモポリマーを既知面積の基材
表面上に塗布した試料を利用することで作成した。結果
を表−６に示す。
【００２１】ラット肝実質細胞は、一般的に知られるベ
リー(Ｂerry)とフレンド(Ｆriend)らのコラゲナーゼ灌
流法により入手し、培養は、得られた細胞培養支持体材
料上にて、５％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、１０-8Ｍデキサ
メサゾン、１０-7Ｍインスリン、１０mＭニコチンアミ
ドさらに、１０ng／ml 表皮成長因子(ＥＧＦ)を含むＷ
illiams Ｅ培地を培地として、５％二酸化炭素中、３
０℃で行なった。実施例２の培養１日目と２日目の培養
細胞のようすをそれぞれ光学顕微鏡写真として図１(a)
及び(b)に示す。次に、その増殖細胞の入ったペトリデ
ィッシュを５℃冷却、放置することにより、増殖細胞を
剥離させた。増殖細胞剥離回収率は下式に従って求め
た。
【００２２】 増殖細胞剥離回収率(％)＝１００×(剥離回収した細胞
総数)／(増殖させた細胞総数)
【００２３】その際、剥離回収した細胞総数および増殖
させた細胞総数を計測するためには、細胞を個々の状態
にしなければならない。従って、剥離回収した細胞総数
は、５℃に冷却、放置した後、回収した細胞塊に対し、
トリプシン−ＥＤＴＡ処理を行ない、細胞を個々の状態
にして行なった。また、増殖させた細胞総数は、上記方
法で剥離回収した細胞総数に、５℃に冷却、放置しても
剥離しなかった細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理で、細
胞を個々の状態に剥離させた細胞総数を加え合わせるこ
とにより求めた。結果を表−６に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】実施例５、６、７、８ 基材として、ベクトン・ディキンソン・ラブウェア社製
ファルコン３００２ペトリディッシュを用い、Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミドのイソプロピルアルコール溶液
のペトリディッシュ上への塗布量を各々表−２に示す量
とする点以外は、実施例２と同様にして、細胞培養支持
体材料を得、被覆量を求め、さらに、細胞を培養し、こ
れを剥離、回収し、増殖細胞剥離回収率を求めた。結果
を表−６に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】実施例９、１０、１１ ファルコン３００２ペトリディッシュに対し、実施例３
と同様にして、細胞培養支持体材料を得た。被覆量を表
−６に示す。この細胞培養支持体材料で、肝細胞を、表
−３に示す温度で培養する点以外は、実施例３と同様に
して実施し、これを剥離、回収し、増殖細胞剥離回収率
を求めた。結果を表−６に示す。
【００２９】
【表３】
【００３０】実施例１２〜２３ 基材として、ベクトン・ディキンソン・ラブウェア社製
ファルコン３００２ペトリディッシュを用い、Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミドの代わりに、各々表−４に示す
モノマーを利用して細胞培養支持体材料を得、このもの
を利用してラット肝実質細胞を各々表−４に示す温度で
培養する点以外は、実施例２と同様に実施した。各々の
被覆量と増殖細胞剥離回収率を表−６に示す。
【００３１】
【表４】
【００３２】比較例１ 細胞培養支持体として、ベクトン・ディキンソン・ラブ
ウェア社製ファルコン３００２ペトリディッシュを用
い、表面処理を全く行なわずに実施例１、２、３、４と
同様な実験を行なった。ラット肝実質細胞の培養も実施
例１、２、３、４と同様に、３０℃で培養する方法を採
用した。培養１日後のようすを図２に示す。増殖細胞の
剥離回収率を表−６に示す。
【００３３】比較例２、３ 細胞培養用支持体基材として、ベクトン・ディキンソン
・ラブウェア社製ファルコン３００２ペトリディッシュ
を用い、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを表−５に示
す濃度でイソプロピルアルコールに溶解して、ペトリデ
ィッシュ上に０．１ml添加後、電子線を表−５に示す線
量で照射することにより、ペトリディッシュ表面にポリ
−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを被覆した以外は実
施例１、２、３、４、５と同様の実験を行った。ラット
肝実質培養も実施例１、２、３、４、５と同様に実施し
た。各々の被覆量と増殖細胞剥離回収率を表−６に示
す。
【００３４】
【表５】
【００３５】比較例４ ファルコン３００２ペトリディッシュに対し、実施例３
と同様にして、細胞培養支持体材料を得た。被覆量を表
−６に示す。この細胞培養支持体材料で、肝細胞を２０
℃で培養する点以外は、実施例３と同様にして実施し、
これを剥離、回収し、増殖細胞剥離回収率を求めた。結
果を表−６に示す。
【００３６】
【表６】
【００３７】以上の実施例、及び比較例の結果により、
実施例１〜１１では、基材表面に塗布するＮ−イソプロ
ピルアクリルアミドの溶液の濃度、及び塗布量を変える
ことにより、本発明で示すところの被覆量の細胞培養支
持体材料が得られ、このものを使用し、本発明で示すと
ころの温度域内でラット肝実質細胞を培養することによ
り、肝細胞は写真−１に示されるようにスフェロイドを
形成した。さらに培地を下限臨界溶解温度より十分に低
い５℃とすることにより、高収率で、スフェロイドを維
持したまま剥離、回収することが可能であった。このこ
とは実施例１２〜２３に示されるように、使用するモノ
マー種を変化させて細胞培養支持体材料を得、それぞれ
について、本発明で示すところの温度域内で肝細胞を培
養する場合でも同様であった。
【００３８】一方、比較例１では、表面処理を全く行わ
なかった材料を用い、実施例と同様に３０℃で培養を実
施しても、表−２に示されるように、細胞は単層状態で
あり、スフェロイドを形成せず、また、温度を下げても
剥離現象は観察されなかった。
【００３９】また、比較例２、３において、細胞培養温
度を実施例１〜８と同様に３０℃とし、基材表面の被覆
量が本発明で示すところの範囲外である材料を使用する
と、被覆量が少ない場合では細胞剥離性は認められたも
のの、培養中の細胞は単層状態であり(比較例２)、ま
た、被覆量が多い場合では、細胞は付着しない(比較例
３)ことから、いずれも本発明の効果を十分に満足しな
いことが分かる。
【００４０】さらに、比較例４において実施例３で得ら
れた細胞培養支持体材料を使用し、本発明で示すところ
の範囲外の温度で肝細胞を培養した場合、下限臨界溶解
温度より十分に低い温度で培養した場合では、細胞は、
付着せず本発明の効果を十分に満足していないことが分
かる。
【００４１】実施例２４、２５ ファルコン３００２ペトリディッシュに対し、実施例
２、３と同様にして細胞培養支持体材料を得た(それぞ
れ実施例２４、２５)。基材表面上の被覆量を表−９に
示す。この細胞培養支持体材料を用いて、ウシ大動脈血
管内皮細胞を培養した。ウシ大動脈血管内皮細胞の培養
は、ウシ胎児血清(ＦＣＳ)を１０％含むダルベッコー改
変イーグル培地(ＤＭＥＭ)を培地として、５％二酸化炭
素中で、３０℃で行なう方法を採用した。常法に従い培
地交換を行ない２４日間培養した。このときの実施例２
４のようすを、光学顕微鏡写真として図３に示す。次に
この増殖細胞の入ったペトリディッシュを５℃に冷却、
放置することにより増殖細胞を剥離させ、実施例１、
２、３、４と同様な方法にて、増殖細胞剥離回収率を求
めた。結果を表−９に示す。
【００４２】実施例２６、２７ ファルコン３００２ペトリディッシュに対し、実施例２
