JP7533898B2 - 血中半減期の向上のための抗体Ｆｃ変異体 - Google Patents

Description

本発明は、血中半減期が向上した新規な抗体Ｆｃ変異体及びその製造方法に関する。

全世界的に遺伝子組換え、細胞培養などの生命工学技術の発達に伴ってタンパク質の構造と機能に対する研究が活発に行われてきている。これは、生命現象に対する理解を高めるだけでなく、各種疾病の発病機作を糾明する上で決定的な役割を果たすことにより、効果的な疾病診断と治療の道を拓き、生活の質を向上させるのに大きく寄与している。特に、１９７５年にＢ細胞（Ｂ Ｃｅｌｌ）と骨髄癌細胞（Ｍｙｅｏｌｏｍａ ｃｅｌｌ）を融合して単一クローン抗体を生産するハイブリドーマ技術（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が開発（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７，１９７５）されながら、癌、自己免疫疾患、炎症、心血管疾患、感染などの臨床分野において治療用抗体を用いた免疫治療（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）に対する研究開発が活発に行われている。

治療用抗体は、既存の低分子薬物に比べてターゲットに非常に高い特異性を示し、生体毒性が低く、副作用が少ないだけでなく、約３週の優れた血中半減期を有することから、最も効果的な癌治療方法の一つとされている。実際に全世界の大手製薬会社と研究所で癌発病因子をはじめとする、癌細胞に特異的に結合して効果的に除去する治療用抗体の研究開発に拍車をかかっている。治療用抗体医薬品の開発企業は、ロシュ、アムジェン、ジョンソンエンドジョンソン、アボット、ビーエムエスなどの製薬企業が主流であり、特に、ロシュは、坑癌治療目的のハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）などが代表商品であり、この３種の治療用抗体をもって２０１２年には世界市場で約１９５億ドルの売上げを達成するなど、大きな利回りを上げている他、世界の抗体医薬品市場をリードしている。レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）を開発したジョンソンエンドジョンソンも、売上げの増加で世界抗体市場において急成長しており、アボットとビーエムエスなどの製薬企業も最終開発段階の治療用抗体を多数保有していることが知られている。その結果、低分子医薬品が主流だった世界製薬市場において、疾病ターゲットに特異的であるとともに副作用の低い治療用抗体を含むバイオ医薬品が急速にそのシェアを広げていっている。

抗体のＦｃ部位は、免疫白血球又は血清補体分子を募集し、癌細胞又は感染した細胞のような損傷された細胞が除去され得るように働く。Ｃγ２及びＣγ３ドメインの間のＦｃ上の部位は新生（ｎｅｏｎａｔａｌ）受容体ＦｃＲｎとの相互作用を媒介し、その結合は、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）から血流（ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ）へ細胞内移入された抗体を再循環させる（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１－２２０；Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：７３９－７６６）。この過程は、全長ＩｇＧ（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ＩｇＧ）抗体分子の巨大なサイズに起因して腎臓濾過（ｋｉｄｎｅｙ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）による体内除去減少と関連付けられ、１週～３週範囲の有利な抗体血清半減期（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）を有する。また、ＦｃＲｎに対するＦｃの結合は、抗体運搬においても重要な役目を担当する。したがって、Ｆｃ部位は、細胞内輸送（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）及びリサイクル機作によって抗体が循環して延長された血清持続性（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｓｅｒｕｍ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ）を維持するのに必須の役割を果たす。

治療剤として抗体又はＦｃ融合タンパク質の投与は、半減期の特性を考慮して、定められた頻度の注射を必要とする。生体内でより長い半減期は、より低い頻度の注射又はより少ない投与量を可能にするという明白な長所がある。このため、現在進行されている多くの臨床研究において、抗体の半減期を増加させるためにＦｃ部位に突然変異を導入したり、ＡＤＣＣ効果を極大化させるために変異を導入したＦｃドメインを用いた次世代坑癌抗体治療剤や坑癌タンパク質治療剤の開発に多くの努力を注いでいる（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１５／ Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｒｅｕｔｅｒｓ）。

しかしながら、上記研究陣はＦｃドメインに一部の突然変異を導入し、増加したＦｃＲｎ結合親和性及び生体内半減期を有する一部のタンパク質及び抗体を見出すために努力しているものの、まだ生体内半減期を大きく向上できずにいるのが現実であり、より最適化した突然変異を導入した抗体の開発が切実に望まれている。

上記の背景技術として説明された事項は、本発明の背景に関する理解増進のためのものに過ぎず、この技術分野における通常の知識を有する者に既に知られた従来技術に該当することを認めるものとして解釈されてはならない。

本発明者らは、既存のタンパク質又は抗体治療剤の体内半減期を効率的に増加させるために鋭意努力した。その結果、野生型Ｆｃドメインの一部のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列に置換して最適化することによって、タンパク質又は抗体治療剤の優れた活性を保有しながら血中半減期を極大化させることができる方法を確認し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、ヒト抗体Ｆｃドメインのアミノ酸配列のうちの一部が他のアミノ酸配列に置換されたＦｃ変異体を含むポリペプチドを提供することにある。

本発明の他の目的は、前記ポリペプチドを含む抗体を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記ポリペプチドをコードする核酸分子を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記核酸分子を含むベクターを提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記ベクターを含む宿主細胞を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記ポリペプチド、抗体、核酸分子又はベクターを含む組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記ポリペプチド又は抗体の製造方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記ポリペプチドのスクリーニング方法を提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によってさらに明確になるだろう。

本発明の一態様によれば、本発明は、ヒト抗体Ｆｃドメインのアミノ酸配列の一部が他のアミノ酸配列に置換されたＦｃ変異体を含むポリペプチドを提供する。

本発明の他の態様によれば、本発明は、ヒト抗体Ｆｃドメインのアミノ酸配列の一部が他のアミノ酸配列に置換されたＦｃ変異体を含むポリペプチドを含む抗体又はタンパク質治療剤の血中半減期（Ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）増加用の組成物を提供する。

本発明者らは、既存のタンパク質又は抗体治療剤の体内半減期を効率的に増加させるための方法として、野生型Ｆｃドメインの一部のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列に置換及び最適化してＦｃ変異体を製造することによって、これを含むタンパク質又は抗体治療剤の半減期を極大化できる方法を見出そうとした。

抗体は特定抗原に特異的に結合を示すタンパク質であり、天然抗体は通常、２個の同じ軽鎖（Ｌ）及び２個の同じ重鎖（Ｈ）で構成された、約１５０，０００ダルトンのヘテロダイマー糖タンパク質である。

本発明で用いられるヒト抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５個の主要クラスがあり、好ましくはＩｇＧである。抗体のパパイン分解は２個のＦａｂ断片と１個のＦｃ断片を形成し、ヒトＩｇＧ分子において、Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６のＮ－末端をパパイン分解することによって生成される（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０：２３６１－２３７０，１９８１）。

抗体Ｆｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＧ抗体のＦｃドメイン、或いはそれらの変形であり得る。一実施態様においては、前記ドメインはＩｇＧ抗体のＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体のＦｃドメイン）である。一実施態様においては、前記ＦｃドメインはＩｇＧ１Ｆｃドメイン（例えば、抗ＨＥＲ２抗体のＦｃドメイン、好ましくはトラスツズマブのＦｃドメイン、より好ましくは配列目録第２８配列のＦｃドメイン）であり得る。本発明のＦｃドメインを含むポリペプチドは、ポリペプチドの一部又は全部が糖化していなくても糖化していてもよい。また、ポリペプチドに、Ｆｃドメインに加えて、抗体に由来する一つ以上の領域が含まれてもよい。さらに、前記ポリペプチドには抗体由来の抗原結合ドメイン（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）が含まれてもよく、複数のポリペプチドが抗体又は抗体型タンパク質を形成してもよい。

