JP7520813B2 - 多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、多能性幹細胞の製造方法、及び多能性幹細胞に関する。本発明はさらに、多能性幹細胞の未分化性をモニタリングする方法にも関する。本発明はさらに、体細胞の製造方法にも関する。
本願は、２０１９年３月２９日に、日本に出願された特願２０１９－０６６８４４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、無限に増殖できる能力と様々な体細胞に分化する能力を有している。多能性幹細胞から分化誘導させた体細胞を移植する治療法の実用化によって、難治性疾患や生活習慣病に対する治療法を根本的に変革できる可能性を有する。例えば、多能性幹細胞から、神経細胞をはじめとして、心筋細胞、血液細胞、及び網膜細胞等の多種多様な体細胞に試験管内で分化誘導する技術が既に開発されている。

一方で、多能性幹細胞を用いた再生医療は、実用化に向けて課題が残されており、その一つとして、多能性幹細胞の生産性が挙げられる。例えば、肝臓の再生には約２×１０^１１個の細胞が必要と言われている。多能性幹細胞の培養方法は、平坦な基板上に細胞接着させて培養する接着培養と、液体培地中に細胞を浮遊させて培養する浮遊培養に大別される。接着培養により前記個数の細胞を培養するには１０^６ｃｍ^２以上の基板が必要であり、これは一般的な１０ｃｍディッシュで約２０，０００枚分に相当する。このように、基板表面上での接着培養では得られる細胞数が培養面積に依存するためスケールアップが困難であり、再生医療に必要な量の細胞を供給することは困難である。浮遊培養では液体培地中で細胞を浮遊させながら培養するため、得られる細胞数は培地体積に依存する。そのため、浮遊培養はスケールアップが容易であり、細胞の大量生産に適している。例えば、非特許文献１には、浮遊培養の細胞培養容器としてスピナーフラスコを用い、液体培地を撹拌しながら多能性幹細胞を浮遊培養する方法が開示されている。

また、前記再生医療の実用化に向けた別の課題としては、目的の体細胞の生産性が挙げられる。目的の体細胞を効率的に生産するための取り組みとして、分化誘導効率を向上させる取り組みが挙げられ、その方法は種々報告されている。例えば、非特許文献２には分化誘導時に複数の添加因子を使用することにより、効率的に、ヒト多能性幹細胞から膵臓β細胞へ分化誘導させる技術が開示されている。また、非特許文献３では、多能性幹細胞の接着培養において、出発原料となる多能性幹細胞集団の均質性を高めるために、未分化逸脱細胞（多能性を失った細胞）を選択的に除去しておく方法が開示されている。また、非特許文献４には、多能性幹細胞の接着培養において、ＷＮＴタンパク質の分泌を抑制する薬剤を添加して培地中のＷＮＴタンパク質濃度を低くすることによって、未分化逸脱細胞の出現を抑制する方法が開示されている。

Ｏｌｍｅｒ Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐａｒｔ Ｃ， Ｖｏｌｕｍｅ １８ （１０）： ７７２－７８４ （２０１２） Ｓｈｉｇｅｈａｒｕ Ｇ．Ｙａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１７ Ｆｅｂ；９（２）：１６８－１７９ Ｍｅｅ－Ｈａｅ Ｋｉｍ． Ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２０１７ Ｍａｒ ７；７（１）：９３． Ｄｏｒｏｔａ Ｋｕｒｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， Ｖｏｌ． ４， １１４－１２８， Ｊａｎｕａｒｙ １３， ２０１５

上述したように、多能性幹細胞から目的の体細胞を効率的に生産するため方法は各種開発されている。しかしながら、非特許文献２の方法は、使用する添加因子が高価であるため、体細胞の生産コストが高くなる傾向があり、非特許文献３の方法では、未分化逸脱細胞を廃棄するため、得られる多能性幹細胞の収量が少なくなる。

一方、本発明者らが、接着培養及び浮遊培養にて多能性幹細胞を培養したところ、接着培養では未分化逸脱細胞は検出されなかったにも関わらず、浮遊培養では未分化逸脱細胞が高頻度で出現することが見出された。それぞれの培養方法において、培地中に含まれるＷＮＴタンパク質濃度を分析した結果、接着培養では未分化逸脱細胞が検出されていないにも関わらず、培地中に含まれるＷＮＴタンパク質の濃度は浮遊培養と比較して接着培養の方が高いことが分かり、非特許文献４における知見とは矛盾していることが見出された。つまり、本発明者らは、多能性幹細胞の培養時に未分化逸脱細胞が出現する本質的な原因は、培地中のＷＮＴタンパク質濃度以外にあるという課題を見出した。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、多能性幹細胞の浮遊培養において多能性幹細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質の量を所定の値以下にすることで、未分化逸脱細胞の出現を抑制して均質な多能性幹細胞集団を獲得できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明によれば、以下の態様が提供される。
＜１＞ 下記式（１）により算出される、多能性幹細胞の細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴタンパク質の量を、２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下に維持する条件下において多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞の製造方法。
（１） （細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴタンパク質の量）＝(培地のＷＮＴタンパク質の濃度）÷（１細胞あたりが培地に接する表面積）
＜２＞ 前記培地中において、多能性幹細胞１０^４個あたりのＷＮＴタンパク質量が１．０ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞ 前記ＷＮＴタンパク質が、多能性幹細胞から分泌される、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜３Ａ＞前記ＷＮＴタンパク質が、ＷＮＴ３Ａタンパク質である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の方法。
＜４＞ 前記培地が、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１つを含む、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の方法。
＜５＞ 前記培地が、ＦＧＦ２を含む、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の方法。
＜５Ａ＞ 前記培地中のＦＧＦ２濃度が５０ｎｇ／ｍＬ以下である、＜５＞に記載の方法。
＜５Ｂ＞ 前記培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を含む、＜１＞から＜５Ａ＞の何れか一に記載の方法。
＜６＞ 前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を形成する工程を含む、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の方法。
＜６Ａ＞前記浮遊培養する工程が、多能性幹細胞をＷＮＴタンパク質分泌阻害剤の存在下において培養する工程を含む、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の方法。
＜６Ｂ＞前記の浮遊培養する工程において、多能性幹細胞におけるＢｒａｃｈｙｕｒｙおよびＳＯＸ１７の発現が陰性である、＜１＞から＜６Ａ＞の何れか一項に記載の方法。
＜７＞ 前記細胞凝集塊において、ＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、ＳＯＸ２が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、Ｎａｎｏｇが陽性を呈する細胞の比率が９０％以上である、＜６＞に記載の方法。
＜８＞ 前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含む、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の方法。

＜９＞ ＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の方法により製造される多能性幹細胞。
＜１０＞ 下記式（１）により算出される、多能性幹細胞の細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴタンパク質の量が２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下であること；及び
培地中における多能性幹細胞１０^４個あたりのＷＮＴタンパク質量が１．０ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下であること：
の何れか一以上を指標として、多能性幹細胞の未分化性をモニタリングする方法。
（１） （細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴタンパク質の量）＝(培地のＷＮＴタンパク質の濃度）÷（１細胞あたりが培地に接する表面積）

＜１１＞ ＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の方法により多能性幹細胞を製造する工程、及び
前記多能性幹細胞を分化誘導因子の存在下で培養する工程、
を含む、体細胞の製造方法。
＜１２＞ 前記体細胞が、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、及び外胚葉系細胞からなる群より選択される、＜１１＞に記載の製造方法。
＜１３＞ 前記体細胞が、心筋細胞、骨格筋細胞、神経細胞、巨核球、造血幹細胞、気道上皮細胞、生殖細胞、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、軟骨細胞、T細胞、エリスロポエチン産生細胞、腸管上皮、膵臓細胞、肝細胞、肺胞上皮細胞、及び腎臓細胞からなる群より選択される少なくとも１つである、
＜１１＞に記載の製造方法。

本発明によれば、均質な多能性幹細胞集団を得ることができ、効率的な分化誘導が可能である。

図１は、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の接着培養の５日目及び１０日目の位相差画像を示す。 図２は、ヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株の接着培養の５日目及び１０日目の位相差画像を示す。 図３は、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の浮遊培養の５日目及び１０日目の位相差画像を示す。 図４は、ヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株の浮遊培養の５日目及び１０日目の位相差画像を示す。 図５は、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株及びＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を接着培養及び浮遊培養したときの１０日目の遺伝子発現を測定した結果を示す。 図６は、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株及びＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を接着培養及び浮遊培養したときの５日目における培地中に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質濃度を示す。 図７は、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株及びＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を接着培養及び浮遊培養したときの５日目における培地中の細胞１０^４個あたりのＷＮＴ３Ａタンパク質量を示す。 図８は、ＷＮＴ３Ａタンパク質を無添加又は添加してヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を接着培養したときの５日目の位相差画像を示す。 図９は、ＷＮＴ３Ａタンパク質を無添加又は添加してヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を接着培養したときの５日目の位相差画像を示す。 図１０は、ＷＮＴ３Ａタンパク質を無添加又は添加してヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を接着培養したときの５日目の遺伝子発現を測定した結果を示す。 図１１は、ＷＮＴ３Ａタンパク質を無添加又は添加してヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を接着培養したときの５日目の遺伝子発現を測定した結果を示す。 図１２は、細胞外へのＷＮＴタンパク質分泌を抑制した状態でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を浮遊培養したときの５日目及び１０日目の位相差画像を示す。 図１３は、細胞外へのＷＮＴタンパク質分泌を抑制した状態でヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を浮遊培養したときの５日目及び１０日目の位相差画像を示す。 図１４は、細胞凝集塊の直径と１細胞凝集塊に含まれる細胞数の関係を示す。 図１５は、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を培養したときの未分化マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇの発現を測定した結果を示す。 図１６は、ヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を培養したときの未分化マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇの発現を測定した結果を示す。 図１７は、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株から三胚葉系細胞への分化誘導後に、内胚葉マーカー、中胚葉マーカー及び外胚葉マーカーの遺伝子発現を測定した結果を示す。

［多能性幹細胞の製造方法］
本発明による多能性幹細胞の製造方法は、多能性幹細胞の細胞表面の単位面積あたりに接する培地に含まれる、ＷＮＴタンパク質の濃度を、２．９×１０^２（μｇ／ｍＬ）／ｃｍ^２以下に維持する条件下において多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、方法である。多能性幹細胞の細胞表面の単位面積あたりに接する培地に含まれる、ＷＮＴタンパク質の濃度は、多能性幹細胞の細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれる、ＷＮＴタンパク質の量ともいえる。したがって、本発明は、多能性幹細胞の細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれる、ＷＮＴタンパク質の量を、２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下に維持する条件下において多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、方法もまた提供する。

（多能性幹細胞）
多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有する細胞であって、適切な条件下のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。具体的には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９８，９５：１３７２６－３１）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Ｎａｔｕｒｅ．２００８，４５６：３４４－９）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、ヒトの体性幹細胞（組織幹細胞）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明に用いる多能性幹細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。

本発明における多能性幹細胞は、単一細胞、及び複数の細胞からなる細胞集団が挙げられる。前記細胞集団は、複数個の細胞が三次元的に凝集することによって一つの塊状の細胞集団となる細胞凝集塊を形成していてもよい。なお、細胞凝集塊については後段で説明する。

ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、又はヒトが挙げられる。好ましくはヒトに由来する細胞を使用できる。

ＥＳ細胞の具体例としては、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等のＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、及びこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。各ＥＳ細胞は当分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。マウスのＥＳ細胞は、１９８１年にエバンスら（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４－６）、及びマーチンら（Ｍａｒｔｉｎ ＧＲ．ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７８：７６３４－８）によって樹立されている。ヒトのＥＳ細胞は、１９９８年にトムソンら（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５－７）によって樹立されており、ＷｉＣｅｌｌ研究施設（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウェブサイト：ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／、マジソン、ウイスコンシン州、米国）、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、京都大学などから入手可能であり、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ社（ウェブサイト：ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ／、スウェーデン）から購入可能である。

人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞に初期化因子を導入することにより体細胞を未分化状態へと初期化し、多能性を付与した培養細胞である。ｉＰＳ細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ(Ｒｕｄｏｌｆ Ｊａｅｎｉｓｃｈ)らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（Ｊａｍｅｓ Ｔｈｏｍｓｏｎ）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Ｋｏｎｒａｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。例えば、国際公開第２００７／０６９６６６号には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。

ｉＰＳ細胞の製造に用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、体細胞とは、生体を構成する細胞のうち、生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、又はヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。体細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞、肺胞上皮細胞）、内皮細胞（例えば、血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、膵臓細胞、白血球細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞等）、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓・眼・耳を構成する細胞などが挙げられる。

本発明で用いられる細胞は、任意の動物由来のものであってよく、例えば、マウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類；ヒト、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類；及びイヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜若しくは愛玩動物などの哺乳動物由来のものであってよいが、ヒト由来の細胞が特に好ましい。

ｉＰＳ細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉、中胚葉又は内胚葉への多分化能を有する幹細胞である。また、ｉＰＳ細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。

体細胞からｉＰＳ細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子

上記以外にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Ｎａｔｕｒｅ．２００８ Ｊｕｌ ３１；４５４（７２０４）：６４６－５０）、低分子化合物を利用した方法（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｊａｎ ９；４（１）：１６－９、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｎｏｖ ６；５（５）：４９１－５０３）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｍａｙ ８；４（５）：３８１－４）などが報告されており、いずれの方法で製造されたｉＰＳ細胞でもよい。

