JPH0466092A - Production of laminary oligosaccharide - Google Patents
Production of laminary oligosaccharideInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はラミナリオリゴ糖の新規な製造方法に関する。[Detailed description of the invention] [Industrial application field] The present invention relates to a novel method for producing laminarioligosaccharides.
ラミナリオリゴ糖はグルコースが２個以上β−１，３結
合しててきる少糖類である。β−１，３結合のポリマー
（β−１，３グルカン）の中には制癌活性のあるものが
知られており、その構成単位であるラミナリオリゴ糖に
も種々の生理活性か期待される。Laminario-oligosaccharide is an oligosaccharide in which two or more glucose molecules are linked with β-1,3 bonds. Some β-1,3 bond polymers (β-1,3 glucan) are known to have anticancer activity, and the laminarioligosaccharides that are their constituent units are also expected to have various physiological activities.
ラミナリオリゴ糖の製造方法としては、β−１゜３グル
カンの酸部分加水分解による方法しか知られていない。As a method for producing laminarioligosaccharides, only a method using acid partial hydrolysis of β-1°3 glucan is known.
従来法によるラミナリオリゴ糖の製造方法におし、）て
は、原料としてβ−１，３グルカンか使用される。しか
しながら、β−１，３グルカンを安価に供給する方法は
なく、そのため製造されるラミナリオリゴ糖は大変高価
なものになることが避けられなかった。In the conventional method for producing laminarioligosaccharides, β-1,3 glucan is used as a raw material. However, there is no method for supplying β-1,3 glucan at low cost, and therefore the produced laminarioligosaccharides inevitably become very expensive.
本発明者らはこの課題を解決するために鋭意研究を進め
た結果、本発明を完成するに至った。The present inventors conducted extensive research to solve this problem, and as a result, completed the present invention.
すなわち本発明は、グルコース−１−リン酸とグルコー
スをラミナリビオースホスホリラーゼ及ヒ／又はβ−１
，３−オリゴグルカンホスホリラーゼにより処理してラ
ミナリオリゴ糖を製造するにあたり、前記グルコースの
初濃度が１ｍＭ以上２Ｍ未満であり、グルコース−１−
リン酸の使用量がグルコース１モルに対して０．１モル
以上、かつ初濃度が１０ｍＭ以上２Ｍ未満であり、反応
時間が１００時間以下であり、製造されるラミナリオリ
ゴ糖の平均重合度が２以上２０以下であることを特徴と
するラミナリオリゴ糖の製造方法に関する。That is, the present invention provides glucose-1-phosphate and glucose with laminaribiose phosphorylase and/or β-1
, 3-oligoglucan phosphorylase to produce laminario oligosaccharide, the initial concentration of glucose is 1 mM or more and less than 2M, and glucose-1-
The amount of phosphoric acid used is 0.1 mol or more per 1 mol of glucose, the initial concentration is 10 mM or more and less than 2M, the reaction time is 100 hours or less, and the average degree of polymerization of the laminario oligosaccharide produced is 2 or more. The present invention relates to a method for producing a laminarioligosaccharide characterized in that the polysaccharide has a molecular weight of 20 or less.
本発明においてラミナリオリゴ糖は、グルコース−１−
リン酸とグルコースをラミナリビオースホスホリラーゼ
及び／又はβ−１，３−オリゴグルカンホスホリラーゼ
により処理することによって製造される。In the present invention, the laminario oligosaccharide is glucose-1-
It is produced by treating phosphoric acid and glucose with laminaribiose phosphorylase and/or β-1,3-oligoglucan phosphorylase.
ここで、これら２種類の酵素は国際生化学連合酵素委員
会報告によりラミナリビオースホスホリラーゼ（ＥＣ２
，４，１，３１） 、 β−１，３−オリゴグルカン
ホスホリラーゼ（ＥＣ２，４，１，３０）と異なった酵
素番号が与えられているが、これらの酵素はすべてラミ
ナリオリゴ糖を加リン酸分解し、グルコース−１−リン
酸と重合度の１つ少ないラミナリオリゴ糖を生成する本
質的に同一の反応を触媒する。Here, these two types of enzymes are known as laminaribiose phosphorylase (EC2) according to a report by the Enzyme Committee of the International Union of Biochemistry.
