JPH0469571A - カンジダ症の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、カンジダ症の検出方法に関し、更に詳細には
ヒト尿試料を用いたカンジダ症の検出方法に関する。本
発明は、またこのような検出のための検出キットに関す
る。

〔従来の技術〕

カンジダ症はカンジダ（（ａｎｄｉｄａ）属の真菌によ
り引起される感染症で、深在性真菌症の中での頻度は最
も高く、近年の増加は著しい。

カンジダ症の検出方法としては、臨床検査材料より、被
検菌を分離培養し、純粋培養後、形態学的検査、生化学
的検査、及び血清学的検査を組合せ、被検菌の同定・検
出を行う方法や、患者血清中のカンジダ抗体を検出する
方法等が開発されている。また患者血清中の抗原物質や
、代謝物質を検出する方法も開発され、例えばモンソン
（Ｍｏｎｓｏｎ、　Ｔ、Ｐ、）らは、カンジダ症患者の
血清中の遊離型Ｄ−マンノース量が有意に上昇すること
を報告している〔クリニカル　ケミストリー（ＣＩｉｎ
、Ｃｈｅｍ、　）第２５巻、第１３８４頁（１９７９）
　］。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記各方法において、分離培養方法は、長時間を要する
こと、血清中のカンジダ抗体価を測定する方法は、カン
ジダが成体の正常フローラの構成員の一つであることか
ら、抗細菌剤の投与によってカンジダ菌が消化管内等に
大量に存在する場合に、感染巣の存在なしにカンジダ抗
体が検出される場合があること、また逆に一般的には流
血中抗体価が極めて低い、あるいは検出し得る抗体を作
らないこと等、使用する際に多々の問題点があった。

モンソンらの血清中の遊離型Ｄ−マンノースを測定する
方法は簡便な方法ではあるが、この報告はあくまでも血
清中の遊離型Ｄ−マンノース量の変化について述べてい
るにすぎず、ヒト尿試料中の遊離型Ｄ−マンノース量と
カンジダ症の関係を報告した例はない。上記血清中のＤ
−マンノースの測定には採血という操作が必要であり、
大量試料が処理される集団検診には、その簡便性、大量
処理能力、コストの点で問題があった。

本発明の目的は、カンジダ症を尿試料を用いて簡便に検
出する新規な検出方法及び定量用キットを提供すること
にある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はカンジダ症
の検出方法に関し、ヒト尿試料中の遊離型Ｄ−マンノー
ス量を正常値と比較測定することを特徴とし、また第２
の発明はカンジダ症の検出用キットであって、遊離型Ｄ
−マンノースの２−アミノピリジル化試薬を含有するこ
とを特徴とする。

本発明において使用するカンジダ症検出用試料は、ヒト
尿から得られるものであり、通常は尿そのものを、また
場合によっては一定量のろ紙などの吸着材に染みこませ
、ここから抽出する方法などによって調製し用いること
もできる。

尿試料中の遊離型Ｄ−マンノース量は、例えば前出クリ
ニカル　ケミス）　Ｕ−記載のガスクロマトグラフィ一
方法や、クリニカル　ケミストリー第３巻、第２３９頁
（１９８４）記載の酵素学的方法を用い測定すれば良い
が、特開昭６４−１０１７７号公報記載の方法に準じ、
尿試料中の遊離型Ｄ−マンノースの２−アミノピリジル
化を行い、次いでＨＰＬＣで検出するのが最も高感度な
方法である。例えば尿試料２μｍを減圧乾固し、次いで
２−アミノピリジン１ｇを酢酸０．４６８ｒｎｌ及びメ
タノール０．６　ｒｎｌに溶解した２−アミノピリジル
化試薬７μｌを添加し、９０℃、１５分間の２−アミノ
ピリジル化反応を行う。反応終了後余剰の試薬を留去し
、次いでジメチルアミンボラン５９ｍｇを酢酸１艷に溶
解した還元剤１０μｌを添加し、９０℃、３０分間の還
元反応を行う。反応終了後余剰の試薬を留去する。この
場合、各段階で留去可能な試薬を用いており、この一連
の反応を同一容器内で行うことができる。この蛍光標識
物は、例えば水に溶解後、例えばイオン交換樹脂クロマ
トグラフィーを行うことにより少量の試料中の遊離型Ｄ
−マンノース量を効率よく、高感度に測定することがで
きる。