初期化因子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドを用いた遺伝子導入、合成ＲＮＡの導入、タンパク質として直接導入などが挙げられる。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡ若しくはＲＮＡ、又は低分子化合物等を用いた方法で作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を始めとする多能性幹細胞は、市販品又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製したものを用いてもよい。

ｉＰＳ細胞として、例えば２５３Ｇ１株、２５３Ｇ４株、２０１Ｂ６株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、１２０１Ｃ１株、１２０５Ｄ１株、１２１０Ｂ２株、１２３１Ａ３株、１３８３Ｄ２株、１３８３Ｄ６株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１２０－３ｆ７株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１２０－４ｆ１株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１１４－４ｆ１株、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株、１５Ｍ６３株、１５Ｍ６６株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、ＴｋＤＮ４－Ｍ株、ＴｋＤＡ３－１株、ＴｋＤＡ３－２株、ＴｋＤＡ３－４株、ＴｋＤＡ３－５株、ＴｋＤＡ３－９株、ＴｋＤＡ３－２０株、ｈｉＰＳＣ ３８－２株、ＭＳＣ－ｉＰＳＣ１株、ＢＪ－ｉＰＳＣ１株等を使用することができる。

ＥＳ細胞として、例えばＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ―３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＥＥＳ１株、ＳＥＥＳ２株、ＳＥＥＳ３株、ＨＵＥＳ８株、ＣｙＴ４９株、Ｈ１株、Ｈ９株、ＨＳ－１８１株等を使用することができる。新たに作製された臨床グレードのｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞を用いてもよい。

本発明における多能性幹細胞としては、単一細胞、及び数個の細胞又は多数の細胞からなる細胞集団が挙げられる。前記細胞集団については、複数個の細胞が相互に接着等することによって一つの塊である細胞凝集塊を形成していてもよい。

（ＷＮＴタンパク質）
ＷＮＴ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ－ｔｙｐｅ ＭＭＴＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｆａｍｉｌｙ）タンパク質とは、ＷＮＴシグナル経路に関与するタンパク質である。ＷＮＴタンパク質は、７回膜貫通型受容体Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）、共役受容体として機能する１回膜貫通型受容体ＬＲＰ５／６（ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ５／６）、及びチロシンキナーゼ活性を有する１回膜貫通型受容体であるＲｏｒ若しくはＲＹＫと結合し、β－カテニン経路、平面内細胞極性（ｐｌａｎａｒ ｃｅｌｌ ｐｏｌａｒｉｔｙ，ＰＣＰ）経路、及びカルシウム経路の３種類の経路を活性化させる。β－カテニン経路は、転写促進因子として機能するβ－カテニンのタンパク質レベルを調節することにより、シグナル伝達が制御され細胞の増殖や分化を制御する。ＷＮＴタンパク質はリボソームで合成され、小胞体内でアスパラギン結合型糖鎖修飾と膜結合型アシル基転移酵素のｐｏｒｃｕｐｉｎｅによるパルミチン酸の脂質修飾を受けた後、ゴルジ体から細胞外に分泌される。

ヒトのＷＮＴタンパク質は、１９種類同定されている（ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６）。

上記の通り、ＷＮＴシグナル経路には、細胞表面のＷＮＴ受容体に結合することよってβ－カテニンの安定化を介して遺伝子発現を誘導するβ－カテニン経路、ＪＮＫやＲｈｏキナーゼを活性化するＰＣＰ経路、及びＰＫＣなどを活性化するカルシウム（Ｃａ^２＋）経路がある。本発明におけるＷＮＴタンパク質は、いずれの経路に関与するタンパク質であってもよいが、β－カテニン経路に関与するタンパク質が好ましく、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ等が好ましい。ＷＮＴタンパク質としては、ＷＮＴ３Ａタンパク質が特に好ましい。ヒトのＷＮＴ３Ａ（ＧＥＮＥ ＩＤ：８９７８０）の遺伝子配列及びアミノ酸配列としては、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿０３３１３１．４及びＮＰ＿１４９１２２．１として登録されているもの等が挙げられる。

本発明における、多能性幹細胞の細胞表面の単位面積あたりに接する培地に含まれる、ＷＮＴタンパク質の濃度とは、単一（シングルセル）の多能性幹細胞の細胞表面の単位面積あたりに接している培地に含まれるＷＮＴタンパク質の濃度である。換言すれば、多能性幹細胞の細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれる、ＷＮＴタンパク質の量であり、単一（シングルセル）の多能性幹細胞の細胞表面の単位面積あたりに接している単位培地に含まれるＷＮＴタンパク質の量である。

前記多能性幹細胞の細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれる、ＷＮＴタンパク質の量としては、２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下であれば特に限定されないが、上限としては例えば、２．８×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、２．７×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、２．６×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、２．５×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、２．４×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、２．３×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、２．２×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、２．１×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、２．０×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、１．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、１．８×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、１．７×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、１．６×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、１．５×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、１．４×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、１．３×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、１．２×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、１．１×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、１．０×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、９０μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、８０μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、７０μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、６０μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、５０μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、４０μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、３０μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、２０μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、１０μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、１μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下、又は０．１μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下が好ましい。前記ＷＮＴタンパク質の濃度の下限としては、例えば、０μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以上、１．０×１０^－５μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以上、１．０×１０^－４μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以上、１．０×１０^－３μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以上、又は１．０×１０^－２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以上が好ましい。

細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれる、ＷＮＴタンパク質の量は以下の式（１）により算出することができる。
（１） （細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴタンパク質の量）＝(培地のＷＮＴタンパク質の濃度）÷（１細胞あたりが培地に接する表面積）

前記式（１）中、「１細胞あたりが培地に接する表面積」は、細胞凝集塊の体積と、１細胞凝集塊に含まれる細胞数から、下記式により算出することができる。
（細胞凝集塊の体積）＝４÷３×π（円周率）×（（細胞凝集塊の直径）÷２）^３
（１細胞の体積）＝（細胞凝集塊の体積）÷（１細胞凝集塊に含まれる細胞数）
（１細胞の直径）＝２×（３÷（４×π）×（１細胞の体積））^１／３
（１細胞あたりが培地に接する表面積）＝４×π×（（１細胞の直径）÷２）^２

前記式（１）中、「培地のＷＮＴタンパク質の濃度」は、培養上清を採取し、常法によりＷＮＴタンパク質濃度を測定することにより、取得することができる。培地のＷＮＴタンパク質濃度の測定には、例えば、ＥＬＩＳＡ等を用いることができる。「培地のＷＮＴタンパク質の濃度」は、抗ＷＮＴ３Ａ抗体を用いたＥＬＩＳＡにより測定されたＷＮＴ３Ａタンパク質の濃度であることが好ましい。ＥＬＩＳＡ用試料としては、培地上清を用いることができる。前記測定には、市販のＷＮＴ３Ａ用ＥＬＩＳＡキットを用いてもよい。

具体例としては、以下の方法が挙げられる。
位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊画像を取得し、画像解析ソフト（例えばｉｍａｇｅ Ｊ）で解析することにより、細胞凝集塊の直径を測定することができる。次に、細胞凝集塊の直径と１細胞凝集塊に含まれる細胞数の関係式に基づいて、前記細胞凝集塊の直径から１細胞凝集塊に含まれる細胞数を算出する。次に、前記細胞凝集塊を球と仮定して、前記細胞凝集塊の直径から細胞凝集塊の体積を算出し、さらに前記細胞凝集塊に含まれる細胞の充填率は１００％であると仮定して、前記細胞凝集塊の体積と前記１細胞凝集塊に含まれる細胞数から１細胞の体積を算出することができる。そして、前記細胞凝集塊に含まれる細胞が球であると仮定して、前記１細胞の体積から１細胞の直径を算出し、前記１細胞の直径から１細胞の表面積を算出して、これを１細胞あたりが培地に接する表面積とすることができる。ＥＬＩＳＡ等の常法により測定した培地中に含まれるＷＮＴタンパク質濃度と、前記１細胞あたりが培地に接する表面積から、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質の量を算出することができる。

また、１細胞凝集塊の直径と１細胞凝集塊に含まれる細胞数の関係式は以下の方法により導くことができる。細胞株や培地添加剤の構成が異なる複数の培養条件で浮遊培養を行い、位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊画像を取得し、画像解析ソフト（例えばｉｍａｇｅ Ｊ）で解析することにより、各条件についてそれぞれ細胞凝集塊１０個の直径を測定する。そして、前記細胞凝集塊１０個の直径の平均値を算出し、各条件における細胞凝集塊の平均直径とすることができる。また、位相差顕微鏡観察により培養液中の細胞凝集塊数を測定することができる。そして、細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去し、細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して１０分間処理し、ピペッティングによって単細胞まで分散させることができる。この細胞を培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色することにより、培養液中の生細胞数を測定することができる。前記細胞凝集塊数及び前記生細胞数から、下記式（２）に従い、１細胞凝集塊に含まれる細胞数（ｃｅｌｌｓ／ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を算出することができる。
（２） （１細胞凝集塊に含まれる細胞数）＝（生細胞数）÷（細胞凝集塊数）

また、前記細胞凝集塊の平均直径と前記１細胞凝集塊に含まれる細胞数をグラフにプロットし、２次近似で近似曲線を作成することで、細胞凝集塊の直径と１細胞凝集塊に含まれる細胞数の関係を表す近似式を得ることができる。前記方法により得た近似式の一例を以下に示す。
（１細胞凝集塊に含まれる細胞数）
＝０．１１１×（細胞凝集塊の直径）^２－０．９５８５×（細胞凝集塊の直径）

１細胞凝集塊に含まれる細胞数は、細胞凝集塊数及び前記生細胞数から前記式（２）により算出してもよいし、前記近似式を得て細胞凝集塊の平均直径から算出してもよい。前記近似式を得ることにより、細胞凝集塊の平均直径のみから１細胞凝集塊に含まれる細胞数を算出することが可能となる。

本発明においては、培地中における多能性幹細胞１０^４個あたりのＷＮＴタンパク質量が、１．０ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下である条件下において多能性幹細胞を培養してもよい。培地中における多能性幹細胞１０^４個あたりのＷＮＴタンパク質量（ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ）は、下記式に従い算出することができる。
（多能性幹細胞１０^４個あたりのＷＮＴタンパク質量（ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ））
＝（培地中のＷＮＴタンパク質の濃度（ｐｇ／ｍＬ））÷（培地中の生細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ））×１０^４

培地中において、多能性幹細胞１０^４個あたりのＷＮＴタンパク質量は、１．０ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下であれば特に限定されないが、上限としては、例えば９．０×１０^－１ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、８．０×１０^－１ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、７．０×１０^－１ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、６．８×１０^－１ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、６．０×１０^－１ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、５．０×１０^－１ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、４．０×１０^－１ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、３．２×１０^－１ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、３．０×１０^－１ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、２．０×１０^－１ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、１．０×１０^－１ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、９．０×１０^－２ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、８．０×１０^－２ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、７．０×１０^－２ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、６．０×１０^－２ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下、又は５．０×１０^－２ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下が好ましい。前記ＷＮＴタンパク質量の下限としては、例えば１．０×１０^－４ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以上、１．０×１０^－３ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以上、又は１．０×１０^－２ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以上が好ましい。

また、培地中のＷＮＴタンパク質は、多能性幹細胞から分泌されたものでもよい。培地中におけるＷＮＴタンパク質量は、培地中に存在するＷＮＴタンパク質量である。外部から培地にＷＮＴタンパク質を添加しない場合、培地中のＷＮＴタンパク質量は、多能性幹細胞から分泌されたＷＮＴタンパク質に由来する。前記ＷＮＴタンパク質は、好ましくはＷＮＴ３Ａタンパク質である。

本発明においては、多能性幹細胞からのＷＮＴタンパク質の細胞外への分泌量を抑制した条件下において、多能性幹細胞を培養してもよい。

多能性幹細胞からのＷＮＴタンパク質の細胞外への分泌量を抑制した条件下としては、例えば、培地中に含まれるＷＮＴタンパク質濃度を１００ｐｇ／ｍＬ以下に維持する条件下である。培地中に含まれるＷＮＴタンパク質濃度の上限としては、例えば９０ｐｇ／ｍＬ以下、８４ｐｇ／ｍＬ以下、８０ｐｇ／ｍＬ以下、７０ｐｇ／ｍＬ以下、６０ｐｇ／ｍＬ以下、５４ｐｇ／ｍＬ以下、５０ｐｇ／ｍＬ以下、４０ｐｇ／ｍＬ以下、３０ｐｇ／ｍＬ以下、２０ｐｇ／ｍＬ以下、又は１０ｐｇ／ｍＬ以下が好ましく、下限としては０．１ｐｇ／ｍＬ以上、又は１ｐｇ／ｍＬ以上が好ましい。