本明細書において抗体Ｆｃドメインのアミノ酸残基番号は、当業界で通常用いられるカバットのＥＵナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）に従う（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ” ５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１におけるようなＥＵ指数番号）（ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ａｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）と同じ意味）。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の置換されたＦｃ変異体は、カバットのＥＵナンバリングシステムに従うＭ４２８Ｌのアミノ酸置換を含む。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の置換されたＦｃ変異体は、カバットのＥＵナンバリングシステムに従う下記のアミノ酸置換を含む：ａ）Ｍ４２８Ｌ；及びｂ）Ｑ３１１Ｒ又はＬ３０９Ｇ。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の置換されたＦｃ変異体は、カバットのＥＵナンバリングシステムに従うＰ２２８Ｌ及びＭ４２８Ｌのアミノ酸置換を含む。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の前記Ｐ２２８Ｌ及びＭ４２８Ｌアミノ酸置換を含むＦｃ変異体は、カバットのＥＵナンバリングシステムに従う２３４、２６４、２６９、２９２、３０９、３４２、３５９、３６４、３６８、３８８、３９４、４２２、４３４及び４４５番のアミノ酸からなる群から選ばれる１つ以上の更なるアミノ酸置換を含む。

前記更なるアミノ酸置換は、Ｌ３０９Ｒ及びＮ４３４Ｓであり得る。

前記更なるアミノ酸置換は、Ｖ２６４Ｍ、Ｌ３６８Ｑ、Ｅ３８８Ｄ、Ｖ４２２Ｄ及びＰ４４５Ｓであってもよい。

前記更なるアミノ酸置換は、Ｒ２９２Ｌ、Ｔ３５９Ａ及びＳ３６４Ｇであってもよい。

前記更なるアミノ酸置換は、Ｌ２３４Ｆ、Ｅ２６９Ｄ、Ｑ３４２Ｌ、Ｅ３８８Ｄ及びＴ３９４Ａであってもよい。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の置換されたＦｃ変異体は、カバットのＥＵナンバリングシステムに従う下記のアミノ酸置換を含む：ａ）Ｍ４２８Ｌ；及びｂ）Ｐ２３０Ｑ又はＰ２３０Ｓ。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の前記ａ）Ｍ４２８Ｌ；及びｂ）Ｐ２３０Ｑ又はＰ２３０Ｓ位置でアミノ酸置換を含むＦｃ変異体は、カバットのＥＵナンバリングシステムに従う２４３、２４６、２９５、３２０、３５６、３６１、３８４及び４０５番のアミノ酸からなる群から選ばれる１つ以上の更なるアミノ酸置換を含む。

前記更なるアミノ酸置換は、Ｆ２４３Ｙ、Ｋ２４６Ｅ、Ｎ３６１Ｓ及びＮ３８４Ｉであり得る。

前記更なるアミノ酸置換は、Ｑ２９５Ｌ、Ｋ３２０Ｍ、Ｄ３５６Ｅ及びＦ４０５Ｉであってもよい。

本発明は、ＦｃＲｎ（ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に対する結合及び解離を調整するアミノ酸置換を含むＦｃ変異体に関する。特に、酸性条件（ｐＨ７よりも低いｐＨ条件）でＦｃＲｎに対する増加した結合親和度（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を示し、中性ｐＨ条件では非常に低いＦｃＲｎ結合力を示すＦｃ変異体、又はその機能的変異体を含む。

本明細書において半減期を増加させようとする“抗体治療剤”は特に制限されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ドメイン抗体、二重特異的抗体、抗体模倣体、キメラ抗体、抗体接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、ヒト抗体又はヒト化抗体であるか、その断片を含む。

モノクローナル抗体としては、例えば、パニツムマブ（ベクチビックス）、オファツムマブ（アーゼラ）、ゴリムマブ（シンポニー）、イピリムマブ（ヤーボイ）などのヒト抗体；トシリズマブ（アクテムラ）、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ベバシズマブ（アバスチン）、オマリズマブ（ゾレア）、メポリズマブ（ボサトリア）、ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ）、パリビズマブ（シナジス）、ラニビズマブ（ルセンティス）、セルトリズマブ（シムジア）、オクレリズマブ、モガムリズマブ（ポテリジオ）、エクリズマブ（ソリリス）などのヒト化抗体；リツキシマブ（リツキサン）、セツキシマブ（アービタックス）、インフリキシマブ（レミケード）、バシリキシマブ（シムレクト）などのキメラ抗体などを上げることができる。

本明細書において半減期を増加させようとする“タンパク質治療剤”は特に制限されず、インスリンなどのホルモン、成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、好中球増殖因子、変形性成長因子などのサイトカイン、エタネルセプト（エンブレル）、アフリベルセプト（アイリーア、ザルトラップ）、アバタセプト（オレンシア）、アレファセプト（アメビブ）、ベラタセプト（ニューロジクス）、リロナセプト（アルカリスト）などのＦｃ融合タンパク質、テリパラチド（フォルテオ）、エキセナチド（バイエッタ）、リラグルチド（ビクトーザ）、ランレオチド（ソマチュリン）、プラムリンチド（シムリン）、エンフビルチド（フゼオン）などのペプチド治療剤、ＶＥＧＦ受容体、Ｈｅｒ２受容体、Ｇ－タンパク質連結受容体、イオンチャネルなどの細胞表面受容体の全部或いは一部のポリペプチドなどを含む。

前記抗体又はタンパク質治療剤は、本発明のポリペプチド又はこれをコードする核酸に結合されるか、或いは前記核酸を発現させるためのベクターに共に挿入され、それらの半減期の増加に有用に用いられ得る。

本発明の好ましい具現例によれば、前記Ｆｃ変異体は、ｐＨ５．６～６．４（好ましくはｐＨ５．８～６．２）においてＦｃＲｎに対する結合親和度（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）が、野生型Ｆｃドメインに比べて１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は１００％以上増加するか、或いは野生型Ｆｃドメインに比べて２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上又は１００倍以上増加し得る。

本発明の好ましい具現例によれば、前記Ｆｃ変異体は、ｐＨ７．０～７．８（好ましくはｐＨ７．２～７．６）においてＦｃＲｎ（ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）から解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）する程度が、野生型Ｆｃドメインと比較して同一であるか或いは実質的に変化しなくて済む。

本発明の一実施例によれば、本発明の置換されたＦｃ変異体は、野生型Ｆｃ又は既に開発された他のＦｃ変異体と比較して、弱酸性条件（例えば、ｐＨ５．８～６．２）では非常に向上した結合親和度を示し、中性条件（例えば、ｐＨ７．４）では同一であるか、実質的に同等又はそれ以上のレベルの解離程度を示した（実施例４及び８）。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の置換されたＦｃ変異体は、野生型に比べて半減期（Ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）が増加したものである。

本発明の置換されたＦｃ変異体の半減期は、野生型Ｆｃドメインに比べて１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は１００％以上増加するか、或いは野生型Ｆｃドメインに比べて２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上又は１０倍以上増加し得る。

本発明の一実施例によれば、本発明の置換されたＦｃ変異体は野生型に比べて顕著に向上した体内半減期を示した（実施例１１、表３）。

本明細書において、“Ｆｃガンマ受容体”又は“ＦｃγＲ”は、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合するタンパク質系の任意の構成員を意味し、ＦｃγＲ遺伝子によってエンコードされる。その例として、ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ及びＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂを含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、並びに任意の発見されないＦｃγＲ又はＦｃγＲが含まれるが、これに制限されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ネズミ、ウサギ及びサルが含まれるが、その他の任意の生物体から由来してもよい。

本明細書において、“ＦｃＲｎ”又は“ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ”とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合するタンパク質を意味し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によってエンコードされる。前記ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ネズミ、ウサギ及びサルが含まれるが、任意の生物体から由来してもよい。機能的ＦｃＲｎタンパク質は、軽鎖及び重鎖と呼ばれる２個のポリペプチドを含む。軽鎖はベータ－２－マイクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってエンコードされる。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記ポリペプチドを含む抗体を提供する。

