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JP7525400B2 - 植物体における還元糖含有量の調節 - Google Patents

植物体における還元糖含有量の調節 Download PDF

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JP7525400B2 JP2020551348A JP2020551348A JP7525400B2 JP 7525400 B2 JP7525400 B2 JP 7525400B2 JP 2020551348 A JP2020551348 A JP 2020551348A JP 2020551348 A JP2020551348 A JP 2020551348A JP 7525400 B2 JP7525400 B2 JP 7525400B2
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Description

本発明は、たばこ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ならびにその変異体、相同体、および断片に由来するスクロースシンターゼをコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列を開示する。それによりコードされるポリペプチド配列、ならびにその変異体、相同体、および断片も開示される。植物体またはその一部における還元糖のレベルを調節するための、一つ以上のＮｔＳＵＳ遺伝子の発現、またはそれによりコードされるＮｔＳＵＳポリペプチド（複数可）の機能もしくは活性の調節も開示される。
エアロゾルおよび煙中の風味化合物の放出が変化するたばこ材料を製造する必要性が、当該技術分野において継続的にある。エアロゾルおよび煙中のアクリルアミドの放出が変化するたばこ材料を製造する必要性も、当該技術分野において継続的にある。
本発明は、これらおよび他の必要性の対処に努める。
スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）は、スクロース合成に関与する鍵酵素、ならびに乾燥処理済みのたばこ葉におけるグルコース、フルクトース、ラクトース、およびマルトースなどの還元糖の蓄積を促進する鍵酵素である。ＳＵＳの発現を調節することによって、たばこ葉の乾燥処理の間および後の還元糖のプールを調節することが可能である。乾燥処理済みのたばこにおける還元糖の含有量の変化は、加熱で得られたたばこ風味の異なる知覚をもたらし得る。本明細書に記載されるように、特定のＮｔＳＵＳ遺伝子が乾燥処理中に過剰発現する一方で、他のものは過剰発現せず、還元糖のレベルの調節に貢献しない。しかしながら、これらの遺伝子は、他の代謝経路に関与している可能性が高く、それらの発現の変化によって、農学的に無害である表現型をもたらし得る（例えば、遅い成長）。どのＮｔＳＵＳ遺伝子が乾燥処理中に過剰発現するかを知ることによって、有利なことに、関連する遺伝子のみが変化する植物の選択が可能となり、他の代謝プロセスに対する潜在的な悪影響を減少させる。
ＮｔＳＵＳ１－Ｓ（配列番号１）、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ（配列番号３）、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ（配列番号５）、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ（配列番号７）、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ（配列番号９）、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ（配列番号１１）、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ（配列番号１３）、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ（配列番号１５）、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ（配列番号１７）、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ（配列番号１９）、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ（配列番号２１）、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔ（配列番号２３）を含む、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ由来のいくつかのＳＵＳゲノムポリヌクレオチド配列が本明細書に記載される。ＮｔＳＵＳ１－Ｓ（配列番号２）、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ（配列番号４）、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ（配列番号６）、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ（配列番号８）、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ（配列番号１０）、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ（配列番号１２）、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ（配列番号１４）、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ（配列番号１６）、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ（配列番号１８）、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ（配列番号２０）、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ（配列番号２２）、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔ（配列番号２４）の対応する推定ポリペプチド配列も開示されている。ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｔは、乾燥処理中に糖代謝において役割を果たし得る。ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｓは特に、乾燥処理中に糖代謝において役割を果たすことが示されている。たばこ乾燥処理中に、熱風送管乾燥処理済みのたばこは通常、空気乾燥処理済みのたばこよりも少なくとも８倍多い還元糖を含有し、これは主に、バージニアたばこにおけるデンプンの高い蓄積に起因する。しかしながら、植物の収穫後および老化プロセス中に、大部分のデンプンが最初にスクロースに、次いでスクロース代謝の鍵酵素として、ＳＵＳに関与する可能性が高い還元糖、ならびにインベルターゼがに変換される。したがって、本開示は、乾燥処理済みの植物材料中の還元糖含有量の調節において特に有用である。
一態様では、（ｉ）配列番号１、もしくは配列番号３、もしくは配列番号９、もしくは配列番号１１、もしくは配列番号１７、もしくは配列番号１９、もしくは配列番号２１、もしくは配列番号２３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリヌクレオチド、または配列番号５、もしくは配列番号７、もしくは配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリヌクレオチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２に対して少なくとも９４％の配列同一性、もしくは配列番号４に対して少なくとも９３％の配列同一性、もしくは配列番号６に対して少なくとも９５％の配列同一性、もしくは配列番号８に対して少なくとも９６％の配列同一性、もしくは配列番号１０もしくは配列番号１２に対して少なくとも９３％の配列同一性、もしくは配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性、もしくは配列番号１６に対して少なくとも９６％の配列同一性、もしくは配列番号１８に対して少なくとも８９％の配列同一性、もしくは配列番号２０に対して少なくとも９２％の配列同一性、もしくは配列番号２２に対して少なくとも９３％の配列同一性、もしくは配列番号２４に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチド、あるいは（ｉｖ）（ｉ）に記載した単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクター、を含む植物体細胞が記載され、前述の植物体細胞は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性が修飾されていない対照植物体細胞と比較して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性を調節する少なくとも１つの修飾を含む。
また、配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも６９％の配列同一性、または配列番号６もしくは配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性、または配列番号１０もしくは配列番号１２に対して少なくとも７４％の配列同一性、または配列番号１４もしくは配列番号１６に対して少なくとも７６％の配列同一性、または配列番号１８もしくは配列番号２０に対して少なくとも６８％の配列同一性、または配列番号２２もしくは配列番号２４に対して少なくとも６９％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドも記載される。
好適には、前述の植物体細胞は、配列番号５もしくは配列番号１３に対して少なくとも８０％の配列同一性、または配列番号９もしくは配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含む。
好適に、前述の植物体細胞は、配列番号６に対して少なくとも８１％の配列同一性、または配列番号１０もしくは配列番号１２に対して少なくとも７２％の配列同一性、または配列番号１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドを含む。
好適に、前述の植物体細胞は、配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性、または配列番号１０もしくは配列番号１２に対して少なくとも７４％の配列同一性、または配列番号１４に対して少なくとも７６％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドを含む。
好適には、少なくとも１つの修飾は、植物体細胞のゲノムの修飾、または構築物、ベクター、もしくは発現ベクターの修飾、またはトランスジェニック修飾である。
好適には、植物体細胞のゲノムの修飾、または構築物、ベクター、もしくは発現ベクターの修飾は、突然変異または編集である。
好適には、修飾によって、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性が、対照植物体細胞と比較して増加または減少する。
好適には、植物体細胞は、請求項１（ｉ）のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡの少なくとも１９ヌクレオチドに対して少なくとも８０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを含む。
好適には、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの調節された発現または活性は、対照植物体由来の葉における還元糖のレベルと比較して、植物体細胞由来の葉における還元糖のレベルを調節し、好適には、還元糖は、グルコースもしくはフルクトースであるか、または好適には、葉は、早期乾燥処理済みの葉もしくは乾燥処理済みの葉である。
別の態様では、本明細書に記載される植物体細胞を含む植物体またはその一部が記載される。
別の態様では、本明細書に記載される植物体またはその一部由来の植物材料、乾燥処理済みの植物材料、または均質化した植物材料が記載される。
好適には、植物材料は、本明細書に記載される植物体またはその一部からのバイオマス、種子、茎、花、または葉を含む。
好適には、乾燥処理済みの植物材料は、熱風送管乾燥処理、日光乾燥処理、または空気乾燥処理済みの植物材料である。
別の態様では、本明細書に記載される植物体細胞、本明細書に記載される植物体の一部、または本明細書に記載される植物材料を含むたばこ製品が記載される。
別の態様では、本明細書に記載される植物体を生成するための方法が記載され、配列番号１、もしくは配列番号３、もしくは配列番号９、もしくは配列番号１１、もしくは配列番号１７、もしくは配列番号１９、もしくは配列番号２１、もしくは配列番号２３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するか、または配列番号５、もしくは配列番号７、もしくは配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含む植物体細胞を提供する工程と、（ｂ）植物体細胞を修飾して、対照植物体細胞と比較して前述のポリヌクレオチドの発現を調節する工程と、（ｃ）植物体細胞を植物体に増殖させる工程と、を含む。
好適には、工程（ｃ）は、植物体細胞を含む挿し木または苗木から植物体を栽培することを含む。
好適には、植物体細胞を修飾する工程は、ゲノム編集またはゲノム工学によって細胞のゲノムを修飾することを含む。
好適には、ゲノム編集またはゲノム工学は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発、化学的突然変異誘発または放射線突然変異誘発、相同的組み換え、オリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発、およびメガヌクレアーゼ媒介突然変異誘発から選択される。
好適には、植物体細胞を修飾する工程は、構成的プロモーターに作用できるように連結された、配列番号１、もしくは配列番号３、もしくは配列番号９、もしくは配列番号１１、もしくは配列番号１７、もしくは配列番号１９、もしくは配列番号２１、もしくは配列番号２３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するか、または配列番号５、もしくは配列番号７、もしくは配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含む構築物で、細胞をトランスフェクトすることを含む。
好適には、植物体細胞を修飾する工程は、請求項１（ｉ）のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡに対して少なくとも８０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを、細胞に導入することを含む。
好適には、植物体細胞は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡの少なくとも１９ヌクレオチドに対して少なくとも８０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを発現させる構築物でトランスフェクトされる。
別の態様では、対照植物材料と比較して変化した量の還元糖を有する乾燥処理済みの植物材料を生成するための方法が記載され、（ａ）本明細書に記載される植物体もしくはその一部または植物材料を提供する工程と、（ｂ）植物材料をそこから収穫する工程と、（ｃ）植物材料を乾燥処理する工程と、を含む。
好適には、植物材料は、乾燥処理済みの葉、乾燥処理済みの茎、もしくは乾燥処理済みの花、またはそれらの混合物を含む。
好適には、乾燥処理方法は、空気乾燥処理、火力乾燥処理、煙乾燥処理、および熱風送管乾燥処理からなる群から選択される。
いくつかの利点
有利なことに、本明細書に記載されるＮｔＳＵＳポリヌクレオチド配列は、乾燥処理中に、特に乾燥処理の開始から発現する。一つ以上のＮｔＳＵＳポリヌクレオチド配列の発現の調節は、乾燥処理済みのたばこ葉におけるグルコースおよびフルクトースなどの還元糖のレベルの調節ももたらすことができる。特に、一つ以上のＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの発現の増加または減少は、還元糖のレベルの増加または減少、および加熱によりそこから得られたたばこの異なる知覚をもたらすことができる。
紙巻たばこの煙において、還元糖は、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、アセトン、２－フルフラル、およびアクロレインなどのカルボニル構成成分の放出に影響を与える（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｍｏｋｅ，２nd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｏｄｇｍａｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｅｔｔｉ，２０１６を参照）。したがって、還元糖含有量は、そのようなカルボニル化合物の放出を変化させ得る。エアロゾルおよび煙における芳香放出に関して、グルコース、および比較的程度は小さいがフルクトースは、加熱によりアミノ酸と相互作用するとき、メイラード反応を介してアマドリ化合物を生成し得る。遊離アミノ酸は、この化学反応の制限要因とみなされるが、還元糖の存在は、アマドリ化合物の形成を可能にするために必要である。パン、ナッツ、またはポップコーンのような風味は、プロリンおよびグルコースを加熱し、したがって２－アセチル－１－ピロラインのような生成物を生成することに起因する。プロリンおよび還元糖が、特に熱風送管乾燥処理済みのたばこにおいて豊富であるため、バージニアたばこの加熱または喫煙時にナッツのような特徴が得られる。ブレンド中では、アクリルアミド（加熱によるグルコース（フルクトース）とアスパラギンの相互作用によって生じる発癌性化合物）は典型的には、バーレーたばこ（アスパラギン中で豊富）と、バージニア（還元糖中で豊富）たばこの組み合わせによって生じ得る。したがって、還元糖対アミノ酸のバランスの改変は、エアロゾルおよび煙中の風味化合物およびアクリルアミドの両方の放出に影響を与え得る。
有利なことに、加熱されたたばこのたばこ材料の再組み合わせは、適切なキャストリーフ調製のための還元糖を必要とすることが多い。葉の乾燥処理中のＳＵＳ遺伝子の発現の調節は、還元糖の含有量およびバランスに影響を与え、それによりキャストリーフ調製に影響を与え得る。有利なことには、消費者により受け入れられ得る非遺伝子改変植物体が生成され得る。
有利なことには、本開示は、ＥＭＳ突然変異体である植物体の使用に制限されるものではない。ＥＭＳ突然変異体である植物体は、育種後の作物に改善特性をもたらす可能性が低い場合がある。一旦育種を開始すると、ＥＭＳ突然変異体である植物体の望ましい特性は種々の理由で失われうる。例えば、いくつかの突然変異が所望され、その突然変異は優性であるかまたは劣性である可能性があり、遺伝子標的における点突然変異を特定するのが困難である恐れがある。対照的に、本開示は、所望の表現型を有する植物体を生成するために特異的に操作され得るＮｔＡＡＴポリヌクレオチドを活用する。本開示は、様々な植物品種または作物に適用され得る。
収穫（成熟）後、２日間の乾燥処理（４８時間の乾燥処理）後、および乾燥処理の終了時の、還元糖の種類毎の含有量を示す棒グラフである。
本開示で使用する段落の見出しは系統立てるためであり、限定することを意図していない。
１．定義
他に断りがない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているのと同じ意味を有する。矛盾がある場合は定義を含めて本文書が適用される。好ましい方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載するものと類似または同等の方法および材料は、本発明の実施または試験で使用しうる。本明細書で開示する材料、方法、および例は単なる例示であり、制限することを意図していない。
本明細書で使用されるとき、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）］、「ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ）］、「ｈａｖｉｎｇ］、「ｈａｓ」「ｃａｎ」、「ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ）」およびその変形は、付加的な作用または構成の可能性を除外しないオープンエンド移行句、用語または言葉であることを意図する。
単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は文脈に別段の表示がある場合を除き複数の意味を含む。
「および／または」という用語は、（ａ）もしくは（ｂ）、または（ａ）および（ｂ）の両方を意味する。
本開示は、明示的な記載または非記載にかかわらず、本明細書に提示した実施形態または要素を「備える」、「からなる」および「から本質的になる」他の実施形態も意図する。
本明細書の数値範囲の詳細説明として、その間の中間の各数字も同程度の精度で明確に意図される。例えば、６－９の範囲では、数字６と９に加えて数字７と８が意図されており、６．０－７．０の範囲では、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０が明確に意図される。
明細書および特許請求の範囲全体で使用される以下の用語は次の意味を有する。
「コード配列」または「ポリヌクレオチドをコードする」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。さらに、コード配列は、ポリヌクレオチドが投与される個体または哺乳動物の細胞で発現を導くことが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含め、制御要素に作用可能に連結される開始および終結シグナルを含むことができる。コーディング配列は最適化コドンとすることができる。
「相補体」または「相補的」とは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン－クリック（例えば、Ａ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を意味することができる。「相補性」は、例えば、相互に逆平行に整列するときに各位置のヌクレオチド塩基が相補的であるような、２つのポリヌクレオチド間で共有される特性を指す。
「構築物」は、一つ以上のポリヌクレオチドを含む二本鎖の組み換え体ポリヌクレオチド断片を指す。構築物は、補完的「センス鎖またはコード鎖」と対になった「テンプレート鎖」塩基を含む。所定の構築物を、ベクター（発現ベクターなど）内に位置するプロモーターの向きに対して同一（またはセンス）または反対（またはアンチセンス）のいずれかの方向に、可能性のある２つの方向でベクターに挿入できる。
対照植物体または対照植物体細胞の文脈での「対照」という用語は、一つ以上の遺伝子またはポリペプチドの発現、機能、または活性が修飾（例えば、増加または減少）されておらず、そのため、それが同じ一つ以上の遺伝子またはポリペプチドの発現、機能、または活性が修飾されている植物体との比較を提供することができる、植物体または植物体細胞を意味する。本明細書で使用されるとき、「対照植物体」は、試験パラメーター以外の全パラメーターで試験植物体または改質した植物体と実質的に等価な植物である。例えば、ポリヌクレオチドが導入された植物体に言及するとき、対照植物体は、そのようなポリヌクレオチドが導入されていない等価な植物である。対照植物体は、対照ポリヌクレオチドが導入された等価な植物であり得る。そのような例では、対照ポリヌクレオチドは、植物体にほとんどまたは全く表現型効果をもたらさないことが期待されているものである。対照植物体は、空のベクターを備えうる。対照植物体は、野生型植物に相当しうる。対照植物体は、Ｔ１分離体が導入遺伝子をもはや持たないヌル分離体でもあり得る。
「ドナーＤＮＡ」または「ドナー鋳型」は、対象の遺伝子の少なくとも一部分を含む二本鎖ＤＮＡ断片または分子を指す。ドナーＤＮＡは、完全機能ポリペプチドまたは部分機能ポリペプチドをコードすることができる。
「内在性遺伝子またはポリペプチド」は、有機体のゲノムに由来し、遺伝子材料の欠失、獲得、または交換などの変化を受けない遺伝子またはポリペプチドを指す。内在性遺伝子は、正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を経る。内在性ポリペプチドは、正常な発現を受ける。
「エンハンサー配列」は、遺伝子発現を増加させることができる配列を指す。これらの配列は、上流、イントロン内または転写領域の下流に位置することができる。転写領域は、プロモーターから転写終結領域までのエクソンと介在イントロンから成る。遺伝子発現の増大は、転写効率の増加、成熟ｍＲＮＡの安定化、および翻訳の強化を含む様々な機構によってできる。
「発現」は、機能的産物の生成を意味する。例えば、ポリヌクレオチド断片の発現は、ポリヌクレオチド断片の転写（例えば、ｍＲＮＡもしくは機能性ＲＮＡが生じる転写）、および／またはｍＲＮＡの前駆体または成熟ポリペプチドへの翻訳）を意味し得る。「過剰発現」は、同じ実験のヌル分離（または非トランスジェニック）有機体での産生レベルを超えるトランスジェニック有機体における遺伝子産物の生成を意味する。
「機能性」および「完全機能性」は、生物学的機能または活性を有するポリペプチドを説明する。「機能遺伝子」は、機能性または活性ポリペプチドに翻訳されるｍＲＮＡへ転写される遺伝子を意味する。
「遺伝子構築物」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、発現を導くことが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御要素に作用可能に連結される開始および終結シグナルを含むことができる。
「ゲノム編集」は、アミノ酸置換を有する切断型内在性ポリペプチドまたは内在性ポリペプチドのポリペプチド発現が得られるような、内在性ポリペプチドをコードする内在性遺伝子の変化を意味する。ゲノム編集は、ＨＤＲなどの修復機構による切断またはアミノ酸置換を有する遺伝子のコピーを用いて、標的化される内在性遺伝子の領域を置き換えるか、または内在性遺伝子全体を置き換えることを含むことができる。ゲノム編集は、その後にＮＨＥＪによって修復される内在性遺伝子における二本鎖切断を発生させることによる、内在性遺伝子におけるアミノ酸置換の発生も含み得る。ＮＨＥＪは、アミノ酸置換が起き得る修復の間に少なくとも１つの塩基対を追加または削除できる。ゲノム編集は、２つのヌクレアーゼ標的部位間の切断とＮＨＥＪによるＤＮＡ切断の修復を作り出すために、同じＤＮＡ鎖で２つのヌクレアーゼの同時作用による遺伝子セグメントの削除も含めることができる。
配列に関する「非相同性」は、外来種を起源とする配列、または同種に由来する場合は慎重な人の介入によって構成および／またはゲノム遺伝子座が生来の形態から大幅に改変される配列を意味する。
「相同組み換え修復」または「ＨＤＲ」は、１片の相同ＤＮＡが、主に細胞周期のＧ２およびＳ期に核中に存在するとき、二本鎖ＤＮＡ損傷を修復する細胞機構を意味する。ＨＤＲはドナーＤＮＡまたはドナー鋳型を使って修復を案内し、また遺伝子全体の選択的付加を含め、ゲノムへの特異的配列変化を作り出すことができる。ドナー鋳型が部位特異的ヌクレアーゼと共に提供される場合、その後の細胞機構が相同組み換えによって切断を修復するが、これはＤＮＡ切断の存在下で桁違いに増大する。相同ＤＮＡ片が存在しないと、代わりにＮＨＥＪが行われ得る。
「相同性」または「類似性」という用語は、配列の整列によって比較した２個のポリペプチド間または２個のポリヌクレオチド分子間の配列の類似性の度合いを意味する。比較対象の２個の不連続なポリヌクレオチド間の相同性の度合いは、比較可能な位置での同一または一致するヌクレオチドの数の関数である。
２つまたは以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの文脈での「同一」または「同一性」は、配列が特定領域にわたり同じである残基を一定比率有することを意味する。同一配列の比率は、２つの配列を最適に整列し、特定領域で２つの配列を比較し、両配列で存在する同一残基の位置の数を測定して順序が一致した位置数を得て、特定領域の合計位置数で除し、その結果に１００を乗じて算出することができる。２つの配列が異なる長さを持つ場合、あるいは整列によって一つ以上の互い違いの末端が生じ、比較対象の特定領域が単一配列しか含まない場合は、単一配列の残基は計算の分母に含め、分子に含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較するとき、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は等価とみなしうる。同一性は、手動で、またはＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、もしくはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎなどのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって決定され得る。一般的な多重整列プログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４）２２，４６７３－４６８０、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９７），２４，４８７６－４８８２）は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの多重整列を作成するのに好適な方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの適切なパラメータは以下の通りである：ポリヌクレオチド整列について：ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティ＝６．６６、行列＝Ｉｄｅｎｔｉｔｙ。ポリペプチド整列について：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、行列＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびタンパク質の整列について：ＥＮＤＧＡＰ＝－１、およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列の整列のためにこれらのパラメータおよび他のパラメータを変える必要がありうることに留意するであろう。続いて、好適には、同一性のパーセント計算値は、こうした整列からＮ／Ｔ（Ｎは、配列が同一残基を共有している位置の数、Ｔは、ギャップを含めるがオーバーハングを除いて比較される位置の総数である）として計算される。
「増加」または「増加した」という用語は、限定はされないが、ポリペプチド機能もしくは活性、転写機能もしくは活性、および／またはポリペプチド発現などの、量または機能もしくは活性の約１０％～約９９％の増加、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、もしくは少なくとも２００％、またはそれ以上の増加を意味する。「増加した」という用語または「増加した量」という句は、修飾されていない、植物または同様式で加工された同品種の植物体由来の製品で発見されるものよりも多い、修飾植物体または修飾植物体から製造した製品の量または機能もしくは活性を意味することができる。したがって、一部の文脈では、同様式で加工された同品種の野生型植物体が、量の増加が得られるかどうかを測定するための対照として使用される。
本明細書で使用されるとき、「増加」または「増加した」という用語は、ポリペプチド機能、転写機能、またはポリペプチド発現などの量または機能の約１０％～約９９％の減少、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％以上の減少を意味する。「増加した」という用語または「増加した量」という句は、修飾されていない、植物または同様式で加工された同品種の植物体由来の製品で発見されるものよりも少ない、修飾植物体または修飾植物体から製造した製品の量または機能を意味することができる。したがって、一部の文脈では、同様式で加工された同品種の野生型植物体が、量の減少が得られるかどうかを測定するための対照として使用される。
「抑制する」または「抑制された」という用語は、限定はされないが、ポリペプチド機能もしくは活性、転写機能もしくは活性、および／またはポリペプチド発現などの、量または機能もしくは活性の約９８％～約１００％の減少、または少なくとも９８％、少なくとも９９％であるが、特に１００％の減少を意味する。
「導入される」という用語は、ポリヌクレオチド（例えば、構築物）またはポリペプチドを細胞に提供することを意味する。「導入される」は、ポリヌクレオチドが細胞のゲノムに組み込まれ得る、真核細胞へのポリヌクレオチドの取り込みへの言及を含み、細胞へのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの過渡的な供給への言及を含む。「導入される」は、安定的または過渡的な形質転換方法、ならびに性的交雑への言及を含む。したがって、ポリヌクレオチド（例えば、組み換え体構築物／発現構築物）を細胞に挿入する文脈での「導入される」は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、ポリヌクレオチドが細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ、自律レプリコンに変換され、または過渡的に発現（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）し得る真核細胞へのポリヌクレオチドの取り込みへの言及を含む。
「単離される」または「精製される」という用語は、その天然の状態で発見されたときに、通常はそれに付随する構成成分を実質的または本質的に含まない材料を意味する。純粋および均一性は、一般的にポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して測定される。調製物中に存在する優勢種であるポリペプチドは、十分に精製される。特に、単離ポリヌクレオチドは、所望の遺伝子に隣接し、所望のポリペプチド以外のポリペプチドをコードする、オープンリーディングフレームから分離される。本明細書で使用されるとき、「精製される」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが電気泳動ゲルで本質的に１つのバンドを引き起こすことを意味する。具体的には、これは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。単離されるポリヌクレオチドは、天然に存在する宿主細胞から精製することができる。当業者に既知の従来型のポリヌクレオチド精製方法を使用して、単離ポリヌクレオチドを得ることができる。また、この用語は組み換え体ポリヌクレオチドおよび化学的に合成したポリヌクレオチドも包含しうる。
「調節する」または「調節すること」とは、対象のプロセス、経路、機能、または活性における定性的または定量的な変化、変更、または改変を引き起こすか、または促進することを指す。限定されないが、そのような変化、変更、または改変は、対象の相対的なプロセス、経路、機能、または活性の増加または減少であり得る。例えば、遺伝子発現もしくはポリペプチド発現、またはポリペプチド機能もしくは活性は、調節され得る。典型的には、相対的な変化、変更、または改変は、対照と比較することによって決定される。
本明細書で使用されるとき、「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路」は、相同的鋳型を必要としないで切断末端を直接ライゲーションすることによってＤＮＡ中の二重鎖切断を修復する経路を意味する。ＮＨＥＪによるＤＮＡ末端の鋳型非依存性連結反応は、ＤＮＡ切断点にランダムな微小挿入と微小欠失（ｉｎｄｅｌ）を導入する確率的、エラー誘発修復プロセスである。この方法を使用して、標的遺伝子配列のリーディングフレームを意図的に破壊、削除または変化させることができる。ＮＨＥＪは、一般的に微小相同と呼ばれる短い相同ＤＮＡ配列を使用して修復を案内する。これらの微小相同は、しばしば二重鎖切断の末端上の一本鎖オーバーハングに存在する。オーバーハングが完全に相溶性であるときに、通常、ＮＨＥＪが正確に切断を修復するが、ヌクレオチドの損失に至る不正確な修復が起きる可能性があり、オーバーハングが相溶性でないときがはるかに一般的である。
