JPH0494693A - アフィジコリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アフィジコリンの製造法に関する。

更に詳しくは、微生物を培養してアフィジコリンを製造
する方法に関する。

〔従来の技術〕

アフィジコリンは、かびの一種である Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　１ｅｃａｎｉｉより得られ
る抗ウィルス剤として発見され、上記式で表わされる如
くティラサイタリックジテルペンテトラオールの構造を
有する水難溶性物質であり、真核細胞由来ＤＮＡポリメ
ラーゼα型に高い特異的阻害作用を示すことから、この
酵素の型の判別に用いられており、特殊なウィルスを除
き、原核細胞由来のＤＮＡポリメラーゼには無効であり
、主としてＤＮＡの複製、修飾機序の解析などに利用さ
れている。また、抗腫瘍作用、抗ウィルス作用、植物種
子生長抑制作用を有することも知られており、こうした
用途への利用も図られている。

しかしながら、アフィジコリンは、その製造効率が低く
、極めて高価な生化学的試薬として市販されている（現
在の市販価格１ｍｇ当り５５００円）。上記Ｃｅｐｈａ
ｌｏｓｐｏｒｉｕｍ　ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ以外の真菌
類。

例えばＰｈｏｍａ　ｂｅｔａｅ　（特開昭５８−２２０
６９０号公報）、Ｈａｒｚｉｅｌｌａ　ｅｎｔｏｍｏｐ
ｈｉｌａ　（Ａｇｒｉ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、第４
２巻第８号第１６１１頁、　１９７８年）、０ｎｙｃｈ
ｏｐｈｏｒａｃｏｐｒｏｐｈｉｌａ　（Ｔｙａｎｓ、　
Ｂｒ、　ｍｙｃｏｌ、　Ｓｏｃ、第８３巻第１号第１４
９頁＋１９８４年）、Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ　５ｐｈａ
ｅｒｉｃａ（ＣＡＮ。

Ｊ、　ＭＩＣＲＯＢ’ＩＯＬ、第２０巻第４１６頁、１
９７４年）などを用い、アフィジコリンを産生ずること
も報告されているが、いずれも産生能力が低く満足でき
るものではない。例えば、　Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ　５
ｐｈａｅｒｉｃａの培養培地１．５Ｑからは、アフィジ
コリンが１２０ｍｇｊ！離されるにすぎない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、微生物を培養してアフィジコリンを製
造するに際し、高産生能力でアフィジコリンを産生ずる
アフィジコリンの製造法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

かかる本発明の目的は、バーチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃ
ｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物を培養し、アフィジコ
リンを生成蓄積せしめて、これを採取するアフィジコリ
ンの製造法によって達成される。

バーチシリウム属に属する微生物としては、真菌の生産
する生理活性物質探索の過程で土壌（岐阜市内の竹林中
に自生するきのこの付着物）中より分離したー菌株ＫＮ
−０４（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１４２７）が用いられ、それ
の人工的変異株、例えば紫外線、Ｘ線、放射線、化学薬
品などの人工的変異手段を用いて変異させたものも同様
に用いられる。

このバーチシリウム属の微生物ＫＮ−０４は、下記の菌
学的性質を有する。

［ａ］培養的特徴（２５℃平面培養） （１）ポテトデキストロース寒天培地 （第２図の写真参照） コロニーの生育は良く８日目で直径約４２１１１ｍに達
する。平坦な湿性のコロニーで中央部から周辺に向かっ
てやや隆起したロープ状の菌糸が放射状に伸びている。

コロニー周辺は円形である。コロニー中央部は酵母状の
生育を示し、突起している。コロニー裏面は培養初期白
色、培養後期中心付近がわずかに黄変する。表裏面共に
しわはない。

（２）サブロー寒天培地（第３図の写真参照）コロニー
の生育は良く８日目で直径約３８１１１１１１に達する
。平坦な湿性のコロニーで中央部から周辺に向かってや
や隆起したロープ状の菌糸が放射状に伸びている。コロ
ニー周辺は円形である。コロニー中央部は酵母状の生育
を示し、突起している。コロニー裏面は培養初期白色、
培養後期中心付近かわずかに黄変する。表裏面共にしわ
はない。

（３）　ＹｐＳｓ寒天培地（第４図の写真参照）コロニ
ーの生育は良く８日目で直径約４０ｍｍニ達スる。白色
綿毛状のコロニーで、ローフ状の菌糸は比較的細く、は
っきりとしていない。コロニー周辺は円形である。コロ
ニー中央部は酵母状の生育を示し、突起している。

コロニー裏面は白色である。表裏面共にしわはない。

（４）ツアペック寒天培地（第５図の写真参照）コロニ
ーの生育は良く８日目で直径約３３ｍ＋＋＋ニ達スる。

白色綿毛状の薄いコロニーで、ロープ状の菌糸はほとん
どない。コロニー周辺は円形である。コロニー中央部は
酵母状の生育を示し、突起している。コロニー裏面は白
色である。表裏面共にしわはない。

