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JP7521819B2 - タンパク質産生及びライブラリー生成のための哺乳類細胞株 - Google Patents

タンパク質産生及びライブラリー生成のための哺乳類細胞株 Download PDF

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Description

本発明は、改変された細胞株、並びに、タンパク質発現のための安定的な細胞の迅速な生成及び、指向性進化及びタンパク質工学のためのタンパク質ライブラリーの作製のためのその使用に関連する。
現在、哺乳類細胞からのタンパク質産生に利用可能な方法は、主に３つの細胞株におけるランダム化された導入遺伝子の組込みに依存している。ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、マウス骨髄腫細胞（Ｓｐ２０及びＮＳ０）、及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。これらの方法は、高価で時間がかかる。バイオテクノロジー産業の標準として治療用タンパク質産生に求められるのは、凍結細胞ストックからの更新時に無期限に近いタンパク質産生能力をもつ、安定的な組換えタンパク質産生細胞株の生成である。
指向性進化によるタンパク質改変には、インビトロ突然変異誘発法によるＤＮＡライブラリーの生成（例えば、変異性ＰＣＲ、縮重プライマーＰＣＲ突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリング）、続いて発現ホストへのクローニング、及びハイスループットスクリーニングが要求される。
哺乳類細胞中において生成されうるライブラリーの大きさは、トランスフェクション効率の低さにより制限されている。それゆえに、タンパク質ライブラリーのハイスループットスクリーニングには、主にインビトロ又は微生物における発現に基づいた直交表面ディスプレイプラットフォームがしばしば用いられている（例えば、リボソーム、ファージ、酵母及び細菌のディスプレイ）。哺乳類細胞と比べて、それらのホストは、タンパク質のフォールディング、糖鎖付加パターン及び発現において大きな影響を与えうる。
しかし決定的なことに、その標準的な系では複雑なタンパク質を効果的に発現及びスクリーニングすることができない（例えば、全長抗体）。加えて、治療用タンパク質の場合、インビトロ又は微生物系におけるライブラリーのスクリーニングに続いて、適切な特徴付けのために哺乳類発現系への遺伝的サブクローニングの必要性がしばしば生じる。
本発明の基礎となる課題は、遺伝子組換えタンパク質の発現及び、タンパク質改変と指向性進化アプリケーションのため大きなタンパク質ライブラリーの生成及びスクリーニングのために用いられる、安定的な哺乳類細胞株を生成するための迅速で信頼性があり高価でない方法を提供することである。この問題は、独立請求項の主題により解決される。
ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞の生成を示す。（Ａ）模式図は、抗体を発現する野生型（ＷＴ）ハイブリドーマ細胞がＰｎＰ－ｍＲｕｂｙに変換されることを示す。（Ｂ）リーダー配列（Ｌ）、ｍＲＮＡスプライス部位（ＳＳ）、ＶＨ及びＩｇＧ定常重鎖領域（ＣＨ１）を有するＷＴ ＩｇＨゲノム遺伝子座の標的を示す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ標的部位（黒色）はＶＨとＣＨ１との間のイントロン内にある。ドナーコンストラクトは、７３２ｂｐ及び７１１ｂｐの２つのホモロジーアームと隣接する終止コドンを有するｍＲｕｂｙ遺伝子からなる。ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ ＩｇＨ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９プラスミド（ｐＸ４５８）及びドナーコンストラクトのＷＴ細胞へのトランスフェクションによって生成され、ＨＤＲに基づいたＶＨ領域のｍＲｕｂｙへの交換をもたらす。（Ｃ）フローサイトメトリーのドットプロットは、ＷＴ細胞は専らＩｇＨ陽性かつｍＲｕｂｙ陰性であり、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞は専らｍＲｕｂｙ陽性かつＩｇＨ陰性であることを示す。（Ｄ）ＷＴ及びＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞からのゲノムＤＮＡに対して、５’ＨＡのフォワードプライマー及び３’ＨＡの外部のリバースプライマーを用いてＰＣＲを行った。アガロースゲルは予想されるバンドの大きさを示す。ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞からのバンドの抽出及びサンガーシーケンシングにより、ＶＨ領域のｍＲｕｂｙへの交換が確認された。（Ｅ）ＷＴハイブリドーマＩｇＫ遺伝子座の標的であり、以下の注釈：ＶＬ及びＩｇＫ軽鎖定常領域（ＣＫ）、その他（Ａ）に記載したものと同様の注釈である。２つのｇＲＮＡ標的部位は、ＶＬ領域を欠損させるために利用される。（Ｆ）フローサイトメトリーのドットプロットは、ＷＴ細胞がＩｇＨ及びＩｇＫ強陽性であり、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞が専らＩｇＨ及びＩｇＫ陰性であることを示す。（Ｅ）ｇＲＮＡ－Ｆ部位の５’フォワードプライマー及びｇＲＮＡ－Ｈ部位の３’リバースプライマーを用いて、ＷＴ及びＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞からのゲノムＤＮＡのＰＣＲを行った。アガロースゲルで、ＷＴ細胞において予想されたサイズが示され、またＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞株由来の増幅はほとんど示されなかった。この図全体において、ＷＴ細胞はクローンＷＥＮ１．３に対応し、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞はクローン１Ｅ９．Ｃ３に対応する（表１参照）。 ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞の生成を示す。（Ａ）模式図は、抗体を発現する野生型（ＷＴ）ハイブリドーマ細胞がＰｎＰ－ｍＲｕｂｙに変換されることを示す。（Ｂ）リーダー配列（Ｌ）、ｍＲＮＡスプライス部位（ＳＳ）、ＶＨ及びＩｇＧ定常重鎖領域（ＣＨ１）を有するＷＴ ＩｇＨゲノム遺伝子座の標的を示す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ標的部位（黒色）はＶＨとＣＨ１との間のイントロン内にある。ドナーコンストラクトは、７３２ｂｐ及び７１１ｂｐの２つのホモロジーアームと隣接する終止コドンを有するｍＲｕｂｙ遺伝子からなる。ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ ＩｇＨ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９プラスミド（ｐＸ４５８）及びドナーコンストラクトのＷＴ細胞へのトランスフェクションによって生成され、ＨＤＲに基づいたＶＨ領域のｍＲｕｂｙへの交換をもたらす。（Ｃ）フローサイトメトリーのドットプロットは、ＷＴ細胞は専らＩｇＨ陽性かつｍＲｕｂｙ陰性であり、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞は専らｍＲｕｂｙ陽性かつＩｇＨ陰性であることを示す。（Ｄ）ＷＴ及びＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞からのゲノムＤＮＡに対して、５’ＨＡのフォワードプライマー及び３’ＨＡの外部のリバースプライマーを用いてＰＣＲを行った。アガロースゲルは予想されるバンドの大きさを示す。ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞からのバンドの抽出及びサンガーシーケンシングにより、ＶＨ領域のｍＲｕｂｙへの交換が確認された。（Ｅ）ＷＴハイブリドーマＩｇＫ遺伝子座の標的であり、以下の注釈：ＶＬ及びＩｇＫ軽鎖定常領域（ＣＫ）、その他（Ａ）に記載したものと同様の注釈である。２つのｇＲＮＡ標的部位は、ＶＬ領域を欠損させるために利用される。（Ｆ）フローサイトメトリーのドットプロットは、ＷＴ細胞がＩｇＨ及びＩｇＫ強陽性であり、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞が専らＩｇＨ及びＩｇＫ陰性であることを示す。（Ｅ）ｇＲＮＡ－Ｆ部位の５’フォワードプライマー及びｇＲＮＡ－Ｈ部位の３’リバースプライマーを用いて、ＷＴ及びＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞からのゲノムＤＮＡのＰＣＲを行った。アガロースゲルで、ＷＴ細胞において予想されたサイズが示され、またＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞株由来の増幅はほとんど示されなかった。この図全体において、ＷＴ細胞はクローンＷＥＮ１．３に対応し、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞はクローン１Ｅ９．Ｃ３に対応する（表１参照）。 新たな抗体を表面発現し分泌するようにリプログラミングされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙハイブリドーマの生成を示す。（Ａ）模式図は、ｍＲｕｂｙを発現するＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞がｓＦＡｂを介して新たな抗体を発現するハイブリドーマに再変換されることを示す。（Ｂ）ｓＦＡｂドナーコンストラクトの簡略化した設計図を示す（完全な設計図の詳細については、図Ｓ８を参照）。（Ｃ）ｇＲＮＡ－Ｊ標的部位がｍＲｕｂｙ遺伝子内にあるＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ ＩｇＨ遺伝子座を示す。ｐＸ４５８．２及びｓＦＡｂドナーでトランスフェクションされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞は、ＨＤＲによりｍＲｕｂｙのゲノムが置換される。その後、新たな抗体は１本鎖ｍＲＮＡ転写物として発現する。（Ｄ）フローサイトメトリーのドットプロットは、ｐＸ４５８及びｓＦＡｂドナーによるＰｎＰ－ｍＲｕｂｙのトランスフェクション後に発生した異なる細胞群を示す。ＩｇＨ発現陽性細胞をソートした。（Ｅ）フローサイトメトリーのドットプロットは、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞の初期群及び、（Ｄ）においてＩｇＨ陽性群をソートして得られたＩｇＨ及びＩｇＫ発現強陽性の細胞（ＰｎＰ－ＨＥＬ２３）を示す。（Ｆ）グラフは、ハイブリドーマ培養液上清に対するサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果（ＩｇＫ抗体で捕捉し、ＩｇＨ抗体を主に検出した）、ＰｎＰ－ＨＥＬ２３はＷＴと同程度のＩｇＧ分泌を示すことを表す。（Ｇ）（Ｃ）で示したプライマーを用いて、ＷＴ、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ及びＰｎＰ－ＨＥＬ２３細胞のゲノムＤＮＡのＰＣＲを行った。ゲノムＰＣＲ産物はアガロースゲルで、ＰｎＰ－ＨＥＬ２３において予想された大きさのバンドを示す。（Ｈ）ｍＲＮＡからのＲＴ－ＰＣＲの結果、ＰｎＰ－ＨＥＬ２３においてのみ、正しい大きさの位置にバンドが見られる。このＰｎＰ－ＨＥＬ２３からのバンドを抽出し、サンガーシーケンシングを行い、ＰｎＰ－ｓＦＡｂコンストラクトの正しい組込みが確認された。この図全体において、ＷＴ細胞はクローンＷＥＮ１．３に対応し、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞はクローン１Ｅ９．Ｃ３に対応し、ＰｎＰ－ＨＥＬ２３はクローンＹに対応する（表１参照）。 新たな抗体を表面発現し分泌するようにリプログラミングされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙハイブリドーマの生成を示す。（Ａ）模式図は、ｍＲｕｂｙを発現するＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞がｓＦＡｂを介して新たな抗体を発現するハイブリドーマに再変換されることを示す。（Ｂ）ｓＦＡｂドナーコンストラクトの簡略化した設計図を示す（完全な設計図の詳細については、図Ｓ８を参照）。（Ｃ）ｇＲＮＡ－Ｊ標的部位がｍＲｕｂｙ遺伝子内にあるＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ ＩｇＨ遺伝子座を示す。ｐＸ４５８．２及びｓＦＡｂドナーでトランスフェクションされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞は、ＨＤＲによりｍＲｕｂｙのゲノムが置換される。その後、新たな抗体は１本鎖ｍＲＮＡ転写物として発現する。（Ｄ）フローサイトメトリーのドットプロットは、ｐＸ４５８及びｓＦＡｂドナーによるＰｎＰ－ｍＲｕｂｙのトランスフェクション後に発生した異なる細胞群を示す。ＩｇＨ発現陽性細胞をソートした。（Ｅ）フローサイトメトリーのドットプロットは、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞の初期群及び、（Ｄ）においてＩｇＨ陽性群をソートして得られたＩｇＨ及びＩｇＫ発現強陽性の細胞（ＰｎＰ－ＨＥＬ２３）を示す。（Ｆ）グラフは、ハイブリドーマ培養液上清に対するサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果（ＩｇＫ抗体で捕捉し、ＩｇＨ抗体を主に検出した）、ＰｎＰ－ＨＥＬ２３はＷＴと同程度のＩｇＧ分泌を示すことを表す。（Ｇ）（Ｃ）で示したプライマーを用いて、ＷＴ、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ及びＰｎＰ－ＨＥＬ２３細胞のゲノムＤＮＡのＰＣＲを行った。ゲノムＰＣＲ産物はアガロースゲルで、ＰｎＰ－ＨＥＬ２３において予想された大きさのバンドを示す。（Ｈ）ｍＲＮＡからのＲＴ－ＰＣＲの結果、ＰｎＰ－ＨＥＬ２３においてのみ、正しい大きさの位置にバンドが見られる。このＰｎＰ－ＨＥＬ２３からのバンドを抽出し、サンガーシーケンシングを行い、ＰｎＰ－ｓＦＡｂコンストラクトの正しい組込みが確認された。この図全体において、ＷＴ細胞はクローンＷＥＮ１．３に対応し、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞はクローン１Ｅ９．Ｃ３に対応し、ＰｎＰ－ＨＥＬ２３はクローンＹに対応する（表１参照）。 抗原特異的抗体の表面発現及び分泌をするＰｎＰ－ＨＥＬ２３細胞を示す。（Ａ）フローサイトメトリーのヒストグラムは、ＰｎＰ－ＨＥＬ２３細胞がＨＥＬ同種抗原に対する特異抗体を表面発現することを示す。（Ｂ）ＥＬＩＳＡ法のデータは、ＰｎＰ－ＨＥＬ２３細胞がＨＥＬに特異的な抗体を分泌することを示す。ＷＴ細胞はクローンＷＥＮ１．３に対応し、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞はクローン１Ｅ９．Ｃ３に対応し、ＰｎＰ－ＩｇＧ細胞はクローンＹに対応する（表１参照）。 迅速で再生可能なＰｎＰ抗体産生細胞の生成を示す。（Ａ）フローサイトメトリーのドットプロットは、ｐＸ４５８．２及び異なるＰｎＰ－ｓＦＡｂドナーコンストラクトによりトランスフェクションされた後のＰｎＰ－ｍＲｕｂｙを示す。細胞をＩｇＨの発現に基づいてソートした。（Ｂ）フローサイトメトリーのドットプロットは、（Ａ）で分類した後、３つ全てのＰｎＰ細胞株がＩｇＨ及びＩｇＫを発現することを示す。（Ｃ）図２Ｇ及び２Ｈと同様に、ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡについてＰＣＲ及びＲＴ－ＰＣＲをそれぞれ行った。