JPH04288097A - Ｈｃｖ非構造領域のペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス遺伝子の非構造領域にコー
ドされるタンパク質の抗原部位の一部に一致するペプチ
ドに関し、本発明のペプチドはＣ型肝炎ウィルスに対す
る抗体の検出、ならびにＣ型肝炎ウィルス遺伝子の非構
造領域にコード化されるタンパク質のポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体を得る目的で哺乳動物に投与さ
れる免疫原等に利用される。

［従来の技術］ われわれの住んでいる地球上にはさまざまなウィルスが
存在している。人類は、輸血という手段を用いてお互い
に生命を維持することがある。現在まで、この輸血によ
って肝炎が発症した例は数多い。Ｂ型肝炎ウィルス（以
下ＨＢＶと略す）もその原因となっていた。しかし、Ｈ
ＢＶの存在の有無を検出する検査試薬が開発され、輸血
前にＨＢＶの存在を確認することができるようになり、
輸血によるＨＢＶ感染者はなくなった。

ところがＡ型肝炎ウィルス（以下ＨＡＶと略す）やＨＢ
Ｖが原因と考えられない肝炎の発生源を確認する事がで
きなかった。ところが、Ｃｈｏｏ，Ｑ−Ｌ．らの文献（
Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：３５９−３６２，１９８９）
およびＫｕｏ，Ｇ．らの文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４
：３６２−３６４，１９８９）によって、非Ａ非Ｂ型肝
炎ウィルスの存在が明らかにされた。これを彼らはＣ型
肝炎ウィルス（以下ＨＣＶと略す）と呼んだ。

ＨＣＶはヒトとチンパンジーにのみ感染することが以前
から明らかになっていた。非Ａ非Ｂ型肝炎患者に投与さ
れた血液凝固第ＶＩＩＩ因子製剤と同じ血液凝固第ＶＩ
ＩＩ因子製剤をチンパンジーに投与し、非Ａ非Ｂ型肝炎
を発症させた。さらにその肝臓からの抽出物を別のチン
パンジーに投与し、同様に非Ａ非Ｂ型肝炎を発症させ、
このチンパンジーの血漿を抽出した。そして、その血漿
をさらに別のチンパンジーに投与し、非Ａ非Ｂ型肝炎の
発症を確認した。この発症が確認された血漿をフラビノ
ウィルスと想定したウィルス粒子の濃縮操作（Ｂｒａｄ
ｌｅｙ，Ｄ．Ｗ．らＧａｓｔｒ−ｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇ
ｙ　８８：７７３−７７９，１９８９参照）を行い、Ｒ
ＮＡを抽出した。ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、λｇｔ
１１ライブラリーを作製した。これを回復期のチンパン
ジー血清や非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清を用いてスクリ
ーニングを行い、反応するクローンの選択を行った。そ
の結果、５−１−１というクローンのみがＨＣＶに由来
するｃＤＮＡ断片だった。

以上の操作は、特公表平２−５００８８０（国際公開番
号ＷＯ８９／０４６６９）に記載されており、遺伝子配
列も明かなものとなった。この中で彼らはＨＣＶ抗体の
検出は、５−１−１を含むヒトスーパーオキシドディス
ムターゼ遺伝子の一部との融合タンパクとして酵母で発
現させたの組換タンパクＣ−１００−３（以下Ｃ−１０
０−３と略す）を用いている。

５−１−１はＨＣＶの非構造タンパク質であり、コアや
エンベロープを構成するタンパク質ではない。

それゆえ、Ｃ−１００−３領域に対する抗体は感染から
３ヶ月から６ヶ月以上しないと検出されない。

また、発症しても抗体が検出されなくなる場合もある。

Ｃ−１００−３を用いた分析では非Ａ非Ｂ型肝炎を発症
した患者の７０％程度しか抗体を検出できていない。ま
た、ヒトスーパーオキシドディスムターゼの一部を含む
ためにこれに対する非特異的な反応が生ずる。したがっ
て、より特異性を高めた、非特異反応のないＨＣＶ抗原
を提供する必要がある。

［発明が解決しようとする課題］ 従来のＣ−１００−３抗原を用いたＨＣＶ抗体の分析で
はＨＣＶに感染した患者の７０％程度しか検出すること
ができず、さらには非特異的な反応が生じる怖れがある
。