, 4, 1, 31) and β-1,3-oligoglucan phosphorylase (EC2, 4, 1, 30), but all of these enzymes phosphorylate laminal oligosaccharides. and catalyzes essentially the same reaction that produces laminario oligosaccharides with one less degree of polymerization than glucose-1-phosphate.
本発明者らは、これらの酵素の触媒する反応が逆方向に
も進行することに注目した。すなわち、グルコースを出
発とし、グルコース−１−リン酸によりこれらの酵素の
作用によってβ−１，３結合を生成することによりラミ
ナオリゴ糖を合成することに成功した。The present inventors noticed that the reactions catalyzed by these enzymes also proceed in the opposite direction. That is, starting with glucose, we succeeded in synthesizing lamina oligosaccharides by generating β-1,3 bonds through the action of these enzymes using glucose-1-phosphate.
本発明による酵素反応は、通常トリス−塩酸緩衝液、イ
ミダゾール−塩酸緩衝液等の適当な溶液中で行われる。The enzyme reaction according to the present invention is usually carried out in an appropriate solution such as Tris-HCl buffer or imidazole-HCl buffer.
本発明において、グルコースの初濃度は通常１ｍＭ以上
２Ｍ未満に設定する。グルコースの初濃度が１ｍＭ未満
の場合は、本反応速度か非常に遅くなる。一方、２Ｍを
超える場合は、溶解度の問題で反応が困難になる。また
、他方の原料であるグルコース−１−リン酸の使用量は
、グルコース１モルに対して０．１モル以上、かつ初濃
度１０ｍＭ以上２Ｍ未満に設定する。グルコース−１−
リン酸の使用量がグルコース１モルに対して０．１モル
未満の場合は、反応速度が遅くなるとともに、反応系に
原料であるグルコースが大量に残存する問題か生じる。In the present invention, the initial concentration of glucose is usually set at 1 mM or more and less than 2M. If the initial concentration of glucose is less than 1 mM, the reaction rate will be very slow. On the other hand, if it exceeds 2M, the reaction becomes difficult due to solubility issues. Further, the amount of glucose-1-phosphate, which is the other raw material, is set to be 0.1 mol or more per 1 mol of glucose, and an initial concentration of 10 mM or more and less than 2M. glucose-1-
If the amount of phosphoric acid used is less than 0.1 mol per 1 mol of glucose, the reaction rate will be slow and a large amount of the raw material glucose will remain in the reaction system.
また、初濃度が１０ｍＭ未満では、製造されるラミナリ
オリゴ糖の濃度が薄く実用的でない。一方、初濃度が２
Ｍを超える場合は、溶解度の問題がありやはり実用的で
ない。Furthermore, if the initial concentration is less than 10 mM, the concentration of the laminario oligosaccharide produced will be too low to be practical. On the other hand, the initial concentration is 2
If it exceeds M, it is not practical due to the problem of solubility.
反応時間は通常１００時間以内で行われる。反応時間か
１００時間を超える場合は、原料のグルコース−１−リ
ン酸が比較的不安定なため、その一部が分解し、反応の
収率が低くなる。The reaction time is usually within 100 hours. If the reaction time exceeds 100 hours, glucose-1-phosphoric acid as a raw material is relatively unstable, and a portion of it decomposes, resulting in a low reaction yield.
ここで、グルコースとグルコース−１−リン酸の初濃度
の比を変えることによって、製造されるラミナリオリゴ
糖の重合度を変化させることが可能である。すなわち、
グルコースの使用量を減少させるほど、より重合度の大
きいラミナリオリゴ糖が製造される。Here, by changing the ratio of the initial concentrations of glucose and glucose-1-phosphate, it is possible to change the degree of polymerization of the laminaria oligosaccharide produced. That is,
As the amount of glucose used is reduced, laminar oligosaccharides with a higher degree of polymerization are produced.