（Ｄ、Ｅ）ＰｎＰ－ＨＥＬ２３．２細胞のフローサイトメトリーのドットプロットは、（Ａ）及び（Ｂ）と同様であるが、Ｃａｓ９ソート工程は省略した。ＰｎＰ－ＨｙＨＥＬ１０はクローンＵに対応し、ＰｎＰ－ＥＢＶ－２Ｇ４はクローンＡＡに対応し、ＰｎＰ－ＥＢＶ－４Ｇ７はクローンＡＢに対応し、ＰｎＰ－ＨＥＬ２３はクローンＡＣに対応する（表１参照）。 Ｃａｓ９及びＡＩＤを発現するＰｎＰハイブリドーマ細胞の生成を示す。（ａ）ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ Ｒｏｓａ２６遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的を示す。ドナーコンストラクトは、Ｃａｓ９遺伝子に２Ａペプチド及びピューロマイシン耐性遺伝子を提供する。この遺伝子座への組込みは、すべてのＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞におけるＣａｓ９の構成的発現をもたらす。（ｂ）及び（ｃ）Ｒｏｓａ２６遺伝子座又は野生型ＡＩＤ遺伝子座いずれかへの組込みによる、誘導性ＡＩＤ遺伝子座のＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－Ｃａｓ９細胞への組込みを示す。（ｄ）模式図は、ＡＩＤの発現による誘導性合成体細胞超変異によって大きなライブラリーが生成されることを示す。これらのライブラリーは、フローサイトメトリーによるハイスループットスクリーニング及び指向性進化に使用することができる。 Ｃａｓ９及びＡＩＤを発現するＰｎＰハイブリドーマ細胞の生成を示す。（ａ）ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ Ｒｏｓａ２６遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的を示す。ドナーコンストラクトは、Ｃａｓ９遺伝子に２Ａペプチド及びピューロマイシン耐性遺伝子を提供する。この遺伝子座への組込みは、すべてのＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞におけるＣａｓ９の構成的発現をもたらす。（ｂ）及び（ｃ）Ｒｏｓａ２６遺伝子座又は野生型ＡＩＤ遺伝子座いずれかへの組込みによる、誘導性ＡＩＤ遺伝子座のＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－Ｃａｓ９細胞への組込みを示す。（ｄ）模式図は、ＡＩＤの発現による誘導性合成体細胞超変異によって大きなライブラリーが生成されることを示す。これらのライブラリーは、フローサイトメトリーによるハイスループットスクリーニング及び指向性進化に使用することができる。 ハイブリドーマ細胞の免疫グロブリン遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の検証を示す。（Ａ）フローサイトメトリーのドットプロットは、ｐＸ４５８によるトランスフェクション後のＷＥＮ１．３細胞におけるＣａｓ９－２Ａ－ＧＦＰの発現を示す。（Ｂ）Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果は、ＩｇＨ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の標的を検証する（全てのｇＲＮＡのアガロースゲルの位置が確認された）。（Ｃ）Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果は、ＩｇＫ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の標的を検証する（全てのｇＲＮＡのアガロースゲルの位置が確認された）。 ハイブリドーマ細胞の免疫グロブリン遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の検証を示す。（Ａ）フローサイトメトリーのドットプロットは、ｐＸ４５８によるトランスフェクション後のＷＥＮ１．３細胞におけるＣａｓ９－２Ａ－ＧＦＰの発現を示す。（Ｂ）Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果は、ＩｇＨ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の標的を検証する（全てのｇＲＮＡのアガロースゲルの位置が確認された）。（Ｃ）Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果は、ＩｇＫ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の標的を検証する（全てのｇＲＮＡのアガロースゲルの位置が確認された）。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によるＲＯＳＡ２６遺伝子座の標的を示す。（Ａ）同定されたＣＲＩＳＰＲ標的を有するＲＯＳＡ２６遺伝子座（マウス染色体６）；切断解析のためのフラグメント増幅のために使用されるプライマーも示す。（Ｂ）ＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにおけるＤＮＡゲルは、確認した４つのガイドＲＮＡの全てがＣＲＩＳＰＲ切断の成功を誘導することを示す。フラグメントは、（Ａ）に示す予想されたサイズと一致する。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によるＲＯＳＡ２６遺伝子座の標的を示す。（Ａ）同定されたＣＲＩＳＰＲ標的を有するＲＯＳＡ２６遺伝子座（マウス染色体６）；切断解析のためのフラグメント増幅のために使用されるプライマーも示す。（Ｂ）ＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにおけるＤＮＡゲルは、確認した４つのガイドＲＮＡの全てがＣＲＩＳＰＲ切断の成功を誘導することを示す。フラグメントは、（Ａ）に示す予想されたサイズと一致する。 ＰｎＰ－Ｃａｓ９細胞株の設計及び検証を示す。（Ａ）ＲＯＳＡ２６遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９誘導型ＨＤＲによる構成的Ｃａｓ９カセットの組込みの標的とされる。２つの別々の遺伝子がカセットに含まれている。ウシ成長ホルモン（ｂＣＧｈ）を有するＳｐＣａｓ９－２Ａ－ピューロマイシン遺伝子、ＧＦＰ遺伝子はマウスｐＰＧＫプロモーターの転写制御下にある。５’及び３’ホモロジーアームもコンストラクト中に存在する。１：ＳＶ４０ｐＡ； ２：ＡＩＤ； ３：Ｆ２Ａ； ４：ＧＦＰ； ５：ＴＲＥ３Ｇｓプロモーター； ６：ｈＰＧＫプロモーター； ７：Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ； ８：ＳＶ４０ｐＡ； ９：ホモロジーアーム； １０：ｐＣＡＧプロモーター； １１：ＳｐＣａｓ９； １２：Ｔ２Ａ； １３：ピューロマイシン； １４：ｂＧＨ ｐＡ； １５：ｍＰＧＫプロモーター； １６：ＧＦＰ； １７：ホモロジーアーム。（Ｂ）Ｃａｓ９ドナーコンストラクトの詳細であり、Ｃａｓ９誘導型ＮＨＥＪによってＧＦＰをその後不活性化するために使用されるＧＦＰ又はｐＰＧＫ内のガイドＲＮＡ標的部位を示す。（Ｃ）ＰｎＰＣａｓ９におけるガイドＲＮＡの導入前又は導入後のサンガーシーケンシング結果。（Ｄ）ガイドＲＮＡの存在下でのＰｎＰ－Ｃａｓ９細胞が、ＧＦＰ細胞のＣａｓ９誘導型ＮＨＥＪをもたらすことをＴ７Ｅ１アッセイで確認する。（Ｅ）フローサイトメトリーのプロットは、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－Ｃａｓ９細胞において、ｍＲｕｂｙを標的とするｇＲＮＡの添加が、ほぼ全ての細胞におけるｍＲｕｂｙ発現のノックアウトをもたらすことを示す。 ＰｎＰ－Ｃａｓ９細胞株の設計及び検証を示す。（Ａ）ＲＯＳＡ２６遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９誘導型ＨＤＲによる構成的Ｃａｓ９カセットの組込みの標的とされる。２つの別々の遺伝子がカセットに含まれている。ウシ成長ホルモン（ｂＣＧｈ）を有するＳｐＣａｓ９－２Ａ－ピューロマイシン遺伝子、ＧＦＰ遺伝子はマウスｐＰＧＫプロモーターの転写制御下にある。５’及び３’ホモロジーアームもコンストラクト中に存在する。１：ＳＶ４０ｐＡ； ２：ＡＩＤ； ３：Ｆ２Ａ； ４：ＧＦＰ； ５：ＴＲＥ３Ｇｓプロモーター； ６：ｈＰＧＫプロモーター； ７：Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ； ８：ＳＶ４０ｐＡ； ９：ホモロジーアーム； １０：ｐＣＡＧプロモーター； １１：ＳｐＣａｓ９； １２：Ｔ２Ａ； １３：ピューロマイシン； １４：ｂＧＨ ｐＡ； １５：ｍＰＧＫプロモーター； １６：ＧＦＰ； １７：ホモロジーアーム。（Ｂ）Ｃａｓ９ドナーコンストラクトの詳細であり、Ｃａｓ９誘導型ＮＨＥＪによってＧＦＰをその後不活性化するために使用されるＧＦＰ又はｐＰＧＫ内のガイドＲＮＡ標的部位を示す。（Ｃ）ＰｎＰＣａｓ９におけるガイドＲＮＡの導入前又は導入後のサンガーシーケンシング結果。（Ｄ）ガイドＲＮＡの存在下でのＰｎＰ－Ｃａｓ９細胞が、ＧＦＰ細胞のＣａｓ９誘導型ＮＨＥＪをもたらすことをＴ７Ｅ１アッセイで確認する。（Ｅ）フローサイトメトリーのプロットは、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－Ｃａｓ９細胞において、ｍＲｕｂｙを標的とするｇＲＮＡの添加が、ほぼ全ての細胞におけるｍＲｕｂｙ発現のノックアウトをもたらすことを示す。 ＰｎＰ－Ｃａｓ９細胞株の設計及び検証を示す。（Ａ）ＲＯＳＡ２６遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９誘導型ＨＤＲによる構成的Ｃａｓ９カセットの組込みの標的とされる。２つの別々の遺伝子がカセットに含まれている。ウシ成長ホルモン（ｂＣＧｈ）を有するＳｐＣａｓ９－２Ａ－ピューロマイシン遺伝子、ＧＦＰ遺伝子はマウスｐＰＧＫプロモーターの転写制御下にある。５’及び３’ホモロジーアームもコンストラクト中に存在する。１：ＳＶ４０ｐＡ； ２：ＡＩＤ； ３：Ｆ２Ａ； ４：ＧＦＰ； ５：ＴＲＥ３Ｇｓプロモーター； ６：ｈＰＧＫプロモーター； ７：Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ； ８：ＳＶ４０ｐＡ； ９：ホモロジーアーム； １０：ｐＣＡＧプロモーター； １１：ＳｐＣａｓ９； １２：Ｔ２Ａ； １３：ピューロマイシン； １４：ｂＧＨ ｐＡ； １５：ｍＰＧＫプロモーター； １６：ＧＦＰ； １７：ホモロジーアーム。（Ｂ）Ｃａｓ９ドナーコンストラクトの詳細であり、Ｃａｓ９誘導型ＮＨＥＪによってＧＦＰをその後不活性化するために使用されるＧＦＰ又はｐＰＧＫ内のガイドＲＮＡ標的部位を示す。（Ｃ）ＰｎＰＣａｓ９におけるガイドＲＮＡの導入前又は導入後のサンガーシーケンシング結果。（Ｄ）ガイドＲＮＡの存在下でのＰｎＰ－Ｃａｓ９細胞が、ＧＦＰ細胞のＣａｓ９誘導型ＮＨＥＪをもたらすことをＴ７Ｅ１アッセイで確認する。（Ｅ）フローサイトメトリーのプロットは、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－Ｃａｓ９細胞において、ｍＲｕｂｙを標的とするｇＲＮＡの添加が、ほぼ全ての細胞におけるｍＲｕｂｙ発現のノックアウトをもたらすことを示す。 ＰｎＰ－Ｃａｓ９細胞株の設計及び検証を示す。（Ａ）ＲＯＳＡ２６遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９誘導型ＨＤＲによる構成的Ｃａｓ９カセットの組込みの標的とされる。２つの別々の遺伝子がカセットに含まれている。ウシ成長ホルモン（ｂＣＧｈ）を有するＳｐＣａｓ９－２Ａ－ピューロマイシン遺伝子、ＧＦＰ遺伝子はマウスｐＰＧＫプロモーターの転写制御下にある。５’及び３’ホモロジーアームもコンストラクト中に存在する。１：ＳＶ４０ｐＡ； ２：ＡＩＤ； ３：Ｆ２Ａ； ４：ＧＦＰ； ５：ＴＲＥ３Ｇｓプロモーター； ６：ｈＰＧＫプロモーター； ７：Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ； ８：ＳＶ４０ｐＡ； ９：ホモロジーアーム； １０：ｐＣＡＧプロモーター； １１：ＳｐＣａｓ９； １２：Ｔ２Ａ； １３：ピューロマイシン； １４：ｂＧＨ ｐＡ； １５：ｍＰＧＫプロモーター； １６：ＧＦＰ； １７：ホモロジーアーム。（Ｂ）Ｃａｓ９ドナーコンストラクトの詳細であり、Ｃａｓ９誘導型ＮＨＥＪによってＧＦＰをその後不活性化するために使用されるＧＦＰ又はｐＰＧＫ内のガイドＲＮＡ標的部位を示す。（Ｃ）ＰｎＰＣａｓ９におけるガイドＲＮＡの導入前又は導入後のサンガーシーケンシング結果。（Ｄ）ガイドＲＮＡの存在下でのＰｎＰ－Ｃａｓ９細胞が、ＧＦＰ細胞のＣａｓ９誘導型ＮＨＥＪをもたらすことをＴ７Ｅ１アッセイで確認する。（Ｅ）フローサイトメトリーのプロットは、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－Ｃａｓ９細胞において、ｍＲｕｂｙを標的とするｇＲＮＡの添加が、ほぼ全ての細胞におけるｍＲｕｂｙ発現のノックアウトをもたらすことを示す。 ＰｎＰ－ｉＡＩＤ－ｍＲｕｂｙ細胞株の生成及び選択を示す。（Ａ）ｉＳＳＨＭドナーカセット（Ｄｏｘ誘導性プロモーターシステム下のＧＦＰ－２Ａ－ＡＩＤコンストラクト）の組込み物が、Ｃａｓ９誘導性ＨＤＲによってハイブリドーマ細胞のＲｏｓａ２６座に組込まれることを示す。ハイブリドーマ細胞は、それらのリプログラミングされたＩｇＨ遺伝子座においてｍＲｕｂｙを発現する。（Ｂ）Ｃａｓ９（２Ａ－ＢＦＰ）を発現する細胞をソートし、次いでＤｏｘの存在下（又は陰性対照として非存在下）で、ＧＦＰ陽性細胞を単一細胞分離し、増殖させる。（Ｃ）Ｂからの単一細胞分離コロニー中のＤｏｘの有無によるＧＦＰ発現の解析。 ＰｎＰ－ｉＡＩＤ－ｍＲｕｂｙ細胞株の生成及び選択を示す。（Ａ）ｉＳＳＨＭドナーカセット（Ｄｏｘ誘導性プロモーターシステム下のＧＦＰ－２Ａ－ＡＩＤコンストラクト）の組込み物が、Ｃａｓ９誘導性ＨＤＲによってハイブリドーマ細胞のＲｏｓａ２６座に組込まれることを示す。ハイブリドーマ細胞は、それらのリプログラミングされたＩｇＨ遺伝子座においてｍＲｕｂｙを発現する。（Ｂ）Ｃａｓ９（２Ａ－ＢＦＰ）を発現する細胞をソートし、次いでＤｏｘの存在下（又は陰性対照として非存在下）で、ＧＦＰ陽性細胞を単一細胞分離し、増殖させる。（Ｃ）Ｂからの単一細胞分離コロニー中のＤｏｘの有無によるＧＦＰ発現の解析。 ＰｎＰ－ｉＡＩＤ－ｍＲｕｂｙ細胞株の生成及び選択を示す。（Ａ）ｉＳＳＨＭドナーカセット（Ｄｏｘ誘導性プロモーターシステム下のＧＦＰ－２Ａ－ＡＩＤコンストラクト）の組込み物が、Ｃａｓ９誘導性ＨＤＲによってハイブリドーマ細胞のＲｏｓａ２６座に組込まれることを示す。ハイブリドーマ細胞は、それらのリプログラミングされたＩｇＨ遺伝子座においてｍＲｕｂｙを発現する。（Ｂ）Ｃａｓ９（２Ａ－ＢＦＰ）を発現する細胞をソートし、次いでＤｏｘの存在下（又は陰性対照として非存在下）で、ＧＦＰ陽性細胞を単一細胞分離し、増殖させる。（Ｃ）Ｂからの単一細胞分離コロニー中のＤｏｘの有無によるＧＦＰ発現の解析。 ＰｎＰ－ｉＡＩＤ－ＩｇＧ細胞株の生成及び選択を示す。（Ａ）ｉＳＳＨＭドナーカセット（Ｄｏｘｉｎｄｕｃｉｂｌｅプロモーターシステム下のＧＦＰ－２Ａ－ＡＩＤコンストラクト）の組込み物が、Ｃａｓ９誘導性ＨＤＲによってハイブリドーマ細胞のＲｏｓａ２６座に組込まれることを示す。ハイブリドーマ細胞は、それらのリプログラミングされたＩｇＨ遺伝子座においてｓＦＡｂを介してＩｇＧを発現する。（Ｂ）Ｃａｓ９（２Ａ－ＢＦＰ）を発現する細胞をソートし、次いでＤｏｘの存在下（又は陰性対照として非存在下）で、ＧＦＰ陽性細胞を単一細胞分離し、増殖させる。（Ｃ）Ｂからの単一細胞分類コロニー中のＤｏｘの有無によるＧＦＰ発現の解析。 ＰｎＰ－ｉＡＩＤ－ＩｇＧ細胞株の生成及び選択を示す。（Ａ）ｉＳＳＨＭドナーカセット（Ｄｏｘｉｎｄｕｃｉｂｌｅプロモーターシステム下のＧＦＰ－２Ａ－ＡＩＤコンストラクト）の組込み物が、Ｃａｓ９誘導性ＨＤＲによってハイブリドーマ細胞のＲｏｓａ２６座に組込まれることを示す。ハイブリドーマ細胞は、それらのリプログラミングされたＩｇＨ遺伝子座においてｓＦＡｂを介してＩｇＧを発現する。