本発明は、ＨＣＶ感染患者の血清中に存在する抗ＨＣＶ
抗体の検出に用いることができるＨＣＶの非構造領域の
抗原部位に相当するペプチドを提供することを目的とす
る。

［課題を解決する手段および作用］ 発明者は、Ｎａｔｕｒｅ　３０２：４９０−４９５，１
９８３でＧｅｏ−ｆｆｒｅｙ　Ｒｓが合成したペプチド
が抗ＨＣＶ抗体に抗原性を持つことが明らかにされてい
ることにもとずき、従来例で明らかになったＨＣＶの非
構造領域遺伝子配列からそのアミノ酸配列を求め、これ
をもとにして、ホップとウッズの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７８，Ｎ
ｏ．６，ｐｐ３８２４−３８２８，１９８１）を用いて
、各アミノ酸の親水性値に基づき抗原性を強く持つ部分
を予測した。その結果に基いて、アミノ末端からカルボ
キシ末端の方向を左から右へ記した下記式のアミノ酸配
列で表現されるｍｏｋｋ−１、ｍｏｋｋ−２、ｍｏｋｋ
−３、ｍｏｋｋ−４、ｍｏｋｋ−５、ｍｏｋｋ−６、ｍ
ｏｋｋ−７、ｍｏｋｋ−３３を合成した。そして、これ
らのペプチドをＨＣＶと診断された患者の検体を用いて
抗原性を確認した。上記ｍｏｋｋ−１からｍｏｋｋ−２
３までの８種類のペプチドのアミノ酸配列は次のとおり
である。下記式中、記号は次のように定義した。

本発明のペプチドは上式のアミノ酸配列で特定される８
種のペプチドであるが、その類似物および上記各式で特
定されるアミノ酸配列のうち少なくとも６個のアミノ酸
からなる配列に一致するペプチドも本発明の範囲である
。これは、抗原決定基の最小のサイズが６個のアミノ酸
からなる配列であることに由来する（Ｉｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍ−したがって上式のアミノ酸配列式の一部であって
も、６個以上の連続したアミノ酸からなる配列からなり
、上式のペプチドと交差反応性（ｃｒｏｓｓ　ｒｅａｃ
ｔｉｖｅ）を有するペプチドは本発明に含まれる。

上式のアミノ酸配列で特定されるペプチドの類似物は、
上式中の１または複数のアミノ酸が別のアミノ酸に置換
されたもの、削除されたもの、および上式中のアミノ酸
配列中のアミノ酸に１または複数のアミノ酸が付加され
たものであって、上式のペプチドと交差反応性を有する
ペプチドである。交差反応性を有するかどうかは、アミ
ノ酸配列の３次元構造に起因するＨＣＶに対する抗体に
対する免疫反応性をテストすることで確認することがで
きる。

本発明のペプチドは支持体に固相化してＨＣＶ抗原に対
する抗体の分析を行うことができる。

支持体としてはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、分子量
５万から１０万程度のポリペプチド、マイクロプレート
のウェル、直径０．１μｍから６ｍｍ程度のポリスチレ
ンボールなどがあげられる。

［実施例］ ペプチドの構造 第１図に示したＨＣＶの非構造領域のアミノ酸の配列を
もとにその抗原部位をＨｏｐｐ　ＴＰのＰｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ　７８：３８２４−３８２８，
１９８１に示されている方法で算出した。各アミノ酸に
固有の親水性値を与えて、第１図のアミノ酸配列中の連
続する６個のアミノ酸の親水性値を合計し、その６個の
アミノ酸からなるペプチドの抗原性を示す親水性値とす
る。この操作を第１図に示すＨＣＶの一次構造のアミノ
酸すべてについて行った。結果を第２図に示した。図中
、横軸はアミノ酸の位置を表わし、縦軸は連続する６個
のアミノ酸からなるペプチドの親水性値を表す。親水性
値の高さに抗原性は比例する。

本発明のｍｏｋｋ−１からｍｏｋｋ−３３、および、比
較の為に用いたＣ−１００−３の各ペプチドのアミノ酸
位置は以下の通りである。

抗原部位を予測する他の方法としては、ＪａｃｋＫのＭ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ　１５７：１０５，１９８２に示されて
いるＨｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ＶａｌｕｅやＡｌａｎ　Ｍ
ｓのＳｃｉｅｎｃｅ　２２７，：４２９，１９８５に示
されているＡｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ　Ｖａｌｕｅなど
を用いても良い。

親水性値を用いた場合の計算の結果を第２図（Ａ）から
第２図（Ｍ）に示す。その結果、抗原性が高いと予測さ
れるＨＣＶの非構造領域に位置するペプチドｍｏｋｋ−
１、ｍｏｋｋ−２、ｍｏｋｋ−３、ｍｏｋｋ−４、ｍｏ
ｋｋ−５、ｍｏｋｋ−６、ｍｏｋｋ−７、ｍｏｋｋ−３
３のアミノ酸配列を選択した。