４と同様な方法で細胞培養支持体材料を得、このものを
利用し、表−７に示す温度で培養する点以外は、実施例
２４と同様にして実施し、これを剥離、回収し、増殖細
胞剥離回収率を求めた。結果を表−９に示す。
【００４３】
【表７】
【００４４】比較例５ 細胞培養支持体として、ベクトン・ディキンソン・ラブ
ウェア社製ファルコン３００２ペトリディッシュを用
い、表面処理を全く行なわずに実施例２４、２５と同様
な実験を行なった。ウシ大動脈血管内皮細胞の培養も、
実施例２４、２５と同様に３０℃で培養する方法を採用
した。、培養１日後のようすを光学顕微鏡写真として図
４に示す。増殖細胞の剥離回収率を表−９に示す。
【００４５】比較例６、７ ファルコン３００２ペトリディッシュに対し、実施例２
４と同様にして、細胞培養支持体材料を得た。被覆量を
表−９に示す。この細胞培養支持体材料で、肝細胞を表
−８に示す温度で培養する点以外は、実施例２４と同様
にして実施し、これを剥離、回収し、増殖細胞剥離回収
率を求めた。結果を表−９に示す。
【００４６】
【表８】
【００４７】
【表９】 以上の実施例、及び比較例に示されるように、使用する
細胞をラット肝実質細胞からウシ大動脈血管内皮細胞へ
変更しても、基材表面のポリマー被覆量、及び、細胞培
養温度を本発明で示すところの範囲内であれば、培養し
た細胞は例えば図３に示されるように組織状に増殖し、
管腔形成が認められた(実施例２４〜２７)。このものに
対し、培地を下限臨界溶解温度より十分に低い５℃とす
ることにより、高収率で、管腔形成を維持したまま剥
離、回収することが可能であった。
【００４８】一方、比較例５では表面処理を全く行わな
かった材料を用い、実施例２４、２５と同様に３０℃で
培養を実施しても表−９に示されるように細胞は単層状
態であり、管腔形成せず、また、温度を下げても剥離現
象は観察されなかった。
【００４９】さらに、比較例６、７において実施例２４
で得られた細胞培養支持体材料を使用し本発明で示すと
ころの範囲外の温度で血管内皮細胞を培養した場合、下
限臨界溶解温度より十分に低い温度で培養した場合で
は、細胞は付着せず(比較例６)高い温度で培養した場合
では、付着はするものの単層状態であり(比較例７)、い
ずれも本発明の効果を十分に満足していないことが分か
る。
【００５０】実施例２８ 実施例３で得られた剥離細胞の損傷度合を確認するた
め、これを遠心分離(６００Ｇ５分)により回収し、全量
をベクトン・ディキンソン・ラブウェア社製ファルコン
３００２ペトリディッシュで再び培養させた。細胞の培
養は、実施例１、２、３、４と同様の方法を採用した。
細胞の損傷度合は培養１日後、常法であるエンザイム
イムノアッセイ(ＥＩＡ)法を用いてアルブミン分泌能を
求めることより判断した。結果を表−１０に示す。
【００５１】実施例２９ 実施例７で得られた剥離細胞に対し、実施例２８と同様
な操作でアルブミン分泌能を求めた。結果を表−１０に
示す。
【００５２】比較例８ 比較例１で培養した肝細胞を０．０５％トリプシン溶液
−０．０２％ＥＤＴＡ溶液を用いて剥離させ、その後の
操作は、実施例２８と同様に行なうことにより、剥離細
胞のアルブミン分泌能を求めた。結果を表−１０に示
す。
【００５３】比較例９ 実施例２８、２９及び比較例８の剥離操作前の肝細胞の
アルブミン分泌能を調べるために、比較例１で培養した
肝細胞を剥離させずに、上記ＥＩＡ法にてアルブミン分
泌能を求めた。結果を表−１０に示す。
【００５４】
【表１０】
【００５５】実施例２８、２９及び比較例８,９の結果
より、今回使用した肝細胞は、本来、比較例９に示され
る値のアルブミン分泌能を持っており、この機能は実施
例２８、２９での細胞では、ほぼ何等のアルブミン分泌
能を示した。一方、比較例８での細胞では、約１／５の
分泌能しか示さなかった。このことは、本発明の剥離細
胞は、従来のそれよりも細胞自身の損傷度が小さいこと
を意味する。
【００５６】
【発明の効果】本発明は、温度を変化させるだけという
簡便な操作で、不純物等を全く混入させることなく高収
率で組織状態の培養細胞を回収することができる。しか
も、従来の方法と比較すると回収された培養細胞は何等
の損傷を受けることがなく、従って細胞機能を十分に保
持しながら、培養・回収の繰り返し操作を行なうことが
できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】光学顕微鏡写真による実施例６のそれぞれ培養
１日と２日の培養細胞の形態を示す。
【図２】光学顕微鏡写真による実施例６のそれぞれ培養
１日と２日の培養細胞の形態を示す。
【図３】光学顕微鏡写真による比較例１の培養細胞の形
態を示す。
【図４】光学顕微鏡写真による実施例２４の培養細胞の
形態を示す。
【図５】光学顕微鏡写真による比較例５の培養細胞の形
態を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成４年２月１９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】本発明に使用する細胞培養支持体は、基材
表面上が適当なポリマーで被覆される。そのような適当
なポリマーは、Ｔが０〜８０℃、好ましくは０〜５０°
を有する(尚 「臨界溶解温度」とは、２層分離している２
種の物質が或る温度になると互いに完全溶解し均一層と
なるその温度のことを言う。特に、温度を上げて完全溶
解に達する場合の温度を「上限臨界溶解温度」、温度を下
げて完全溶解する場合の温度を「下限臨界溶解温度」と言
うことがある)。Ｔが８０℃を越えると細胞が死滅する
可能性があるので好ましくない。またＴが０℃より低い
と、一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細
胞が死滅してしまうため好ましくない。そのような好適
なポリマーとしては、例えば特開平２−２１１８６５号
公報に記載のポリマーが挙げられる(これを参照により
ここに導入し、その開示とする)。具体的には適当なポ
リマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリ
ルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタク
リルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルア
クリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロ
フルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−
テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド(Ｔ＝約３５
℃)、及びポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝
３２℃)、等が挙げられる。その他のポリマーとして
は、例えばポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ
−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプ
ロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタ
クリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポ
リ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリメチルビニルエ
ーテル等が挙げられる。そのようなポリマーは、例えば
モノマーの単独重合体がＴ＝０〜８０℃を有するような
