JPH0440367A - 球状分離剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はクロマトグラフィー分離に用いられる分離剤に
関し、さらに詳しくは水系でのクロマトグラフィー分離
に際し、耐圧性、機械的強度にすぐれ、高速分離操作が
可能で、かつ高分離能を有する球状分離剤に関する。

従来水系でのクロマトグラフィー分離操作にはセルロー
ス、アガロース、デキストラン、キトサンなどの天然高
分子を架橋ゲル化させた球状粒子およびポリアクリルア
ミド（共）重合体、ポリビニルアルコール（共）重合体
、親水性ポリアクリル酸エステル（共）重合体などの合
成高分子系架橋球状ゲルが分離剤として用いられてきて
いる。

これら親水性の強い分離剤は、水系での使用に際しては
分離対象物質（基質）と疎水的な相互作用を持たず、非
特異的な吸着を起こしにくいため、基質の回収率が良い
という利点を持っている。しかしながら上記分離剤は親
水性であるがために水による膨潤が激しく、水系での使
用の際、耐圧性、機械的強度が著しく低下してしまい、
高速クロマトグラフィー分離操作が困難になる欠点を有
している。ここで、かかる分離剤をクロマトグラフィー
による分離に使用する時は、通常、粒子の大きな分離剤
を使用し、溶離液流による圧損失をできるだけ小さく抑
え、カラム内に充填された分離剤の変形、破壊を防止し
て、クロマトグラフィー分動操作を可能にしている。し
かしながらクロマトグラフィー分離においては充填され
た分離剤の粒子径が小さくなればなるほど分離能が向上
するのが通常であるので、かかる観点からすると従来の
親水性の強い分離剤は耐圧性、機械的強度の制約から粒
子径を小さくはできず、必然的にその分離能も満足でき
る状態のものではないという欠点も持っている。

これら親水性の強い分離剤の水系での耐圧性、機械的強
度を改善するには架橋密度をあげて、水による膨潤を抑
えてやればよいが、かかる親水性の強い分離剤を用いて
のクロマトグラフィー分離においては分離剤の架橋密度
と分離能のあいだには密接な関係があり、架橋密度が上
がり過ぎると逆に分離能が低下することが知られており
、耐圧性、機械的強度、分離能が同時に改善された分離
剤を得ることは、はなはだ困難であった。

疏水性の強いポリスチレン（共）重合体、ポリアクリル
酸エステル（共）重合体を水系でのクロマトグラフィー
分離操作の分離剤として用いると、耐圧性、機械的強度
については問題はないが、基質との疎水的相互作用が強
く、基質を吸着してしまったり、基質の回収率が悪いな
どの問題がある。

シリカゲルのような無機分離剤は、耐圧性、機械的強度
が大きく、基質との非特異的な相互作用、吸着も起こり
にくいので水系で使用する分離剤として非常に優れたも
のであるが、アルカリ性領域での使用に際しては問題が
あり、広いｐＨ範囲での使用可能性という面では、高分
子系の分離剤におとる欠点がある。

以上述べた如く、従来の水系でのクロマトグラフィー分
離に使用された分離剤はそれぞれ一長一短があり、耐圧
性、機械的強度、耐アルカリ性、分離能などの分離とし
て要求される性能をすべてバランスよく満たすものは無
いといえる状況下、本発明は水系でのクロマトグラフィ
ー分離に適した、耐圧性、機械的強度、耐アルカリ性、
分離能などの諸性能が著しく改善された分離剤を提供す
るものである。

本発明者らは水系でのクロマトグラフィー分離において
分離剤に耐圧性、機械的強度、耐アルカリ性を付与する
には疏水性球状ポリマー担体が適していること、基質と
分離剤との疎水的な相互作用による吸着の制御、基質回
収率の向上には分離剤表面を親水性の化合物で覆ってや
れば良いこと、分離能を改善するには分離剤の粒子径を
小さくすると同時に、分離剤担体とリガンドの間に適当
な長さを持つスペーサーを導入してやれば良いことなど
を見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、アミノ基を導入した疏水性球状ポリ
マー担体に、親水性エポキシ樹脂を化学結合させ、しか
るのち残余のエポキシ基にリガンドを固定化させること
により得られる球状分離剤を提供するものであり、本発
明での球状分離剤は水系でのクロマトグラフィー分離操
作に使用する時、特に有効である。