酵素処理の反応温度は酵素が失活しない範囲であればよ
く、通常２０〜６０″Ｃの範囲で行われる。The reaction temperature for the enzyme treatment may be within a range that does not deactivate the enzyme, and is usually carried out within a range of 20 to 60''C.
さらに、反応系のｐＨは用いる酵素の最適ｐＨ付近で行
い、通常５〜８の範囲である。Furthermore, the pH of the reaction system is around the optimum pH of the enzyme used, and is usually in the range of 5 to 8.
ここで用いられる酵素は如何なる生物起源のものでも差
し支えないか、両酵素を菌体内に含有していることが知
られているミドリムシ目（Ｅｕｇｌｅｎｉｄａ）の生物
起源のものを用いることが好ましい。また、これらの酵
素は精製品、未精製品、公知の固定化法により固定化さ
れた固定化酵素あるいは該酵素を含む菌体等いずれの状
態で用いても差し支えない。The enzyme used here may be of any biological origin, but it is preferable to use one of biological origin from the order Euglenida, which is known to contain both enzymes in its bacterial cells. Furthermore, these enzymes may be used in any state, such as purified products, unpurified products, immobilized enzymes immobilized by known immobilization methods, or microbial cells containing the enzymes.
酵素反応終了後、適宜の方法により反応液からラミナリ
オリゴ糖を分離する。例えば、反応液にエタノールを加
えてラミナリオリゴ糖を沈澱させることにより分離する
ことが可能である。また、もし重合度が一定のラミナリ
オリゴ糖が必要であれば、活性炭カラムクロマトあるい
はゲル濾過等の方法によりこれらを得ることが可能であ
る。After the enzymatic reaction is completed, the laminarioligosaccharide is separated from the reaction solution by an appropriate method. For example, it is possible to separate the laminaria oligosaccharide by adding ethanol to the reaction solution to precipitate the laminario oligosaccharide. Furthermore, if laminar oligosaccharides with a constant degree of polymerization are required, they can be obtained by methods such as activated carbon column chromatography or gel filtration.
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。な
お、各実施例に用いた酵素は以下の方法により調製した
ものである。Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples. In addition, the enzyme used in each example was prepared by the following method.
調製例（酵素液の調製）
ユーグレナ・グラチリス”ｚ株（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒ
ａｃｉｌｉｓｚ）の培養菌体２ｇ（湿潤重量）を８−の
５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（１）Ｈ７，Ｏ）に懸濁し
て超音波破砕処理を行った。該処理液を遠心分離し、そ
の上清を酵素液とした。酵素活性は１．１１単位／ｙｄ
であった。Preparation example (preparation of enzyme solution)
2 g (wet weight) of cultured cells of M. acilisz) were suspended in 8-50mM Lis-HCl buffer (1) H7, O) and subjected to ultrasonic disruption treatment. The treated solution was centrifuged, and the supernatant was used as an enzyme solution. Enzyme activity is 1.11 units/yd
Met.
なお、酵素活性の単位は、３７℃、 ｐＨ７，０おいて
１０ｍＭグルコース、１０ｍＭグルコース−１−リン酸
から１分間に１ＭＭのリン酸及び等モルのラミナリビオ
ースを生成する酵素量として定義した。Note that the unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that produces 1 MM phosphoric acid and equimolar laminaribiose in 1 minute from 10 mM glucose and 10 mM glucose-1-phosphate at 37° C. and pH 7.0.
実施例１〜５
５０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）中にグル
コース−１−リン酸１００ｍＭ、 グルコース５〜１
００ｍＭ、酵素０．０８９単位／−になるよう反応液を
調製し、３７℃において４８時間反応を行った。Examples 1-5 50mM) Glucose-1-phosphate 100mM in Lis-HCl buffer (pH 7,0), glucose 5-1
The reaction solution was prepared to have a concentration of 00 mM and 0.089 units/- of enzyme, and the reaction was carried out at 37°C for 48 hours.