本明細書でいう用語“抗体”は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ドメイン抗体、二重特異的抗体、抗体模倣体、キメラ抗体、抗体接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、ヒト抗体又はヒト化抗体であるか、その断片（例えば、抗原に結合する抗体断片）を意味する。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明は、抗体Ｆｃ領域の最適化（例えば、Ｍ４２８Ｌ及びＱ３１１Ｒ；又はＭ４２８Ｌ及びＬ３０９Ｇなど）によってＦｃドメイン又はこれを含むポリペプチドの半減期を極大化することができる。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記ポリペプチドをコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、又は該ベクターを含む宿主細胞を提供する。

本発明の核酸分子は単離したものであるか、組み換えられたものであり得、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡだけでなく、対応する相補性配列が含まれる。“単離した核酸”は、天然生成源から単離した核酸である場合、核酸が単離した個体のゲノムに存在する周辺遺伝配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的に又は化学的に合成された核酸、例えばＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドの場合、このような手順から生成された核酸が単離した核酸分子として理解され得る。単離した核酸分子は、別の断片の形態又はより大きい核酸構築物の成分としての核酸分子を表す。核酸は他の核酸配列と機能的関係で配置される時に“作動可能に連結”される。例えば、全配列又は分泌リーダ（ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡは、ポリペプチドが分泌される前の形態である前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーはポリペプチド配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作動可能に連結され、又はリポソーム結合部位は翻訳を促進するように配置されるとき、コーディング配列に作動可能に連結される。一般に、“作動可能に連結された”とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接して位置することを意味し、分泌リーダの場合、隣接して同一リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは隣接して位置する必要はない。連結は、便利な制限酵素部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを通常の方法によって使用する。

本明細書でいう用語“ベクター”は、核酸配列を複製可能な細胞への導入のために核酸配列を挿入できる伝達体を意味する。核酸配列は外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であり得る。ベクターとしてはプラスミド、コスミド及びウイルス（例えばバクテリオファージ）を挙げることができるが、これに制限されない。当業者は標準的な組換え技術によってベクターを構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４など）。

本明細書でいう用語“発現ベクター”は、転写される遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むベクターを意味する。一部の場合には、その後にＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。発現ベクターには様々な調節配列を含むことができる。転写及び翻訳を調節する調節配列と共にベクター及び発現ベクターには、他の機能も提供する核酸配列も含まれ得る。

本明細書でいう用語“宿主細胞”は、真核生物及び原核生物を含み、前記ベクターを複製できるか、ベクターによってコードされる遺伝子を発現できる任意の形質転換可能な生物を意味する。宿主細胞は前記ベクターによって形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）又は形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）可能であり、これは外生の核酸分子が宿主細胞内に伝達又は導入される過程を意味する。

本発明の宿主細胞は好ましくは、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などを挙げることができるが、これに制限されるものではない。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、下記の段階を含むヒト抗体Ｆｃ変異体を含むポリペプチドの製造方法を提供する：
ａ）前記ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する段階；及び
ｂ）前記宿主細胞により発現したポリペプチドを回収する段階。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、下記の段階を含む抗体の製造方法を提供する：
ａ）前記ポリペプチドを含む抗体を発現する宿主細胞を培養する段階；及び
ｂ）前記宿主細胞から発現した抗体を精製する段階。

本発明の製造方法において、抗体の精製は、濾過、ＨＰＬＣ、陰イオン交換又は陽イオン交換、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、親和度クロマトグラフィー、又はそれらの組合せを含むことができ、好ましくはプロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）を使用する親和クロマトグラフィーを用いることができる。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、下記の段階を含むＦｃ変異体を含むポリペプチドのスクリーニング方法を提供する：
ａ）カバットのＥＵナンバリングシステムに従うＭ４２８Ｌ突然変異を含むＦｃ変異体ライブラリーを構築する段階；及び
ｂ）前記Ｍ４２８Ｌ突然変異を含むＦｃ変異体から、ｐＨ５．６～６．４でＦｃＲｎに対する親和度が野生型に比べて高いＦｃ変異体を選別する段階。

本発明のＭ４２８Ｌ突然変異を含むＦｃ変異体は、更なるアミノ酸置換を含むことができる。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の更なるアミノ酸置換は、Ｑ３１１Ｒ又はＬ３０９Ｇ突然変異を含む。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の更なるアミノ酸置換は、Ｐ２２８Ｌ突然変異を含む。

本発明のＰ２２８Ｌ突然変異を含むＦｃ変異体は、更なるアミノ酸置換を含むことができる。

前記更なるアミノ酸置換は特に制限されず、好ましくはカバットのＥＵナンバリングシステムに従う２３４、２６４、２６９、２９２、３０９、３４２、３５９、３６４、３６８、３８８、３９４、４２２、４３４及び４４５番のアミノ酸からなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸において突然変異を含む。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の更なるアミノ酸置換は、Ｐ２３０Ｑ又はＰ２３０Ｓ突然変異を含む。

本発明のＰ２３０位置に突然変異を含むＦｃ変異体は、更なるアミノ酸置換を含むことができる。

前記更なるアミノ酸置換は特別に制限されず、好ましくはカバットのＥＵナンバリングシステムに従う２４３、２４６、２９５、３２０、３５６、３６１、３８４及び４０５番のアミノ酸からなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸において突然変異を含む。

本発明のスクリーニング方法は、蛍光標識細胞分離（ＦＡＣＳ）スクリーニング、又は他の自動化したフロサイトメトリー技術を用いることができる。フロサイトメトリーを実施するための機器は当業者に公知である。かかる機器の例には、ＦＡＣＳＡｒｉａ、ＦＡＣＳ Ｓｔａ ｒ Ｐｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎ及びＦＡＣＳｏｒｔ機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、Ｅｐｉｃｓ Ｃ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）、ＭＯＦＬＯ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｃｏｌｏ．）、ＭＯＦＬＯ－ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を挙げることができる。一般に、フロサイトメトリー技術には、液体試料中の細胞又は他の粒子の分離が含まれる。典型的には、フロサイトメトリーの目的は、分離された粒子をそれらの一つ以上の特性（例えば、標識されたリガンド又は他の分子の存在）に対して分析することである。粒子はセンサーによって一つずつ通過し、大きさ、屈折、光散乱、不透明度、照度、形状、蛍光などに基づいて分類される。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記アミノ酸置換を含むＦｃ変異体を含むポリペプチド、前記抗体、前記核酸分子又は前記ベクターを含む組成物を提供する。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組成物は、癌の予防又は治療用薬剤学的組成物である。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物（又は、ポリペプチド、抗体、核酸分子又はベクター）は癌抗原を認識する。

本発明の一実施例によれば、本発明のＦｃ変異体は、対照群（例えば、トラスツズマブ）に比べて同等又はそれ以上のＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性を示し、前記顕著な半減期の増加とともに高い坑癌活性を有する（実施例１３、図１８）。

本発明の薬剤学的組成物は、（ａ）前記ポリペプチド、抗体、前記ポリペプチドをコードする核酸分子又は該核酸分子を含むベクター；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むことができる。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記薬剤学的組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む癌の予防又は治療方法を提供する。

本発明が予防又は治療しようとする癌の種類は制限されず、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）及び急性リンパ球白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性非リンパ球白血病（ａｃｕｔｅ ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）、慢性リンパ球白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）及び多発骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ）などのリンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ）、神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、網膜芽細胞腫（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）、ウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ Ｔｕｍｏｒ）、骨腫瘍（ｂｏｎｅ ｔｕｍｏｒｓ）及び軟部組織肉腫（ｓｏｆｔ－ｔｉｓｓｕｅ ｓａｒｃｏｍａｓ）などの小児固形腫瘍（ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、尿路癌（ｕｒｉｎａｒｙ ｃａｎｃｅｒｓ）、子宮癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃａｎｃｅｒｓ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒｓ）、膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）及びその他皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒｓ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）及び精巣癌（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ）などの成人の通常の固形腫瘍（ｃｏｍｍｏｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ）を含めて多数の癌を治療するように投与することができる。

