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JP7507495B2 - 核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体ならびに調製方法と使用 - Google Patents

核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体ならびに調製方法と使用 Download PDF

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Description

本開示は、アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）遺伝子発現を抑制できる核酸、当該核酸を含む組成物と複合体に関する。本開示は、さらに、これらの核酸、組成物及び複合体の調製方法と使用に関する。
脂質（血中脂質）異常は、高脂血症とも呼ばれ、脂肪代謝又は作動の異常により、血漿脂質が正常値より高くなる全身性疾患であり、全世界の患者の健康に深刻な脅威を与えている。従来の脂質異常治療薬としては、主にスタチン系、コレステロール吸収阻害剤、樹脂系、プロブコール、フィブラート系及びニコチン酸並びにその誘導体がある。
アポリポタンパク質Ｃ３は、脂質代謝に重要な役割を果たし、ＡＰＯＣ３変異遺伝子を保有する人は、血液循環中のＡＰＯＣ３の発現量が４６％低下し、血漿中のトリグリセリドレベルが一般の人と比較して３９％低下する。また、低い脂質レベルにより、ＡＰＯＣ３変異遺伝子保有者の心臓病のリスクを非保有者と比較して３５．１％低下させることができる。したがって、遺伝子レベルで遺伝子発現をサイレンシングさせ、ＡＰＯＣ３の生成を遮断することができれば、疑いなく最も理想的な治療手段となるであろう。また、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）というメカニズムに基づき、興味あるいずれかの目的とする遺伝子の発現を配列特異的に抑制又は遮断し、疾患を治療する目的を達成することができる。
低分子ＲＮＡ薬物の開発において、適切なｓｉＲＮＡの配列及び修飾並びにその送達系は、２つのキー技術である。
いくつかの実施形態において、本開示は、式（３０８）に示される構造を有するｓｉＲＮＡ複合体を提供する。
Figure 0007507495000001
 式中、ｎ１は、１～３から選択される整数であり、ｎ３は、０～４から選択される整数であり、ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２～１０から選択される整数であり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈであり、又はＣ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０アルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基である。
Figure 0007507495000002
 式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、
ＮｕはｓｉＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｓｉＲＮＡのうちの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、ｉ）～ｖ）から選択される１組であり、
ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＺａ１－３’（配列番号１）、
５’－Ｚａ２ＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡ－３’（配列番号２）
ただし、Ｚａ１はＡであり、Ｚａ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺａ１に対応するヌクレオチドＺａ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺａ２に対応するヌクレオチドＺａ４が含まれ、前記Ｚａ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１３に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１４に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＺｂ１－３’（配列番号１３）、
５’－Ｚｂ２ＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵ－３’（配列番号１４）
ただし、Ｚｂ１はＡであり、Ｚｂ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｂ１に対応するヌクレオチドＺｂ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｂ２に対応するヌクレオチドＺｂ４が含まれ、前記Ｚｂ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２５に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２６に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＣＵＺｃ１－３’（配列番号２５）、
５’－Ｚｃ２ＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡ－３’（配列番号２６）
ただし、Ｚｃ１はＡであり、Ｚｃ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｃ１に対応するヌクレオチドＺｃ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｃ２に対応するヌクレオチドＺｃ４が含まれ、前記Ｚｃ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３７に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３８に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＺｄ１－３’（配列番号３７）、
５’－Ｚｄ２ＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵ－３’（配列番号３８）
ただし、Ｚｄ１はＡであり、Ｚｄ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｄ１に対応するヌクレオチドＺｄ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｄ２に対応するヌクレオチドＺｄ４が含まれ、前記Ｚｄ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号４９に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号５０に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＺｅ１－３’（配列番号４９）、
５’－Ｚｅ２ＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣ－３’（配列番号５０）
ただし、Ｚｅ１はＡであり、Ｚｅ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｅ１に対応するヌクレオチドＺｅ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｅ２に対応するヌクレオチドＺｅ４が含まれ、前記Ｚｅ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
Ｒ２は、長さ１～２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
各Ｌ１は、長さ１～７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
Figure 0007507495000003
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、
Ｍ１は標的基を表す。
いくつかの実施形態において、本開示は、アポリポタンパク質Ｃ３遺伝子発現を抑制できるｓｉＲＮＡを提供する。前記ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドは、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、ｉ）～ｖ）から選択される１組であり、
ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＺａ１－３’（配列番号１）、
５’－Ｚａ２ＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡ－３’（配列番号２）
ただし、Ｚａ１はＡであり、Ｚａ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺａ１に対応するヌクレオチドＺａ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺａ２に対応するヌクレオチドＺａ４が含まれ、前記Ｚａ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１３に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１４に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＺｂ１－３’（配列番号１３）、
５’－Ｚｂ２ＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵ－３’（配列番号１４）
ただし、Ｚｂ１はＡであり、Ｚｂ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｂ１に対応するヌクレオチドＺｂ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｂ２に対応するヌクレオチドＺｂ４が含まれ、前記Ｚｂ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２５に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２６に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＣＵＺｃ１－３’（配列番号２５）、
５’－Ｚｃ２ＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡ－３’（配列番号２６）
ただし、Ｚｃ１はＡであり、Ｚｃ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｃ１に対応するヌクレオチドＺｃ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｃ２に対応するヌクレオチドＺｃ４が含まれ、前記Ｚｃ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３７に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３８に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＺｄ１－３’（配列番号３７）、
５’－Ｚｄ２ＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵ－３’（配列番号３８）
ただし、Ｚｄ１はＡであり、Ｚｄ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｄ１に対応するヌクレオチドＺｄ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｄ２に対応するヌクレオチドＺｄ４が含まれ、前記Ｚｄ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号４９に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号５０に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＺｅ１－３’（配列番号４９）、
５’－Ｚｅ２ＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣ－３’（配列番号５０）
ただし、Ｚｅ１はＡであり、Ｚｅ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｅ１に対応するヌクレオチドＺｅ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｅ２に対応するヌクレオチドＺｅ４が含まれ、前記Ｚｅ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つである。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチドは、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドから選択される１つであり、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択される１つである。
いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示は、上記本開示のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の、前記アポリポタンパク質Ｃ３遺伝子の異常発現による脂質異常の治療及び／又は予防のための薬物の調製への使用を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を脂質異常に罹患している被験体に投与することを含む、脂質異常の治療及び／又は予防方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を肝細胞と接触させることを含む、前記肝細胞におけるアポリポタンパク質Ｃ３遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を含むキットを提供する。
本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、当該ｓｉＲＮＡを含む組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、良好な安定性、高い遺伝子抑制活性を有し、及び／又は脂質レベルを顕著に低下させることができる。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、優れたＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ抑制特性を示し、１ｍｇ／ｋｇの用量で、高脂血症モデルマウスの肝臓における少なくとも８２．０％のＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの発現を抑制した。
実験において、従来技術で提供される複合分子によって形成された複合体と比較して、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体が優れた脂質低下能力を示し、かつ、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、低投与量、少ない投与頻度で、１８９日間に及ぶ実験期間中、優れた脂質抑制作用を持続的に示すことができることが明らかになった。
例えば、複合体２、４及び５については、７７日間以内、３つの複合体を３ｍｇ／ｋｇで単回投与したところ、ＴＧに対する抑制率は７７日間と長期間にわたって７０～９０％に維持され、ＣＨＯに対する抑制率も、同様に７７日間、常に基本的に５０％に維持され、かつＴＧに対する抑制率が約５０％以上に維持された期間は１４７日間に上った。投与量を１ｍｇ／ｋｇにしたところ、単回投与後７日目に、３つの複合体によるＴＧに対する抑制率はいずれも約８０％に達し、かつ４９日間と長期間にわたって５０％以上のＴＧ含有量の低減効果が持続的に示され、また、単回投与３５日後に、１ｍｇ／ｋｇ用量群の３つの複合体は、依然として少なくとも約５０％のＣＨＯ含有量の低減効果を示した。複合体１については、３ｍｇ／ｋｇ用量群又は１ｍｇ／ｋｇ用量群のいずれも、１１２日間と長期間にわたりトランスジェニックマウスのＴＧ及びＣＨＯレベルを顕著に低下させることができ、かつ該低減効果は、比較複合体２より明らかに優れていた。薬剤の単回投与５６日間、３ｍｇ／ｋｇ用量群又は１ｍｇ／ｋｇ用量群のいずれも、複合体１によるＴＧ及びＣＨＯに対する抑制率はいずれも５０％以上であり、かつＴＧに対する抑制作用がより顕著であった。１１２日間と長期間にわたり、２つの用量作用でのＴＧレベルは常に５０％程度に維持された。
また、例えば、複合体３は、９８日間と長期間にわたり、トランスジェニックマウスのＴＧ及びＣＨＯレベルを顕著に低下させることができる。複合体３を３ｍｇ／ｋｇで単回投与後１４日目に、ＴＧに対する抑制率は９３．６％に達し、単回投与後７日目に、ＣＨＯに対する抑制率は６３．０％に達した。複合体４、６、７は、２つの用量でヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスに対していずれも顕著な脂質低下作用を有し、３ｍｇ／ｋｇ用量群では、薬剤投与後８４日間、ＴＧに対する抑制率が常に５０％以上に維持され、ＣＨＯに対する抑制率が３０％以上に維持された。３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇでは、複合体４、６及び７によるＴＧに対する抑制作用は常に比較複合体２より強く、ＣＨＯに対する抑制も同様の傾向があることに注意すべきである。
複合体８及び９について、異なる時点でＴＧ抑制のＥＤ５０値をテストした。ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスに対して、複合体８を０．１６ｍｇ／ｋｇ又は複合体９を０．１１ｍｇ／ｋｇで単回皮下注射するだけで、投与後半月の時点でも半分の血清ＴＧ含有量の低減が可能であるという治療効果を達成でき、本開示の複合体を１ｍｇ／ｋｇ未満で単回皮下注射するだけで、投与後１ヶ月の時点でも半分の血清ＴＧ含有量の低減が可能であるという効果を達成できることを、予期し得る。
このように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、アポリポタンパク質Ｃ３遺伝子の発現を抑制し、アポリポタンパク質Ｃ３遺伝子過剰発現による脂質異常を効果的に治療及び／又は予防することができ、応用において明るい見通しを有している。
本開示の他の特徴と利点については、後述する発明を実施するための形態部分において詳しく説明する。
本発明の実施例及び従来技術の技術的解決手段をより明瞭に説明するために、以下に、実施例と従来技術に用いられる図面を簡単に説明する。以下に説明される図面は、単に本発明のいくつかの実施例に過ぎないことが明らかである。
トランスフェクションされていないＨｕｈ７細胞と、Ｈｕｈ７細胞において異なる複合体を異なる最終濃度までトランスフェクションしたときのＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量のヒストグラムである。 生理食塩水と異なる用量の各複合体を投与したヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスにおける血清総コレステロール（ＣＨＯ）レベル及びトリグリセリド（ＴＧ）レベルの経時的変化図である。 生理食塩水および異なる用量の複合体４を投与したヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内の肝臓組織におけるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量の散布図である。
以下に本開示の発明を実施するための形態を詳しく説明する。また、ここで説明される発明を実施するための形態は、本開示を説明又は解釈するためのものに過ぎず、本開示を制限するためのものではないと理解すべきである。
本開示において、ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ配列とは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００００４０．１に示される配列を指す。さらに、特に説明がない限り、本開示において用いられる用語「標的遺伝子」とは、上記ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡを発現する遺伝子を指し、用語「標的ｍＲＮＡ」とは、上記ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡを指す。
［定義］
文脈において、特に説明がない限り、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表す。いくつかの実施形態において、Ｐ１は、特定の修飾がＶＰ、Ｐｓ又はＰであることを表し、組合せ文字ＶＰは、当該組合せ文字ＶＰの右側に隣接する１つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル（５’－（Ｅ）－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ－ＶＰ）修飾ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字Ｐｓは、当該組合せ文字Ｐｓの右側に隣接する１つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、大文字Ｐは、当該文字Ｐの右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチドであることを表す。
文脈において、前記「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。「ヌクレオチドアナログ」とは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指し、例えば、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＢＮＡと略称される）又は非環式ヌクレオチドがある。前記「メトキシ修飾ヌクレオチド」とは、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。
本明細書の文脈において、「相補」又は「逆相補」という用語は、互換的に使用されてもよく、当業者に周知の意味、即ち、二本鎖核酸分子において、一方の鎖の塩基と他方の鎖上の塩基とが相補的に対合するという意味を有する。ＤＮＡにおいて、プリン塩基であるアデニン（Ａ）は、常にピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）（又は、ＲＮＡにおいてウラシル（Ｕ）である）と対合し、プリン塩基であるグアニン（Ｃ）は、常にピリミジン塩基であるシトシン（Ｇ）と対合する。各塩基対は、いずれも１つのプリンと１つのピリミジンを含む。一方の鎖上のアデニンが常に他方の鎖上のチミン（又はウラシル）と対合するとともに、グアニンが常にシトシンと対合する場合、両方の鎖同士が相補的である、またその相補鎖の配列から当該鎖の配列を推定できると考えられる。これに応じて、「ミスマッチ」は、本分野では、二本鎖核酸において、対応する位置での塩基が相補的に対合して存在しないことを意味する。
文脈において、特に説明がない限り、「基本的に逆相補的」とは、関連する２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「実質的に逆相補的」とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「完全に逆相補的」とは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチが存在しないことを指す。
文脈において、一方のヌクレオチド配列と他方のヌクレオチド配列に「ヌクレオチド差異」が存在するとは、前者が後者に比べて、同じ位置のヌクレオチドの塩基種類が変化したことを指し、例えば、後者において１つのヌクレオチド塩基がＡであるとき、前者の同じ位置での、対応するヌクレオチド塩基がＵ、Ｃ、Ｇ又はＴである場合に、当該位置で２つのヌクレオチド配列間にヌクレオチド差異が存在すると認められている。いくつかの実施形態において、元の位置のヌクレオチドの代わりに無塩基ヌクレオチド又はその等価物を用いる場合、当該位置でヌクレオチド差異が生じたとも考えられる。