モノマーの単独若しくは共重合により調製される。モノ
マーとしては例えば、(メタ)アクリルアミド化合物、Ｎ
−(若しくはＮ,Ｎ−ジ)アルキル置換(メタ)アクリルア
ミド誘導体、環状基を有する(メタ)アクリルアミド誘導
体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの
１種以上を使用してよい。又、増殖細胞の種類によって
Ｔを調節する必要がある場合や、被覆物質と細胞培養支
持体との相互作用を高める必要が生じた場合や、細胞支
持体の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場
合などには、上記以外の他のモノマー類を更に加えて共
重合してよい。更に本発明に使用する上記ポリマーとそ
の他のポリマーとのグラフトまたはブロック共重合体、
あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を
用いてもよい。また、ポリマー本来の性質が損なわれな
い範囲で架橋することも可能である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】本発明の細胞培養法は、上記のようにして
得られた細胞培養支持体上にて行われる。本発明の細胞
培養法に適用される細胞としては特に限定されないが、
例えばウシ大動脈血管内皮細胞、ウシ肝実質細胞、ラッ
ト肝実質細胞、ラット線維芽細胞、ヒト血管内皮細胞、
ヒトケラチノサイト等が挙げられる。このような細胞
は、当業者に周知の方法で入手し得る。培養温度は、
(Ｔ−１０)℃〜(Ｔ＋１０)℃であり、好ましくは(Ｔ−
５)℃〜(Ｔ＋５)℃、より好ましくは(Ｔ−４℃)〜(Ｔ＋
４℃)である。更に好ましくは培養温度は、Ｔが上限臨
界溶解温度の場合はその温度以下であり、又Ｔが下限臨
界溶解温度の場合はその温度以上である。基材上に被覆
されるポリマーが下限臨界溶解温度を有し培養温度が
(Ｔ＋１０)℃より高い場合、又はポリマーが上限臨界溶
解温度を有し培養温度が(Ｔ−１０)℃より低い場合、培
養細胞は単層状となり組織状として回収することが出来
ない。又、基材上に被覆されるポリマーが下限臨界溶解
温度を有し培養温度が(Ｔ−１０)℃より低い場合、又は
ポリマーが上限臨界溶解温度を有し培養温度が(Ｔ＋１
０)℃より高い場合は、細胞は支持体上に付着せず培養
が困難となる。具体的には、被覆ポリマーが例えば前記
ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである場合の培
養温度は２４〜３５℃、ポリマーがポリ−Ｎ−ｎ−プロ
ピルアクリルアミドである場合の培養温度は１７〜２４
℃、ポリマーがポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミ
ドである場合の培養温度は２４〜３０℃、ポリマーがポ
リ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミドの場合の培養温
度は３１〜３８℃、ポリマーがポリ−Ｎ−テトラヒドロ
フルフリルアクリルアミドの場合の培養温度は２４〜３
１℃、ポリマーがポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメ
タクリルアミドの場合の培養温度は３１〜３８℃、ポリ
マーがポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミドの場合の
培養温度は２４〜３５℃が、それぞれ好ましい。その他
の培養条件は特に限定されず、当分野に於いて通常行わ
れる条件下に培養を行ってよい。例えば培地としては、
ウシ胎児血清(FCS)等の血清が添加されているものでも
よいし、或は無血清培地でもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５０】実施例２８ 実施例３で得られた剥離細胞の損傷度合を確認するた
め、これを遠心分離(６００Ｇ×５分)により回収し、全
量をベクトン・ディキンソン・ラブウェア社製ファルコ
ン３００２ペトリディッシュで再び培養させた。細胞の
培養は、実施例１、２、３、４と同様の方法を採用し
た。細胞の損傷度合は培養１日後、常法であるエンザイ
ム イムノアッセイ(ＥＩＡ)法を用いてアルブミン分泌
能を求めることより判断した。結果を表−１０に示す。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１２月３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】光学顕微鏡写真による実施例６のそれぞれ培養
１日と２日の培養細胞の生物の形態を示す。
【図２】光学顕微鏡写真による実施例６のそれぞれ培養
１日と２日の培養細胞の生物の形態を示す。
【図３】光学顕微鏡写真による比較例１の培養細胞の生
物の形態を示す。
【図４】光学顕微鏡写真による実施例２４の培養細胞の
生物の形態を示す。
【図５】光学顕微鏡写真による比較例５の培養細胞の生
物の形態を示す。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年４月２１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 細胞及びその培養法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞及びその培養法に
関する。より詳しくは本発明は、周囲温度を変化させる
だけで培養細胞を、高収率で、細胞を傷つけることなく
且つ薬品等の第３成分の混入若しくは汚染無しに容易に
細胞培養支持体から組織状として剥離回収出来る細胞培
養法に関する。本発明は又、そのような細胞培養法で得
られる細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、種々の目的により、生体内の細胞
を生体外で培養しようとする試みが活発に行なわれてい
る。その中で特に、生体外でも生体内と同様に立体的に
細胞を培養し、皮膚や肝細胞などの組織状細胞を得よう
とする試みは、生体外で細胞本来の機能を維持させよう
とする点、また、各種ハイブリッド型人工臓器、バイオ
シミュレーター、安全性評価用細胞等の開発の点から、
最近注目されている研究である。この組織状細胞を得る
方法としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニ
ン等の細胞付着付物質をスポンジ状に成型し、細胞を三
次元に培養する方法、また、プロテオグリカン等の細胞
非付着性物質上で培養する方法、さらに対象とする細胞
を肝細胞とした場合、ポリ−Ｎ−Ｐ−ビニルベンジル−
Ｄ−ラクトンアミド(ＰＶＬＡ)上を培養する方法等が開
発されており、また、これらの方法で得られた組織状細
胞自身の生化学的機能も高いことが確認されている。
【０００３】しかしながら、いずれの方法による組織状
細胞においても、基材から剥離させ更に高次の検討に供
するためには、トリプシンのような蛋白質分解酵素や化
学薬品を用いなければならず、細胞が変性し細胞本来の
機能が損なわれるという問題や、剥離の際には種々の人
工基質等が混入するという問題等があった。
【０００４】一方、本発明者らは、トリプシンのような
たんぱく分解酵素やキレート剤のＥＤＴＡ等による処理
を施さずに環境温度を変化させるだけで、培養・増殖さ
せた細胞を、支持体表面から剥離・回収することが可能
な細胞培養支持体材料を以前に提案している(特開平２
−２１１８６５号公報)。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は人工基材上