本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ
ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の薬剤学的組成物は経口又は非経口で投与でき、好ましくは非経口投与であり、例えば、静脈内注入、局所注入及び腹腔注入などで投与できる。

本発明の薬剤学的組成物投与の対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は制限されないが、好ましくは脊椎動物、より好ましくはヒト、チンパンジーを含む霊長類、イヌ、ネコなどの愛玩動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳動物を含む意味として解釈される。

本発明の薬剤学的組成物の適度な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、普通の熟練した医師は所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇである。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量の形態で製造したり、又は多用量容器内に内入させて製造することができる。この時、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であり得、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

本発明の薬剤学的組成物は、単独の療法として用いることができるが、他の通常の化学療法又は放射療法と共に用いてもよく、このような併行療法を実施する場合にはより効果的に癌治療ができる。本発明の組成物と共に使用できる化学療法剤は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イソホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ビスフファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）及びメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などを含む。本発明の組成物と共に利用可能な放射療法は、Ｘ線走査及びγ－線走査などである。

本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ｉ）本発明は、ヒト抗体Ｆｃドメインのアミノ酸配列の一部が他のアミノ酸配列に置換されたＦｃ変異体を含むポリペプチド又はこれを含む抗体を提供する。

（ｉｉ）また、本発明は、前記ポリペプチド又は抗体の製造方法を提供する。

（ｉｉｉ）本発明のＦｃ変異体は、一部のアミノ酸配列の最適化によって体内半減期を極大化でき、癌の治療に有用に用いることができる。

ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ＦｃＲｎとｄｉｍｅｒｉｃ ＦｃＲｎの発現及び精製のための発現用ベクター及び精製後ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル写真である。 Ｍ２５２及びＭ４２８に１８種のアミノ酸が含まれるように作製するためのライブラリー模式図である。 ２Ｍライブラリー探索過程及び選別されたＭ４２８Ｌ変異体を示す。 Ｍ４２８Ｌを基本として作製されたエラーライブラリーとポイントライブラリーの模式図を表す。 エラーライブラリー（図５Ａ）及びポイントライブラリー（図５Ｂ）から見出した変異体のＦＡＣＳ蛍光強度測定結果である。 トラスツズマブの重鎖及び軽鎖を動物細胞内で発現させるためのプラスミドを示す。 野生型トラスツズマブの発現及び精製結果である。 商業用トラスツズマブ及び研究室で作製したトラスツズマブの物性比較結果である（ａ：ＣＥ－ｃＩＥＦ、ｂ：ＳＥＣ）。 Ｎ－グリカンプロファイリングによる商業用トラスツズマブ及び研究室で作製したトラスツズマブの物性比較結果である。 １０種のトラスツズマブＦｃ変異体の発現及び精製結果である（図１０Ａ：親和度クロマトグラフィー 、図１０Ｂ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、図１０Ｃ：最終収率目録）。 トラスツズマブＦｃ変異体のＳＥＣ特性分析結果である。 ＥＬＩＳＡを用いたトラスツズマブＦｃ変異体のＦｃＲｎ結合力測定結果である。 ＢｉａＣｏｒｅによるｐＨ６．０と７．４におけるトラスツズマブＦｃ変異体とｈＦｃＲｎとの結合力測定結果である（図１３Ａ：ｐＨ６．０（ｃａｐｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ）、図１３Ｂ：ｐＨ７．４（Ａｖｉｄ Ｆｏｒｍａｔ）での結合力測定）。 一般マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６））とヒトＦｃＲｎ Ｔｇマウスにおける商業用及び研究室作製のトラスツズマブの薬動学比較結果である。 ヒトＦｃＲｎ ＴｇマウスにおけるＦｃ変異体の薬動学分析結果である（静脈注射で各変異体５ｍｇ／ｋｇ注射、ｎ＝５）。 ＥＬＩＳＡを用いたトラスツズマブＦｃ変異体のＦｃγＲｓ結合力測定結果である。 Ｎｏｒｍａｌ ＩｇＧと対照群（トラスツズマブ）に対する評価トラスツズマブＦｃ変異体の効果器機能（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）比較結果である（ＡＤＣＣアッセイ）。 トラスツズマブＦｃ変異体の効果器機能（ＡＤＣＣ）比較結果である。 ＥＬＩＳＡを用いたトラスツズマブＦｃ変異体のＣ１ｑ結合力測定結果である。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって、本発明の範囲がそれらの実施例に制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

［実施例］
［実施例１．Ｆｃ変異体ライブラリーを探索するためのＦｃＲｎ（ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現及び精製］
ＦｃＲｎにｐＨ－依存的結合力が向上したＦｃ変異体を探索するためにｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ＦｃＲｎとｄｉｍｅｒｉｃ ＦｃＲｎの発現及び精製を行うための発現用ベクターを準備した（図１）。ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ＦｃＲｎを得るためにｐＭＡＺ－β２ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ＧＳｌｉｎｋｅｒ－ＦｃＲｎα－ｃｈａｉｎ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨｉｓのＤＮＡプラスミドを確保した。このＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｆ細胞にコトランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、３００ｍｌ規模で臨時発現させた。培養を終えた培養液は、７０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離によって除去し、上澄み液を取って２５ｘＰＢＳを用いて平衡化した。ボトルトップフィルターを用いて０．２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。ＰＢＳで平衡化した後、Ｎｉ－ＮＴＡレジン（Ｑｉａｇｅｎ）を入れ、１６時間４℃でＦｃＲｎとレジンを結合させた。ＦｃＲｎと結合したレジンをカラムに流してから、５０ｍｌ ｗａｓｈ－１バッファー（ＰＢＳ）、２５ｍｌ ｗａｓｈ－２バッファー（ＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾール）、２５ｍｌ ｗａｓｈ－３バッファー（ＰＢＳ＋２０ｍＭイミダゾール）、２００μｌ ｗａｓｈ－４バッファー（ＰＢＳ＋２５０ｍＭイミダゾール）を流してｔＦｃＲｎ以外のタンパク質を除去した。そして、２．５ｍｌ溶出バッファー（ＰＢＳ＋２５０ｍＭイミダゾール）を流し、ｔＦｃＲｎを得た。そして、バッファーを変えるためにＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した。Ｄｉｍｅｒｉｃ ＦｃＲｎを得るためにＯｓｌｏ大学から受けたｐｃＤＮＡ－ＦｃＲｎα－ｃｈａｉｎ－ＧＳＴ－β２ ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎプラスミドを確保した。このＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｆ細胞にコトランスフェクションし、３００ｍｌ規模で臨時発現させた。培養済み培養液は７０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して除去し、上澄み液を取って２５ｘＰＢＳを用いて平衡化した。ボトルトップフィルターを用いて０．２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。ＰＢＳで平衡化した後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ａｇａｒｏｓｅ ４Ｂ（ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ）レジンを入れて１６時間４℃でＦｃＲｎとレジンを結合させた。ＦｃＲｎと結合したレジンをカラムに流してから１０ｍｌ洗浄バッファー（ＰＢＳ）を流し、ｄＦｃＲｎ以外のタンパク質を除去した。そして、２．５ｍｌ溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ＋１０ｍＭ
ＧＳＨ ｐＨ８．０）を流し、バッファーを変えるためにＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ ３Ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した。精製後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを用いて大きさを確認した（図１）。精製されたｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ＦｃＲｎとｄｉｍｅｒｉｃ ＦｃＲｎに蛍光信号が生成されるようにＡｌｅｘａ
４８８を用いて蛍光標識をした。