前記ＨＣＶの非構造領域のペプチドを以下に示す方法で
合成した、ペプチドの合成は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ　４３０Ａ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｚｅｒを用い、ｔ−Ｂｏｃアミノ酸の対称性無水
物で合成を行った。

つぎに、アニソール・ジメチルサルファイド・パラチオ
クレゾール内に溶かした合成ペプチドを０−５℃のフッ
化水素酸の存在下で、１時間反応させて脱保護を行った
。この方法は、Ｓ．ＳａｋａｋｉｂａｒａによるＢｕｌ
ｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．４０：２１６４，１９
６７に示されている方法である。この粗結晶を２Ｎ酢酸
に溶解して抽出し、凍結乾燥した。これをＳＩＳＥＩＤ
Ｏカプセルパック　Ｃ１８　ＳＧ１２０直径４６ｍｍ長
さ２５０ｍｍを用い、純水中に０．１％Ｔｒｉｆｌｕｏ
ｒａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＴＦＡ）と５％ＣＨ３ＣＮ
が含まれる溶液と、純水中に０．１％ＴＦＡと５０％Ｃ
Ｈ３ＣＮが含まれる溶液を流量１２ｍｌ／ｍｉｎでグラ
ディエントをかけることによって精製した。

このときのｍｏｋｋ−３のクロマトグラフを第３図（Ａ
）に示す。ピーク１７が本発明の合成ペプチドである。

これを分取し、さらに精製したものを分析したクロマト
グラフを第３図（Ｂ）に示した。

この精製に使用したカラム、精製条件も上記と同じであ
る。

ＥＬＩＳＡ　ＰＬＡＴＥの作製 ｍｏｋｋ−１〜ｍｏｋｋ７、ｍｏｋｋ−３３の８種のＨ
ＣＶペプチドを以下の手順で９６穴マイクロプレート底
面に固定化した。

０．１５Ｍ　ＮａＣｌ　０．０１Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４−
ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液（ＰＢＳ）ＰＨ７．０、４μｇ／
ｍｌのＨＣＶペプチドをＮＵＮＣ社９６ウェルＥＬＩＳ
Ａ　ＰＬＡＴＥ　６８６６７に１ウェルあたり１００μ
ｌずつ分注し、３７℃で６０分反応させた。

前記の溶液を除去後、０．０１Ｍ　ＰＢＳ　ＰＨ７．０
で３回洗浄した。洗浄液を除去後、０．１％ゼラチン０
．０１Ｍ　ＰＢＳ　ＰＨ７．０を１ウェルあたり３００
μｌずつ分注し、３７℃で６０分反応させた。さらに前
記の溶液を除去後、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　０．
０１Ｍ　ＰＢＳ　ＰＨ７．０で３回洗浄した。そして２
５℃で６時間乾燥後４℃で検体分析時まで保存した。

ｍｏｋｋ−２とｍｏｋｋ−３を１：１に混合したペプチ
ドの混合物は次の方法で作成した。

０．１５Ｍ　Ｎａｃｌ　０．０１Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４　
−ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液（ＰＢＳ）ＰＨ７．０、に２μ
ｇ／ｍｌのペプチドｍｏｋｋ−２と２μｇ／ｍｌのｍｏ
ｋｋ−３を１：１に混合し、ＮＵＮＣ社９６ウェルＥＬ
ＩＳＡ　ＰＬＡＴＥ　６８６６７に１ウェルあたり１０
０μｌずつ分圧し、３７℃で６０分反応させた。前記の
溶液を除去後、０．０１Ｍ　ＰＢＳ　ＰＨ７．０で３回
洗浄した。洗浄液を除去後、０．１％ゼラチン０．０１
Ｍ　ＰＢＳ　ＰＨ７．０を１ウェルあたり３００μｌず
つ分注し、３７℃で６０分反応させた。さらに前記の溶
液を除去後、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　０．０１Ｍ
　ＰＢＳ　ＰＨ７．０で３回洗浄した。そして２５℃で
６時間乾燥後４℃で検体分析時まで保存した。

検体の分析 ＨＣＶ患者で慢性肝炎、肝硬変検体、肝癌検体２０検体
を選出して上で作製したＨＣＶペプチドを固相化したＥ
ＬＩＳＡ　ＰＬＡＴＥで次のような手順で分析を行った
。

各検体を０．０１％　ＢＳＡ　０．０５％　Ｔｗｅｅｎ
２０　０．０１　ＭＰＢＳ　ＰＨ７．０で５０希釈して
各ウェル１００μｌ分注して３７℃で６０分反応させた
。反応後、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　０．０１Ｍ　
ＰＢＳ　ＰＨ７．０で５回洗浄後、洗浄液を除去して０
．１μｇペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を３７
℃６０分反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０　０．０１Ｍ　ＰＢＳ　ＰＨ７．０で５回洗浄後、洗
浄液を除去して０．０２３％過酸化水素水、０．００５
％０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）０．１Ｍクエン酸
−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液を１００μｌ分圧して３７℃、
３０分反応させた。反応後、５Ｎ硫酸を５０μｌ添加し
て反応を停止させ、４９１ｎｍのプレートリーダーで吸
光度を測定した。