本発明においては、上記した条件、即ち、
多能性幹細胞において細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴタンパク質の量が２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下であること（以下、「条件１」という場合がある。）；及び
培地中における多能性幹細胞１０^４個あたりのＷＮＴタンパク質量が１．０ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下であること（以下、「条件２」という場合がある。）：
の何れか一以上の条件を満たすための方法は特には限定されない。そのような方法としては、例えば、ＷＮＴタンパク質分泌阻害剤を添加する方法、遺伝子組み換えによりＷＮＴタンパク質の分泌を阻害する方法、培地交換の頻度を調整して培地中に含まれるＷＮＴタンパク質を除去する方法、及び培地を流加することによって培地中に含まれるＷＮＴタンパク質を希釈する方法等が挙げられる。本発明においては、ＷＮＴタンパク質分泌阻害剤を添加する方法が好ましい。

本発明においては、上記した条件、即ち、
多能性幹細胞において細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴタンパク質の量が２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下であること（条件１）；及び
培地中における多能性幹細胞１０^４個あたりのＷＮＴタンパク質量が１．０ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下であること（条件２）：
の何れか一以上を指標として、多能性幹細胞の未分化性をモニタリングすることができる。即ち、上記何れか一以上の指標を満たしている場合には、多能性幹細胞の未分化性が維持されていると判定することができる。なお、培地中のＷＮＴタンパク質の量は、ＥＬＩＳＡなどの常法により定量することができる。

（維持培養）
本発明において浮遊培養を行う前の多能性幹細胞は、未分化維持培地を用いて未分化性を維持したものとすることが好ましい。未分化維持培地を用いて多能性幹細胞の未分化性を維持する培養のことを、多能性幹細胞の維持培養ともいう。

未分化維持培地は、多能性幹細胞の未分化性を維持できる培地であれば特に限定されない。未分化維持培地としては、例えば、ＦＧＦ２（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－２）、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、ＩＧＦ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＰＡＩ、ＰＥＤＦ、ＩＧＦＢＰ－２、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）及びＩＧＦＢＰ－７からなる群から選択される１つ以上を含む培地等が挙げられる。前記例示した因子は、多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られている。未分化維持培地としては、例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）（例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎなど）（味の素社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ｈＥＳＣ ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）等を使用することができるが、特に限定されない。また、未分化維持培地には、ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンフォテリシンＢなどの抗生物質を添加してもよく、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｒｅ Ｙ－２７６３２（富士フィルム和光純薬社）等のＲＯＣＫ阻害剤を添加してもよい。

多能性幹細胞の維持培養は、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、又はマトリゲル等の細胞接着タンパク質をコートした細胞培養用ディッシュ上において、上記した未分化維持培地を用いて行うことができる。

多能性幹細胞の維持培養の培養温度は、特に限定されないが、好ましくは３６．０℃から３８．０℃であり、より好ましくは３６．５℃から３７．５℃である。培養期間は、特に限定されないが、好ましくは１日から１４日とすることができる。多能性幹細胞の維持培養は、例えば、１日から７日毎、２日から５日毎、３日から５日毎、３日から４日毎に、細胞を継代しながら行ってもよい。維持培養における継代数は特に限定されない。ＣＯ_２インンキュベータ等を利用して、約１％から１０％、好ましくは５％のＣＯ_２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。

多能性幹細胞の維持培養を行う際には、適当な頻度で培地交換を行うことが好ましい。培地交換の頻度は特に限定されず、細胞種や培養条件により適宜培地交換の頻度を調整することができる。例えば、好ましくは５日に一回以上、４日に一回以上、３日に一回以上、２日に一回以上、又は１日に一回以上の頻度で培地交換作業を行うことができる。培地交換に用いる液体培地としては、上記と同様の液体培地を用いることができる。培地交換の方法は特に限定されない。例えば、好ましくは培養容器から上清をアスピレーターやピペット等で吸引除去し、その後、新鮮な液体培地を穏やかに添加した後、再度培養容器をＣＯ_２インキュベーター等の培養環境に戻すことで継続して維持培養することができる。

継代の方法は特に限定されない。例えば、好ましくは培養容器から上清をアスピレーターやピペット等で吸引除去し、その後、必要に応じて洗浄を行うことができる。洗浄液には、バッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生理食塩水、又は液体培地（基礎培地が好ましい）を使用すればよい。洗浄後の細胞に対し、例えば機械的、化学的又は生物学的な方法により細胞を剥離し、維持培養を継続するために維持培養用の新鮮培地及び培養容器に播種して維持培養を継続してもよい。継代後の維持培養に用いる液体培地及び培養の条件としては、上記と同様の未分化維持培地及び条件を用いることができる。また剥離の際は、ＥＤＴＡ、ＴｒｙＰＬＥ^ＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ、アキュターゼ^ＴＭ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、トリプシン／ＥＤＴＡ、トリプシン／コラゲナーゼ、ＲｅＬｅＳＲ^ＴＭ等を細胞剥離液として使用して培養基材から剥離又は細胞同士を剥離さてもよいし、セルスクレーパー等を用いて細胞を培養基材から剥離させてもよい。剥離させた細胞は、ピペッティング又はストレーナーを用いて十分に分散させて単離してもよいし、分散させずにコロニー状のまま播種してもよい。

本発明では、維持培養した後に単離された細胞を用いることができる。ここで「単離された細胞」とは、複数の細胞が集団として接着している細胞を剥離、分散した状態の前記細胞である。単離とは、培養容器や培養担体等に接着していた状態の細胞又は細胞同士が接着している状態の細胞集団を剥離、分散して単一の細胞にする工程である。単離する細胞集団は液体培地中に浮遊した状態であってもよい。単離の方法は特に限定されない。例えば、上記の維持培養における継代方法と同様の方法で、培養容器から上清をアスピレーターやピペット等で吸引除去し、その後、必要に応じて洗浄を行うことができる。洗浄液には、バッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生理食塩水、又は液体培地（基礎培地が好ましい）を使用すればよい。洗浄後の細胞に対し、例えば機械的、化学的又は生物学的な方法により細胞を剥離する。剥離のためには、剥離剤（トリプシン又はコラゲナーゼ等の細胞剥離酵素）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等のキレート剤、又は剥離剤とキレート剤の混合物等を好適に使用することができる。剥離剤は特に限定されないが、トリプシン、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標登録）、ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ディスパーゼ（商標登録）、コラゲナーゼ、ＲｅＬｅＳＲ^ＴＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などが挙げられる。剥離剤と併せてピペッティングを行うことで、好適に単離することもできる。また、ストレーナーに細胞を通過させることによって、好適に単離することもできる。単離後に凍結保存した前記細胞も本発明で好適に使用することができる。

（浮遊培養）
本発明においては、前記条件１及び条件２の何れか又は両方を満たす条件下で、多能性幹細胞を培地中において浮遊培養する。例えば、多能性幹細胞からのＷＮＴタンパク質の細胞外への分泌量を抑制した条件下で、多能性幹細胞を培地中において浮遊培養する。浮遊培養とは、細胞を培養皿等の培養容器に非接着の状態で培養することである。浮遊培養の形態は、細胞が培養容器に非接着の状態で培養されていれば、特に限定されない。例えば、細胞をマイクロキャリア等に接着させたものを培養してもよいし、後述するように複数の細胞が互いに接着して一つの塊となった細胞凝集塊の形態で浮遊培養してもよい。また、前記細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子を混在させることもできる。このように液体培地中で細胞を浮遊させながら培養する浮遊培養は、スケールアップが容易であることから、細胞の大量生産に適していると期待される。

浮遊培養における培地は、多能性幹細胞の未分化性を維持できる培地であれば特に限定されない。例えば、ＦＧＦ２（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－２）、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、ＩＧＦ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＰＡＩ、ＰＥＤＦ、ＩＧＦＢＰ－２、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）及びＩＧＦＢＰ－７からなる群から選択される１つ以上を基礎培地に含む培地等が挙げられる。前記例示した因子は、多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られている。浮遊培養における培地としては、例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）（例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎなど）（味の素社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ｈＥＳＣ ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）等を使用することができるが、特に限定されない。
また、浮遊培養における培地には、ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンフォテリシンＢなどの抗生物質を添加してもよい。また、浮遊培養における培地は、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１つを含んでもいてもよく、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムの全てを含んでいてもよい。浮遊培養における培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、リン酸化酵素阻害剤等の成分を含有してもよい。

浮遊培養における培地にはＦＧＦ２が含まれていてもよい。浮遊培養における培地がＦＧＦ２を含む場合、ＦＧＦ２濃度の上限としては、例えば１００ｎｇ／ｍＬ以下であり、９０ｎｇ／ｍＬ以下、８０ｎｇ／ｍＬ以下、７０ｎｇ／ｍＬ以下、６０ｎｇ／ｍＬ以下、５０ｎｇ／ｍＬ以下、４０ｎｇ／ｍＬ以下、３０ｎｇ／ｍＬ以下、２０ｎｇ／ｍＬ以下、１０ｎｇ／ｍＬ以下、９ｎｇ／ｍＬ以下、８ｎｇ／ｍＬ以下、７ｎｇ／ｍＬ以下、６ｎｇ／ｍＬ以下、５ｎｇ／ｍＬ以下、４ｎｇ／ｍＬ以下、３ｎｇ／ｍＬ以下、２ｎｇ／ｍＬ以下、又は１ｎｇ／ｍＬ以下が好ましい。また、下限としては０．１ｎｇ／ｍＬ以上が好ましい。ＦＧＦ２の存在下で培養することにより、多能性幹細胞の未分化維持及び細胞増殖を促進することができる。

浮遊培養における培地には、リン酸化酵素阻害剤としてＲＯＣＫ（ロック；Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ；Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤が含まれていてもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ－キナーゼ(ＲＯＣＫ、Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）のキナーゼ活性を阻害する物質として定義され、例えば、Ｙ－２７６３２（４－［（１Ｒ）－１－アミノエチル］－Ｎ－ピリジン－４－イルシクロヘキサン－１－カルボキサミド）又はその２塩酸塩（例えば、Ｉｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，９７６－９８３（２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２５，２７３－２８４（２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン）又はその２塩酸塩（例えば、Ｕｅｎａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８９：９９０－９９４（１９９７）参照）、Ｈ－１１５２（（Ｓ）－（＋）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］－ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン）又はその２塩酸塩（例えば、Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９３：２２５－２３２（２００２）参照）、Ｗｆ－５３６（（＋）－（Ｒ）－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）ベンズアミド１塩酸塩）（例えば、Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２（４）：３１９－３２４（２００３）参照）及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号、同第２００３００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。本発明では、少なくとも１種のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することにより、多能性幹細胞の細胞凝集塊（スフェロイド）の形成及び成長を促進することができる。

培地がＹ－２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤を含む場合、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度の下限としては、例えば０．１μＭ以上、０．２μＭ以上、０．５μＭ以上、１μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、又は１０μＭ以上が好ましい。前記濃度の上限としては、細胞死が起こらない範囲であれば特に限定されないが、例えば２００μＭ以下、１５０μＭ以下、１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、４０μＭ以下、３０μＭ以下、２０μＭ以下、又は１５μＭ以下が好ましい。

本発明における浮遊培養は、多能性幹細胞をＷＮＴタンパク質分泌阻害剤の存在下において培養する工程でもよい。ＷＮＴタンパク質分泌阻害剤とは、細胞外へのＷＮＴタンパク質の分泌を抑制する効果を有する添加剤である。例えば、細胞内において膜結合型アシル基転移酵素のＰｏｒｃｕｐｉｎｅ（Ｐｏｒｃｎ）を不活化し、Ｗｎｔタンパク質のパルミチル化を抑制することで、ＷＮＴタンパク質の細胞外への分泌を抑制する。

前記ＷＮＴタンパク質分泌阻害剤としては、ＩＷＰ－２，ＩＷＰ－Ｏ１，ＩＷＰ－Ｌ６，ＩＷＰ－３，ＩＷＰ－４，ＧＮＦ－６２３１，ＷＮＴ－Ｃ５９，ＬＧＫ９７４（ＷＮＴ９７４），又はＥＴＣ－１５９（ＥＴＣ－１９２２１５９）などが挙げられる。ＩＷＰ－２などのＷＮＴタンパク質分泌阻害剤を使用する場合、培地における添加濃度は、特に限定されないが、下限としては例えば０．１μＭ以上、０．２μＭ以上、０．５μＭ以上、１μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、又は１０μＭ以上が好ましい。上限としては、例えば２００μＭ以下、１５０μＭ以下、１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、４０μＭ以下、３０μＭ以下、２０μＭ以下、又は１５μＭ以下が好ましい。

浮遊培養のための多能性幹細胞は、常法により調製したものを用いることができる。例えば、多能性幹細胞は、上記した維持培養後に、例えば機械的、化学的又は生物学的な方法により剥離し、浮遊培養のための培地に播種することができる。例えば、ＥＤＴＡ、ＴｒｙＰＬＥ^ＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ、アキュターゼ^ＴＭ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、トリプシン／ＥＤＴＡ、トリプシン／コラゲナーゼ、ＲｅＬｅＳＲ^ＴＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等を細胞剥離液として使用して培養基材から剥離又は細胞同士を剥離させ、十分に分散させてから浮遊培養に用いる。細胞を分散させるためにストレーナーを通過させて単一細胞にまで分散させることができる。

浮遊培養のための培養容器は特に限定されず、浮遊培養用のプレート、又はバイオリアクターなどを使用することができる。培養容器としては、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させるための人工的処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）がされていない培養容器を使用してもよいし、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸によるコーティング処理）がなされた培養容器を使用してもよい。また、培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。