文脈において、特に本開示のｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含む組成物又はｓｉＲＮＡ複合体の調製方法を説明する際に、特に説明がない限り、前記ヌクレオシドモノマー（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｏｎｏｍｅｒ）とは、調製するｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体におけるヌクレオチドの種類と順序に応じてホスホルアミダイト固相合成に用いられる修飾又は未修飾のヌクレオシドホスホルアミダイトモノマー（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＲＮＡ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ。ＲＮＡ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓをＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓということもある）を指す。ホスホルアミダイト固相合成は、当業者に公知のＲＮＡ合成に用いられる方法である。本開示に用いられるヌクレオシドモノマーは、いずれも市販品として購入可能である。
本開示の文脈において、特に説明がない限り、「複合」とは、それぞれ特定の機能を有する２つ以上の化学部分間が共有結合的に互いに結合することを指し、これに応じて、「複合体」とは、当該各化学部分間が共有結合的に結合することにより形成された化合物を指す。さらには、「ｓｉＲＮＡ複合体」は、特定の機能を有する１又は複数の化学部分がｓｉＲＮＡに共有結合的に結合して形成された化合物を表す。以下の文章では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体を単に「複合体」ともいうことがある。ｓｉＲＮＡ複合体は、文脈により、ｓｉＲＮＡ複合体の総称、複数の具体的な特定の化学分子のｓｉＲＮＡ複合体の総称、又は複数の具体的な特定の化学分子のｓｉＲＮＡ複合体のそれぞれであると理解される。本開示の文脈において、「複合分子」は、反応させることによりｓｉＲＮＡに複合され、最終的に本開示のｓｉＲＮＡ複合体を形成することができる１群の化合物又は特定の化合物であると理解すべきである。
本明細書で用いられる場合、２つのアルファベット文字間又は記号間のものでないダッシュ（「－」）は、置換基の結合点の位置を示すために用いられている。例えば、構造式「－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２」における最も左側のダッシュは、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基により結合することを指す。
本明細書で用いられる場合、「任意の」又は「任意に」とは、続いて記載する事象又は状況が発生してもよく、発生しなくてもよいこと、並びに前記記載が事象又は状況が発生した場合と発生しない場合を含むことを指す。例えば、「任意に置換され」た「アルキル」は、以下の文章で定義される「アルキル」及び「置換アルキル」を含む。１又は複数の置換基を含む任意の基に関して、これらの基が、立体的に非現実的な、合成上実行不可能な及び／又は本質的に不安定ないかなる置換又は置換パターンも導入することは意図されないと、当業者に理解される。
本明細書で用いられる場合、「アルキル」とは、特定の数の炭素原子を有する直鎖と分岐鎖を指し、前記特定の数は、通常１～２０個の炭素原子、例えば、１～１０個の炭素原子、１～８個又は１～６個の炭素原子である。例えば、Ｃ１－Ｃ６アルキルは、１～６個の炭素原子の直鎖と分岐鎖アルキルを含む。特定の数の炭素を有するアルキル残基を命名する場合、当該数の炭素を有する全ての分岐鎖及び直鎖形式を含むことを意図する。したがって、例えば、「ブチル」は、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ－ブチルを含むことを意味し、「プロピル」は、ｎ－プロピル及びイソプロピルを含む。アルキレンは、アルキルのサブセットであり、アルキルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキルを指し、前記炭素－炭素二重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から１つの水素分子を除去することにより得られる。当該基は、二重結合のシス又はトランス配置にあってもよい。典型的なアルケニルとしては、ビニルと、プロパ－１－エン－１－イル、プロパ－１－エン－２－イル、プロパ－２－エン－１－イル（アリル）、プロパ－２－エン－２－イル等のプロペニルと、ブタ－１－エン－１－イル、ブタ－１－エン－２－イル、２－メチルプロパ－１－エン－１－イル、ブタ－２－エン－１－イル、ブタ－２－エン－２－イル、ブタ－１，３－ジエン－１－イル、ブタ－１，３－ジエン－２－イル等のブテニルとを含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、アルケニルは、２～２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態において、２～１０個、２～８個又は２～６個の炭素原子を有する。アルケニレンは、アルケニルのサブセットであり、アルケニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキル基を指し、前記炭素－炭素三重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から２つの水素分子を除去することにより得られる。典型的なアルキニルとしては、エチニルと、プロパ－１－イン－１－イル、プロパ－２－イン－１－イル等のプロピニルと、ブタ－１－イン－１－イル、ブタ－１－イン－３－イル、ブタ－３－イン－１－イル等のブチニルとを含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、アルキニルは、２～２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態において、２～１０、２～８又は２～６個の炭素原子を有する。アルキニレンは、アルキニルのサブセットであり、アルキニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルコキシ」とは、酸素橋により結合した特定の数の炭素原子のアルキルを指し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、２－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、２－ヘキシルオキシ、３－ヘキシルオキシ、３－メチルペンチルオキシ等がある。アルコキシは、通常１～１０個、１～８個、１～６個又は１～４個の、酸素橋により結合した炭素原子を有する。
本明細書で用いられる場合、「アリール」とは、芳香族単環式又は多環式炭化水素環系から誘導される、環炭素原子から水素原子を除去して形成された基を指す。前記芳香族単環式又は多環式炭化水素環系は、水素及び６～１８個の炭素原子の炭素のみを含有し、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従う環状、非局在化（４ｎ＋２）π－電子系を含む。アリールとしては、フェニル、フルオレニル及びナフチル等の基を含むが、これらに限定されない。アリーレンは、アリールのサブセットであり、アリールと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「シクロアルキル」とは、通常３～７個の環状炭素原子を有する非芳香族炭素環を指す。環は、飽和であってもよいし、１又は複数の炭素－炭素二重結合を有してもよい。シクロアルキルの実例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル及びシクロヘキセニル、並びにノルボルナン（ｎｏｒｂｏｒｎａｎｅ）等の架橋及びカゴ状環状基を含む。
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン置換基」又は「ハロ」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを指し、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を含む。
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン化アルキル」とは、特定の数の炭素原子が１又は複数、最大許容数までのハロゲン原子で置換された、上記のように定義されるアルキル基を指す。ハロゲン化アルキルの実例としては、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、２－フルオロエチル及びペンタフルオロエチルを含むが、これらに限定されない。
「複素環基」とは、２～１２個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１～６個のヘテロ原子とを含む、安定した３～１８員非芳香族環状基を指す。明細書において特に説明がない限り、複素環基は、単環、二環、三環又は四環系であり、縮合環又は架橋環系を含んでもよい。複素環基におけるヘテロ原子は、任意に酸化されてもよい。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。複素環基は、一部飽和又は完全飽和である。複素環基は、環の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合することができる。このような複素環基の実例としては、ジオキサニル、チオフェニル［１，３］ジスルホニル（ｔｈｉｅｎｙｌ［１，３］ｄｉｔｈｉａｎｙｌ）、デカヒドロイソキノリニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドール、オクタヒドロイソインドール、２－オキサピペラジニル、２－オキサピペリジル、２－オキサピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、４－ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリスルホニル（ｔｒｉｔｈｉａｎｙｌ）、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル（ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、チアモルホリニル（ｔｈｉａｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、１－オキソチオモルホリニル（１－ｏｘｏ－ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）及び１，１－ジオキソチオモルホリニル（１，１－ｄｉｏｘｏ－ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）を含むが、これらに限定されない。
「ヘテロアリール」とは、２個～１７個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１～６個のヘテロ原子とを含む、３～１８員芳香環ラジカルから誘導される基を指す。本明細書で用いられる場合、ヘテロアリールは、単環、二環、三環又は四環系であってもよく、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従う環状非局在化（４ｎ＋２）π－電子系を含む。ヘテロアリールは、縮合環又は架橋環系を含む。ヘテロアリールにおけるヘテロ原子は任意に酸化される。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。ヘテロアリールは、環中の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合する。ヘテロアリールの実例としては、アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドール、１，３－ベンゾジオキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾ［ｄ］チアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピニル（ｂｅｎｚｏ［ｂ］［１，４］ｄｉｏｘｅｐｉｎｙｌ）、ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジニル（ｂｅｎｚｏ［ｂ］［１，４］ｏｘａｚｉｎｙｌ）、１，４－ベンゾジオキサン（１，４－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｎｙｌ）、ベンゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル（ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｙｌ）、ベンゾジオキシニル（ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎｙｌ）、ベンゾピラニル、ベンゾピロニル、ベンゾフリル、ベンゾフラノニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチエノ［３，２－ｄ］ピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２－ａ］ピリジル、カルバゾリル、シンノリル（ｃｉｎｎｏｌｉｎｙｌ）、シクロペンタ［ｄ］ピリミジニル、６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、５，６－ジヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル（５，６－ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｈ］ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｙｌ）、５，６－ジヒドロベンゾ［ｈ］シンノリニル（５，６－ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｈ］ｃｉｎｎｏｌｉｎｙｌ）、６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２－ｃ］ピリダジニル、ジベンゾフリル、ジベンゾチオフェニル、フリル、フラノニル、フロ［３，２－ｃ］ピリジル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジニル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリジル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル（ｉｎｄａｚｏｌｙｌ）、インドール、イソインドール、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル（ｉｎｄｏｌｉｚｉｎｙｌ）、イソオキサゾリル、５，８－メタノ－５，６，７，８－テトラヒドロキナゾリニル（５，８－ｍｅｔｈａｎｏ－５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｙｌ）、ナフチリジニル（ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｙｌ）、１，６－ナフチリジノニル（１，６－ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｏｎｙｌ）、オキサジアゾリル、２－オキソアゼピニル（２－ｏｘｏａｚｅｐｉｎｙｌ）、オキサゾリル、オキシラニル（ｏｘｉｒａｎｙｌ）、５，６，６ａ，７，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロベンゾ［Ｈ］キナゾリニル、１－フェニル－１Ｈ－ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル（ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｙｌ）、プテリジニル（ｐｔｅｒｉｄｉｎｙｌ）、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジニル、ピリジル、ピリド［３，２－ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４－ｄ］ピリミジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノキサリニル（ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｙｌ）、キノリル、テトラヒドロキノリル、５，６，７，８－テトラヒドロキナゾリニル、５，６，７，８－テトラヒドロベンゾ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、６，７，８，９テトラヒドロ－５Ｈ－シクロヘプタ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８－テトラヒドロピリド［４，５－ｃ］ピリダジニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、チエノ［３，２－ｄ］ピリミジニル、チエノ［２，３－ｃ］プリジニル（ｔｈｉｅｎｏ［２，３－ｃ］ｐｒｉｄｉｎｙｌ）及びチオフェニル（ｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌ／ｔｈｉｅｎｙｌ）を含むが、これらに限定されない。
本開示において各種のヒドロキシ保護基を用いることができる。一般的には、保護基は、化学官能基を特定の反応条件に不敏感にすることができ、且つ分子の残りの部分を実質的に損傷することなく分子中の当該官能基に付加する、及びそれから除去することができる。代表的なヒドロキシ保護基は、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８，２２２３～２３１１、及びＧｒｅｅｎｅａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，２ｄ ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に開示されており、引用により、上記文献は、全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、保護基は、塩基性条件で安定しているが、酸性条件で除去することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル、９－フェニルキサンテン－９－イル（Ｐｉｘｙｌ）及び９－（ｐ－メトキシフェニル）キサンテン－９－イル（Ｍｏｘ）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、Ｔｒ（トリチル）、ＭＭＴｒ（４－メトキシトリチル）、ＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）及びＴＭＴｒ（４，４’，４’’－トリメトキシトリチル）を含む。
「被験体」という用語は、本明細書で用いられる場合、任意の動物、例えば、哺乳動物又は有袋動物を指す。本開示の被験体としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル又は他の種類のマカク属のサル）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット及び任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる場合、「治療」、「軽減」又は「改善」は、ここで互換的に使用されてもよい。これらの用語は、有益な又は所望の結果を得る方法を指し、治療効果を含むが、これに限定されない。「治療効果」は、治療される潜在的障害を根絶又は改善することを意味する。また、治療効果は、被験体が依然として潜在的障害の苦痛を受ける可能性があるにもかかわらず、潜在的障害に関連する１又は複数の生理的症状を根絶又は改善することにより、被験体に改善が観察されて得られる。
本明細書で用いられる場合、「防止」と「予防」は互換的に使用されてもよい。これらの用語は、有益又は所望の結果を得る方法を指し、予防効果を含むが、これに限定されない。「予防効果」を得るために、当該疾患に対する診断が行われていないかもしれないが、複合体又は組成物を特定の疾患に罹患するリスクのある被験体に投与、又は疾患の１又は複数の病理学的症状が報告された被験体に投与することができる。
本開示のｓｉＲＮＡは、基本的な構造単位としてヌクレオチド基を含み、前記ヌクレオチド基がリン酸基、リボース基及び塩基を含むことは、当業者に公知であるので、ここで説明を省略する。
＜第１のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第１のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第１のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第１のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記第１のｓｉＲＮＡに対して、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＺａ１－３’（配列番号１）、
５’－Ｚａ２ＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡ－３’（配列番号２）
ただし、Ｚａ１はＡであり、Ｚａ２はＵであり、
前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺａ１に対応するヌクレオチドＺａ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺａ２に対応するヌクレオチドＺａ４が含まれ、前記Ｚａ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
文脈において、「位置が対応する」とは、ヌクレオチド配列の同一端から、ヌクレオチド配列において同じ位置にあることを指す。例えば、前記第１のｓｉＲＮＡに対して、ヌクレオチド配列Ｉの３’端の１番目のヌクレオチドは、位置が配列番号１の３’端の１番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚａ４の位置での差異を含み、Ｚａ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚａ４の位置での差異であり、Ｚａ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚａ３は、Ｚａ４と相補的なヌクレオチドである。これらのヌクレオチド差異は、ｓｉＲＮＡ複合体による標的遺伝子抑制能力を顕著に低下させることがなく、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡ複合体も、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記実質的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチがないことを指す。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＺａ３－３’（配列番号３）、
５’－Ｚａ４ＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡ－３’（配列番号４）
ただし、前記Ｚａ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚａ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚａ４は、Ｚａ３と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚａ３はＵであり、Ｚａ４はＡであり、
前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが１９～２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが２０～２６ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩは、ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶは、ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しい。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＧＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＣＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵＧＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＣＡＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが同じであり、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜第２のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第２のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第２のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第２のｓｉＲＮＡのうちの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１４に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＺｂ１－３’（配列番号１３）、