［実施例２．Ｆｃ変異体２Ｍライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）の作製］
トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ）にあるＦｃ部分の遺伝子（配列目録第２９配列）を、ＳｆｉＩ制限酵素を用いてｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－Ｆｃ－ＦＬＡＧを作製した。作製されたベクターに基づいて、Ｆｃ内に２つのＭｅｔ部分をｃｙｓとＭｅｔ以外の残り１８個の他のアミノ酸に置換され得るように、ｐＭｏｐａｃ１２－ｓｅｑ－Ｆｗ、Ｆｃ－Ｍ２５２－１－Ｒｖ、Ｆｃ－Ｍ２５２－２－Ｒｖ、Ｆｃ－Ｍ２５２－３－Ｒｖ、Ｆｃ－Ｍ４２８－Ｆｗ、Ｆｃ－Ｍ４２８－１－Ｒｖ、Ｆｃ－Ｍ４２８－２－Ｒｖ、Ｆｃ－Ｍ４２８－３－Ｒｖ、Ｆｃ－Ｍ４２８－ｆｒｇ３－Ｆｗ、ｐＭｏｐａｃ１２－ｓｅｑ－Ｒｖプライマーを用いてライブラリーインサートを作製した（表１、図２）。作製されたインサートをＳｆｉＩ制限酵素処理して同じＳｆｉＩで処理されたベクターとライゲーションした。その後、大腸菌Ｊｕｄｅ１（（Ｆ’［Ｔｎ１０（Ｔｅｔ^ｒ）ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃＩ^ｑΔ（ｌａｃＺ）Ｍ１５］ｍｃｒＡΔ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ）Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ΔｌａｃＸ７４ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａ ｌｅｕ）７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫｒｐｓＬｅｎｄＡ１ｎｕｐＧ）に形質転換し、巨大Ｆｃ変異体２Ｍライブラリー（ライブラリーサイズ：１×１０^９）を構築した。

［実施例３．バクテリア培養及びフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いたＦｃ変異体２Ｍライブラリー探索］
構築された２Ｍ Ｆｃ変異体ライブラリー探索のために、大腸菌Ｊｕｄｅ１細胞に形質転換されているＦｃ変異体ライブラリー細胞１ｍｌを３７℃２５０ｒｐｍ振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）条件で２％（ｗ／ｖ）グルコースに、抗生剤はクロラムフェニコール（４０μｇ／ｍＬ）の含まれたＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）培地に入れて４時間培養した。振盪培養されたライブラリー細胞をＴＢ培地に１：１００で接種した後、３７℃２５０ｒｐｍ振盪によりＯＤ_６００が０．５に到達するまで培養した。その後、冷却（ｃｏｏｌｉｎｇ）のために２０分間２５℃で培養した後、１ｍＭ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－１－ｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を入れて発現誘導をした。培養が終わった後、細胞を回収してＯＤ_６００ノーマライズによって均一の量ずつ１４０００ｒｐｍ、１分間遠心分離して細胞を収穫した。１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加して細胞を再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）し、１分間遠心分離する洗浄過程を２回反復した。１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］で再懸濁して３７℃、３０分間回転させ、細胞外膜を除去した。遠心分離して上澄み液を捨てた後、１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を添加して再懸濁及び遠心分離をした。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して再懸濁した後、３７℃、１５分間回転させてペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後に上澄み液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後に３００μｌを取り、７００μｌのＰＢＳと蛍光標識されたｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ＦｃγＲＩＩＩａ－Ａｌｅｘａ ４８８ ｆｌｏｕｒプローブを共に入れて常温で回転させ、スフェロプラスト（ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ）に蛍光プローブをラベリングした。ラベリング後、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後にフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｓ３ ｓｏｒｔｏｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ））を用いて、高い蛍光を示す上位３％細胞を回収するために選別（ｓｏｒｔｉｎｇ）作業を行い、蛍光が高い細胞の純度を高めるために、選別された細胞をさらに再選別（ｒｅｓｏｒｔｉｎｇ）した。再選別したサンプルを、ｐＭｏｐａｃ１２－ｓｅｑ－ＦｗとｐＭｏｐａｃ１２－ｓｅｑ－Ｒｖプライマーを用いてＴａｑポリマーレイズ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）によりＰＣＲで遺伝子増幅し、ＳｆｉＩ制限酵素処理、ライゲーション、形質転換過程を経てソートされた細胞の遺伝子が増幅されたサブライブラリーを作製した。この過程を総２ラウンドにわたって反復した後、約４０個の個別クローンをそれぞれ分析し、野生型Ｆｃに比べてｐＨ５．８でＦｃＲｎと高い親和度を示すＭ４２８Ｌ変異体を選別した（図３）。

［実施例３．Ｆｃ変異体エラーライブラリー及びポイントライブラリーの作製］
見出されたＭ４２８Ｌを鋳型とし、さらに２種のライブラリーを作製した。一番目のライブラリーは、ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ手法を用いてＦｃに変異を導入し、エラーライブラリーを作製した。エラー率は、Ｆｃ（６８０ｂｐ）に０．３％エラー（２．０４ｂｐ）が入るようにｅｐ－Ｆｃ－Ｆｗ、ｅｐ－Ｆｃ－Ｒｖプライマーを用いてライブラリー（ライブラリーサイズ：２×１０^８）を作製した。二番目のライブラリーは、Ｍ４２８Ｌを鋳型とし、ＦｃとＦｃＲｎ結合部位を選定し、該当の部位に無作為に突然変異が導入されるように、ｐＭｏｐａｃ１２－ｓｅｑ－Ｆｗ、ｐＭｏｐａｃ１２－ｓｅｑ－Ｒｖ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃０－Ｒｖ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃１－１－Ｆｗ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃１－２－Ｆｗ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃１－３－Ｆｗ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃１－４－Ｆｗ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃１－５－Ｆｗ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃１－Ｒｖ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃２－１－Ｆｗ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃２－２－Ｆｗ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃２－３－Ｆｗ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃２－Ｒｖ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃３－１－Ｆｗ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃３－２－Ｆｗ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃３－３－Ｆｗ、Ｆｃ－Ｓｕｂ＃３－４－Ｆｗプライマーを用いてポイントライブラリーを作製した（図４）。その後、上記のような方法でＪｕｄｅ１に形質転換してＦｃ変異体ライブラリーを構築した。

［実施例４．バクテリア培養及びフローサイトメトリーを用いたＦｃ変異体エラー及びポイントライブラリー探索と、ＰＦｃ３、ＰＦｃ２９、ＰＦｃ４１、ＥＦｃ２９、ＥＦｃ４１、ＥＦｃ８２、ＥＦｃ８８などの変異体選別］
先に見出されたＭ４２８Ｌを基本としてさらに作製されたエラーライブラリーとポイントライブラリーに対して、上記のような方法で選別及び再選別作業を行った。エラーライブラリーは５ラウンドにわって反復し、ポイントライブラリーは１回選別を行った後、両ライブラリーから得られたグループでそれぞれ約１００個の個別クローンを分析し、ｐＨ５．８でＦｃＲｎに高い親和度を示し、ｐＨ７．４では低い親和度を示すＦｃ変異体を選別した。ＦＡＣＳを用いてそれぞれを分析した結果、エラーライブラリーから見出されたＥＦｃ６、ＥＦｃ２９、ＥＦｃ４１、ＥＦｃ４６、ＥＦｃ７０、ＥＦｃ９０ＥＦｃ８２、ＥＦｃ８８の方が野生型Ｆｃに比べてｐＨ５．８において高い蛍光強度を示したが、先行研究で見出されたメディミューン（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）のＹＴＥ（Ｇａｂｒｉｅｌ Ｊ．Ｒｏｂｂｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１３Ｄｅｃ；５７（１２）：６１４７－６１５３）やゼンコア（Ｘｅｎｃｏｒ）のＬＳ（米国特許登録番号第８，３２４，３５１号）に比べてはｐＨ５．８で高い蛍光強度を示し、ｐＨ７．４でＬＳに比べて低い蛍光を示す変異体はＥＦｃ６、ＥＦｃ２９、ＥＦｃ４１、ＥＦｃ８２、ＥＦｃ８８であることを確認した。また、ポイントライブラリーから見出された変異体ＰＦｃ３、ＰＦｃ２９、ＰＦｃ４１はＹＴＥやＬＳに比べてｐＨ５．８で高い蛍光強度を示したが、ＰＦｃ３０は低い蛍光強度を示した。そして、ＰＦｃ２９、ＰＦｃ４１は、ｐＨ７．４でＬＳに比べて低い蛍光を示すことを確認した。最終的に、血中半減期を向上させるものと予想されるＥＦｃ６、ＥＦｃ２９、ＥＦｃ４１、ＥＦｃ８２、ＥＦｃ８８、ＰＦｃ３、ＰＦｃ２９、ＰＦｃ４１を選定した（表２、図５）。