（Ｂ）Ｃａｓ９（２Ａ－ＢＦＰ）を発現する細胞をソートし、次いでＤｏｘの存在下（又は陰性対照として非存在下）で、ＧＦＰ陽性細胞を単一細胞分離し、増殖させる。（Ｃ）Ｂからの単一細胞分類コロニー中のＤｏｘの有無によるＧＦＰ発現の解析。 ＰｎＰ－ｉＡＩＤ－ＩｇＧ細胞株の生成及び選択を示す。（Ａ）ｉＳＳＨＭドナーカセット（Ｄｏｘｉｎｄｕｃｉｂｌｅプロモーターシステム下のＧＦＰ－２Ａ－ＡＩＤコンストラクト）の組込み物が、Ｃａｓ９誘導性ＨＤＲによってハイブリドーマ細胞のＲｏｓａ２６座に組込まれることを示す。ハイブリドーマ細胞は、それらのリプログラミングされたＩｇＨ遺伝子座においてｓＦＡｂを介してＩｇＧを発現する。（Ｂ）Ｃａｓ９（２Ａ－ＢＦＰ）を発現する細胞をソートし、次いでＤｏｘの存在下（又は陰性対照として非存在下）で、ＧＦＰ陽性細胞を単一細胞分離し、増殖させる。（Ｃ）Ｂからの単一細胞分類コロニー中のＤｏｘの有無によるＧＦＰ発現の解析。 ｓｓＯＤＮ誘導性ＨＤＲを最適化し、ＣＤＲＨ３遺伝的多様性を有する合成抗体（ｓＡｂ）ライブラリーを構築するための一般的なワークフローを示す。（Ａ）Ａ．Ｉ：Ｃａｓ９ベクターｐＸ４５８でトランスフェクションした後の、Ｃａｓ９による切断を指示するためのＣＤＲＨ３ ｓｇＲＮＡ部位を有する重鎖遺伝子座におけるＰｎＰ－ＨＥＬ２３ ｓＡｂコンストラクト。Ｃａｓ９誘導性二本鎖切断は、ＮＨＥＪを介した切断部位の近くに挿入／欠失（ＩｎＤｅｌｓ）を導入し、フレームシフト突然変異及び機能不全タンパク質発現を引き起こす。分解図中に示す配列は配列番号１７である。Ａ．ＩＩａ：次いで、ＣＤＲＨ３についてのコドン再配列を伴うドナーｓｓＯＤＮによって促進されるＨＤＲを介して、抗体発現を回復させることができる。Ａ．ＩＩｂ：縮重ｓｓＯＤＮのＨＤＲ取込みを介したｓＡｂカセットのＣＤＲＨ３へのさらなる遺伝的多様性の付加（ＮＮＫランダム化）。ソート結果：左上：Ａ１上パネル； 右上：Ａ１下パネル（＝Ａ．ＩＩａ／ｂ上パネル）； 左下：Ａ．ＩＩａ下パネル； Ａ．ＩＩｂ下パネル。（Ｂ）ＨＤＲパーセンテージは、蛍光標識された抗原での標識を介して、フローサイトメトリー解析によって評価される。ＨＥＬに対する抗原特異的抗体発現を回復した細胞のパーセンテージを表す。トランスフェクション陽性（ＧＦＰ＋）細胞についてスクリーニングした後のｎ＝２の実験の代表データを示す。１：Ｃａｓ９プラスミド； ２：Ｃａｓ９ ＲＮＰ； ３：Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋改変ｓｓＯＤＮ； ４：Ｃａｓ９細胞＋改変ｓｓＯＤＮ。 ｓｓＯＤＮ誘導性ＨＤＲを最適化し、ＣＤＲＨ３遺伝的多様性を有する合成抗体（ｓＡｂ）ライブラリーを構築するための一般的なワークフローを示す。（Ａ）Ａ．Ｉ：Ｃａｓ９ベクターｐＸ４５８でトランスフェクションした後の、Ｃａｓ９による切断を指示するためのＣＤＲＨ３ ｓｇＲＮＡ部位を有する重鎖遺伝子座におけるＰｎＰ－ＨＥＬ２３ ｓＡｂコンストラクト。Ｃａｓ９誘導性二本鎖切断は、ＮＨＥＪを介した切断部位の近くに挿入／欠失（ＩｎＤｅｌｓ）を導入し、フレームシフト突然変異及び機能不全タンパク質発現を引き起こす。分解図中に示す配列は配列番号１７である。Ａ．ＩＩａ：次いで、ＣＤＲＨ３についてのコドン再配列を伴うドナーｓｓＯＤＮによって促進されるＨＤＲを介して、抗体発現を回復させることができる。Ａ．ＩＩｂ：縮重ｓｓＯＤＮのＨＤＲ取込みを介したｓＡｂカセットのＣＤＲＨ３へのさらなる遺伝的多様性の付加（ＮＮＫランダム化）。ソート結果：左上：Ａ１上パネル； 右上：Ａ１下パネル（＝Ａ．ＩＩａ／ｂ上パネル）； 左下：Ａ．ＩＩａ下パネル； Ａ．ＩＩｂ下パネル。（Ｂ）ＨＤＲパーセンテージは、蛍光標識された抗原での標識を介して、フローサイトメトリー解析によって評価される。ＨＥＬに対する抗原特異的抗体発現を回復した細胞のパーセンテージを表す。トランスフェクション陽性（ＧＦＰ＋）細胞についてスクリーニングした後のｎ＝２の実験の代表データを示す。１：Ｃａｓ９プラスミド； ２：Ｃａｓ９ ＲＮＰ； ３：Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋改変ｓｓＯＤＮ； ４：Ｃａｓ９細胞＋改変ｓｓＯＤＮ。 ｓｓＯＤＮ誘導性ＨＤＲを最適化し、ＣＤＲＨ３遺伝的多様性を有する合成抗体（ｓＡｂ）ライブラリーを構築するための一般的なワークフローを示す。（Ａ）Ａ．Ｉ：Ｃａｓ９ベクターｐＸ４５８でトランスフェクションした後の、Ｃａｓ９による切断を指示するためのＣＤＲＨ３ ｓｇＲＮＡ部位を有する重鎖遺伝子座におけるＰｎＰ－ＨＥＬ２３ ｓＡｂコンストラクト。Ｃａｓ９誘導性二本鎖切断は、ＮＨＥＪを介した切断部位の近くに挿入／欠失（ＩｎＤｅｌｓ）を導入し、フレームシフト突然変異及び機能不全タンパク質発現を引き起こす。分解図中に示す配列は配列番号１７である。Ａ．ＩＩａ：次いで、ＣＤＲＨ３についてのコドン再配列を伴うドナーｓｓＯＤＮによって促進されるＨＤＲを介して、抗体発現を回復させることができる。Ａ．ＩＩｂ：縮重ｓｓＯＤＮのＨＤＲ取込みを介したｓＡｂカセットのＣＤＲＨ３へのさらなる遺伝的多様性の付加（ＮＮＫランダム化）。ソート結果：左上：Ａ１上パネル； 右上：Ａ１下パネル（＝Ａ．ＩＩａ／ｂ上パネル）； 左下：Ａ．ＩＩａ下パネル； Ａ．ＩＩｂ下パネル。（Ｂ）ＨＤＲパーセンテージは、蛍光標識された抗原での標識を介して、フローサイトメトリー解析によって評価される。ＨＥＬに対する抗原特異的抗体発現を回復した細胞のパーセンテージを表す。トランスフェクション陽性（ＧＦＰ＋）細胞についてスクリーニングした後のｎ＝２の実験の代表データを示す。１：Ｃａｓ９プラスミド； ２：Ｃａｓ９ ＲＮＰ； ３：Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋改変ｓｓＯＤＮ； ４：Ｃａｓ９細胞＋改変ｓｓＯＤＮ。 ｓｓＯＤＮ誘導性ＨＤＲを最適化し、ＣＤＲＨ３遺伝的多様性を有する合成抗体（ｓＡｂ）ライブラリーを構築するための一般的なワークフローを示す。（Ａ）Ａ．Ｉ：Ｃａｓ９ベクターｐＸ４５８でトランスフェクションした後の、Ｃａｓ９による切断を指示するためのＣＤＲＨ３ ｓｇＲＮＡ部位を有する重鎖遺伝子座におけるＰｎＰ－ＨＥＬ２３ ｓＡｂコンストラクト。Ｃａｓ９誘導性二本鎖切断は、ＮＨＥＪを介した切断部位の近くに挿入／欠失（ＩｎＤｅｌｓ）を導入し、フレームシフト突然変異及び機能不全タンパク質発現を引き起こす。分解図中に示す配列は配列番号１７である。Ａ．ＩＩａ：次いで、ＣＤＲＨ３についてのコドン再配列を伴うドナーｓｓＯＤＮによって促進されるＨＤＲを介して、抗体発現を回復させることができる。Ａ．ＩＩｂ：縮重ｓｓＯＤＮのＨＤＲ取込みを介したｓＡｂカセットのＣＤＲＨ３へのさらなる遺伝的多様性の付加（ＮＮＫランダム化）。ソート結果：左上：Ａ１上パネル； 右上：Ａ１下パネル（＝Ａ．ＩＩａ／ｂ上パネル）； 左下：Ａ．ＩＩａ下パネル； Ａ．ＩＩｂ下パネル。（Ｂ）ＨＤＲパーセンテージは、蛍光標識された抗原での標識を介して、フローサイトメトリー解析によって評価される。ＨＥＬに対する抗原特異的抗体発現を回復した細胞のパーセンテージを表す。トランスフェクション陽性（ＧＦＰ＋）細胞についてスクリーニングした後のｎ＝２の実験の代表データを示す。１：Ｃａｓ９プラスミド； ２：Ｃａｓ９ ＲＮＰ； ３：Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋改変ｓｓＯＤＮ； ４：Ｃａｓ９細胞＋改変ｓｓＯＤＮ。 誘導性ＡＩＤの突然変異活性の評価。（ａ）実験概要。（ＧＦＰ－２Ａを介して）組込まれたＴｅｔＯｎｅ－ＡＩＤに基づいてソートされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞を、Ｄｏｘ（１μｇ／ｍｌ、毎日誘導更新）により７２時間誘導し、ＦＡＣＳで高（未変化）又は低（減少）ｍＲｕｂｙ蛍光に基づいてソートした。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を２つの集団から抽出し、ｍＲｕｂｙ遺伝子をクローン化しサンガーシーケンシングを行った。（ｂ）左から右へ、ＦＡＣＳのプロットを表す：ソート時の細胞（表示されたゲート及びパーセンテージは原型のものではないが、説明目的のために解析後に再現した）。回復後の２つのソートされた集団：ｍＲｕｂｙ高発現に基づいてソートされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ＡＩＤ Ｒｅｄ－ｈｉｇ、及びｍＲｕｂｙ発現減少に基づいてソートされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ＡＩＤ Ｒｅｄ－ｌｏｗ；陽性対照として用いたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞。配列解析のためにゲノムＤＮＡを単離した。（ｃ）配列をｍＲｕｂｙにマッピングし、突然変異の存在を調べた。このグラフは、各サンプルの変異したクローンの割合を示す。「大きな欠失」とは、１ヌクレオチドより大きい欠失を意味する。大きな欠失を有するクローンを産生する唯一のサンプルは、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ＡＩＤ Ｒｅｄ－ｌｏｗであった。棒の上の値は、群における実際の頻度（％変換前）を表す。（ｄ）解析したクローンにおける１ｋｂあたりの突然変異率。４つのサンプル／群のそれぞれについて、全ての解析されたクローンについて配列決定されたヌクレオチド（ｍＲｕｂｙ ＯＲＦのみ、７１１ｂｐ）を合計し、結果的にｋｂ当たりの突然変異したヌクレオチドの頻度を計算した。特に、欠失の場合、欠失した各ヌクレオチドは突然変異したものとして計算された。注：（ｃ）及び（ｄ）で報告されたデータは、単一のｎｔ置換のコード化又は非コード化（サイレント）結果を説明しない。 誘導性ＡＩＤの突然変異活性の評価。（ａ）実験概要。（ＧＦＰ－２Ａを介して）組込まれたＴｅｔＯｎｅ－ＡＩＤに基づいてソートされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞を、Ｄｏｘ（１μｇ／ｍｌ、毎日誘導更新）により７２時間誘導し、ＦＡＣＳで高（未変化）又は低（減少）ｍＲｕｂｙ蛍光に基づいてソートした。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を２つの集団から抽出し、ｍＲｕｂｙ遺伝子をクローン化しサンガーシーケンシングを行った。（ｂ）左から右へ、ＦＡＣＳのプロットを表す：ソート時の細胞（表示されたゲート及びパーセンテージは原型のものではないが、説明目的のために解析後に再現した）。回復後の２つのソートされた集団：ｍＲｕｂｙ高発現に基づいてソートされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ＡＩＤ Ｒｅｄ－ｈｉｇ、及びｍＲｕｂｙ発現減少に基づいてソートされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ＡＩＤ Ｒｅｄ－ｌｏｗ；陽性対照として用いたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞。配列解析のためにゲノムＤＮＡを単離した。（ｃ）配列をｍＲｕｂｙにマッピングし、突然変異の存在を調べた。このグラフは、各サンプルの変異したクローンの割合を示す。「大きな欠失」とは、１ヌクレオチドより大きい欠失を意味する。大きな欠失を有するクローンを産生する唯一のサンプルは、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ＡＩＤ Ｒｅｄ－ｌｏｗであった。棒の上の値は、群における実際の頻度（％変換前）を表す。（ｄ）解析したクローンにおける１ｋｂあたりの突然変異率。４つのサンプル／群のそれぞれについて、全ての解析されたクローンについて配列決定されたヌクレオチド（ｍＲｕｂｙ ＯＲＦのみ、７１１ｂｐ）を合計し、結果的にｋｂ当たりの突然変異したヌクレオチドの頻度を計算した。特に、欠失の場合、欠失した各ヌクレオチドは突然変異したものとして計算された。注：（ｃ）及び（ｄ）で報告されたデータは、単一のｎｔ置換のコード化又は非コード化（サイレント）結果を説明しない。 誘導性ＡＩＤの突然変異活性の評価。（ａ）実験概要。（ＧＦＰ－２Ａを介して）組込まれたＴｅｔＯｎｅ－ＡＩＤに基づいてソートされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞を、Ｄｏｘ（１μｇ／ｍｌ、毎日誘導更新）により７２時間誘導し、ＦＡＣＳで高（未変化）又は低（減少）ｍＲｕｂｙ蛍光に基づいてソートした。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を２つの集団から抽出し、ｍＲｕｂｙ遺伝子をクローン化しサンガーシーケンシングを行った。（ｂ）左から右へ、ＦＡＣＳのプロットを表す：ソート時の細胞（表示されたゲート及びパーセンテージは原型のものではないが、説明目的のために解析後に再現した）。回復後の２つのソートされた集団：ｍＲｕｂｙ高発現に基づいてソートされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ＡＩＤ Ｒｅｄ－ｈｉｇ、及びｍＲｕｂｙ発現減少に基づいてソートされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ＡＩＤ Ｒｅｄ－ｌｏｗ；陽性対照として用いたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞。配列解析のためにゲノムＤＮＡを単離した。（ｃ）配列をｍＲｕｂｙにマッピングし、突然変異の存在を調べた。このグラフは、各サンプルの変異したクローンの割合を示す。「大きな欠失」とは、１ヌクレオチドより大きい欠失を意味する。大きな欠失を有するクローンを産生する唯一のサンプルは、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ＡＩＤ Ｒｅｄ－ｌｏｗであった。棒の上の値は、群における実際の頻度（％変換前）を表す。（ｄ）解析したクローンにおける１ｋｂあたりの突然変異率。４つのサンプル／群のそれぞれについて、全ての解析されたクローンについて配列決定されたヌクレオチド（ｍＲｕｂｙ ＯＲＦのみ、７１１ｂｐ）を合計し、結果的にｋｂ当たりの突然変異したヌクレオチドの頻度を計算した。特に、欠失の場合、欠失した各ヌクレオチドは突然変異したものとして計算された。注：（ｃ）及び（ｄ）で報告されたデータは、単一のｎｔ置換のコード化又は非コード化（サイレント）結果を説明しない。 誘導性ＡＩＤの突然変異活性の評価。（ａ）実験概要。（ＧＦＰ－２Ａを介して）組込まれたＴｅｔＯｎｅ－ＡＩＤに基づいてソートされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞を、Ｄｏｘ（１μｇ／ｍｌ、毎日誘導更新）により７２時間誘導し、ＦＡＣＳで高（未変化）又は低（減少）ｍＲｕｂｙ蛍光に基づいてソートした。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を２つの集団から抽出し、ｍＲｕｂｙ遺伝子をクローン化しサンガーシーケンシングを行った。（ｂ）左から右へ、ＦＡＣＳのプロットを表す：ソート時の細胞（表示されたゲート及びパーセンテージは原型のものではないが、説明目的のために解析後に再現した）。回復後の２つのソートされた集団：ｍＲｕｂｙ高発現に基づいてソートされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ＡＩＤ Ｒｅｄ－ｈｉｇ、及びｍＲｕｂｙ発現減少に基づいてソートされたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ＡＩＤ Ｒｅｄ－ｌｏｗ；陽性対照として用いたＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞。配列解析のためにゲノムＤＮＡを単離した。（ｃ）配列をｍＲｕｂｙにマッピングし、突然変異の存在を調べた。このグラフは、各サンプルの変異したクローンの割合を示す。「大きな欠失」とは、１ヌクレオチドより大きい欠失を意味する。大きな欠失を有するクローンを産生する唯一のサンプルは、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ＡＩＤ Ｒｅｄ－ｌｏｗであった。棒の上の値は、群における実際の頻度（％変換前）を表す。（ｄ）解析したクローンにおける１ｋｂあたりの突然変異率。４つのサンプル／群のそれぞれについて、全ての解析されたクローンについて配列決定されたヌクレオチド（ｍＲｕｂｙ ＯＲＦのみ、７１１ｂｐ）を合計し、結果的にｋｂ当たりの突然変異したヌクレオチドの頻度を計算した。特に、欠失の場合、欠失した各ヌクレオチドは突然変異したものとして計算された。注：（ｃ）及び（ｄ）で報告されたデータは、単一のｎｔ置換のコード化又は非コード化（サイレント）結果を説明しない。