この２−アミノピリジル化試薬をそろえキットとしてお
くことで、目的試料中の遊離型Ｄ−マンノース量を簡便
に測定することができる。

キット中に含有される試薬としては、例えば２−アミノ
ピリジン、酢酸、メタノールをそれぞれ単独、又は混合
させたものを含有させれば良い。またこのほか、還元剤
を含有させても良い。

またＨＰＬＣを行う場合の標準物質として２アミノピリ
ジル化マンノースを含有させても良く、更にはＨＰＬＣ
用カラムをそろえておいても良い。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を示し、本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない
。

実施例１ 健常人１０例及びカンジダ症患者１７例の尿中遊離型Ｄ
−マンノース量を測定した。

尿２μｌを反応チューブに入れ、減圧下濃縮乾固した。

次いで２−アミノピリジル化試薬（２−アミノピリジン
１ｇを酢酸０．４６８ｍ１゜メタノール０．６　ｍ！！
に溶解して作製する）　７μｌを加え、封管した後９０
℃にて１５分間反応させた。反応後間管し、Ｎ２気流下
減圧にて濃縮乾固した。残渣に還元剤（ジメチルアミン
ボラン５９ｍｇを酢酸１−に溶解して作製する）１０μ
ｌを加え、封管した後９０℃、３０分間反応させた。反
応後メタノールを用いた共沸操作により余剰の試薬を留
去した。残渣を５００μ矛の水に溶解し、そのうち５μ
ｌをＨＰＬＣにて分析した。ＨＰＬＣの条件は、カラム
はパルバックＡ型（ＰＡＬＰＡＫ　Ｔｙｐｅ　Ａ　：宝
酒造社製、４，６Ｘ１５０ｍｍ）を用い、溶媒は１０％
Ｔ七ト二トリル含有０．７　Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９，
０）で、流量は０．３ｍｊ’／分、カラム温度は６５℃
とした。

蛍光検出は励起波長３１０　ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍ
で行った。尿中の遊離型Ｄ−マンノース量をクレアチニ
ン量で補正し、健常人尿中とカンジダ症患者尿中の遊離
型Ｄ−マンノース量を比較した。その結果を第１図に示
す。すなわち第１図は本発明により測定した尿中遊離型
Ｄ−マンノース量のクレアチニン補正値（μｒｎｏｌ／
ｇ、　Ｃｒ。

縦軸）をカンジダ症患者、健常人別（横軸）にプロット
したグラフである。第１図に示すようにカンジダ症患者
の遊離型Ｄ−マンノース量は健常人に比べ高値を示す。

実施例２ 尿試料中道離型Ｄ−マンノース量を測定するためのキッ
トを作成した。

遊離型Ｄ−マンノースの２−アミノピリジル化試薬（Ａ
剤）、及び還元剤として、ジメチルアミンボラン（Ｂ−
１剤）及びＢ−１剤の溶解剤としての酢酸（Ｂ−２剤）
より成るキットを作成した。

表　　１ Ａ剤：２−アミノピリジル　　７００μｌ試薬 （２−アミノピリジン１ｇを 酢酸０．４６８ｍｆ、メタノ− ル０．６ｍｊ２に溶解させたも の） Ｂ−１剤ニジメチルアミンボラン　５９　ｍｇＢ−２剤
：酢酸　　　　　　　　　　１ｍ１１００回分 〔発明の効果〕 以上詳細に述べたように、本発明により尿試料中の遊離
型Ｄ−マンノース量がカンジダ症のマーカーとなること
が見出され、該疾病の新たな検出方法及び定量用キット
が開発された。

【図面の簡単な説明】

第１図は各尿中の遊離型Ｄ−マンノース濃度の測定結果
を示す図である。 第　／　図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト尿試料中の遊離型Ｄ−マンノース量を正常値と
   比較測定することを特徴とするカンジダ症の検出方法。 ２、カンジダ症の検出用キットであって、遊離型Ｄ−マ
   ンノースの２−アミノピリジル化試薬を含有することを
   特徴とするカンジダ症の検出用キット。