に、組織状細胞を形成させ、且つ、細胞の機能を損なう
ことなく剥離・回収させることを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、以上のよ
うな点に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、先に提案した細
胞培養支持体において、所定量のポリマーもしくはコポ
リマーが被覆された細胞培養支持体を利用し、且つ、細
胞を培養する温度を所定範囲内とすることにより、細胞
を組織状態で培養することが可能となり、しかも温度を
変化させるだけで、その組織状細胞を剥離・回収するこ
とが可能であり、さらにその剥離した細胞はその機能を
保持していることを見い出し、本発明に至った。
【０００７】即ち本発明は、水に対する臨界溶解温度
(以下、単に「Ｔ」と云うことがある。)が０〜８０℃の
ポリマーを基材表面に被覆した細胞培養支持体上にて、
細胞を(Ｔ−１０)〜(Ｔ＋１０)℃にて培養することを特
徴とする組織状細胞の培養法を提供する。
【０００８】本発明に使用する細胞培養支持体は、基材
表面上が適当なポリマーで被覆される。そのような適当
なポリマーは、Ｔが０〜８０℃、好ましくは０〜５０°
を有する(尚 「臨界溶解温度」とは、２層分離している２
種の物質が或る温度になると互いに完全溶解し均一層と
なるその温度のことを言う。特に、温度を上げて完全溶
解に達する場合の温度を「上限臨界溶解温度」、温度を下
げて完全溶解する場合の温度を「下限臨界溶解温度」と言
うことがある)。Ｔが８０℃を越えると細胞が死滅する
可能性があるので好ましくない。またＴが０℃より低い
と、一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細
胞が死滅してしまうため好ましくない。そのような好適
なポリマーとしては、例えば特開平２−２１１８６５号
公報に記載のポリマーが挙げられる(これを参照により
ここに導入し、その開示とする)。具体的には適当なポ
リマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリ
ルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタク
リルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルア
クリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロ
フルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−
テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド(Ｔ＝約３５
℃)、及びポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝
３２℃)、等が挙げられる。その他のポリマーとして
は、例えばポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ
−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプ
ロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタ
クリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポ
リ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリメチルビニルエ
ーテル等が挙げられる。そのようなポリマーは、例えば
モノマーの単独重合体がＴ＝０〜８０℃を有するような
モノマーの単独若しくは共重合により調製される。モノ
マーとしては例えば、(メタ)アクリルアミド化合物、Ｎ
−(若しくはＮ,Ｎ−ジ)アルキル置換(メタ)アクリルア
ミド誘導体、環状基を有する(メタ)アクリルアミド誘導
体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの
１種以上を使用してよい。又、増殖細胞の種類によって
Ｔを調節する必要がある場合や、被覆物質と細胞培養支
持体との相互作用を高める必要が生じた場合や、細胞支
持体の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場
合などには、上記以外の他のモノマー類を更に加えて共
重合してよい。更に本発明に使用する上記ポリマーとそ
の他のポリマーとのグラフトまたはブロック共重合体、
あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を
用いてもよい。また、ポリマー本来の性質が損なわれな
い範囲で架橋することも可能である。
【０００９】本発明に使用する細胞培養支持体は、基材
上に上記ポリマーを被覆して得られる。ポリマーの被覆
量は、５〜８０μg／cm2が好ましく、さらに好ましくは
６〜４０μg／cm2である。ポリマー被覆量が８０μg／c
m2を超過すると細胞は細胞培養支持体表面上に付着せ
ず、逆に被覆量が少ないと細胞は単層の状態で培養され
組織状とならず、又培養細胞を支持体から剥離回収する
のも困難となる。このようなポリマー被覆量は、例えば
フーリエ変換赤外分光計全反射法(FT-IR-ATR法)、被覆
部若しくは非被覆部の染色や蛍光物質の染色による分
析、更に接触角測定等による表面分析を単独或は併用し
て求めることが出来る。
【００１０】被覆を施される上記基材の材質は、通常細
胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレ
ン、ポリメチルメタクリレート等の高分子化合物、ある
いはセラミックス、金属等が挙げられる。尚、基材表面
はオゾン処理、プラズマ処理、スパッタリング等の処理
技術を用いて親水化を施されたものでも良い。形状は、
ペトリディッシュに限定されることはなく、プレート、
ファイバー、(多孔質)粒子、また、一般に細胞培養等に
用いられる容器の形状(フラスコ等)を付与されていても
構わない。
【００１１】基材へのポリマーの被覆方法は、後述する
ような化学的方法、物理的方法、を単独でまたは併
用して行うことができる。被覆時に前記モノマーを使用
する場合、そのモノマーは気体、液体、固体いずれの状
態でも良い。また、ポリマーを使用する場合にはおいて
も、そのポリマーは、液体、固体状態のいずれの状態で
も良い。これらのものを化学的な反応によって結合さ
せる場合、電子線照射(ＥＢ)、γ線照射、紫外線照射、
プラズマ処理、コロナ処理、さらに基材と被覆材料が適
当な反応性官能基を有する場合はラジカル及びイオン反
応等の一般に用いられる有機反応、を用いることができ
る。物理的な相互作用による方法としては、被覆材料
を単独または基材との相溶性の良いマトリックスを媒体
とし、塗布、混練等の物理的吸着を用いる方法等がある
が、これらに限られるわけではない。
【００１２】本発明の細胞培養法は、上記のようにして
得られた細胞培養支持体上にて行われる。本発明の細胞
培養法に適用される細胞としては特に限定されないが、
例えばウシ大動脈血管内皮細胞、ウシ肝実質細胞、ラッ
ト肝実質細胞、ラット線維芽細胞、ヒト血管内皮細胞、
ヒトケラチノサイト等が挙げられる。このような細胞
は、当業者に周知の方法で入手し得る。培養温度は、
(Ｔ−１０)℃〜(Ｔ＋１０)℃であり、好ましくは(Ｔ−
５)℃〜(Ｔ＋５)℃、より好ましくは(Ｔ−４℃)〜(Ｔ＋
４℃)である。更に好ましくは培養温度は、Ｔが上限臨
界溶解温度の場合はこの温度範囲内でしかもその上限臨
界溶解温度以下が良く、又Ｔが下限臨界溶解温度の場合