用語及び定義
本明細書の文脈において、配列同一性及び配列同一性のパーセンテージという用語は、２つの整列した配列を比較することによって決定される値を指す。比較のための配列のアラインメントのための方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列のアラインメントは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のグローバルアラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４ （１９８８）の類似検索法又は、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって行われ、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。
アミノ酸配列の比較のための一例としては、デフォルト設定を用いるＢＬＡＳＴＰアルゴリズムがある：期待値：１０； ワードサイズ：３； クエリ範囲での最大一致：０； マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２； ギャップコスト：存在１１、拡張１； 構成調整：条件付き構成スコアマトリクス調整。核酸配列の比較のためのそのような一例は、デフォルト設定を用いるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムである：期待閾値：１０； ワードサイズ：２８； クエリ範囲での最大一致：０； マッチ／ミスマッチスコア：１．－２； ギャップコスト：リニア。他に記載がない限り、本明細書で提供される配列同一性値は、タンパク質及び核酸比較のための上記の既定のパラメーターをそれぞれ用いて、ＢＬＡＳＴプログラム群（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））を用いて得られた値を指す。
本明細書の文脈において、用語「Ｂ細胞」は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えによって免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座のゲノム再編成を完了したリンパ系統の細胞を指す。
本明細書の文脈において、用語「ＩｇＨ遺伝子座」は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座を指す。
本明細書の文脈において、用語「部位特異的エンドヌクレアーゼ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びメガヌクレアーゼからなる群から選ばれるエンドヌクレアーゼを指す。
本明細書の文脈において、「ＣＲＩＳＰＲ介在エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）」という用語は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐｙＣａｓ９）のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、ＳｐｙＣａｓ９の相同分子種、又はＳｐｙＣａｓ９もしくはその相同分子種の改変タンパク質変異体を指す。
本明細書の文脈において、用語「相同分子種」は、単一の祖先遺伝子からの直系で進化した遺伝子及びその対応するポリペプチドを指す。言い換えれば、相同分子種遺伝子／ポリペプチドは共通の祖先を共有し、ある種が２つの別々の種に分かれたときに分離した。その後、生じた２種における単一の遺伝子のコピーを相同分子種と称する。２つの遺伝子が相同分子種であることを確かめるために、当業者は、遺伝子又はポリペプチドの整列したヌクレオチド又はアミノ酸配列を比較することによって、遺伝子系統の系統発生分析を行うことができる。
本明細書の文脈において、抗体という用語は、細胞生物学及び免疫学の分野で知られているその意味で使用される；Ｇ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ型）、Ｅ型（ＩｇＥ型）又はＭ型（ＩｇＭ型）の免疫グロブリンを含むが、これに限定されない全抗体を意味し、任意の抗原結合フラグメント又はその単鎖、及び関連する又は誘導されたコンストラクトを含む。全抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を介在し得る。
本明細書の文脈における抗体様分子という用語は、高い親和性（ｋｄ≦１０Ｅ－８ｍｏｌ／Ｌ）で別の分子又は標的に特異的に結合することができる分子を指す。抗体様分子は、抗体の特異的結合と同様にその標的に結合する。抗体様分子という用語は、例えば設計されたアンキリンリピートタンパク質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｚuｒｉｃｈ）アルマジロリピートタンパク質に由来するポリペプチド、ロイシンリッチリピートタンパク質に由来するポリペプチド、及びテトラリコペプチドリピートタンパク質に由来するポリペプチドのようなリピートタンパク質を包含する。抗体様分子という用語は、プロテインＡドメインに由来するポリペプチド（プロテインＡドメイン由来ポリペプチド）、フィブロネクチンドメインＦＮ３に由来するポリペプチド、コンセンサスフィブロネクチンドメインに由来するポリペプチド、リポカリンに由来するポリペプチド、ジンクフィンガーに由来するポリペプチド、Ｓｒｃ相同ドメイン２（ＳＨ２）に由来するポリペプチド、Ｓｒｃ相同ドメイン３（ＳＨ３）に由来するポリペプチド、ＰＤＺドメインに由来するポリペプチド、γ－クリスタリン由来のポリペプチド、ユビキチン由来のポリペプチド、システインノットポリペプチド由来のポリペプチド、及びノッティン由来のポリペプチドをさらに包含する。
用語「プロテインＡドメイン由来ポリペプチド」は、プロテインＡの誘導体であり、免疫グロブリンのＦｃ領域及びＦａｂ領域に特異的に結合することができる分子を指す。
アルマジロリピートタンパク質という用語は、少なくとも１つのアルマジロリピートを含むポリペプチドを指し、アルマジロリピートは、ヘアピン構造を形成するαヘリックスの対によって特徴付けられる。
本明細書の文脈におけるヒト化ラクダ科動物抗体という用語は、重鎖又は重鎖の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）のみからなり、そのアミノ酸配列がヒトにおいて天然に産生される抗体との類似性を増加させるように改変された抗体を指し、したがって、ヒトに投与した場合、免疫原性の低下が示される。ラクダ抗体をヒト化するための一般的な戦略は、Ｖｉｎｃｋｅら “Ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｈｕｍａｎｉｚｅ ａ ｃａｍｅｌｉｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｎａｎｏｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄ”， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００９ Ｊａｎ ３０；２８４（５）：３２７３－３２８４， ａｎｄ ＵＳ２０１１１６５６２１Ａ１．に示されている。
本明細書の文脈において、結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）領域という用語は、細胞生物学及び免疫学の分野で知られているその意味で使用される；それは、ジスルフィド結合によって共有結合されたＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む２つの同一の重鎖フラグメントを含む抗体の画分を指す。
本明細書で使用される用語のさらなる定義は、必要に応じて文書全体を通して与えられる。
発明の概要
本発明の第１の態様によれば、細胞株の生成方法であって、
ａ．複数の哺乳類Ｂ細胞を提供し、複数のＢ細胞の各々は、マーカータンパク質をコードする遺伝子組換えゲノムＤＮＡ配列を含み、遺伝子組換えゲノムＤＮＡ配列が前記Ｂ細胞に含まれる内因性免疫グロブリン遺伝子座、特にＩｇＨ遺伝子座に挿入され、前記遺伝子組換えゲノムＤＮＡ配列は部位特異的ヌクレアーゼ、特にＣＲＩＳＰＲ介在エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）による切断に適する工程、
ｂ．前記マーカータンパク質をコードする前記遺伝子組換えゲノムＤＮＡ配列を、目的タンパク質をコードする第２の遺伝子組換えＤＮＡ配列で置換する工程、
ｃ．前記マーカータンパク質の存在又は非存在に基づいて前記Ｂ細胞をソートする工程、及び
ｄ．前記マーカータンパク質が存在しないＢ細胞を回収する工程
を含む方法を提供する。
特定の実施形態では、マーカータンパク質は蛍光タンパク質である。
特定の実施形態では、マーカータンパク質は、抗生物質薬物に対する耐性を付与するタンパク質である。
特定の実施形態では、前記マーカータンパク質は蛍光タンパク質であり、前記ソートはフローサイトメトリーによって行われる。
本明細書の文脈において、「前記マーカータンパク質をコードする前記遺伝子組換えゲノムＤＮＡ配列を、目的タンパク質をコードする第２の遺伝子組換えＤＮＡ配列で置換する」という表現は、マーカータンパク質はもはや発現されず、目的タンパク質が代わりに発現されるように、実際にＤＮＡ配列が置換され、機能的にも置換されることを示す。
当業者であれば、「（マーカータンパク質をコードする）前記遺伝子組換えゲノムＤＮＡ配列は部位特異的ヌクレアーゼによる切断に適する」という表現が、マーカータンパク質をコードするＤＮＡ配列内の切断及び、直近の３’及び／又は５’隣接領域内の切断のいずれもを含むことを認識する。
特定の実施形態では、前記遺伝子組換えゲノム配列は、５’隣接配列領域及び３’隣接配列領域と隣接し、前記５’隣接配列領域及び／又は前記３’隣接配列領域は、部位特異的ヌクレアーゼによる切断に適する。
特定の実施形態では、前記隣接配列領域は、０～１５００ヌクレオチド、特に０ヌクレオチド又は１～７００ヌクレオチド、さらに特に０ヌクレオチド又は１～１００ヌクレオチドから成る。部位特異的ヌクレアーゼ、特にＣａｓ９による切断を受けやすい部位は、典型的には、マーカータンパク質をコードする配列から５００ヌクレオチド以内又はマーカータンパク質をコードする配列内にある。
特定の実施形態では、目的タンパク質は、抗体、抗体様分子、ヒト化ラクダ科動物抗体又は免疫グロブリン抗原結合フラグメントである。後に挿入される目的遺伝子が抗体である場合、内因性免疫グロブリンＶＨ遺伝子は、マーカータンパク質をコードする組換えゲノムＤＮＡ配列によって置換又は破壊される。
本明細書の文脈において、「ＶＨ遺伝子」という用語は、免疫グロブリン重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を指す。
本明細書の文脈において、「ＶＬ遺伝子」という用語は、免疫グロブリン軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を指す。
特定の実施形態では、複数のＢ細胞は、プライマリーＢ細胞、不死化Ｂ細胞、ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、形質細胞腫細胞及びリンパ腫細胞を含む群から選択される。
特定の実施形態では、マーカータンパク質及び／又は目的タンパク質は、内因性免疫グロブリンプロモーター、特にＶＨプロモーターの制御下で発現される。
本明細書の文脈において、用語「ＶＨプロモーター」は、「ＶＨ遺伝子」のプロモーターを指す。
特定の実施形態では、内因性ＶＨ遺伝子及び内因性ＶＬ遺伝子は、前記複数のＢ細胞のそれぞれにおいて破壊される。これは、Ｂ細胞が免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖のいずれも発現できないことを意味する。
特定の実施形態において、複数のＢ細胞は、前記ＣＲＩＳＰＲ介在エンドヌクレアーゼを構成的に発現するように遺伝子改変される。
特定の実施形態では、複数のＢ細胞は、誘発可能かつ調整可能な手段で活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を発現するように遺伝子改変される。
本明細書の文脈において、「活性化誘導型シチジンデアミナーゼ」という用語は、ゲノムＤＮＡ内のシトシン塩基を脱アミノ化して、それらをウラシル（ＥＣ ３．５．４．３８）に変換することができる酵素を指す。
特定の実施形態では、複数のＢ細胞はセーフハーバー遺伝子座を含み、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の発現カセットが前記セーフハーバー遺伝子座に挿入される。
本明細書の文脈において、用語「セーフハーバー遺伝子座」は、導入遺伝子の組込みに適した染色体位置を指す。セーフハーバー遺伝子座に組込まれた導入遺伝子は、安定して発現され、内因性遺伝子の活動を乱さない。セーフハーバー遺伝子座の例は、マウスＲｏｓａ２６遺伝子座又はＡＡＶＳ１遺伝子座である。
特定の実施形態では、前記セーフハーバー遺伝子座に挿入されたＣＲＩＳＰＲ介在エンドヌクレアーゼは、構成的活性型プロモーター、特にＣＡＧプロモーター、ＣＢｈプロモーター、又はＣＭＶプロモーターの制御下にある。ＣＡＧプロモーターは、ニワトリβ－アクチンプロモーター（Ｊｕｎ－ｉｃｈｉら、Ｇｅｎｅ ７９（２）：２６９－２７７）に融合したサイトメガロウイルスエンハンサーからなるハイブリッドコンストラクトである。ＣＢｈプロモーターは、ＣＢＡ（ニワトリβ－アクチン）プロモーターのハイブリッド型である（Ｇｒａｙら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ。、２０１１，２２（９）：１１４３－１１５３）。「ＣＭＶプロモーター」という用語は、ヒトヘルペスウイルス５ Ｔｏｌｅｄｏ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＧＵ９３７７４２．２）のようなヒトヘルペスウイルスのヒトサイトメガロウイルス前初期エンハンサー及びプロモーター配列を指す。例示的なＣＭＶ配列は、参照番号Ｘ０３９２２．１、Ｍ６４９４０．１、Ｍ６４９４１．１、Ｍ６４９４２．１、Ｍ６４９４３．１、Ｍ６４９４４．１及びＫ０３１０４．１でＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。
特定の実施形態では、複数のＢ細胞はセーフハーバー遺伝子座を含み、前記活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）をコードするＤＮＡ配列を含む第２の発現カセットが前記セーフハーバー遺伝子座に挿入される。
特定の実施形態では、第２の発現カセットは、活性化因子分子による誘導性活性化に適した調節配列を含む。
特定の実施形態では、第２の発現カセットは、誘導性発現系、特にＴｅｔ－Ｏｎｅ誘導性発現系を含む。Ｔｅｔ－Ｏｎｅ誘導性発現系は、転写活性化タンパク質（Ｔｅｔ－Ｏｎ）及び誘導性プロモーター（ＰＴＲＥ３ＧＳ）を含む。抗生物質ドキシサイクリンの存在下で、Ｔｅｔ－ＯｎはＰＴＲＥ３ＧＳのｔｅｔＯ配列に結合し、プロモーターの下流遺伝子、すなわち活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）をコードする遺伝子の高レベルの転写を活性化する。ドキシサイクリン濃度が低下すると、発現が減少し、ＡＩＤ発現及び体細胞超変異の調整可能な系が生成される。