突然変異位置はカバットのＥＵナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１）におけるようなＥＵ指数番号に従う。

［実施例５．Ｆｃ変異体導入のための対照群トラスツズマブの生産及び精製］
本発明では、ＩｇＧ１治療用抗体の代表であるトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ，Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））を選定して、見出されたＦｃ変異体を導入し、後に対照群としようとした。

野生型トラスツズマブ遺伝子は、Ｄｒｕｇ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／）のアミノ酸配列からｂａｃｋ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎと同時にｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎによって重鎖可変領域と軽鎖可変領域のそれぞれを合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）した。合成されたトラスツズマブ重鎖遺伝子はｐＯｐｔｉＶＥＣ－Ｆｃベクターに、トラスツズマブ軽鎖遺伝子はｐＤＮＡ３．３ベクターにそれぞれサブクローニングした（図６）。トラスツズマブ重鎖及び軽鎖をコードしている動物細胞発現用プラスミドをそれぞれ製造し、ＨＥＫ２９３細胞で発現及び精製した。

ＨＥＫ２９３Ｆで培養後、プロテインＡ親和度クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ，ｃａｔ ＃１１００１３１３）とゲル濾過クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ ＭａｂｓｅｌｅｃｔＳｕｒｅ，ＧＥ，ｃａｔ ＃１１－００３４－９５）を用いて野生型トラスツズマブを精製し、３００ｍｌ培養液から７．７ｍｇの高純度野生型トラスツズマブを確保した（図７）。

［実施例６．研究室作製（ｉｎ－ｈｏｕｓｅ）及び商業用（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ）トラスツズマブ物性の比較分析］
ＣＨＯ懸濁培養で生産された商業用（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ）トラスツズマブと違い、研究室で作製（ｉｎ－ｈｏｕｓｅ）されたｉｎ－ｈｏｕｓｅトラスツズマブはＨＥＫ２９３で生産したので、選別されたＦｃ－変異体を導入してその機能を分析する前に、２種の基本特性分析を行った。ＣＥ（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＰＡ８００ Ｐｌｕｓ，Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）による分析は、ｐＨ３～１０の勾配を形成するＰｈａｒｍａｌｙｔｅ ３－１０両性担体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７－０４５６－０１）を使って試料のｐＩ値及びＣｈａｒｇｅ ｖａｒｉａｎｔｓを分析した。分析の結果、ＳＥＣ（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｔｓｋｇｅｌ Ｇ３０００ｓｗｘｌ，Ｔｏｓｏｈ）によるｉｍｐｕｒｉｔｙはなく、ＣＥ（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＰＡ８００ Ｐｌｕｓ，Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）によるｃｈａｒｇｅ ｖａｒｉａｎｔによるｐＩ値は、商業用では８．２７～８．７４であり、メインピークのＰＩが８．６２であり、自体生産したトラスツズマブのＰＩは８．２９～８．７８、メインピークは８．６５であって、両者が類似していた（図８）。しかし、ｃＩＥＦ分析の結果、研究室で作製したトラスツズマブではメインピーク以外のピークにおける若干の含量差が観察され、これは、商業用はＣＨＯで生産されるが、研究室で作製したトラスツズマブの生産細胞株がＨＥＫ２９３であって、グリカンパターンが異なるため、シアル酸などによる酸化（ｏｘｄａｔｉｏｎ）である可能性もあり、グリカン分析も行った（図９）。

グリカン分析は、タンパク質からＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＢ，１８６００７９９０－１）を用いてＮ－ｇｌｙｃａｎを剥がした後、ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳ試薬（Ｗａｔｅｒｓ，１８６００７９８９－１）を用いてラベリング後、ＵＰＬＣシステム（Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｉ ｃｌａｓｓ，Ｗａｔｅｒｓ，ＦＬＲ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いて分析した。グリカン分析の結果、糖パターンは類似しており、各組成当たりの含有量差だけが示され、これはシアル酸による酸化が原因であるとは考えられず、生産細胞株の差異によって現れるものと考えられたし、結合力分析及び薬動学分析には大きな影響がないことを確認し（Ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）、選別されたＦｃ変異体を導入して生産した。

［実施例７．Ｆｃ変異体の生産、精製及び物成分析］
商業用と研究室で作製した野生型に加えて、ＬＳ（ＸｅｎＣｏｒ）、ＹＴＥ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、４２８Ｌなどの対照群変異体５種と、ＰＦｃ２９、ＰＦｃ４１、ＥＦｃ２９、ＥＦｃ４１及びＥＦｃ８２などの５種の選別された変異体をＨＥＫ２９３Ｆ動物細胞に形質注入した。形質注入一日前にＨＥＫ２９３Ｆ細胞を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で３００ｍｌ継代培養し、翌日、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，２３９６６）を用いて形質注入した。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培養液（Ｇｉｂｃｏ，１２３３８－０１８）３０ｍｌに変異体の重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を２：１の割合でまず混ぜ、次にＰＥＩ：変異体遺伝子＝１：２割合で混ぜて常温で２０分間置いてから、前日に継代培養しておいた細胞に混ぜて振盪ＣＯ_２インキュベーターで３７℃、１２５ｒｐｍ、８％ＣＯ_２条件で６日間培養した後、遠心分離して上澄み液だけを取った。

上澄み液からのタンパク質の精製は、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂｓｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラムを装着したＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを用いて親和クロマトグラフィーで行った。上澄み液３００ｍｌを１分当たり３ｍｌの速度で流し、１００ｍｌの１ｘＰＢＳで洗浄した後、ＩｇＧ溶出バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ，２１００９）を１分当たり５ｍｌの速度で５ｍｌずつ６個の切片（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を収集し、１Ｍ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）５００ｕｌを混ぜて中和させた後、各切片を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（ＢｉｏＲａｄ，５０００００１）溶液でタンパク質を確認して新しいチューブに取った。３０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ（ＵＦＣ９０３０９６）を用いて精製された変異体を濃縮した後、物成分析した（図１０及び図１１）。

研究室作製野生型トラスツズマブ以外の各Ｆｃ変異体は、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａで精製後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって純度９０％以上の純度及び分子量を確認した。効能評価及び純度分析に要求される高純度タンパク質試料の確保（純度９７％以上）のためにＳＥＣ－ＨＰＬＣ（図１１Ａ）実験を行った。等張条件（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）（移動相１ＸＰＢＳ ｐＨ７．０、１ｍｌ／ｍｉｎ流速）で分析した結果、Ｆｃ変異体はいずれもメインピークに対する保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）が同一であり、分子量予測の結果、予想分子量として確認した（図１１Ｂ）。

［実施例８．ＥＬＩＳＡを用いたＦｃ変異体のＦｃＲｎ結合力の測定］
先に準備した変異体のＦｃＲｎ ｐＨ－依存的結合力と効果機能を示させ得るＦｃγＲｓ、Ｃ１ｑとの結合力を測定するためにＥＬＩＳＡ測定を行った。まず、ＦｃＲｎにｐＨ－依存的結合力を測定するために、０．０５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３、ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌで希釈したＩｇＧ Ｆｃ変異体をそれぞれ５０μｌずつ底平ポリスチレン高結合９６ウェルマイクロプレート（Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）（ｃｏｓｔａｒ）に４℃、１６時間固定化した後、１００μｌの４％スキームミルク（ＧｅｎｏｍｉｃＢａｓｅ）（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ５．８／ｐＨ７．４）で常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ ＰＢＳＴ（ｐＨ５．８／ｐＨ７．４）１８０μｌで４回ずつ洗浄過程を行った後、１％ スキームミルク（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ５．８／ｐＨ７．４）で連続して希釈されたＦｃＲｎを５０μｌ各ウェルに分注し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ａｎｔｉ－ＧＳＴ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を行い、洗浄過程を行った。１－Ｓｔｅｐ
Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５０μｌずつ添加して発色した後、２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を５０μｌずつ入れて反応を終了した後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて分析した。見出した変異体は、ＦｃＲｎに対してｐＨ５．８ではＬＳ変異体と類似な結合力を有し、ｐＨ７．４ではＬＳに比べて解離しやすいことが観察された（図１２）。