本発明で使用する疏水性球状ポリマー担体としては、ス
チレンを主成分としクロルメチル化スチレン、ジビニル
ベンゼンを共重合したもの、メチルメタアクリレートも
しくはスチレンを主成分とし、ジビニルベンゼン、グリ
シジルメタアクリレートを共重合したものなど、疏水性
の強いモノマーを使用して、懸濁重合で得られた球状ポ
リマー担体が例示されるが、なかんずく懸濁重合の際に
、七ツマー類には可溶であるが、生成するポリマーには
不熔解である物質、例えば、脂肪族炭化水素、高級脂肪
族アルコール、高級脂肪酸およびそのエステル、アミド
例えばジエチルベンゼン、ラウリル酸メチル等の多孔化
剤をモノマー類の総重量の０．５〜５倍重量、共存させ
て得られる多孔質の球状ポリマー担体が本発明に使用す
るのに最適である。なお、多孔化剤が０．５倍重量より
少ないと、強度的に強いものが得られるが、多孔質化が
不十分で比表面積が小さい担体となって仕舞う。

また、多孔化剤が５倍重量より大きいと、多孔化剤の使
用量の割には、比表面積が大きくならず、強度的に弱い
担体になって仕舞うのが、通常である。

これら疏水性球状ポリマー担体にアミノ基導入するには
クロルメチル化スチレンを共重合した担体は、アンモニ
アで処理することによりアミノ基を導入でき、グリシジ
ルメタアクリレートを共重合して得られた球状ポリマー
担体にアミノ基を導入するには、これら担体に脂肪族ジ
アミン、芳香族ジアミンなどの１分子中に複数個のアミ
ノ基を有する化合物、例えばエチレンジアミン、プロピ
レンジアミン、１．４−ブチレンジアミン、１．’６−
へキサメチレンジアミン、キシリレンジアミンなどを作
用させると、担体上のオキシラン環との反応が容易に起
き、担体にアミノ基を導入できる。

また担体にアミノ基を導入するには、アミノ基含有モノ
マー例えばビニルアミン、２−アミノエチルメタアクリ
レートなどを懸濁重合時に共重合させてもよい、また疏
水性球状ポリマー担体として、無孔質、多孔質いずれの
ものも使用することができる。担体へのアミノ基の導入
量は、アミノ基量が以後のりガントの固定化量を決定す
るので、できるだけアミノ基を多量に導入することが望
ましい、導入後の担体の強度、導入方法の容易さなどを
考慮した場合、０．０１ｍｅｑ／ｇｒ〜５．Ｏｍｅｑ／
ｇｒの導入量が実際的である。

アミノ基を導入した疏水性球状ポリマー担体と化学結合
させる親水性エポキシ樹脂として、ポリエチレングリコ
ールジグリシジルエーテル（なお、ポリエチレングリコ
ール単位の重合度は２〜３０程度が望ましい、）ポリプ
ロピレングリコールジグリシジルエーテル（ポリプロピ
レングリコール単位の重合度は２〜３０が望ましい、）
ポリグリセリンポリグリシジルエーテル、ソルビトール
ポリグリシジルエーテルが例示されるが、水溶性であり
、分子量に多孔質担体の孔内に拡散していくことができ
るエポキシ樹脂であればここに例示したちの以外のもの
も使用できる。

以上のごとく、親水性のエポキシ樹脂の一種類以上を、
アミノ基を導入した疏水性球状ポリマーと接触させ、８
０〜１００℃で３時間程度加熱してやると、容易にエポ
キシ樹脂のエポキシ基と、担体上に導入されたアミノ基
との反応が起き、化学結合せしめることができ、疏水性
球状ポリマーの表面に親水性のエポキシ樹脂層を形成で
きる０通常、このエポキシ樹脂層には未反応のエポキシ
基が残っているので、このエポキシ基に所望のりガント
を反応させることにより、リガンドの固定化が可能であ
る。すなわち、このエポキシ基を用いて、アミノ基、カ
ルボキシル基、ヒドロキシル基などの活性水素を有する
官能基を持つリガンドを固定化できるのである。