本明細書の文脈において、「体細胞超変異（ＳＨＭ）」という用語は、複数のゲノム突然変異が生成される細胞機構を指す。ＳＨＭは、酵素活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）によるＤＮＡ中のシトシンのウラシルへの脱アミノ化を含む。得られた塩基対のミスマッチ（ウラシル －グアノシン、Ｕ：Ｇ）は、ゲノム突然変異を引き起こすことができ、例えば、変異性ＤＮＡポリメラーゼによるウラシル塩基の除去及びギャップの補充を介して、又はウラシルがチミジンとして処理される際のＤＮＡ複製を介して行われる。
本明細書の文脈において、「誘導性合成体細胞超変異（ｉＳＳＨＭ）」という用語は、誘導性発現系からのＡＩＤ発現の活性化によって前記複数のＢ細胞において誘導され得るＳＨＭを指す。
特定の実施形態では、前記遺伝子組換えゲノムＤＮＡ配列の前記置換は、Ｃａｓ９介在性部位特異的ＤＮＡ切断及び、その後の相同性指向修復（ＨＤＲ）又は非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）による前記第２の遺伝子組換えＤＮＡ配列の組込みによって介在される。この方法はガイドＲＮＡ及び置換ＤＮＡを提供することを含む。
本明細書の文脈において、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡは、Ｃａｓ９結合に必要な配列と、改変されるべきゲノム標的を定義する約２３ヌクレオチドのユーザー定義の「標的配列」とからなる短い合成ＲＮＡである（表２参照）。
そのようなガイドＲＮＡは、インビトロで転写されたＲＮＡ又は市販の合成オリゴヌクレオチドＲＮＡのトランスフェクションによって提供することができる。あるいは、ガイドＲＮＡは、細胞へのＤＮＡ配列のトランスフェクション又はウイルス形質導入によって提供することができ、そのようなＤＮＡ配列は、ガイドＲＮＡをコードする（及び細胞内で発現する）。ＩｇＨ遺伝子座における複数のゲノム部位の同時切断のために、複数のガイドＲＮＡが提供され得る（これは導入遺伝子挿入の効率を改善する）。
置換ＤＮＡは、目的タンパク質をコードする前記第２の遺伝子組換えＤＮＡ配列を含む。置換ＤＮＡは、環状又は線状のいずれかの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、又は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（例えば、オリゴヌクレオチド）のトランスフェクション又はウイルス形質導入によって提供することができる。
本発明のこの態様の特定の実施形態では、前記目的タンパク質は全長抗体である。全長抗体は、合成抗原結合フラグメント（ｓＦＡｂ）コンストラクトに基づくことができる。免疫グロブリン重鎖遺伝子座及び免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の両方の標的化を回避しながら新しい全長抗体を再導入するために、全長軽鎖及び重鎖のいずれもを一本鎖転写物として野生型ＶＨプロモーターから発現させることができる（図２Ｂ）。
特定の実施形態では、複数のＢ細胞はマウスハイブリドーマ細胞である。
特定の実施形態では、複数のＢ細胞はマウスハイブリドーマ細胞であり、マウスＣＨ領域は異なる種のＣＨ領域、特にヒトＣＨ領域で置換される。これは、マウスハイブリドーマ細胞によるヒト抗体の生成を可能にする。
本明細書の文脈において、「ＣＨ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするＤＮＡ配列を指す。
本発明のこの態様の特定の実施形態では、前記第２の遺伝子組換え核酸配列は、１つ以上の目的遺伝子及び追加のプロモーターを含む。このようにして、本発明の方法によって、複数の遺伝子又は合成遺伝子ネットワーク全体を安定して発現する細胞株を生成することができる。
安定した哺乳類細胞からの組換えタンパク質発現のための現在の技術的方法は、開発するために少なくとも８～１０週間を要し、商業的実体において１つのタンパク質当たり１０，０００ＵＳドル以上の費用がかかる。産業的な治療目的のための安定な細胞株の生成には最大で１年間かかる。
通常、タンパク質産生の効率の変動により、複数クローンの解析が必要となる。遺伝子サイレンシングがいくつかの組込み部位で経時的に起こることが知られているため、クローンの生産性に影響を及ぼす要因は、組込み数及び組込み部位である。
本発明の第２の態様によれば、タンパク質変異体のライブラリーの生成方法が提供される。この方法は、本発明の第１の態様又は上記の実施形態のいずれかに従う方法、続いて、（ドナーｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡ上のランダム化領域を通じて）ランダム化された核酸配列で遺伝子組換えＤＮＡの領域を改変するさらなる工程を含む。その後、部位特異的突然変異誘発による目的タンパク質内のゲノム突然変異が生成される。
本発明のこの態様の代替法によれば、タンパク質変異体のライブラリーを生成する方法は、本発明の第１の態様による方法又は上記の態様のいずれかを含み、その後に
ａ．活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）の発現を誘導し、その後、誘導性合成体細胞超変異（ｉＳＳＨＭ）によって目的タンパク質内に複数のゲノム突然変異を生成し、又は
ｂ．前記遺伝子組換えＤＮＡの領域をランダム化された核酸配列で改変し、その後、部位特異的突然変異誘発により目的タンパク質内にゲノム突然変異を生成する工程を含む。
本発明の第３の態様によれば、タンパク質変異体のライブラリーの生成方法が提供される。この方法は、本発明の第１の態様による方法を含み、続いて、活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）の発現を誘導するさらなる工程により、その後、誘導性合成体細胞超変異（ｉＳＳＨＭ）による目的タンパク質内の複数のゲノム突然変異を生成する。
ＡＩＤは、免疫グロブリン（ＩｇＨ、ＩｇＫ又はＩｇＬ）遺伝子座内で突然変異を生成するのに特に有効である。したがって、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列が免疫グロブリン遺伝子座、例えばＩｇＨ遺伝子座に挿入されることは、ｉＳＳＨＭにとって有利である。
特定の実施形態では、遺伝子組換えゲノムＤＮＡ配列の前記領域の前記改変は、Ｃａｓ９介在性部位特異的ＤＮＡ切断及び、
ａ．相同性指向修復（ＨＤＲ）又は非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）による前記ランダム化遺伝子組換えＤＮＡ配列のその後の組込み、又は
ｂ．ＮＨＥＪによる遺伝子組換えＤＮＡ配列の修復による塩基のその後の挿入又は欠失
のいずれかによって介在される。
この方法は、本発明の第１の態様と同様の方法でガイドＲＮＡ及び置換ＤＮＡを提供することを含む。ガイドＲＮＡ及びランダム化核酸配列は、縮重ヌクレオチド又はトリヌクレオチドコドンを含むｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡのトランスフェクション又はウイルス形質導入によって提供することができる。ｓｓＤＮＡのＨＤＲ効率を改善するために、ホスホロチオエート結合を５’及び３’末端並びにｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド全体に導入する。ホスホロチオエート結合は、リン酸骨格の非架橋酸素と硫黄原子との交換である。リン酸骨格の硫黄原子は、ヌクレアーゼ分解に対するｓｓＤＮＡの耐性を増加させる。
本明細書の文脈において、「縮重ヌクレオチド」という用語は、任意の混合ヌクレオチド組成物をコードするＤＮＡ配列の箇所を指す。
本明細書の文脈において、「トリヌクレオチド」又は三量体ホスホラミダイトという用語は、任意の混合アミノ酸組成物をコードするＤＮＡ配列の３つの連続したヌクレオチドを指す。
当業者であれば、本発明の第２の態様によるタンパク質変異体のライブラリーの生成が、細胞株のライブラリーの生成を含むことを認識する。
それらの例において、目的タンパク質が抗体である場合、突然変異抗体は、改善された又は新規な抗原結合のためにスクリーニングされる。蛍光標識した抗原を細胞に添加し、細胞をＦＡＣＳによりスクリーニングする。あるいは、抗原に結合した磁気ビーズを使用する磁気関連細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）によって初期スクリーニング工程を実施することができる。いくつかの周期のスクリーニング及びｉＳＳＨＭ又は部位特異的突然変異誘発を実施して、抗体又はタンパク質の改変を継続することができる。
特定の実施形態では、マーカータンパク質は蛍光タンパク質である。非限定的な例として、そのような蛍光タンパク質は、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びその誘導体、例えば以下より選択され得る。
－強化型青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、強化型青色蛍光タンパク質２（ＥＢＦＰ２）、ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ
－強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ｅｍｅｒａｌｄ、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ａｖＧＦＰ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ
－黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、ｃｉｔｒｉｎｅ、 ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ｔｏｐａｚ、ＳＹＦＰ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ
－強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、 ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＳＣＦＰ。
本発明を実施するための蛍光タンパク質はまた、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｔｒｉａｔａ由来の蛍光タンパク質及びその誘導体を含む群から選択され得る：
－ｍＴａｇＢＦＰ、
－ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ｍＴＦＰ１
－Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ２、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＣｏｐＣＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ
－ＴａｇＹＦＰ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＰｈｉＹｆＰ
－Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ－Ｔａｎｄｅｍ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍａｘ、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ
－ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｅｑＦＰ６１１、ｔｄＲＦＰ６１１、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ
－ｔｄＲＦＰ６３９、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｋａｔｕｓｈｋａ、ｔｄＫａｔｕｓｈｋａ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、ＡＱ１４３。
蛍光タンパク質はまた、小超赤色蛍光タンパク質（ｓｍＵＲＦＰ）のようなシアノバクテリアＴｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍのａｌｐｈａ－ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ由来のタンパク質を含む。
当業者であれば、本発明の第１の態様による方法が、上記のリストに含まれていない他の蛍光タンパク質でも機能し得ることを認識する。
本発明の別の態様は、本発明の第１、第２又は第３の態様による方法によって得られる前記Ｂ細胞に含まれる内因性免疫グロブリン遺伝子座に挿入された発現遺伝子組換えゲノムＤＮＡ配列を含むヒトＢ細胞株を提供する。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の第１、第２又は第３の態様による方法によって得られたタンパク質が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の第２又は第３の態様による方法によって得られたタンパク質改変体のライブラリーが提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、哺乳類Ｂ細胞が提供され、
ａ．マーカータンパク質をコードする遺伝子組換えゲノムＤＮＡ配列を、前記Ｂ細胞に含まれる内因性免疫グロブリン遺伝子座、特にＩｇＨ遺伝子座に挿入し、マーカー遺伝子は蛍光タンパク質をコードし、
ｂ．前記遺伝子組換えゲノム配列は、部位特異的ヌクレアーゼ、特にＣＲＩＳＰＲ介在エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）による切断に適する。
本発明のこの態様の特定の実施形態では、前記Ｂ細胞の内因性ＶＨ遺伝子及び内因性ＶＬ遺伝子は破壊される。
特定の実施形態では、哺乳類Ｂ細胞はヒト細胞である。
本発明のさらに別の態様は、それぞれが遺伝子組換えタンパク質の変異体をコードする複数の哺乳類Ｂ細胞と関連する。その全体中の複数は、そのような変異体のライブラリーを構成する。その複数に含まれる複数のＢ細胞の各細胞は、目的タンパク質の変異体をコードする遺伝子組換えゲノムＤＮＡ配列を含む。遺伝子組換えゲノムＤＮＡ配列は、前記Ｂ細胞、特にＩｇＨ遺伝子座に含まれる内因性免疫グロブリン座に挿入され、前記複数の細胞によってコードされる各変異体は、前記複数の別の細胞によってコードされる任意の他の変異体とは区別される。当業者であれば、複数の各細胞が１以上の個別の細胞によって表現される可能性が高いこと、すなわち、クローンのいくつかの細胞が細胞を構成し得ることを理解する。ここで重要な点は、変異体がある細胞においては共通していて、多数（特定の実施形態では、≧１００、≧１０００、≧１０，０００、又は≧１００．０００）の異なる変異体が複数の中に存在し得ることである。
本発明のこの態様の特定の実施形態では、複数のＢ細胞にコードされる各変異体は、そのアミノ酸配列の１～５位において別の変異体と区別される。
本発明のこの態様の特定の実施形態では、各変異体は、前記複数のＢ細胞によってコードされる任意の他の変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一である。言い換えれば、変異体は、個々のＢ細胞間でそれらの配列の重要な部分を共有しながらも非常に広い変異幅を示すことができる。
本発明のこの態様の特定の実施形態において、複数のＢ細胞は、プライマリーＢ細胞、不死化Ｂ細胞、ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、形質細胞腫細胞、及びリンパ腫細胞を含む群から選択される。
単一の分離可能な特徴の代替手段が「実施形態」として本明細書に記載されている場合は、そのような代替手段を自由に組み合わせて、本明細書に開示する本発明の別個の実施形態を形成できることを理解されたい。
本発明は、以下の実施例及び図面によりさらに説明され、それからさらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明することを意図しているが、その範囲を限定するものではない。