浮遊培養は、静置培養であってもよいし、液体培地が流動する条件での培養であってもよい。静置培養を行う場合、例えば、培地の粘性等を利用してもよく、凹凸を有するマイクロウェル等を用いてもよい。液体培地が流動する条件での培養としては、スピナー等を使用して液体培地を懸濁する条件での培養であってもよいが、細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養が好ましい。細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養としては、例えば、旋回流、揺動流等の流れによる応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように液体培地が流動する条件での培養、及び直線的な往復運動により液体培地が流動する条件での培養が挙げられ、旋回流及び／又は揺動流を利用した培養が特に好ましい。

旋回培養（振盪培養）は、液体培地と細胞を収容した培養容器を概ね水平面に沿って円、楕円、扁平した円、扁平した楕円等の閉じた軌道を描くように旋回させることにより行う。旋回速度は特に限定されないが、好ましくは２００ｒｐｍ以下、１５０ｒｐｍ以下、１２０ｒｐｍ以下、１１５ｒｐｍ以下、１１０ｒｐｍ以下、１０５ｒｐｍ以下、１００ｒｐｍ以下、９５ｒｐｍ以下、又は９０ｒｐｍ以下でもよい。旋回速度の下限は特に限定されず、好ましくは１ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、５０ｒｐｍ以上、６０ｒｐｍ以上、７０ｒｐｍ以上、８０ｒｐｍ以上、又は９０ｒｐｍ以上でもよい。旋回速度がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成されやすく、好適に細胞が増殖できる。

旋回培養の際の旋回幅は特に限定されないが、好ましくは１ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、又は２５ｍｍ以上でもよい。旋回幅の上限は特に限定されず、好ましくは２００ｍｍ以下、１００ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、又は２５ｍｍ以下でもよい。旋回培養の際の回転半径もまた特に限定されないが、好ましくは旋回幅が前記の範囲となるように設定される。回転半径は好ましくは５ｍｍ以上、又は１０ｍｍ以上でもよい。回転半径の上限は特に前提されず、好ましくは１００ｍｍ以下、又は５０ｍｍ以下でもよい。旋回幅がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成されやすく、好適に細胞が増殖できる。

揺動培養は、揺動（ロッキング）撹拌により液体培地を流動させながら行う培養である。揺動培養は、液体培地と細胞を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば１分間に２回から５０回、好ましくは４回から２５回（一往復を１回とする）揺動させることができる。揺動角度は特に限定されないが、例えば０．１°から２０°、より好ましくは２°から１０°とすることができる。
更に、上記のような旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。

スピナーフラスコ状の培養容器を用いた培養は、培養容器の中に攪拌翼を使用して、液体培地を攪拌しながら行う培養である。回転数や培地量は特に限定されない。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、メーカー推奨の培養液量を好適に使用することができる。回転数は例えば１０ｒｐｍ以上、３００ｒｐｍ以下とすることができるが、特に限定されない。

浮遊培養を行う際には、培地中の多能性幹細胞の播種密度（浮遊培養の開始時の細胞密度）は適宜調整することができる。前記播種密度の下限としては、例えば１×１０^４細胞／ｍＬ以上、２×１０^４細胞／ｍＬ以上、又は１×１０^５細胞／ｍＬ以上が好ましく、上限としては例えば１×１０^７細胞／ｍＬ以下、又は１×１０^６細胞／ｍＬ以下が好ましい。播種密度がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成されやすく、好適に細胞が増殖できる。

浮遊培養の際の培地量は使用する培養容器によって適宜調整することができる。例えば１２ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が３．５ｃｍ^２）を使用する場合は、培地量は、０．５ｍＬ／ウェル以上、１．５ｍＬ／ウェル以下とすることができ、より好ましくは１ｍＬ／ウェルとすることができる。例えば６ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が９．６ｃｍ^２）を使用する場合は、培地量の下限は好ましくは１．５ｍＬ／ウェル以上、２ｍＬ／ウェル以上、又は３ｍＬ／ウェル以上でもよく、培地量の上限は好ましくは６．０ｍＬ／ウェル以下、５ｍＬ／ウェル以下、又は４ｍＬ／ウェル以下でもよい。例えば１２５ｍＬ三角フラスコ（容量が１２５ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、培地量の下限は好ましくは１０ｍＬ／容器以上、又は３０ｍＬ／容器以上でもよく、培地量の上限は好ましくは５０ｍＬ／容器以下でもよい。例えば５００ｍＬ三角フラスコ（容量が５００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、培地量の下限は好ましくは１００ｍＬ／容器以上、又は１２０ｍＬ／容器以上でもよく、培地量の上限は好ましくは１５０ｍＬ／容器以下、又は１２５ｍＬ／容器以下でもよい。例えば１０００ｍＬ三角フラスコ（容量が１０００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、培地量の下限は好ましくは２５０ｍＬ／容器以上、又は２９０ｍＬ／容器以上でもよく、培地量の上限は好ましくは３５０ｍＬ／容器以下、又は３１０ｍＬ／容器以下でもよい。例えば２０００ｍＬ三角フラスコ（容量が２０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、培地量の下限は好ましくは５００ｍＬ／容器以上、又は６００ｍＬ／容器以上でもよく、培地量の上限は好ましくは１０００ｍＬ／容器以下、又は７００ｍＬ／容器以下でもよい。例えば３０００ｍＬ三角フラスコ（容量が３０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、培地量の下限は好ましくは１０００ｍＬ／容器以上、又は１５００ｍＬ／容器以上とすることができ、培地量の上限は好ましくは２０００ｍＬ／容器以下、又は１６００ｍＬ／容器以下でもよい。例えば２Ｌ培養バッグ（容量が２Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、培地量の下限は好ましくは１００ｍＬ／バッグ以上、５００ｍＬ／バッグ以上、又は１０００ｍＬ／バッグ以上でもよく、培地量の上限は好ましくは２０００ｍＬ／バッグ以下、１５００ｍＬ／バッグ以下、又は１１００ｍＬ／バッグ以下でもよい。例えば１０Ｌ培養バッグ（容量が１０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、培地量の下限は好ましくは５００ｍＬ／バッグ以上、１Ｌ／バッグ以上、又は５Ｌ／バッグ以上でもよく、培地量の上限は好ましくは１０Ｌ／バッグ以下、又は６Ｌ／バッグ以下でもよい。例えば、２０Ｌ培養バッグ（容量が２０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、培地量の下限は好ましくは１Ｌ／バッグ以上、５Ｌ／バッグ以上、又は１０Ｌ／バッグ以上でもよく、培地量の上限は好ましくは２０Ｌ／バッグ以下、１５Ｌ／バッグ以下、又は１１Ｌ／バッグ以下でもよい。例えば５０Ｌ培養バッグ（容量が５０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、培地量の下限は好ましくは１Ｌ／バッグ以上、１０Ｌ／バッグ以上、又は２５Ｌ／バッグ以上でもよく、培地量の上限は好ましくは５０Ｌ／バッグ以下、４０Ｌ／バッグ以下、又は３０Ｌ／バッグ以下でもよい。培養液量がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成されやすく、好適に細胞が増殖できる。

使用する培養容器の容量は適宜選択することができ特に限定されないが、液体培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積の下限として、好ましくは０．３２ｃｍ^２以上、０．６５ｃｍ^２以上、１．９ｃｍ^２以上、３．０ｃｍ^２以上、３．５ｃｍ^２以上、９．０ｃｍ^２以上、又は９．６ｃｍ^２以上でもよい。前記面積の上限として、好ましくは１０００ｃｍ^２以下、５００ｃｍ^２以下、３００ｃｍ^２以下、１５０ｃｍ^２以下、７５ｃｍ^２以下、５５ｃｍ^２以下、２５ｃｍ^２以下、又は２１ｃｍ^２以下でもよい。

浮遊培養の培養温度は、特に限定されないが、好ましくは３６．０℃から３８．０℃であり、より好ましくは３６．５℃から３７．５℃である。ＣＯ_２インンキュベータ等を利用して、約１％から１０％、好ましくは５％のＣＯ_２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。

浮遊培養の培養期間は特に限定されないが、培養期間の下限は１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、又は１０日以上でもよく、培養期間の上限は３０日以下、２９日以下、２８日以下、２７日以下、２６日以下、２５日以下でもよい。

本発明において、浮遊培養する工程は、好ましくは、細胞凝集塊を形成する工程を含む。細胞凝集塊とは、複数の細胞が三次元的に凝集して形成される塊状の細胞集団であって、スフェロイドとも呼ばれる。多能性幹細胞の細胞凝集塊は、多能性幹細胞の細胞集団から形成される。また、細胞凝集塊は、通常、略球状を呈し、一般的には５０μｍから２０００μｍ程度の直径を有する。

本発明の方法により作製される細胞凝集塊の寸法は特に限定されないが、顕微鏡で観察したとき、観察像での最も幅の広い部分の寸法の上限としては、例えば１０００μｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下、又は３００μｍ以下が好ましくい。前記寸法の下限としては、例えば３０μｍ以上、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、又は１００μｍ以上が好ましい。このような寸法範囲の細胞凝集塊は、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。

本発明により形成される細胞凝集塊の集団は、前記集団を構成する細胞凝集塊のうち重量基準で、例えば１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上が上記の範囲の寸法を有することができる。上記の範囲の寸法の細胞凝集塊を２０％以上含む細胞凝集塊の集団では、個々の細胞凝集塊において、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。

また、本発明により形成される細胞凝集塊は、前記細胞凝集塊を構成する細胞のうち生細胞の割合（生存率）が、例えば５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上であることが好ましい。上記の範囲の生存率の細胞集団は、細胞の増殖に好ましい状態である。

浮遊培養を行う際には、適当な頻度で培地交換を行うことが好ましい。培地交換の頻度は特に限定されず、細胞種や培養条件により異なるが、好ましくは５日に一回以上、４日に一回以上、３日に一回以上、２日に一回以上、又は１日に一回以上の頻度で培地交換作業を行うことができる。この頻度の培地交換は、本発明に使用したような多能性幹細胞の細胞凝集塊を培養する際に特に好適である。培地交換に用いる液体培地としては、上記と同様の液体培地を用いることができ、培養の条件としては上記と同様の条件を用いることができる。培地交換の方法は特に限定されない。例えば、好ましくは細胞凝集塊を含む培養液を遠沈管に全量回収し、遠心分離又は静置状態で５分程度置き、沈降した細胞凝集塊を残して上清を除去し、その後、新鮮な液体培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度プレート等の培養容器に分散した細胞を戻すことで細胞凝集塊を継続して培養することができる。

浮遊培養を行う際には、適当な頻度で継代を行うことが好ましい。継代の頻度は特に限定されないが、好ましくは８日に一回以上、７日に一回以上、６日に一回以上、５日に一回以上、４日に一回以上、又は３日に一回以上の頻度で継代作業を行うことができる。この頻度の継代は、本発明に使用したような多能性幹細胞の細胞凝集塊を培養する際に特に好適である。継代の方法は特に限定されない。例えば、好ましくは細胞凝集塊を含む培養液を遠沈管に全量回収し、遠心分離又は静置状態で５分程度置き、沈降した細胞凝集塊を残して上清を除去し、細胞凝集塊を回収することができる。また、回収した細胞凝集塊を必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法は特に限定されないが、例えば、遠沈管に回収した細胞凝集塊に対して洗浄液を加え、再度上記の方法で細胞凝集塊を沈降させ、上清を除去することによって細胞凝集塊を洗浄することができる。洗浄回数は限定されない。洗浄液には、バッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生理食塩水、又は液体培地（基礎培地が好ましい）を使用することができる。回収した細胞凝集塊に対して、例えば機械的、化学的又は生物学的な方法により単離し、浮遊培養のための新鮮培地に播種して浮遊培養を再開することができる。継代後の浮遊培養に用いる液体培地及び培養の条件としては上記と同様の液体培地及び条件を用いることができる。単離に用いる剥離剤として例えば、ＥＤＴＡ、ＴｒｙＰＬＥ^ＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ、アキュターゼ^ＴＭ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、トリプシン／ＥＤＴＡ、トリプシン／コラゲナーゼ、ＲｅＬｅＳＲ^ＴＭ等を含む細胞剥離液を使用して培養基材から細胞を剥離又は細胞同士を剥離させ、ピペッティングやストレーナーを用いて十分に分散させて、単離した状態で細胞を播種することができる。

浮遊培養後、細胞は培養液中に浮遊した状態で存在する。したがって、細胞の回収は、静置状態又は遠心分離により上清の液体成分を除去することで達成できる。また、細胞の回収方法としてはフィルターや中空糸分離膜等を選択することもできる。静置状態で液体成分を除去する場合、培養液の入った容器を静置状態５分程度置き、沈降した細胞や細胞凝集塊を残して上清を除去すればよい。また遠心分離は、遠心力によって細胞がダメージを受けない回転速度と処理時間で行えばよい。例えば、回転速度の下限は、細胞を沈降できれば特に限定はされないが、例えば１００ｒｐｍ以上、５００ｒｐｍ以上、８００ｒｐｍ以上、又は１０００ｒｐｍ以上でとすることができる。一方、上限は細胞が遠心力によるダメージを受けない、又は受けにくい速度であればよく、例えば１４００ｒｐｍ以下、１５００ｒｐｍ以下、又は１６００ｒｐｍ以下とすることができる。また処理時間の下限は、上記回転速度により細胞を沈降できる時間であれば特に限定はされないが、例えば１０秒以上、３０秒以上、１分以上、３分以上、又は５分以上とすることができる。また、処理時間の上限は、上記回転により細胞がダメージを受けない、又は受けにくい時間であればよく、例えば３０秒以下、６分以下、８分以下、又は１０分以下とすることができる。回収した細胞は、必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法は、特に限定されない。例えば前述の浮遊培養工程における「継代方法」に記載の洗浄方法と同様に行ってもよい。洗浄液には、バッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生理食塩水、又は液体培地（基礎培地が好ましい）を使用することができる。