「非天然の」という用語は、天然では形成されないか、または天然には存在しないポリヌクレオチド、遺伝子突然変異、ポリペプチド、植物体、植物体細胞、および植物材料などの物質を説明する。こうした非天然の物質または人工的な物質は、本明細書で説明したか、または当業界において公知の方法によって、作成、合成、開始、修飾、介在、または操作されうる。こうした非天然の物質または人工的な物質は、人によって作成、合成、開始、修飾、干渉、または操作されうる。こうして、一例として、非天然の植物体、非天然の植物体細胞または非天然の植物材料は、伝統的な植物体育種テクニック（戻し交雑など）を使用して、または遺伝子操作技術（アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、メガヌクレアーゼおよびこれに類するものなど）により作成されうる。さらなる例として、非天然の植物体、非天然の植物体細胞または非天然の植物材料は、結果的に得られる植物体、植物体細胞または植物材料またはその子孫が天然では形成されないかまたは天然には存在しない遺伝的構成（例えば、ゲノム、染色体またはそのセグメント）を含むように、一つ以上の遺伝的突然変異（例えば、一つ以上の多型）を第一の植物体または植物体細胞から第二の植物体または植物体細胞（これはそれ自体が天然でありうる）に遺伝子移入するかまたは移動することで作成しうる。結果的に得られる植物体、植物体細胞または植物材料は、こうして人工的なものであるか、または天然のものではない。したがって、人工的または非天然の植物体または植物体細胞は、結果的に得られる遺伝子配列が第一の植物体または植物体細胞とは異なる遺伝的背景を備える第二の植物体または植物体細胞内で自然発生する場合であっても、第一の天然の植物体または植物体細胞内での遺伝子配列を修飾することにより作成しうる。ある特定の実施形態では、突然変異は、遺伝子またはポリペプチドなど、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド中に天然に存在する天然の突然変異ではない。遺伝的背景の差異は、表現型的差異により、またはポリヌクレオチド配列決定、遺伝的マーカー（例えば、ミクロサテライトＲＮＡマーカー）の存在または非存在など、当該技術分野において既知の分子生物学技術により検出され得る。
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、共有結合で共に結合される少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写は相補鎖の配列も定義する。したがって、ポリヌクレオチドは、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。ポリヌクレオチドの多くの変異体が所与のポリヌクレオチドと同じ目的で使用され得る。したがって、１つのポリヌクレオチドが実質的に同一のポリヌクレオチドおよびその相補体も包含する。一本鎖は、厳密なハイブリッド形成条件下で所与の配列にハイブリッド形成し得るプローブを提供する。したがって、ポリヌクレオチドは、厳密なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するプローブも包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含有してもよい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、または混成体であってもよく、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ－ヌクレオチドとリボ－ヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得る。ポリヌクレオチドは、化学的合成法または組み換え法によって得られる。
相補的断片をハイブリッド形成するための一本鎖ＤＮＡの特異性は、反応条件の「厳密さ」によって決定される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９））。ハイブリッド形成厳密性はＤＮＡ二重鎖を形成する傾向が減少するにつれて増加する。ポリヌクレオチドハイブリッド形成反応において、例えば、ライブラリから完全長クローンを同定するために使用され得る特異的ハイブリッド形成（高度な厳密性）を支持するように厳密さが選択され得る。特異性が低いハイブリッド形成（低い厳密性）を使用してＤＮＡ分子またはセグメントを正確ではないが関連を確認する（相同であるが同一ではない）ことができる。ＤＮＡ二重鎖は、（１）相補的塩基対の数、（２）塩基対のタイプ、（３）反応混合物の塩濃度（イオン強度）、（４）反応温度、および（５）ＤＮＡ二重鎖の安定性を減少させるホルムアミドなどの特定の有機溶媒の存在によって安定化される。一般に、プローブが長くなると、適当なアニーリングに必要な温度が高くなる。一般的な手法は温度を変えることであり、相対温度が高くなると反応条件がより厳しくなる。「厳密な条件下」でハイブリッド形成するということは、相互に少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列がハイブリッド形成されたままである、ハイブリッド形成プロトコルを説明している。一般に、厳密な条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで、特定配列の融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、所与の配列に相補的なプローブの５０％が所与の配列に平衡でハイブリッド形成する温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、およびポリヌクレオチド濃度下）である。所与の配列がＴｍで一般に過剰に存在するため、プローブの５０％が平衡状態で占められる。
「厳密なハイブリッド形成条件」は、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドがその特異的配列にハイブリッド形成することを可能にする条件である。厳密な条件は配列依存的であり、かつ相違する。厳密な条件は典型的には、（１）低イオン強度および高温洗浄、例えば、５０℃で１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、（２）ハイブリッド形成中の変性剤、例えば、４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）、または（３）５０％ホルムアミドを含む。また、一般的に洗浄液は、４２℃、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを含み、４２℃で０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃で５０％ホルムアミド洗浄し、次いで５５℃でＥＤＴＡ含有の０．１ｘＳＳＣから成る高厳密洗浄液で洗浄する。好適には、この条件は、例えば相互に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同の配列が通常、相互にハイブリッド形成されたままであるようなものである。
「中程度の厳密条件」は、洗浄溶液、およびポリヌクレオチドがポリヌクレオチドの全体、断片、誘導体、または類似体にハイブリッド形成するような、厳密性が低いハイブリッド形成条件を使用する。１例は、５５℃で６ｘＳＳＣ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ中のハイブリッド形成、続く３７℃、１ｘＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで１回または複数回洗浄する。温度、イオン強度などはプローブの長さなどの実験的要因に適合するように調節することができる。他の中程度の厳密性条件は記載されている（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照）。
「低い厳密条件」は、洗浄溶液、およびポリヌクレオチドがポリヌクレオチドの全体、断片、誘導体、または類似体にハイブリッド形成するような、中程度の厳密性よりも厳密性が低いハイブリッド形成条件を使用する。低い厳密性ハイブリッド形成条件の非限定的な例には、３５％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／体積）硫酸デキストラン中４０℃でハイブリッド形成し、次いで、５０℃で２ｘＳＳＣ、２５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳ中で１回以上の洗浄が含まれる。交差種ハイブリッド形成などの他の低い厳密性条件は、十分に記載されている（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０を参照）。
「作用可能に連結される」は、遺伝子発現が空間的に結合されるプロモーター制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下で遺伝子の５’（上流）または５’（下流）に位置しうる。プロモーターと遺伝子の間の距離は、プロモーター由来の遺伝子で調節する、遺伝子とプロモーターの間の距離とほぼ同じとすることができる。当該技術分野で公知なように、プロモーター機能の喪失せずにこの距離の変更を行うことができる。「作用可能に連結される」とは、１つの機能がもう１つによって調節されるような、単一断片でのポリヌクレオチド断片の会合を意味する。例えば、プロモーターは、ポリヌクレオチド断片の転写を調節することが可能であるときに、ポリヌクレオチド断片に作用可能に連結されている。
「植物体」という用語は、そのライフサイクルまたは発育の任意の段階にある任意の植物体、およびその子孫を意味する。一つの実施形態では、植物はたばこ植物であり、これはたばこ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）に属する植物を意味する。この用語は、植物全体、植物器官、植物組織、植物珠芽、植物種子、植物体細胞、およびその子孫への言及を含む。植物体細胞として、限定はされないが、種子、懸濁培養、胚、分裂組織部位、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉および花粉粒の細胞が挙げられる。好適な種、栽培種、混成体、および品種のたばこ植物が本明細書で記載されている。
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド断片」は、本明細書において互換的に使用され、合成、非天然、または改変ヌクレオチド塩基を任意に含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ヌクレオチド（通常、５’－一リン酸塩形態で発見される）は、下記の一文字表示、アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡ）に対しては「Ａ」、シチジレートまたはデオキシシチジル酸に対しては「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸に対しては「Ｇ」、ウリジル酸に対しては「Ｕ」、デオキシチミジル酸に対しては「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）の対しては「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対しては「Ｙ」、ＧまたはＴに対しては「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対しては「Ｈ」、イノシンに対しては「Ｉ」、および任意のヌクレオチドに対しては「Ｎ」で示される。したがって、ポリヌクレオチドは、限定はされないが、ゲノムＤＮＡ、補完的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡまたはその断片とすることができる。その上、ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖、一本鎖および二本鎖の領域の混合物、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む混成体分子、または一本鎖および二本鎖の領域もしくはその断片（複数可）の混合物を有する混成体分子であり得る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方またはその断片を含む、三重鎖領域で構成されることもできる。ポリヌクレオチドは、ホスホチオアートなどの一つ以上の変性塩基を含むことができ、またペプチド核酸（ＰＮＡ）とすることができる。一般的に、ポリヌクレオチドは、単離したかまたはクローン化したｃＤＮＡの断片、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、または個別ヌクレオチド、上記の組み合わせから組み立てることができる。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列として示されているが、ポリヌクレオチドは、それらの対応するＲＮＡ配列、およびその逆相補体を含むそれらの相補的（例えば、完全に補完的な）ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。本開示のポリヌクレオチドは、添付の配列表に記載されている。
「ポリペプチド」または「ポリペプチド配列」は、一つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸のポリマー、ならびにアミノ酸の天然のポリマーを指す。これらの用語は、限定されないが、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、水酸化、およびＡＤＰリボース化を含む修飾も含む。本開示のポリペプチドは、添付の配列表に記載されている。
「プロモーター」は、細胞におけるポリヌクレオチドの発現を付与、活性化、または増強することが可能である合成または天然由来分子を意味する。この用語は、一般に上流に位置し、二本鎖ポリヌクレオチド断片に作用可能に連結されたポリヌクレオチドの要素／配列を意味する。プロモーターは、対象の未変性遺伝子の近傍の領域に完全に由来し得るか、または異なる未変性プロモーターもしくは合成ポリヌクレオチドセグメントに由来する異なる要素から構成され得る。プロモーターは、さらに発現を高めたり、および／またはその空間的発現および／または過渡的発現を変えたりするために、一つ以上の特異的転写制御配列を備えることができる。プロモーターは、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素を備えてもよく、転写の開始部位から数千程の塩基対を配置することができる。プロモーターはウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫および動物を含む発生源を由来にできる。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織または器官に対して、または発現が起こる成長段階に対して、あるいは生理的ストレス、病原体、金属イオンまたは誘発剤などの外部刺激に応じて構成的または差別的に遺伝子成分の発現を調節することができる。
本明細書で交互に使用されるとき、「組織特異的プロモーター」および「組織好適プロモーター」は、必ずしも一つの組織または器官だけで発現するのではなく、一つの特定の細胞でも発現するプロモーターを意味する。「発生的に調節されたプロモーター」は、その機能が発生事象によって決定されるプロモーターを意味する。「構成的プロモーター」は、遺伝子を大部分の細胞型においてほとんどの場合に発現させるプロモーターを指す。「誘導プロモーター」は、例えば、化合物（化学誘導物質）による内因的もしくは外因的刺激の存在に応じて、または環境、ホルモン、化学、および／または発生シグナルに応じて、作用可能に連結されたＤＮＡ配列を選択的に発現させる。誘導プロモーターまたは調節されたプロモーターの例として、光、熱、ストレス、フラッディングもしくは乾燥、病原体、植物ホルモン、創傷、またはエタノール、ジャスモン酸、サリチル酸、もしくは薬害軽減剤などの化学物質によって調節されるプロモーターが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「組み換え体」は、化学合成、または遺伝子組み換え技術によるポリヌクレオチドの単離セグメントの操作などによる、２つのそうでなければ分離した配列セグメントの人工的組み合わせを意味する。この用語はまた、非相同ポリヌクレオチドの導入によって修飾された細胞もしくはベクター、またはそのように修飾された細胞由来の細胞への言及を含むが、慎重な人の介入なしに発生するものなど、天然の事象（例えば、自然突然変異、自然形質転換または形質導入または転位）による細胞またはベクターの改変を包含しない。
「組み換え体構築物」は、通常天然では一緒に発見されないポリヌクレオチド断片の組み合わせを意味する。したがって、組み換え体構築物は、異なる供給源に由来する制御配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、通常天然で発見されるものとは異なる様式で配列された制御配列およびコード配列を含み得る。組み換え体構築物は、組み換えＤＮＡ構築物であり得る。
本明細書で互換的に使用されるとき、「調節配列」および「調節要素」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすポリヌクレオチド配列を意味する。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列が挙げられる。「調節配列」および「調節要素」という用語は本明細書で交互に使用される。
「部位特異的ヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ配列を特異的に認識または開裂することができる酵素を意味する。部位特異的ヌクレアーゼを改変することができる。改変した部位特異的ヌクレアーゼの例として、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬ、エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系システム、およびメガヌクレアーゼが挙げられる。
「たばこ」という用語は、たばこ作物（例えば、圃場で栽培し、水耕で栽培されていない複数のたばこ植物）、たばこ植物、ならびに本明細書に記載されるように調製および／または取得された根、茎、葉、花、および種子を含むが、これらに限定されないその一部を指すように集合的な意味で使用される。「たばこ」は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物およびその製品を含むことが理解される。
「たばこ製品」という用語は、限定はされないが、喫煙材料（例えば、紙巻たばこ、シガー、およびパイプたばこ）、嗅ぎたばこ、噛みたばこ、ガム、およびトローチ剤、ならびに消費者たばこ製品の製造のための構成要素、材料、および成分を含む、消費者たばこ製品を意味する。好適には、これらのたばこ製品は、たばこから収穫したたばこ葉および葉柄から製造され、たばこ調製物中で従来型技術に従って切断、乾燥、乾燥処理、および／または発酵させる。
「転写ターミネーター」、「終止配列」、または「ターミネーター」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を意味し、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸配列の付加に影響を与える特徴がある。
「トランスジェニック」は、ゲノムが組み換え体構築物などの非相同ポリヌクレオチドの存在によって変化した任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部分、または植物体を意味し、それらの最初のトランスジェニック事象、ならびに最初のトランスジェニック事象から性的交雑または無性繁殖によって作られたものが含まれる。この用語は、在来型植物育種方法または天然の事象（例えば、無作為他家受精、非組み換え型ウイルス感染、非組み換え型細菌形質転換、非組み換え型転位、または自然的変異など）によるゲノム（染色体または染色体外）の変化を包含しない。
「トランスジェニック植物」は、そのゲノム内に一つ以上の非相同ポリヌクレオチドを含む植物体、すなわち、通常その中では発見されず、人為的操作によって問題の植物（またはその植物の祖先）に導入されている、組み換え体遺伝子材料を含む植物体を指す。例えば、非相同ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが継続世代に伝わるように安定的にゲノム内に統合され得る。非相同ポリヌクレオチドは、単独で、または組み換え体ＤＮＡ構築物の一部としてゲノムに統合することができる。また、遺伝的改良生殖質の商業開発は、複数形質を導入する段階まで進み、しばしば遺伝子スタッキング手法と呼ばれている。当該手法では、対象の異なる特性を付与する複数遺伝子を植物に導入することができる。遺伝子スタッキングは、限定はされないが、同時形質転換、再形質転換、および異なる導入遺伝子を持つ交雑系統を含む多くの手段によって達成することができる。したがって、組み換え体ＤＮＡが形質転換によって導入された物細胞から栽培した植物はトランスジェニック植物であり、導入した導入遺伝子を含む植物の全子孫（有性生殖または無性生殖にかかわらず）も同様である。トランスジェニック植物という用語は、植物または樹木の全体および植物または樹木の部分、例えば、穀粒、種子、花、葉、根、果実、花粉、茎などを包含することが理解される。各非相同ポリヌクレオチドがトランスジェニック植物に異なる形質を付与することができる。
「転写活性化因子様エフェクター」または「ＴＡＬＥ」は、特定のＤＮＡ配列を認識して結合するポリペプチド構造を意味する。「ＴＡＬＥ ＤＮＡ－結合ドメイン」は、ＲＶＤモジュールとしても知られ、各ＲＶＤモジュールがＤＮＡの単一塩基対を特異的に認識する縦列３３－３５アミノ酸反復配列を含むＤＮＡ結合ドメインを意味する。定義された配列を認識するアレイを組み立てるためにＲＶＤモジュールを任意の順序で配置することができる。ＲＶＤアレイに続いて２０個のアミノ酸の単一短縮型反復によってＴＡＬＥ ＤＮＡ－結合ドメインの結合特異性が決定される。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは１２～２７ＲＶＤモジュールを持つことができ、各モジュールがＲＶＤを含み、単一のＤＮＡ塩基対を認識する。４つの可能なＤＮＡヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）を個々に認識する特異的ＲＶＤが同定されている。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがモジュールのため、任意の特定のＤＮＡ配列を認識するために４つの異なるＤＮＡヌクレオチド認識する反復を一緒に連結させることができる。次に、これらの標的化ＤＮＡ結合ドメインを人工転写因子は触媒ドメインに結合し、メチルトランスフェラーゼ、インテグラーゼ、ヌクレアーゼおよびリコンビナーゼを含め、機能的酵素を作り出すことができる。
本明細書で互換的に使用されるとき、「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」または「ＴＡＬＥＮ」は、エンドヌクレアーゼＦｏｋＩなどのヌクレアーゼの触媒ドメイン、およびカスタムＤＮＡ配列に標的化され得る設計ＴＡＬＥ ＤＮＡ－結合ドメインの操作された融合ポリペプチドを意味する。
「ＴＡＬＥＮモノマー」は、触媒ヌクレアーゼドメインおよび設計ＴＡＬＥ ＤＮＡ－結合ドメインを有する操作された融合ポリペプチドを意味する。ＴＡＬＥＮ標的領域を標的化し、切断する２つのＴＡＬＥＮモノマーを設計することができる。
「導入遺伝子」は、１つの生命体から単離され、異なる生命体に導入される遺伝子配列を含む遺伝子または遺伝子材料を意味する。この非天然のＤＮＡセグメントは、トランスジェニック生命体でＲＮＡまたはポリペプチドを産生する能力を保持し得るか、またはトランスジェニック有機体の遺伝子コードの正常機能を変化させ得る。導入遺伝子の導入は有機体の表現型を変える可能性がある。
ポリヌクレオチドに関する「変異体」とは、（ｉ）ポリヌクレオチドの一部分もしくは断片、（ｉｉ）ポリヌクレオチドもしくはその一部分の相補体、（ｉｉｉ）対象のポリヌクレオチドもしくはその相補体と実質的に同一であるポリヌクレオチド、または（ｉｖ）対象ポリヌクレオチド、その相補体、もしくはそれと実質的に同一のポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチドを意味する。
ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によって配列が相違するが、少なくとも１つの生物学的機能または活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを意味する。変異体はまた、少なくとも１つの生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、１つのアミノ酸を類似特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、一般的に微小変化を伴うと当該技術分野で認識されている。
「品種」という用語は、同じ種の他の植物体と区別する一定の特性を共有する植物体の母集団を意味する。一つ以上の特有の形質を有しながらも、品種は、その品種内の個体間で非常に些細な全体的変化によって特性付けられる。品種は、しばしば市販されていることがある。
「ベクター」とは、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物、およびポリヌクレオチド共役体などの輸送を可能にするためのポリヌクレオチド構成成分の組み合わせを含むポリヌクレオチド媒体を指す。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、染色体または酵母人工染色体とすることができる。ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡベクターとすることができる。好適なベクターには、円形の二本鎖ヌクレオチドプラスミド、線形の二本鎖ヌクレオチドプラスミド、および他の任意の起源のベクターなど、染色体外の複製が可能なエピソームが含まれる。本明細書で使用されるとき、「発現ベクター」は、ポリヌクレオチド（複数可）、ポリヌクレオチド構築物、およびポリヌクレオチド共役体などの発現を可能にするポリヌクレオチド構成成分の組み合わせを含むポリヌクレオチド媒体である。好適な発現ベクターには、円形の二本鎖ヌクレオチドプラスミド、線形の二本鎖ヌクレオチドプラスミド、および他の任意の起源の機能的に等価な発現ベクターなど、染色体外の複製が可能なエピソームが含まれる。発現ベクターは、上流に位置し、下記に定義する通り、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物、またはポリヌクレオチド共役体に作用可能に連結された、少なくともプロモーターを含む。
「ジンクフィンガー」」は、ＤＮＡ配列を認識し結合するポリペプチド構造を意味する。ジンクフィンガードメインはヒトプロテオームにおける最も一般的なＤＮＡ結合モチーフである。単一ジンクフィンガーは約３０のアミノ酸を含み、ドメインは一般的に、１塩基対あたり１個のアミノ酸側鎖の相互作用を介して３つの連続するＤＮＡ塩基対に結合することによって機能する。
「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＺＦＮ」は、完全に組み立てられたときにＤＮＡを切断できる、少なくとも１つのヌクレアーゼまたはヌクレアーゼの一部に効果的に結合する少なくとも１つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質分子を意味する。
他に断りがない限り、本開示に関連して使用される化学的および技術的用語は当業者が通常理解している意味を有するものとする。例えば、本明細書に記載した細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにポリペプチドおよびポリヌクレオチド化学およびハイブリッド形成に関連して使用される任意の命名および技術は、当該技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。用語の意味と範囲は明確でなければならないが、任意の潜在的な曖昧性の事実が発生した場合には、本明細書で提供した定義が任意の辞書または外部定義を越えて優先される。さらに、別段の指示がない限り、単数用語は複数を含み、複数用語は単数を含むものとする。
２．ポリヌクレオチド
一実施形態では、配列表に示される任意のポリヌクレオチドを含む、本明細書に説明される任意の配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる単離ポリヌクレオチドが提供される。単離ポリヌクレオチドは、それに対する少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、それから実質的に成ることが適切である。
好適には、本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）は、配列表に示されるポリペプチド（複数可）の機能または活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％以上を有する活性ポリペプチドをコードする。
別の実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、もしくは配列番号２３、または配列番号５、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、それからなる、またはそれから本質的になる、単離ポリヌクレオチドが提供される。
好適には、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、もしくは配列番号２３、または配列番号５、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３に対して少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから実質的になる。
好適には、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、もしくは配列番号２３、または配列番号５、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３に対して少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、８５％、約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから実質的になる。
好適には、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号１３、または配列番号１５に対して少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、８５％、約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから実質的になる。
好適には、単離ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、または配列番号２３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから実質的になる。
別の実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、もしくは配列番号２３、または配列番号５、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３に対して実質的な相同性（すなわち、配列類似性）または実質的な同一性を有するポリヌクレオチドを含む、それからなる、またはそれから実質的になるポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、それに対して実質的な相同性（すなわち、配列類似性）または実質的な同一性を有する配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、または配列番号２３の断片が提供され、断片は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、または配列番号２３の対応する断片に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
別の実施形態では、それに対して実質的な相同性（すなわち、配列類似性）または実質的な同一性を有する配列番号５、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３の断片が提供され、断片は、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３の対応する断片に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
別の実施形態では、ＳＵＳとして機能するポリペプチドをコードする、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、もしくは配列番号２３、または配列番号５、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３に対して十分または実質的な程度の同一性または類似性を含むポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、もしくは配列番号２３、または配列番号５、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３として本明細書で指定されるポリヌクレオチドを含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドのポリマーが提供される。
好適には、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＳＵＳファミリーのメンバーをコードする。
本明細書で説明したポリヌクレオチドは、未変性または変性のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）としうるヌクレオチドの重合体を含めることができる。従って、ポリヌクレオチドは、限定はされないが、ゲノムＤＮＡ、補完的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡまたはその断片とすることができる。その上、ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む混成体分子、または一本鎖のおよび二本鎖の領域またはその断片の混合物を持つ混成体分子とすることができる。さらに、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方またはその断片を含む、三重鎖領域で構成されることもできる。ポリヌクレオチドは、ホスホチオアートなどの一つ以上の変性塩基を含むことができ、またペプチド核酸とすることができる。一般的に、ポリヌクレオチドは、単離したかまたはクローン化したｃＤＮＡの断片、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、または個別ヌクレオチド、上記の組み合わせから組み立てることができる。本明細書に説明されるポリヌクレオチドはＤＮＡ配列として示されているが、それらは、それらの対応するＲＮＡ配列、およびそれらの逆相補体を含むそれらの相補的な（例えば、完全に相補的な）ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。
本明細書で説明したポリヌクレオチドは、一般的にリン酸ジエステル結合を含むが、一部のケースでは、ポリヌクレオチド類似物は、例えば、ホスホルアミド酸、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、またはＯ－メチルホホロアミダイト連鎖、ならびにペプチドポリヌクレオチドのバックボーンおよび連鎖を含む、代わりのバックボーンを持ちうる。その他の類似体ポリヌクレオチドは、陽性のバックボーンを持つもの、非イオン性バックボーン、および非リボースバックボーンを含む。例えば、こうした分子の生理学的環境での、またはバイオチップ上のプローブとしての安定性および半減期を増大させるためなどの様々な理由で、リボース－リン酸塩バックボーンの修飾を行いうる。天然のポリヌクレオチドおよび類似物の混合物を作成することができるが、別の方法として、異なるポリヌクレオチド類似物の混合物、ならびに天然のポリヌクレオチドおよび類似物の混合物を作成しうる。
様々なポリヌクレオチド類似物、例えば、ホスホルアミド酸、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、Ｏ－メチルホホロアミダイト連鎖およびペプチドポリヌクレオチドのバックボーンおよび連鎖などが知られている。その他の類似体ポリヌクレオチドは、陽性のバックボーンを持つもの、非イオン性バックボーン、および非リボースバックボーンを含む。一つ以上の炭素環式糖を含むポリヌクレオチドも含まれる。