はこの温度範囲内でしかもその下限臨界溶解温度以上が
良い。基材上に被覆されるポリマーが下限臨界溶解温度
を有し培養温度が(Ｔ＋１０)℃より高い場合、又はポリ
マーが上限臨界溶解温度を有し培養温度が(Ｔ−１０)℃
より低い場合、培養細胞は単層状となり組織状として回
収することが出来ない。又、基材上に被覆されるポリマ
ーが下限臨界溶解温度を有し培養温度が(Ｔ−１０)℃よ
り低い場合、又はポリマーが上限臨界溶解温度を有し培
養温度が(Ｔ＋１０)℃より高い場合は、細胞は支持体上
に付着せず培養が困難となる。具体的には、被覆ポリマ
ーが例えば前記ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
である場合の培養温度は２４〜３５℃、ポリマーがポリ
−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドである場合の培養温
度は１７〜２４℃、ポリマーがポリ−Ｎ−ｎ−プロピル
メタクリルアミドである場合の培養温度は２４〜３０
℃、ポリマーがポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミ
ドの場合の培養温度は３１〜３８℃、ポリマーがポリ−
Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミドの場合の培
養温度は２４〜３１℃、ポリマーがポリ−Ｎ−テトラヒ
ドロフルフリルメタクリルアミドの場合の培養温度は３
１〜３８℃、ポリマーがポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリ
ルアミドの場合の培養温度は２４〜３５℃が、それぞれ
好ましい。その他の培養条件は特に限定されず、当分野
に於いて通常行われる条件下に培養を行ってよい。例え
ば培地としては、ウシ胎児血清(FCS)等の血清が添加さ
れているものでもよいし、或は無血清培地でもよい。
【００１３】上記培養後、培養細胞を細胞培養支持体か
ら剥離させ回収するには、周囲温度を前記ポリマーの上
限臨界溶解温度に対し、＋１０℃以上もしくは下限臨界
溶解温度に対し、−１０℃以下に変化させるだけで良
く、細胞を培養していた培養液中においてもその他の等
張液中においても可能であり、目的に合わせて選択する
ことができる。その際、培養細胞を効率的に且つ容易に
剥離させる目的で、細胞培養支持体を軽くたたいたり揺
らしたり、更にはピペット等を使用して培地を撹拌する
などしてもよい。
【００１４】
【作用】以下本発明の作用を、被覆ポリマー調製用モノ
マーとしてＮ−イソプロピルアクリルアミド、及び支持
体基材として細胞培養用ペトリディッシュ材料として一
般に用いられるポリスチレンを用いた場合を例にとっ
て、より具体的に説明する。
【００１５】細胞培養支持体は、例えば上記ポリスチレ
ン基材上でＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーを
イソプロピルアルコール溶液として被覆し、その後電子
線照射(ＥＢ)により重合させて、得られる。その結果、
ポリスチレン基材上には生成ポリマー、即ちポリ−Ｎ−
イソプロピルアクリルアミドが被覆される。尚このよう
なポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは水溶液中で
約３２℃に下限臨界溶解温度を有する。そして下限臨界
溶解温度である３２℃以上ではこのポリマーはその占有
体積が小さくなりポリマー中の水分子を排除して、支持
体表面は疎水性を示す。しかし、逆に３２℃以下ではポ
リマーの占有体積は大きくなりポリマー中の水分子の占
める体積分率が上昇し、支持体表面は親水性を示すよう
になる。従って温度を制御するだけで、細胞培養支持体
表面の親水・疎水性は調整され、細胞の支持体への接着
性が変化する。そのため、温度を変化させるだけで培養
・増殖後の細胞を破壊することなく細胞培養支持体から
容易に剥離、回収することが可能となるものと考えられ
る。
【００１６】上記のような性質を持った細胞培養支持体
上で正常肝細胞を播種しポリ−Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミドの下限臨界温度３２℃に対し、上記範囲の培養
温度域で培養すると、正常な肝実質細胞は一般的な接着
性細胞に見られるような支持体全体に単層に伸展するの
ではなく、スフェロイド(組織状態)を形成する。又、血
管内皮細胞を同様な方法で培養すると、管腔組織(組織
状態)を形成する。このようにして得られた組織状細胞
を支持体から剥離するには、培養液の温度を上記ポリマ
ーの下限臨界温度に対し、上記範囲の培養温度域以下に
するだけで高収率に、組織状態を維持したまま、細胞本
来の機能を損なわずに、第３成分の混入なく、回収出来
る。
【００１７】
【発明の効果】本発明により、周囲温度を変化させるだ
けで培養細胞を、組織状で、高収率で、傷つけることな
く且つ薬品等の第３成分の混入若しくは汚染無しに容易
に細胞培養支持体から剥離回収出来る。
【００１８】
【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】実施例１、２、３、４ 細胞培養支持体基材として、ベクトン・ディキンソン・
ラブウェア(ＢectonＤickinson Ｌabware)社製ファル
コン(ＦＡＬＣＯＮ)３００２ペトリディッシュを用い、
培養する細胞としてはラット肝実質細胞を採用した。Ｎ
−イソプロピルアクリルアミドを表−１に示す各濃度の
イソプロピルアルコール溶液として、ペトリディッシュ
上に、０.１ml添加後、電子線を３０Ｍrad照射すること
により、ペトリディッシュ表面上に、ポリ−Ｎ−イソプ
ロピルアクリルアミドを被覆した。電子線照射後、イオ
ン交換水により、ペトリディッシュを洗浄し、残存モノ
マー及び遊離ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを
取り除き、クリーンベンチ内で乾燥し、さらに、エチレ
ンオキサイド(ＥＯ)ガス滅菌さらに十分に脱気を行なう
ことにより、細胞培養支持体材料を得た。
【００２０】得られた細胞培養支持体表面上の被覆量
は、フーリエ変換赤外分光計全反射法(ＦＴ−ＩＲ−Ａ
ＴＲ法)を用い、基材に由来する１０２８cm-1の吸収に
対する被覆物であるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミドに由来するアミドＩＩ(１５４０cm-1)の吸収の比を
算出する方法により求めた。その際、検量線は既知量の
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドホモポリマーを既知面
積の基材表面上に塗布した試料を利用することで作成し
た。結果を表−６に示す。
【００２１】ラット肝実質細胞は、一般的に知られるベ
リー(Ｂerry)とフレンド(Ｆriend)らのコラゲナーゼ灌
流法により入手し、培養は、得られた細胞培養支持体材
料上にて、５％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、１０-8Ｍデキサ
メサゾン、１０-7Ｍインスリン、１０mＭニコチンアミ
ドさらに、１０ng／ml 表皮成長因子(ＥＧＦ)を含むＷ
illiams Ｅ培地を培地として、５％二酸化炭素中、３
０℃で行なった。実施例２の培養１日目と２日目の培養
細胞のようすをそれぞれ光学顕微鏡写真として図１及び
図２に示す。次に、その増殖細胞の入ったペトリディッ
シュを５℃冷却、放置することにより、増殖細胞を剥離
させた。増殖細胞剥離回収率は下式に従って求めた。
【００２２】 増殖細胞剥離回収率(％)＝１００×(剥離回収した細胞
総数)／(増殖させた細胞総数)