本発明においては、上記した浮遊培養により、培養液中に、多能性幹細胞の細胞凝集塊を形成することができる。

本発明によって製造された多能性幹細胞は、未分化性を維持できる。
細胞の未分化性は、未分化マーカーの発現状態を解析することにより確認することができる。未分化マーカーの発現状態の解析は、例えば、リアルタイムＰＣＲ、又はフローサイトメトリー等により行うことができる。未分化マーカーとしては、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＲＥＸ－１、ＬＩＮ２８、ＬＥＦＴＢ、ＧＤＦ３、ＺＦＰ４２、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＴＥＲＴ、ＫＬＦ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ等が挙げられるが、これらに限定されない。未分化マーカーとしては、上記の中でも、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇが好ましい。なお、未分化マーカーは多能性幹細胞マーカーと同義であり、両者は互換的に使用することができる。

また、細胞凝集塊を構成する多能性幹細胞は、好ましくは未分化性を保持している。

細胞凝集塊において、ＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率は、好ましくは９０％以上であり、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は９５％以上でもよい。
細胞凝集塊において、ＳＯＸ２が陽性を呈する細胞の比率は、好ましくは９０％以上であり、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上でもよい。
細胞凝集塊において、Ｎａｎｏｇが陽性を呈する細胞の比率は、好ましくは９０％以上であり、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、又は９６％以上でもよい。
前記未分化マーカーが陽性を呈する細胞の比率が前記範囲内である細胞凝集塊を構成する多能性幹細胞の細胞集団は、未分化性が高く、より均質な細胞集団である。前記未分化マーカーが陽性を呈する細胞の比率は、前記未分化マーカーに対する蛍光標識済抗体及び蛍光標識済のアイソタイプコントロール抗体を用いたフローサイトメトリー解析により測定することができる。

浮遊培養により得られる多能性幹細胞におけるＯｃｔ４の遺伝子発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０^－１以上、１．２×１０^－１以上、１．３×１０^－１以上、１．４×１０^－１以上、又は１．５×１０^－１以上であることが好ましい。

浮遊培養により得られる多能性幹細胞におけるＳＯＸ２の遺伝子発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．７×１０^－２以上、１．８×１０^－２以上、１．９×１０^－２以上、２．０×１０^－２以上、２．１×１０^－２以上、２．２×１０^－２以上、又は２．３×１０^－２以上であることが好ましい。

浮遊培養により得られる多能性幹細胞におけるＮａｎｏｇの遺伝子発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０^－２以上、１．１×１０^－２以上、１．２×１０^－２以上、１．３×１０^－２以上、１．４×１０^－２以上、１．５×１０^－２以上、１．６×１０^－２以上、１．７×１０^－２以上、１．８×１０^－２以上、１．９×１０^－２以上、又は２．０×１０^－２以上であることが好ましい。

上記未分化マーカーの発現量が前記範囲内である多能性幹細胞は、未分化性が高く、より均質な細胞集団である。

Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、中胚葉で特異的に発現する遺伝子であり、中胚葉細胞のマーカー遺伝子として用いることができる。
浮遊培養により得られる多能性幹細胞におけるＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０^－４以下、１．０×１０^－５以下、又は１．０×１０^－６以下であることが好ましい。

前記ＳＯＸ１７は、内胚葉で特異的に発現する遺伝子であり、内胚葉細胞のマーカー遺伝子として用いることができる。
浮遊培養により得られる多能性幹細胞におけるＳＯＸ１７の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０^－５以下、又は１．０×１０^－６以下であることが好ましい。

ＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する前記未分化マーカー、中胚葉マーカー及び内胚葉マーカーの相対遺伝子発現量は、定量的リアルタイムＰＣＲ解析により測定することができる。

［多能性幹細胞］
本発明によれば、上記した本発明による多能性幹細胞の製造方法により製造される多能性幹細胞が提供される。

本発明の多能性幹細胞は、未分化性を維持していることから、所望の細胞に効率よく分化誘導することができる。多能性幹細胞から所望の細胞への分化誘導のためには、任意の分化誘導培地を使用することができる。分化誘導培地としては、例えば、神経分化培地、骨芽細胞分化培地、心筋細胞分化培地、脂肪細胞分化培地、腸上皮細胞分化培地等を使用することができるが、特に限定されない。分化誘導培地としては、外胚葉分化培地、中胚葉分化培地、又は内胚葉分化培地を使用することもできる。

［体細胞の製造方法］
本発明はまた、上記した本発明による多能性幹細胞の製造方法により製造される多能性幹細胞を、分化誘導因子の存在下で培養し体細胞へと分化させることを含む、体細胞の製造方法に関する。

本発明で使用する分化誘導因子としては、例えば、ＴＧＦβシグナルに作用する物質、ＷＮＴシグナルに作用する物質、ヘッジホッグシグナルに作用する物質、ＢＭＰシグナルに作用する物質、並びにＮｏｄａｌ／アクチビンシグナルに作用する物質が挙げられ、具体的には国際公開第２０１６/０６３９８６号、国際公開第２０１２/０２０８４５号、並びに国際公開第２０１６/０６０２６０号に記載されている分化誘導因子を用いることができる。

また、本発明による多能性幹細胞の製造方法により製造される多能性幹細胞は、未分化性を維持していることから、所望の体細胞に効率よく分化誘導することができる。多能性幹細胞から所望の細胞への分化誘導のためには、任意の分化誘導培地を使用することができる。分化誘導培地としては、例えば、神経分化培地、骨芽細胞分化培地、心筋細胞分化培地、脂肪細胞分化培地、腸上皮細胞分化培地等を使用することができるが、特に限定されない。分化誘導培地としては、外胚葉分化培地、中胚葉分化培地、又は内胚葉分化培地を使用することができる。本発明の多能性幹細胞を、所望の体細胞への分化誘導に適した分化培地を用いて培養することにより、所望の体細胞を調製することができる。

多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導させることを意図する場合には、例えば、Ｄ‘Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００６ Ｎｏｖ；２４（１１）：１３９２－４０１に記載されている方法を使用することができ、ヒトＥＳ細胞をＷＮＴ３ａとアクチビンＡを含む培地中で培養することで内胚葉系細胞に分化誘導できることが示されている。

多能性幹細胞を中胚葉系細胞に分化誘導させることを意図する場合には、例えば、特表２０１３－５３０６８０号公報に記載されている方法を使用することができる。特表２０１３－５３０６８０号公報には、（ｉ）アクチビンＡおよびＷＮＴを含む培地中でヒト多能性幹細胞を培養する工程、および（ｉｉ）ＢＭＰおよびＷＮＴもしくはＷＮＴの機能等価物を含む培地中で、工程（ｉ）で得られた細胞を培養する工程を含む、ヒト多能性幹細胞から中間中胚葉系細胞の製造方法が記載されている。また、Ａｌｂｅｒｔ Ｑ Ｌａｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２５：１２１１－１２２２５，２０１５には、ヒト多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１で処理した後に、ＦＧＦ２及びレチノイン酸で処理することにより効率的に中胚葉系細胞に分化誘導できることが記載されている。本発明においても、上記文献に記載されている分化誘導因子を用いて、多能性幹細胞を中胚葉系細胞に分化誘導させることができる。

多能性幹細胞を外胚葉系細胞に分化誘導させることを意図する場合には、例えば、ＢＭＰ阻害剤（Ｎｏｇｇｉｎ等）及びＴＧＦβ／アクチビン阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養する方法（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ＳＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７，２７５－２８０（２００９））、ＢＭＰ阻害剤（Ｎｏｇｇｉｎ等）及びＮｏｄａｌ／アクチビン阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養する方法（Ｂｅａｔａ Ｓｕｒｎａｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１２；３０：１８７５－１８８４）を採用することができる。

分化誘導の培養条件は、動物細胞を培養できる条件であれば特に限定されないが、例えば、上記多様性幹細胞の維持培養と同様の条件を用いることができる。分化誘導の培養温度は、特に限定されないが、好ましくは３６．０℃から３８．０℃であり、より好ましくは３６．５℃から３７．５℃である。ＣＯ_２インンキュベータ等を利用して、約１％から１０％、好ましくは５％のＣＯ_２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。

内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などへと分化する能力を有し、一般的に、胚体内胚葉（ＤＥ）と言われることがある。多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、及びＥＯＭＥＳ等を挙げることができる。
分化誘導により得られる内胚葉系細胞におけるＳＯＸ１７の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０^－４以上、１．０×１０^－３以上、又は１．０×１０^－２以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる内胚葉系細胞におけるＦＯＸＡ２の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０^－５以上、１．０×１０^－４以上、又は１．０×１０^－３以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる内胚葉系細胞におけるＣＸＣＲ４の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０^－３以上、１．０×１０^－2以上、又は１．０×１０^－１以上であることが好ましい。

中胚葉系細胞は、体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓、血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管、脾臓、腎臓、尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）などへと分化する。中胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＦＯＸＦ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＨＡＮＤ１、ＥＶＸ１、ＩＲＸ３、ＣＤＸ２、ＴＢＸ６、ＭＩＸＬ１、ＩＳＬ１、ＳＮＡＩ２、ＦＯＸＣ１、ＣＸＣＲ４、ＶＥＧＦＲ２、及びＰＤＧＦＲα等を挙げることができる。
分化誘導により得られる中胚葉系細胞におけるＣＤＸ２の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０^－５以上、１．０×１０^－４以上、又は１．０×１０^－３以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる中胚葉系細胞におけるＣＸＣＲ４の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０^－５以上、１．０×１０^－４以上、又は１．０×１０^－３以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる中胚葉系細胞におけるＶＥＧＦＲ２の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０^－４以上、１．０×１０^－３以上、又は１．０×１０^－２以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる中胚葉系細胞におけるＰＤＧＦＲαの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０^－４以上、１．０×１０^－３以上、又は１．０×１０^－２以上であることが好ましい。

外胚葉系細胞は、皮膚の表皮や男性の尿道末端部の上皮、毛髪、爪、皮膚腺（乳腺、汗腺を含む）、感覚器（口腔、咽頭、鼻、直腸の末端部の上皮を含む、唾液腺）水晶体などを形成する。外胚葉系細胞の一部は発生過程で溝状に陥入して神経管を形成し、脳や脊髄などの中枢神経系のニューロンやメラノサイトなどの元にもなる。また末梢神経系も形成する。外胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＦＧＦ５、ＯＴＸ２、ＳＯＸ１、ＮＥＳＴＩＮ、及びＰＡＸ６等を挙げることができる。
分化誘導により得られる外胚葉系細胞におけるＰＡＸ６の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０^－６以上、１．０×１０^－５以上、又は１．０×１０^－４以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる外胚葉系細胞におけるＳＯＸ１の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０^－４以上、１．０×１０^－３以上、又は１．０×１０^－２以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる外胚葉系細胞におけるＮＥＳＴＩＮの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０^－３以上、１．０×１０^－２以上、又は５．０×１０^－２以上であることが好ましい。

本発明における製造方法により製造される体細胞は、前記本発明の多能性幹細胞の製造方法により製造された多能性幹細胞から分化誘導することができる。体細胞の種類は、生体内に存在し得る体細胞であれば特に限定されないが、例えば、体性幹細胞（骨髄、脂肪組織、歯髄、胎盤、卵膜、臍帯血、羊膜、絨毛膜等に由来する間葉系幹細胞、神経幹細胞等）、神経細胞、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、心筋細胞、心筋前駆細胞、肝細胞、肝臓前駆細胞、α細胞、β細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞、角膜細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、周細胞、骨格筋細胞、巨核球、造血幹細胞、気道上皮細胞、生殖細胞、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、Ｔ細胞、エリスロポエチン産生細胞、腸管上皮、肺胞上皮細胞、腎臓細胞等が例示できる。体細胞は、前記のような細胞に遺伝子導入された形態、または前記のような細胞においてゲノム上の対象遺伝子などがノックダウンされた形態でもよい。

以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

＜参考例１：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の接着培養＞
（工程１：ヒトｉＰＳ細胞の維持培養）
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株（京都大学ｉＰＳ細胞研究所）をＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）コートした細胞培養用ディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で維持培養を行った。培地はＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用し、毎日培地交換を行った。細胞播種時のみＹ－２７６３２（富士フイルム和光純薬社）を最終濃度が１０μＭとなるように培地に添加した。