その他の類似物は、ペプチドポリヌクレオチド類似物であるペプチドポリヌクレオチドを含む。これらのバックボーンは、天然のポリヌクレオチドの多価のリン酸ジエステルバックボーンとは対照的に、中性条件下で実質的に非イオン性である。これは結果的に有利となりうる。まず、ペプチドポリヌクレオチドバックボーンは、ハイブリッド形成動態学を改善しうる。ペプチドポリヌクレオチドは、ミスマッチの塩基対と完全に一致した塩基対を比較すると融解温度でより大きな変化を持つ。ＤＮＡおよびＲＮＡは、一般に内部でのミスマッチについて２～４℃の融解温度の低下を示す。非イオン性ペプチドポリヌクレオチドバックボーンについては、この低下は７～９℃に近い。同様に、それらが持つ非イオン性から、これらのバックボーンに付着した塩基のハイブリッド形成は、塩分濃度に対して比較的鈍感である。さらに、ペプチドポリヌクレオチドは、細胞の酵素によって劣化することも、より小さな範囲に分解されることもないと考えられ、そのためより一層安定性がありうる。
開示されたポリヌクレオチド、およびその断片の用途の中には、ハイブリッド形成アッセイでのプローブとしての断片の使用、または増幅アッセイで使用するためのプライマーがある。こうした断片は、一般的にＤＮＡ配列の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０以上の連続するヌクレオチドを備える。その他の実施形態で、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０または６０以上の連続するヌクレオチドを備える。したがって、一態様において、プローブまたはプライマーまたは両方の使用を含む、ポリヌクレオチドを検出するための方法も提供される。例示的なプライマーについては、本明細書に記載されている。
ハイブリッド形成条件の選択に影響する基本的なパラメータおよび適切な条件を考案するための手引きについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に記載がある。遺伝暗号の知識と本明細書に記載のポリペプチド配列との組み合わせの知識を用いて、縮重オリゴヌクレオチドのセットが調製され得る。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法鎖反応（ＰＣＲ）など、プライマーとして有用であり、そこでＤＮＡ断片が単離され増幅される。ある一定の実施形態で、縮重プライマーは、遺伝的ライブラリ用のプローブとして使用できる。そのようなライブラリは、ｃＤＮＡライブラリ、ゲノムライブラリ、またさらには電子的な発現配列タグまたはＤＮＡライブラリを含む。この方法によって識別された相同配列は次に、本明細書で特定した配列の相同体を特定するためのプローブとして使用される。
また、潜在的な用途は、低い厳密性条件下で、典型的には中程度に厳密な条件で、かつ一般には高度に厳密な条件下で、本明細書に記載されるようにポリヌクレオチド（複数可）にハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド（例えば、プライマーまたはプローブ）である。ハイブリッド形成条件の選択に影響する基本的なパラメータおよび適切な条件を考案するための手引きについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に記載があり、当業界の当業者であれば、例えば、ポリヌクレオチドの長さまたは塩基の組成に基づき、簡単に決定できる。
中程度および高度に厳密な条件を達成する１つの方法が本明細書に定義される。当然のことながら、洗浄する温度および洗浄する塩分濃度は、当業者にとって公知であり、下記にさらに説明のある、ハイブリッド形成反応および二重鎖の安定性を支配する基本原則を適用することにより、望ましい度合いの厳密性を達成するために必要に応じて調整できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ （１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙを参照）。ポリヌクレオチドを未知の配列のポリヌクレオチドにハイブリッド形成するとき、混成体の長さは、ハイブリッド形成するポリヌクレオチドの長さであると想定される。既知の配列のポリヌクレオチドをハイブリッド形成するとき、混成体の長さは、ポリヌクレオチドの配列を整列させ、最適な配列の補完性のある領域を識別することにより決定できる。長さが５０塩基対未満であると予想される混成体についてのハイブリッド形成温度は、混成体の融解温度よりも５～１０℃低いべきだが、ここで、融解温度は以下の等式によって決定される。長さが１８塩基対未満の混成体では、融解温度（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。長さが１８塩基対を超える混成体では、融解温度（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎは混成体中の塩基の数、［Ｎａ＋］はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオン濃度（１×標準クエン酸ナトリウムの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）である。通常、こうしたそれぞれのハイブリッド形成用ポリヌクレオチドは、ハイブリッド形成の対象となるポリヌクレオチドの長さの少なくとも２５％（少なくとも５０％、６０％、または７０％であることが一般で、少なくとも８０％が最も一般的）の長さを持ち、またハイブリッド形成の対象となるポリヌクレオチドと少なくとも６０％の配列同一性（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）を持つ。
当業者であれば理解できるように、直鎖ＤＮＡは、５’－３’方向と３’－５’方向の２つの潜在的な方向性を持つ。例えば、第１の配列が５’－３’方向に配置されており、かつ第２の配列が同一のポリヌクレオチド分子／鎖内で５’－３’方向に配置されている場合には、第１の配列および第２の配列は、同一の方向を向いており、すなわち同一の方向を有する。通常、所定のプロモーターの制御下にある関心のプロモーター配列および遺伝子は、同一の方向に配置される。しかしながら、５’－３’方向に配置されている第１の配列に関して、第２の配列が同一のポリヌクレオチド分子／鎖内で３’－５’方向に配置されている場合には、第１の配列および第２の配列は、アンチセンスの方向を向いており、すなわちアンチセンス方向を有する。相互に対してアンチセンス方向を有する２つの配列は、代わりに、第１の配列（５’－３’方向）および第１の配列の逆相補配列（５’－３’方向に配置されている第１の配列）が同一のポリヌクレオチド分子／鎖内に配置されている場合に、同一の方向を有するとも説明され得る。本明細書に記載した配列は、５’－３’方向で示されている。
少なくとも１つの修飾（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つ以上に含まれ得る。少なくとも１つの修飾（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｔのうちの一つ以上に含まれ得る。
少なくとも１つの修飾（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｔのうちの一つ以上に含まれ得るが、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つ以上には修飾（複数可）（例えば、突然変異（複数可））は含まれない。
少なくとも１つの修飾（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｔのうちの一つ以上に含まれ得るが、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つ以上には修飾（複数可）（例えば、突然変異（複数可））は含まれない。
少なくとも１つの修飾（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｓに含まれ得るが、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つ以上には修飾（複数可）（例えば、突然変異（複数可））は含まれず、調節されない。
少なくとも１つの修飾（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｓに含まれ得るが、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つ以上には修飾（複数可）（例えば、突然変異（複数可））は含まれず、調節されない。
３．ポリペプチド
別の態様では、配列表に示される任意のポリペプチドを含む、本明細書に説明される任意のポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる単離ポリペプチドが提供される。それに対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、それから実質的に成る単離ポリペプチドが適切である。
一実施形態では、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号２に対して少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから実質的になるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号４に対して少なくとも９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
一実施形態では、配列番号６または配列番号８に対して少なくとも８０％、８１％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号６に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号８に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
一実施形態では、配列番号１０または配列番号１２に対して少なくとも７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号１０または配列番号１２に対して少なくとも９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
一実施形態では、配列番号１４または配列番号１６に対して少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号１４に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号１６に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
一実施形態では、配列番号１８または配列番号２０に対して少なくとも６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号１８に対して少なくとも８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号２０に対して少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
一実施形態では、配列番号２２または配列番号２４に対して少なくとも６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号２２に対して少なくとも９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号２４に対して少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドが提供される。
一実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、もしくは配列番号２３、または配列番号５、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３によってコードされたポリペプチドが提供される。
ポリペプチドは、ＳＵＳとして機能するために、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２、もしくは配列番号２４、または配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４に対して十分または実質的な程度の同一性または類似性を含む配列を含むことができる。
ポリペプチド（複数可）の断片は、典型的には、完全長配列の機能または活性の一部または全てを保持する。
本明細書で考察されるように、ポリペプチドはまた、任意のタイプの変更（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、または置換、グリコシル化状態の変化、再折り畳みもしくは異性化、三次元構造、または自己会合状態に影響を及ぼす変化）の導入により生成される突然変異体も含み、これは、それらの機能または活性の一部または全部をまだ有するという条件で、故意に操作され得るか、または自然に単離され得る。好適には、この機能または活性は調節される。
欠失は、ポリペプチドからの一つ以上のアミノ酸の除去を指す。挿入は、一つ以上のアミノ酸残基が、ポリペプチド内の所定の部位に導入されることを意味する。挿入は、単一または複数のアミノ酸の配列内の挿入を含みうる。置換は、ポリペプチドのアミノ酸を類似した性質（類似した疎水性、親水性、抗原性、ａ－らせん状構造またはβ－シート構造を形成または破損する傾向など）を持つ他のアミノ酸と置き換えることを意味する。アミノ酸置換は、単一の残基の置換であるが、ポリペプチドに対して課された機能的制約に応じてクラスター化することもでき、範囲は約１～約１０個のアミノ酸としうる。アミノ酸置換は、下記に記載した通り伝統的なアミノ酸置換が好ましい。アミノ酸の置換、欠失および／または挿入は、ペプチド合成テクニック（固相ペプチド合成など）または組み換えＤＮＡ操作を使用して行うことができる。置換、挿入、または欠失のあるポリペプチドの変異体を生成するためにＤＮＡ配列を操作するための方法は、当該技術分野において周知である。変異体は、静的な変化をもたらす改変を有し得、機能的に等価なポリペプチドをもたらし得る。物質の二次的な結合が保持されている限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および両親媒性の類似性に基づき、意図的なアミノ酸置換が行われ得る。例えば、負の電荷を帯びたアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正電荷を帯びたアミノ酸は、リシンおよびアルギニンを含み、ならびに類似した親水性値を持つ無電荷の極性頭基を備えたアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。伝統的な置換は、例えば、下記の表に従い行いうる。第二の列の同一ブロックにあるアミノ酸および好ましくは第三の列の同一系統にあるアミノ酸は、相互に置換しうる。
ポリペプチドは、成熟ポリペプチドもしくは未熟ポリペプチド、または未熟ポリペプチドに由来するポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、公知の方法を使用して線形または環状にしうる。ポリペプチドは一般に、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、または少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含む。
少なくとも１つの修飾（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つ以上に含まれ得る。
少なくとも１つの修飾（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｔのうちの一つ以上に含まれ得るが、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つ以上には修飾（複数可）（例えば、突然変異（複数可））は含まれない。
少なくとも１つの修飾（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｔのうちの一つ以上に含まれ得るが、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つ以上には修飾（複数可）（例えば、突然変異（複数可））は含まれない。
少なくとも１つの修飾（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｓに含まれ得るが、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つ以上には修飾（複数可）（例えば、突然変異（複数可））は含まれず、調節されない。
少なくとも１つの修飾（例えば、突然変異）は、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｓに含まれ得るが、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つ以上には修飾（複数可）（例えば、突然変異（複数可））は含まれず、調節されない。
植物体の修飾
ａ．形質転換
組み換え体構築物は、ポリペプチドの発現、機能、または活性を調節するために、植物体または植物体細胞を形質転換するために使用され得る。組み換え体ポリヌクレオチド構築物は、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドをコードし、ポリペプチドを発現するのに適切な制御領域に作用可能に連結された、ポリヌクレオチドを備えることができる。こうして、ポリヌクレオチドは、本明細書で説明したポリペプチドをコードするコード配列を備えることができる。ポリペプチドの発現、機能、または活性が調節される植物体または植物体細胞は、突然変異体、非天然、トランスジェニック、人造、または遺伝子組み換えの植物体または植物体細胞を含むことができる。遺伝子組み換え植物体または植物体細胞は、組み換えＤＮＡの安定した組込みによって改変されたゲノムを含むことが適切である。組み換えＤＮＡは、遺伝子組み換えされ、細胞の外に構築されたＤＮＡを含み、また天然のＤＮＡ、またはｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡを含むＤＮＡを含む。遺伝子導入植物体は、当初形質転換された植物体細胞から再生された植物体や、形質転換した植物体の後の世代または交雑種からの子孫遺伝子組み換え植物体を含むことができる。好適には、トランスジェニック修飾によって、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または機能または活性が、対照植物体と比較して改変される。
組み換え体ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、未変性のポリペプチドとすることも、または細胞に対して異質組織とすることもできる。一部の場合では、組み換え体構築物は、発現を調節し、制御領域と作用可能に連結されたポリヌクレオチドを含む。適切な制御領域の例は、本明細書で説明している。
本明細書で説明したものなど、組み換え体ポリヌクレオチド構築物を含むベクターも提供されている。適切なベクターバックボーンは、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体、またはバクテリオファージ人工染色体など、当業界で日常的に使用されているものを含む。適切な発現ベクターは、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、およびレトロウイルスに由来するプラスミドおよびウイルスのベクターを含むがこれらに限定はされない。多数のベクターおよび発現システムが市販されている。
ベクターは、例えば、複製の起源、足場アタッチメント領域またはマーカーを含むことができる。マーカー遺伝子は、植物体細胞に対して選択可能な表現型を与えることができる。例えば、マーカーは、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはハイグロマイシン）、または除草剤（例えば、グリホサート、クロルスルフロンまたはフォスフィノスリシン）などの殺生物剤耐性を与えることができる。さらに、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するようデザインされたタグ配列を含むことができる。ルシフェラーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、緑色蛍光ポリペプチド、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃ、またはヘマグルチニン配列などのタグ配列が、一般にコードされたポリペプチドと融合したものとして表現される。こうしたタグは、カルボキシルまたはアミノのいずれかの終端も含めた、ポリペプチド内のどこにでも挿入できる。
植物体または植物体細胞は、安定して転換されるようにそのゲノムに組み入れられた組み換え体ポリヌクレオチドを持つことで転換させることができる。本明細書で説明した植物体または植物体細胞は、安定して転換させることができる。安定して転換された細胞は通常、毎回の細胞分裂でも導入されたポリヌクレオチドを保持する。植物体または植物体細胞はまた、組み換え体ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み入れられないように、過渡的に転換させることができる。過渡的に転換された細胞は通常、十分な数の細胞分裂の後で、導入された組み換え体ポリヌクレオチドが娘細胞内で検出されないように、導入された組み換え体ポリヌクレオチドのすべてまたは一部を毎回の細胞分裂で失う。
バイオリステック、遺伝子ガン技術、アグロバクテリウム－介在性形質転換、ウイルスベクター媒介形質転換、ウイルスベクター媒介形質転換、凍結融解法、マイクロ粒子衝撃、直接的なＤＮＡ取り込み、超音波処理、マイクロ注射、植物ウイルス媒介導入、および電気穿孔を含む、植物体細胞を形質転換するための多くの方法が、当該技術分野において利用可能である。外来性ＤＮＡを植物体染色体に組み入れるためのアグロバクテリウムシステムが、植物体遺伝子工学で広範にわたり研究、修正、および開発されてきた。センスまたはアンチセンスの方向に作用可能に制御配列に結合された、主題の精製済みポリペプチドに対応するＤＮＡ配列を含む、裸の組み換えＤＮＡ分子が、従来の方法により適切なＴ－ＤＮＡ配列に結合される。これらはポリエチレングリコール技術によるか、またはエレクトロポーレーション技術によってプロトプラストに導入されるが、どちらも標準技術である。あるいは、主題の精製済みポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子を含むこうしたベクターは、生きたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞に導入され、次いでその細胞は、ＤＮＡを植物体細胞に導入する。Ｔ－ＤＮＡベクター配列を伴わない裸のＤＮＡによる形質転換は、プロトプラストとＤＮＡ含有リポソームとの融合によるか、またはエレクトロポーレーションによって達成できる。Ｔ－ＤＮＡベクター配列を伴わない裸のＤＮＡは、不活性の高速微粒子銃によって細胞を転換するために使用することもできる。
細胞または培養組織が形質転換のための受容体組織として使用される場合、植物体は、希望に応じて、当業者にとって公知の技術によって転換した培養体から再生することができる。
組み換え体構築物に含める制御領域の選択は、効率、選択可能性、誘導性、望ましい発現レベル、および細胞優先的または組織優先的な発現を含むがこれに限定されない、いくつかの要因に依存する。コード配列に対して制御領域を適切に選択し配置することにより、コード配列の発現を調節することは、当業者にとって日常的な事柄である。ポリヌクレオチドの転写は、類似した方法で調節できる。一部の適切な制御領域は、転写のみで、または主にある一定の細胞型で開始される。植物体ゲノムＤＮＡ内の制御領域の識別および特性付けをするための方法は、当業界において公知である。
適切なプロモーターは、異なる組織にまたは細胞型（例えば、根特異的プロモーター、苗条特異的プロモーター、木部特異的プロモーター）に存在するか、または異なる発育段階で存在するか、または異なる環境的条件に応じて存在する組織特異的要因によって認識される組織特異的プロモーターを含む。適切なプロモーターは、ほとんどの細胞型で特定の誘導物質を必要とせずに活性化できる構成的プロモーターを含む。ＲＮＡｉポリペプチド製造を制御するための適切なプロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ／３５Ｓ）、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓまたはユビキチンプロモーターまたはファゼオリンプロモーターを含む。当業者は、組み換え体プロモーターの複数の変形物を生成することができる。
組織特異的プロモーターは、植物体組織または生殖組織など特定の細胞または組織で、植物体の発育中の特定時点にのみ活性である転写制御要素である。組織特異的発現は、例えば、ある一定の組織内のポリヌクレオチドの発現が好ましい時に、有利なことがある。発育管理下の組織特異的プロモーターの例は、植物体組織（例えば、根もしくは葉）、または生殖組織（果実、胚珠、種子、花粉、雌しべ、花、もしくは任意の胚性の組織など）など、ある一定の組織内でのみ（または主として限定的に）転写を開始できるプロモーターを含む。生殖組織特異的プロモーターは、例えば、葯特異的、胚珠特異的、胚特異的、胚乳特異的、外皮特異的、種子および種皮特異的、花粉特異的、花弁特異的、咢片特異的、またはその組み合わせが考えられる。
適切な葉特異的プロモーターは、ビルビン酸塩、Ｃ４植物体（トウモロコシ）由来のオルソリン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター、トウモロコシ由来のｃａｂ－ｍ１Ｃａ＋２プロモーター、シロイヌナズナｍｙｂ関連遺伝子プロモーター（Ａｔｍｙｂ５）、リブロースニリン酸カルボキシラーゼ（ＲＢＣＳ）プロモーター（例えば、葉および人工光源で栽培した苗木で発現されるトマトＲＢＣＳ１、ＲＢＣＳ２およびＲＢＣＳ３Ａ遺伝子、栽培中のトマト果実で発現されるＲＢＣＳ１およびＲＢＣＳ２、または葉身および葉鞘の葉肉細胞でほぼ排他的に高レベルで発現されるリブロースニリン酸カルボキシラーゼプロモーター）を含む。
適切な老化特異的プロモーターは、果実の成熟、老化および葉の脱離時に活性となるトマトプロモーター、システインプロテアーゼをコードする遺伝子のトウモロコシプロモーター、８２Ｅ４のプロモーターおよびＳＡＧ遺伝子のプロモーターを含む。適切な葯特異的プロモーターを使用することができる。当業者にとって公知の適切な根優先的プロモーターを選択しうる。適切な種子優先的プロモーターは、種子特異的プロモーター（種子の発育時に活性なプロモーター、例えば、種子保存ポリペプチドのプロモーター）、および種子発芽プロモーター（種子の発芽時に活性なプロモーター）の両方を含む。こうした種子優先的プロモーターは、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘発されたメッセージ）、ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａ ｚｅｉｎ）、ｍｉｌｐｓ（ミオ－イノシトール－１－リン酸シンターゼ）、ｍＺＥ４０－２（別称、Ｚｍ－４０）、ｎｕｃｌｃ、およびｃｅｌＡ（セルロースシンターゼ）を含む。Ｇａｍａ－ｚｅｉｎは、一つの胚乳特異的プロモーターである。Ｇｌｏｂ－１は、一つの胚特異的プロモーターである。双子葉植物体では、種子特異的プロモーターは、マメベータ－ファゼオリン、ナピン、β－コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどを含む。単子葉植物体では、種子特異的プロモーターは、トウモロコシ１５ｋＤａ ｚｅｉｎプロモーター、２２ｋＤａ ｚｅｉｎプロモーター、２７ｋＤａ ｚｅｉｎプロモーター、ｇ－ｚｅｉｎプロモーター、２７ｋＤａ γ－ｚｅｉｎプロモーター（ｇｚｗ６４Ａプロモーターなど、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｓ７８７８０を参照）、ｗａｘｙプロモーター、シュランケン１プロモーター、シュランケン２プロモーター、グロブリン１プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ２２３４４を参照）、Ｉｔｐ２プロモーター、ｃｉｍ１プロモーター、トウモロコシｅｎｄ１およびｅｎｄ２プロモーター、ｎｕｃ１プロモーター、Ｚｍ４０プロモーター、ｅｅｐ１およびｅｅｐ２；ｌｅｃ１、チオレドキシンＨプロモーター；ｍｌｉｐ１５プロモーター、ＰＣＮＡ２プロモーター、およびシュランケン－２プロモーターを含む。
誘導性プロモーターの例は、病原体の攻撃、嫌気性条件、高温、光、乾燥、低温、または高塩分濃度に反応するプロモーターを含む。病原体誘導性プロモーターは、病原性に関連したポリペプチド（ＰＲポリペプチド）に由来するものを含み、これは病原体（例えば、ＰＲポリペプチド、ＳＡＲポリペプチド、ベータ－１，３－グルカナーゼ、キチナーゼ）による感染に続いて誘発される。
植物体プロモーターに加えて、適切なその他のプロモーターは、細菌性の起源、例えば、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、およびＴｉプラスミドに由来するその他のプロモーターから誘導され得るか、またはウイルスのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、たばこモザイクウイルスの構成的プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓプロモーター、もしくはゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）から誘導され得る。
植物体細胞へのポリヌクレオチド導入、および植物体ゲノムへの後続の挿入の好適な方法は、マイクロ注射（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８６）４：３２０－３３４）、電気穿孔（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：５６０２－５６０６）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（ＵＳ５，９８１，８４０およびＵＳ５，５６３，０５５）、遺伝子直接導入（ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８４）３：２７１７－２７２２）、および衝撃粒子加速（ＵＳ４，９４５，０５０、ＵＳ ５，８７９，９１８、ＵＳ５，８８６，２４４、ＵＳ５，９３２，７８２、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（１９９５）、およびＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：９２３－９２６）を含む。
ｂ．突然変異
本明細書に記載される一つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに突然変異を含む植物体または植物体細胞が開示されており、前述の突然変異は、ＮｔＳＵＳまたはそれによりコードされるポリペプチドの調節された機能または活性をもたらす。
（乾燥処理済みの）植物体内または（乾燥処理済みの）たばこ植物材料内のＮｔＳＵＳポリペプチドのレベルを調節するための方法が提供されており、前述の方法は、前述の植物体のゲノム中に、少なくとも１つのＮｔＳＵＳ遺伝子の発現を調節する一つ以上の突然変異を導入することを含み、前述の少なくとも１つの遺伝子は、本開示に従った配列から選択される。
また、調節されたレベルの還元糖を有する植物体を特定するための方法も提供されており、前述の方法は、対象の植物体からのポリヌクレオチド試料を、本開示に従った配列における一つ以上の突然変異の存在についてスクリーニングすることと、任意に、還元糖のレベルを調節することが既知である突然変異（複数可）と、特定された突然変異（複数可）を相関付けることとを含む。
また、本開示に従ってＮｔＳＵＳ遺伝子内の一つ以上の突然変異に対してヘテロ接合性またはホモ接合性である植物体または植物体細胞も開示されており、前述の突然変異は、遺伝子の発現またはそれによりコードされるＮｔＳＵＳポリペプチドの機能もしくは活性の調節をもたらす。
有性交雑を含めて一つの植物に突然変異を組み合わせるために、多くのアプローチを利用できる。遺伝子の発現またはそれによりコードされるポリペプチドの機能もしくは活性を調節する、本開示に従った遺伝子における一つ以上の好都合なヘテロ接合性またはホモ接合性の突然変異を有する植物体は、その発現またはそれによりコードされるポリペプチドの機能もしくは活性を調節する一つ以上の他の遺伝子における一つ以上の好都合なヘテロ接合性またはホモ接合性の突然変異を有する遺伝子と交雑され得る。一実施形態において、交雑は、同一植物体内の本開示に従った遺伝子内に一つ以上の好都合なヘテロ接合性またはホモ接合性の突然変異を導入するために行われる。
植物体内における本開示の一つ以上のポリペプチドの機能または活性は、そのポリペプチドの機能または活性を阻害するように修飾されておらず、かつ同一のプロトコルを使用して栽培、収穫、および乾燥処理された植物体内の同一のポリペプチド（複数可）の機能または活性よりも低いまたは高い場合に、増加または減少している。
一部の実施形態において、突然変異（複数可）は、植物体または植物体細胞中へと突然変異誘発アプローチを使用して導入され、導入された突然変異は、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析、または表現型分析などの、当業者にとって既知の方法を使用して特定または選択される。遺伝子発現に影響を与えるか、またはコードされたポリペプチドの機能を妨げる突然変異は、当該技術分野において周知である方法を使用して決定され得る。遺伝子エクソンにおける挿入性の突然変異は、通常は結果的にヌル突然変異体をもたらす。保存された残基における突然変異は、コードされたポリペプチドの代謝機能の抑制に特に有効であり得る。例えば、高度に保存された領域のうちの一つ以上における突然変異は、ポリペプチド機能を変化させる可能性が高いが、それらの高度に保存された領域の外側の突然変異は、ポリペプチド機能にはほとんどまたは全く影響しない可能性が高いことが理解されるであろう。さらに、単一ヌクレオチドでの突然変異は、終止コドンを作り出すことができ、これは切断型ポリペプチドをもたらし、切断の程度に応じて機能喪失をもたらす。
突然変異体のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを獲得するための方法も開示されている。植物体細胞または植物材料を含めた、関心の任意の植物体は、突然変異を誘発することが知られている様々な方法により遺伝的に修飾でき、これには、部位特異的変異誘発、オリゴヌクレオチドを標的とした変異誘発突然変異誘発、化学的に誘発された突然変異誘発、照射誘発された突然変異誘発、修飾塩基を利用した突然変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを利用した突然変異誘発、二本鎖分解突然変異誘発、修復欠損宿主系統を利用した突然変異誘発、合計遺伝子合成による突然変異誘発、ＤＮＡシャフリングおよびその他の同等な方法が含まれる。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの断片も開示されている。ポリヌクレオチドの断片は、天然ポリペプチドの生物学的機能を保持するポリペプチド断片をコードしてもよく、そのため、植物体における代謝産物輸送ネットワークに関与する。あるいは、ハイブリッド形成プローブまたはＰＣＲプライマーとして有用なポリヌクレオチドの断片は一般的に、生物学的機能を保持している断片ポリペプチドをコードしない。その上、開示されたポリヌクレオチドの断片は、本明細書で考察したとおり、組み換え体構築物内で組み立てられ得るものを含む。ポリヌクレオチドの断片は、少なくとも約２５個のヌクレオチド、約５０個のヌクレオチド、約７５個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチド、約１５０個のヌクレオチド、約２００個のヌクレオチド、約２５０個のヌクレオチド、約３００個のヌクレオチド、約４００個のヌクレオチド、約５００個のヌクレオチド、約６００個のヌクレオチド、約７００個のヌクレオチド、約８００個のヌクレオチド、約９００個のヌクレオチド、約１０００個のヌクレオチド、約１１００個のヌクレオチド、約１２００個のヌクレオチド、約１３００個のヌクレオチド、または約１４００個のヌクレオチドから、本明細書に記載したポリペプチドをコードする完全長ポリヌクレオチドの範囲であり得る。ポリペプチドの断片は、少なくとも約２５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約７５個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸から、本明細書に記載した完全長ポリペプチドまでの範囲であり得る。突然変異ポリペプチド変異体は、一つ以上の突然変異ポリペプチド変異体を含む、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体（例えば、突然変異体、非天然の、遺伝子導入、人造または遺伝子組み換え植物体）または植物体細胞を作成するために使用できる。好適には、突然変異ポリペプチド変異体は、未成熟のポリペプチドの機能を保持する。突然変異ポリペプチド変異体の機能は、未成熟のポリペプチドと比較して、高い、低い、またはほぼ同一であり得る。