［実施例９．ｐＨ６．０とｐＨ７．４でトラスツズマブＦｃ変異体とｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｈＦｃＲｎとの結合力測定の比較分析］
このように、物成分析から確認された商業用及び研究室作製トラスツズマブ以外の選別されたＦｃ変異体のｐＨによるヒトＦｃＲｎとの結合力差を比較するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）装備を用いてＫ_Ｄ値を測定比較した。ｐＨ６．０条件では文献（Ｙｅｕｎｇ ＹＡ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９）によってａｎｔｉｇｅｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃａｐｔｕｒｅ方式でヒトＦｃＲｎを検体（ａｎａｌｙｔｅ）とした。ＨＥＲ２ ＥＣＤドメインが～３，０００ＲＵ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ）レベルで固定されたＣＭ５チップ表面にＦｃ変異体をリガンドとして展開液（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ６．０）に希釈して～３００ＲＵレベルで注入しキャプチャーした。検体であるｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ＦｃＲｎ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ．，ＣＴ００９－Ｈ０８Ｈ）は、１２５ｎＭから始めてＦｃＲｎ展開液に順次に希釈して３０ｕｌ／ｍｉｎ流速で２分間注入し、２分間解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）して結合力を測定した。各サイクルごとに１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）の３０ｍｌ／ｍｉｎの流速で３０秒間ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎを行った。センソグラムはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ）で１：１結合モデル（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）を適用して分析した。その結果、Ｆｃ変異体は、対照群として用いられた商業用トラスツズマブ（１５ｎＭ）及び研究室作製トラスツズマブ（１６．９ｎＭ）とｂａｃｋｂｏｎｅとして用いられた４２８Ｌ（９ｎＭ）に比べては結合力が良くなったが（ＰＦｃ３：５．６ｎＭ、ＰＦｃ２９：６．８ｎＭ、ＰＦｃ４１：５．９ｎＭなど）、世界最高として知られたＹＴＥ（５．７ｎＭ）及びＬＳ（４．１ｎＭ）に比べては結合力が多少劣った。しかし、その値の差はほとんど誤差範囲内であり、類似していることを確認した。ｐＨ７．０条件では、リガンドと検体（ａｎａｌｙｔｅｓ）がよく結合しないので、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｈＦｃＲｎを直接固定化（ｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）した後、Ｆｃ変異体を濃度別に注入するａｖｉｄ ｆｏｒｍａｔ（Ｚａｌｅｖｓｋｙ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０）で測定した。ヒトＦｃＲｎ
ＥＣＤドメイン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をＣＭ５チップ表面に～１，５００ＲＵレベルで固定化した。ＦｃＲｎが固定されたチップの表面にＦｃ変異体を３０００ｎＭから始めてＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．４）に順次に希釈して５ｍｌ／ｍｉｎの流速で２分間注入した。結合したＦｃ変異体は２分間解離させ、各ｃｙｃｌｅが終わると、チップ表面を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）でｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎした（ｃｏｎａｔａｔ ｔｉｍｅ ３０秒；流速３０ｕｌ／ｍｉｎ）。このうち、Ｆｃ変異体の２種（ＰＦｃ２９、ＰＦｃ４１）がｐＨ６．０条件で高い結合力を維持しながらｐＨ７．４条件ではＹＴＥとＬＳよりも速く解離すること（ＥＬＩＳＡ結果と一致）から、半減期増加効果を期待できることを予想し（図１３）、実際にヒトＦｃＲｎ Ｔｇマウスで体内薬動学実験を進行した。

［実施例１０．一般Ｂ６マウスとｈＦｃＲｎ Ｔｇマウスで商業用及び研究室作製トラスツズマブ生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＰＫ実験の比較分析］
ヒトＦｃＲｎ Ｔｇマウスと遺伝的バックグラウンドが同じＢ６一般マウス（中央実験動物センター、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６））におけるＰＫ分析の結果、論文で報告された通り、一般マウスＦｃＲｎとヒト抗体のＦｃとの親和力が、ヒトＦｃＲｎとヒト抗体Ｆｃに比べて高いことを確認した。しかし、一般マウスにおけるＰＫ値は、研究室作製及び商業用抗体間の差異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）があり、研究室作製抗体が不安定（ｕｎｓｔａｂｌｅ）に見えたが、Ｔｇマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｔｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂ，ＣＡＧＦＣＧＲＴ）２７６Ｄｃｒ／ＤｃｒＪ）では、一般マウスよりはＡＵＣが多少低いが、研究室作製及び商業用抗体間の薬動学傾向は類似に測定されることが確認された。したがって、Ｔｇマウスにおける実際の体内薬動学分析において、ＨＥＫ２９３で生産した研究室作製由来Ｆｃ変異体の実験測定に問題がないことを確認した（図１４）。

［実施例１１．ＬＳ、ＹＴＥ外２種の変異体（ＰＦｃ２９及びＰＦｃ４１）の４種に対するｈＦｃＲｎ Ｔｇマウス薬動学］
ＥＬＩＳＡとＢｉａＣｏｒｅ装備でｐＨ６．０及びｐＨ７．４で測定した結合力結果に一貫性があり、これに基づいて、ｐＨ６．０酸性条件でＬＳと同等に結合力が良く、ｐＨ７．４で解離力がＬＳよりも高かった、ＰＦｃ２９とＰＦｃ４１の２種類を選別した。これと同時に、現在世界最高とされているＸｅｎＣｏｒのＬＳ ｍｕｔａｎｔとＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＹＴＥを対照群とし、総４種のトラスツズマブＦｃ変異体をヒトＦｃＲｎ Ｔｇマウス２０匹（各群当たり５匹ずつ５ｍｇ／ｋｇをＩ．Ｖ（微静脈）で注射後、顔面静脈から採血（総１２回→０秒、３０秒、１時間、６時間、２４時間、３日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日、５０日））から得られた血液を用いてＥＬＩＳＡで濃度分析した後、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎでＮＣＡ（ｎｏｎ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）した。ＥＬＩＳＡとＢｉａＣｏｒｅ分析の結果において、予想の通り、Ｆｃ変異体の２種（ＰＦｃ２９及びＰＦｃ４１）とも体内半減期増加効果を示し、特にＰＦｃ２９の場合、先行研究で見出されたＬＳに比べても高い半減期効果を示した（図１５、表３）。

ｔ_１／２，ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ；Ｔ_ｍａｘ，ｔｉｍｅ ａｔ ｍａｘｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｃ_０，ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｅｄ ｚｅｒｏ
ｔｉｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｃ_ｍａｘ，ｍａｘｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ＡＵＣ_ｌａｓｔ，ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ ｆｒｏｍ
ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｌａｓｔ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ＡＵＣ_ｉｎｆ， ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ ｆｒｏｍ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｎｆｉｎｉｔｙ；ＡＵＣ_{％Ｅｘｔｒａｐ}，ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｅｄ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ ａｔ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ；Ｖ_ｚ，ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ；ＣＬ，ｃｌｅａｒａｎｃｅ。