（工程２：ヒトｉＰＳ細胞の接着培養）
前記工程１の方法で維持培養したヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株をＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジーズ社）で３分間から５分間処理してディッシュから剥離し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて、１ｍＬあたり４．６×１０^４個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎを０．５μｇ／ｃｍ^２でコートした細胞培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社）に１ウェルあたり２ｍＬの細胞懸濁液を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で接着培養を行った。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養５日目に継代を行い、培養１０日目まで接着培養を行った。Ｙ－２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で毎日培地交換を行った。培養５日目にウェルから培養上清を回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅを１ウェルあたり０．５ｍＬ添加して３分間から５分間処理してウェルから細胞を剥離し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて、１ｍＬあたり４．６×１０^４個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎを０．５μｇ／ｃｍ^２でコートした細胞培養用６ウェルプレートに、１ウェルあたり２ｍＬの細胞懸濁液を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で接着培養を継続した。培養５日目及び培養１０日目に位相差顕微鏡を用いて細胞の位相差画像を取得した。その結果を図１に示す。

＜参考例２：ヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株の接着培養＞
（工程１：ヒトｉＰＳ細胞の維持培養）
ヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株（リプロセル社）を参考例１の工程１と同じ方法で維持培養した。

（工程２：ヒトｉＰＳ細胞の接着培養）
参考例２の工程１で維持培養したＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を参考例１の工程２と同じ方法で接着培養した。培養５日目及び培養１０日目に位相差顕微鏡を用いて細胞の位相差画像を取得した。その結果を図２に示す。

＜比較例１：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の浮遊培養＞
（工程１：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の維持培養）
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を参考例１の工程１と同じ方法で維持培養した。

（工程２：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の浮遊培養）
比較例１の工程１で維持したヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株をＡｃｃｕｔａｓｅで３分間から５分間処理してディッシュから剥離し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて、１ｍＬあたり２×１０^５個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社）に１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー（オプティマ社）上で８３ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で浮遊培養を行った。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養５日目に継代を行い、培養１０日目まで浮遊培養を行った。培地交換は、以下のように行った。細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で穏やかに細胞凝集塊を再懸濁し、元のウェルに戻した。培地交換時に、培養１日目及び６日目はＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地にＹ－２７６３２を最終濃度５μＭとなるように添加し、培養２日目及び７日目はＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地にＹ－２７６３２を最終濃度２μＭとなるように添加した。培養５日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を回収し、細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して１０分間処理した。ピペッティングによって細胞凝集塊を単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて、１ｍＬあたり２×１０^５個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。浮遊培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で８３ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で浮遊培養を継続した。培養５日目及び培養１０日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。その結果を図３に示す。

＜比較例２：ヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株の浮遊培養＞
（工程１：ヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株の維持培養）
参考例１の工程１と同じ方法でヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を維持培養した。

（工程２：ヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株の浮遊培養）
比較例２の工程１で維持培養したヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を比較例１の工程２と同じ方法で浮遊培養した。培養５日目及び培養１０日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。その結果を図４に示す。

＜比較例３：定量的リアルタイムＰＣＲ解析及びＥＬＩＳＡ解析＞
参考例１、参考例２、比較例１、比較例２で得られた細胞に対し、以下に示す手順で定量的リアルタイムＰＣＲ解析を行った。
培養１０日目の細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで３から１０分間処理し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞をＴＲＩｚｏｌＴＭＲｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて溶解させた。ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標） ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ＴＲＩｚｏｌＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔで溶解させた細胞溶液からｔｏｔａｌ ＲＮＡを単離・精製した。精製したＲＮＡをＢｉｏＳｐｅｃ－ｎａｎｏ（島津製作所社）を用いて濃度測定し、４０ｎｇ分取した。分取したＲＮＡに対し、ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡社）を２μＬとＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ_２Ｏを添加して１０μＬに調製し、ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成の反応条件は、３７℃で１５分反応後、５０℃で５分反応、９８℃で５分反応を連続して行い、その後４℃に冷却した。合成したｃＤＮＡ溶液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０（ナカライテスク社）で１００倍希釈し、３８４ｗｅｌｌ ＰＣＲプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に５μＬ／ｗｅｌｌで添加した。ＫＯＤ ＳＹＢＲ(R) ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社）、５０μＭに調製したＦｏｒｗａｒｄプライマー、５０μＭに調製したＲｅｖｅｒｓｅプライマー、ＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社）を１００：１：１：４８の割合で混合し、この混合液を１５μＬ／ｗｅｌｌで前記３８４ｗｅｌｌ ＰＣＲプレートに添加して混合した。プライマーはｂＡＣＴ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＳＯＸ１７を用いた。３８４ｗｅｌｌ ＰＣＲプレートを遠心分離してウェル内の気泡を除去し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲ解析を実施した。反応条件を表１に示す。

定量的リアルタイムＰＣＲ解析に使用したプライマーの塩基配列を以下に示す(配列表の配列番号１～１２にも記載する)。
ＡＣＴＢ（Ｆ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＯＣＴ４（Ｆ）：５’－ＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＣ－３’（配列番号３）
ＯＣＴ４（Ｒ）：５’－ＴＣＧＴＴＧＴＧＣＡＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡ－３’（配列番号４）
ＳＯＸ２（Ｆ）：５’－ＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣ－３’（配列番号５）
ＳＯＸ２（Ｒ）：５’－ＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＣＣＧＴＡＣＣＡＣ－３’（配列番号６）
Ｎａｎｏｇ（Ｆ）：５’－ＡＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣ－３’（配列番号７）
Ｎａｎｏｇ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＴＣＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＧＧＴＴＣＣＣＡ－３’（配列番号８）
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｆ）：５’－ＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡＣ－３’（配列番号９）
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｒ）：５’－ＡＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＡＧＴＴＧＴＣＡＧ－３’（配列番号１０）
ＳＯＸ１７（Ｆ）：５’－ＡＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧ－３’（配列番号１１）
ＳＯＸ１７（Ｒ）：５’－ＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＣ－３’（配列番号１２）

遺伝子発現を測定した結果を表２、図５に示す。

接着培養を行った参考例１及び参考例２では、分化マーカー遺伝子であるＢｒａｃｈｙｕｒｙ及びＳＯＸ１７の遺伝子発現は検出されなかった。一方、浮遊培養を行った比較例１及び比較例２では、分化マーカー遺伝子の遺伝子発現が検出された。これらのことから、接着培養では未分化逸脱細胞は出現しなかったが、浮遊培養では未分化逸脱細胞が出現したことが明らかになった。

参考例１、参考例２、比較例１、比較例２で得られた培養５日目の培養上清に対し、以下に示す手順でＷＮＴ３Ａタンパク質のＥＬＩＳＡ解析を行い、培地中に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質濃度（ｐｇ／ｍＬ）及び細胞のＷＮＴ３Ａタンパク質量（ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ）を算出した。
ＷＮＴ３Ａ ＥＬＩＳＡキット（アビバシステムズバイオロジー社）付属の試薬及び反応用プレートを室温に戻した。キット付属のＷＮＴ３Ａ Ｓｔａｎｄａｒｄのバイアルを遠心分離し、バイアル内の粉末を集めた。キット付属の希釈液を１ｍＬ添加して混合した後、室温で１５分間静置し、最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａ溶液を調製した。前記最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａ溶液を基に、キット付属の希釈液で希釈して最終濃度０．１５６ｎｇ／ｍＬ、０．３１３ｎｇ／ｍＬ、０．６２５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａ溶液希釈系列を作成した。反応用プレートに０．１５６ｎｇ／ｍＬから１０ｎｇ／ｍＬの希釈系列及び培養５日目の培養上清を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、プレートシールを貼った。反応用プレートを３７℃で２時間反応させ、ウェル内の液を除去した。反応用プレートの各ウェルにキット付属の１×Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＷＮＴ３Ａ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、プレートシールを貼った。反応用プレートを３７℃で１時間反応させ、ウェル内の液を除去した。反応用プレートの各ウェルをキット付属の洗浄用バッファ３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。反応用プレートのウェル内の液を除去した後、キット付属の１×Ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、プレートシールを貼った。反応用プレートを３７℃で１時間反応させ、ウェル内の液を除去した。反応用プレートの各ウェルをキット付属の洗浄用バッファ３００μＬ／ｗｅｌｌで５回洗浄した。反応用プレートのウェル内の液を除去した後、キット付属のＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを９０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、プレートシールを貼った。反応用プレートを遮光環境下３７℃で２０分間反応させた後、キット付属のＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを５０μＬ／ｗｅｌｌで添加して混合し、反応を終了した。
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（モレキュラーデバイス社）を用いて４５０ｎｍ（補正波長５４０ｎｍ）で吸光度を測定し、培地中に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質濃度を算出した。また、以下の式に従い、培養５日目の生細胞数測定結果から、細胞のＷＮＴ３Ａタンパク質量（ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ）を算出した。
（細胞のＷＮＴ３Ａタンパク質量）＝（培地中に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質濃度）×（１ウェルあたりの培地液量）÷（培養５日目の生細胞数）×１０^４
算出した培地中に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質濃度及び細胞のＷＮＴ３Ａタンパク質量を表３、図６、図７に示す。

参考例１及び比較例２について培地中に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質濃度を比較すると、参考例１におけるＷＮＴ３Ａタンパク質の濃度は比較例２よりも高かった。一方で、未分化逸脱細胞は、参考例１では出現せず、比較例２では出現した。この結果は、培地中に含まれるＷＮＴタンパク質濃度が高くても、未分化逸脱細胞が出現しない場合があることを示しており、多能性幹細胞のＷＮＴタンパク質の分泌を抑制して培地中のＷＮＴタンパク質濃度を下げることで未分化逸脱細胞の出現を抑制することが開示されている非特許文献４とは矛盾する。

つまり、上記培地中のＷＮＴタンパク質濃度を下げる方法は、未分化逸脱細胞出現の問題を真に解決していない。そこで、本発明者らは浮遊培養における未分化逸脱細胞出現の原因究明と、浮遊培養において未分化逸脱細胞の出現を抑制して分化誘導に適した均質な多能性幹細胞集団を調製する方法を提供することを課題に設定した。

本発明者らは、浮遊培養における未分化逸脱細胞出現の原因を究明するためには、接着培養と浮遊培養における細胞の周囲環境の違いを考慮する必要があると考えた。接着培養では、細胞は単層のコロニーを形成するため細胞から分泌されたＷＮＴタンパク質が迅速に培地中に拡散するのに対し、浮遊培養では、細胞凝集塊を形成するために、細胞凝集塊内部で細胞から分泌されたＷＮＴタンパク質が細胞凝集塊外部の培地に拡散しにくいと推測された。これにより、浮遊培養では細胞凝集塊内部でＷＮＴタンパク質が高濃度に蓄積されるため、細胞凝集塊内部の細胞が接するＷＮＴタンパク質濃度は細胞凝集塊外部の培地中に含まれるＷＮＴタンパク質濃度よりも高くなると考えられる。つまり、浮遊培養において未分化逸脱細胞の出現を抑制するためには、培地中に含まれるＷＮＴタンパク質濃度の抑制ではなく、培地中の細胞のＷＮＴ３Ａタンパク質量（ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ）及び／又は細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質の量（μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２）の抑制が重要であると考えた。また、培地中の細胞のＷＮＴ３Ａタンパク質量（ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ）及び／又は細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質の量（μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２）は、未分化逸脱細胞の出現を予測又は評価する際の指標となるとなり得る。

なお、比較例１及び比較例２では、ＷＮＴタンパク質の細胞外への分泌量を制御せずに浮遊培養を行ったところ、未分化逸脱細胞が出現し、そのときの培地中の細胞のＷＮＴ３Ａタンパク質量は１．０ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓよりも高い値であった。

＜参考例３：接着培養における細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質の量の測定＞
比較例３の解析結果から、浮遊培養では細胞凝集塊内部においてＷＮＴタンパク質が高濃度に蓄積されるため、培地中に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質濃度は未分化性維持の指標として十分でなく、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質の量が未分化維持に重要であることが示唆された。そこで、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質の量について、接着培養において未分化維持可能な範囲を求めるため、以下の方法でＷＮＴ３Ａタンパク質を添加した接着培養を行い、模擬的に未分化逸脱細胞が出現する環境を再現した。

（工程１：ヒトｉＰＳ細胞の維持培養）
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株及びＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を、参考例１の工程１と同じ手順で維持培養した。

（工程２：培地中にＷＮＴ３Ａタンパク質を添加したヒトｉＰＳ細胞の接着培養）
参考例３の工程１の手順で維持培養したヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株及びＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株をＡｃｃｕｔａｓｅで３分間から５分間処理してディッシュから剥離し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて、１ｍＬあたり４．６×１０^４個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎを１ｃｍ^２あたり０．５μｇでコートした細胞培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社）に１ウェルあたり２ｍＬの細胞懸濁液を播種した。各ウェルにＷＮＴ３Ａタンパク質（アールアンドディーシステムス社）を最終濃度が１０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で接着培養を行った。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養５日目まで接着培養を行った。培地交換は毎日行った。培地はＹ－２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地に播種時と同じ最終濃度でＷＮＴ３Ａを添加したものを用いた。培養５日目に位相差顕微鏡を用いて細胞の位相差画像を取得した。取得した位相差画像を図８、図９に示す。また、培養５日目にウェルから培養上清を回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅを１ウェルあたり０．５ｍＬ添加して３分間から５分間処理してウェルから細胞を剥離し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。