反応後のラミナリオリゴ糖は高速液体クロマトグラフィ
ーを用いて定量した。その結果、表１に示したようなラ
ミナリオリゴ糖が製造された。なお、表１における収率
は、グルコース−１−リン酸に対する収率を表すもので
ある。The laminarioligosaccharides after the reaction were quantified using high performance liquid chromatography. As a result, laminario oligosaccharides as shown in Table 1 were produced. In addition, the yield in Table 1 represents the yield with respect to glucose-1-phosphate.
比較例１
５０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）中にグル
：＋−スー１−リン酸１００ ｍＭ、 グル：ｌ−，
７，０，５ｍＭ、酵素０．０８９単位／−になるよう反
応液を調製し、３７°Ｃにおいて４８時間反応を行った
。Comparative Example 1 50mM) Glu:+-su-1-phosphate 100mM in Lis-HCl buffer (pH 7,0), Glu:l-,
The reaction solution was prepared to have a concentration of 7.0.5mM and 0.089 units/- of enzyme, and the reaction was carried out at 37°C for 48 hours.
その結果、ラミナリオリゴ糖の生成を高速液体クロマト
グラフィーでは検出できなかった。As a result, the formation of laminarioligosaccharides could not be detected by high performance liquid chromatography.
比較例２
５０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）中にグル
コース−１−リン酸ＩＭ、 グルコース２．５Ｍ。Comparative Example 2 50mM) Glucose-1-phosphate IM in Lis-HCl buffer (pH 7.0), glucose 2.5M.
酵素０．０８９単位／−になるような反応液の調製を試
みたが、溶解度の問題で反応液を調製することができな
かった。An attempt was made to prepare a reaction solution in which the concentration of enzyme was 0.089 units/-, but due to solubility problems, the reaction solution could not be prepared.
比較例３
５０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ）１７．０）中にグ
ルコース−１−リン酸１０ｍＭ、 グルコース２００
ｍＭ。Comparative Example 3 50mM) Glucose-1-phosphate 10mM in Lis-HCl buffer (p) 17.0), Glucose 200mM)
mM.
酵素０．０８９単位／ ｍｅになるよう反応液を調製し
、３７℃において４８時間反応を行った。その結果、平
均重合度２．１のラミナリオリゴ糖を収率７５％で得た
。しかしながら、反応液中の残存グルコース量が生成し
たラミナリオリゴ糖の１０倍以上であった。The reaction solution was prepared to have an enzyme concentration of 0.089 units/me, and the reaction was carried out at 37°C for 48 hours. As a result, a laminarioligosaccharide with an average degree of polymerization of 2.1 was obtained in a yield of 75%. However, the amount of glucose remaining in the reaction solution was 10 times or more the amount of laminario oligosaccharide produced.
比較例４
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）中にグル
コース−１−リン酸８ ｍＭ、 グルコース２０ｍＭ
、酵素０．０８９単位／ｉｔ’になるよう反応液を調製
し、３７°Ｃにおいて４８時間反応を行った。その結果
、ラミナリオリゴ糖の生成を高速液体クロマトグラフィ
ーでは検出できなかった。Comparative Example 4 Glucose-1-phosphate 8mM, glucose 20mM in 50mM Tris-HCl buffer (pH 7,0)
The reaction solution was prepared so that the concentration of enzyme was 0.089 units/it', and the reaction was carried out at 37°C for 48 hours. As a result, the formation of laminarioligosaccharides could not be detected by high performance liquid chromatography.
比較例５
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）中にグル
コース−１−リン酸２Ｍ、 グルコースＩＭ、酵素０
、０８９単位／ｍｌになるような反応液の調製を試みた
が、溶解度の問題で反応液を調製することができなかっ
た。Comparative Example 5 2M glucose-1-phosphate, glucose IM, 0 enzyme in 50mM Tris-HCl buffer (pH 7.0)
, 089 units/ml, but could not be prepared due to solubility problems.