水系の溶離液を用い、クロマトグラフィー分離を行う例
として配位子交換クロマトグラフィー法があるが、これ
に用いられる分離剤としてアミノ酸とくにＬ−プロリン
（もしくはＤ−プロリン）を担体に固定化したものが用
いられている。従来の当該分離法に用いられてきた分離
剤は前述したように耐圧性、機械的強度、耐アルカリ性
、非特異的吸着性などクロマトグラフィー分離剤として
要求される諸性能に一長一短があり、必ずしも満足のい
くものでは無かった０本発明に従って製造した配位子交
換クロマトグラフィー用分離剤は、従来の当該分離法に
用いられた分離剤と比較して、基質の担体に対する非特
異的な吸着が起こりにくくなっていること、親水性のエ
ポキシ樹脂が適当な長さのスペーサーになっていること
、水系での使用でも十分な耐圧性、機械的強度を持って
いるため溶離液流による圧力損失での分離剤の変形、破
壊が起きないなどの理由により、優れた分離能を持って
いる。

また水系の溶離液を用いるクロマトグラフィーとして、
蛋白質などの分離、精製が代表的であるが、これに用い
る分離剤としても、本発明による分離剤は、蛋白質と分
離剤間の疏水性相互作用に基づく非特異的吸着が少なく
、かつスペーサー効果によると考えられる分離能の向上
も達成されており、優れたものになっている。

以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する
。

［疎水性球状ポリマー担体の合成］ （１）メチルメタアクリレート４０重量部、ジビニルヘ
ンガフ４０重量部、グリシジルメタアクリレート２０重
量部、ベンゾイルパーオキシド１．０重量部、多孔化剤
としてラウリル酸メチル１００重量部からなる原料溶液
を、ポリビニルアルコール１．５重量％水溶液５００重
量部に分散させた。攪拌下８５°Ｃで８時間重合を行っ
た後、球状ポリマーを濾過により分離し、よく水洗した
。多孔化剤をアセトンで抽出し、多孔質の疎水性球状ポ
リマー担体を得た。

（以後、担体ｌと称する。） （２）スチレン４０重量部、ジビニルベンゼン４０！量
部、グリシジルメタアクリレート２０重量部、ベンゾイ
ルパーオキシド１．０重量部、多孔化剤としてジエチル
ベンゼン７０重量部、イソオクタン３０重量部からなる
原料溶液を、ポリビニルアルコール１．５重量％水溶液
５００重量部に分散させた。攪拌下８５℃で１２時間重
合を行った後、球状ポリマーを濾過により分離し、良く
水洗した。多孔化剤をアセトンで抽出し、多孔質の疎水
性球状ポリマー担体を得た。（以後、担体２と称する。

）［疎水性球状ポリマー担体へのアミノ基の導入］（１
）　１００ｄ共栓付き三角フラスコに、担体１をｌ。

ｇ、テトラヒドロフラン２０ｄ、エチレンジアミン１０
ｇを秤取し、マグネチックスクーラーでの攪拌下、６０
°Ｃで８時間の反応を行った０反応終了後、濾過、洗浄
を行い、アミノ基の導入された疎水性球状ポリマー担体
を得た。アミノ基が０．７ｓｅｑ／　ｇ導入されていた
（これを担体３とする）。

（２）担体２についても、　（１）と同様にしてエチレ
ンジアミンを反応させ、アミノ基の導入された疎水性球
状ポリマー担体を得た。アミノ基が０．８■ｅｑ／ｇ導
入されていた（これを担体４とする）。

［親水性エポキシ樹脂とアミノ基を導入した疎水性ポリ
マー担体との化学結合法］ ブナコールＥＸ８３０（ポリエチレングリコールジグリ
シジルエーテル）５ｇを、水１０−に溶解し、しかる後
アミノ基の導入された疎水性球状ポリマー５ｇ（担体３
）を加え、８０°Ｃで５時間反応させた０反応後、ポリ
マー担体を濾過でとりだし、洗浄を行い、未反応の親水
性エポキシ樹脂などを洗い出した。担体上に０．６ｓｅ
ｑ／ｇｒのエポキシ基が導入されていた。

実施例１ 前述した工程を経て得られた親水性エポキシ樹脂が化学
結合で固定化されている担体３を２ｇ、共栓付き三角フ
ラスコにとり、これにし−プロリン０．５ｇ、）リエチ
ルアミン０．５ｇ、水１０Ｊｄを加え、マグネチシクス
クーラーの攪拌下６０°Ｃで３時間反応を行った。充分
な洗浄後、固定化されていたＬ−プロリンを測定したと
ころ、０．４ｓｅｑ／ｇｒのＬ−プロリン（リガンド）
が担体上に固定化されており、配位子交換クロマトグラ
フィー用の球状分Ｍ割が得られた。