本発明を実現するために、本発明者らはｐｌｕｇ－ａｎｄ－（ｄｉｓ）ｐｌａｙ（ＰｎＰ）哺乳類細胞株を生成した。本発明者らは、抗体タンパク質の産生工場として機能するマウスＢリンパ球（ハイブリドーマ細胞）を用いた。
ＰｎＰ細胞株は、以下の要素からなる：
１）ＩｇＨ遺伝子座内の内因性ＶＨ遺伝子は、蛍光タンパク質（ｍＲｕｂｙ、元々はｍＲｕｂｙ２と呼ばれ、Ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ プラスミド＃：４０２６０（Ｌａｍら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１２， ９：１００５－１０１２）に由来する）に置換した。これは、ＷＴハイブリドーマ細胞を、ＶＨ及びＩｇＧ ＣＨ１遺伝子の間のイントロンを標的としたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９プラスミド（ｐＸ４５８）（Ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ プラスミド＃：４８１３８）（Ｃｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３， ３３９：８１９―８２３）でトランスフェクションすることにより行った。さらに、ｍＲｕｂｙ遺伝子及びＷＴハイブリドーマ細胞のＩｇＨ遺伝子座に対応するホモロジーアームからなるドナーＤＮＡコンストラクトを、コトランスフェクションした。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＷＴ細胞のＤＮＡ中の標的とされた２本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し、相同性指向修復（ＨＤＲ）又は非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）のＤＮＡ修復メカニズムを促進し、ＶＨ遺伝子に代わりｍＲｕｂｙ遺伝子の部位特異的な組込みをもたらした。野生型ＩｇＨプロモーターはｍＲｕｂｙの発現に使用された（図１ａ－ｄ）。
２）ＩｇＫ遺伝子座の内因性ＶＬ遺伝子は、軽鎖ノックアウト細胞株を生成するために欠失させた。これは、ＩｇＫ遺伝子座内のＶＬ遺伝子に隣接する２箇所を標的としたｇＲＮＡを有するｐＸ４５８を、（１）に記載した）ハイブリドーマ細胞にトランスフェクションすることによって行った。これにより、ハイブリドーマ細胞においてＶＬ遺伝子が欠失し、内因性軽鎖の発現がノックアウトされた（図１ｅ－ｇ）。得られた細胞をＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞とよぶ。
３）ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞は、新しい抗体を産生する細胞に転換された。これらをＰｎＰ－ＩｇＧ細胞とよぶ。これは、（ＩｇＨ遺伝子座内に組込まれている）ｍＲｕｂｙ遺伝子を標的とするｇＲＮＡを有するｐＸ４５８で、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞をトランスフェクションすることにより行った。さらに、ＩｇＨ遺伝子座に対応するホモロジーアームをともなう合成抗体フラグメント（ｓＦＡｂ）のドナーＤＮＡコンストラクトをコトランスフェクションした。１）と同様、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９はＤＳＢ及びＨＤＲ、又はＮＨＥＪを促進し、それらはＩｇＨ遺伝子座へのｓＦＡｂの組込みを標的とした。この結果、この全長抗体（ＩｇＫ及びＩｇＨ）が１本鎖ＲＮＡ転写物としてＩｇＨ遺伝子座から発現されることが示された（図２）。ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞は、１度のトランスフェクション及び選択の手順により、組換えタンパク質（例えばＰｎＰ－ＩｇＧ）を発現する安定的な哺乳類細胞株に変換し得る（図３及び４）。
４）ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞は、Ｃａｓ９の構成的発現のために改変された（ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－Ｃａｓ９細胞）。これは、Ｒｏｓａ２６のセーフハーバー遺伝子座内の領域を標的としたｇＲＮＡ及びＣａｓ９－２Ａ－ピューロマイシンからなるドナーＤＮＡコンストラクトを有するｐＸ４５８を、構成的活性化プロモーター（例えば、ＣＡＧプロモーター又はＣＭＶプロモーター）の制御下でＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞にトランスフェクションすることにより行った（Ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ プラスミド＃：４８１３９）（Ｐｌａｔｔら、ＣＥＬＬ ２０１４、１５９：４４０－４５５；Ｒａｎら、ＮａｔＰｒｏｔｅｃ ２０１３、８：２２８１－２３０８）。これらの細胞の利点は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９プラスミド（ｐＸ４５８）でトランスフェクションする必要性が除かれていることであり、従って、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ細胞を組換えタンパク質（例えばＰｎＰ－ＩｇＧ）を発現する細胞株に転換するためには、ｇＲＮＡ（インビトロで転写されたもの、又は商業的に合成されたもの）及びドナーコンストラクト（置換ＤＮＡ、例えばｓＦＡｂ）をトランスフェクションすることのみが必要であり、このことは効率を良くする（図５ａ）。
ｇＲＮＡのインビトロ転写は、ｐＸ４５８の設計に従って、Ｔ７プロモーター、ｇＲＮＡをコードするカスタマイズされたスペーサー領域及び転写促進領域からなるテンプレートＤＮＡを用いて行われる。このコンストラクトは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ、ＡＭ１３３４）の鋳型として供され、インビトロ転写の結果、キメラ的な１本鎖ｇＲＮＡが得られた。プロトコルは以下で入手可能である。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｉｏ／ｖｉｅｗ／Ｉｎ－ｖｉｔｒｏ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｏｆ－ｇｕｉｄｅ－ＲＮＡｓ－ｄ４ｗ８ｘｄ？ｓｔｅｐ＝３
５）さらにＨＥＬ（ＰｎＰ－ＨＥＬ２３）に抗原特異的な抗体を発現するＰｎＰ－ＩｇＧ細胞を、ＶＨ遺伝子の相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）において改変し、部位特異的突然変異誘発によりタンパク質変異体の大きなライブラリーを生成した。それにより、抗原親和性や新たな抗原の結合を増大させるためのスクリーニングが可能となった。これは次の方法により行った：
ＰｎＰ－ＨＥＬ２３細胞のｓＦＡｂ遺伝子を、抗体発現をノックアウトするように改変した。ＣＤＲ－Ｈ３を標的とするガイドＲＮＡを含むｐＸ４５８ベクターでこれらの細胞をトランスフェクションすることによって、ＮＨＥＪによる修復を通したヌクレオチドの挿入又は欠失により、抗体の発現をノックアウトする。ヌクレオチドの挿入又は欠失は、フレームシフト突然変異と、その後の遺伝子内に残る下流の全てのアミノ酸の変異とを引き起こす。抗体を発現しない単一細胞クローンをフローサイトメトリーで単離し、増幅することができる。適切なクローン（ＰｎＰ－ＨＥＬ２３－ＩｇＨ－）は表現型及び遺伝子型の解析により選択した。タンパク質変異体のライブラリーは、その後、ランダム化された核酸の組込みを通じて、前記細胞クローンに由来され得る。
抗体の親和性成熟は、ＣＤＲ－Ｈ３を標的とするガイドＲＮＡの提供と、トランスフェクション又はウイルス形質導入によるＤＮＡ置換とにより行った。その置換されたＤＮＡは、各部位とも元のＣＤＲ－Ｈ３に含まれる単一のアミノ酸に対応する３つのランダム化された核酸の領域を含んだ（図１１）。
新しい抗原特異抗体を探索するためのタンパク質ライブラリーは、抗体親和性成熟のために記載された方法と類似した方法でＣＤＲ－Ｈ３を完全に置換することによって生成してもよい。ＣＤＲ－Ｈ３を標的とするガイドＲＮＡと置換ＤＮＡはトランスフェクション又はウイルス形質導入によって提供される。その置換ＤＮＡは、ＣＤＲ－Ｈ３の可変長領域に対応する３～６９のランダム化された核酸を含む領域を有する（図１１）。いずれの例においても、標的抗原に対して機能的な抗体を産生する細胞はフローサイトメトリーによってスクリーニングされ、ソートされる。
６）このｐｌｕｇ－ａｎｄ－（ｄｉｓ）ｐｌａｙ（ＰｎＰ）哺乳類細胞株を、誘導性合成体細胞超変異ｉＳＳＨＭによってタンパク質変異体の大きなライブラリーを生成できるようにさらに改変し、これは指向性進化とハイスループットスクリーニングのために使用可能である（ＰｎＰ－ｉＡＩＤ細胞）。これは次の方法により行った：
ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ２細胞株を、ＲＯＳＡ２６セーフハーバー遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡ及びドナーコンストラクト（置換ＤＮＡ）を含むｐＸ４５８ベクターでトランスフェクションした。ドナーコンストラクトは、次の要素からなるＴｅｔ－Ｏｎｅシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（Ｈｅｉｎｚら、 Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１１、２２：１６６－１７６）を含む（図５ｂ）：
ｉ．順方向に、Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇタンパク質の構成的発現をもたらすヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１（ｈＰＧＫ）プロモーター；
ｉｉ．順方向に、ＶＰ１６活性化領域と接続するｒＴｅｔＲの融合タンパク質（ｒｔＴＡ）であるＴｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ転写活性化タンパク質のコード配列；
ｉｉｉ．逆方向に、改変されたｔｅｔ応答要素（ＴＲＥ）及び最小のＣＭＶプロモーターに結合したＴＥＴオペレーターの７つの直接重複配列を含む、ＰＴＲＥ３Ｇの改変版であるＰＴＲＥ３ＧＳ誘導プロモーター；
ｉｖ．その発現がＰＴＲＥ３ＧＳプロモーターにより制御され、以下をコードするＤＮＡ配列を含む目的遺伝子（ＧＯＩ）：
ｉ．蛍光性レポータータンパク質（例えば、ＧＦＰ又は青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ））；
ｉｉ．「自己切断型」２Ａペプチド；
ｉｉｉ．活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）；
ｖ．ＲＯＳＡ２６遺伝子座に対応するホモロジーアーム（＞５００ ｂｐ）。
代わりに、ホモロジーアームのないドナーコンストラクトを使用可能である。これらの例では、ＮＨＥＪによってドナーコンストラクトを組込むことができる。
代替方法においては、ＰｎＰ－ｉＡＩＤ細胞株の生成のための開始基盤としてＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－Ｃａｓ９細胞が使用された。この例では、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－Ｃａｓ９細胞は、Ｒｏｓａ２６のセーフハーバー遺伝子座内の直交部位を標的としたｇＲＮＡのインビトロ転写産物及びドナーコンストラクト（置換ＤＮＡ）でトランスフェクションした。ドナーは前記４）と同じ要素を含む。
代替方法においては、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－Ｃａｓ９細胞は、マウスの野生型ＡＩＤゲノム遺伝子座を標的とするｇＲＮＡのインビトロ転写物でトランスフェクションした。この場合、ドナーコンストラクトは前記４）と同じ要素からなるが、ｉｖ）のうち活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）をコードする遺伝子の第１イントロンが存在するもののみは除かれる（図５ｃ）。
抗生物質ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の存在下では、Ｔｅｔ－ＯｎはＰＴＲＥ３ＧＳの中のｔｅｔＯ配列と結合し、高レベルの転写を活性化する。しかし、Ｄｏｘの量が減少すると、発現は減少し、それによりＡＩＤ発現及びＳＨＭの調整可能な系が作られる。ＰｎＰ－ｉＡＩＤ細胞は、ＩｇＨ遺伝子座のタンパク質変異体の大きなライブラリーを生成するために、Ｄｏｘと共に長時間培養され得る。指向性進化及びタンパク質改変はその後、フローサイトメトリーによるハイスループットスクリーニングによって実施可能である（図５ｄ）。
表１．ハイブリドーマクローンの概要
表２．ｇＲＮＡｓのリスト
この表（配列番号０１～配列番号１８）に列挙された配列は、それぞれのｇＲＮＡの標的配列をコードするＤＮＡ配列を示す。
方法
ハイブリドーマ細胞培養条件
ＷＴハイブリドーマ細胞株（Ｗｅｎ１．３）は、Ａｎｎｅｔｔｅ Ｏｘｅｎｉｕｓ教授（ＥＴＨチューリッヒ）から寄贈されたものである。すべてのハイブリドーマ細胞株を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清［（ＦＢＳ）、Ｔｈｅｒｍｏ、１００８２－１４７］、１００ Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ、１５１４０－１２２）、２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ７５１３）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ、１５６３０－０５６）及び５０μＭ ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ３１４８）を添加した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地［（ＤＭＥＭ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１１９６０－０４４］で培養した。すべてのハイブリドーマ細胞は、温度３７℃及びＣＯ２濃度５％のインキュベーター中で保持された。ハイブリドーマは、典型的には、Ｔ－２５フラスコ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＮＣ－１５６３６７）中の１０ｍｌの培地中に保持され、４８／７２時間ごとに継代された。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的コンストラクトのクローニング及び組立て