【００２３】その際、剥離回収した細胞総数および増殖
させた細胞総数を計測するためには、細胞を個々の状態
にしなければならない。従って、剥離回収した細胞総数
は、５℃に冷却、放置した後、回収した細胞塊に対し、
トリプシン−ＥＤＴＡ処理を行ない、細胞を個々の状態
にして行なった。また、増殖させた細胞総数は、上記方
法で剥離回収した細胞総数に、５℃に冷却、放置しても
剥離しなかった細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理で、細
胞を個々の状態に剥離させた細胞総数を加え合わせるこ
とにより求めた。結果を表−６に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】実施例５、６、７、８ 基材として、ベクトン・ディキンソン・ラブウェア社製
ファルコン３００２ペトリディッシュを用い、Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミドのイソプロピルアルコール溶液
のペトリディッシュ上への塗布量を各々表−２に示す量
とする点以外は、実施例２と同様にして、細胞培養支持
体材料を得、被覆量を求め、さらに、細胞を培養し、こ
れを剥離、回収し、増殖細胞剥離回収率を求めた。結果
を表−６に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】実施例９、１０、１１ ファルコン３００２ペトリディッシュに対し、実施例３
と同様にして、細胞培養支持体材料を得た。被覆量を表
−６に示す。この細胞培養支持体材料で、肝細胞を、表
−３に示す温度で培養する点以外は、実施例３と同様に
して実施し、これを剥離、回収し、増殖細胞剥離回収率
を求めた。結果を表−６に示す。
【００２８】
【表３】
【００２９】実施例１２〜２３ 基材として、ベクトン・ディキンソン・ラブウェア社製
ファルコン３００２ペトリディッシュを用い、Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミドの代わりに、各々表−４に示す
モノマーを利用して細胞培養支持体材料を得、このもの
を利用してラット肝実質細胞を各々表−４に示す温度で
培養する点以外は、実施例２と同様に実施した。各々の
被覆量と増殖細胞剥離回収率を表−６に示す。
【００３０】
【表４】
【００３１】比較例１ 細胞培養支持体として、ベクトン・ディキンソン・ラブ
ウェア社製ファルコン３００２ペトリディッシュを用
い、表面処理を全く行なわずに実施例１、２、３、４と
同様な実験を行なった。ラット肝実質細胞の培養も実施
例１、２、３、４と同様に、３０℃で培養する方法を採
用した。培養１日後のようすを図３に示す。増殖細胞の
剥離回収率を表−６に示す。
【００３２】比較例２ ファルコン３００２ペトリディッシュに対し、実施例３
と同様にして、細胞培養支持体材料を得た。被覆量を表
−６に示す。この細胞培養支持体材料で、肝細胞を２０
℃で培養する点以外は、実施例３と同様にして実施し、
これを剥離、回収し、増殖細胞剥離回収率を求めた。結
果を表−５に示す。
【００３３】
【表５】
【００３４】以上の実施例、及び比較例の結果により、
実施例１〜１１では、基材表面に塗布するＮ−イソプロ
ピルアクリルアミドの溶液の濃度、及び塗布量を変える
ことにより、本発明で示すところの被覆量の細胞培養支
持体材料が得られ、このものを使用し、本発明で示すと
ころの温度域内でラット肝実質細胞を培養することによ
り、肝細胞は図１及び図２に示されるようにスフェロイ
ドを形成した。さらに培地を下限臨界溶解温度より十分
に低い５℃とすることにより、高収率で、スフェロイド
を維持したまま剥離、回収することが可能であった。こ
のことは実施例１２〜２３に示されるように、使用する
モノマー種を変化させて細胞培養支持体材料を得、それ
ぞれについて、本発明で示すところの温度域内で肝細胞
を培養する場合でも同様であった。
【００３５】一方、比較例１では、表面処理を全く行わ
なかった材料を用い、実施例と同様に３０℃で培養を実
施しても、図３に示されるように、細胞は単層状態であ
り、スフェロイドを形成せず、また、温度を下げても剥
離現象は観察されなかった。
【００３６】さらに、比較例２において実施例３で得ら
れた細胞培養支持体材料を使用し、本発明で示すところ
の範囲外の温度で肝細胞を培養した場合、下限臨界溶解
温度より十分に低い温度で培養した場合では、細胞は、
付着せず本発明の効果を十分に満足していないことが分
かる。
【００３７】実施例２４、２５ ファルコン３００２ペトリディッシュに対し、実施例
２、３と同様にして細胞培養支持体材料を得た(それぞ
れ実施例２４、２５)。基材表面上の被覆量を表−８に
示す。この細胞培養支持体材料を用いて、ウシ大動脈血
管内皮細胞を培養した。ウシ大動脈血管内皮細胞の培養
は、ウシ胎児血清(ＦＣＳ)を１０％含むダルベッコー改
変イーグル培地(ＤＭＥＭ)を培地として、５％二酸化炭
素中で、３０℃で行なう方法を採用した。常法に従い培
地交換を行ない２４日間培養した。このときの実施例２
４のようすを、光学顕微鏡写真として図４に示す。次に
この増殖細胞の入ったペトリディッシュを５℃に冷却、
放置することにより増殖細胞を剥離させ、実施例１、
２、３、４と同様な方法にて、増殖細胞剥離回収率を求
めた。結果を表−８に示す。
【００３８】実施例２６、２７ ファルコン３００２ペトリディッシュに対し、実施例２
４と同様な方法で細胞培養支持体材料を得、このものを
利用し、表−６に示す温度で培養する点以外は、実施例
２４と同様にして実施し、これを剥離、回収し、増殖細
胞剥離回収率を求めた。結果を表−８に示す。
【００３９】
【表６】
【００４０】比較例３ 細胞培養支持体として、ベクトン・ディキンソン・ラブ
ウェア社製ファルコン３００２ペトリディッシュを用
い、表面処理を全く行なわずに実施例２４、２５と同様
な実験を行なった。ウシ大動脈血管内皮細胞の培養も、
実施例２４、２５と同様に３０℃で培養する方法を採用
した。、培養１日後のようすを光学顕微鏡写真として図
５に示す。増殖細胞の剥離回収率を表−８に示す。
【００４１】比較例４、５ ファルコン３００２ペトリディッシュに対し、実施例２
４と同様にして、細胞培養支持体材料を得た。被覆量を
表−８に示す。この細胞培養支持体材料で、ウシ大動脈
血管内皮細胞を表−７に示す温度で培養する点以外は、
実施例２４と同様にして実施し、これを剥離、回収し、
増殖細胞剥離回収率を求めた。結果を表−８に示す。
【００４２】
【表７】
【００４３】
【表８】 以上の実施例、及び比較例に示されるように、使用する
細胞をラット肝実質細胞からウシ大動脈血管内皮細胞へ
変更しても、基材表面のポリマー被覆量、及び、細胞培
養温度を本発明で示すところの範囲内であれば、培養し
た細胞は例えば図４に示されるように組織状に増殖し、
管腔形成が認められた(実施例２４〜２７)。このものに
対し、培地を下限臨界溶解温度より十分に低い５℃とす
ることにより、高収率で、管腔形成を維持したまま剥
離、回収することが可能であった。
【００４４】一方、比較例３では表面処理を全く行わな
かった材料を用い、実施例２４、２５と同様に３０℃で
培養を実施しても図５に示されるように細胞は単層状態
であり、管腔形成せず、また、温度を下げても剥離現象
は観察されなかった。
【００４５】さらに、比較例４、５において実施例２４
で得られた細胞培養支持体材料を使用し本発明で示すと
ころの範囲外の温度で血管内皮細胞を培養した場合、下
限臨界溶解温度より十分に低い温度で培養した場合で
は、細胞は付着せず(比較例４)高い温度で培養した場合
では、付着はするものの単層状態であり(比較例５)、い
ずれも本発明の効果を十分に満足していないことが分か
る。