５’－Ｚｂ２ＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵ－３’（配列番号１４）
ただし、Ｚｂ１はＡであり、Ｚｂ２はＵであり、
前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｂ１に対応するヌクレオチドＺｂ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｂ２に対応するヌクレオチドＺｂ４が含まれ、前記Ｚｂ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１３に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１４に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１４に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚｂ４の位置での差異を含み、Ｚｂ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚｂ４の位置での差異であり、Ｚｂ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚｂ３は、Ｚｂ４と相補的なヌクレオチドである。これらのヌクレオチド差異は、ｓｉＲＮＡ複合体による標的遺伝子抑制能力を顕著に低下させることがなく、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡ複合体も、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１５に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号１６に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＺｂ３－３’（配列番号１５）、
５’－Ｚｂ４ＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵ－３’（配列番号１６）
ただし、前記Ｚｂ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚｂ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚｂ４は、Ｚｂ３と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚｂ３はＵであり、Ｚｂ４はＡであり、
前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが１９～２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが２０～２６ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩは、ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶは、ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しい。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣＣＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが同じであり、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜第３のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第３のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第３のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第３のｓｉＲＮＡのうちの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２６に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＣＵＺｃ１－３’（配列番号２５）、
５’－Ｚｃ２ＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡ－３’（配列番号２６）
ただし、Ｚｃ１はＡであり、Ｚｃ２はＵであり、
前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｃ１に対応するヌクレオチドＺｃ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｃ２に対応するヌクレオチドＺｃ４が含まれ、前記Ｚｃ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２５に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２６に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２６に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚｃ４の位置での差異を含み、Ｚｃ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚｃ４の位置での差異であり、Ｚｃ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚｃ３は、Ｚｃ４と相補的なヌクレオチドである。これらのヌクレオチド差異は、ｓｉＲＮＡ複合体による標的遺伝子抑制能力を顕著に低下させることがなく、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡ複合体も、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号２８に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＣＵＺｃ３－３’（配列番号２７）、
５’－Ｚｃ４ＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡ－３’（配列番号２８）
ただし、前記Ｚｃ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚｃ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚｃ４は、Ｚｃ３と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚｃ３はＵであり、Ｚｃ４はＡであり、
前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが１９～２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが２０～２６ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩは、ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶは、ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しい。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＵＧＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが同じであり、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜第４のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第４のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第４のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第４のｓｉＲＮＡのうちの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３８に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＺｄ１－３’（配列番号３７）、
５’－Ｚｄ２ＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵ－３’（配列番号３８）
ただし、Ｚｄ１はＡであり、Ｚｄ２はＵであり、
前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｄ１に対応するヌクレオチドＺｄ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｄ２に対応するヌクレオチドＺｄ４が含まれ、前記Ｚｄ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３７に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３８に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３８に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚｄ４の位置での差異を含み、Ｚｄ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚｄ４の位置での差異であり、Ｚｄ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚｄ３は、Ｚｄ４と相補的なヌクレオチドである。これらのヌクレオチド差異は、ｓｉＲＮＡ複合体による標的遺伝子抑制能力を顕著に低下させることがなく、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡ複合体も、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３９に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号４０に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＺｄ３－３’（配列番号３９）、
５’－Ｚｄ４ＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵ－３’（配列番号４０）
ただし、前記Ｚｄ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚｄ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚｄ４は、Ｚｄ３と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚｄ３はＵであり、Ｚｄ４はＡであり、
前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが１９～２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが２０～２６ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩは、ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶは、ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しい。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＡＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＵＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧＡＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＵＣＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＧＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが同じであり、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜第５のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第５のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第５のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第５のｓｉＲＮＡのうちの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号４９に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号５０に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＺｅ１－３’（配列番号４９）、
５’－Ｚｅ２ＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣ－３’（配列番号５０）
ただし、Ｚｅ１はＡであり、Ｚｅ２はＵであり、
前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｅ１に対応するヌクレオチドＺｅ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｅ２に対応するヌクレオチドＺｅ４が含まれ、前記Ｚｅ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号４９に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号５０に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号５０に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚｅ４の位置での差異を含み、Ｚｅ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚｅ４の位置での差異であり、Ｚｅ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚｅ３は、Ｚｅ４と相補的なヌクレオチドである。これらのヌクレオチド差異は、ｓｉＲＮＡ複合体による標的遺伝子抑制能力を顕著に低下させることがなく、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡ複合体も、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号５１に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号５２に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＺｅ３－３’（配列番号５１）、
５’－Ｚｅ４ＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣ－３’（配列番号５２）
ただし、前記Ｚｅ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚｅ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚｅ４は、Ｚｅ３と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚｅ３はＵであり、Ｚｅ４はＡであり、
前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが１９～２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが２０～２６ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩは、ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶは、ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しい。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＵＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＡＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＵＵＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが同じであり、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜ｓｉＲＮＡのオーバーハング末端と修飾＞
以下に、ヌクレオチド配列Ｖ、核酸配列、ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチド修飾、及び修飾配列の説明は、上記の第１～第５のｓｉＲＮＡのいずれか１つに適用可能である。即ち、特に明記されていない場合、以下のｓｉＲＮＡの説明は、第１のｓｉＲＮＡ、第２のｓｉＲＮＡ、第３のｓｉＲＮＡ、第４のｓｉＲＮＡ及び第５のｓｉＲＮＡを１つずつ説明したものと見なされるべきである。例えば、特定のｓｉＲＮＡが指定されていない場合、「前記ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含む」とは、「第１のｓｉＲＮＡ、第２のｓｉＲＮＡ、第３のｓｉＲＮＡ、第４のｓｉＲＮＡ又は第５のｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含む」ことを意味する。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１～３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され（即ち、ヌクレオチド配列ＩＩ又はヌクレオチド配列ＩＶの末端に結合され）、アンチセンス鎖の３’オーバーハング末端を構成する。これにより、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が、１９／２０、１９／２１、１９／２２、２０／２１、２０／２２、２０／２３、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２２／２３、２２／２４、２２／２５、２３／２４、２３／２５又は２３／２６であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｖは、長さが２ヌクレオチドであり、これにより、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が、１９／２１、２１／２３又は２３／２５であってもよい。
前記ヌクレオチド配列Ｖにおける各ヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであってもよく、合成しやすく合成コストを節約するために、前記ヌクレオチド配列Ｖは、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド（ｄＴｄＴ）又は連続した２個のウラシルリボヌクレオチド（ＵＵ）であり、或いは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡとの親和力を向上させるために、ヌクレオチド配列Ｖは、標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと相補的である。したがって、いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比は１９／２１又は２１／２３であり、このとき、本開示のｓｉＲＮＡがより良好なｍＲＮＡサイレンシング活性を有する。
標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドとは、５’末端で標的ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド又はヌクレオチド配列を指し、当該標的ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列ＩＩと実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であるヌクレオチド配列であるか、又はヌクレオチド配列ＩＩ及びヌクレオチド配列ＩＶから構成されるヌクレオチド配列と実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であるヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態において、前記第１のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＺａ３－３’（配列番号５）、
５’－Ｚａ４ＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡＧＣ－３’（配列番号６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＣＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＺａ３－３’（配列番号７）、
５’－Ｚａ４ＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡＧＣＡＡ－３’（配列番号８）
ただし、前記Ｚａ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚａ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚａ４は、Ｚａ３と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記第２のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＺｂ３－３’（配列番号１７）、
５’－Ｚｂ４ＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣ－３’（配列番号１８）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号２０に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＺｂ３－３’（配列番号１９）
５’－Ｚｂ４ＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵ－３’（配列番号２０）
ただし、前記Ｚｂ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚｂ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚｂ４は、Ｚｂ３と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記第３のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号３０に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＣＵＺｃ３－３’（配列番号２９）、
５’－Ｚｃ４ＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵ－３’（配列番号３０）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号３２に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＣＵＺｃ３－３’（配列番号３１）、
５’－Ｚｃ４ＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵ－３’（配列番号３２）