特に明記しない限り、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９プラスミド及びＨＤＲドナーコンストラクトのクローニングは、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ、Ｅ２６１１Ｓ）（Ｇｉｂｓｏｎら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９，６：３４３－３４５）によるＧｉｂｓｏｎアセンブリ及びクローニングによって行った。必要に応じて、ＧｉｂｓｏｎアセンブリクローニングのためのフラグメントをＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ［ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＫＡＰＡ）、ＫＫ２６０２］で増幅した。すべてのｇＲＮＡは、標準的な脱塩により精製された一本鎖５’－リン酸化オリゴヌクレオチドとしてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）社より入手した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９実験の基礎は、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇからの贈与物として得られたプラスミドｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ＧＦＰ（ｐＸ４５８）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４８１３８）に依存していた（Ｒａｎら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２０１３、８： ２３０８）。ＧＦＰ（ｅＧＦＰ変異体）をＢＰＦ（ＴａｇＢＦＰ変異体）に置換することにより、ｐＸ４５８の代替バージョンを生成した（ｐＸ４５８．２又はｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ＢＦＰ）。ｇＲＮＡをクローニングするために、両バージョンのｐＸ４５８をＢｂｓＩ［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ）、Ｒ０５３９Ｓ］で消化し、ｇＲＮＡオリゴヌクレオチドをＤＮＡ Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｓ）でプラスミドに連結した。ｍＲｕｂｙ（ｍＲｕｂｙ２変異体）の遺伝子は、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｌｉｎからの贈与物であるプラスミドｐｃＤＮＡ３－ｍＲｕｂｙ２（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４０２６０）（Ｌａｍら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１２，９：１００５－１０１２； Ｊｉｎｅｋら、ｅＬｉｆｅ ２０１３、２：ｅ００４７１－ｅ００４７１）に由来した。Ｇｅｎｅｗｉｚから入手したｐＵＣ５７（Ｋａｎ）－ＨＤＲプラスミドに、ＨＤＲドナー（ｍＲｕｂｙ及び抗体コンストラクト）をクローニングした。このベクターは、アノテートされたマウスゲノム配列（ＧＲＣｍ３８）に従ってホモロジーアームを用いて設計された。２Ａ抗体コンストラクトは、合成遺伝子フラグメント（ｇＢｌｏｃｋｓ、ＩＤＴ）として得られた。ＨＤＲドナーベクターを、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＫＫ２６０２）を用いたＰＣＲによって線状化した。ＨＤＲドナーの全てのプラスミド及び線状版、並びにｐＸ４５８及びｐＸ４５８－ＢＦＰは、最終精製工程としてエタノール沈殿した。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９コンストラクトによるハイブリドーマトランスフェクション
ハイブリドーマ細胞を、プログラムＣＱ－１０４を有するＳＦ細胞株４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）ＸキットＬ（Ｌｏｎｚａ、Ｖ４ＸＣ－２０２４）を用いて４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システム（Ｌｏｎｚａ）でトランスフェクションした。細胞を以下のように調製した：１０６個の細胞を取り、９０×Ｇで５分間遠心分離し、１ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ、３１９８５－０６２）で洗浄し、そして同条件で再度遠心分離した。最終的に、ＳＦバッファーで希釈したベクターを含む総容量１００μｌのヌクレオフェクション混合物に細胞を再懸濁した（キットメーカーガイドラインによる）。ＶＨ遺伝子座の交換のために、ｇＲＮＡ－Ｅ（ＶＨを標的とする）又はｇＲＮＡ－Ｊ（ｍＲｕｂｙを標的とする）を有する５μｇのｐＸ４５８（又はｐＸ４５８－ＢＦＰ）及び、５μｇの環状又は線状化ＨＤＲドナーコンストラクトを、細胞にヌクレオフェクションした。ＶＬを欠損させるために、ｇＲＮＡ－Ｆ及びｇＲＮＡ－Ｈを有するｐＸ４５８をそれぞれ５μｇ、細胞にコトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を、典型的には、２４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ、ＮＣ－１４２４７５）中の１ｍｌの増殖培地で培養した。著しい細胞増殖が観察された場合、２４時間後に０．５－１．０ｍｌの新鮮な増殖培地を細胞に補充した。選別後、典型的にはトランスフェクションの４８時間後、細胞を２４ウェルプレートに回収し、増殖後に６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ、ＮＣ－１４０６７５）及びＴ－２５フラスコに徐々に移動させた。ＶＨをｍＲｕｂｙに置き換えた後、細胞を、Ｕ底９６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ０８１２）中で１００μｌの回収容量で単一細胞分離した。最終的にクローンは２４ウェルプレート、６ウェルプレート及びＴ－２５フラスコで増殖させた。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的のゲノム解析及び転写解析
ハイブリドーマ細胞株のゲノムＤＮＡを典型的には１０６個の細胞から回収し、遠心分離（２５０×Ｇ、５分）によりＰＢＳで洗浄し、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＴＭ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、ＱＥ０９０５０）に再懸濁した。次いで、細胞を６８℃で１５分間、９５℃で８分間インキュベートした。転写解析のために、全ＲＮＡを１０６～５×１０６個の細胞から単離した。細胞をＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ、１５５９６－０２６）で溶解し、全ＲＮＡをＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌＴＭ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｒ２０５２）で抽出した。Ｍａｘｉｍａ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ、ＥＰ０７４２）を、全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成に使用した（Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｗｉｔｈ ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（登録商標） Ｂｕｆｆｅｒ， ＮＥＢ， Ｍ０２６７Ｓ）。下流のＰＣＲ反応の鋳型として、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの両方を用いた。ＷＴ ＩｇＨ及びＩｇＫ遺伝子座並びにｍＲｕｂｙを標的とするｇＲＮＡを、最初にＮＨＥＪの３０回の誘導によってその活性について試験した。標的フラグメントをＫＡＰＡ２Ｇ Ｆａｓｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（ＫＡＰＡ、ＫＫ５１２１）を用いたＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ産物をＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼで消化してミスマッチを検出した（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ突然変異検出キット、ＩＤＴ、７０６０２０）。ＨＤＲ評価のために、ホモロジーアームの内側及び外側に結合するプライマーを用いてゲノム及びｃＤＮＡについてＰＣＲを行い、続いてＤＮＡアガロースゲルでフラグメントサイズ分析を行った。選択されたＰＣＲ産物をサンガーシーケンシングに供した。
ハイブリドーマのフローサイトメトリー解析及びソート
フローサイトメトリーに基づく解析及び細胞単離を、それぞれＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）及びＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（商標） ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。トランスフェクションの２４時間後、約１００μｌの細胞を採取し、２５０ｘＧで５分間遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁し、（２Ａ－ＧＦＰ／－ＢＦＰを介して）Ｃａｓ９の発現について解析した。トランスフェクションの４８時間後、全てのトランスフェクションされた細胞を採取し、ソーティングバッファー（ＳＢ）：２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＢＳＡを添加したＰＢＳ）に再懸濁した。標識が必要な場合、細胞をＰＢＳで洗浄し、氷上で３０分間標識抗体又は抗原とともにインキュベートし、光から保護し、ＰＢＳで再度洗浄し、解析又はソートした。標識試薬及び作業濃度は、以下の表３に記載されている。１０６個とは異なる細胞数の場合には、抗体／抗原及びインキュベーション容量を比例的に調節した。
表３．フローサイトメトリー標識試薬とそれらの作業濃度
ＥＬＩＳＡ法による抗体分泌の測定
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて、ハイブリドーマ細胞株からのＩｇＧの分泌を測定した。ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、１００１０－０１５）中で４μｇ／ｍｌの濃度としたＶｋ軽鎖に特異的な捕捉ポリクローナル抗体（ヤギ抗マウス、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１５－００５－１７４）でプレートを被覆した。２％ｗ／ｖのミルク（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、Ａ０８３０）及び０．０５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、Ａ１３８９）（ＰＢＳＭＴ）を添加したＰＢＳでプレートをブロッキングした。次いで、細胞培養上清（１０６細胞／試料、最小濃度の試料に標準化したもの）を２％ｗ／ｖミルク（ＰＢＳＭ）を添加したＰＢＳ中で、（１：３の比率で）段階希釈した。陽性対照として、精製マウスＩｇＧ２ｂ、κアイソタイプコントロール（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４０１２０２）を５ｎｇ／μｌ（ハイブリドーマ増殖培地で希釈）の開始濃度で使用し、上清として段階希釈した。ブロッキング後、上清及び陽性対照を室温にて１時間又は４℃にて終夜インキュベートし、続いてＴｗｅｅｎ－２０ ０．０５％ｖ／ｖを添加したＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。マウスＦｃ領域に特異的なＨＲＰ標識二次抗体（ヤギ抗マウス、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ２５５４）を使用し、ＰＢＳＭ中で１．７μｇ／ｍｌの濃度とし、続いてＰＢＳＴで３回洗浄した。ＥＬＩＳＡ検出は、ＨＲＰ基質として１－Ｓｔｅｐ ＴＭ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ、３４０２８）を用いて行った。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ ＰＲＯ ＮａｎｏＱｕａｎｔ（Ｔｅｃａｎ）を用いて４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。抗原特異性の測定のために、プレートをＰＢＳ中で濃度４μｇ／ｍｌとした精製鶏卵リゾチーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、６２９７１－１０Ｇ－Ｆ）で被覆した。ブロッキング、洗浄及び上清のインキュベーション工程は、１：５の比の上清の段階希釈を除いて、前述の手順と同様にして行った。０．７μｇ／ ｍｌの濃度としたＶｋ軽鎖特異的ＨＲＰ標識二次抗体（ラット抗マウス、Ａｂｃａｍ、ＡＢ９９６１７）を使用した。ＨＲＰ基質によるＥＬＩＳＡ検出及び吸光度の読み取りは、先に述べたように行った。
ＲＯＳＡ２６遺伝子座の標的化
Ｗｅｎ１．３細胞のマウスセーフハーバー座ＲＯＳＡ２６を増幅し、サンガーシーケンシングを行い、得られた配列を用いてＤＮＡカセットホモロジーアームを設計した。ガイドＲＮＡ標的配列（ｇＲＮＡ－ＬからｇＲＮＡ－Ｐ）は、Ｓｕｒｖｅｒｙｏｒアッセイによって個別に検証された（図７）。この遺伝子座は、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ＡＩＤ、ＰｎＰ－ＩｇＧ－ＡＩＤ及びＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－Ｃａｓ９細胞株の生成の標的となった。ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ＡＩＤ及びＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－Ｃａｓ９細胞株の生成におけるＲＯＳＡ２６の標的化のために、それらの高い切断効率によりｇＲＮＡ－Ｏ及びｇＲＮＡ－Ｐが選択された。
ＡＩＤ細胞株の生成及びドキシサイクリンによる誘導
誘導性ＡＩＤ（ｉＳＳＨＭ）系へのドナーカセットのクローニングを３段階で行った。（１）Ｔｅｔ－Ｏｎｅ（商標）誘導性発現系（６３４３０１）はＴａｋａｒａ Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した；ＧＦＰ－２Ａ－ＡＩＤは、合成遺伝子フラグメント（ｇＢｌｏｃｋｓ、ＩＤＴ）として得て、ＧｉｂｓｏｎアセンブリクローニングによってｐＴｅｔＯｎｅベクターにクローニングした。（２）ハイブリドーマのＲＯＳＡ２６遺伝子座のためのホモロジーアーム（８２９及び８２１ｂｐ）をゲノムＤＮＡ ＰＣＲによって得て、ｐＵＣ５７（Ｋａｎ）プラスミドにクローニングした。（３）最後に、以前にクローニングされた－ポイント（１）参照－Ｔｅｔ－Ｏｎｅ－ＧＦＰ－２Ａ－ＡＩＤコンストラクト（順方向：ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ｈＰＧＫ）、Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ転写活性化タンパク質、及びＳＶ４０ポリＡシグナル；逆方向：ＰＴＲＥ３ＧＳ誘導性プロモーター、ＧＦＰ－２Ａ－ＡＩＤコンストラクト及びＳＶ４０ポリＡシグナルを含む）を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリクローニングによってホモロジーアームの間に挿入した。ＨＤＲドナーを、酵素ＡｊｕＩ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＥＲ１９５１）を用いて制限消化してＰＣＲにより線状化した。以前にｐＸ４５８－ＢＦＰにおいて記載したように、ｇＲＮＡ－Ｏを得てクローニングした。代替のＮＨＥＪ挿入設計として、ＴｅｔＯｎｅ－ＧＦＰ－２Ａ－ＡＩＤコンストラクトは、ホモロジーアームなしで線状化される。ＴｅｔＯｎｅ－ｉＳＳＨＭ系の導入のために改変された細胞株は：ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ｐＡ（ｂＧＨポリＡ鎖を有するＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ）；ＰｎＰ－ＨＥＬ２３－ＩｇＨ－（ＨＣＤＲ３にフレームシフト挿入を有し抗体発現がノックアウトされたＰｎＰ－ＨＥＬ２３－次のセクションを参照）。これらの細胞のためのワークフローを図９と図１０に示す。