培養５日目の位相差画像を画像解析ソフト（例えばｉｍａｇｅ Ｊ）で解析し、培養面積に対して細胞の表面積が占める割合を算出した。この値と培養面積（９．２ｃｍ^２／ｗｅｌｌ）から細胞表面が培地に接する面積を算出した。さらに、細胞表面が培地に接する面積と培養５日目の生細胞数から、１細胞あたりが培地に接する表面積（ｃｍ^２）を算出した。１細胞あたりが培地に接する表面積と添加したＷＮＴ３Ａタンパク質濃度から、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の量を算出した。各値の算出は以下の式に従った。

（培養面積に対して細胞の表面積が占める割合）＝（位相差画像視野内における細胞が占める面積）÷（位相差画像視野内の総面積）

（細胞表面が培地に接する面積）＝（１ウェルあたりの培養面積）×（培養面積に対して細胞の表面積が占める割合）

（１細胞あたりが培地に接する表面積）＝（細胞表面が培地に接する面積）÷（培養５日目の生細胞数）

（細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の量）＝(添加したＷＮＴ３Ａタンパク質濃度）÷（１細胞あたりが培地に接する表面積）

培養５日目に単細胞まで分散させて得られた細胞に対し、比較例３と同じ手順で定量的リアルタイムＰＣＲ解析を行い、得られた細胞集団の未分化性を評価した。各培養条件における、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の量及び遺伝子発現を測定した結果を表４、図１０、図１１に示す。

細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の量が６．７×１０^３μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下では分化マーカー遺伝子の発現が検出されず、未分化逸脱細胞は出現しなかった。一方で、５．２×１０^４μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以上では分化マーカー遺伝子の発現が検出され、未分化逸脱細胞が出現した。これらの結果から、接着培養において、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴタンパク質の量が、１．０×１０^４μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下である条件下で多能性幹細胞を培養すると、均質な多能性幹細胞集団を製造可能であることが明らかになった。

＜実施例１：ＷＮＴタンパク質の分泌を抑制した条件下でのヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の浮遊培養＞
（工程１：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の維持培養）
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を参考例１の工程１と同じ方法で維持培養した。

（工程２：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の浮遊培養）
細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質量を２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下に維持するような条件で浮遊培養を行った。具体的には、実施例１の工程１の方法で維持培養したヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株をＡｃｃｕｔａｓｅで３分間から５分間処理してディッシュから剥離し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて、１ｍＬあたり２×１０^５個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社）に１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。播種したウェルにＷＮＴタンパク質分泌阻害剤であるＩＷＰ－２（富士フィルム和光純薬社）を最終濃度が２μＭとなるように添加した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー（株式会社オプティマ）上で８３ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で浮遊培養を行った。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養５日目に継代を行い、培養１０日目まで浮遊培養を行った。培地交換は、以下のように行った。細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、最終濃度２μＭでＩＷＰ－２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で穏やかに細胞凝集塊を再懸濁し、元のウェルに戻した。培地交換時に、培養１日目及び６日目はＳｔｅｍＦｉｔ培地にＹ－２７６３２を最終濃度５μＭとなるように添加し、培養２日目及び７日目はＳｔｅｍＦｉｔ培地にＹ－２７６３２を最終濃度２μＭとなるように添加した。培養５日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を回収し、細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して１０分間処理した。ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて、１ｍＬあたり２×１０^５個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。浮遊培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。播種したウェルにＷＮＴタンパク質分泌阻害剤であるＩＷＰ－２（富士フィルム和光純薬社）を最終濃度が２μＭとなるように添加した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で８３ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で浮遊培養を継続した。培養５日目及び培養１０日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。その結果を図１２に示す。

＜実施例２：ＷＮＴタンパク質の分泌を抑制した条件下でのヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株の浮遊培養＞
（工程１：ヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株の維持培養）
ヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を参考例１の工程１と同じ方法で維持培養した。

（工程２：ヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株の浮遊培養）
細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質量を２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下に維持するような条件で浮遊培養を行った。具体的には、実施例２の工程１で維持培養したヒトｉＰＳ細胞ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を実施例１の工程２と同じ方法で浮遊培養した。培養５日目及び培養１０日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。その結果を図１３に示す。

＜実施例３：定量的リアルタイムＰＣＲ解析及びＥＬＩＳＡ解析＞
実施例１及び実施例２で得られた細胞集団について比較例３と同様の方法で、定量的リアルタイムＰＣＲ解析を行った。遺伝子発現を測定した結果を表５に示す。

実施例１及び実施例２のいずれにおいても、分化マーカー遺伝子であるＢｒａｃｈｙｕｒｙ及びＳＯＸ１７の遺伝子発現は検出されず、未分化逸脱細胞は出現しなかった。

実施例１及び実施例２で得られた培養５日目の培養上清について比較例３と同様の方法で、ＷＮＴ３Ａタンパク質のＥＬＩＳＡ解析を行い、培養５日目の培地中におけるＷＮＴ３Ａタンパク質の濃度及び細胞のＷＮＴ３Ａタンパク質量を分析した。算出した培地中に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質濃度及び細胞のＷＮＴ３Ａタンパク質量を表６に示す。

実施例１及び実施例２のいずれにおいても、細胞のＷＮＴ３Ａタンパク質量は、１．０ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下であった。つまり、浮遊培養の際には、培地中において、細胞のＷＮＴタンパク質量を１．０ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下で浮遊培養すれば、未分化性を維持した、均質な多能性幹細胞集団を取得することが可能であることが分かった。

＜実施例４：浮遊培養における細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質の量の算出＞
比較例３の解析結果から、浮遊培養では細胞凝集塊内部においてＷＮＴタンパク質が高濃度に蓄積されるため、培地中に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質濃度は未分化性維持の指標として十分でなく、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質の量が未分化維持に重要であることが示唆された。そこで、以下の手順で、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質の量について、浮遊培養において未分化維持可能な範囲を算出した。

（工程１：細胞凝集塊の直径と１細胞凝集塊に含まれる細胞数の関係式算出）
比較例１及び比較例２、実施例１及び実施例２と同じ方法で培養５日目まで浮遊培養を行い、培養５日目に生細胞数の測定と細胞凝集塊画像の取得を行った。さらに、培養５日目において位相差顕微鏡で細胞凝集塊の個数を測定した。画像解析ソフト（例えばｉｍａｇｅ Ｊ）で細胞凝集塊画像を解析し、細胞凝集塊の直径を測定した。各培養条件について細胞凝集塊１０個の直径を測定し、それらの平均直径を算出した。また、培養５日目に測定した生細胞数及び細胞凝集塊数を用いて、以下の式に従って１細胞凝集塊に含まれる細胞数（ｃｅｌｌｓ／ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を算出した。
（１細胞凝集塊に含まれる細胞数）＝（生細胞数）÷（細胞凝集塊数）

測定した細胞凝集塊の平均直径と１細胞凝集塊に含まれる細胞数を表７に示す。

細胞凝集塊の平均直径と１細胞凝集塊に含まれる細胞数をグラフにプロットし、２次近似で近似曲線を作成した。プロットしたグラフを図１４に示す。その結果、細胞凝集塊の直径と１細胞凝集塊に含まれる細胞数の関係は以下の近似式で表された。
（１細胞凝集塊に含まれる細胞数）
＝０．１１１×（細胞凝集塊の直径）^２－０．９５８５×（細胞凝集塊の直径）

（工程２：１細胞あたりが培地に接する表面積の算出）
比較例１及び比較例２、並びに実施例１及び実施例２で得られた培養５日目の細胞凝集塊画像を、画像解析ソフト（例えばｉｍａｇｅ Ｊ）で解析し、細胞凝集塊の直径を測定した。比較例１及び比較例２、並びに実施例１及び実施例２のそれぞれについて、細胞凝集塊１０個の直径を測定し、それらの平均直径を算出した。実施例４の工程１にて算出した近似式を用いて、比較例１及び比較例２、並びに実施例１及び実施例２における細胞凝集塊の平均直径から１細胞凝集塊に含まれる細胞数を算出した。また、細胞凝集塊を球と仮定して、細胞凝集塊の平均直径から細胞凝集塊の体積を算出した。さらに、細胞凝集塊に含まれる細胞の充填率は１００％であると仮定して、細胞凝集塊の体積と１細胞凝集塊に含まれる細胞数から１細胞の体積を算出した。細胞凝集塊に含まれる細胞が球であると仮定して、１細胞の体積から１細胞の直径を算出した。そして、１細胞の直径から１細胞の表面積を算出し、これを１細胞あたりが培地に接する表面積とした。各値の算出は以下の式に従った。

（細胞凝集塊の体積）＝４÷３×π（円周率）×（（細胞凝集塊の直径）÷２）^３
（１細胞の体積）＝（細胞凝集塊の体積）÷（１細胞凝集塊に含まれる細胞数）
（１細胞の直径）＝２×（３÷（４×π）×（１細胞の体積））^１／３
（１細胞あたりが培地に接する表面積）＝４×π×（（１細胞の直径）÷２）^２

（工程３：細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質の量の算出）
比較例３及び実施例３で測定した培地中に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質濃度と、実施例４の工程２で算出した１細胞あたりが培地に接する表面積から、浮遊培養に関して、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質の量を算出した。この値の算出は以下の式に従った。

（細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の量）＝(培地中に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の濃度）÷（１細胞あたりが培地に接する表面積）

比較例１及び比較例２、実施例１及び実施例２の細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質の量を表８に示す。

実施例１及び実施例２のいずれにおいても、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の量は、２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下であった。つまり、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の量を２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下で浮遊培養すれば、未分化性を維持した、均質な多能性幹細胞集団を取得することが可能であることが分かった。
また、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の量について、参考例３の接着培養と実施例４の浮遊培養の場合では、未分化維持可能な範囲が顕著に異なることが明らかになった。

＜実施例５：フローサイトメトリー解析＞
参考例１及び参考例２、比較例１及び比較例２、並びに実施例１及び実施例２で得られた培養１０日目の細胞を以下の手順でフローサイトメトリー解析し、得られた細胞集団の均質性を評価した。
培養１０日目の細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで３分間から１０分間処理し、ピペッティングによって単細胞まで分散させ、ＰＢＳ（－）で懸濁した。この細胞懸濁液の一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。生細胞数を基に２×１０^６個の細胞を分取し、ＰＢＳ（－）で洗浄した。その後、４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）により室温で２０分間固定後、ＰＢＳ（－）で３回洗浄し、冷メタノールにより－２０℃で一晩透過処理を行った。ＰＢＳ（－）で３回洗浄後、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳ（－）によりブロッキングした。その後、細胞のサンプルを２つに分注し、それぞれ３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳ（－）を用いて５０μＬずつに懸濁した。分注したサンプルに対し、一方にはＯＣＴ４抗体、ＳＯＸ２抗体、又はＮａｎｏｇ抗体を添加し、もう一方にはアイソタイプコントロール抗体を添加した。使用した抗体及びその添加量を表９に記載する。各抗体を添加した後混合し、４℃で１時間染色した。

３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳ（－）で１回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ（メルク社）にて解析した。その結果を表１０、図１５、図１６に示す。

接着培養を行った参考例１及び参考例２では、未分化マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、又はＮａｎｏｇが陽性を呈する細胞の比率は９５％以上であった。浮遊培養を行った比較例１及び比較例２では、これらの比率が低下したことから、未分化逸脱細胞が出現し、細胞集団の均質性が低下することが分かった。細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質量を２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下に維持するような条件で浮遊培養を行った実施例１及び実施例２では、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、又はＮａｎｏｇの未分化マーカーが陽性を呈する細胞の比率は９５％以上であり、未分化逸脱細胞の出現を抑制して均質な細胞集団が得られた。つまり、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴタンパク質量を２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下に維持する条件下で浮遊培養した場合には、均質な多能性幹細胞集団を取得することが可能であることが明らかになった。

＜比較例４：三胚葉系細胞への分化誘導＞
以下の手順で多能性幹細胞の分化誘導を行った。下記工程における培養日数は全て、全て工程１における浮遊培養の開始日を０日目としてカウントしている。

（工程１：多能性幹細胞集団の調製）
比較例１と同じ方法で浮遊培養を行い、培養１０日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収した。遠沈管を５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた後、培養上清を除去した。細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して１０分間処理し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて、１ｍＬあたり２×１０^５個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。浮遊培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で８３ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で培養１２日目まで浮遊培養を継続した。培養１１日目に、Ｙ－２７６３_２を最終濃度５μＭで含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で培地交換を行った。培地交換は、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させ、その後、培養上清を除去し、新鮮培地で穏やかに再懸濁して元のウェルに戻すことにより行った。
工程１の浮遊培養において、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の量は、比較例１と同等レベルであると考えられる。つまり、浮遊培養中、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質量は、２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下に維持されない。また、培地中の多能性幹細胞のＷＮＴ３Ａタンパク質量は１．０ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下に維持されない。

（工程２－Ａ：内胚葉分化誘導）
前記工程１の後、内胚葉分化誘導を行った。培養１２日目及び１３日目に表１１の内胚葉分化誘導培地１で培地交換を行い、培養１４日目に表１１の内胚葉分化誘導培地２で培地交換を行い、培養１５日目に表１１の内胚葉分化誘導培地３で培地交換を行った。培地交換は、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させ、その後、培養上清を除去し、新鮮培地で穏やかに再懸濁して元のウェルに戻すことにより行った。その後、培養１６日目まで浮遊培養を継続し、内胚葉分化誘導した細胞サンプルとした。