比較例６
実施例１の条件において１５０５０時間反応った。その
結果、平均重合度２．７のラミナリオリゴ糖か収率約５
５％て得られた。したがって、この場合は実施例１の結
果と比較して収率か低下していた。Comparative Example 6 The reaction was carried out under the conditions of Example 1 for 15,050 hours. As a result, the yield of laminarioligosaccharides with an average degree of polymerization of 2.7 was approximately 5.
5% was obtained. Therefore, in this case, the yield was lower than the results of Example 1.
表１
〔発明の効果〕
本発明によれば、容易にラミナリオリゴ糖を製造するこ
とか可能である。これは使用した酵素につき知られてい
る性質からは予想し難いことである。しかも、原料の初
濃度比を変化させることによって各種の重合度のラミナ
リオリゴ糖を製造することが可能である。Table 1 [Effects of the Invention] According to the present invention, it is possible to easily produce laminario oligosaccharides. This is difficult to predict from the known properties of the enzyme used. Furthermore, by changing the initial concentration ratio of the raw materials, it is possible to produce laminario oligosaccharides with various degrees of polymerization.
本発明において得られるラミナリオリゴ糖は、医薬品原
料あるいは食品分野等において有用なものである。The laminario-oligosaccharides obtained in the present invention are useful in the fields of pharmaceutical raw materials, foods, and the like.
Claims (1)
オースホスホリラーゼ及び／又はβ−１、３−オリゴグ
ルカンホスホリラーゼにより処理してラミナリオリゴ糖
を製造するにあたり、前記グルコースの初濃度が１ｍＭ
以上２Ｍ未満であり、グルコース−１−リン酸の使用量
がグルコース１モルに対して０．１モル以上、かつ初濃
度が１０ｍＭ以上２Ｍ未満であり、反応時間が１００時
間以下であり、製造されるラミナリオリゴ糖の平均重合
度が２以上２０以下であることを特徴とするラミナリオ
リゴ糖の製造方法。 ２、酵素がミドリムシ目（Ｅｕｇｌｅｎｉｄａ）に属す
る生物由来のものである請求項１記載の製造方法。[Claims] 1. In producing laminarioligosaccharide by treating glucose-1-phosphate and glucose with laminaribiose phosphorylase and/or β-1,3-oligoglucan phosphorylase, the initial concentration of glucose is 1mM
2M or more, the amount of glucose-1-phosphate used is 0.1 mol or more per 1 mol of glucose, the initial concentration is 10 mM or more and less than 2M, the reaction time is 100 hours or less, and the production A method for producing a laminario-oligosaccharide, characterized in that the average degree of polymerization of the laminario-oligosaccharide is 2 or more and 20 or less. 2. The production method according to claim 1, wherein the enzyme is derived from an organism belonging to the order Euglenida.
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|---|---|---|---|
| JP2175259A JP2955590B2 (en) | 1990-07-04 | 1990-07-04 | Method for producing laminari-oligosaccharide |
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| JPH0466092A true JPH0466092A (en) | 1992-03-02 |
| JP2955590B2 JP2955590B2 (en) | 1999-10-04 |
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| JP2175259A Expired - Lifetime JP2955590B2 (en) | 1990-07-04 | 1990-07-04 | Method for producing laminari-oligosaccharide |
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| JP (1) | JP2955590B2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001079475A1 (en) * | 2000-04-19 | 2001-10-25 | Showa Sangyo Co., Ltd. | Laminaribiose phosphorylase, process for producing the same and process for producing laminarioligosaccharide by using the enzyme |
| WO2010092997A1 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | 国立大学法人三重大学 | Β-1,3-glucan manufacturing method |
-
1990
- 1990-07-04 JP JP2175259A patent/JP2955590B2/en not_active Expired - Lifetime
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| JP2955590B2 (en) | 1999-10-04 |
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