本明細書で説明したポリヌクレオチドおよびポリペプチドでの突然変異は、人造の突然変異または合成的な突然変異または遺伝子組み換えの突然変異を含むことができる。本明細書で説明したポリヌクレオチドおよびポリペプチドでの突然変異は、生体外または生体内の操作工程を含むプロセスによって獲得されるか、または獲得可能である突然変異であり得る。本明細書で説明したポリヌクレオチドおよびポリペプチドでの突然変異は、人による介入を含むプロセスによって獲得されるか、または獲得可能である突然変異であり得る。
突然変異をポリヌクレオチド内に無作為に導入する方法には、化学的突然変異誘発および放射線突然変異誘発が含まれ得る。化学的突然変異誘発は、突然変異を誘発するための、突然変異原性、催奇形性、または発癌性有機化合物などの外因的に添加された化学物質の使用を伴う。主に点突然変異、ならびに短い欠失、挿入、ミスセンス突然変異、単純配列反復、塩基転換、および／または遷移を引き起こす突然変異原は、化学的突然変異原または放射線を含めて、突然変異を引き起こすために使用され得る。突然変異原は、エチルメタンスルホン酸塩、メチルメタンスルホン酸塩、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア、トリエチルメラミン、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソウレア、プロカルバジン、クロランブシル、シクロホスファミド、ジエチル硫酸塩、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェン・マスタードカラシナ、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、２－アミノプリン、７，１２ジメチル－ベンズ（ａ）アントラセン、酸化エチレン酸化物、ヘキサメチルホスホルアミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン、ジエポキシブタン、およびこれに類するもの）、２－メトキシ－６－クロロ－９［３－（エチル－２－クロロ－エチル）アミノプロピルアミノ］アクリジン二塩酸塩およびホルムアルデヒドを含む。
突然変異原が直接原因ではなかったかもしれない座での天然の突然変異も、それらが結果的に望ましい表現型をもたらす場合には意図されている。適切な変異原性物質には、例えば、イオン化放射線（Ｘ線、γ線、高速中性子照射およびＵＶ放射放射線など）も含めることができる。突然変異誘発性化学物質または放射線の投与量は、致死性または不稔性により特徴付けられる閾値レベル未満である突然変異頻度が得られるように、各タイプの植物体組織に対して実験的に決定される。突然変異スクリーニングのための植物体ポリヌクレオチドを調製するために、当業者に既知の植物体ポリヌクレオチドを調製する任意の方法が使用され得る。
突然変異プロセスは、一つ以上の植物体交雑工程を含み得る。
突然変異の後、早熟の終止コドンまたはそれ以外での非機能的な遺伝子を生成した突然変異を特定するためにスクリーニングを実施できる。突然変異の後、上昇または減少したレベルで発現することが可能である機能遺伝子を作り出す突然変異を特定するために、スクリーニングが実施され得る。突然変異体のスクリーニングは、配列決定により、または遺伝子もしくはポリペプチドに対して特異的な一つ以上のプローブもしくはプライマーを使用することにより実施され得る。遺伝子発現の調節、ｍＲＮＡの安定性の調節、またはポリペプチドの安定性の調節をもたらすことができる、ポリヌクレオチド内での特定の突然変異も引き起こされ得る。こうした植物体は、本明細書では、「非天然の」または「突然変異体」植物体と呼ぶ。一般に、突然変異体または非天然の植物体には、操作される前には植物体内に存在しなかった、外来性または合成的な、または人造のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の少なくとも一部分が含まれるようになる。外来性のヌクレオチドは、単一のヌクレオチド、二つ以上のヌクレオチド、二つ以上の連続するヌクレオチド、または二つ以上の非連続的なヌクレオチド、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、もしくは１５００個、またはそれ以上の連続的または非連続的なヌクレオチドなどであり得る。
ｃ．トランスジェニックおよび遺伝子編集
突然変異誘発以外に、ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドのうちの一つ以上の発現または機能または活性を調節することができる組成物としては、一つ以上の内在性遺伝子の転写を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチド、ＲＮＡ転写物（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム）の翻訳を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチド、一つ以上のポリペプチドの安定性を妨害できる配列特異的ポリペプチド、一つ以上のポリペプチドの酵素機能または基質もしくは調節ポリペプチドに関する一つ以上のポリペプチドの結合機能を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチド、一つ以上のポリペプチドに対して特異性を示す抗体、一つ以上のポリペプチドの安定性または一つ以上のポリペプチドの酵素機能もしくは一つ以上のポリペプチドの結合機能を妨害できる小分子化合物、一つ以上のポリヌクレオチドを結合するジンクフィンガーポリペプチド、および一つ以上のポリヌクレオチドに対して機能を有するメガヌクレアーゼが挙げられる。遺伝子編集技術、遺伝的編集技術およびゲノム編集技術は、当業界で周知である。
ｄ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーポリペプチドは、一つ以上の本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの発現または機能または活性を調節するために使用され得る。各種の実施形態で、ポリヌクレオチドのコード配列の一部または全部を含むゲノムＤＮＡ配列が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介の突然変異誘発により修飾される。ゲノムＤＮＡ配列で、ジンクフィンガーポリペプチド結合のための一意の部位が検索される。別の方法として、ゲノムＤＮＡ配列で、ジンクフィンガーポリペプチド結合のための二つの一意の部位が検索されるが、ここで、両方の部位は両側の鎖上にあり、例えば、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の塩基対だけ離れた互いに近い場所にある。したがって、ポリヌクレオチドを結合するジンクフィンガーポリペプチドが提供されている。
ジンクフィンガーポリペプチドは、遺伝子内の選択した標的部位を認識するよう設計され得る。ジンクフィンガーポリペプチドは、ファージディスプレー選択、細菌性ツーハイブリッド選択、または細菌性ワンハイブリッド選択などがあるが、これらに限定されない選択方法に連結された、切断もしくは拡張または部位特異的突然変異誘発のプロセスによって、天然のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと非天然のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとから得られたモチーフの任意の組み合わせを含むことができる。「非天然のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」という用語は、標的のポリヌクレオチド内にあり、修飾の対象となるポリヌクレオチドを含む細胞または生物体内では発生しない、３塩基対配列を結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを意味する。標的遺伝子に対して一意である特定のポリヌクレオチドを結合するジンクフィンガーポリペプチドの設計のための方法は、当該技術分野において既知である。
他の実施形態で、ジンクフィンガーポリペプチドは、ポリヌクレオチドの制御配列に結合するように選択され得る。さらに具体的に言えば、制御配列は、転写開始部位、開始コドン、エクソンの領域、エクソン－イントロンの境界、転写終結区、または終止コドンを備えうる。したがって、本開示は、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドの近傍またはその内部でジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介の突然変異誘発により生成された突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体または植物体細胞と、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介の突然変異誘発により、こうした植物体または植物体細胞を作成するための方法とを提供する。ジンクフィンガーポリペプチドおよびジンクフィンガーヌクレアーゼを植物体に送達するための方法は、メガヌクレアーゼの送達について後述する内容と類似している。
ｅ．メガヌクレアーゼ
別の態様で、メガヌクレアーゼ（Ｉ－ＣｒｅＩなど）を使用して、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの、または他の方法で遺伝学的変性のある植物体を生成する方法が説明されている。天然のメガヌクレアーゼならびに組み換え体メガヌクレアーゼは、植物体のゲノムＤＮＡ内の単一の部位で、または比較的少ない部位で、特異的に二本鎖切断を引き起こし、一つ以上の本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの分裂を可能にするために使用され得る。メガヌクレアーゼは、ＤＮＡ認識性質が変化した強化メガヌクレアーゼとしうる。メガヌクレアーゼポリペプチドは、当該技術分野において既知の様々な異なるメカニズムにより、植物体細胞に送達され得る。
本開示は、植物体細胞または植物体内で本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）（または本明細書で説明したその任意の組み合わせ）を不活性化するためのメガヌクレアーゼの使用を包含する。特に、本開示は、メガヌクレアーゼを使用して植物体内でのＮｔＳＵＳポリヌクレオチドを不活性化するための方法を提供し、（ａ）本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドを含む植物体細胞を提供することと、（ｂ）メガヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼをコードする構築物を前述の植物体細胞内に導入することと、（ｃ）メガヌクレアーゼがＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）を実質的に不活性化することを可能にすることと、を含む。
メガヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドのコード領域内のメガヌクレアーゼ認識部位を切断するために使用できる。こうした切断では、非相同末端結合による変異原性ＤＮＡ修復の後で、結果的にメガヌクレアーゼ認識部位でのＤＮＡの欠失につながることが頻繁にある。遺伝子コード配列内でのこうした突然変異は、一般に遺伝子を不活性化するのに十分である。植物体細胞を修飾するためのこの方法には、まず、適切な形質転換方法を使用したメガヌクレアーゼ発現カセットの植物体細胞への送達が関与する。最高の効率を得るためには、メガヌクレアーゼ発現カセットを選択マーカーに結合し、選択物質の存在下で、首尾よく転換された細胞を選択することが望ましい。このアプローチによって、結果的にメガヌクレアーゼ発現カセットがゲノムに組み込まれるようになるが、これは、植物体が規制当局の許可を要する可能性が高い場合には望ましくないことがある。こうしたケースでは、メガヌクレアーゼ発現カセット（および結合された選択マーカー遺伝子）は、その後の植物体の世代で従来的な育種テクニックを使用して分離しうる。
メガヌクレアーゼ発現カセットを送達した後、植物体細胞は、当初、使用された特定の形質転換処置にとって一般的な条件下で培養される。これは、形質転換した細胞を培養液で、温度２６℃未満で暗所で頻繁に培養することを意味しうる。こうした標準条件は、植物体細胞を形質転換過程から回復させるために、ある期間（１～４日が好ましい）について使用できる。この最初の回復期間後の任意の時点で、操作されたメガヌクレアーゼの機能を刺激してメガヌクレアーゼ認識部位を切断し突然変異を起こさせるために、培養温度を上昇させ得る。
ｆ．ＴＡＬＥＮ
遺伝子編集の一つの方法には、細胞が修復メカニズムに反応できる二本鎖の分解を誘発する、転写活性化剤様差動因子ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用が関与する。ＮＨＥＪにより、アニーリングのための配列の重複が非常に少ないかまたは全くない二本鎖切断のうちのどちらかの側からＤＮＡが再結合される。この修復機メカニズムは、挿入または欠失、または染色体の再配列によるゲノム内の誤りを誘発する。こうした誤りがあると、その位置で遺伝子産物が非機能的なものにコードされる。ある特定の用途では、ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドを植物体のゲノムから正確に除去することが望ましくあり得る。こうした用途は、強化メガヌクレアーゼの対を使用して可能であり、そのそれぞれが意図された欠失のどちらかの側にあるメガヌクレアーゼ認識部位を切断する。遺伝子を認識してそれに結合し、二本鎖切断をゲノムに導入することが可能であるＴＡＬＥＮも使用され得る。したがって、別の態様では、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼを使用して、突然変異体、非天然、もしくはトランスジェニックの、または本明細書に記載される別の方法での遺伝子改変の植物体を生成するための方法が企図されている。
ｇ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
遺伝子編集の別の方法には、細菌性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用が関与する。バクテリアおよび古細菌は、侵入するウイルスＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡに対して保護する適応的免疫系の一部である、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）と呼ばれる染色体要素を示す。Ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムで、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドと機能して、標的ＤＮＡに二本鎖切断を導入する。Ｃａｓ９による標的の切断は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの間の塩基対だけでなく、ｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡの間の塩基対形成を必要とする。標的認識は、配列ＮＧＧと一致する、フォトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの存在によって促進される。このシステムは、ゲノム編集用に利用できる。Ｃａｓ９は通常は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡで構成される二重ＲＮＡによってプログラムされる。ただし、これらのＲＮＡのコア成分は、Ｃａｓ９ターゲティングのために単一の混成体「案内ＲＮＡ」に組み入れることができる。部位特異的切断のための標的ＤＮＡに対する非翻訳ＲＮＡガイドの使用が、ＴＡＬＥＮなどの既存の技術よりも著しく単純明快であることが約束される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法を使用すると、ヌクレアーゼ錯体の再標的化は、新しいＲＮＡ配列の導入のみを必要とし、ポリペプチド転写因子の特異性を設計し直す必要がない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を、植物種にわたって広く適用可能であるウイルス媒介ゲノム編集プラットフォームを開示する国際出願第ＷＯ ２０１５／１８９６９３ Ａ１号の方法で植物体において実施した。たばこガウリウイルス（ＴＲＶ）のＲＮＡ２ゲノムを、ガイドＲＮＡを担持し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを過剰発現するＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物体に送達するように操作した。本開示の文脈では、ガイドＲＮＡは、本明細書に開示されるＮｔＳＵＳポリヌクレオチド配列のいずれかに由来し得、植物体細胞のゲノムを編集し、突然変異体である植物体を得るためにＷＯ ２０１５／１８９６９３ Ａ１の教示を適用した。ペースの速い技術の開発は、植物界において広範な適用性を有する多種多様なプロトコルを生み出しており、これは多くの最近の科学評論記事において十分に分類されている（例えば、Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１６）１２：８、およびＦｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．（２０１６）７：５０６）。植物体におけるその用途に特に焦点を当てたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのレビューは、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ（２０１５）３３，１，ｐ４１－５２にある。Ｂｏｒｔｅｓｉ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＴＡＬＥＮの間の比較も行う。植物体ゲノムを操作するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの使用における最近の開発については、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ（２０１７）７，３，ｐ２９２－３０２）およびＣｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．（２０１７）３６，１－８で考察されている。植物体で使用するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドは、「ａｄｄｇｅｎｅ」、非営利プラスミドリポジトリ（ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ）に列挙されており、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓプラスミドは、市販されている。
ｈ．アンチセンス修飾
アンチセンス技術は、ＮｔＳＵＳポリペプチドの発現または活性の調節に使用され得る別の周知の方法である。抑制されるＮｔＳＵＳ遺伝子のポリヌクレオチドは、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるように、クローン化され、調節領域および転写終結配列に作用できるように連結されている。次に、組み換え体構築物は植物体細胞に変形し、ＲＮＡのアンチセンス鎖が生成される。ポリヌクレオチドが抑制されるために遺伝子の全配列である必要はないが、通常は抑制の対象となる遺伝子のセンス鎖の少なくとも一部分に対して実質的に相補的である。
ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの発現に影響を及ぼすリボザイムまたは触媒ＲＮＡに転写しうる。リボザイムは、実際的に任意の標的ＲＮＡと特異的に対をなし、リン酸ジエステルバックボーンを特定の位置で切断し、それによって標的ＲＮＡを機能的に不活性化するように設計できる。異質組織ポリヌクレオチドは、特定のｍＲＮＡ転写物を切断するよう設計されたリボザイムをコードでき、こうしてポリペプチドの発現が阻止される。ハンマーヘッド型リボザイムは特定のｍＲＮＡを破壊するのに有用であるが、ｍＲＮＡを部位特異的認識配列で切断する様々なリボザイムを使用することができる。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと補完的塩基対を形成するフランキング領域によって指図される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ＲＮＡが５’－ＵＧ－３’ポリヌクレオチドを含むことである。ハンマーヘッド型リボザイムの構成および製造は、当業界において公知である。ハンマーヘッド型リボザイム配列は、生体内での．切断効率を増大させるために、輸送ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などの安定したＲＮＡに埋め込むことができる。
一つの実施形態で、ＲＮＡ転写物の翻訳を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチドは干渉ＲＮＡである。ＲＮＡ干渉またはＲＮＡサイレンシングは、進化的に保守的なプロセスであり、そのプロセスによって特定のｍＲＮＡを酵素による劣化の標的にすることができる。二本鎖ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）は、干渉ＲＮＡ経路を開始するために、細胞（例えば、二本鎖ＲＮＡウイルス、または干渉ＲＮＡポリヌクレオチド）によって導入または生成される。二本鎖ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼであるＲＮａｓｅｓ ＩＩＩによって、長さが２１～２４ｂｐの複数の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖に変換され得る。その後で、ｓｉＲＮＡは、ＡＴＰ依存性のプロセスによってｓｉＲＮＡの巻き戻しを促進するＲＮＡ誘発サイレンシング複合体によって認識され得る。巻き戻されたｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、活性化したＲＮＡ誘発サイレンシング複合体を、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖に相補的な配列を含む標的とされたｍＲＮＡに案内する。標的とされたｍＲＮＡおよびアンチセンス鎖は、Ａ型らせんを形成でき、Ａ型らせんの主要な溝は活性化したＲＮＡ誘発サイレンシング複合体によって認識できる。標的ｍＲＮＡは、活性化したＲＮＡ誘発サイレンシング複合体によって、ｓｉＲＮＡ鎖の５’端の結合部位によって限定される単一の部位で切断され得る。活性化したＲＮＡ誘発サイレンシング複合体は、別の切断事象を触媒するために再利用できる。
干渉ＲＮＡ発現ベクターは、ｍＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、または関連するＲＮＡ変異体の発現レベルを低減することにより、ＲＮＡ干渉を示す干渉ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする干渉ＲＮＡ構築物を含み得る。発現ベクターは、本明細書でさらに説明する通り、上流に位置し、干渉ＲＮＡ構築物に作用可能に連結されたプロモーターを備えうる。干渉ＲＮＡ発現ベクターは、適切な最小のコアプロモーター、関心の干渉ＲＮＡ構築物、上流（５’）制御領域、下流（３’）制御領域（転写終結およびポリアデ二レーションシグナルを含む）、および当業者にとって公知である様々な選択マーカーなどのその他の配列を備えうる。
二本鎖ＲＮＡ分子は、ステムループ構造の単一のオリゴヌクレオチドから組み立てたｓｉＲＮＡ分子であって、ｓｉＲＮＡ分子の自己相補的センスおよびアンチセンス領域が、ポリヌクレオチドベースあるいは非ポリヌクレオチドベースのリンカー（複数可）によって連結されている、ｓｉＲＮＡ分子、ならびに２つ以上のループ構造および自己相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を含むステムを有する、環状一本鎖ＲＮＡであって、環状ＲＮＡが、生体内または生体外のいずれかで処理されて、干渉ＲＮＡを媒介することが可能な活性ＳｉＲＮＡ分子を生成することができる、環状一本鎖ＲＮＡを含み得る。
小ヘアピンＲＮＡ分子の使用も意図されている。これらは、逆相補（センス）配列に加えて特定のアンチセンス配列を備え、これは一般にスペーサーまたはループ配列で分離されている。スペーサーまたはループの切断により、それらがアニールして二本鎖ＲＮＡ分子を形成しうるように、一本鎖のＲＮＡ分子およびその逆相補が提供される（随意に、一方または両方の鎖の３’端または５’端での一つ、二つ、三つまたはそれ以上のヌクレオチドの追加または除去につながりうる追加的な処理ステップがある）。スペーサーは、スペーサーの切断（および、随意に、結果的に一方または両方の鎖の３’端または５’端での一つ、二つ、三つ、四つ、またはそれ以上のヌクレオチドの追加または除去につながりうるその後の処理工程）の前に、二本鎖構造（または幹）のアニールと形成をするために、アンチセンスおよびセンス配列を許容する十分な長さのものとすることができる。スペーサー配列は通常、２つの相補的ポリヌクレオチド領域の間に位置する関連性のないポリヌクレオチドであり、これは、二本鎖ポリヌクレオチドにアニールされたときに小ヘアピンＲＮＡを含む。スペーサー配列は一般的に、約３～約１００個のヌクレオチドを含む。
関心の任意のＲＮＡポリヌクレオチドは、ヘアピン二重鎖を生成するために適切な配列組成、ループサイズ、および幹の長さを選択することで生成できる。ヘアピン二重鎖の幹の長さを設計するための適切な範囲は、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドの幹長を含むが、これは、約１４～３０個のヌクレオチド、約３０～５０個のヌクレオチド、約５０～１００個のヌクレオチド、約１００～１５０個のヌクレオチド、約１５０～２００個のヌクレオチド、約２００～３００個のヌクレオチド、約３００～４００個のヌクレオチド、約４００～５００個のヌクレオチド、約５００～６００個のヌクレオチド、および約６００～７００個のヌクレオチドなどである。ヘアピン二重鎖のループ長さを設計するための適切な範囲は、ループの長さが約４～２５個のヌクレオチド、約２５～５０個のヌクレオチド、あるいはヘアピン二重鎖の幹が相当に長い場合にはより長くなる。ある一定の実施形態で、二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子は、長さが約１５～約４０個のヌクレオチドである。別の実施形態で、ｓｉＲＮＡ分子は、長さが約１５～約３５個のヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。別の実施形態で、ｓｉＲＮＡ分子は、長さが約１７～約３０個のヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。別の実施形態で、ｓｉＲＮＡ分子は、長さが約１９～約２５個のヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。別の実施形態で、ｓｉＲＮＡ分子は、長さが約２１～約２３個のヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。ある特定の実施形態では、２１個よりも長いヌクレオチドの二重鎖領域を備えるヘアピン構造は、ループ配列および長さに関係なく、効果的なＳｉＲＮＡ依存性のサイレンシングを促進し得る。ＲＮＡ干渉の例示的な配列が本明細書に記載されている。
標的ｍＲＮＡ 配列は通常、長さが約１４～約５０個のヌクレオチドである。したがって、標的ｍＲＮＡは、長さが約１４～約５０個のヌクレオチドの領域についてスキャンされ得、これは、以下の基準：Ａ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ比率が約２：１～約１：２であること、標的配列の５’端にＡＡジヌクレオチドまたはＣＡジヌクレオチドがあること、標的ｍＲＮＡに対して一意の少なくとも連続して１０個のヌクレオチドの配列があること（すなわち、配列が、同じ植物体に由来する他のｍＲＮＡ配列内には存在しない）、ならびに３つ以上の連続的なグアニン（Ｇ）ヌクレオチドまたは３つ以上の連続的なシトシン（Ｃ）ヌクレオチドの「並び」がないこと、のうちの一つ以上を満たすことが好ましい。これらの基準は、当該技術分野において既知の様々な技術を使用して評価され得、例えば、ＢＬＡＳＴなどのコンピュータプログラムを公に利用可能なデータベースの検索に使用して、選択した配列が標的ｍＲＮＡに対して一意であるかどうかを判断することができる。別の方法として、配列は、市販されているコンピュータソフトウェア（例えば、市販品であるＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ、Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、およびｓｉＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ）を使用して選択され得る（またｓｉＲＮＡ配列が設計され得る）。
一つの実施形態で、標的ｍＲＮＡ配列は、上記の基準のうち一つ以上を満たす、長さが約１４～約３０個のヌクレオチドであるものが選択される。別の実施形態で、上記の基準のうち一つ以上を満たす、長さが約１６～約３０個のヌクレオチドである配列が選択される。さらなる実施形態で、上記の基準のうち一つ以上を満たす、長さが約１９～約３０個のヌクレオチドである配列が選択される。別の実施形態で、上記の基準のうち一つ以上を満たす、長さが約１９～約２５個のヌクレオチドである配列が選択される。
例示的な実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、本明細書で説明したポリヌクレオチドのいずれか１つの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上の連続するヌクレオチドに対して相補的である特定のアンチセンス配列を含む。
ｓｉＲＮＡ分子が含む特定のアンチセンス配列は、相補体と同一または実質的に同一であり得る。一実施形態で、ｓｉＲＮＡ分子が含む特定のアンチセンス配列は、標的ｍＲＮＡ配列の相補体と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。配列同一性を決定する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）ソフトウェアのＢＬＡＳＴＮプログラム、またはＮＣＢＩウェブサイトで提供されているものを使用して決定することができる。
植物体での二本鎖ＲＮＡ－サイレンシングを誘発するための一つの方法は、ヘアピンＲＮＡを生成する遺伝子構築物を用いた形質転換である（Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０７，３１９－３２０を参照）。こうした構築物は、適切なスペーサーにより分離された標的遺伝子配列の逆の領域を含む。スペーサー断片として機能的植物体イントロン領域を挿入することでさらに、イントロンがスプライスされたヘアピンＲＮＡが生成されるため、遺伝子サイレンシング誘導の効率が高まる（Ｐｌａｎｔ Ｊ．（２００１），２７，５８１－５９０）。幹の長さは、約５０個のヌクレオチド～約１キロベースであることが適切である。イントロンスプライスしたヘアピンＲＮＡを生成するための方法は、当該技術分野で十分に説明されている（例えば、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）７２，２，６１５－６１７）．（２００８）７２，２，６１５－６１７を参照）。
二重鎖または二本鎖構造を持つ干渉ＲＮＡ分子（例えば、二本鎖ＲＮＡまたは小ヘアピンＲＮＡ）は、ブラントエンドを持つことができ、また３’または５’オーバーハングを持つことができる。本明細書で使用されるとき、「オーバーハング」は、一方のＲＮＡ鎖の３’－終端が他方の鎖の５’－終端を越えて延びるとき（３’オーバーハング）、またはその逆のとき（５’オーバーハング）に、二重鎖構造から突き出している、対をなしていないヌクレオチド（単一もしくは複数）を意味する。オーバーハングを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの変性バージョンとすることができる。一つの実施形態で、干渉ＲＮＡ分子の少なくとも一つの鎖は、約１～約６個のヌクレオチドの３’オーバーハングを持つ。その他の実施形態で、３’オーバーハングは、長さが約１～約５個のヌクレオチド、約１～約３個のヌクレオチドおよび約２～約４個のヌクレオチドである。
干渉ＲＮＡ分子が分子の一方の端で３’オーバーハングを含むとき、他方の端は、平滑末端とするか、または同様にオーバーハング（５’または３’）を持つことができる。干渉ＲＮＡ分子が分子の両方の端にオーバーハングを含むとき、オーバーハングの長さは同一または異なる長さとしうる。一つの実施形態で、干渉ＲＮＡ分子は、分子の両端で約１～約３個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。さらなる実施形態で、干渉ＲＮＡ分子は、分子の両端に２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを持つ二本鎖ＲＮＡである。なお別の実施形態で、干渉ＲＮＡのオーバーハングを含むヌクレオチドは、ＴＴジヌクレオチドまたはＵＵジヌクレオチドである。
干渉ＲＮＡ分子は、一つ以上の５’または３’－キャップ構造を含むことができる。「キャップ構造」という用語は、オリゴヌクレオチドのいずれかの終端に組み入れられる化学的修飾を意味し、これはエキソヌクレアーゼ劣化から分子を保護し、また細胞内での送達または局在化の促進もしうる。
干渉ＲＮＡ分子に適用可能な別の修飾は、一つ以上の部分または共役体の干渉ＲＮＡ分子への化学的連結であり、これは、干渉ＲＮＡ分子の機能、細胞の分布、細胞の摂取、生物学的利用能、または安定性を高める。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で十分に確立された方法によって合成または修飾をしうる。化学的修飾は、２’修飾、非天然の塩基の導入、リガンドへの共有結合、およびリン酸塩結合のチオリン酸塩結合での置き換えを含む。この実施形態で、二重鎖構造の完全性は、少なくとも一つ、および一般には二つの化学的結合によって強化される。
二つの一本鎖の一方または両方でのヌクレオチドは、例えば、限定はされないが、ある一定のヌクレアーゼなど、細胞の酵素の活性化を調節するために修飾しうる。細胞の酵素の活性化を低減または抑制するための技術は、当該技術分野において公知であり、２’－アミノ修飾、２’－フルオロ修飾、２’－アルキル修飾、無電荷のバックボーン修飾、モルホリノ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、およびホスホルアミド酸を含むが、これに限定されない。
リガンドは、例えば、その細胞吸収を高めるために干渉ＲＮＡ分子に結合されうる。ある一定の実施形態で、疎水性リガンドは、細胞の薄膜の直接的な浸透を促進するために分子と結合される。ある一定の事例で、陽イオン性のリガンドをオリゴヌクレオチドに結合させることで、結果的にヌクレアーゼに対する抵抗性が改善されることがよくある。
「Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ」（ＴＩＬＬＩＮＧ）は、発現、機能、または活性が修飾されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの生成および／または特定に使用できる、もう一つの突然変異誘発技術である。ＴＩＬＬＩＮＧでは、こうした突然変異体を持つ植物体の選択も許容される。ＴＩＬＬＩＮＧは、高密度の突然変異誘発を、高スループットのスクリーニング方法と組み合わせている。ＴＩＬＬＩＮＧの方法は、当業界で周知である（ＭｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８：４５５－４５７およびＳｔｅｍｐｌｅ（２００４）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ５（２）：１４５－５０）．５（２）：１４５－５０を参照）。
様々な実施形態は、本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのうちの一つ以上、または一つ以上のＮｔＳＵＳポリヌクレオチドを含む干渉ＲＮＡ構築物を含む、発現べクターを対象とする。
様々な実施形態は、本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのうちの一つ以上または一つ以上の干渉ＲＮＡ構築物を含む、発現ベクターを対象とする。
様々な実施形態は、自己アニーリングしてヘアピン構造を形成することが可能である、本明細書で説明した一つ以上の干渉ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする、一つ以上のＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたは一つ以上の干渉ＲＮＡ構築物を含む、発現ベクターを対象とし、ここで構築物は、（ａ）本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのうちの一つ以上と、（ｂ）ヘアピン構造のループを形成する第２の配列と、（ｃ）第１の配列の逆相補配列を含み、第１の配列と同一の方向に位置する第３の配列とを含み、第２の配列は、第１の配列と第３の配列との間に配置され、第２の配列は、第１の配列と第３の配列に作用可能に連結されている。