検体分析の結果 ｍｏｋｋ−１、ｍｏｋｋ−２、ｍｏｋｋ−３、ｍｏｋｋ
−４、ｍｏｋｋ−５、ｍｏｋｋ−６、ｍｏｋｋ−７、ｍ
ｏｋｋ−２＋ｍｏｋｋ−３、ｍｏｋｋ−３３のＥＬＩＳ
ＡＰＬＡＴＥでの分析結果を第４図に示す。その判定結
果を第５図に示す。第５図の＋は陽性、−は陰性を示す
。第４図、第５図の数値は、ＥＩＡリーダのＯＤ値であ
る。ＣＵＴ　ＯＦＦ値は、本ＥＬＩＳＡで健常人集団の
血清を分析した場合に陰性と判断する基準値である。Ｃ
ＵＴ　ＯＦＦ値よりも分析値が高い場合に陽性と判定し
、ＣＵＴ　ＯＦＦ値以下の分析値を示した場合に陰性と
判定する。本発明では、健常人集団２０検体の血清を用
いてその設定を行った。検体番号１から５は陰性検体で
ある。

検体番号６から１８は慢性肝炎で肝硬変、肝癌を含む検
体である。検体番号６から１８の検体はＣ−１００−３
のペプチドで陽性を示した検体である。

ｍｏｋｋ−２およびｍｏｋｋ−３の領域が高い検出率を
示した。ｍｏｋｋ−２とｍｏｋｋ−３を１：１に混合し
たｍｏｋｋ−２＋ｍｏｋｋ−３は、ｍｏｋｋ−２、ｍｏ
ｋｋ−３ペプチド単独で用いたものより検体の陽性判定
率が高かった。ｍｏｋｋ−３３については、第４図およ
び第５図からｍｏｋｋ−３３がＣ−１００−３の分析デ
ータと一致した。したがって、ｍｏｋｋ−３３がＣ−１
００−３の抗原部位と一致する。Ｃ−１００−３のよう
な抗原部位を用いなくてもｍｏｋｋ−３３を用いればＨ
ＣＶ抗体陽性者を簡単に検出することができる。さらに
読み取れるＯＤ値も高く検出の性能もＣ−１００−３に
比べ高い。

［発明の効果］ 本発明によるＣ型肝炎ウィルスの非構造領域の抗原部位
に位置するペプチドを用いることによって、ＨＣＶ抗体
陽性者を見つけだすことができる。ＨＣＶ抗体陽性者の
検体を本ペプチドでスクリーニングすることにより輸血
による肝炎の発症を防止することができ、人類にとって
非常に有用な診断薬となる。

【図面の簡単な説明】

第１図（Ａ）から第１図（Ｄ）は、ＨＣＶの非構造領域
におけるアミノ酸配列であり、第２図（Ａ）から第２図
（Ｍ）は、ＨＣＶの抗原部位を予測するための親水性値
を示したグラフであり、第３図（Ａ）は、化学合成した
ｍｏｋｋ−３の精製前のクロマトグラムであり、第３図
（Ｂ）は、化学合成したｍｏｋｋ−３の精製後のクロマ
トグラムであり、第４図は、検体の各ＥＬＩＳＡ　ＰＬ
ＡＴＥによる分析結果であり、第５図は、検体の各ＥＬ
ＩＳＡ　ＰＬＡＴＥによる判定結果である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｃ型肝炎ウィルスに対する抗体に反応性を
   有し、下記（ａ）から（ｋ）で特定されるアミノ酸配列
   の一部または全体に一致する少なくとも６個のアミノ酸
   を含むペプチドのグループから選択されることを特徴と
   するペプチド、 （ｉ）蛋白質の３次構造に起因するＣ型肝炎ウィルスの
   抗体に対する免疫反応性が維持される範囲内で上記（ａ
   ）から（ｈ）の１または複数のアミノ酸を置換、削除、
   または付加されたペプチド。 （ｊ）蛋白質の３次構造に起因するＣ型肝炎ウィルスの
   抗体に対する免疫反応性が維持される範囲内で上記（ａ
   ）から（ｉ）のペプチドを２個以上化学的に合成したも
   の。 （ｋ）特許の請求範囲（ａ）から（ｊ）のペプチドを２
   個以上混合したもの。