ただし、前記Ｚｃ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚｃ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚｃ４は、Ｚｃ３と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記第４のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号４１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号４２に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＺｄ３－３’（配列番号４１）、
５’－Ｚｄ４ＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵ－３’（配列番号４２）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号４４に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＺｄ３－３’（配列番号４３）、
５’－Ｚｄ４ＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣ－３’（配列番号４４）
ただし、前記Ｚｄ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚｄ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚｄ４は、Ｚｄ３と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記第５のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号５４に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＺｅ３－３’（配列番号５３）、
５’－Ｚｅ４ＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵ－３’（配列番号５４）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号５６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＺｅ３－３’（配列番号５５）、
５’－Ｚｅ４ＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵ－３’（配列番号５６）
ただし、前記Ｚｅ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚｅ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚｅ４は、Ｚｅ３と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本開示に記載されたｓｉＲＮＡは、ｓｉＡＰａ１、ｓｉＡＰａ２、ｓｉＡＰｂ１、ｓｉＡＰｂ２、ｓｉＡＰｃ１、ｓｉＡＰｃ２、ｓｉＡＰｄ１、ｓｉＡＰｄ２、ｓｉＡＰｅ１又はｓｉＡＰｅ２である。
ｓｉＡＰａ１
センス鎖：５’－ＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵ－３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：５’－ＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡＧＣ－３’（配列番号１０）
ｓｉＡＰａ２
センス鎖：５’－ＧＣＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵ－３’（配列番号１１）
アンチセンス鎖：５’－ＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡＧＣＡＡ－３’（配列番号１２）
ｓｉＡＰｂ１
センス鎖：５’－ＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵ－３’（配列番号２１）
アンチセンス鎖：５’－ＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣ－３’（配列番号２２）
ｓｉＡＰｂ２
センス鎖：５’－ＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵ－３’（配列番号２３）
アンチセンス鎖：５’－ＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵ－３’（配列番号２４）
ｓｉＡＰｃ１
センス鎖：５’－ＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＣＵＡ－３’（配列番号３３）
アンチセンス鎖：５’－ＵＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵ－３’（配列番号３４）
ｓｉＡＰｃ２
センス鎖：５’－ＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＣＵＡ－３’（配列番号３５）
アンチセンス鎖：５’－ＵＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵ－３’（配列番号３６）
ｓｉＡＰｄ１
センス鎖：５’－ＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＣ－３’（配列番号４５）
アンチセンス鎖：５’－ＧＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵ－３’（配列番号４６）
ｓｉＡＰｄ２
センス鎖：５’－ＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＣ－３’（配列番号４７）
アンチセンス鎖：５’－ＧＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣ－３’（配列番号４８）
ｓｉＡＰｅ１
センス鎖：５’－ＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵ－３’（配列番号５７）
アンチセンス鎖：５’－ＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵ－３’（配列番号５８）
ｓｉＡＰｅ２
センス鎖：５’－ＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵ－３’（配列番号５９）
アンチセンス鎖：５’－ＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵ－３’（配列番号６０）
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、ｓｉＡＰａ１、ｓｉＡＰａ２、ｓｉＡＰｂ１、ｓｉＡＰｂ２、ｓｉＡＰｃ１、ｓｉＡＰｃ２、ｓｉＡＰｄ１、ｓｉＡＰｄ２、ｓｉＡＰｅ１又はｓｉＡＰｅ２に示されるヌクレオチド配列（即ち、核酸塩基配列）を有する。
前述したように、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの一部又は全部は、修飾ヌクレオチドであり、ヌクレオチド基上のこれらの修飾により、本開示のｓｉＲＮＡ複合体がＡＰＯＣ３遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱める又は喪失させることはない。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。本開示の文脈において、用いられる用語「修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が他の基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ、或いは、ヌクレオチド上の塩基が修飾された塩基であるヌクレオチドを指す。前記修飾ヌクレオチドにより、ｓｉＲＮＡが遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱める又は喪失させることはない。例えば、Ｊ．Ｋ． Ｗａｔｔｓ，Ｇ．Ｆ． Ｄｅｌｅａｖｅｙ，ａｎｄ Ｍ．Ｊ． Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ： ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２００８，１３（１９－２０）： ８４２－５５に開示された修飾ヌクレオチドを選択してもよい。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖又は前記アンチセンス鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び／又は少なくとも１つのリン酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である。言い換えれば、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖において少なくとも１本の一本鎖のリン酸－糖骨格中のリン酸エステル基及び／又はリボース基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基及び／又は修飾基を有するリボース基である。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖におけるヌクレオチドは、全て修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドは、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
本開示の発明者は、驚くべきことに、本開示に記載されたｓｉＲＮＡにより、動物実験において血漿中安定性と遺伝子サイレンシング効率の高度なバランスが取られていることを見出した。
いくつかの実施形態において、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、前記ヌクレオチド配列Ｉにおけるフルオロ修飾ヌクレオチドが５個以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩにおけるフルオロ修飾ヌクレオチドが７個以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
本開示の文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換された、以下の式（７）に示される構造を有するヌクレオチドを指す。「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つである。
これらのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチドは、当業者に公知であり、これらのヌクレオチドは、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドから選択される１つであってもよい。
いくつかの実施形態において、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（８）に示される２’－メトキシ（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチドは、例えば、式（９）に示される２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、２’－アミノ（２’－ＮＨ２）修飾ヌクレオチドは式（１０）に示される。いくつかの実施形態において、２’－デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）は式（１１）に示される。
Figure 0007507495000004
ヌクレオチドアナログとは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指す。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド又は非環式ヌクレオチドであってもよい。
架橋ヌクレオチド（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、ＢＮＡと略称される）とは、拘束された又は近づけないヌクレオチドを指す。ＢＮＡは、五員環、六員環、又は七員環の、「固定された」Ｃ３’－エンド糖パッカリングを有する架橋構造を含んでもよい。通常当該橋を当該リボースの２’－、４’－位に導入して２’，４’－ＢＮＡヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ＢＮＡは、式（１２）に示されるＬＮＡ、式（１３）に示されるＥＮＡ、式（１４）に示されるｃＥＴ ＢＮＡ等であってもよい。
Figure 0007507495000005
非環式ヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖環が開環されたヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、非環式ヌクレオチドは、式（１５）に示されるアンロックド核酸（ＵＮＡ）、又は式（１６）に示されるグリセロール核酸（ＧＮＡ）であってもよい。
Figure 0007507495000006
上記式（１５）及び式（１６）において、Ｒは、Ｈ、ＯＨ又はアルコキシ（Ｏ－アルキル）から選択される。
イソヌクレオチドとは、ヌクレオチドにおいて塩基のリボース環における位置が変化した化合物を指す。いくつかの実施形態において、イソヌクレオチドは、式（１７）又は（１８）に示される、塩基がリボース環の１’－位から２’－位又は３’－位に移行した化合物であってもよい。
Figure 0007507495000007
上記式（１７）～式（１８）の化合物において、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ又はＴ等の核酸塩基を表し、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ又は上述した非フッ素基から選択される。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択されるいずれか１つである。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、文脈において、前記メトキシ修飾ヌクレオチドは、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。
文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」、「２’－フルオロ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’－ヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチド」及び「２’－フルオロリボース基を有するヌクレオチド」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドの２’－ヒドロキシ基がフッ素で置換された、式（７）に示される構造を有する化合物を指し、「メトキシ修飾ヌクレオチド」、「２’－メトキシ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチド」及び「２’－メトキシリボース基を有するヌクレオチド」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドのリボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換された、式（８）に示される構造を有する化合物を指す。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位又は第５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、８、９、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、ｓｉＡＰａ１－Ｍ１、ｓｉＡＰａ２－Ｍ１、ｓｉＡＰａ１－Ｍ２、ｓｉＡＰａ２－Ｍ２、ｓｉＡＰａ１－Ｍ３、ｓｉＡＰａ２－Ｍ３、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ１、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ１、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ２、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ２、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ３、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ３、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ１、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ１、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ２、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ２、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ３、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ３、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ１、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ１、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ２、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ２、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ３、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ３、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ１、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ１、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ２、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ２、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ３、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ３のいずれか１つである。
ｓｉＡＰａ１－Ｍ１
センス鎖：５’－ＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号６１）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍ－３’（配列番号６２）
ｓｉＡＰａ２－Ｍ１
センス鎖：５’－ＧｍＣｍＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号６３）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍ－３’（配列番号６４）
ｓｉＡＰａ１－Ｍ２
センス鎖：５’－ＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号６５）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍ－３’（配列番号６６）
ｓｉＡＰａ２－Ｍ２
センス鎖：５’－ＧｍＣｍＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号６７）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍ－３’（配列番号６８）
ｓｉＡＰａ１－Ｍ３
センス鎖：５’－ＵｍＵｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号６９）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍ－３’（配列番号７０）
ｓｉＡＰａ２－Ｍ３
センス鎖：５’－ＧｍＣｍＵｍＵｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号７１）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍ－３’（配列番号７２）
ｓｉＡＰｂ１－Ｍ１
センス鎖：５’－ＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号７３）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｆＧｆＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号７４）
ｓｉＡＰｂ２－Ｍ１
センス鎖：５’－ＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号７５）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｆＧｆＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍ－３’（配列番号７６）
ｓｉＡＰｂ１－Ｍ２
センス鎖：５’－ＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号７７）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号７８）
ｓｉＡＰｂ２－Ｍ２
センス鎖：５’－ＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号７９）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍ－３’（配列番号８０）
ｓｉＡＰｂ１－Ｍ３
センス鎖：５’－ＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号８１）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号８２）
ｓｉＡＰｂ２－Ｍ３
センス鎖：５’－ＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号８３）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍ－３’（配列番号８４）
ｓｉＡＰｃ１－Ｍ１
センス鎖：５’－ＵｍＡｍＵｍＵｍＣｆＵｍＣｆＡｆＧｆＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍＵｍＡｍ－３’（配列番号８５）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍＡｆＧｍＧｍＡｍＧｆＡｍＧｆＣｆＡｍＣｍＵｍＧｍＡｆＧｍＡｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍ－３’（配列番号８６）
ｓｉＡＰｃ２－Ｍ１
センス鎖：５’－ＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｆＵｍＣｆＡｆＧｆＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍＵｍＡｍ－３’（配列番号８７）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍＡｆＧｍＧｍＡｍＧｆＡｍＧｆＣｆＡｍＣｍＵｍＧｍＡｆＧｍＡｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍ－３’（配列番号８８）
ｓｉＡＰｃ１－Ｍ２
センス鎖：５’－ＵｍＡｍＵｍＵｍＣｆＵｍＣｆＡｆＧｆＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍＵｍＡｍ－３’（配列番号８９）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍＡｆＧｍＧｍＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｆＧｍＡｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍ－３’（配列番号９０）