【００４６】実施例２８ 実施例３で得られた剥離細胞の損傷度合を確認するた
め、これを遠心分離(６００ＧＸ５分)により回収し、全
量をベクトン・ディキンソン・ラブウェア社製ファルコ
ン３００２ペトリディッシュで再び培養させた。細胞の
培養は、実施例１、２、３、４と同様の方法を採用し
た。細胞の損傷度合は培養１日後、常法であるエンザイ
ム イムノアッセイ(ＥＩＡ)法を用いてアルブミン分泌
能を求めることより判断した。結果を表−９に示す。
【００４７】実施例２９ 実施例７で得られた剥離細胞に対し、実施例２８と同様
な操作でアルブミン分泌能を求めた。結果を表−９に示
す。
【００４８】比較例６ 比較例１で培養した肝細胞を０．０５％トリプシン溶液
−０．０２％ＥＤＴＡ溶液を用いて剥離させ、その後の
操作は、実施例２８と同様に行なうことにより、剥離細
胞のアルブミン分泌能を求めた。結果を表−９に示す。
【００４９】比較例７ 実施例２８、２９及び比較例６の剥離操作前の肝細胞の
アルブミン分泌能を調べるために、比較例１で培養した
肝細胞を剥離させずに、上記ＥＩＡ法にてアルブミン分
泌能を求めた。結果を表−９に示す。
【００５０】
【表９】
【００５１】実施例２８、２９及び比較例６、７の結果
より、今回使用した肝細胞は、本来、比較例７に示され
る値のアルブミン分泌能を持っており、この機能は実施
例２８、２９での細胞では、ほぼ同等のアルブミン分泌
能を示した。一方、比較例６での細胞では、約１／５の
分泌能しか示さなかった。このことは、本発明の剥離細
胞は、従来のそれよりも細胞自身の損傷度が小さいこと
を意味する。
【００５２】
【発明の効果】本発明は、温度を変化させるだけという
簡便な操作で、不純物等を全く混入させることなく高収
率で組織状態の培養細胞を回収することができる。しか
も、従来の方法と比較すると回収された培養細胞は何等
の損傷を受けることがなく、従って細胞機能を十分に保
持しながら、培養・回収の繰り返し操作を行なうことが
できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】光学顕微鏡写真による実施例２の培養１日の培
養細胞の生物の形態を示す。
【図２】光学顕微鏡写真による実施例２の培養２日の培
養細胞の生物の形態を示す。
【図３】光学顕微鏡写真による比較例１の培養細胞の生
物の形態を示す。
【図４】光学顕微鏡写真による実施例２４の培養細胞の
生物の形態を示す。
【図５】光学顕微鏡写真による比較例３の培養細胞の生
物の形態を示す。
フロントページの続き (72)発明者 桜井 靖久 東京都杉並区永福３−17−６ (72)発明者 坂井 秀昭 和歌山県那賀郡岩出町畑毛310−３ フレ グランス畑毛210号 (72)発明者 ▲吉▼野 智子 和歌山県和歌山市関戸３丁目５−２ (72)発明者 中村 浩一 和歌山県和歌山市園部1030の15

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 水に対する臨界溶解温度(Ｔ)が０〜８０
    ℃のポリマーを５〜８０μg／cm2の被覆量で基材表面に
    被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を(Ｔ−１０)〜
    (Ｔ＋１０)℃にて培養することを特徴とする細胞培養
    法。
  2. 【請求項２】 ポリマーがポリ−Ｎ−イソ,プロピルア
    クリルアミドであり、培養温度が２４〜３５℃である請
    求項１記載の細胞培養法。
  3. 【請求項３】 ポリマーがポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアク
    リルアミドであり、培養温度が１７〜２４℃である請求
    項１記載の細胞培養法。
  4. 【請求項４】 ポリマーがポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタ
    クリルアミドであり、培養温度が２４〜３０℃である請
    求項１記載の細胞培養法。
  5. 【請求項５】 ポリマーがポリ−Ｎ−エトキシエチルア
    クリルアミドであり、培養温度が３１〜３８℃である請
    求項１記載の細胞培養法。
  6. 【請求項６】 ポリマーがポリ−Ｎ−テトラヒドロフル
    フリルアクリルアミドであり、培養温度が２４〜３１℃
    である請求項１記載の細胞培養法。
  7. 【請求項７】 ポリマーがポリ−Ｎ−テトラヒドロフル
    フリルメタクリルアミドであり、培養温度が３１〜３８
    ℃である請求項１記載の細胞培養法。
  8. 【請求項８】 ポリマーがポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアク
    リルアミドであり、培養温度が２４〜３５℃である請求
    項１記載の細胞培養法。
  9. 【請求項９】 請求項１〜８何れかに記載の細胞培養法
    で得られる細胞。
JP4009089A 1992-01-22 1992-01-22 細胞及びその培養法 Pending JPH05244938A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP4009089A JPH05244938A (ja) 1992-01-22 1992-01-22 細胞及びその培養法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP4009089A JPH05244938A (ja) 1992-01-22 1992-01-22 細胞及びその培養法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH05244938A true JPH05244938A (ja) 1993-09-24

Family

ID=11710894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP4009089A Pending JPH05244938A (ja) 1992-01-22 1992-01-22 細胞及びその培養法

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPH05244938A (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006019043A1 (ja) * 2004-08-17 2006-02-23 Kyushu Institute Of Technology 細胞培養用多孔性シート状物とそれを用いたバイオリアクター及び培養方法
EP1970439A2 (en) 2007-03-15 2008-09-17 Dai Nippon Printing Co., Ltd. Cell culture support and manufacture thereof
WO2009025043A1 (ja) * 2007-08-22 2009-02-26 Celagix, Res. Ltd. 新規架橋ポリマー、その製造方法及びその用途
JP2009131275A (ja) * 2009-03-11 2009-06-18 Cellseed Inc 細胞培養支持体
EP2298858A1 (en) * 2000-03-16 2011-03-23 Cellseed Inc. Bed material for cell culture, method for co-culture of cell and co-cultured cell sheet obtainable therefrom
JP4755368B2 (ja) * 2001-07-24 2011-08-24 株式会社セルシード 高密度細胞アレイ用基板、製造法、及びその利用方法