［実施例１２．ＥＬＩＳＡを用いたＦｃ変異体のＦｃγＲｓ結合力の測定］
ＦｃγＲｓとの結合力を測定するために０．０５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３ ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌで希釈したＩｇＧ Ｆｃ変異体をそれぞれ５０μｌずつ底平ポリスチレン高結合９６ウェルマイクロプレート（ｃｏｓｔａｒ）に４℃、１６時間固定化した後、１００μｌの４％スキームミルク（ＧｅｎｏｍｉｃＢａｓｅ）（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ７．４）で常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）１８０μｌで４回ずつ洗浄過程を行った後、１％スキームミルク（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ７．４）で連続希釈されたＦｃγＲｓを５０μｌ各ウェルに分注し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ＦｃＲｓはａｎｔｉ－ＧＳＴ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を行い、洗浄過程を行った。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５０μｌずつ添加して発色した後、２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を５０μｌずつ入れて反応を終了した後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ
Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて分析した。各実験はいずれも２連（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で行い、ＥＬＩＳＡの結果、それぞれのＦｃγＲｓ［ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ）、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ））に対する結合力が確認できた（図１６）。

［実施例１３．Ｆｃ変異体の抗体依存性細胞－媒介の細胞毒性（ＡＤＣＣ）による作動体機能（効果器機能）測定］
トラスツズマブＦｃ変異体の抗体依存性細胞－媒介の細胞毒性ＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性は、ＡＤＣＣリポーターバイオアッセイキット（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｂｉｏａｓｓａｙ ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７０１０）を用いて評価した。具体的に、標的細胞（Ｔａｒｇｅｔ
ｃｅｌｌｓ）として用いられるＳＫＢＲ－３を９６－ウェル組織培養プレートの各ウェルに５Ｘ１０^３ｃｅｌｌｓ／１００μｌずつ分注した後、３７℃ ＣＯ_２培養器で２０時間培養した。２０時間経過後、マルチピペットを用いてプレートの各ウェルにＳＵ９５μｌの培養培地を除去し、ＡＤＣＣリポーターバイオアッセイキットから提供されたＡＤＣＣアッセイバッファー２５μｌを各ウェルに分注した。Ｎｏｒｍａｌ ＩｇＧ、トラスツズマブとトラスツズマブＦｃ変異体は、ＡＤＣＣアッセイバッファーに濃度別に希釈して準備した後、細胞が存在する９６－ウェル組織培養プレートの各ウェル当たり２５μｌずつ分注し、効果器細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）を添加するまで常温に置いた。キットから提供する効果器細胞は、３７℃恒温水槽で２～３分間溶かした後に６３０μｌを取り、ＡＤＣＣアッセイバッファー３．６ｍＬと混合した。標的細胞と抗体希釈物を含むプレートに、準備した効果器細胞をウェル当たり２５μｌずつ分注した後、３７℃ ＣＯ_２培養器で６時間反応させた。時間が経過するとプレートを取り出して１５分間常温に置いた後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ^ＴＭルシフェラーゼアッセイ試薬をウェル当たり７５μｌずつ添加し、５分間常温で反応させた。反応後、ルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ，Ｅｎｓｐｉｒｅ ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を用いて各ウェルのルミネセンス（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を測定した。各試験抗体のＡＤＣＣ活性度は、実験した結果の平均値を誘導倍率（Ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）で表示し、次の式によって決定した：
Ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ＝
ＲＬＵ（ｉｎｄｕｃｅｄ^１－ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ^２）／ＲＬＵ（ｎｏａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｔｒｏｌ^３－ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）
１．ｉｎｄｕｃｅｄ：標的細胞、試験抗体そして効果器細胞が混合された試料から得られたＲＬＵ値
２．ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ：ＡＤＣＣアッセイバッファーから得たＲＬＵ値
３．ｎｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｔｒｏｌ：標的細胞と効果器細胞だけが混合された試料から得たＲＬＵ値。

ＳＫＢＲ－３に対するトラスツズマブとトラスツズマブＦｃ変異体（ＬＳ、ＹＴＥ、ＰＦＣ２９及びＰＦＣ４１）のＡＤＣＣ活性を相互比較した（図１７）。その結果、最高濃度における最大活性値を基準にして、各試験物質のＡＤＣＣ活性は、陽性）対照物質であるトラスツズマブに比べて、ＬＳは約１．５倍、ＰＦｃ２９は１．１８倍、そしてＰＦｃ４１は１．２７倍高かったが、ＹＴＥは４．２倍低い活性を示した。結果的に、トラスツズマブＦｃ変異体２種（ＰＦｃ２９及びＰＦｃ４１）と対照変異体ＬＳは、既存対照薬（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）よりも１．１８～１．５倍向上したＡＤＣＣ活性を示した。しかし、次の図に見られるように、測定された変異体それぞれのＥＣ５０値では、対照群ＬＳ（ＥＣ５０＝０．０５５７５ｕｇ／ｍＬ）に比べて本発明で見出したＦｃ変異体ＰＦｃ２９（ＥＣ５０＝０．０４５４３ｕｇ／ｍＬ）とＰＦｃ４１（ＥＣ５０＝０．０５４０５ｕｇ／ｍＬ）の方がより安定した効能を示すことを確認した（図１８）。

［実施例１４．ＥＬＩＳＡを用いたＦｃ変異体のＣ１ｑ結合力の測定］
Ｃ１ｑとの結合力を測定するために０．０５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３ ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌで希釈したＩｇＧ Ｆｃ変異体をそれぞれ５０μｌずつ底平ポリスチレン高結合９６ウェルマイクロプレート（ｃｏｓｔａｒ）に４℃、１６時間固定化した後、１００μｌの４％スキームミルク（ＧｅｎｏｍｉｃＢａｓｅ）（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ７．４）で常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）１８０μｌで４回ずつ洗浄過程を行った後、１％スキームミルク（ｉｎ ０．０５％ ＰＢＳＴ ｐＨ７．４）で連続希釈されたＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ１ｑ Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を５０μｌ各ウェルに分注して常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ａｎｔｉ－Ｃ１ｑ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を行い、洗浄過程を行った。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５０μｌずつ添加して発色した後、２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を５０μｌずつ入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて分析した。分析の結果、Ｃ１ｑ結合力が、先行研究で見出されたＬＳとＹＴＥに比べて、本研究で見出したＰＦｃ２９の方が高かった（図１９）。

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好ましい具現例に過ぎず、それらに本発明の範囲が制限されないという点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とその同等物によって定義されるべきであろう。

Claims (10)

1. ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体Ｆｃ変異体を含むポリペプチドであって、前記Ｆｃ変異体は野生型に比べて３０％以上増加した半減期を有しており、
   前記増加した半減期は前記野生型のヒト抗体のＦｃドメインにおけるアミノ酸置換によるものであり、
   前記半減期の３０％以上の増加のための前記アミノ酸置換は、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ヒト抗体ＦｃドメインでカバットのＥＵナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）に従うＭ４２８Ｌ及びＱ３１１Ｒのみからなる、ポリペプチド。
2. 請求項１のポリペプチドを含む抗体。
3. 前記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ドメイン抗体、二重特異的抗体、抗体模倣体、キメラ抗体、抗体接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、ヒト抗体又はヒト化抗体であるか、又はその断片であることを特徴とする、請求項２に記載の抗体。
4. 請求項１のポリペプチドをコードする核酸分子。
5. 請求項４の核酸分子を含むベクター。
6. 請求項５のベクターを含む宿主細胞。
7. 請求項１のポリペプチド、請求項２の抗体、請求項４の核酸分子又は請求項５のベクターを含む組成物。
8. 請求項１のポリペプチド、請求項４の核酸分子又は請求項５のベクターを含む組成物であり、
   前記組成物は、抗体又はタンパク質治療剤の血中半減期（Ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）増加用の組成物であることを特徴とする、組成物。
9. 下記の段階を含む、野生型に比べて半減期が増加したヒト抗体Ｆｃ変異体を含むポリペプチドの製造方法：
   ａ）請求項１のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する段階；及び
   ｂ）前記宿主細胞により発現したポリペプチドを回収する段階。
10. 下記の段階を含む、野生型に比べて半減期が増加した抗体の製造方法：
    ａ）請求項１のポリペプチドを含む抗体を発現させる宿主細胞を培養する段階；及び
    ｂ）前記宿主細胞から発現した抗体を精製する段階。

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