ｓｉＡＰｃ２－Ｍ２
センス鎖：５’－ＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｆＵｍＣｆＡｆＧｆＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍＵｍＡｍ－３’（配列番号９１）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍＡｆＧｍＧｍＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｆＧｍＡｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍ－３’（配列番号９２）
ｓｉＡＰｃ１－Ｍ３
センス鎖：５’－ＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍＣｆＡｆＧｆＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍＵｍＡｍ－３’（配列番号９３）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍＡｆＧｍＧｍＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｆＧｍＡｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍ－３’（配列番号９４）
ｓｉＡＰｃ２－Ｍ３
センス鎖：５’－ＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍＣｆＡｆＧｆＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍＵｍＡｍ－３’（配列番号９５）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍＡｆＧｍＧｍＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｆＧｍＡｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍ－３’（配列番号９６）
ｓｉＡＰｄ１－Ｍ１
センス鎖：５’－ＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｍＣｆＵｆＣｆＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号９７）
アンチセンス鎖：５’－ＧｍＧｆＡｍＧｍＡｍＧｆＣｍＡｆＣｆＵｍＧｍＡｍＧｍＡｆＡｍＵｆＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍ－３’（配列番号９８）
ｓｉＡＰｄ２－Ｍ１
センス鎖：５’－ＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｍＣｆＵｆＣｆＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号９９）
アンチセンス鎖：５’－ＧｍＧｆＡｍＧｍＡｍＧｆＣｍＡｆＣｆＵｍＧｍＡｍＧｍＡｆＡｍＵｆＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号１００）
ｓｉＡＰｄ１－Ｍ２
センス鎖：５’－ＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｍＣｆＵｆＣｆＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号１０１）
アンチセンス鎖：５’－ＧｍＧｆＡｍＧｍＡｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｆＡｍＵｆＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍ－３’（配列番号１０２）
ｓｉＡＰｄ２－Ｍ２
センス鎖：５’－ＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｍＣｆＵｆＣｆＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号１０３）
アンチセンス鎖：５’－ＧｍＧｆＡｍＧｍＡｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｆＡｍＵｆＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号１０４）
ｓｉＡＰｄ１－Ｍ３
センス鎖：５’－ＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｆＵｆＣｆＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号１０５）
アンチセンス鎖：５’－ＧｍＧｆＡｍＧｍＡｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｆＡｍＵｆＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍ－３’（配列番号１０６）
ｓｉＡＰｄ２－Ｍ３
センス鎖：５’－ＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｆＵｆＣｆＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号１０７）
アンチセンス鎖：５’－ＧｍＧｆＡｍＧｍＡｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｆＡｍＵｆＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号１０８）
ｓｉＡＰｅ１－Ｍ１
センス鎖：５’－ＧｍＧｍＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１０９）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｆＧｆＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１１０）
ｓｉＡＰｅ２－Ｍ１
センス鎖：５’－ＡｍＧｍＧｍＧｍＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１１１）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｆＧｆＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍＵｍＵｍ－３’（配列番号１１２）
ｓｉＡＰｅ１－Ｍ２
センス鎖：５’－ＧｍＧｍＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１１３）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１１４）
ｓｉＡＰｅ２－Ｍ２
センス鎖：５’－ＡｍＧｍＧｍＧｍＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１１５）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍＵｍＵｍ－３’（配列番号１１６）
ｓｉＡＰｅ１－Ｍ３
センス鎖：５’－ＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１１７）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１１８）
ｓｉＡＰｅ２－Ｍ３
センス鎖：５’－ＡｍＧｍＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１１９）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍＵｍＵｍ－３’（配列番号１２０）
上記修飾を有するｓｉＲＮＡは、コストが低いだけでなく、血中のリボヌクレアーゼで核酸を切断しにくくすることができ、これにより、核酸の安定性を向上させ、核酸がより強いヌクレアーゼ加水分解耐性という特性を有するようにする。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖において、少なくとも１本の一本鎖のリン酸－糖骨格中のリン酸エステル基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基である。いくつかの実施形態において、修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である。いくつかの実施形態において、前記修飾基を有するリン酸エステル基は、式（１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である。
Figure 0007507495000008
このような修飾により、ｓｉＲＮＡの二本鎖構造を安定化させ、塩基対合の高い特異性と高い親和力を維持することができる。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡにおいて、チオリン酸エステル基は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、又はそれらの任意の組合せからなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の５’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の３’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、以下の位置のうち少なくとも一箇所に結合されて存在する。
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、ｓｉＡＰａ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰａ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰａ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰａ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰａ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰａ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ３Ｓのいずれか１つである。
ｓｉＡＰａ１－Ｍ１Ｓ
センス鎖：５’－ＵｍｓＵｍｓＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１２１）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍｓＧｍｓＣｍ－３’（配列番号１２２）
ｓｉＡＰａ２－Ｍ１Ｓ
センス鎖：５’－ＧｍｓＣｍｓＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１２３）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍｓＡｍｓＡｍ－３’（配列番号１２４）
ｓｉＡＰａ１－Ｍ２Ｓ
センス鎖：５’－ＵｍｓＵｍｓＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１２５）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍｓＧｍｓＣｍ－３’（配列番号１２６）
ｓｉＡＰａ２－Ｍ２Ｓ
センス鎖：５’－ＧｍｓＣｍｓＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１２７）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍｓＡｍｓＡｍ－３’（配列番号１２８）
ｓｉＡＰａ１－Ｍ３Ｓ
センス鎖：５’－ＵｍｓＵｍｓＡｍＡｍＡｍＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１２９）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍｓＧｍｓＣｍ－３’（配列番号１３０）
ｓｉＡＰａ２－Ｍ３Ｓ
センス鎖：５’－ＧｍｓＣｍｓＵｍＵｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１３１）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍｓＡｍｓＡｍ－３’（配列番号１３２）
ｓｉＡＰｂ１－Ｍ１Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＣｍｓＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１３３）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｆＧｆＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍｓＣｍｓＣｍ－３’（配列番号１３４）
ｓｉＡＰｂ２－Ｍ１Ｓ
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１３５）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｆＧｆＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号１３６）
ｓｉＡＰｂ１－Ｍ２Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＣｍｓＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１３７）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍｓＣｍｓＣｍ－３’（配列番号１３８）
ｓｉＡＰｂ２－Ｍ２Ｓ
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１３９）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号１４０）
ｓｉＡＰｂ１－Ｍ３Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＣｍｓＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１４１）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍｓＣｍｓＣｍ－３’（配列番号１４２）
ｓｉＡＰｂ２－Ｍ３Ｓ
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１４３）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号１４４）
ｓｉＡＰｃ１－Ｍ１Ｓ
センス鎖：５’－ＵｍｓＡｍｓＵｍＵｍＣｆＵｍＣｆＡｆＧｆＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍＵｍＡｍ－３’（配列番号１４５）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍｓＡｆｓＧｍＧｍＡｍＧｆＡｍＧｆＣｆＡｍＣｍＵｍＧｍＡｆＧｍＡｆＡｍＵｍＡｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号１４６）
ｓｉＡＰｃ２－Ｍ１Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＧｍｓＵｍＡｍＵｍＵｍＣｆＵｍＣｆＡｆＧｆＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍＵｍＡｍ－３’
（配列番号１４７）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍｓＡｆｓＧｍＧｍＡｍＧｆＡｍＧｆＣｆＡｍＣｍＵｍＧｍＡｆＧｍＡｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍｓＧｍｓＵｍ－３’（配列番号１４８）
ｓｉＡＰｃ１－Ｍ２Ｓ
センス鎖：５’－ＵｍｓＡｍｓＵｍＵｍＣｆＵｍＣｆＡｆＧｆＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍＵｍＡｍ－３’（配列番号１４９）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍｓＡｆｓＧｍＧｍＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｆＧｍＡｆＡｍＵｍＡｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号１５０）
ｓｉＡＰｃ２－Ｍ２Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＧｍｓＵｍＡｍＵｍＵｍＣｆＵｍＣｆＡｆＧｆＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍＵｍＡｍ－３’
（配列番号１５１）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍｓＡｆｓＧｍＧｍＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｆＧｍＡｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍｓＧｍｓＵｍ－３’（配列番号１５２）
ｓｉＡＰｃ１－Ｍ３Ｓ
センス鎖：５’－ＵｍｓＡｍｓＵｍＵｍＣｍＵｍＣｆＡｆＧｆＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍＵｍＡｍ－３’（配列番号１５３）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍｓＡｆｓＧｍＧｍＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｆＧｍＡｆＡｍＵｍＡｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号１５４）
ｓｉＡＰｃ２－Ｍ３Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＧｍｓＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍＣｆＡｆＧｆＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍＵｍＡｍ－３’（配列番号１５５）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍｓＡｆｓＧｍＧｍＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｆＧｍＡｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍｓＧｍｓＵｍ－３’（配列番号１５６）
ｓｉＡＰｄ１－Ｍ１Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＧｍｓＵｍＡｍＵｆＵｍＣｆＵｆＣｆＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号１５７）
アンチセンス鎖：５’－ＧｍｓＧｆｓＡｍＧｍＡｍＧｆＣｍＡｆＣｆＵｍＧｍＡｍＧｍＡｆＡｍＵｆＡｍＣｍＵｍｓＧｍｓＵｍ－３’（配列番号１５８）
ｓｉＡＰｄ２－Ｍ１Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＣｍｓＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｍＣｆＵｆＣｆＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号１５９）
アンチセンス鎖：５’－ＧｍｓＧｆｓＡｍＧｍＡｍＧｆＣｍＡｆＣｆＵｍＧｍＡｍＧｍＡｆＡｍＵｆＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍｓＣｍｓＣｍ－３’（配列番号１６０）
ｓｉＡＰｄ１－Ｍ２Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＧｍｓＵｍＡｍＵｆＵｍＣｆＵｆＣｆＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号１６１）
アンチセンス鎖：５’－ＧｍｓＧｆｓＡｍＧｍＡｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｆＡｍＵｆＡｍＣｍＵｍｓＧｍｓＵｍ－３’（配列番号１６２）
ｓｉＡＰｄ２－Ｍ２Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＣｍｓＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｍＣｆＵｆＣｆＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号１６３）
アンチセンス鎖：５’－ＧｍｓＧｆｓＡｍＧｍＡｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｆＡｍＵｆＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍｓＣｍｓＣｍ－３’（配列番号１６４）
ｓｉＡＰｄ１－Ｍ３Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＧｍｓＵｍＡｍＵｍＵｍＣｆＵｆＣｆＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号１６５）
アンチセンス鎖：５’－ＧｍｓＧｆｓＡｍＧｍＡｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｆＡｍＵｆＡｍＣｍＵｍｓＧｍｓＵｍ－３’（配列番号１６６）
ｓｉＡＰｄ２－Ｍ３Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＣｍｓＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｆＵｆＣｆＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号１６７）
アンチセンス鎖：５’－ＧｍｓＧｆｓＡｍＧｍＡｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｆＡｍＵｆＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍｓＣｍｓＣｍ－３’（配列番号１６８）
ｓｉＡＰｅ１－Ｍ１Ｓ
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１６９）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｆＧｆＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号１７０）
ｓｉＡＰｅ２－Ｍ１Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＧｍｓＧｍＧｍＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１７１）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｆＧｆＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号１７２）
ｓｉＡＰｅ１－Ｍ２Ｓ
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１７３）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号１７４）
ｓｉＡＰｅ２－Ｍ２Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＧｍｓＧｍＧｍＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１７５）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号１７６）
ｓｉＡＰｅ１－Ｍ３Ｓ
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１７７）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号１７８）
ｓｉＡＰｅ２－Ｍ３Ｓ
センス鎖：５’－ＡｍｓＧｍｓＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１７９）