（工程２－Ｂ：中胚葉分化誘導）
前記工程１の後、中胚葉分化誘導を行った。培養１２日目に表１２の中胚葉分化誘導培地１で培地交換を行い、培養１３日目に表１２の中胚葉分化誘導培地２で培地交換を行った。培地交換は、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させ、その後、培養上清を除去し、新鮮培地で穏やかに再懸濁して元のウェルに戻すことにより行った。その後、培養１５日目まで浮遊培養を継続し、中胚葉分化誘導した細胞サンプルとした。

（工程２－Ｃ：外胚葉分化誘導）
前記工程１の後、外胚葉分化誘導を行った。培養１２日目から１６日目まで毎日、表１３の外胚葉分化誘導培地で培地交換を行った。培地交換は、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させ、その後、培養上清を除去し、新鮮培地で穏やかに再懸濁して元のウェルに戻すことにより行った。その後、培養１７日目まで浮遊培養を継続し、外胚葉分化誘導した細胞サンプルとした。

＜実施例６：三胚葉系細胞への分化誘導＞
以下の手順で多能性幹細胞の分化誘導を行った。

（工程１：多能性幹細胞集団の調製）
培養１０日目まで実施例１と同じ方法で浮遊培養を行った点と、培養１０日目の播種培地と培養１１日目の培地交換培地にＩＷＰ－２を最終濃度２μＭとなるように添加した点を除いて、比較例４の工程１と同じ方法で多能性幹細胞集団を調製した。
工程１の浮遊培養において、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の量は、実施例１と同等レベルであると考えられる。つまり、浮遊培養中、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地中に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質量は、２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下に維持される。また、培地中の多能性幹細胞のＷＮＴ３Ａタンパク質量は１．０ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下に維持される。

（工程２－Ａ：内胚葉分化誘導）
前記工程１の後、比較例４の工程２―Ａと同じ手順で内胚葉分化誘導を行った。

（工程２－Ｂ：中胚葉分化誘導）
前記工程１の後、比較例４の工程２―Ｂと同じ手順で中胚葉分化誘導を行った。

（工程２－Ｃ：外胚葉分化誘導）
前記工程１の後、比較例４の工程２―Ｃと同じ手順で外胚葉分化誘導を行った。

＜実施例７：定量的リアルタイムＰＣＲ解析による分化誘導効率の比較＞
比較例４及び実施例６にて三胚葉系細胞へ分化誘導した細胞集団を、比較例３と同じ手順で定量的リアルタイムＰＣＲ解析した。

内胚葉分化誘導したサンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ解析に使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＡＣＴＢ（Ｆ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＳＯＸ１７（Ｆ）：５’－ＡＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧ－３’（配列番号１１）
ＳＯＸ１７（Ｒ）：５’－ＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＣ－３’（配列番号１２）
ＦＯＸＡ２（Ｆ）：５’－ＧＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＧＴＧ－３’（配列番号１３）
ＦＯＸＡ２（Ｒ）：５’－ＧＣＣＧＡＣＡＴＧＣＴＣＡＴＧＴＡＣＧＴＧＴＴ－３’（配列番号１４）
ＣＸＣＲ４（Ｆ）：５’－ＡＣＴＧＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＣＧＧＡＣＡＡＧ－３’（配列番号１５）
ＣＸＣＲ４（Ｒ）：５’－ＡＧＧＴＡＧＣＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧ－３’（配列番号１６）

中胚葉分化誘導したサンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ解析に使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＡＣＴＢ（Ｆ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＣＤＸ２（Ｆ）：５’－ＣＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＡＧＡＣＣＴＡＣ－３’（配列番号１７）
ＣＤＸ２（Ｒ）：５’－ＧＴＣＡＧＴＣＣＡＧＧＣＡＡＴＧＣＴＴＣ－３’（配列番号１８）
ＣＸＣＲ４（Ｆ）：５’－ＡＣＴＧＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＣＧＧＡＣＡＡＧ－３’（配列番号１５）
ＣＸＣＲ４（Ｒ）：５’－ＡＧＧＴＡＧＣＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧ－３’（配列番号１６）
ＶＥＧＦＲ２（Ｆ）：５’－ＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＡＣ－３’（配列番号１９）
ＶＥＧＦＲ２（Ｒ）：５’－ＴＣＴＣＣＣＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＣＣＧ－３’（配列番号２０）
ＰＤＧＦＲα（Ｆ）：５’－ＧＣＴＧＡＧＣＣＴＡＡＴＣＣＴＣＴＧＣＣ－３’ 配列番号２１）
ＰＤＧＦＲα（Ｒ）：５’－ＡＣＴＧＣＴＣＡＣＴＴＣＣＡＡＧＡＣＣＧ－３’（配列番号２２）

外胚葉分化誘導したサンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ解析に使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＡＣＴＢ（Ｆ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＰＡＸ６（Ｆ）：５’－ＡＧＧＡＡＴＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＣＡＡＧＧ－３’（配列番号２３）
ＰＡＸ６（Ｒ）：５’－ＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧ－３’（配列番号２４）
ＳＯＸ１（Ｆ）：５’－ＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＣＡＣＴＴＡＣ－３’（配列番号２５）
ＳＯＸ１（Ｒ）：５’－ＡＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＧＴＣＴＧＡＡＧＧ－３’（配列番号２６）
ＮＥＳＴＩＮ（Ｆ）：５’－ＴＣＡＡＧＣＡＣＣＡＣＴＧＴＧＧＡＣＴＣ－３’（配列番号２７）
ＮＥＳＴＩＮ（Ｒ）：５’－ＡＧＧＴＴＣＣＡＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡ－３’（配列番号２８）

遺伝子発現量を測定した結果を表１４から表１６及び図１７に示す。

実施例６は、比較例４と比べて、内胚葉分化誘導後の内胚葉分化マーカー遺伝子（ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、及びＣＸＣＲ４）の発現量が高い傾向を示した。また、中胚葉分化誘導後の中胚葉分化マーカー遺伝子（ＣＤＸ２、ＣＸＣＲ４、ＶＥＧＦＲ２、及びＰＤＧＦＲα）と、外胚葉分化誘導後の外胚葉分化マーカー遺伝子（ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、及びＮＥＳＴＩＮ）の発現量も同様に、実施例６は、比較例４と比べて、高い傾向を示した。

これらの結果より、細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴタンパク質の量を２．９×１０^２μｇ・ｍＬｃｍ^２以下に維持する条件下で多能性幹細胞集団を調製することにより、三胚葉系細胞への分化誘導効率が高まるということが明らかになった。

＜実施例７：三胚葉系細胞への分化誘導＞
参考例１、参考例２、比較例１、比較例２、実施例１、実施例２で得られた培養１０日目の細胞について、Ｓｕｎｄａｒｉ Ｃｈｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０（６）：５５３－５５６，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１３に記載されている以下の手順で三胚葉系細胞へ分化誘導することが可能である。

（工程１：分化誘導細胞の調製）
参考例１、参考例２、比較例１、比較例２、実施例１、実施例２で得られた培養１０日目の細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで３から１０分間処理し、ピペッティングによって単細胞まで分散させる。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２及び最終濃度２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を含むＭＥＦ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定する。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２及び最終濃度２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むＭＥＦ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地を用いて１ｍＬあたり５×１０^５ 個の細胞を含むように調製する。Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）をコートした細胞培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬの細胞懸濁液を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で接着培養を行う。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養１日目に最終濃度２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むＭＥＦ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地で培地交換を行う。

（工程２－Ａ：外胚葉系細胞への分化誘導）
実施例７の工程１で調製した細胞に対し、培養２日目に最終濃度１０％でｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、最終濃度５００ｎｇ／ｍＬでＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｙｔｅｍｓ社）、最終濃度１０μＭでＳＢ４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ社）を含むＫｎｏｃｋＯｕｔ－ＤＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で培地交換する。培養３日目も同じ培地を用いて培地交換し、培養４日目に外胚葉系細胞集団を得ることができる。

（工程２－Ｂ：中胚葉系細胞への分化誘導）
実施例７の工程１で調製した細胞に対し、培養２日目に最終濃度１００ｎｇ／ｍＬで組み換えヒトＡｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加したＲＰＭＩ－Ｂ２７（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）培地で培地交換する。培養３、４、５日目に最終濃度１０ｎｇ／ｍＬで組み換えヒトＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加したＲＰＭＩ－Ｂ２７（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）培地で培地交換することで、培養６日目に中胚葉系細胞集団を得ることができる。

（工程２－Ｃ：内胚葉系細胞への分化誘導）
実施例７の工程１で調製した細胞に対し、培養２日目に最終濃度２．５ｇ／ＬでＮａＨＣＯ_３、最終濃度１％でｇｌｕｔａｍａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、最終濃度５．５ｍＭでｇｌｕｃｏｓｅ、最終濃度０．１％でＦＡＦ－ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ／Ｌａｍｐｉｒｅ社）、５００００倍希釈になるようにＩＴＳ：Ｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、最終濃度２０ｎｇ／ｍＬでＷＮＴ３Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬでＡｃｔｉｖｉｎ Ａを添加したＭＣＤＢ－１３１培地で培地交換する。培養３、４、５日目に前記添加剤のうちＷＮＴ３Ａ以外を添加したＭＣＤＢ－１３１培地で培地交換することで培養６日目に内胚葉系細胞集団を得ることができる。

（工程３：分化誘導効率の測定）
前記工程２－Ａ、Ｂ、Ｃで得られた細胞集団について、以下の方法で免疫蛍光染色を行い、三胚葉系細胞への分化誘導効率を求めることができる。
前記工程２－Ａ、Ｂ、Ｃで得られた細胞に対し、ＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドで３０分間反応させて細胞を固定化する。細胞をＰＢＳで洗浄し、最終濃度５％でロバ血清、最終濃度０．３％でＴｒｉｔｏｎを含むＰＢＳを添加して、室温で１時間反応させてブロッキングを行う。その後、各サンプルに対して１次抗体を５００倍希釈になるように添加し、１晩反応させる。１次抗体は外胚葉系細胞に対しては抗Ｓｏｘ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、中胚葉系細胞に対しては抗Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、内胚葉系細胞に対しては抗Ｓｏｘ１７抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用する。１次抗体反応後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１次抗体に対応したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４で標識された２次抗体を５００倍希釈になるように添加し、室温で１時間反応させる。反応後、ＰＢＳで洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を１０００倍希釈になるように添加して、核染色を行う。免疫蛍光染色された細胞を、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５ Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ （ＨＣＳ） Ｐｌａｔｆｏｒｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、１０倍視野で１ウェルあたり３０枚ずつ画像取得する。取得した画像の標識された核の数から細胞数を算出し、各抗体で標識された細胞の数から各三胚葉系細胞の数を算出する。視野内の細胞数に対する各三胚葉系細胞の数から分化誘導効率を求めることができる。

Claims (12)

1. 下記式（１）により算出される、多能性幹細胞の細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の量を、２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下に維持する条件下において、多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞の製造方法。
   （１） （細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の量）＝(培地のＷＮＴ３Ａタンパク質の濃度）÷（１細胞あたりが培地に接する表面積）
2. 培地中において、多能性幹細胞１０^４個あたりのＷＮＴ３Ａタンパク質量が１．０ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＷＮＴ３Ａタンパク質が、多能性幹細胞から分泌される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記培地が、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
5. 前記培地が、ＦＧＦ２を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
6. 前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を形成する工程を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
7. 前記細胞凝集塊において、ＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、ＳＯＸ２が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、Ｎａｎｏｇが陽性を呈する細胞の比率が９０％以上である、請求項６に記載の方法。
8. 前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
9. 下記式（１）により算出される、多能性幹細胞の細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の量が２．９×１０^２μｇ／ｍＬ・ｃｍ^２以下であること；及び
   培地中における多能性幹細胞１０^４個あたりのＷＮＴ３Ａタンパク質量が１．０ｐｇ／１０^４ｃｅｌｌｓ以下であること：
   の何れか一以上を指標として、浮遊培養における、多能性幹細胞の未分化性をモニタリングする方法。
   （１） （細胞表面の単位面積あたりに接する単位培地に含まれるＷＮＴ３Ａタンパク質の量）＝(培地のＷＮＴ３Ａタンパク質の濃度）÷（１細胞あたりが培地に接する表面積）
10. 請求項１から８の何れか一項に記載の方法により多能性幹細胞を製造する工程、及び
    前記多能性幹細胞を分化誘導因子の存在下で培養する工程
    を含む、体細胞の製造方法。
11. 前記体細胞が、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、及び外胚葉系細胞からなる群より選択される、請求項１０に記載の製造方法。
12. 前記体細胞が、心筋細胞、骨格筋細胞、神経細胞、巨核球、造血幹細胞、気道上皮細胞、生殖細胞、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、軟骨細胞、T細胞、エリスロポエチン産生細胞、腸管上皮、膵臓細胞、肝細胞、肺胞上皮細胞、及び腎臓細胞からなる群より選択される少なくとも１つである、
    請求項１０に記載の製造方法。

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