開示されたＮｔＳＵＳポリヌクレオチドは、ヘアピン構造を形成しない様々なポリヌクレオチドの構成に利用され得る。例えば、二本鎖ＲＮＡは、（１）ＤＮＡの第一の鎖を第一のプロモーターに作用可能に結合することにより転写し、（２）ＤＮＡ断片の第一の鎖の逆相補配列を第二のプロモーターに作用可能に結合することにより転写して、形成できる。ポリヌクレオチドのそれぞれの鎖は、同一の発現ベクターから、または異なる発現ベクターから転写できる。ＲＮＡ干渉を有するＲＮＡ二重鎖は、酵素学的にｓｉＲＮＡに変換されてＲＮＡレベルを調節することができる。
こうして、様々な実施形態は、自己アニーリングが可能な干渉ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする、本明細書で説明した一つ以上のＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたは干渉ＲＮＡ構築物を含む発現ベクターを対象とし、ここで構築物は、（ａ）一つ以上の本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドと、（ｂ）第１の配列と同一の方向に配置された、第１の配列の相補的（例えば、逆相補的）配列を含む第２の配列とを含む。
本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリペプチドのうちの一つ以上（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の内在性発現レベルを、遺伝子発現の共抑制を促進することにより調節するための様々な組成物および方法が提供されている。
ｍＲＮＡの翻訳を調節することによって内在性遺伝子の発現レベルを調節するための様々な組成および方法が提供されている。宿主（たばこ）植物体細胞は、ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドに作用可能に連結され、ｍＲＮＡの一部分に対して相補的な配列を有するＲＮＡポリヌクレオチドの発現を可能にするために、プロモーターに対してアンチセンスの方向に配置されたプロモーターを含む、発現ベクターを用いて形質転換され得る。
ｍＲＮＡの翻訳を調節するための様々な発現ベクターは、ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドに作用可能に連結されたプロモーターを含み得、ここで、その配列は、プロモーターに対してアンチセンス方向に配置される。アンチセンスＲＮＡポリヌクレオチドの長さは変動させることができ、約１５～２０個のヌクレオチド、約２０～３０個のヌクレオチド、約３０～５０個のヌクレオチド、約５０～７５個のヌクレオチド、約７５～１００個のヌクレオチド、約１００～１５０個のヌクレオチド、約１５０～２００個のヌクレオチド、および約２００～３００個のヌクレオチドとしうる。
ｉ．可動遺伝要素
別の方法として、遺伝子は、トランスポゾン（例えば、ＩＳ要素）を関心の植物体のゲノムに導入することにより、不活性化のための標的にすることができる。これらの可動遺伝要素は、有性の交配によって導入でき、挿入変異をポリペプチド機能の損失についてスクリーニングできる。親株内で分裂させた遺伝子は、親株をトランスポゾン誘発突然変異誘発の対象ではない植物体と、例えば、有性交配によって交雑させることで、他の植物体に導入できる。当業者にとって公知の任意の標準的な育種テクニックを利用できる。一つの実施形態で、一つ以上の遺伝子は、一つ以上のトランスポゾンの挿入により不活性化できる。突然変異によって、結果的に、一つ以上の遺伝子の同型接合の分裂、一つ以上の遺伝子の異型接合の分裂、または複数の遺伝子が分裂した場合に同型接合および異型接合の破壊の両方の組み合わせにつながることがある。適切な置き換え可能な要素は、レトロトランスポゾン、レトロポゾン、およびＳＩＮＥ様の要素を含む。こうした方法は、当業者にとって公知である。
ｊ．リボザイム
別の方法として、ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドは、自己切断および複製の能力がある数多くの小さい環状ＲＮＡに由来するリボザイムを植物体に導入することにより、不活性化のための標的にできる。これらのＲＮＡは、単独（ウイロイドＲＮＡ）で、またはヘルパーウイルス（サテライトＲＮＡ）と共に、のいずれかで複製ができる。適切なＲＮＡの例には、アボカドサンブロッチウイロイドに由来するもののほか、たばこ輪点ウイルス、ルーサン一過性条斑ウイルス、ベルベットたばこ斑紋ウイルス、テリミノイヌホオズキ斑紋ウイルス、および地下性クローバ斑点ウイルスに由来するサテライトＲＮＡが含まれる。様々な標的ＲＮＡ特異的リボザイムが、当業者に知られている。
４．植物体
突然変異体または非天然の植物体または植物体細胞は、結果的にそれらの遺伝子またはそれらの遺伝子産物の発現または機能または活性が調節される一つ以上のＮｔＳＵＳ遺伝子における一つ以上の突然変異の任意の組み合わせを有することができる。例えば、突然変異体または非天然の植物体または植物体細胞は、単一のＮｔＳＵＳ遺伝子内での単一の突然変異、単一のＮｔＳＵＳ遺伝子内での複数の突然変異、二つ以上、三つ以上、もしくは四つ以上のＮｔＳＵＳ遺伝子内での単一の突然変異、または二つ以上、三つ以上、もしくは四つ以上のＮｔＳＵＳ遺伝子内での複数の突然変異を有し得る。さらなる例として、突然変異体または非天然の植物体または植物体細胞は、ＮｔＳＵＳポリペプチドまたはその一部分の活性部位をコードするＮｔＳＵＳ遺伝子の一領域内でなど、ＮｔＳＵＳ遺伝子（複数可）の特定の部分内での一つ以上の突然変異を有し得る。さらなる例として、突然変異体または非天然の植物体または植物体細胞は、ＮｔＳＵＳ遺伝子（複数可）の活性または発現を調節するという条件で、それが調節するＮｔＳＵＳ遺伝子の上流または下流の一領域内などの一つ以上のＮｔＳＵＳ遺伝子（複数可）の外側の一領域に、一つ以上の突然変異を有し得る。上流要素には、プロモーター、エンハンサーまたは転写因子を含めることができる。一部の要素（エンハンサーなど）は、調整する遺伝子の上流または下流に位置することができる。一部の要素は、それが調節する遺伝子の数十万塩基対だけ上流または下流に位置することがこれまでに判明しているため、要素はそれが調節する遺伝子の近くに位置する必要はない。突然変異体または非天然の植物体または植物体細胞は、遺伝子の最初のヌクレオチド１００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド２００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド３００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド４００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド５００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド６００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド７００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド８００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド９００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド１０００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド１１００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド１２００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド１３００個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド１４００個以内または遺伝子の最初のヌクレオチド１５００個以内に位置する、一つ以上の突然変異を持ちうる。突然変異体または非天然の植物体または植物体細胞は、遺伝子の１００個のヌクレオチドの第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４または第１５番目の組内またはその組み合わせに位置する一つ以上の突然変異を持ちうる。突然変異ポリペプチド変異体を含む突然変異体または非天然の植物体または植物体細胞（例えば、本明細書で説明した通り、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体または植物体細胞およびこれに類するもの）が開示されている。
一つの実施形態で、植物体からの種子は突然変異誘発された後、第一世代突然変異体の植物体に栽培される。次に、第一世代の植物体は、自家受粉がなされ、第一世代植物体からの種子が第二世代の植物体に栽培され、次にこれがその座位で突然変異についてスクリーニングされる。突然変異について突然変異を誘発する植物材料をスクリーニングすることはできるが、第二世代の植物体をスクリーニングすることの利点は、細胞体のすべての突然変異が生殖細胞系列変異に対応することである。当業者であれば、突然変異体である植物体を生成するために、種子、花粉、植物体組織または植物体細胞を含むがこれに限定されない様々な植物材料が突然変異誘発しうることを理解することになる。ただし、突然変異誘発した植物材料のタイプは、植物体のポリヌクレオチドがいつ突然変異についてスクリーニングを受けるかに影響し得る。例えば、非突然変異誘発性植物体の受粉前に花粉が突然変異誘発の対象となるとき、その受粉の結果生じる種子は第一世代植物体に栽培される。第一世代の植物体の各細胞は、花粉内で生成された突然変異を含むことになり、こうしてこれらの第一世代の植物体はその後、第二世代まで待たずに突然変異についてスクリーニングを受けうる。
ａ．修飾した植物の調製、スクリーニング、および交雑
個体植物体、植物体細胞、または植物材料から調製したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドは、任意に、突然変異誘発性の植物体組織、細胞、または材料を起源とする植物体の母集団内で、突然変異についてのスクリーニングを促進させるためにプールすることができる。植物体、植物体細胞または植物材料のその後の一世代以上の世代をスクリーニングできる。随意にプールされる群のサイズは、使用するスクリーニング方法の感受性に依存する。
試料が任意にプールされた後、それらは、ＰＣＲなどのポリヌクレオチド特異的増幅技術に供され得る。遺伝子または遺伝子のすぐ隣にある配列に特異的な一つ以上の任意のプライマーまたはプローブは、任意にプールされた試料内で配列を増幅するために利用され得る。一つ以上のプライマーまたはプローブは、有用な突然変異が最も発生する可能性の高い座の領域を増幅するよう設計されていることが適切である。プライマーは、ポリヌクレオチドの領域内での突然変異を検出するように設計されることが最も好ましい。さらに、プライマーおよびプローブは、点突然変異についてのスクリーニングを容易にするために、既知の多型の部位を避けることが好ましい。増幅生成物の検出を促進するために、一つ以上のプライマーまたはプローブを従来的な任意の標識付け方法を使用して標識付けしうる。プライマーまたはプローブは、当業界でよく理解されている方法を使用して、本明細書で説明した配列に基づき設計できる。
増幅生成物の検出を促進するために、プライマーまたはプローブを従来的な任意の標識付け方法を使用して標識付けしうる。これらは、当業界でよく理解されている方法を使用して、本明細書で説明した配列に基づき設計できる。
多型は、当業界において公知の手段により識別しうるが、いくつかがこれまでに文献に記載されている。
いくつかの実施形態では、植物は、植物、植物組織または植物体細胞から再生または栽培することができる。植物細胞または植物組織から植物を再生、または栽培する任意の適切な方法は、限定はされないが、組織培養またはプロトプラストからの再生等が使用できる。好適には、カルス誘導培地、シュート誘導培地および／または根誘導培地上で形質転換した植物体細胞を栽培することによって植物を再生することができる。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１－８４ （１９８６）．を参照のこと。次に、これらの植物を栽培し、同じ形質転換系統または異なる系統のいずれかで受粉し、所望の表現型特性の発現を有する結果物の雑種を同定する。所望の表現型特性の発現が安定的に維持、継承されるのを確実にするために２世代以上栽培し、所望の表現型特性の発現の達成を保証するために種子を収穫することができる。したがって、本明細書で使用されるとき、「形質転換種子」は、植物ゲノムに安定的に統合されたヌクレオチド構築物を含む種子を意味する。
したがって、さらなる態様で、突然変異体である植物体を調製する方法が提供されている。方法には、本明細書で説明した機能的ＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）をコードするＮｔＳＵＳ遺伝子を含む、植物体の少なくとも１つの細胞の提供が関与する。次に、植物体の少なくとも１つの細胞が、本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）の機能を調節するのに効果的な条件下で処理される。次に、少なくとも１つの突然変異体である植物体細胞は、突然変異体である植物体内に増殖させられ、突然変異体である植物体は、対照植物体のそれと比較して調節されたレベルの記載されるＮｔＳＵＳポリペプチド（複数可）（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）を有する。突然変異体である植物体を作成するこの方法の一つの実施形態において、処理手順には、上述の通り、および少なくとも一つの突然変異体である植物体細胞を得るのに効果的な条件下で、少なくとも一つの細胞を化学的突然変異誘発物質に晒す段階が関与する。この方法の別の実施形態で、処理手順には、少なくとも一つの細胞を少なくとも一つの突然変異体である植物体細胞を得るのに効果的な条件下で線源に晒す段階が関与する。「突然変異体である植物体」という用語は、対照植物体と比較して遺伝子型が修飾され、それが遺伝子工学または遺伝的修飾以外の手段によることが適切である、突然変異体である植物体が含まれる。
ある一定の実施形態で、突然変異体である植物体、突然変異体である植物体細胞、または突然変異体である植物材料は、別の植物体、植物体細胞または植物材料で自然に発生し、望ましい特性を与える一つ以上の突然変異を備えうる。この突然変異は、別の植物体、植物体細胞、または植物材料（例えば、突然変異が誘導された植物体とは異なる遺伝的背景を持つ植物体、植物体細胞または植物材料）に組み込んで（例えば、遺伝子移入）、それに対する特性を与えることができる。こうして一例として、第一の植物体で自然に発生した突然変異が第二の植物体（第一の植物体とは異なる遺伝的背景を持つ第二の植物体など）に導入されうる。したがって当業者は、本明細書で説明した望ましい特性を与える遺伝子の一つ以上の突然変異体対立形質をそのゲノム内に自然に持つ植物体を、検索し特定することができる。自然に発生する突然変異体対立遺伝子は、本明細書で説明した遺伝子で一つ以上の突然変異を持つ系統、品種または混成体を生成するために、育種、戻し交配および遺伝子移入を含む様々な方法により、第二の植物体に移動させることができる。同じ技術は、第１の植物体から第２の植物体への一つ以上の非天然の突然変異（複数可）の遺伝子移入にも適用され得る。望ましい特性を示す植物体は、突然変異体である植物体のプールからスクリーニングして除外しうる。選択は、本明細書で説明したポリヌクレオチドの知識を利用して実施されることが適切である。したがって、対照と比較した遺伝的特性についてのスクリーニングが可能である。こうしたスクリーニングのアプローチには、本明細書で考察した通り従来的な増幅および／またはハイブリッド形成技術の適用が関与し得る。したがって、本開示のさらなる態様は、突然変異体である植物体を特定するための方法に関し、（ａ）植物体からのＮｔＳＵＳポリヌクレオチドを含む試料を提供する工程と、（ｂ）ＮｔＳＵＳポリヌクレオチド配列を決定する工程とを含み、対照植物体のＮｔＳＵＳポリヌクレオチドと比較したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの配列の差は、前述の植物体が突然変異体である植物体であることを示す。別の態様では、対照植物体と比較して増加または減少したレベルの還元糖（複数可）を蓄積する、突然変異体である植物体を特定するための方法が提供されており、（ａ）スクリーニングされる植物体からの試料を提供する工程と、（ｂ）前述の試料が、本明細書に記載されるＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのうちの一つ以上において一つ以上の突然変異を含むかを決定する工程と、（ｃ）前述の植物体の少なくとも１つの還元糖のレベルを決定する工程とを含む。好適には、少なくとも１つの還元糖のレベルは、緑葉、早期乾燥処理済みの葉、または乾燥処理済みの葉において決定される。別の態様では、対照植物体と比較して増加または減少したレベルの少なくとも１つの還元糖を有する、突然変異体である植物体を調製するための方法が提供されており、（ａ）第１の植物体からの試料を提供する工程と、（ｂ）前述の試料が、調節されたレベルの少なくとも１つの還元糖をもたらす、本明細書に記載されるＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのうちの一つ以上において一つ以上の突然変異を含むかを決定する工程と、（ｃ）第２の植物体に一つ以上の突然変異を導入する工程とを含む。好適には、少なくとも１つの還元糖のレベルは、緑葉、早期乾燥処理済みの葉、または乾燥処理済みの葉において決定される。突然変異は、遺伝子組み換え、遺伝子操作、遺伝子移入、植物体育種、戻し交配、およびこれに類するものによるなど、当業界において公知の様々な方法を使用して、第二の植物体に移動できる。一つの実施形態で、第一の植物体は、天然の植物体である。一つの実施形態で、第二の植物体は、第一の植物体とは異なる遺伝的背景を持つ。別の態様では、対照植物体と比較して増加または減少したレベルの少なくとも１つの還元糖を有する、突然変異体である植物体を調製するための方法が提供されており、（ａ）第１の植物体からの試料を提供する工程と、（ｂ）前述の試料が、調節されたレベルの少なくとも１つの還元糖をもたらす、本明細書に記載されるＮｔＳＵＳポリヌクレオチドのうちの一つ以上において一つ以上の突然変異を含むかを決定する工程と、（ｃ）第１の植物体から第２の植物体に一つ以上の突然変異を遺伝子移入する工程とを含む。好適には、少なくとも１つの還元糖のレベルは、緑葉、早期乾燥処理済みの葉、または乾燥処理済みの葉において決定される。一つの実施形態で、遺伝子移入の工程は、植物体育種を含み、随意に、戻し交配およびこれに類するものを含む。一つの実施形態で、第一の植物体は、天然の植物体である。一つの実施形態で、第二の植物体は、第一の植物体とは異なる遺伝的背景を持つ。一つの実施形態で、第一の植物体は、栽培品種または優良栽培品種ではない。一つの実施形態で、第二の植物体は、栽培品種または優良栽培品種である。さらなる態様が、本明細書に記載した方法によって獲得されたか、または獲得可能な突然変異体である植物体（栽培品種または優良栽培品種の突然変異である植物体を含む）に関連する。ある一定の実施形態で、「突然変異体である植物体」は、一つ以上の本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの配列内など、植物体の特定の領域にのみ局所化された一つ以上の突然変異を有し得る。この実施形態によれば、突然変異体である植物体の残りのゲノム配列は、突然変異誘発前の植物体と同一となるかまたは実質的に同一となる。
ある一定の実施形態で、突然変異体である植物体は、一つ以上の本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの配列内およびゲノムの一つ以上のさらなる領域など、植物体の複数のゲノム領域に局所化された一つ以上の突然変異を有し得る。この実施形態によれば、突然変異体である植物体の残りのゲノム配列は、突然変異誘発前の植物体と同一ではなくなるか、または実質的に同一ではなくなる。ある一定の実施形態で、突然変異体である植物体は、本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）の一つ以上、二つ以上、三つ以上、四つ以上、もしくは五つ以上のエクソンでは一つ以上の突然変異を有しなくてもよく、または本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）の一つ以上、二つ以上、三つ以上、四つ以上、もしくは五つ以上のイントロンでは一つ以上の突然変異を有しなくてもよく、または本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）のプロモーターでは一つ以上の突然変異を有しなくてもよく、または本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）の３’非翻訳領域では一つ以上の突然変異を有しなくてもよく、または本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（Ｈｕの５’非翻訳領域では一つ以上の突然変異を有しなくてもよく、または本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）のコード領域では一つ以上の突然変異を有しなくてもよく、または本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）の非コード領域では一つ以上の突然変異を有しなくてもよく、またはその二つ以上、三つ以上、四つ以上、五つ以上、もしくは六つ以上のその部分の任意の組み合わせであってもよい。
さらなる態様では、植物体、植物体細胞、または植物材料を特定する方法が提供されており、（ａ）植物体、植物体細胞、または植物材料を突然変異誘発に供することと、（ｂ）前述の植物体、植物体細胞、または植物材料、またはその子孫から試料を得ることと、（ｃ）ＮｔＳＵＳ遺伝子またはその変異体もしくは断片のポリヌクレオチド配列を決定することとを含み、ここで、前述の配列の差異は、その中での一つ以上の突然変異を示す。この方法はまた、転写開始部位、開始コドン、イントロンの領域、エクソン－イントロンの境界、転写終結区、または終止コドンなど、植物体細胞におけるＮｔＳＵＳ遺伝子の発現に影響を及ぼす、ゲノム領域において生じる突然変異（複数可）を有する植物体の選択を可能にする。
ｂ．植物科、種、品種、種子、および組織培養
遺伝的改変における使用に好適な植物としては、単子葉および双子葉植物、ならびに植物細胞系が挙げられ、以下の科のうちの１つからの種を含む。Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ、Ａｌｌｉａｃｅａｅ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ、Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ、Ａｒｅｃａｃｅａｅ、Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ、Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ、Ｂｉｘａｃｅａｅ、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ、Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ、Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ、Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘａｃｅａｅ、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ、Ｃｏｌｃｈｉｃａｃｅａｅ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ、Ｅｐｈｅｄｒａｃｅａｅ、Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌａｃｅａｅ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ、Ｆａｂａｃｅａｅ、Ｌａｍｉａｃｅａｅ、Ｌｉｎａｃｅａｅ、Ｌｙｃｏｐｏｄｉａｃｅａｅ、Ｍａｌｖａｃｅａｅ、Ｍｅｌａｎｔｈｉａｃｅａｅ、Ｍｕｓａｃｅａｅ、Ｍｙｒｔａｃｅａｅ、Ｎｙｓｓａｃｅａｅ、Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ、Ｐｉｎａｃｅａｅ、Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ、Ｐｏａｃｅａｅ、Ｒｏｓａｃｅａｅ、Ｒｕｂｉａｃｅａｅ、Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ、Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ、Ｔａｘａｃｅａｅ、Ｔｈｅａｃｅａｅ、またはＶｉｔａｃｅａｅ。
適切な種は、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ、Ａｂｉｅｓ、Ａｃｅｒ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ａｌｌｉｕｍ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ、Ａｎａｎａｓ、Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、Ａｒｕｎｄｏ、Ａｔｒｏｐａ、Ｂｅｒｂｅｒｉｓ、Ｂｅｔａ、Ｂｉｘａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ、Ｃａｍｅｌｌｉａ、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ、Ｃａｎｎａｂｉｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ、Ｃｉｎｃｈｏｎａ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ、Ｃｏｌｅｕｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｔｕｒａ、Ｄｉａｎｔｈｕｓ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ、Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｖｅａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｊａｔｒｏｐｈａ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｍｅｎｔｈａ、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ、Ｍｕｓａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐａｐａｖｅｒ、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｉｎｕｓ、Ｐｏａ、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｒｏｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｓａｌｉｘ、Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ、Ｓｃｏｐｏｌｉａ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｓｐａｒｔｉｎａ、Ｓｐｉｎａｃｅａ、Ｔａｎａｃｅｔｕｍ、Ｔａｘｕｓ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｕｎｉｏｌａ、Ｖｅｒａｔｒｕｍ、Ｖｉｎｃａ、Ｖｉｔｉｓ、およびＺｅａといった属の一つを含みうる。
適切な種は、Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐｐ．、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ ｓｐｐ．、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｓｐｐ．、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇｅｒａｒｄｉｉ（ｂｉｇ ｂｌｕｅｓｔｅｍ）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ（オオガマ）、Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（クサヨシ）、Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ（ギョウギシバ）、Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（ヒロハノウシノケグサ）、Ｓｐａｒｔｉｎａ ｐｅｃｔｉｎａｔａ（プレーリーコード－グラス）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ａｒｕｎｄｏ ｄｏｎａｘ（ダンチク）、Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ（ライ麦）、Ｓａｌｉｘ ｓｐｐ．（ヤナギ）、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｓｐｐ．（ユーカリ）、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ（コムギタイムライ麦）、竹、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ）、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ（ジャトロファ）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（キャスター）、Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（ヤシ）、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（アマ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、β ｖｕｌｇａｒｉｓ（サトウキビ）、Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（ｃａｓｓａｙａ）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ（レタス）、Ｍｕｓｙｃｌｉｓｅ ａｌｃａ（バナナ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ（ブロッコリ、カリフラワー、芽キャベツ）、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（茶）、Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ（イチゴ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ（ココア）、Ｃｏｆｆｅｙｃｌｉｓｅｃａ（コーヒー）、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ（ブドウ）、Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ（パイナップル）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ（トウガラシおよび甘トウガラシ）、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ（タマネギ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ（メロン）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ（キュウリ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ（カボチャ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ（ｓｑｕａｓｈ）、Ｓｐｉｎａｃｅａ ｏｌｅｒａｃｅａ（ホウレンソウ）、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ（スイカ）、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ（オクラ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ（ナス）、Ｒｏｓａ ｓｐｐ．（バラ）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ（カーネーション）、Ｐｅｔｕｎｉａ ｓｐｐ．（ペチュニア）、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ（ポインセチア）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ（ルピナス）、Ｕｎｉｏｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（オート麦）、ベントグラス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｓｐｐ．）、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ（ポプラ）、Ｐｉｎｕｓ ｓｐｐ．（マツ）、Ａｂｉｅｓ ｓｐｐ．（モミ）、Ａｃｅｒ ｓｐｐ．（カエデ）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（大麦）、Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ（ブルーグラス）、Ｌｏｌｉｕｍ ｓｐｐ．（ドクムギ）およびＰｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ（チモシー）、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス）、Ｓｏｒｇｈｕｙｃｌｉｓｅまたは（モロコシ、スーダングラス）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（ススキ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．（ｅｎｅｒｇｙｃａｎｅ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ（ポプラ）、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（キャノーラ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（ワタ）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（イネ）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、β ｖｕｌｇａｒｉｓ（サトウダイコン）、またはＰｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ（トウジンビエ）を含みうる。