アンチセンス鎖：５’－ＡｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号１８０）
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドは、５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである。
慣用の前記５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、当業者に公知であり、例えば、５’－リン酸ヌクレオチドは、以下の構造を有してもよい。
Figure 0007507495000009
また、例えば、Ａｎａｓｔａｓｉａ Ｋｈｖｏｒｏｖａ ａｎｄ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｋ． Ｗａｔｔｓ，Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３５（３）： ２３８～４８には、以下の４種類の５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが開示されている。
Figure 0007507495000010
 式中、ＲはＨ、ＯＨ、メトキシ、フッ素から選択され、Ｂａｓｅは核酸塩基を表し、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される。
いくつかの実施形態において、５’－リン酸ヌクレオチドは、式（２）に示される、５’－リン酸修飾を含むヌクレオチドであり、５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、式（３）に示される、ビニルリン酸エステル修飾を含むヌクレオチドであり、又は、式（５）に示される、チオリン酸エステル修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、ｓｉＡＰａ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰａ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰａ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰａ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰａ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰａ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰａ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰａ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰａ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰａ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰａ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰａ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ１Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｄ１Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｄ１Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｄ１Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ１Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ１Ｕ－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ３ＳＰ１のいずれか１つである。
ｓｉＡＰａ１－Ｍ１Ｐ１
センス鎖：５’－ＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１８１）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍ－３’（配列番号１８２）
ｓｉＡＰａ２－Ｍ１Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＣｍＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１８３）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍ－３’（配列番号１８４）
ｓｉＡＰａ１－Ｍ２Ｐ１
センス鎖：５’－ＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１８５）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍ－３’（配列番号１８６）
ｓｉＡＰａ２－Ｍ２Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＣｍＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１８７）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍ－３’（配列番号１８８）
ｓｉＡＰａ１－Ｍ３Ｐ１
センス鎖：５’－ＵｍＵｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１８９）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍ－３’（配列番号１９０）
ｓｉＡＰａ２－Ｍ３Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＣｍＵｍＵｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１９１）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍ－３’（配列番号１９２）
ｓｉＡＰａ１－Ｍ１ＳＰ１
センス鎖：５’－ＵｍｓＵｍｓＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１９３）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍｓＧｍｓＣｍ－３’（配列番号１９４）
ｓｉＡＰａ２－Ｍ１ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＣｍｓＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１９５）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍｓＡｍｓＡｍ－３’（配列番号１９６）
ｓｉＡＰａ１－Ｍ２ＳＰ１
センス鎖：５’－ＵｍｓＵｍｓＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１９７）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍｓＧｍｓＣｍ－３’（配列番号１９８）
ｓｉＡＰａ２－Ｍ２ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＣｍｓＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号１９９）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍｓＡｍｓＡｍ－３’（配列番号２００）
ｓｉＡＰａ１－Ｍ３ＳＰ１
センス鎖：５’－ＵｍｓＵｍｓＡｍＡｍＡｍＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２０１）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍｓＧｍｓＣｍ－３’（配列番号２０２）
ｓｉＡＰａ２－Ｍ３ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＣｍｓＵｍＵｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２０３）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍｓＡｍｓＡｍ－３’（配列番号２０４）
ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ１Ｐ１
センス鎖：５’－ＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３２７）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍ－３’（配列番号３２８）
ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ１Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＣｍＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３２９）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍ－３’（配列番号３３０）
ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ２Ｐ１
センス鎖：５’－ＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３３１）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍ－３’（配列番号３３２）
ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ２Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＣｍＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３３３）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍ－３’（配列番号３３４）
ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ３Ｐ１
センス鎖：５’－ＵｍＵｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３３５）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍ－３’（配列番号３３６）
ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ３Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＣｍＵｍＵｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３３７）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＧｆＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍ－３’（配列番号３３８）
ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ１ＳＰ１
センス鎖：５’－ＵｍｓＵｍｓＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３３９）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍｓＧｍｓＣｍ－３’（配列番号３４０）
ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ１ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＣｍｓＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３４１）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍｓＡｍｓＡｍ－３’（配列番号３４２）
ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ２ＳＰ１
センス鎖：５’－ＵｍｓＵｍｓＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３４３）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍｓＧｍｓＣｍ－３’（配列番号３４４）
ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ２ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＣｍｓＵｍＵｍＡｍＡｍＡｆＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３４５）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍｓＡｍｓＡｍ－３’（配列番号３４６）
ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ３ＳＰ１
センス鎖：５’－ＵｍｓＵｍｓＡｍＡｍＡｍＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３４７）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍｓＧｍｓＣｍ－３’（配列番号３４８）
ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ３ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＣｍｓＵｍＵｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｆＧｆＧｆＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３４９）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＡｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｆＵｍＵｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍｓＡｍｓＡｍ－３’（配列番号３５０）
ｓｉＡＰｂ１－Ｍ１Ｐ１
センス鎖：５’－ＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２０５）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｆＧｆＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号２０６）
ｓｉＡＰｂ２－Ｍ１Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２０７）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｆＧｆＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２０８）
ｓｉＡＰｂ１－Ｍ２Ｐ１
センス鎖：５’－ＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２０９）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号２１０）
ｓｉＡＰｂ２－Ｍ２Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２１１）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２１２）
ｓｉＡＰｂ１－Ｍ３Ｐ１
センス鎖：５’－ＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２１３）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号２１４）
ｓｉＡＰｂ２－Ｍ３Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２１５）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２１６）
ｓｉＡＰｂ１－Ｍ１ＳＰ１
センス鎖：５’－ＡｍｓＣｍｓＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２１７）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｆＧｆＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍｓＣｍｓＣｍ－３’（配列番号２１８）
ｓｉＡＰｂ２－Ｍ１ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２１９）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｆＧｆＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号２２０）
ｓｉＡＰｂ１－Ｍ２ＳＰ１
センス鎖：５’－ＡｍｓＣｍｓＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２２１）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍｓＣｍｓＣｍ－３’（配列番号２２２）
ｓｉＡＰｂ２－Ｍ２ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２２３）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号２２４）
ｓｉＡＰｂ１－Ｍ３ＳＰ１
センス鎖：５’－ＡｍｓＣｍｓＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２２５）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍｓＣｍｓＣｍ－３’（配列番号２２６）
ｓｉＡＰｂ２－Ｍ３ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２２７）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号２２８）
ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ１Ｐ１
センス鎖：５’－ＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３５１）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｆＧｆＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号３５２）
ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ１Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３５３）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｆＧｆＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍ－３’（配列番号３５４）
ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ２Ｐ１
センス鎖：５’－ＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３５５）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号３５６）
ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ２Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３５７）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍ－３’（配列番号３５８）
ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ３Ｐ１
センス鎖：５’－ＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３５９）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍ－３’（配列番号３６０）
ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ３Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３６１）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＧｆＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍ－３’（配列番号３６２）
ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ１ＳＰ１
センス鎖：５’－ＡｍｓＣｍｓＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３６３）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｆＧｆＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍｓＣｍｓＣｍ－３’（配列番号３６４）
ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ１ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３６５）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｆＧｆＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号３６６）
ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ２ＳＰ１
センス鎖：５’－ＡｍｓＣｍｓＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３６７）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍｓＣｍｓＣｍ－３’（配列番号３６８）
ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ２ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３６９）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号３７０）
ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ３ＳＰ１
センス鎖：５’－ＡｍｓＣｍｓＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３７１）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍｓＣｍｓＣｍ－３’（配列番号３７２）
ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ３ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵｆＵｆＣｆＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＡｍ－３’（配列番号３７３）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＡｍＧｍＣｍＡｆＣｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｆＡｍＣｆＵｍＧｍＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号３７４）