実施例２ 親水性エポキシ樹脂が化学結合で固定化されている担体
４についても、実施例１と同じ反応条件でＬ−プロリン
をリガンドとして固定化し、配位子交換クロマトグラフ
ィー用の球状分離剤を得た。

固定化されたし一プロリンは、０．３４ｓｅｑ／ｇｒで
あった。

比較例１ Ｉ旦体ｌにも、グリシジルメタアクリレートにもとづく
エポキシ基が残っているので、これをそのまま用いてＬ
−プロリンの固定化を試みた。Ｌ−プロリンの固定化反
応条件は実施例と同じにした、得られた配位子交換クロ
マトグラフィー用の球状分離剤は、Ｌ−プロリンの固定
化反応が実施例１はと進まず、実施例１の１／３程度の
量のし−プロリンが固定されたにすぎなかった。

比較例２ 市販されている配位子交換クロマトグラフィー用分離剤
（ｍ品名二ＣＨＩＲＯ３ＯＬＶＥ　　ＪＰＳ　　ＣＨＩ
ＭＩＥ社製）を入手し、実施例との比較試料とした。こ
れはアクリルアミド、Ｎ−メナロール化アクリルアミド
、架橋性上ツマ−を共重合し、さらにＬ−プロリンを固
定化した親水性球状ゲルである。

［評価結果］ 各配位子交換クロマトグラフィー用分離剤を下表の項目
について評価を行った。

第１表 ＊耐圧性は霧ｆｆｉ／ｓｉｎで表示した。

（評価結果説明　） 耐圧性：比較例２の従来品は、溶離液量を０．５＠１／
ｗｉｎ以上にすると、それによる液圧の為押し潰され、
カラムの閉塞が起きる。

実施例１．２の本発明は、溶離液流量を１０ｍ１／ｗｉ
ｎ以上にしても、カラムの閉塞は起きず高速クロマト分
離が可能である。

分離能；比較例２の従来品は、カラム内で充填剤が変形
しているためか、分離能が悪い。

なお、比較例１は、担体に直接リガンドの固定化が十分
進まず、リガンド固定化量が少ない、そのため、分離能
は実施例１．２の本発明品より迩かに劣っているのであ
る。

評価方法： 耐圧性評価法：上記カラムにスラリー法にて各分離剤を
充填する時、分離剤が液圧 で押し潰され、カラムの閉塞が起 きる時の液流量。

（単位：ｆｆ１Ｉ！／ｓ＋ｉｎ、、） 〉１０は１０ｄ／＋ｉｉｎ以上のｗＬ流量でも、分離剤
は押し潰されずカラム の閉塞が起きないことを示す。

分離能評価法： 液体クロマトグラフィーによる、Ｄ。

Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン （通称ＤＯＰＡ　）の光学分割を行い、各分離剤の分離
能を比較した。クロマ グラフィーのピークは第１図に示した ごとくである。

カラム：　４．６ｗΦ×１５０１１１Ｌステンレスカラ
ム分離剤径：３７〜７４μ謝 溶離液：（１５ｍＭ酢酸＋０．６ｍＭ酢酸ｗ４）／Ｌ溶
液 分離能 ＲＬ　　ｊ　ＲＬ　　”　ｔＢ／　ｔ□Ｒｈ　　：　（
ｈ＋＋　ｈｔ　　２　ｈｖ）／（ｈ＋＋ｈ＊　）Ｒ８：
分離度　Ｒｓ　＝２（ｔ　、ｔ　　Ｌ　＊１）／（ｗ＋
＋Ｗｔ） （なお、Ｗ６、Ｗ、はそれぞれ ０体、Ｌ体のピーク中を示す） 結果を第１表に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例における０ＤＰＡ分離のクロマトチャー
トを示す。 図面 箪１図 ［

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ基を導入した疏水性球状ポリマー担体に、
   親水性エポキシ樹脂を化学結合させ、しかるのち残余の
   エポキシ基にリガンドを固定化させることにより得られ
   る球状分離剤。