様々な実施形態は、遺伝子発現レベルを調節するために修飾し、それによってポリペプチドの発現レベルが対照植物体と比較して関心の植物体組織内で調節される植物体または植物体細胞（たばこ植物体など）を生成する、突然変異体たばこ、非天然のたばこ、または遺伝子組み換えのたばこ植物体または植物体細胞を対象とする。開示される組成物および方法は、Ｎ．ｒｕｓｔｉｃａおよびＮ．ｔａｂａｃｕｍを含む、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属に属する任意の種（例えば、ＬＡ Ｂ２１、ＬＮ ＫＹ１７１、ＴＩ １４０６、Ｂａｓｍａ、Ｇａｌｐａｏ、Ｐｅｒｉｑｕｅ、Ｂｅｉｎｈａｒｔ １０００－１、およびＰｅｔｉｃｏ）に適用することができる。その他の主としては、Ｎ．ａｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｎ．ａｆｒｉｃａｎａ、Ｎ．ａｌａｔａ、Ｎ．ａｍｅｇｈｉｎｏｉ、Ｎ．ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ａｒｅｎｔｓｉｉ、Ｎ．ａｔｔｅｎｕａｔａ、Ｎ．ａｚａｍｂｕｊａｅ、Ｎ．ｂｅｎａｖｉｄｅｓｉｉ、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ｎ．ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ、Ｎ．ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｎ．ｃａｖｉｃｏｌａ、Ｎ．ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ、Ｎ．ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｃｏｒｙｍｂｏｓａ、Ｎ．ｄｅｂｎｅｙｉ、Ｎ．ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ、Ｎ．ｆｏｒｇｅｔｉａｎａ、Ｎ．ｆｒａｇｒａｎｓ、Ｎ．ｇｌａｕｃａ、Ｎ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｎ．ｇｏｏｄｓｐｅｅｄｉｉ、Ｎ．ｇｏｓｓｅｉ、Ｎ．ｈｙｂｒｉｄ、Ｎ．ｉｎｇｕｌｂａ、Ｎ．ｋａｗａｋａｍｉｉ、Ｎ．ｋｎｉｇｈｔｉａｎａ、Ｎ．ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ、Ｎ．ｌｉｎｅａｒｉｓ、Ｎ．ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｎ．ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｎ．ｍｉｅｒｓｉｉ、Ｎ．ｎｏｃｔｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｎｕｄｉｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｎ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｅｓｐｅｒｉｓ、Ｎ．ｏｔｏｐｈｏｒａ、Ｎ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ｎ．ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｐｅｔｕｎｉｏｉｄｅｓ、Ｎ．ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ、Ｎ．ｒａｉｍｏｎｄｉｉ、Ｎ．ｒｅｐａｎｄａ、Ｎ．ｒｏｓｕｌａｔａ、Ｎ．ｒｏｓｕｌａｔａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｇｕｌｂａ、Ｎ．ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｓｅｔｃｈｅｌｌｉｉ、Ｎ．ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｎ．ｓｏｌａｎｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｓｐｅｇａｚｚｉｎｉｉ、Ｎ．ｓｔｏｃｋｔｏｎｉｉ、Ｎ．ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｎ．ｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎ．ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａ、Ｎ．ｕｍｂｒａｔｉｃａ、Ｎ．ｕｎｄｕｌａｔａ、Ｎ．ｖｅｌｕｔｉｎａ、Ｎ．ｗｉｇａｎｄｉｏｉｄｅｓ、およびＮ．ｘ ｓａｎｄｅｒａｅが挙げられる。一実施形態では、植物体は、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍである。
たばこ栽培品種および優良たばこ栽培品種の使用も、本明細書で意図されている。したがって、遺伝子組み換えであるか、非天然であるか、または突然変異体である植物体は、一つ以上の導入遺伝子、または一つ以上の遺伝子突然変異、またはその組み合わせを含む、たばこ品種または優良たばこ栽培品種としうる。遺伝子突然変異（例えば、一つ以上の多型）は、個別たばこ品種またはたばこ栽培品種（例えば、優良たばこ栽培品種）内に天然には存在しない突然変異とするか、または個別たばこ品種またはたばこ栽培品種（例えば、優良たばこ栽培品種）で天然に発生しないとする場合に、天然に発生する遺伝子突然変異とすることができる。
特に有用なＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ品種には、バーレータイプ、ダークタイプ、熱風送管乾燥処理タイプ、およびオリエンタルタイプのたばこが含まれる。品種または栽培品種の非限定的な例は：ＢＤ ６４、ＣＣ １０１、ＣＣ ２００、ＣＣ ２７、ＣＣ ３０１、ＣＣ ４００、ＣＣ ５００、ＣＣ ６００、ＣＣ ７００、ＣＣ ８００、ＣＣ ９００、Ｃｏｋｅｒ １７６、Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｃｏｋｅｒ ３７１ Ｇｏｌｄ、Ｃｏｋｅｒ ４８、ＣＤ ２６３、ＤＦ９１１、ＤＴ ５３８ ＬＣ Ｇａｌｐａｏ ｔｏｂａｃｃｏ、ＧＬ ２６Ｈ、ＧＬ ３５０、ＧＬ ６００、ＧＬ ７３７、ＧＬ ９３９、ＧＬ ９７３、ＨＢ ０４Ｐ、ＨＢ ０４Ｐ ＬＣ、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、Ｈｙｂｒｉｄ ４０３ＬＣ、Ｈｙｂｒｉｄ ４０４ＬＣ、Ｈｙｂｒｉｄ ５０１ ＬＣ、Ｋ １４９、Ｋ ３２６、Ｋ ３４６、Ｋ ３５８、Ｋ３９４、Ｋ ３９９、Ｋ ７３０、ＫＤＨ ９５９、ＫＴ ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ １６０、ＫＹ １７、ＫＹ １７１、ＫＹ ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＹ１４ｘＬ８ ＬＣ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ、ＭｃＮａｉｒ ３７３、ＭｃＮａｉｒ ９４４、ｍｓＫＹ １４ｘＬ８、Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ、Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ ＬＣ、ＮＢＨ ９８、Ｎ－１２６、Ｎ－７７７ＬＣ、Ｎ－７３７１ＬＣ、ＮＣ １００、ＮＣ １０２、ＮＣ ２０００、ＮＣ ２９１、ＮＣ ２９７、ＮＣ ２９９、ＮＣ ３、ＮＣ ４、ＮＣ ５、ＮＣ ６、ＮＣ７、ＮＣ ６０６、ＮＣ ７１、ＮＣ ７２、ＮＣ ８１０、ＮＣ ＢＨ １２９、ＮＣ ２００２、Ｎｅａｌ Ｓｍｉｔｈ Ｍａｄｏｌｅ、ＯＸＦＯＲＤ ２０７、ＰＤ ７３０２ ＬＣ、ＰＤ ７３０９ ＬＣ、ＰＤ ７３１２ ＬＣ、’Ｐｅｒｉｑｕｅ’ ｔｏｂａｃｃｏ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ ６１０、Ｒ ６３０、Ｒ ７－１１、Ｒ ７－１２、ＲＧ １７、ＲＧ ８１、ＲＧ Ｈ５１、ＲＧＨ ４、ＲＧＨ ５１、ＲＳ １４１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ １６８、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７２、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７９、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２５、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２７、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２３４、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－２８、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－７０、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ－６、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ＮＦ３、ＴＩ １４０６、ＴＩ １２６９、ＴＮ ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ ９０、ＴＮ ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ Ｄ９４、ＴＮ Ｄ９５０、ＴＲ（Ｔｏｍ Ｒｏｓｓｏｎ）Ｍａｄｏｌｅ、ＶＡ ３０９、ＶＡ３５９、ＡＡ ３７－１、Ｂ１３Ｐ、Ｘａｎｔｈｉ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ－Ｍｏｒ）、Ｂｅｌ－Ｗ３、７９－６１５、Ｓａｍｓｕｎ Ｈｏｌｍｅｓ ＮＮ、ＫＴＲＤＣ ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｈｙｂｒｉｄ ４９、Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＫＹ８９５９、ＫＹ９、ＭＤ ６０９、ＰＧ０１、ＰＧ０４、ＰＯ１、ＰＯ２、ＰＯ３、ＲＧ１１、ＲＧ ８、ＶＡ５０９、ＡＳ４４、Ｂａｎｋｅｔ Ａ１、Ｂａｓｍａ Ｄｒａｍａ Ｂ８４／３１、Ｂａｓｍａ Ｉ Ｚｉｃｈｎａ ＺＰ４／Ｂ、Ｂａｓｍａ Ｘａｎｔｈｉ ＢＸ ２Ａ、Ｂａｔｅｋ、Ｂｅｓｕｋｉ Ｊｅｍｂｅｒ、Ｃ１０４、Ｃｏｋｅｒ ３４７、Ｃｒｉｏｌｌｏ Ｍｉｓｉｏｎｅｒｏ、Ｄｅｌｃｒｅｓｔ、Ｄｊｅｂｅｌ ８１、ＤＶＨ ４０５、Ｇａｌｐaｏ Ｃｏｍｕｍ、ＨＢ０４Ｐ、Ｈｉｃｋｓ Ｂｒｏａｄｌｅａｆ、Ｋａｂａｋｕｌａｋ Ｅｌａｓｓｏｎａ、Ｋｕｔｓａｇｅ Ｅ１、ＬＡ ＢＵ ２１、ＮＣ ２３２６、ＮＣ ２９７、ＰＶＨ ２１１０、Ｒｅｄ Ｒｕｓｓｉａｎ、Ｓａｍｓｕｎ、Ｓａｐｌａｋ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔａｌｇａｒ ２８、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｙａｙａｌｄａｇ、Ｐｒｉｌｅｐ ＨＣ－７２、Ｐｒｉｌｅｐ Ｐ２３、Ｐｒｉｌｅｐ ＰＢ １５６／１、Ｐｒｉｌｅｐ Ｐ１２－２／１、Ｙａｋａ ＪＫ－４８、Ｙａｋａ ＪＢ １２５／３、ＴＩ－１０６８、ＫＤＨ－９６０、ＴＩ－１０７０、ＴＷ１３６、Ｂａｓｍａ、ＴＫＦ ４０２８、Ｌ８、ＴＫＦ ２００２、ＧＲ１４１、Ｂａｓｍａ ｘａｎｔｈｉ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａである。本明細書で具体的に識別されていない場合であっても、上記の低コンバーター亜種も意図されている。
実施形態は、本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の発現または機能を調節するために修飾された、突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、またはトランスジェニック植物体を生成するための組成物および方法も対象とする。有利なことに、得られた突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組み換えの植物体は、全体的な外観において対照植物体と類似しているか、または実質的に同一でありうる。成熟度、植物体当たりの葉の数、茎の高さ、葉の挿入角度、葉のサイズ（幅および長さ）、節間の距離、および葉身と中央脈の比率など、様々な表現型特性を現場での観察により評価できる。
一つの態様は、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組み換えの植物体の種子に関連する。種子はたばこ種子であることが好ましい。さらなる態様は、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組み換え植物体の花粉または胚珠に関連する。さらに、雄性不稔性を与えるポリヌクレオチドをさらに含む、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、またはトランスジェニック植物体が提供されている。
また、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組み換えの植物体、またはその部分の再生可能な細胞の組織培養も提供されており、培養によって、親のすべての形態学的特性および生理学的特性を発現する能力を持つ植物体が再生される。再生可能な細胞には、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、根、根端、葯、花およびその部分、胚珠、苗条、幹、茎、随およびカプセルに由来する細胞、またはカルスまたはそれに由来する原形質体が含まれる。
本明細書に記載される植物材料は、バージニアタイプなどの熱風送管乾燥処理済みのたばこ材料、またはバーレータイプおよびダークタイプなどの日光乾燥処理済みのたばこ材料など、乾燥処理済みのたばこ材料であり得る。本明細書で説明した植物材料は、バーレータイプおよびダークタイプなど、空気乾燥処理済みのたばこ材料であり得る。
たばこ乾燥処理に関するＣＯＲＥＳＴＡの推奨は、ＣＯＲＥＳＴＡ Ｇｕｉｄｅ Ｎ°１７，Ａｐｒｉｌ ２０１６，Ｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｌｅａｆ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎに記載されている。
ｃ．還元糖含有量の調節
一目的は、植物材料内（例えば、乾燥処理済みの葉中）の少なくとも１つの還元糖の調節されたレベルを示す突然変異体、トランスジェニック、または非天然の植物体またはその部分を提供することである。対照植物体と比較して少なくとも１つの還元糖の調節されたレベルを示す突然変異体、トランスジェニック、または非天然の植物体またはその部分であることが、適切である。突然変異体、遺伝子組み換え、または非天然の植物体またはその部分は、対照植物体と実質的に同一の視覚的外観を持つことが適切である。
したがって、対照細胞または対照植物体と比較して少なくとも１つの還元糖の調節されたレベルを有する突然変異体、トランスジェニック、または非天然の植物体もしくはその部分または植物体細胞が、本明細書で説明されている。突然変異体、トランスジェニック、または非天然の植物体または植物体細胞は、対応する本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの発現を調節することにより、一つ以上の本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリペプチドの合成または機能を調節するよう修飾されてきた。少なくとも１つの還元糖の調節されたレベルは、少なくとも緑葉（早期乾燥処理済みまたは乾燥処理済みの葉が適切）で観察される。ある一定の実施形態で、植物体（緑葉などであるが、早期乾燥処理済みもしくは乾燥処理済みの葉、または乾燥処理済みのたばこであることが適切）内の還元糖のレベルは調節され得る。ある一定の実施形態で、植物体（緑葉などであるが、早期乾燥処理済みの葉、乾燥処理済みの葉、または乾燥処理済みのたばこであることが適切）内の還元糖のレベルは調節され得る。
特定の実施形態では、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つ以上の活性および／または発現が調節される。
特定の実施形態では、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｔのうちの一つ以上の活性および／または発現が調節される。
特定の実施形態では、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｔのうちの一つ以上の活性および／または発現が調節され、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つ以上の活性および／または発現は調節されない。
特定の実施形態では、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｔの活性および／または発現が調節され、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔの活性および／または発現は調節されない。
特定の実施形態では、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｓのうちの一つ以上の活性および／または発現が調節され、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔのうちの一つ以上の活性および／または発現は調節されない。
特定の実施形態では、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、およびＮｔＳＵＳ４－Ｓの活性および／または発現が調節され、ＮｔＳＵＳ１－Ｓ、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔの活性および／または発現は調節されない。さらなる態様は、突然変異体、非天然、またはトランスジェニック植物体または細胞に関連し、ここで、一つ以上の本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリペプチドの発現または活性は、調節され、植物体の一部（例えば、緑葉、早期乾燥処理済みもしくは乾燥処理済みの葉、または乾燥処理済みのたばこが適切）は、前述のＮｔＳＵＳポリペプチド（複数可）の発現または機能が調節されていない対照植物体と比較して、少なくとも１つの還元糖のレベルがその中で少なくとも５％減少した。ある一定の実施形態で、植物体（緑葉などであるが、早期乾燥処理済みもしくは乾燥処理済みの葉、または乾燥処理済みのたばこであることが適切）内の少なくとも１つの還元糖のレベルは、例えば少なくとも約５％調節され得る。
なおさらなる態様は、突然変異体、非天然、またはトランスジェニック植物体または細胞から誘導されるかまたは誘導可能な乾燥処理済み植物材料（乾燥処理済みの葉または乾燥処理済みのたばこなど）に関連し、ここで、一つ以上の本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの発現またはそれによりコードされるＮｔＳＵＳポリペプチドの機能は調節され、少なくとも１つの還元糖のレベルは、対照植物体と比較して少なくとも約５％調節される。
前記植物体またはその部分（例えば、葉）の視覚的外観は、実質的に対照植物体と同一であることが適切である。植物体は、たばこ植物体またはコーヒー植物体であることが適切である。
実施形態は、本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはＮｔＳＵＳポリペプチドのうちの一つ以上の発現または機能を調節するために修飾された突然変異体、非天然、またはトランスジェニック植物体を生成するための組成物および方法も対象とし、これは、調節された還元糖含有量を有する植物体または植物体構成成分（例えば、葉（緑葉または早期乾燥処理済みもしくは乾燥処理済みの葉など）あるいはたばこ）または植物体細胞をもたらす。
本開示従い獲得された突然変異体、非天然、またはトランスジェニック植物体は、視覚的な外観において対応する対照植物体と類似しているか、または実質的に同一であり得る。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の葉の重量は、実質的に対照植物体と同一である。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の葉数は、実質的に対照植物体と同一である。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の葉の重量および葉数は、実質的に対照植物体と同一である。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の茎の高さは、例えば、野外に移植してから１か月、２か月または３か月以上、または最高の高さまで伸びた後１０日、２０日、３０日または３６日またはそれ以上の日数が経過した時点で実質的に対照植物体と同一である。例えば、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の茎の高さは、対照植物体の茎の高さよりも低くない。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体のクロロフィル含有量は、実質的に対照植物体と同一である。別の実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の茎の高さは、実質的に対照植物体と同一であり、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の葉緑素含有量は、実質的に対照植物体と同一である。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の葉のサイズまたは形態または数または彩色は、実質的に対照植物体と同一である。植物体は、たばこ植物体またはコーヒー植物体であることが適切である。
別の態様では、植物体の少なくとも一部（例えば、葉（乾燥処理済みの葉など）またはたばこ）における少なくとも１つの還元糖の量を調節するための方法が提供されており、（ｉ）本明細書に記載されるＮｔＳＵＳポリペプチドのうちの一つ以上（または本明細書に記載されるようなそれらの任意の組み合わせ）の発現または機能を調節する工程であって、好適には、ＮｔＳＵＳポリペプチド（複数可）が、対応する本明細書に記載されるＮｔＳＵＳポリヌクレオチドによってコードされる、工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られる突然変異体、非天然、またはトランスジェニック植物体の少なくとも一部（例えば、葉（乾燥処理済みの葉など）またはたばこもしくは煙）における少なくとも１つの還元糖のレベルを測定する工程と、（ｉｉｉ）その中の少なくとも１つの還元糖のレベルが対照植物体と比較して調節された突然変異体、非天然、またはトランスジェニック植物体のレベルを特定する工程とを含む。前述の突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の視覚的外観は、実質的に対照植物体と同一であることが適切である。植物体はたばこ植物体であることが適切である。
別の態様では、乾燥処理済みの材料の少なくとも一部（乾燥処理済みの葉など）における少なくとも１つの還元糖の量を調節するための方法が提供されており、（ｉ）ＮｔＳＵＳポリペプチドのうちの一つ以上（または本明細書に記載されるようなそれらの任意の組み合わせ）の発現または機能を調節する工程であって、好適には、ＮｔＳＵＳポリペプチド（複数可）が、対応する本明細書に記載されるＮｔＳＵＳポリヌクレオチドによってコードされる、工程と、（ｉｉ）植物材料（葉のうちの一つ以上など）を収穫し、ある期間にわたって乾燥処理する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られる、または工程（ｉｉ）中の乾燥処理済みの植物材料の少なくとも一部における少なくとも１つの還元糖のレベルを測定する工程と、（ｉｖ）その中の少なくとも１つの還元糖のレベルが対照植物体と比較して調節された、乾燥処理済みの植物材料を特定する工程とを含む。
対照と比較した発現の増加は、約５％～約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％以上（２００％、３００％、５００％、１０００％以上など）の増加であり得、これには、転写機能、またはＮｔＳＵＳポリヌクレオチド発現もしくはＮｔＳＵＳポリペプチド発現、またはそれらの組み合わせが含まれる。
対照と比較した機能または活性の増加は、約５％～約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％以上（２００％、３００％、５００％、１０００％以上など）の増加であり得る。
対照と比較した発現の減少は、約５％～約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％の減少であり得、これには、転写機能、またはＮｔＳＵＳポリヌクレオチド発現もしくはＮｔＳＵＳポリペプチド発現、またはそれらの組み合わせが含まれる。
対照と比較した機能または活性の減少は、約５％～約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％の減少であり得る。
本明細書に説明されるポリヌクレオチドおよび組み換え体構築物を使用して、対象の植物種、好適にはタバコにおける、本明細書に説明されるＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたはＮｔＳＵＳポリペプチドの発現または機能または活性を調節することができる。
数多くのポリヌクレオチドをベースにした方法を、植物体および植物体細胞内での遺伝子発現を増大させるために使用できる。一例として、形質転換する植物体との適合性のある構築物、ベクターまたは発現ベクターを準備でき、これは、関心の遺伝子と、植物体または植物体細胞内の遺伝子を過剰発現する能力のある上流プロモーターとを一緒に備える。模範的プロモーターについては、本明細書で説明した。形質転換の後、および好適な条件下で栽培されたとき、プロモーターは、植物体、またはその特定の組織においてＮｔＳＵＳのレベルを調節するために、発現を駆動することができる。模範的な一つの実施形態で、一つ以上の本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）を持つベクターは、植物体または植物体細胞内で遺伝子を過剰発現するために生成される。ベクターは、形質転換の上流に適切なプロモーター（カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターなど）を持ち、植物体のすべての組織内でその構成的な発現を駆動する。ベクターはまた、形質転換されたカルスおよび株細胞の選択肢を与えるために、抗生物質耐性の遺伝子を持つ。
エンハンサー、クロマチン活性化要素、転写因子対応要素、およびこれに類するものを含む発現対照配列を含むことによって、プロモーターからの配列の発現を高めることができる。このような対照配列は構成的であり、かつ転写を普遍的な方法で上方調節する場合があり、またはこれらは通性であり、かつ特異的な信号に対応して転写を上方調節する場合がある。老化に関連付けられた信号および乾燥処理手順の間に活性である信号は、特異的に示される。
したがって、様々な実施形態は、一つ以上の本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の発現レベルを、ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの複数のコピーを植物体ゲノムに組み入れることにより調節するための方法を対象とし、これは、本明細書で説明した一つ以上のＮｔＳＵＳポリヌクレオチドに作用可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを用いて植物体細胞宿主を形質転換することを含む。組み換え体ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、未変性のポリペプチドとすることも、または細胞に対して異質組織とすることもできる。
一実施形態では、本開示での使用の植物体は、そのような植物体が高い還元糖含有量（圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に乾燥質量が約１４％を超える）を有する植物体であるように熱風送管乾燥処理された植物体である。熱風送管乾燥処理された突然変異体、トランスジェニック、または非天然の植物体またはその部分は、圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約１４％未満の乾燥質量、例えば、圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約１０％未満の乾燥質量、または圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約５％未満の乾燥質量、または圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約１％未満の乾燥質量である、還元糖含有量を有することができる。
一実施形態では、本開示での使用の植物体は、そのような植物体が圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に乾燥質量が約６．８％を超える還元糖含有量を有するように日光乾燥処理された植物体である。日光乾燥処理された突然変異体、トランスジェニック、または非天然の植物体またはその部分は、圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約５％未満の乾燥質量、例えば、圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約２．５％未満の乾燥質量、または圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約１％未満の乾燥質量である、還元糖含有量を有することができる。
一実施形態では、本開示での使用の植物体は、空気乾燥処理された植物体である。そのような植物体は、圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約１．７％の乾燥質量を超える還元糖含有量を有する。日光乾燥処理された突然変異体、トランスジェニック、または非天然の植物体またはその部分は、圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約１．５％未満の乾燥質量、例えば、圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約１％未満の乾燥質量、または圃場栽培された場合、乾燥処理の終了時に約０．５％未満の乾燥質量である、還元糖含有量を有することができる。
特定の実施形態では、熱風送管乾燥処理または日光乾燥処理された植物体の使用が好ましい。遊離アミノ酸含有量の測定
アミノ酸含有量は、当該技術分野において既知の様々な方法を使用して測定され得る。１つのそのような方法は、Ｍｅｔｈｏｄ ＭＰ １４７１ ｒｅｖ ５ ２０１１，Ｒｅｓａｎａ，Ｉｔａｌｙ：Ｃｈｅｌａｂ Ｓｉｌｌｉｋｅｒ Ｓ．ｒ．ｌ，Ｍeｒｉｅｕｘ ＮｕｔｒｉＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙである。乾燥処理済みの植物葉中のアミノ酸決定のために、中央脈除去後、乾燥処理済みの葉身を必要に応じて４０℃で２～３日間乾燥させる。次いで、たばこ材料をアミノ酸含有量の分析前に微粉末（約１００ｕＭ）に粉砕する。植物材料中のアミノ酸含有量を測定する別の方法は、ＵＮＩ ＥＮ ＩＳＯ １３９０３：２００５に記載されている。特定の実施形態では、遊離アミノ酸含有量の測定は、ＵＮＩ ＥＮ ＩＳＯ １３９０３：２００５に従って実施される。
還元糖含有量の測定
Ｓｋａｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）により適応されるように、かつＴｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０：１３９－１４４（１９７６）に記載されるように、たばこ試料の分析用に開発されたセグメントフロー比色法を使用して、還元糖含有量を測定することができる。還元糖含有量の測定は、Ｃｏｒｅｓｔａ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ３８，ＣＲＭ３８，ＣＲＭ ａｎｄ ＩＳＯ １５１５４：２００３にも記載されている。乾燥処理済みの葉中の還元糖決定のために、中央脈除去後、乾燥処理済みの葉身を必要に応じて４０℃で２～３日間乾燥させる。次いで、たばこ材料を還元糖の分析前に微粉末（約１００ｕＭ）に粉砕する。特定の実施形態では、還元糖含有量の測定は、ＩＳＯ １５１５４：２００３に従って実施される。
育種
本明細書で説明した一つ以上のＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りのその任意の組み合わせ）の突然変異体対立遺伝子を持つ植物体は、有用な系統、品種、および混成体を生成するための植物体育種プログラムで使用できる。特に、突然変異体対立遺伝子は、上述した商業的に重要な品種に遺伝子移入される。こうして、本明細書で異なる遺伝的同一性を備えた植物体で説明した、突然変異体である植物体、非天然の植物体、または遺伝子組み換えの植物体の交雑を含む、植物体を育種するための方法が提供されている。方法は、さらに子孫植物体と別の植物体との交雑を含めることができ、また随意に、望ましい遺伝的形質または遺伝的背景を持つ子孫が得られるまで交雑が繰り返される。こうした育種方法が果たしている一つの目的は、望ましい遺伝的特性を他の品種、育成系統、混成体または栽培品種、特に商業的利害のあるものに導入することである。別の目的は、異なる遺伝子の遺伝的修飾を単一の植物体品種、系統、混成体または栽培品種へ積み重ねることの促進である。種内および種間の交配が意図されている。こうした交雑から発生した子孫植物体は、育種系統とも言うが、本開示の非天然の植物体の例である。
一実施形態では、非天然の植物体を生成するための方法が提供されており、（ａ）突然変異体またはトランスジェニック植物を第２の植物体と交雑して、子孫たばこ種子を得ることと、（ｂ）子孫たばこ種子を植物体栽培条件下で栽培して、非天然の植物体を得ることとを含む。方法は、（ｃ）前の世代の非天然の植物体を、それ自体または別の植物体と交雑して、子孫たばこ種子を得ることと、（ｄ）工程（ｃ）の子孫たばこ種子を、植物体栽培条件下で栽培して、追加的な非天然の植物体を得ることと、（ｅ）（ｃ）および（ｄ）の交雑および栽培工程を複数回繰り返して、非天然の植物体のさらなる世代を生成することとをさらに含み得る。この方法は、随意に、工程（ａ）の前に、特性付けられ、かつ突然変異体または遺伝子組み換えの植物体とは同一ではない遺伝的同一性を備えた親株を提供する工程を含みうる。一部の実施形態で、育種プログラムにもよるが、交雑および栽培の工程は、非天然の植物体の世代を生成するために、０～２回、０～３回、０～４回、０～５回、０～６回、０～７回、０～８回、０～９回、または０～１０回繰り返される。戻し交雑は、こうした方法の一実施例であり、ここで、親のものと近い遺伝的同一性を持つ次世代の子孫植物体を得るために、子孫はその親またはその親と遺伝的に類似した別の植物体との交雑がなされる。植物体育種、特に植物体育種の技法はよく知られており、本開示の方法で使用できる。本開示はさらに、これらの方法により生成された非天然の植物体を提供する。一定の実施形態では、植物体を選択する工程は除外される。
本明細書に記載した方法の一部の実施形態では、標準現場手続きを使用して、変異体遺伝子のための育種およびスクリーニングからもたらされた系統が現場で評価される。最初の変異誘発されていない親を含む対照遺伝子型が含められ、無作為化完全ブロックデザインまたはその他の適切な現場設計で、エントリーが現場で配列される。たばこについては、標準的な農業方法が使用され、例えば、たばこは、収穫され、秤量され、乾燥処理の前およびその途中に化学薬品やその他の一般的な試験用に標本化される。データの統計分析が実行され、選択した系統の親系統に対する類似性が確認される。選択した植物体の細胞遺伝子学的分析が随意に実施され、染色体補体および染色体対合関係が確認される。
本明細書で説明した通り、遺伝子の突然変異体対立形質を他のたばこに移動または育種するために、マーカー利用選抜（ＭＡＳ）育種プログラムで、ＤＮＡフィンガープリント法、一塩基多型ヌクレオチド多形性、マイクロサテライトマーカー、または類似した技術を使用しうる。例えば、育種家は、農業経済学的に望ましい遺伝子型を備えた突然変異体対立遺伝子を含む遺伝子型をハイブリッド形成したものから、分離母集団を作成できる。Ｆ２または戻し交雑の植物体は、ゲノム配列またはその断片から発育させたマーカーを使用して、本明細書でリストした技術のどれか一つを使用して、スクリーニングすることができる。突然変異体対立遺伝子を所有しているものとして識別された植物体は、戻し交雑または自家受粉をして、スクリーニング対象の第二の母集団を形成できる。期待される継承パターンまたは使用するＭＡＳ技術に応じて、望ましい個体植物体の識別を助けるために、戻し交雑の各サイクルの前に、選択した植物体を自家受粉することが必要なこともある。戻し交雑またはその他の育種手順は、反復親の望ましい表現型が回復されるまで繰り返すことができる。
本開示によれば、育種プログラムにおいて、奏功した交配種は稔性のＦ１植物体を産する。選択したＦ１植物体は、親のうちの一つと交配でき、最初の戻し交雑世代の植物体は自家受粉されて、変異体遺伝子発現（例えば、ヌルバージョンの遺伝子）について再びスクリーニングされる母集団が形成される。戻し交雑、自家受粉、およびスクリーニングの過程が、例えば、少なくとも４回、最終的なスクリーニングによって稔性であり、かつ反復親と合理的に類似した植物体が生成されるまで反復される。希望に応じて、この植物体は自家受粉され、その後で子孫が再びスクリーニングされて、植物体が変異体遺伝子発現を示すことが確認される。一部の実施形態で、Ｆ２世代の植物体母集団は、変異体遺伝子発現についてスクリーニングを受け、例えば、植物体は、標準方法（例えば、ＰＣＲ法）に従い、本明細書で説明したポリヌクレオチド（複数可）（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）についてのポリヌクレオチド配列情報に基づき、プライマーと共に使用して、遺伝子がないためにポリペプチドを発現しないことが識別される。