［ｂ］形態的特徴（第１図） 菌糸は分校し、滑面、隔壁を有し、単一またはロープ状
に集合する。分生子柄は気菌糸または栄養菌糸より生じ
、畢生または輪生状に分枝する。フィアライドは分生子
柄から畢生または輪生状に形成され、先端部がやや細く
なり、下部はやや膨らんでいる。大きさは様々であるが
、大部分１５〜３０×２〜４μｍである。分生子はフィ
アライトの先端に形成される粘性の胞子塊（スボアボー
ル）の中に含まれる。分生子形成様式はフィアロ型であ
る。形状は葉巻タバコ型（あるいは桿菌型）である。

大きさは様々であるが、大部分は３〜７Ｘ１〜２μｍで
ある。

以上の様に本菌は有性生殖器官を形成せず、無性生殖器
官として分生子柄のみを形成することから、不完全菌亜
門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）　。

不完全糸状菌網（）Ｉｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）、不完
全糸状菌目（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に属する
。本菌の分生子柄は畢生もしくは分枝し［第１図（ｃ）
］、フイアライドはところどころで輪生し［第１図（ａ
）〜（ｃ）　］、フィアロ型分生子がフィアライド先端
に粘性の胞子塊となって形成される［第１図（ａ）〜（
ｃ）］ことから、バーチシリウム属（Ｊ、　Ｉｉ、　Ｃ
ａｒｍｉｃｈａｅ１等著のＧｅｎｅｒａ　ｏｆＨｙｐｈ
ｏｍｙｃｅｔｅｓ、　１９８０．　Ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ　ｏｆＡｌｂｅｒｔａ　Ｐｒｅｓｓ、　Ａｌ
ｂｅｒｔａ、　Ｃａｎａｄａ、の１９６頁、２０８頁お
よびＧｅｏｒｇｅ　Ｌ、　Ｂａｒｒｏｎ著のＴｈｅＧｅ
ｎｅｒａ　ｏｆ　Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ　ｆｒｏｍ
　５ｏｉｌ、　１９６ｇ。

Ｔｈｅ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃａ
ｍｐａｎｙ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅの３２１頁に記載）に
帰属する。

さらに種のレベルで検索したところ、本菌は＋Ｗａｉｔ
ｅｒ　Ｇａｍ５著のＣｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ−ａ
ｒｔｉｇｅ　Ｓｈｉ＋＋ｕｎｅｌｐｉｌｚｅ、１９７１
．　Ｇｕｓｔａｖ　ＦｉｓｃｈｅｒＶｅｒｌａｇ、　Ｓ
ｔｕｔｔｇａｒｔの１７６頁に収載されているバーチシ
リウム　レカニ（セファロスポリウムアフィディコラは
異名）に類似する。しかし、本菌とセファロスボリウム
アフィディコラＡＴＣＣ２８３００を同条件（２５℃平
面培養、ポテトデキストロース寒天培地）で比較培養し
た場合、培養上の特徴について大きな差異が観察される
。例えば本菌の生育速度は８日目で直径約４２ｍｍであ
るがセファロスボリウムアフィディコラＡＴＣＣ２８３
００は直径約１９ｍｍに過ぎない。また、本菌は平坦で
湿性のコロニーで、中心付近から周辺に向かってロープ
状の菌糸が放射状に伸びているのに対し、セファロスボ
リウムアフィディコラＡＴＣＣ２８３００では白色ビロ
ード状のコロニーが厚く盛り上がっており、ロープ状の
菌糸は観察されない。さらに大きな差異は、本菌のコロ
ニー中心部が酵母状の生育を示すのに対しセファロスポ
リウム　アフィディコラＡ丁ＣＣ２８３００のコロニー
中心部は明確な特徴を示さない。

本菌をバーチシリウム属既知種の記載と比較照合したと
ころ１合致する種（もしくは種以上の分類群）が無いこ
とから、現段階ではバーチシリウムｓｐ、と考えられる
。なお、本菌は基本的にはバーチシリウム属の形態的特
徴を示すものの木馬の定義にはない酵母状時代［第１図
（ｄ）］を付随することから、正確な分類学的帰属の決
定にはさらに詳細な分類学的研究が必要である。

［Ｃコ生理的特徴 （１）最適生育温度は２３〜２８℃であり、１０〜３５
℃で生育可能である。

（２）最適生育ｐＨは５〜８であり、ｐＨ２〜１０の範
囲で生育し得る。

（３）ポテトデキストロース寒天培地で培養するとき、
培地中にアフィディコリンの結晶が析出することがある
。

この菌株ＫＮ−０４の培養は、通常の真菌培養法によっ
て行われる。即ち、静置培養または振どう培養が用いら
れ、培地としてはこの菌株が利用し得る栄養源を含有す
るものであれば、合成培地、半合成培地、天然培地のい
ずれをも用いることができる。