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センス鎖：５’－ＵｍＡｍＵｍＵｍＣｆＵｍＣｆＡｆＧｆＵｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＣｍＵｍＡｍ－３’（配列番号２２９）
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ｓｉＡＰｄ２－Ｍ２ＳＰ１
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ｓｉＡＰｄ２－Ｍ３ＳＰ１
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ｓｉＡＰｄ１Ｕ－Ｍ１Ｐ１
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ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ１Ｐ１
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ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ１ＳＰ１
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ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ２ＳＰ１
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ｓｉＡＰｄ１Ｕ－Ｍ３ＳＰ１
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ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ３ＳＰ１
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ｓｉＡＰｅ１－Ｍ２Ｐ１
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ｓｉＡＰｅ２－Ｍ２Ｐ１
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ｓｉＡＰｅ１－Ｍ２ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２９３）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号２９４）
ｓｉＡＰｅ２－Ｍ２ＳＰ１
センス鎖：５’－ＡｍｓＧｍｓＧｍＧｍＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２９５）
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ｓｉＡＰｅ１－Ｍ３ＳＰ１
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アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号２９８）
ｓｉＡＰｅ２－Ｍ３ＳＰ１
センス鎖：５’－ＡｍｓＧｍｓＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍ－３’（配列番号２９９）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＡｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号３００）
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ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ１Ｐ１
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ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ２Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＧｍＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＡｍ－３’（配列番号４０３）
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ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ２Ｐ１
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ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ３Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＡｍ－３’（配列番号４０７）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍ－３’（配列番号４０８）
ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ３Ｐ１
センス鎖：５’－ＡｍＧｍＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＡｍ－３’（配列番号４０９）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＧｆＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍＵｍＵｍ－３’（配列番号４１０）
ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ１ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＡｍ－３’（配列番号４１１）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｆＧｆＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号４１２）
ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ１ＳＰ１
センス鎖：５’－ＡｍｓＧｍｓＧｍＧｍＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＡｍ－３’（配列番号４１３）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｆＧｆＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号４１４）
ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ２ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＡｍ－３’（配列番号４１５）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号４１６）
ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ２ＳＰ１
センス鎖：５’－ＡｍｓＧｍｓＧｍＧｍＡｍＣｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＡｍ－３’（配列番号４１７）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号４１８）
ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ３ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＧｍｓＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＡｍ－３’（配列番号４１９）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍｓＣｍｓＵｍ－３’（配列番号４２０）
ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ３ＳＰ１
センス鎖：５’－ＡｍｓＧｍｓＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｆＡｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｍＡｍ－３’（配列番号４２１）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＧｆｓＣｍＡｍＣｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣｆＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号４２２）
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、ｓｉＡＰａ１ＵＭ３ＳＶＰ、ｓｉＡＰｅ１ＵＭ３ＳＶＰ、ｓｉＡＰｂ１ＵＭ３ＳＶＰ、ｓｉＡＰｄ１ＵＭ３ＳＶＰ、ｓｉＡＰｃ１Ｍ３ＳＶＰ、ｓｉＡＰｄ１ＵＭ３ＳＰ、ｓｉＡＰｄ１ＵＭ３ＳＰｓ、ｓｉＡＰａ１Ｍ３ＳＰ、ｓｉＡＰｅ１Ｍ３ＳＰ、ｓｉＡＰｂ１Ｍ３ＳＰ及びｓｉＡＰｃ１Ｍ３ＳＰから選択される１つである。上記ｓｉＲＮＡは、表７に示される。
上記本開示のｓｉＲＮＡにおいて、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字の左右２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、文字と数字の組み合わせＰ１は、当該文字の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表す。いくつかの実施形態において、Ｐ１は、特定の修飾がＶＰ、Ｐｓ又はＰであることを表し、組合せ文字ＶＰは、当該組合せ文字ＶＰの右側に隣接する１つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル（５’－（Ｅ）－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ－ＶＰ）修飾ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字Ｐｓは、当該組合せ文字Ｐｓの右側に隣接する１つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、大文字Ｐは、当該文字Ｐの右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチドであることを表す。
本開示の発明者は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡが顕著に向上した血漿とリソソーム安定性を有するだけでなく、非常に高い遺伝子抑制活性を維持することを意外にも見出した。
本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、本分野における通常のｓｉＲＮＡ調製方法（例えば、固相合成方法及び液相合成方法）により得ることができる。ここで、固相合成は、既に商用カスタマイズサービスが行われている。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入することができ、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。
＜薬物組成物＞
本開示は、活性成分として上述したｓｉＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
前記薬学的に許容可能な担体は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられる担体であってもよく、例えば、磁性ナノ粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、例えば、Ｆｅ３Ｏ４又はＦｅ２Ｏ３に基づくナノ粒子）、カーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｎ ｎａｎｏｔｕｂｅｓ）、メソポーラスシリコン（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃｏｎ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）、ポリアミドアミンデンドリマー（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ （ＰＡＭＡＭ） ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、ポリリジン（ｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）、ＰＬＬ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、ポリＤ－又はＬ－乳酸／グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（Ｄ＆Ｌ－ｌａｃｔｉｃ／ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＰＬＧＡ）、ポリ（アミノエチルエチレンリン酸エステル）（ｐｏｌｙ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＰＰＥＥＡ）及びポリ（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ（２－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＤＭＡＥＭＡ）並びにこれらの誘導体の１又は複数があるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物におけるｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体の含有量に対して特段の要件はないが、いくつかの実施形態においては、ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体との重量比が、１：（１～５００）であってもよい。いくつかの実施形態においては、上記重量比が１：（１～５０）である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物には、薬学的に許容できる他の添加剤が含まれてもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であってもよい。例えば、前記薬学的に許容できる他の添加剤は、ｐＨ緩衝液、保護剤及び浸透圧調節剤の少なくとも１種を含んでもよい。
前記ｐＨ緩衝液は、ｐＨ７．５～８．５のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｂｕｆｆｅｒ）及び／又はｐＨ５．５～８．５のリン酸塩緩衝液であってもよく、例えば、ｐＨ５．５～８．５のリン酸塩緩衝液であってもよい。
前記保護剤は、イノシトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース及びグルコースの少なくとも１種であってもよい。前記薬物組成物の全重量を基準とし、前記保護剤の含有量は０．０１～３０重量％であってもよい。
前記浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムであってもよい。前記浸透圧調節剤の含有量は、前記薬物組成物の浸透圧が２００～７００ミリオスモル／キログラム（ｍＯｓｍ／ｋｇ）となるように決定される。所望の浸透圧により、当業者は、前記浸透圧調節剤の含有量を容易に決定することができる。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、注射液等の液体製剤であってもよく、凍結乾燥粉末注射剤として、投与時に液体添加剤と混合し、液体製剤としてもよい。前記液体製剤は、皮下、筋肉又は静脈注射投与に用いることができるが、これらに限定されず、噴霧により肺に投与、或いは、噴霧により肺を通して他の臓器組織（例えば、肝臓）に投与することもできるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、静脈注射投与に用いられる。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、リポソーム製剤の形式であってもよい。いくつかの実施形態において、前記リポソーム製剤に用いられる薬学的に許容可能な担体は、アミン含有トランスフェクション化合物（以下、有機アミンともいう）、補助脂質及び／又はＰＥＧ化（ポリエチレングリコール化）脂質を含む。ここで、前記有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質は、ＣＮ１０３３８０１１３Ａ（引用によりその全体を本明細書に組み込む）に記載されたアミン含有トランスフェクション化合物又はその薬学的に許容できる塩又は誘導体、補助脂質及びＰＥＧ化脂質からそれぞれ選択される１種又は複数種であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、ＣＮ１０３３８０１１３Ａに記載された式（２０１）に示される化合物又はその薬学的に許容できる塩であってもよい。
Figure 0007507495000011
 式中、
Ｘ１０１及びＸ１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ－Ａ又はＣ－Ａであり、Ａは水素又はＣ１－Ｃ２０炭化水素鎖であり、
Ｙ１０１及びＺ１０１はそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ－ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６及びＲ１０７はそれぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
ｘが１～１０の整数であり、
ｎが１～３の整数であり、ｍが０～２０の整数であり、ｐが０又は１であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ１０２は水素であり、
ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ１０３と式（２０１）における窒素とが、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成する。
Figure 0007507495000012
 式中、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１～６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊Ｎは式（２０１）における窒素原子を表す。
いくつかの実施形態において、Ｒ１０３はポリアミンである。他の実施形態において、Ｒ１０３はケタールである。いくつかの実施形態において、式（２０１）におけるＲ１０１及びＲ１０２のそれぞれは、独立して、任意に置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アルキル又はアルケニルであり、前記アルキル又はアルケニルは、３～約２０個の炭素原子、例えば、８～約１８個の炭素原子、及び０～４個の二重結合、例えば、０～２個の二重結合を有する。
いくつかの実施形態において、ｎとｍのそれぞれが独立して１又は３の値である場合、Ｒ１０３は、下記式（２０４）～式（２１３）のいずれか１つであってもよい。
Figure 0007507495000013
 式（２０４）～式（２１３）において、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１～６の整数であり、各「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊はＲ１０３と式（２０１）における窒素原子との結合可能点を示し、任意の＊位置上の各Ｈは、式（２０１）における窒素原子と結合するために置換されてもよい。
式（２０１）に示される化合物は、ＣＮ１０３３８０１１３Ａの記載により調製されてもよい。
いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、式（２１４）に示される有機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンである。
Figure 0007507495000014
前記補助脂質は、コレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロールの誘導体であり、
前記ＰＥＧ化脂質は、１，２－ジパルミトアミド－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）］－２０００（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－［ｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）］－２０００）である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物において、前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比は（１９．７～８０）：（１９．７～８０）：（０．３～５０）であり、例えば、（５０～７０）：（２０～４０）：（３～２０）であってもよい。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された薬物組成物粒子は、約３０ｎｍ～約２００ｎｍの平均径を有し、一般に約４０ｎｍ～約１３５ｎｍであり、より一般的には、当該リポソーム粒子の平均径は約５０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ又は約７０ｎｍ～約９０ｎｍであり、例えば、当該リポソーム粒子の平均径は、約３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０又は１６０ｎｍである。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された薬物組成物において、ｓｉＲＮＡと全脂質（例えば有機アミン、補助脂質及び／又はＰＥＧ化脂質）の重量比（重量／重量比）は、約１：１～約１：５０、約１：１～約１：３０、約１：３～約１：２０、約１：４～約１：１８、約１：５～約１：１７、約１：５～約１：１５、約１：５～約１：１２、約１：６～約１：１２又は約１：６～約１：１０の範囲内にあり、例えば、本開示のｓｉＲＮＡと全脂質の重量比は約１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７又は１：１８である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、市販時に各成分が独立して存在してもよく、使用時に液体製剤として存在してもよい。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡと上記薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成物は、既知の各種の方法に従い調製されてもよく、従来のｓｉＲＮＡの代わりに本開示により提供されるｓｉＲＮＡを用いればよい。いくつかの実施形態において、以下の方法に従い調製されてもよい。
有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質を上記モル比でアルコールに懸濁させ均一に混合して脂質溶液を得る。アルコールの用量は、得られた脂質溶液の総質量濃度が２～２５ｍｇ／ｍＬ、例えば、８～１８ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記アルコールは、薬学的に許容できるアルコール、例えば、エタノール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００など、室温付近で液体であるアルコールから選択される１種又は複数種であり、例えばエタノールであってもよい。
本開示により提供されるｓｉＲＮＡを緩衝塩溶液に溶解し、ｓｉＲＮＡ水溶液を得る。緩衝塩溶液の濃度が０．０５～０．５Ｍであり、例えば、０．１～０．２Ｍであってもよく、緩衝塩溶液のｐＨを４．０～５．５に調節し、例えば、５．０～５．２であってもよく、緩衝塩溶液の用量は、ｓｉＲＮＡの濃度が０．６ｍｇ／ｍＬ以下、例えば、０．２～０．４ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記緩衝塩は、可溶性酢酸塩、可溶性クエン酸塩から選択される１種又は複数種であり、例えば、酢酸ナトリウム及び／又は酢酸カリウムであってよい。
脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液を混合した後、得られた生成物を４０～６０℃で少なくとも２分間、例えば、５～３０分間培養し、培養したリポソーム製剤を得る。脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液の体積比は１：（２～５）である。