ａ．細胞株の生成
トランスフェクション段階から、細胞をＴｅｔフリーＧＭで維持した：米国調達の、Ｔｅｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｐｒｏｖｅｄ ＦＢＳ（Ｔａｋａｒａ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、６３１１０５）を添加した標準増殖培地。ＰｎＰ－ＨＥＬ２３－ＩｇＨ－及びＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ｐＡ細胞を、ｇＲＮＡ－Ｏを有する約２．５μｇ程度までのｐｘ４５８－ＢＦＰ及び２．５μｇの線状化ｐＴｅｔＯｎｅ－ＨＤＲドナーでトランスフェクションした（前のセクションを参照）。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＢＦＰに基づいてソートし、回収のために増殖させた。一旦回収し、系の機能性を検証するため誘導実験を行った。ドキシサイクリン（Ｔａｋａｒａ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、６３１３１１）をヌクレアーゼフリーの水に溶解し１ｍｇ／ｍｌの濃度とし、滅菌濾過し、使用直前の必要時にＴｅｔフリーＧＭで希釈した。１ｎｇ／ｍｌ～２μｇ／ｍｌの範囲の濃度を試し、１μｇ／ｍｌが最も効率的であることが証明された。３７℃での２４時間又は４８時間のインキュベーションにより細胞を誘導したが、２４時間のインキュベーションが最良の結果をもたらし、組込みの陽性及び誘導効率を確認するための主要条件として選択された。
２４時間の誘導後に細胞をソートした：ＧＦＰ陽性集団から、単一細胞クローンを単離し、増殖させ、解析した。Ｄｏｘ誘導後に強陽性のクローンを選択するために第１のスクリーニングを行った：各試料を１μｇ Ｄｏｘ／細胞 １０５個／１ｍｌ培地の条件で播種し、２４時間後にＧＦＰに基づいてスクリーニングした。ゲノムＤＮＡ抽出、遺伝子座特異的増幅及びサンガーシーケンシングのために、最初のスクリーニング段階による最も優れたクローン（ＰｎＰ－ＨＥＬ２３－ＩｇＨ－の９つ、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ｐＡの４つ）を使用した。ゲノム配列によって、各細胞株について１つの最終クローンを選択した。
ｂ．誘導最適化
トランスフェクションされた各細胞株について最良のクローンを選択した後、５００ｎｇ／ｍｌから１．５μｇ／ｍｌの間の濃度で第２のより厳密な調整を行い、異なる時点（理想的には：２４時間； ４８時間 ； ７２時間； ９６時間）で誘導測定した。ドキシサイクリンの半減期が２４時間であるために、製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により推奨された通り、４８時間毎に培地中で置換された。
各時点について、誘導は以下によって評価した：
・ＦＡＣＳ解析（ＧＦＰ）
・ＲＴ－ＰＣＲ（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ）
・ウェスタンブロット
ｃＤＮＡからのＡＩＤの増幅は、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘを用いて行った。ウエスタンブロットでは、Ｈａｌｔ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ、７８４３０）を添加したＭ－ＰＥＲ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、７８５０１）を使用して培養ハイブリドーマ、典型的には細胞１０６個から溶解物を得た。精製抗ヒト／マウス活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１４－５９５９－８０）を、ＷＢによるＡＩＤ検出のための一次抗体として使用した。
ｃ．ｉＳＳＨＭ（ＡＩＤ活性）評価
ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ｐＡ－ＡＩＤ細胞株について、ＦＡＣＳ解析及びｍＲｕｂｙ蛍光の減少の検出によって、超変異活性が最初に評価された。より詳細な評価のために、ｍＲｕｂｙ遺伝子をｃＤＮＡから増幅させ、サンガー法又は次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって分子増幅フィンガープリント法を用いて解析した（図１２）。ＰｎＰ－ＨＥＬ２３－ＩｇＨ－－ＡＩＤ細胞株について、抗ＩｇＧ２Ｃ及び抗ＩｇＫ（ランダム突然変異による任意の陽性）並びにＨＥＬ－６４７（ＨＥＬ陽性の再獲得）を用いて、細胞を標識した後のフローサイトメトリーにより、回復した抗体発現及び／又は抗原特異性を評価した（前のセクションを参照）。系のより詳細な評価及び最適化のために、（２つの出発プラットフォームのいずれかによって得られた）機能性抗体を発現する細胞株に対してｉＳＳＨＭワークフローを繰り返した。このような状態を得るために、ｐＡＰ－ｍＲｕｂｙ－ｐＡ細胞をトランスフェクションしてｍＲｕｂｙをｓＡｂドナーと交換した；ＰｎＰ－ＨＥＬ２３－ＩｇＨ－－ＡＩＤ細胞をトランスフェクションして、ノックアウトされたＨＥＬ２３ ｓＡｂを同じ又は別の特異性を有する機能的なものと交換した；別の状況では、元のＨＣＤＲ３のコドン変異バージョンを含む１２０のｓｓＯＤＮでＨＤＲによってＨＥＬ２３フレームが修復された。以前に試験されたバインダーがない場合、典型的には、既知で試験可能な抗原を有する抗体を、親和性成熟を評価するために選択した。ＰｎＰ－ｓＡｂ－ＡＩＤ細胞株を獲得した後、前述のようにＡＩＤを誘導した（オン）。４８時間から９６時間の誘導後、ドキシサイクリンを系から取り除いた（オフ）。親和性成熟を評価するために、前述のようにＦＡＣＳ標識を行ったが、抗原濃度を減少させて行った（典型的には１－０．００１μｇ／ｍｌ、解析／親和性成熟サイクルの各周期において１０倍の減少）。陽性細胞をソートし、さらなるｉＳＳＨＭサイクルを経た；必要に応じてサイクルを繰り返した。系からのドキシサイクリン除去後の親和性成熟の各段階について、ＦＡＣＳによりＧＦＰ蛍光をモニタリングすることによって有効なスイッチオフを評価した。いったんオフ状態になると、ＶＬ及びＶＨ領域がｃＤＮＡから増幅され、ｉＳＳＨＭは、分子増幅フィンガープリント法を用いてＮＧＳによって評価された。
ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ２－Ｃａｓ９細胞株の生成
Ｃａｓ９タンパク質の構成的発現のためのドナーカセットのクローニングを３段階で行った。（１）ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏベクター（ｐＸ４５９）及びＭＤＨ１－ＰＧＫ－ＧＦＰ＿２．０ベクターは、Ａｄｄｇｅｎｅから得た（それぞれプラスミド＃４８１３９、＃１１３７５）。Ｃａｓ９－２Ａ－Ｐｕｒｏ及びＧＦＰ遺伝子フラグメントをＰＣＲ（ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ）によってそれぞれのベクターから得て、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリクローニングにより一緒に組立てた。（２）ハイブリドーマのＲＯＳＡ２６遺伝子座に対するホモロジーアーム（１，０００及び９７６ｂｐ）をゲノムＤＮＡ ＰＣＲによって得て、ＧｉｂｓｏｎアセンブリクローニングによりｐＵＣ５７（Ｋａｎ）プラスミド骨格を用いて組立てた。（３）最後に、前に組立てられたフラグメント―ポイント（１）及び（２）参照―をＧｉｂｓｏｎアセンブリクローニングによって組立てた。ＨＤＲドナーを、ＸｈｏＩ及びＭｌｕＩ制限エンドヌクレアーゼによる制限消化、続いてゲル電気泳動精製によって線状化した。ｐＸ４５８（ＢＦＰ）において前述したようにｇＲＮＡ－Ｐをクローニングした。代替的なＮＨＥＪ挿入設計のために、Ｃａｓ９－２Ａ－Ｐｕｒｏ－ＧＦＰコンストラクトをホモロジーアームなしで線状化した。Ｃａｓ９－２Ａ－Ｐｕｒｏ－ＧＦＰドナーでトランスフェクションした後、ＧＦＰ＋細胞をソートし、増殖させた。次いで、単一細胞分離、増殖及びＰＣＲ解析の前の最大１週間、２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ１１１３８０２）を添加した標準増殖培地で培養することによって、ドナーコンストラクトの安定な組込みのための細胞を選択した。Ｃａｓ９－２Ａ－Ｐｕｒｏ－ＧＦＰカセットが正確に組込まれた単一クローンを同定後、ＧＦＰを標的とするガイドＲＮＡのトランスフェクションにより、細胞内のＣａｓ９活性が検証された。Ｃａｓ９切断活性は、Ｔ７Ｅ１アッセイ及びＰＣＲ単位複製配列のサンガーシーケンシングによって確認した（図８）。ＧＦＰノックアウトの有効性は、フローサイトメトリーによって確認した。
構成的なＣａｓ９発現のために改変された細胞株は、ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－ｐＡ； ＰｎＰ－ＨＥＬ２３－ＩｇＨ－。構成的Ｃａｓ９及び誘導性ＡＩＤの両方を組込むように、より包括的な細胞株を設計した； ＲＯＳＡ２６遺伝子座の２つの異なる領域と相同性を有するコンストラクトによって、それらを図８Ａに示すように縦列に組み込むことが可能であった。こうして、ｉＳＳＨＭワークフローでのＣａｓ９の構成的発現によって、高いＨＤＲ効率が達成できるようになった。
Ｃａｓ９細胞－ガイドＲＮＡ又は合成オリゴヌクレオチド（ＩＤＴ）のインビトロ転写
Ｃａｓ９を構成的に発現するＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ－Ｃａｓ９細胞株は、１０の適切なＨＤＲドナー及び既に転写されたガイドＲＮＡでトランスフェクションした。後者は、ＩＤＴ社からのオリゴヌクレオチド又はインビトロ転写物として得られた。インビトロ転写の場合、前述のガイドＤＮＡオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的コンストラクトのクローニング及び組立てのセクションを参照）は、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ、ＡＭ１３３４）の鋳型として機能した。適応されたプロトコルは前述の通りであった（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｉｏ／ｖｉｅｗ／Ｉｎ－ｖｉｔｒｏ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｏｆ－ｇｕｉｄｅ－ＲＮＡｓ－ｄ４ｗ８ｘｄ？ｓｔｅｐ＝３ ａｃｃｅｓｓｅｄ Ｆｅｂ．２１，２０１７）．

Claims (13)

  1. 哺乳類Ｂ細胞株の生成方法であって、
    ａ．複数の哺乳類Ｂ細胞を提供する工程であって、前記複数の哺乳類Ｂ細胞の各々は、マーカータンパク質遺伝子及び内因性ＩｇＨ免疫グロブリン遺伝子座に対応する２つのホモロジーアームを含む遺伝子組換えＤＮＡ配列を含むものであり、前記遺伝子組換えＤＮＡ配列が前記複数の哺乳類Ｂ細胞の各々に含まれる内因性ＩｇＨ免疫グロブリン遺伝子座にＣＲＩＳＰＲ介在エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）システムを用いて挿入される工程を備え、及び前記遺伝子組換えＤＮＡ配列はガイドＲＮＡ標的部位を含む前記工程、
    ｂ．前記マーカータンパク質をコードする前記遺伝子組換えＤＮＡ配列を目的タンパク質及び内因性ＩｇＨ免疫グロブリン遺伝子座に対応する２つのホモロジーアームを含む第２の遺伝子組換えＤＮＡ配列で置換し、目的タンパク質は、抗体、抗体様分子、ヒト化ラクダ抗体、又は免疫グロブリン抗原結合フラグメントから選択され、前記遺伝子組換えＤＮＡ配列の置換が前記遺伝子組換えＤＮＡ配列に対するｇＲＮＡ標的、ＣＲＩＳＰＲ介在エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）介在性部位特異的ＤＮＡ切断及び、その後の非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）による前記マーカータンパク質をコードする遺伝子組換えＤＮＡ配列の不活性化、及び相同性指向修復（ＨＤＲ）による前記第２の遺伝子組換えＤＮＡ配列の組込みをさらに含む工程、
    ｃ．前記マーカータンパク質の存在又は非存在に基づいて前記複数の哺乳類Ｂ細胞を分類する工程、及び
    ｄ．前記マーカータンパク質が存在しない哺乳類Ｂ細胞を選択及び回収する工程
    を含む方法。
  2. 前記複数の哺乳類Ｂ細胞が、プライマリーＢ細胞、不死化Ｂ細胞、ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、形質細胞腫細胞及びリンパ腫細胞を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記マーカータンパク質及び／又は前記目的タンパク質が、内因性免疫グロブリンプロモーターの制御下で発現される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記複数の哺乳類Ｂ細胞の各々において、内因性ＶＨ遺伝子及び内因性ＶＬ遺伝子が破壊される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記複数の哺乳類Ｂ細胞が、前記ＣＲＩＳＰＲ介在エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を構成的に発現するように遺伝的に改変される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記複数の哺乳類Ｂ細胞がセーフハーバー遺伝子座を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ介在エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットが前記セーフハーバー遺伝子座に挿入される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記複数の哺乳類Ｂ細胞が、誘導可能かつ調整可能な手段で活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を発現するように遺伝的に改変される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記複数の哺乳類Ｂ細胞がセーフハーバー遺伝子座を含み、前記活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットが前記セーフハーバー遺伝子座に挿入される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記内因性免疫グロブリンプロモーターが、ＶＨプロモーターである、請求項３～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記目的タンパク質が：
    （ａ）全長抗体、又は
    （ｂ）合成抗原結合フラグメント（ｓＦＡｂ）コンストラクトを含む全長抗体
    である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法の後に、さらに、ドナーｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡのランダム化領域を通じてランダム化された核酸配列で前記遺伝子組換えＤＮＡ配列を改変する工程を含む、タンパク質変異体のライブラリーの生成方法。
  12. 請求項７～１１のいずれか１項に記載の方法の後に、さらに、前記活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）の発現を誘導し、その後、誘導性合成体細胞超変異（ｉＳＳＨＭ）により前記目的タンパク質内に複数の突然変異を生成する工程を含む、タンパク質変異体のライブラリーの生成方法。
  13. 前記マーカータンパク質が蛍光タンパク質である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
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