混成体たばこ品種は、第一の品種の雌性の親株（すなわち、種子親）の自家受粉を阻止して、第二の品種の雄性の親株からの花粉が雌性の親株と受粉できるようにし、Ｆ１混成体種子が雌性の植物体上に形成されるようにすることで生成できる。雌性の植物体の自家受粉は、花の発生の初期段階で花の雄しべを除去することで防止できる。別の方法として、花粉形成は、雄性不稔の形成を使用して、雌性の親株で防止することができる。例えば、雄性不稔は、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）または遺伝子組み換え雄性不稔により生成でき、ここでは、導入遺伝子が小胞子生成および／または花粉生成、または自家不和合性を阻害する。ＣＭＳを含む雌性の親株は、特に有用である。雌性の親株がＣＭＳである実施形態で、花粉が雄性の稔性植物体から収穫され、手作業でＣＭＳ雌性の親株の柱頭に適用され、結果的なＦ１種子が収穫される。
本明細書で説明した品種および系統は、単交雑たばこＦ１混成体を形成するために使用できる。こうした実施形態で、親品種の植物体は、実質的に均質な隣接した母集団として栽培でき、雄性の親株から雌性の親株への自然な他家受粉が促進される。雌性の親株に形成されたＦ１種子は、従来的な手段によって選択的に収穫される。２つの親株品種を大量に栽培して、雌性の親に形成されたＦ１混成体種子と、自家受粉の結果として雄性の親に形成された種子の混合物とを収穫することもできる。別の方法として、三原交雑を行うことができ、ここでは単交雑Ｆ１混成体が雌性の親として使用され、異なる雄性の親と交雑される。また別の方法として、二重交雑混成体を作成でき、ここでは異なる二つの単交雑のＦ１子孫自体の間で交雑される。
突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体の母集団は、望ましい特性または表現型を持つ母集団を構成するものについてスクリーニングまたは選抜をすることができる。例えば、単一の形質転換事象の子孫の母集団は、それによってコードされるポリペプチド（複数可）の望ましいレベルの発現または機能を有する植物体についてスクリーニングをすることができる。発現または活性のレベルを特定するために、物理的および生化学的な方法を使用できる。これらには、ポリヌクレオチドの検出のためのサザン分析またはＰＣＲ増幅、ＲＮＡ転写物の検出のためのノーザンブロット、Ｓ１ ＲＮａｓｅ保護、プライマー延長、またはＲＴ－ＰＣＲ増幅、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム機能を検出するための酵素学的アッセイ、ならびにポリペプチドゲル電気泳動法、ウェスタンブロット、免疫沈降、およびポリペプチドを検出するための酵素連鎖イムノアッセイが含まれる。原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリッド形成、酵素染色、および免疫染色および酵素アッセイなど、その他の技術も、ＮｔＳＵＳポリペプチドまたはＮｔＳＵＳポリヌクレオチドの存在または発現、機能または活性を検出するために使用できる。
一つ以上の組み換え体ポリヌクレオチド、一つ以上のポリヌクレオチド構築物、一つ以上の二本鎖ＲＮＡ、一つ以上の共役体または一つ以上のベクター／発現ベクターを含む、突然変異体であるか、非天然であるか、もしくは遺伝子組み換えの植物体細胞および植物体が本明細書で説明されている。
５．他の遺伝子の修飾
限定されないが、本明細書に記載される植物体およびその部分は、本開示による一つ以上のＮｔＳＵＳポリヌクレオチドおよび／またはＮｔＳＵＳポリペプチドの発現、機能または活性が調節される前または後のいずれかに修飾れ得る。
以下のさらなる遺伝的修飾のうちの１つ以上が、突然変異体、非天然、またはトランスジェニック植物体およびその部分内に存在できる。
窒素性代謝性の中間体の変換に関与する一つ以上の遺伝子が修飾され、より低いレベルの少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）をもたらすことができる。そのような遺伝子の非限定的な例としては、ＷＯ２００６／０９１１９４、ＷＯ２００８／０７０２７４、ＷＯ２００９／０６４７７１、およびＷＯ２０１１／０８８１８０に記載されるようなＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５、およびＣＹＰ８２Ｅ１０などのニコチンデメチラーゼ、ならびにＷＯ２０１６／０４６２８８に記載されるような硝酸レダクターゼをコードするものが挙げられる。
重金属の取り込みまたは重金属輸送に関与する一つ以上の遺伝子が修飾され、より低い重金属含有量をもたらすことができる。非限定的な例には、多剤耐性に関連するポリペプチドファミリー、陽イオン拡散ファシリテーター（ＣＤＦ）ファミリー、Ｚｒｔ－Ｉｒｔ様ポリペプチド（ＺＩＰ）ファミリー、陽イオン交換体（ＣＡＸ）ファミリー、銅トランスポーター（ＣＯＰＴ）ファミリー、重金属ＡＴＰａｓｅファミリー（例えば、ＨＭＡ、ＷＯ２００９／０７４３２５およびＷＯ２０１７／１２９７３９に記載のあるもの）、自然耐性に関連するマクロファージポリペプチド（ＮＲＡＭＰ）の相同体ファミリー、およびＡＴＰ－結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターファミリーの他のメンバー（例えば、ＭＲＰ、ＷＯ２０１２／０２８３０９号に記載のあるもので、重金属（カドミウムなど）の輸送に係わる）に属する遺伝子が含まれる。
他の例示的な修飾により、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現または機能が調節された植物体をもたらすことができ、これは、香味プロファイルを変化させるために使用され得るスクロースエステル組成物の変化をもたらす（ＷＯ２０１３／０２９７９９を参照）。
他の例示的な修飾により、メチオンレベルが調節され得る、トレオニンシンターゼの発現または機能が調節された植物体をもたらすことができる（ＷＯ２０１３／０２９８００を参照）。
他の例示的な修飾により、ベータ－ダマセノン含有量を調節して、香味プロファイルを変化させるために、ネオキサンチンシンターゼ、リコペンベータシクラーゼ、および９－シス－エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼのうちの一つ以上の発現または機能が調節された植物体をもたらすことができる（ＷＯ２０１３／０６４４９９を参照）。
他の例示的な修飾により、その中の硝酸塩レベルを調節するために、クロライドチャネルのＣＬＣファミリーのメンバーの発現または機能が調節された植物体をもたらすことができる（ＷＯ２０１４／０９６２８３およびＷＯ２０１５／１９７７２７を参照）。
他の例示的な修飾により、葉中のアスパラギンのレベルを調節するために一つ以上のアスパラギンシンテターゼの発現または機能が調節され、かつ葉の加熱または燃焼時に生成されるエアロゾル中のアクリルアミドのレベルが調節された植物体をもたらすことができる（ＷＯ２０１７／０４２１６２を参照）。
その他の修飾の例には除草剤耐性の調節が含まれ、例えば、グリホサートは、広分野での数多くの除草剤の有効成分である。グリホサート耐性遺伝子組み換えの植物体は、ａｒｏＡ遺伝子（ネズミチフス菌および大腸菌）．に由来するグリホサートＥＰＳＰ合成酵素）の移入により開発されたものである。スルホニル尿素耐性植物体は、アラビドプシス（シロイヌナズナ）に由来する突然変異体ＡＬＳ（アセト乳酸合成酵素）遺伝子の形質転換により作成されたものである。突然変異体Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｈｙｂｒｉｄｕｓに由来する光化学系ＩＩのＯＢポリペプチドが植物体に移入され、アトラジン耐性トランスジェニック植物体が作成され、またブロモキシニル耐性トランスジェニック植物体は、バクテリアＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するｂｘｎ遺伝子を組み入れることにより作成された。
別の模範的な修飾によって、昆虫に対する耐性のある植物体がもたらされる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）毒素は、最近ブロッコリにおいて例証されたように、Ｂｔ耐性害虫の発生を遅らせる効果的な方法を提供することができ、錐体のｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１Ｃ Ｂｔ遺伝子は、いずれかの単一ポリペプチドに対して耐性のあるコナガ（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ）を駆除し、かつ耐性昆虫の進化を有意に遅らせた。
別の模範的な修飾も、病原体（例えば、ウイルス、バクテリア、菌類）によって生じた疾患に対して抵抗性を持つ植物体をもたらした。Ｘａ２１遺伝子（細菌性胴枯れ病に対する耐性）を発現する植物体と、Ｂｔ融合遺伝子およびキチナーゼ遺伝子（イッテンオオメイガへの耐性および葉鞘への耐性）の両方を発現する植物体が作り出された。
別の模範的な修飾によって、生殖能力（雄性不稔など）が変更された。
別の模範的な修飾によって、非生物的ストレス（例えば、乾燥、温度、塩分）に対する耐性のある植物体がもたらされ、また耐性の遺伝子組み換え植物体がアラビドプシス（シロイヌナズナ）に由来するアシルグリセロールリン酸塩酵素を移入することにより作り出され、またマンニトールおよびソルビトールの合成に関与するマンニトール脱水素酵素およびソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子が、乾燥への耐性を改善する。
別の例示的な修飾は、１つ以上の内因性グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β（１，２）－キシロシルトランスフェラーゼ、およびａ（１，３）－フコシルトランスフェラーゼ）の活性が調節される植物をもたらす（ＷＯ２０１１／１１７２４９を参照）。
別の例示的な修飾は、乾燥処理中に形成されるノルニコチンおよびノルニコチンの代謝産物のレベルが調節できるように、１つ以上のニコチンＮ－デメチラーゼの活性が調節される植物体をもたらす（ＷＯ２０１５／１６９９２７を参照）。
他の例示的な修飾は、ポリペプチドおよび油の貯蔵能力が改善された植物、光合成効率が高められた植物、貯蔵寿命が延長された植物、炭水化物含有量が増加した植物、および真菌類に対して耐性のある植物をもたらすことができる。Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）および／またはシスタチオニンγ－合成酵素（ＣＧＳ）の発現が調節された遺伝子組み換えの植物体も意図されている。
ニコチン合成経路に関与する１つ以上の遺伝子を修飾して、乾燥処理された場合にニコチンのレベルが調節される植物体または植物体の部分をもたらすことができる。ニコチン合成遺伝子は、Ａ６２２、ＢＢＬａ、ＢＢＬｂ、ＪＲＥ５Ｌ１、ＪＲＥ５Ｌ２、ＭＡＴＥ１、ＭＡＴＥ２、ＭＰＯ１、ＭＰＯ２、ＭＹＣ２ａ、ＭＹＣ２ｂ、ＮＢＢ１、ｎｉｃ１、ｎｉｃ２、ＮＵＰ１、ＮＵＰ２、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、ＰＭＴ４、およびＱＰＴ、またはそれらの一つ以上の組み合わせからなる群から選択され得る。
１つ以上のアルカロイドの量の制御に関与する１つ以上の遺伝子を修飾して、調節されたレベルのアルカロイドを生成する植物体または植物体の部分をもたらすことができる。アルカロイドレベル制御遺伝子は、ＢＢＬａ、ＢＢＬｂ、ＪＲＥ５Ｌ１、ＪＲＥ５Ｌ２、ＭＡＴＥ１、ＭＡＴＥ ２、ＭＹＣ２ａ、ＭＹＣ２ｂ、ｎｉｃ１、ｎｉｃ２、ＮＵＰ１、およびＮＵＰ２、またはそれらうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択され得る。
一つ以上のこうした形質は、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体に別の栽培品種から遺伝子移入されうるか、または直接それに形質転換されうる。
様々な実施形態が、突然変異型植物、非天然型植物、またはトランスジェニック植物、ならびに本開示にしたがって１つ以上のポリヌクレオチドの発現レベルを調節することによってそれによりコードされるポリペプチド（複数可）のレベルを調節するバイオマスを提供する。
６．消費可能製品
本明細書に説明される植物体の部分、特にそのような植物体の葉身および中央脈は、様々な消費可能製品に組み込むか、またはそれらの製造に使用することができ、エアロゾル形成材料、エアロゾル形成デバイス、喫煙物品、喫煙可能物品、無煙製品、医療もしくは化粧品、静脈内投与製剤、錠剤、散剤、およびタバコ製品が挙げられるが、これらに限定されない。エアロゾル形成材料の例としては、タバコ組成物、タバコ、タバコ抽出物、刻みタバコ、刻みフィラー、乾燥処理タバコ、膨化タバコ、均質化タバコ、再構成タバコ、およびパイプタバコが挙げられる。喫煙物品および喫煙可能物品は、ある種のエアロゾル形成デバイスである。喫煙物品または喫煙可能物品の例としては、紙巻タバコ、シガリロ、および葉巻タバコが挙げられる。無煙製品の例は、噛みたばこ、および嗅ぎたばこを含む。ある特定のエアロゾル形成デバイスでは、燃焼ではなく、タバコ組成物または別のエアロゾル形成材料が、一つ以上の電気加熱素子によって加熱されて、エアロゾルを生成する。別のタイプの加熱式エアロゾル形成デバイスでは、エアロゾルは、可燃性燃料要素または熱源からの熱を、熱源の内部、周囲、または下流に位置し得る物理的に分離されたエアロゾル形成材料に伝達させることにより生成される。無煙のたばこ製品および様々なたばこを含むエアロゾル形成材料は、乾燥粒子、断片、顆粒、粉末、またはスラリーのほか、薄片、フィルム、タブ、発泡体、またはビーズなど任意の形式の他の成分への蒸着、其れへの混合、それによる包囲、または別の方法でのそれとの組み合わせを含めた、任意の形態のたばこを含みうる。本明細書で使用されるとき、「煙」という用語は、紙巻たばこなどの喫煙物品によって、またはエアロゾル形成材料を燃焼することによって生成される種類のエアロゾルを描写するために使用される。
一つの実施形態で、本明細書で説明した突然変異体、遺伝子組み換えおよび非天然の植物体に由来する乾燥処理済み植物材料も提供されている。たばこ緑葉を乾燥処理する工程は、当業者にとって公知であり、上述のように、空気乾燥処理、火力乾燥処理、熱風送管乾燥処理、および日光乾燥処理が含まれるがこれに限定はされない。
別の実施形態で、たばこを含むエアロゾル形成材料を含むたばこ製品は、本明細書で説明した突然変異体たばこ植物体、遺伝子組み換えのたばこ植物体、または非天然のたばこ植物体に由来する植物材料（葉、好ましくは乾燥処理済みの葉）を含むものとして描写されている。本明細書で説明したたばこ製品は、ブレンドしたたばこ製品とすることができ、未変性のたばこをさらに備えうる。
７．作物管理および農業のための製品および方法
突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体は、例えば、農業においてその他の用途を持ちうる。例えば、本明細書で説明した突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組み換えの植物体は、動物の飼料およびヒトの食品を製造するために使用できる。
本開示はまた、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、または遺伝子組み換えの植物体の栽培、および栽培植物体からの種子の収集を含めた、種子を生産する方法を提供する。本明細書に記載の植物体由来の種子を、当該技術分野において公知の手段によって調整し、包装材料内に袋詰めして、製造物品を形成することができる。紙および布などの包装材料は、当業界で周知である。種子のパッケージは、標識、例えば、包装材料に固定されたタグまたは標識、その中に入っている種子の性質を描写するパッケージに印刷された標識などを持つことができる。
識別、選択、または育種のために植物体の遺伝子型判別をするための組成物、方法、およびキットは、ポリヌクレオチドの試料中のＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の存在を検出する手段を含むことができる。したがって、増幅または検出を行うための、一つ以上のＮｔＳＵＳポリヌクレオチド、および任意に一つ以上のプローブ、および任意に一つ以上の試薬の少なくとも一部分を特異的に増幅するための１つ以上のプライマーを含む組成物が記載されている。
したがって、本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）に対応する約１０個以上連続するポリヌクレオチドを含む、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが開示されている。前述のプライマーまたはプローブは、本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドにハイブリッド形成（例えば、特異的にハイブリッド形成）する約１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、４５個または５０個超の連続するポリヌクレオチドを含むか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態では、プライマーまたはプローブは、遺伝子識別（例えば、サザンハイブリッド形成）または単離（例えば、細菌性コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリッド形成）、または遺伝子検出（例えば、増幅または検出における１つ以上の増幅プライマーとして）の配列依存性方法において使用し得る、約１０～５０個の連続ヌクレオチド、約１０～４０個の連続ヌクレオチド、約１０～３０個の連続ヌクレオチド、または約１５～３０個の連続ヌクレオチドを含み得るか、またはそれらからなり得る。一つ以上の特定のプライマーまたはプローブは、一部分または全部のポリヌクレオチドを増幅または検出するために設計して使用することができる。特定の例として、２つのプライマーをＰＣＲプロトコルにおいて使用して、ポリヌクレオチド断片を増幅してもよい。また、ＰＣＲは、ポリヌクレオチド配列に由来する１つのプライマーと、ポリヌクレオチド配列の上流または下流の配列（例えば、プロモーター配列、ｍＲＮＡ前駆体の３’端またはベクターに由来する配列）にハイブリッド形成する第２のプライマーとを使用しても実施し得る。ポリヌクレオチドの生体外増幅に有用な温度および等温テクニックの例は、当業界で周知である。試料は、植物体、植物体細胞または植物材料、または本明細書で説明した植物体、植物体細胞または植物材料から製造されたか、もしくはそれに由来するたばこ製品としうるか、またはそれらに由来するものとしうる。
さらなる態様で、試料中に含まれる本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）を検出する方法も提供されており、その方法は、（ａ）ポリヌクレオチドを含むか、またはそれを含むとみられている試料を提供する工程と、（ｂ）ＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）の少なくとも一部分を特異的に検出するために、前述の試料を一つ以上のプライマーまたは一つ以上のプローブと接触させる工程と、（ｃ）増幅生成物の存在を検出する工程であって、増幅生成物の存在は、試料中のＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）の存在を示すものである、工程とを含む。さらなる態様では、ＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）の少なくとも一部分を特異的に検出するための１つ以上のプライマーまたはプローブの使用も提供される。ＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）の少なくとも一部分を検出するためのキットも提供されており、これは、ＮｔＳＵＳポリヌクレオチド（複数可）の少なくとも一部分を特異的に検出するための一つ以上のプライマーまたはプローブを備える。キットは、ポリヌクレオチド増幅（ＰＣＲなど）のための試薬、またはプローブハイブリッド形成－検出技術（サザンブロット、ノーザンブロット、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリッド形成、またはマイクロアレイなど）のための試薬を備えうる。キットは、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＬＤＩ質量分析法または試験片などの抗体結合検出技術のための試薬を備えうる。キットは、ＤＮＡ配列決定のための試薬を備えうる。キットは、試薬およびキットを使用するための説明書を含み得る。
一部の実施形態で、キットは、説明した一つ以上の方法についての説明書を備えうる。説明したキットは、遺伝的同一性の決定、系統学的研究、遺伝子型判別、ハプロタイプ、系図分析または植物体育種用に、特に共優性評価で有用なものでありうる。
本開示は、本明細書で説明したＮｔＳＵＳポリヌクレオチドを含む植物体、植物体細胞、または植物材料の遺伝子型判別をする方法も提供する。遺伝子型判別は、染色体対の相同体を区別する手段を提供するもので、植物体母集団内の分離個体を差別化するために使用できる。分子マーカー法は、系統学的研究、作物品種間の遺伝的関係の特徴付け、交雑種または体細胞混成体の識別、単一遺伝形質に影響する染色体のセグメントの局所化、マップベースのクローン化、および定量的継承の研究のために使用できる。遺伝子型判別の具体的な方法では、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）を含む、任意の数の分子マーカー分析テクニックを採用しうる。ＡＦＬＰは、ポリヌクレオチドの可変性に起因する増幅断片間の対立遺伝子の差異の産物である。したがって、本開示は、一つ以上の遺伝子またはポリヌクレオチド、ならびにこれらの遺伝子またはポリヌクレオチドに遺伝的に関連した染色体配列の分離を、ＡＦＬＰ分析などの技法を使用して追跡する手段をさらに提供する。
本発明について、下記の例でさらに説明するが、これらの例では発明をさらに詳細に説明している。これらの例は、本発明を実施するために現時点で意図されている好ましい様式を規定したもので、本発明を例証するものであって、限定するものではない。
実施例１：バーレー、バージニア、およびオリエントタバコ葉における乾燥処理後の主要スクロース代謝遺伝子の特定
バーレー、バージニア、およびオリエントタバコ葉の早期乾燥処理時間中のスクロース代謝に寄与する主要機能を特定するために、収穫時の成熟葉と比較した、４８時間の乾燥処理後の乾燥処理済みの葉における上方制御された遺伝子の機能についての過剰出現分析（ｌｏｇ２倍変化＞２、調整ｐ値＜０．０５）を、バーレー、バージニア、およびオリエントタバコにおいて実施する。乾燥処理の種類およびたばこの品種とは無関係に、４８時間の乾燥処理後に活性である還元糖の産生に関与する遺伝子を特定する。還元糖の産生に関与するたばこ遺伝子が特定される。
葉中の早期乾燥処理中の還元糖の産生に直接関与する主要遺伝子は、ＳＵＳの遺伝子ファミリーに属する。ＳＵＳは、乾燥処理済みの分離した葉における還元糖の蓄積を促進するための主要酵素である可能性が高い。
たばこゲノムは、各祖先からの１つのＳおよび１つのＴコピーを有する６つのファミリーに分配された１２個のＮｔＳＵＳ遺伝子産物を有することが分かっている：ＮｔＳＵＳ１－Ｓ（配列番号１）、ＮｔＳＵＳ１－Ｔ（配列番号３）、ＮｔＳＵＳ２－Ｓ（配列番号５）、ＮｔＳＵＳ２－Ｔ（配列番号７）、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ（配列番号９）、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ（配列番号１１）、ＮｔＳＵＳ４－Ｓ（配列番号１３）、ＮｔＳＵＳ４－Ｔ（配列番号１５）、ＮｔＳＵＳ５－Ｓ（配列番号１７）、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ（配列番号１９）、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ（配列番号２１）、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔ（配列番号：２３）。
ＳＵＳ転写産物は、ゲノム配列ＮｔＳＵＳ２－Ｓ（配列番号５）、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ（配列番号９）、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ（配列番号１１）、およびＮｔＳＵＳ４－Ｓ（配列番号１３）に由来する。これらの遺伝子は、表１に示されるように葉の乾燥処理（老化）中に上方制御される。これは、Ｓコピーが早期乾燥処理済みの葉の化学修飾、この特定の場合において、グルコースおよびフルクトースの増加に特に関与していることを確認する。
バージニアおよびオリエンタルと比較して、バーレーの乾燥処理済みの葉において低量の還元糖レベルが見られるが（図１を参照）、ＮｔＳＵＳ遺伝子は、それにもかかわらずバーレーにおいて活性化され（表１を参照）、構造的応答としても可能性が高く、早期乾燥処理段階中にアミノ酸合成のための利用可能な炭素源を確実にする。
バーレー（ＢＵ）およびバージニア（ＦＣ）の両方で、早期乾燥処理中に発現しないＮｔＳＵＳ１－ＳおよびＮｔＳＵＳ１－Ｔ（表１を参照）は、根および茎で特に発現し、細胞壁合成のために炭水化物を送達するため、または無酸素下で炭素源を供給するための、これらの組織における考えられる特定の機能を示す。一方、早期葉乾燥処理中に誘発されるＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、ＮｔＳＵＳ４－Ｓは全ての器官でも発現するが、ＮｔＳＵＳ２－ＳおよびＮｔＳＵＳ２－Ｔは、主に未熟な花および花弁で発現する。ＮｔＳＵＳ５－Ｓ、ＮｔＳＵＳ５－Ｔ、ＮｔＳＵＳ６－Ｓ、およびＮｔＳＵＳ６－Ｔは、全ての分析された植物体組織において低レベルで発現する（表２を参照）。
乾燥処理済みの葉中の還元糖のプールを増加させるために、ＳＡＧ１２またはＥ４などの老化誘導性プロモーターを使用したＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、および／またはＮｔＳＵＳ４－Ｓの過剰発現が考慮され得る（構成的プロモーターの使用は植物代謝を強く変化させ得る）。一方、ノックアウトＮｔＳＵＳ２－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｓ、ＮｔＳＵＳ３－Ｔ、および／またはＮｔＳＵＳ４－Ｓは、乾燥処理済みの葉中の還元糖の含有量の減少に寄与し得る。
実施例２－バージニアタバコ葉におけるＮｔＳＵＳ発現のサイレンシング
バーレータバコにおけるＮｔＳＵＳのサイレンシングを調査して、これら遺伝子が乾燥処理済みのバージニアタバコ葉中の還元糖含有量の減少に寄与するかどうかを判断する。両方のＮｔＳＵＳのコード配列内の特定のＤＮＡ断片を、ゲートウェイベクター中の強力な構成的ミラビリスモザイクウイルス（ＭＭＶ）プロモーターでクローン化する。ＮｔＳＵＳ遺伝子断片は、ＭＭＶとＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリン合成酵素遺伝子の３’ｎｏｓ末端配列との間に隣接している。
低還元糖含有量の植物体の選択を可能にするために、６０時間の乾燥処理の後、独立したＴ０植物葉およびそれぞれの対照系統を分析して、還元糖含有量の減少に対する影響を決定する。還元糖の最も低いレベルを示す最良のＴ０系統を選択する。種子を、これらの最良のＴ０系統から収穫する。Ｔ１子孫をｑＰＣＲによって分析して、還元糖含有量の減少との関連でのＮｔＳＵＳサイレンシング事象の効率を決定する。
ＮｔＳＵＳ遺伝子の操作（例えば、構成的プロモーターまたは特定の老化プロモーター（ＳＡＧ１２またはＥ４など）のいずれかを使用）は、たばこの乾燥処理済みの葉の化学を変化させ得る。同様に、遺伝子編集戦略（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓまたは突然変異体選択）を使用するノックアウトＮｔＳＵＳ遺伝子は、商業用たばこの主要品種のアミノ酸葉の化学的性質を変化させ得る。
本明細書に引用または記載されるあらゆる刊行物は、本出願の出願日以前に開示された関連情報を提供する。本明細書における記述は、本発明者らがそのような開示に先だって権利を与えられないことの承認としては解釈されないものとする。上記の明細書で言及したすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の様々な修正および変形が、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、当業者に明らかになるであろう。特定の好ましい実施形態に関連付けて本発明を説明してきたが、特許請求する通りの本発明は、こうした特定の実施形態に不当に限定されるべきではない。実際に、本発明を実施するための記述された方法について、細胞生物学、分子生物学および植物体生物学の分野または関連する分野の当業者にとって明らかである様々な改良は、以下の特許請求の範囲の範囲内に収まるものであることが意図される。
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配列リスト
配列番号１：ＮｔＳＵＳ１－Ｓのポリヌクレオチド配列
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配列番号２：ＮｔＳＵＳ１－Ｓのポリペプチド配列
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配列番号３：ＮｔＳＵＳ１－Ｔのポリヌクレオチド配列
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配列番号４：ＮｔＳＵＳ１－Ｔのポリペプチド配列
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配列番号５：ＮｔＳＵＳ２－２のポリヌクレオチド配列
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配列番号６：ＮｔＳＵＳ２－２のポリペプチド配列
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配列番号７：ＮｔＳＵＳ２－Ｔのポリヌクレオチド配列
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配列番号８：ＮｔＳＵＳ２－Ｔのポリペプチド配列
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配列番号９：ＮｔＳＵＳ３－Ｓのポリヌクレオチド配列
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配列番号１０：ＮｔＳＵＳ３－Ｓのポリペプチド配列
MANPKFTRVPSMRERVEDTLSAHRNQLVALLSRYVAQGKGILQPHHLIDEFNNAVCDDTACEKLKDGPFSEVLKATQEAIVLPPFVAIAVRPRPGVWEYVRVNVYDLSVEQLTVPEYLHFKEELVDGEGNNHFVLELDFEPFNASVPRPSRSSSIGNGVQFLNRHLSSIMFRSKDSLDPLLDFLRGHCHKGNVLMLNDRIQRISRLESALSKAEDYLSKLSPDTSYNEFEYALQEMGFERGWGDTARRVLETMHLLSDILQAPDPSTLETFLGRLPMVFNVVILSPHGYFGQANVLGLPDTGGQVVYILDQVRALEAEMLLRIKQQGLNFKPRILVVTRLIPDAKGTMCNQRLERISGTEYSHILRVPFRTEKGILHKWISRFDVWPYLEKFTEDVASEMTAELQGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAYKMGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKFEEKYHFSCQFTADLLAMNNSDFIITSTYQEIAGTKNTVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMTIYFPYSDKEKRLTSLHGSIEKLLFDPAQNEEHIGNLNDKSKPIIFSMARLDHVKNITGLVECYAKNATLRELANLVVVAGYNDVKKSSDREEITEIEKMHALIKEHKLDGQFRWVSAQTNRARNGELYRYIADQRGIFVQPAFYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCHGGPNEIIEPGVSGFHIDPYHPDKAAELMSEFFQRCKQDPTHWEKISASGLRRILERYTWKIYSERLMTLSGVYGFWKLVSKLERRETRRYLEMFYILKFRELAKSVPLAIDDK
配列番号１１：ＮｔＳＵＳ３－Ｔのポリヌクレオチド配列
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配列番号１２：ＮｔＳＵＳ３－Ｔのポリペプチド配列
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配列番号１３：ＮｔＳＵＳ４－Ｓのポリヌクレオチド配列
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配列番号１４：ＮｔＳＵＳ４－Ｓのポリペプチド配列
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配列番号１５：ＮｔＳＵＳ４－Ｔのポリヌクレオチド配列
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配列番号１６：ＮｔＳＵＳ４－Ｔのポリペプチド配列
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配列番号１７：ＮｔＳＵＳ５－Ｓのポリヌクレオチド配列
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配列番号１８：ＮｔＳＵＳ５－Ｓのポリペプチド配列
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配列番号１９：ＮｔＳＵＳ５－Ｔのポリヌクレオチド配列
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配列番号２０：ＮｔＳＵＳ５－Ｔのポリペプチド配列
MASTVAGSMPDALKQSRYHMKRCFARFIAMGRRLMKLKHLTEEIEKTIEDKAERTKILEGSLGKIMSSTQEAAVVPPYVAFAVRHNPGFWDYVKVDAETLSVEAISARDYLKFKEMIFDEDWAKDENALEVDFGAFDYSNHRLALSSSVGNGLNFISKVLSSKFGGKAEDAQPLLDYLLALNHQGENLMINENLNGVSKLQAALIVAEVFVSSFPKDTPYKDFEHKLKEWGFEKGWGHNAGRVRETMRLLSEIIQAPDPINMESFFSRLPTTFNIVIFSIHGYFGQADVLGLPDTGGQVVYILDQVRALEEEMLQRIKQQGLNVKPKILVVTRLIPDARGTTCNQEMEPILNSSHSHILRIPFRTEKGVLRQWDASAKILELMEGKPDLIIGNYTDGNLVASLLANKLGVTQGTIAHALEKTKYEDSDVKWKQFDSKYHFSCQFTADLLAMNAADFIITSTYQEIAGSETRPGQYESHTAFTMPGLYRAVSGINVFDPKFNIAAPGAEQSAYFPFTEKQKRFSAFRPAIEELLYSNEQNNEHIGFLADRKKPIIFSMARFDTVKNLSGLTEWYGKNKKLRNLVNLVIVGGFFDPSKSKDREEAAEIKKMHELIEKYKLKGQMRWIAAQTDKYQNSELYRTIADTKGAFVQPALYEAFGLTVIEAMNCGLPTFATNQGGPAEIIVDGVSGFHIDPYNGDESSKKIADFFEKCKVDSKYWNKICGGGLKRIEEW
配列番号２１：ＮｔＳＵＳ６－Ｓのポリヌクレオチド配列