培地の組成中には、例えば炭素源としてぶどう糖、麦芽
糖、しょ糖、デキストリン、グリセリン、でん粉、じゃ
がいも煎汁、おがくず、コーンミルなどが、窒素源とし
て大豆粉、コーン・スチーブ・リカー、綿実粉、肉エキ
ス、酵母エキス、ペプトン、じゃがいも煎汁、カゼイン
加水分解物、乾燥酵母、米ぬか、アンモニウム塩、硝酸
塩などが、また必要に応じて無機塩としてナトリウム、
カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄などの
硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、リン酸塩、塩化物などがそれ
ぞれ含有され、培地が固体培地として用いられる場合に
は、更にゲル化剤として寒天、ゼラチン、シリカゲル、
ゲランガムなどが含有される。

培養は、好気的条件下で行うのが一般的に有利であり、
培養温度としては約２０〜３０℃、ｐＨは約５〜８の範
囲がそれぞれ好ましく、また培養時間は培地の組成、培
養温度などにより変動するが、般には１週間乃至１ケ月
程度であり、この間にアフィジコリンが培地中に生成蓄
積される。

培地中に生成蓄積されたアフィジコリンの培地からの採
取は、微生物の培養培地より代謝産物を分離精製する通
常の手段を、適宜選択し組合せることによって行われ、
その−例を示すと次の如くである。

即ち、固体培地からアフィジコリンを分離する場合には
、固体培地を粉砕後、アフィジコυンを溶解せしめる親
水性有機溶媒、例えばメタノール中などにけん濁し、室
温下または加熱下に抽出し、抽出液は口過後口液を６０
℃以下の温度で濃縮乾固し、残渣をシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーで精製する。

また、静置液体培地からアフィジコリンを分離する場合
には、培養液を６０℃以下で濃縮乾固した後、固体培地
の場合と同様に処理する。ただし、シリカゲルカラムク
ロマトグラフィーにかける前に、残渣をメタノール−水
混合溶媒で再結晶し、粗結晶とする工程が挿入される。

〔発明の効果〕

バーチシリウム属に属する微生物ＫＮ−０４（ＦＥＲＮ
Ｐ−１１４２７）を用いることにより、この培養培地か
らアフィジコリンを高産生能力で製造することができる
。

〔実施例〕

次に、実施例について本発明を説明する。

実施例１ バーチシリウム属菌株ＫＮ−０４の傾斜培養物の一白金
耳を、容量２００ｍ　Ｑフラスコ内の種培養培地（栄研
化学製品ボテ１へデキストロース寒天培地３９ｇを蒸留
水ＩＱにけん濁し、不溶寒天部分を日別後、オートクレ
ーブで１２０℃、１５分間の滅菌処理をしたもの）３０
ｍ　Ｑに接種し、２５℃で３日間振どう培養した。この
培養液１００μＱを、本培養培地（栄研化学製品ポテト
デキストロース寒天培地３９ｇを蒸留水ＩＱにけん濁し
、オートクレーブで１２０℃、１５分間の滅菌処理後、
熱時にシャーレに１０ｍ　Ｑずつ分注したもの）Ｉｏｎ
　Ｑを含むシャーレ（９ｃｍ径、深さ１５ｍｍ）に接種
し、２５℃で２０日間静置培養を行った。

このようにして培養した培地６２５ｍ　Ｑを粉砕し、２
Ｑのメタノール中で３時間加熱還流した。冷却後口過し
、０液を６０℃以下で濃縮乾固して得られた残渣をシリ
カゲルカラムクロマトグラフィー（ワコーゲルＣ−３０
０、クロロホルム／メタノール）で精製した後、エタノ
ールで再結晶すると、融点２３７〜２３９℃の無色針状
晶のアフィジコリンが９０５ｍｇ得られた。水晶は、Ｉ
ｔ１品（和光純薬製品）とＩＲスペクトル、質量スペク
トル、薄層クロマトグラフィー旋光度の点で同定された
。

実施例２ 実施例１の種培養培地からの培養液１００μＱを、容量
５００ｍ　Ｑフラスコ内の本培養培地（種培養培地と同
じ）４０ｍ　Ｑに接種し、２５℃で２０日間静置培養を
行った。

このようにして培養した培地８０ｍ　Ｑを６０℃以下の
温度で濃縮乾固し、残渣にメタノール１００ｍ　Ｑを加
え、１時間加熱還流した。冷却後口過し、０液を６０℃
以下で濃縮乾固して得られた残渣を、シリカゲルカラム
クロマトグラフィーで精製後エタノールで再結晶すると
、標品と同定される無色針状晶のアフィジコリンが２４
ｍｇ得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、バーチシリウムエスピーの光学顕微鏡的特徴
を示したものであり、（ａ）および（ｂ）はスライドカ
ルチャーの直接ｍ察であり、（Ｃ）はスライドカルチャ
ーのプレパラート観察であり、（ｄ）はコロニー中心部
（酵母状部分）のプレパラート観察である。また、第２
〜５図は、それぞれポテトデキストロース寒天培地、サ
ブロー寒天培地、ＹｐＳｓ寒天培地またはツアペック寒
天培地での２５ｍ平面培養状態を示す写真である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、バーチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に
   属する微生物を培養し、アフィジコリンを生成蓄積せし
   めて、これを採取することを特徴とするアフィジコリン
   の製造法。