WO2011108503A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 独立行政法人科学技術振興機構 培養細胞の剥離方法及び同培養細胞の剥離方法に用いる細胞剥離装置並びに培養器

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2298858A1 (en) * 2000-03-16 2011-03-23 Cellseed Inc. Bed material for cell culture, method for co-culture of cell and co-cultured cell sheet obtainable therefrom
JP4755368B2 (ja) * 2001-07-24 2011-08-24 株式会社セルシード 高密度細胞アレイ用基板、製造法、及びその利用方法
EP1788073A4 (en) * 2004-08-17 2011-10-26 Kyushu Inst Technology POROUS LEAF MEMBER FOR CELL CULTURE, BIOREACTOR AND CULTURE METHOD USING THE SAME
EP1788073A1 (en) * 2004-08-17 2007-05-23 Kyushu Institute of Technology Porous sheet member for cell culture and, utilizing the same, bioreactor and culturing method
US8435781B2 (en) 2004-08-17 2013-05-07 Kyushu Institute Of Technology Porous sheet-form material for cell culture, and bioreactor and culturing method utilizing same
WO2006019043A1 (ja) * 2004-08-17 2006-02-23 Kyushu Institute Of Technology 細胞培養用多孔性シート状物とそれを用いたバイオリアクター及び培養方法
EP1970439A2 (en) 2007-03-15 2008-09-17 Dai Nippon Printing Co., Ltd. Cell culture support and manufacture thereof
US8557583B2 (en) 2007-03-15 2013-10-15 Dai Nippon Printing Co., Ltd. Cell culture support and manufacture thereof
EP2135940A1 (en) 2007-03-15 2009-12-23 Dai Nippon Printing Co., Ltd. Cell culture support and manufacture thereof
JPWO2009025043A1 (ja) * 2007-08-22 2010-11-18 有限会社セラジックス 新規架橋ポリマー、その製造方法及びその用途
WO2009025043A1 (ja) * 2007-08-22 2009-02-26 Celagix, Res. Ltd. 新規架橋ポリマー、その製造方法及びその用途
JP2009131275A (ja) * 2009-03-11 2009-06-18 Cellseed Inc 細胞培養支持体
WO2011108503A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 独立行政法人科学技術振興機構 培養細胞の剥離方法及び同培養細胞の剥離方法に用いる細胞剥離装置並びに培養器
US8753855B2 (en) 2010-03-01 2014-06-17 Japan Science And Technology Agency Method for detaching cultured cells, cell detachment device used in said method for detaching cultured cells, and incubator

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4567936B2 (ja) 細胞培養用支持体材料、細胞の共培養方法およびそれより得られる共培養細胞シート
JPH05192138A (ja) 皮膚細胞培養法及び培養皮膚
Yamato et al. Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture
US9889228B2 (en) Cultured cell sheet, production method, and tissue repair method using thereof
JPH02211865A (ja) 細胞培養支持体材料
JP2003038170A (ja) 前眼部関連細胞シート、３次元構造体、及びそれらの製造法
EP0387975A1 (en) Cell culture substrate cell sheet, cell cluster and preparations thereof
KR101508772B1 (ko) 전안부 관련 세포 시트, 3 차원 구조체, 및 그들의 제조법
WO1993003139A1 (en) Cell culture support, production thereof, and production of cell cluster using same
US20140335610A1 (en) Cell culture substrate, and method for manufacturing same
EP0332682B1 (en) Neutralized perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7-octene sulphonyl fluoride copolymer surface for attachment and growth of animal cells
EP0355112A1 (en) Cell culture processes, materials and products
WO2019035436A1 (ja) 多能性幹細胞の培養基材及び多能性幹細胞の製造方法
US9249386B2 (en) Substrate for cell transfer
Ging-Ho et al. Plasma-induced graft copolymerization of HEMA onto silicone rubber and TPX film improving rabbit corneal epithelial cell attachment and growth
JPH05244938A (ja) 細胞及びその培養法
JPH0923876A (ja) 細胞培養支持体の製造法
JP2007049918A (ja) 細胞培養支持体及びその細胞培養法、細胞回収法と細胞
JPH05260957A (ja) 肝細胞スフェロイド及びその調製法
JP4967520B2 (ja) 細胞転写用部材
JPH03266980A (ja) 細胞培養用基材およびそれを用いた細胞集合体の製造方法
JP2009131275A (ja) 細胞培養支持体
JP4979199B2 (ja) 細胞培養基材及び細胞培養方法
JPH0538278A (ja) 細胞培養支持体材料
JPH0494679A (ja) 細胞培養支持体材料