atggctactgcaccagccctaaatagatcagagtccatagctgatagcatgccagaggccttaaggcaaagccggtaccacatgaagaaatgttttgccaagtacatagagcaaggaaagaggatgatgaaacttcataacttgatggatgagttggagaaagtaattgatgatcctgctgaaaggaaccatgttttggaaggcttacttggctacatattatgcactacaatggtatagctagattcatatgtacttatgatgcccttatattgtttcctgatgtattactcttaaaaccttctttgatcaaatttacaggaggctgcagttgttcctccctacattgcctttgccacgagacagaatcctggattctgggaatatgtgaaagtgaatgctaatgatctttctgttgagggtattacagctacagaatacttgaaattcaaggaaatgatagttgatgaatgctggtatagtatacgttgcagcttatcataccttttgtggttttataacttcaatcagaaaactcatcagagttacctttgtgtgaacatgaaatgcagggcaaaagatgaatatgcactggaaattgattttggagcagtagacttctcaacgcctcgactgaccctatcctcttcaattggcaatggtctcagttatgtttccaagtttctaacttcaaagctaaatgctacctccgcgagtgcacagtgtctggttgactacttgctcactttgaatcatcaaggagatgtacgtcaacaaaaatcaaactccataagtaaacttgtcaactctaagaagaaaaaataggaaaagaagattcacgtaacaaattttctttatgttcaactgcagaaactgatgatcaatgagacactcagcactgtctcaaagcttcaggctgcactggttgtagcagaagcatctatttcctctttaccaacagatacaccatatgagagctttgagctaaggtgatttgttttttcctctacttccctccacttgtgccatgctacgtagtactaagtaacttcaattcttgtaaagattcaaacagtggggttttgagaaaggatggggtgatacagctgaaagggtcagcgacaccatgagaacactgtctgaggtgcttcaggcaccagatccattgaacattcagaagttctttggaagggttccaactgttttcaatattgtattgttctctgtccatggatactttggccaagcagatgttcttggcttgccagacactggtggtcaggtaagcatttaatagcttttacatttaacttctatgcattgacaataaaataatttttaacagtttgaccacttctgctcttgttcaacaggtagtttatgttttggatcaagttgtagcttttgaagaagaaatgctacaaagaattaaacagcaggggctcaatattaagcctcaaattcttgtggtgagttcctagacaatcgacgtgactatgcaattatgtagaggctgtttagaaaagttaatatcatatgttgattgcacagttaacccgactgattccggatgcaaaaggaacaaagtgcaaccaggaactagaaccaatcaagaatacaaaacattcacacatcctcagagttccatttaggacagaaaaaggagtgcttaatcaatgggtttcacgatttgatatctatccatatctggagagatatactcaggtatgtatttttatatcaaccttgctcatcaaagatgtgttgtttcctcaattccatttttccccttggcaaaaggatgctgctgacaaaatcgtcgagctaatggaaggcaaacctgatctaatcattggtaactacactgatgggaatctagtggcttcactaatggctagaaaacttgggataactctggtaacttttcttaatcatatttgatgttgcttcttctccaagttagttcttaatctccactgacctagaccatctttgcaacagggaactattgctcatgctttggagaagacaaaatatgaagactctgacataaaattgaaggaactcgatccgaagtaccacttctcttgccaattcacagctgatttgattgcaatgaattcagcagatttcattatcactagcacataccaagaaatagctggaaggtaagaattagagctaataagtaatgcattcatatgtatttcagcatcgctctttcaccatcatcgaatacacaccactactcagtaaatgtatttgctcaaaagtttgcaacttaatggatctcattcttgaatgcttcaacatatgcagcaaagataaaccaggacagtatgagagccatagtgcatttacccttccagggctttacagagttgcttcaggtatcaatgtctttgatccaaaatttaatattgctgcacctggggcagaccagtcggtgtatttcccttacacagaaaagcagaagcgtttgactgctttccgccctgccattgaggaactgctttttagtaaagtggacaatgacgagcacgtgtaagtctaagtgttaaacttcagcttagtgcctagaacatcccactgctctatgtattgatgtttcacttgtttcaaacagtggatatttagaagacagaaagaaacctatcctgtttaccatggcaaggctggacacagtgaagaacacatctggactaacagaatggtatggcaagaacaagaggctcagaagcttagttaaccttgttgtggttggtggttcctttgatcctacaaaatccaaggatagggaagaagcagctgaaataaaaaagatgcacatgctgatagagaaataccagcttaagggtcagattagatggatagcagctcagactgacagatacagaaatagtgaactctaccgcacaatagcagattccaaaggagcttttgtgcagcctgcattgtatgaagcatttggtctaacagtcattgaggcaatgaactgtggattaccaacctttgctaccaaccaaggtggccctgctgagattattgttgatggggtctcaggctttcatattgatccaaataatggggatgaatcaagcaacaaaattgccaactttttccaaaaatgcagggaggatcctgagtattggaacaggatttcagtccagggtctaaaccgtatatatgaatggtaactcacagataagccattcaaattgcaaagaggcacatatcttgcagaaaatttcttaatccttaaatcctaattttttgcagttacacatggaagatctatgcaaacaaggtattgaatatggggtccatctatactttttggaggacattgtacagagatcagaaacaagcaaagcaaagatacatcgagactttctacaatcttgagtttaggaacttggtatagtgctgcatgacattgacagtataccacaaacatctttatgagatgaattacttttaataaaattgtttttaacctttgcttccttaatggcacttattgcaggtaaaaaatgtgcctatcagaaaggacgaaacaccacaaggaccaaaggagagggagaaagttaagccacagatatcacaaaggcatgctctaaagcttttgcctacagtttttcaagagaccctagtatattctagtactaaattagaattatacagcatgcagcttttgctgttcacctttctaaatcaccagttgtgtcaatcaagttgacaaaatcaataaattgggattttccctttcctatgcttgattgttattactcctactttgtttatggtagtcttccttcattgttttctcctgtacttcttttactacaactgtactgacatactaattatttctgtgtaccaggcgctcacaatcaaggttgcagaagtaagattagataaaattgctactgcatga
配列番号２２：ＮｔＳＵＳ６－Ｓのポリペプチド配列
MATAPALNRSESIADSMPEALRQSRYHMKKCFAKYIEQGKRMMKLHNLMDELEKVIDDPAERNHVLEGLLGYILCTTMEAAVVPPYIAFATRQNPGFWEYVKVNANDLSVEGITATEYLKFKEMIVDECWAKDEYALEIDFGAVDFSTPRLTLSSSIGNGLSYVSKFLTSKLNATSASAQCLVDYLLTLNHQGDKLMINETLSTVSKLQAALVVAEASISSLPTDTPYESFELRFKQWGFEKGWGDTAERVSDTMRTLSEVLQAPDPLNIQKFFGRVPTVFNIVLFSVHGYFGQADVLGLPDTGGQVVYVLDQVVAFEEEMLQRIKQQGLNIKPQILVLTRLIPDAKGTKCNQELEPIKNTKHSHILRVPFRTEKGVLNQWVSRFDIYPYLERYTQDAADKIVELMEGKPDLIIGNYTDGNLVASLMARKLGITLGTIAHALEKTKYEDSDIKLKELDPKYHFSCQFTADLIAMNSADFIITSTYQEIAGSKDKPGQYESHSAFTLPGLYRVASGINVFDPKFNIAAPGADQSVYFPYTEKQKRLTAFRPAIEELLFSKVDNDEHVGYLEDRKKPILFTMARLDTVKNTSGLTEWYGKNKRLRSLVNLVVVGGSFDPTKSKDREEAAEIKKMHMLIEKYQLKGQIRWIAAQTDRYRNSELYRTIADSKGAFVQPALYEAFGLTVIEAMNCGLPTFATNQGGPAEIIVDGVSGFHIDPNNGDESSNKIANFFQKCREDPEYWNRISVQGLNRIYECYTWKIYANKVLNMGSIYTFWRTLYRDQKQAKQRYIETFYNLEFRNLVKNVPIRKDETPQGPKEREKVKPQISQRHALKLLPTVFQETLALTIKVAEVRLDKIATA
配列番号２３：ＮｔＳＵＳ６－Ｔのポリヌクレオチド配列
atggctactgcaccagccctgaaaagatcagagtccatagctgatagcatgccagaggccttaaggcaaagccggtaccacatgaagaaatgttttgccaagtacatagagcaaggcaagaggatgatgaaacttcataacttgatggatgaattggagaaagtaattgatgatcctgctgaaaggaaccatgttttggaaggcttacttggctacatattatgtactacaatggtatagctagattcatatgtacttatgatgtccttatattgtttccggaggcattattcttaaatccttctttgatcaaatttgtaggaggctgcagttgttcctccctatattgccttcgccacgagacagaatcctggattctgggaatatgtgaaagtcaatgctaatgatctttctgttgagggtattacagctacagattacttgaaattcaaggaaatgatagttgatgaaagctggtatagaatactttgcagcttatcataccttttgtggttttataatttcaatcagaaaactcatcagagttacctttgtgtgaacatgacatgcagggcaaaagatgaatatgcactggaaattgattttggagcagtagacttctcaacgcctcgactgaccctatcctcttcaattggaaatggtctcagttatgtttccaagtttctaacttcaaagctaaatgctacctcagcgagtgcacagtgtctggttgactacttgctcactttgaatcaccaaggagatgtacgtcaacaaaaatcaaactccataagtaaacttgtcaactctaagaagtaaaaataggaaaagaagattcatgtaacaaattttctttatgttcaactgtagaaactgatgatcaatgagacactcggcactgtctcaaagcttcaggctgcactggttgtagcagaagcatctatttcctccttaccaacagatacaccataccagagctttgagctaaggtgatttgttttttcctctacttccttccacttttggtgtgctacatagtactaagtaacttcaattcttgtaaagattcaaacagtggggttttgagaaaggatggggtgatacagctgaaagggtccgcgacaccatgagaacactttctgaggtacttcaggcgccagatccattgaacattgagaagttctttgggagggttccaactgttttcaatattgtattgttctctgttcatggatactttggccaagcaaatgttcttggcttgccagacacaggtggtcaggtaagcatctaatagcttttacatttaacttctatgcattgacaataaaataacttctacactaccaaataatttttgaaagtttgaccacttcggctcttgttcaacaggtggtttatgttttggatcaagttgtagcttttgaagaagaaatgctccaaagaattaaacagcaggggctcaatattaagcctcaaattcttgtggtgagctcctagacaatgacgtgactatgcaattaagtagaggctgtttagaaaagttaatatcatatgttgattgcacagttaacccgactgattccggacgccaaaggaacaaagtgcaaccaggaactagaaccaatcaagaatacaaaacattcacacatcctcagagttccatttaggacagaaaaaggagtgcttaatcaatgggtttcacgatttgatatctatccatatctggagagatatactcaggtgtgtatttttatatcaaccctgctcatcaaagatgtgttgtttcctcaattccatttttcgccttgacaaaaggacgctgctgacaaaatcatcgagctaatggaaggcaaacctgatctaatcattggtaactacactgatgggaatctagtggcttctctaatggctagaaagcttgggataactctggtaacttttcttatcatatttgatgttgtttcttctccaagttggttcttaatgtcaactaacccagaccatctttgtaacagggaactattgctcatgctctggagaagacaaaatatgaagactctgacatcaaattgaaggaactcgatccgaagtaccacttttcttgccaattcacagctgatttgattgcaatgaattcagcagatttcattatcacaagcacatatcaagaaatagccggaaggtaagaattggaactacggaagcagagagctaataagtagtgcactcatatatttcagcatcgctctttcgcataatcgaatacacaccactactcagtaaatgtacttgctcaaaagtttacaagtttatggatcttattcttgaatgcttcaacatatgcagcaaagataggccaggacagtatgagagccatagtgcatttacccttccagggctttacagagttgcttcaggcatcaatgtctttgatcctaaatttaatattgctgcacctggggcagaccaatcggtgtatttcccttacacagaaaagcagacgcgtttgactgctttccgccctgccattgaggaactgctttttagtaaagtggacaatgacgagcacatgtaagtcttagtgttaaacttcagctttcagcttagtgcctagaacattccactggctctatgtattaatgtttcacttgtttcaaacacagtggatatttagaagacagaaagaaacctatcctgtttaccatggcaaggctggacacagtgaagaacacatctggactaacagaatggtatggcaagaacaagaggctcagaagcttagttaaccttgttgtggttggtggttcctttgatcctacaaaatccaaggatagagaagaagcagctgaaataaaaaagatgcacatgctgatagagaaataccagcttaagggtcagatcagatggatagcagctcagactgacagatatagaaacagtgaactctaccgcacaatagcagattccaaaggagcttttgtgcagcctgcattatatgaagcatttggtctaacagtcattgaggcaatgaactgtggattaccaacctttgctaccaaccaaggtggccctgctgagattattgttgatggggtctcaggctttcatattgatccaaataatggggatgaatcaagcaacaaagttgccaactttttccaaaaatgcagggaggatcctgagtattggaacaggatttcagtccagggtctaaaccgtatatatgaatggtaactcacagataagccattcaaattgcaaagaggcacatatcttgctgaaaatttcttaatcctttaatcctaaaattttgcagttacacatggaagatctatgcaaacaaggtattgaatatggggtccatctatactttttggaggacattgtacagagatcagaaacaagcaaagcaaagatacatcgagactttctacaatcttgagtttaggaacttggtatagtgctgcatgacattgacagtataccacaaacatctttatgagatgaattacttttaataaaattgtttttaacctttgcctccttaatgacacttattgcaggtaaaaaatgtgcctatcagacaggacgaaacaccacaaggaccaaaggagaggagggagaaagttaagccacagatatcacaaaggcatgctctaaagcttttgcctatagtttttcaggagaccctagtatattctagtactaaattagaattatacagcatgcagcttgcttctgctgttcacctttctaaatcaccagttatgtcaatcaagttgacaaaatcaataaattcggcttttccctttcctatgcttgattgttattactcctacttcgtttatggtagtcttccttcattgttttctcctgtacttcttttactacaactgtactga
配列番号２４：ＮｔＳＵＳ６－Ｔのポリペプチド配列
MATAPALKRSESIADSMPEALRQSRYHMKKCFAKYIEQGKRMMKLHNLMDELEKVIDDPAERNHVLEGLLGYILCTTMEAAVVPPYIAFATRQNPGFWEYVKVNANDLSVEGITATDYLKFKEMIVDESWAKDEYALEIDFGAVDFSTPRLTLSSSIGNGLSYVSKFLTSKLNATSASAQCLVDYLLTLNHQGDKLMINETLGTVSKLQAALVVAEASISSLPTDTPYQSFELRFKQWGFEKGWGDTAERVRDTMRTLSEVLQAPDPLNIEKFFGRVPTVFNIVLFSVHGYFGQANVLGLPDTGGQVVYVLDQVVAFEEEMLQRIKQQGLNIKPQILVLTRLIPDAKGTKCNQELEPIKNTKHSHILRVPFRTEKGVLNQWVSRFDIYPYLERYTQDAADKIIELMEGKPDLIIGNYTDGNLVASLMARKLGITLGTIAHALEKTKYEDSDIKLKELDPKYHFSCQFTADLIAMNSADFIITSTYQEIAGSKDRPGQYESHSAFTLPGLYRVASGINVFDPKFNIAAPGADQSVYFPYTEKQTRLTAFRPAIEELLFSKVDNDEHIGYLEDRKKPILFTMARLDTVKNTSGLTEWYGKNKRLRSLVNLVVVGGSFDPTKSKDREEAAEIKKMHMLIEKYQLKGQIRWIAAQTDRYRNSELYRTIADSKGAFVQPALYEAFGLTVIEAMNCGLPTFATNQGGPAEIIVDGVSGFHIDPNNGDESSNKVANFFQKCREDPEYWNRISVQGLNRIYECYTWKIYANKVLNMGSIYTFWRTLYRDQKQAKQRYIETFYNLEFRNLVKNVPIRQDETPQGPKERREKVKPQISQRHALKLLPIVFQETLVYSSTKLELYSMQLASAVHLSKSPVMSIKLTKSINSAFPFPMLDCYYSYFVYGSLPSLFSPVLLLLQLY
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕植物体細胞であって、
（ｉ）配列番号１、もしくは配列番号３、もしくは配列番号９、もしくは配列番号１１、もしくは配列番号１７、もしくは配列番号１９、もしくは配列番号２１、もしくは配列番号２３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるポリヌクレオチド、または配列番号５、もしくは配列番号７、もしくは配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるポリヌクレオチド、
（ｉｉ）（ｉ）に記載した前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号２に対して少なくとも９４％の配列同一性、もしくは配列番号４に対して少なくとも９３％の配列同一性、もしくは配列番号６に対して少なくとも９５％の配列同一性、もしくは配列番号８に対して少なくとも９６％の配列同一性、もしくは配列番号１０もしくは配列番号１２に対して少なくとも９３％の配列同一性、もしくは配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性、もしくは配列番号１６に対して少なくとも９６％の配列同一性、もしくは配列番号１８に対して少なくとも８９％の配列同一性、もしくは配列番号２０に対して少なくとも９２％の配列同一性、もしくは配列番号２２に対して少なくとも９３％の配列同一性、もしくは配列番号２４に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチド、あるいは
（ｉｖ）（ｉ）に記載した前記単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクターを含み、
前記植物体細胞が、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの前記発現または活性が修飾されていない対照植物体細胞と比較して、前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドの前記発現または活性を調節する少なくとも１つの修飾を含む、植物体細胞。
〔２〕前記植物体細胞が、配列番号５もしくは配列番号１３に対して少なくとも８０％の配列同一性、または配列番号９もしくは配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含むか、あるいは
前記植物体細胞が、配列番号６に対して少なくとも９５％の配列同一性、または配列番号１０もしくは配列番号１２に対して少なくとも９３％の配列同一性、または配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリペプチドを含む、〔１〕に記載の植物体細胞。
〔３〕前記少なくとも１つの修飾が、前記植物体細胞のゲノムの修飾、または前記構築物、ベクター、もしくは発現ベクターの修飾、またはトランスジェニック修飾であり、好ましくは
前記植物体細胞のゲノムの前記修飾、または前記構築物、ベクター、もしくは発現ベクターの前記修飾が、突然変異または編集である、〔１〕または〔２〕に記載の植物体細胞。
〔４〕前記修飾が、前記対照植物体細胞と比較して、前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドの前記発現または活性を増加または減少させ、好ましくは、
前記植物体細胞が、前記〔１〕（ｉ）に記載の前記ポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡの少なくとも１９ヌクレオチドに対して少なくとも８０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを含む、前記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の植物体細胞。
〔５〕前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドの前記調節された発現または活性が、対照植物体由来の葉における還元糖のレベルと比較して、前記植物体細胞由来の葉における還元糖のレベルを調節し、好適には、前記還元糖が、グルコースもしくはフルクトースであるか、または好適には、前記葉が、早期乾燥処理済みの葉もしくは乾燥処理済みの葉である、前記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の植物体細胞。
〔６〕前記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の植物体細胞を含む、植物体またはその一部。
〔７〕前記〔６〕に記載の植物体またはその一部由来の植物材料、乾燥処理済みの植物材料、または均質化した植物材料であり、好ましくは、
前記材料が、前記〔６〕に記載の前記植物体もしくはその一部からのバイオマス、種子、茎、花、もしくは葉を含み、かつ／または
前記乾燥処理済みの植物材料が、熱風送管乾燥処理、日光乾燥処理、または空気乾燥処理済みの植物材料である、植物材料。
〔８〕前記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の植物体細胞、前記〔６〕に記載の植物体の一部、または前記〔７〕に記載の植物材料を含む、たばこ製品。
〔９〕前記〔６〕に記載の植物体を生成するための方法であって、
（ａ）配列番号１、もしくは配列番号３、もしくは配列番号９、もしくは配列番号１１、もしくは配列番号１７、もしくは配列番号１９、もしくは配列番号２１、もしくは配列番号２３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するか、または配列番号５、もしくは配列番号７、もしくは配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含む、植物体細胞を提供する工程と、
（ｂ）対照植物体細胞と比較して前記ポリヌクレオチドの前記発現を調節するために、前記植物体細胞を修飾する工程と、
（ｃ）前記植物体細胞を植物体に増殖させる工程と、を含む、方法。
〔１０〕工程（ｃ）が、前記植物体細胞を含む挿し木または苗木から前記植物体を栽培することを含み、かつ／または
前記植物体細胞を修飾する前記工程が、ゲノム編集またはゲノム工学によって前記細胞の前記ゲノムを修飾することを含み、好ましくは、
前記ゲノム編集またはゲノム工学が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発、化学的突然変異誘発または放射線突然変異誘発、相同的組み換え、オリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発、およびメガヌクレアーゼ媒介突然変異誘発から選択される、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記植物体細胞を修飾する前記工程が、構成的プロモーターに作用可能に連結された、配列番号１、もしくは配列番号３、もしくは配列番号９、もしくは配列番号１１、もしくは配列番号１７、もしくは配列番号１９、もしくは配列番号２１、もしくは配列番号２３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するか、または配列番号５、もしくは配列番号７、もしくは配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含む構築物で、前記細胞をトランスフェクトすることを含み、かつ／あるいは
前記植物体細胞を修飾する前記工程が、前記〔１〕（ｉ）に記載の前記ポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡに対して少なくとも８０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを、前記細胞に導入することを含み、好ましくは、
前記植物体細胞が、前記〔１〕（ｉ）に記載の前記ポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡの少なくとも１９ヌクレオチドに対して少なくとも８０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを発現させる構築物でトランスフェクトされる、前記〔９〕または〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕対照植物材料と比較して変化した量の還元糖を有する乾燥処理済みの植物材料を生成するための方法であって、
（ａ）前記〔６〕に記載の植物体もしくはその一部、または前記〔７〕に記載の植物材料を提供する工程と、
（ｂ）前記植物材料をそこから収穫する工程と、
（ｃ）前記植物材料を乾燥処理する工程と、を含む、方法。
〔１３〕前記植物材料が、乾燥処理済みの葉、乾燥処理済みの茎、もしくは乾燥処理済みの花、またはそれらの混合物を含み、かつ／あるいは
前記乾燥処理方法が、空気乾燥処理、火力乾燥処理、煙乾燥処理、および熱風送管乾燥処理からなる群から選択される、前記〔１２〕に記載の方法。

Claims (15)

  1. 乾燥処理済みのたばこ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）葉であって、
    （ｉ）配列番号９もしくは配列番号１１のＮｔＳＵＳポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、もしくはそれからなるポリヌクレオチド、または配列番号５もしくは配列番号１３のＮｔＳＵＳポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、もしくはそれからなるポリヌクレオチド、
    （ｉｉ）（ｉ）に記載した前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
    （ｉｉｉ）配列番号６のＮｔＳＵＳポリペプチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性、もしくは配列番号１０もしくは配列番号１２のＮｔＳＵＳポリペプチド配列に対して少なくとも９３％の配列同一性、もしくは配列番号１４のＮｔＳＵＳポリペプチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれからなるポリペプチド、あるいは
    （ｉｖ）（ｉ）に記載した前記ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクター
    を含み、前記乾燥処理済みの葉が、前記ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたは前記ＮｔＳＵＳポリペプチドの発現または活性が修飾されていない対照の乾燥処理済みの葉と比較して、（ｉ）に記載した前記ポリヌクレオチドまたは（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）に記載した前記ポリペプチドの発現または活性を調節する少なくとも１つの修飾を含み、
    （ｉ）に記載した前記ポリヌクレオチドまたは（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）に記載した前記ポリペプチドの調節された発現または活性が、前記対照の乾燥処理済みの葉における還元糖のレベルと比較して、前記乾燥処理済みの葉における還元糖のレベルを調節する、乾燥処理済みのたばこ葉。
  2. 前記乾燥処理済みの葉が、配列番号５もしくは配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号９もしくは配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれからなる請求項１（ｉ）に記載の前記ポリヌクレオチドを含むか、あるいは
    前記乾燥処理済みの葉が、配列番号６に対して少なくとも９５％の配列同一性、または配列番号１０もしくは配列番号１２に対して少なくとも９３％の配列同一性、または配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれからなる請求項１（ｉｉｉ）に記載の前記ポリペプチドを含む、
    請求項１に記載の乾燥処理済みの葉。
  3. 前記少なくとも１つの修飾が、前記乾燥処理済みの葉のゲノムの修飾、または前記構築物、ベクター、もしくは発現ベクターの修飾、またはトランスジェニック修飾である、請求項１または２に記載の乾燥処理済みの葉。
  4. 前記乾燥処理済みの葉のゲノムの前記修飾、または前記構築物、ベクター、もしくは発現ベクターの前記修飾が、突然変異または編集である、請求項３に記載の乾燥処理済みの葉。
  5. 前記修飾が、前記対照の乾燥処理済みの葉と比較して、請求項１（ｉ）に記載の前記ポリヌクレオチドまたは請求項１（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）に記載の前記ポリペプチドの発現または活性を増加または減少させる、請求項１～４のいずれかに記載の乾燥処理済みの葉。
  6. 前記乾燥処理済みの葉が、請求項１（ｉ）に記載の前記ポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡの少なくとも１９ヌクレオチドに対して少なくとも９０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを含む、請求項５に記載の乾燥処理済みの葉。
  7. 前記還元糖が、グルコースまたはフルクトースである、請求項１～６のいずれかに記載の乾燥処理済みの葉。
  8. 前記乾燥処理済みの葉が、熱風送管乾燥処理、日光乾燥処理、または空気乾燥処理済みの葉である、請求項１～７のいずれかに記載の乾燥処理済みの葉。
  9. 請求項１～８のいずれかに記載の乾燥処理済みの葉を含む、たばこ製品。
  10. 請求項１～８のいずれかに記載の乾燥処理済みの葉を生成するための方法であって、
    （ａ）配列番号９もしくは配列番号１１のＮｔＳＵＳポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するか、または配列番号５もしくは配列番号１３のＮｔＳＵＳポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、もしくはそれからなるポリヌクレオチドを含む、たばこ植物体細胞を提供する工程と、
    （ｂ）前記ＮｔＳＵＳポリヌクレオチドまたは前記ＮｔＳＵＳポリペプチドの発現または活性が修飾されていない対照植物体細胞と比較して前記ポリヌクレオチドの発現を調節するために、前記植物体細胞を修飾する工程と、
    （ｃ）前記植物体細胞を植物体に再生させる工程と、
    （ｄ）葉をそこから収穫する工程と、
    （ｅ）前記葉を乾燥処理する工程と、
    を含む、方法。
  11. 工程（ｃ）が、前記植物体細胞を含む挿し木または苗木から前記植物体を栽培することを含み、かつ／または
    前記植物体細胞を修飾する前記工程が、ゲノム編集またはゲノム工学によって前記細胞のゲノムを修飾することを含む、
    請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ゲノム編集またはゲノム工学が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発、化学的突然変異誘発または放射線突然変異誘発、相同的組み換え、オリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発、およびメガヌクレアーゼ媒介突然変異誘発から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記植物体細胞を修飾する前記工程が、構成的プロモーターに作用可能に連結された、配列番号９もしくは配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するか、または配列番号５もしくは配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれからなるポリヌクレオチドを含む構築物で、前記細胞をトランスフェクトすることを含み、かつ／あるいは
    前記植物体細胞を修飾する前記工程が、請求項１（ｉ）に記載の前記ポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡに対して少なくとも９０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを、前記細胞に導入することを含む、
    請求項１０～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 前記植物体細胞が、請求項１（ｉ）に記載の前記ポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡの少なくとも１９ヌクレオチドに対して少なくとも９０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを発現させる構築物でトランスフェクトされる、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記乾燥処理方法が、空気乾燥処理、火力乾燥処理、煙乾燥処理、および熱風送管乾燥処理からなる群から選択される、請求項１０～１４のいずれかに記載の方法。
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