培養したリポソーム製剤を濃縮又は希釈し、不純物を除去し、除菌し、本開示により提供される薬物組成物を得る。その物理化学的パラメーターとしては、ｐＨが６．５～８であり、封入効率が８０％以上であり、粒子径が４０～２００ｎｍであり、多分散指数が０．３０以下であり、浸透圧が２５０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、例えば、物理化学的パラメーターとしては、ｐＨが７．２～７．６、封入効率が９０％以上、粒子径が６０～１００ｎｍ、多分散指数が０．２０以下、浸透圧が３００～４００ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。
ここで、濃縮又は希釈は、不純物を除去する前、不純物を除去した後又は同時に行われてもよい。不純物を除去する方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、タンジェンシャルフロー系、中空糸カラムを用い、１００ＫＤａの条件で限外濾過し、限外濾過交換溶液をｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）としてもよい。除菌方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、０．２２μｍのフィルターで濾過して除菌してもよい。
＜ｓｉＲＮＡ複合体＞
本開示は、上記ｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基を含むｓｉＲＮＡ複合体を提供する。
一般的には、前記複合基は、薬学的に許容できる少なくとも１つの標的基及び任意のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含み、前記ｓｉＲＮＡ、前記リンカー及び前記標的基は順に結合されている。いくつかの実施形態において、前記標的基は１～６個である。いくつかの実施形態において、前記標的基は２～４個である。前記ｓｉＲＮＡ分子は、前記複合基に非共有結合的又は共有結合的に複合されてもよく、例えば、前記複合基に共有結合的に複合されてもよい。ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端にある。
いくつかの実施形態において、前記複合基は、ヌクレオチドのリン酸基、２’－位のヒドロキシ基又は塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、前記複合基は、３’－位のヒドロキシ基に結合されてもよく、この場合、ヌクレオチド間が２’－５’リン酸ジエステル結合により結合されている。複合基は、ｓｉＲＮＡ鎖の末端に結合される場合、通常ヌクレオチドのリン酸基に結合され、ｓｉＲＮＡの内部配列に結合される場合、通常リボース糖環或いは塩基に結合される。各種の結合方法については、Ｍｕｔｈｉａｈ Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ．ａｌ． ｓｉＲＮＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｅｌｉｃｉｔ ｒｏｂｕｓｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，１０ （５）：１１８１～７．を参照することができる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との間が酸不安定又は還元可能な化学結合により結合されてもよく、細胞エンドソームの酸性環境で、これらの化学結合が分解され、ｓｉＲＮＡが遊離状態になることができる。分解できない複合方法については、複合基は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合され、複合によるｓｉＲＮＡ活性への影響をできるだけ低下させることができる。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられるリガンド、例えば、ＷＯ２００９０８２６０７Ａ２に記載された各種のリガンドであってもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、コレステロール、胆汁酸、ビタミン（例えば、トコフェロール）、鎖長が異なる脂質分子等の親油性分子と、ポリエチレングリコール等のポリマーと、膜透過性ペプチド等のポリペプチドと、アプタマーと、抗体と、量子ドットと、ラクトース、ポリラクトース、マンノース、ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等の糖類と、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）と、アシアロ糖タンパク質、アシアロ糖残基、リポタンパク（例えば、高密度リポタンパク、低密度リポタンパク等）、グルカゴン、神経伝達物質（例えば、アドレナリン）、成長因子、トランスフェリン等の肝実質細胞に発現する受容体リガンド等の標的分子又はその誘導体により形成されたリガンドから選択される１種又は複数種であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記各リガンドは、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、哺乳動物の肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、ヒト肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合できるリガンドである。これらのリガンドの種類は、当業者に公知であり、その作用として、一般的に標的細胞表面の特異的受容体と結合し、リガンドに結合されるｓｉＲＮＡの標的細胞への送達を媒介する。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、哺乳動物の肝細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体と結合するいずれか１種のリガンドであってもよい。いくつかの実施形態において、各リガンドは、独立してアシアロ糖タンパク質、例えば、アシアロオロソムコイド（ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ、ＡＳＯＲ）又はアシアロフェチュイン（ａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ、ＡＳＦ）である。いくつかの実施形態において、前記リガンドは、糖又は糖の誘導体である。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドはいずれも糖である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、単糖、多糖、修飾単糖、修飾多糖又は糖誘導体である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの前記リガンドは、単糖、二糖又は三糖であってもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは修飾糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドは、いずれも修飾糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドは、いずれも独立して多糖、修飾多糖、単糖、修飾単糖、多糖誘導体又は単糖誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、リガンドのそれぞれ又は少なくとも１つは、グルコース及びその誘導体、マンナン及びその誘導体、ガラクトース及びその誘導体、キシロース及びその誘導体、リボース及びその誘導体、フコース及びその誘導体、ラクトース及びその誘導体、マルトース及びその誘導体、アラビノース及びその誘導体、フルクトース及びその誘導体並びにシアル酸からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、各前記リガンドは、Ｄ－マンノピラノース、Ｌ－マンノピラノース、Ｄ－アラビノース、Ｄ－キシロフラノース、Ｌ－キシロフラノース、Ｄ－グルコース、Ｌ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－ガラクトース、α－Ｄ－マンノフラノース、β－Ｄ－マンノフラノース、α－Ｄ－マンノピラノース、β－Ｄ－マンノピラノース、α－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－グルコフラノース、β－Ｄ－グルコフラノース、α－Ｄ－フルクトフラノース、α－Ｄ－フルクトピラノース、α－Ｄ－ガラクトピラノース、β－Ｄ－ガラクトピラノース、α－Ｄ－ガラクトフラノース、β－Ｄ－ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニルガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブチリルガラクトサミン、Ｎ－イソブチリルガラクトサミン、２－アミノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－１－カルボキシエチル］－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノース、２－デオキシ－２－メチルアミノ－Ｌ－グルコピラノース、４，６－ジデオキシ－４－ホルムアミド－２，３－ジ－Ｏ－メチル－Ｄ－マンノピラノース、２－デオキシ－２－スルホアミノ－Ｄ－グルコピラノース、Ｎ－グリコリル－α－ノイラミン酸、５－チオ－β－Ｄ－グルコピラノース、メチル２，３，４－トリス－Ｏ－アセチル－１－チオ－６－Ｏ－トリチル－α－Ｄ－グルコピラノシド（ｍｅｔｈｙｌ ２，３，４－ｔｒｉｓ－Ｏ－ａｃｅｔｙｌ－１－ｔｈｉｏ－６－Ｏ－ｔｒｉｔｙｌ－α－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、４－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－１，５－ジチオ－α－Ｄ－グルコヘプトピラノシド、２，５－アンヒドロ－Ｄ－アロニトリル、リボース、Ｄ－リボース、Ｄ－４－チオリボース、Ｌ－リボース又はＬ－４－チオリボースから独立して選択されてもよい。前記リガンドの他の選択肢は、例えば、ＣＮ１０５３７８０８２Ａの記載を参照してもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ複合体における、薬学的に許容できる標的基は、ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミンであってもよく、ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子は、１価、２価、３価、４価であってもよい。ここでいう１価、２価、３価、４価は、それぞれｓｉＲＮＡ分子と、標的基としてのガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子を含む複合基から形成されたｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡ分子とガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子とのモル比が１：１、１：２、１：３又は１：４であることを指すと理解すべきである。いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基はＮ－アセチルガラクトサミンである。いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡがＮ－アセチルガラクトサミンを含む複合基と複合する場合、Ｎ－アセチルガラクトサミン分子は３価又は４価である。いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡがＮ－アセチルガラクトサミンを含む複合基と複合する場合、Ｎ－アセチルガラクトサミン分子は３価である。
標的基は、適切なリンカーを介してｓｉＲＮＡ分子に結合されてもよく、当業者は、標的基の具体的な種類により適切なリンカーを選択することができる。これらのリンカー、標的基の種類及びｓｉＲＮＡへの結合方法については、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２の開示内容を参照してもよく、引用によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ－アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、式（３０１）に示される構造であってもよい。
Figure 0007507495000015
 式中、
ｋは１～３の整数であり、
ＬＡは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記ＬＡは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記ＬＣ部にエーテル結合により結合される。
Figure 0007507495000016
 ＬＢは、式（３０３）に示される構造を有するＮ－アシルピロリジンを含む鎖状部であり、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記ＬＣ部にアミド結合により結合され、他端に酸素基を有し、前記ｓｉＲＮＡにリン酸エステル結合により結合される。
Figure 0007507495000017
 ＬＣは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２～４価のリンカー基であり、前記ＬＣは、酸素原子を介してエーテル結合により各前記ＬＡ部に結合されるとともに、窒素原子を介してアミド結合により前記ＬＢ部に結合される。
いくつかの実施形態において、ｎ＝３であり、ＬＣがトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく４価のリンカー基である場合、リンカーとしての－（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン－ＬＢ－によりＮ－アセチルガラクトサミン分子とｓｉＲＮＡ分子を結合して形成されたｓｉＲＮＡ複合体は、その構造が以下の式（３０４）に示される。
Figure 0007507495000018
 式中、二重螺旋構造はｓｉＲＮＡを表す。
同様に、ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。
いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端は、リンカー－（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン－ＬＢ－により３個のＮ－アセチルガラクトサミン分子に共有結合的に複合され、ｓｉＲＮＡ分子とＧａｌＮＡｃ分子とのモル比が１：３である、構造が以下の式（３０５）に示されるｓｉＲＮＡ複合体（以下、（ＧａｌＮＡｃ）３－ｓｉＲＮＡともいう）を得る。
Figure 0007507495000019
 式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ－アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、式（３０６）に示される構造であってもよい。
Figure 0007507495000020
 式中、
ｌは０～３の整数であり、
＊は、リンカーにおいてエーテル結合により標的基に結合される部位を表し、
＃は、リンカーにおいてリン酸エステル結合によりｓｉＲＮＡに結合される部位を表す。
いくつかの実施形態において、ｌ＝２である場合、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０７）に示される構造を有する。
Figure 0007507495000021
 式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。
上記複合体は、従来技術において既に詳しく記載された方法により合成されてもよい。例えば、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２には、複数種の複合体の調製方法が詳しく記載されている。当業者によく知られている方法により、本開示のｓｉＲＮＡ複合体を得る。例えば、ＷＯ２０１４０２５８０５Ａ１には、式（３０５）に示される構造の調製方法が記載されており、Ｒａｊｅｅｖらは、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１５，１６，９０３－９０８に式（３０７）に示される構造の調製方法を記載した。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０８）に示される構造を有する。
Figure 0007507495000022
 式中、
ｎ１は、１～３から選択される整数であり、ｎ３は、０～４から選択される整数であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２～１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈであり、又はＣ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０アルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基である。
Figure 0007507495000023
 式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは本開示のｓｉＲＮＡである。
Ｒ２は、長さ１～２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子は、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
各Ｌ１は、長さ１～７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子は、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよい。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１～Ａ２６の基又はその任意の組合せからなる群から選択されてもよく、Ａ１～Ａ２６の構造と定義は以下のとおりである。
Figure 0007507495000024
 式中、ｊ１は１～２０の整数であり、ｊ２は１～２０の整数であり、
Ｒ’はＣ１－Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｒａは、式Ａ２７～Ａ４５の基又はその任意の組合せからなる群から選択される。
Figure 0007507495000025
 ＲｂはＣ１－Ｃ１０のアルキル基であり、
Figure 0007507495000026
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
便宜上、Ｌ１は、線形アルキレン基として定義されるが、例えば上述の取替及び／又は置換によって生じるアミンやアルケニル基で、線形基ではない、又は名称が異なる可能性があることは、当業者に理解される。本開示内容の目的のために、Ｌ１の長さは、２つの結合点を結合する鎖における原子数である。この目的のために、前記直鎖アルキレンの炭素原子を置換して得られた環（例えば、ヘテロシクリレン又はヘテロアリーレン）を、１個の原子とする。
Ｍ１は、標的基を表し、その定義と選択可能な範囲は上記標的基と同じである。いくつかの実施形態において、各Ｍ１は、哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドから独立して選択される１つである。
Ｍ１が哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドである場合、いくつかの実施形態において、ｎ１は、１～３の整数であってもよく、ｎ３は、０～４の整数であってもよく、前記複合体におけるＭ１標的基の個数が少なくとも２であることを確保する。いくつかの実施形態において、ｎ１＋ｎ３≧２であり、これにより、Ｍ１標的基の個数が少なくとも３であり、Ｍ１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体をより容易に結合させ、さらに前記複合体がエンドサイトーシス（細胞内取込み）作用により細胞に取り込まれることを促進することができる。実験から分かるように、Ｍ１標的基の個数が３個以上である場合、Ｍ１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合の容易さの向上が明らかではないので、合成の容易さ、構造／プロセスコスト及び送達効率等の多方面を総合的に考慮すると、いくつかの実施形態において、ｎ１は１～２の整数であり、ｎ３は０～１の整数であり、かつ、ｎ１＋ｎ３＝２～３である。
いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、独立して２～１０の整数から選択される場合、複数のＭ１標的基間の空間位置をＭ１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合に適合させることができる。本開示により提供される複合体をより簡略化し、より合成しやすく、及び／又はコストを低下させるために、いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、それぞれ独立して２～５の整数であり、いくつかの実施形態において、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である。
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５が、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０アルコキシからそれぞれ独立して選択される１つである場合、いずれも本開示の複合体の性質を変化させることなく、本開示の目的を実現することができることは、当業者に理解され得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立してＨ、メチル基及びエチル基から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、いずれもＨである。
Ｒ３は、式Ａ５９に示される構造の基であり、そのうち、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、調製原料の入手しやすさを考慮し、いくつかの実施形態において、Ｅ１はＯＨ又はＳＨである。
Ｒ２は、窒素含有骨格上のＮとＡ５９との結合を実現するために選択される。本開示の文脈において、「窒素含有骨格」とは、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５が結合された炭素原子とＮが互いに結合している鎖状構造を指す。したがって、Ｒ２は、適当な方法でＡ５９基を窒素含有骨格上のＮに結合することができる任意のリンカー基であってもよい。いくつかの実施形態において、固相合成プロセスにより式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を調製する場合に、Ｒ２基には、窒素含有骨格上のＮに結合される結合部位及びＲ３におけるＰに結合される結合部位がともに含まれる必要がある。いくつかの実施形態において、Ｒ２における前記窒素含有骨格中のＮに結合される部位は、Ｎとアミド結合を形成し、前記Ｒ３上のＰに結合される部位は、Ｐとリン酸エステル結合を形成し、いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’であってもよい。
Figure 0007507495000027
 式中、
Figure 0007507495000028
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
ｑ２の値の範囲は、１～１０の整数であってもよく、いくつかの実施形態において、ｑ２は１～５の整数である。
Ｌ１は、Ｍ１標的基と窒素含有骨格上のＮを結合し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体に肝標的機能を提供するという役割を果たす。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、式Ａ１～Ａ２６の基から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１及びＡ１３から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。
いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３～２５個の原子、３～２０個の原子、４～１５個の原子又は５～１２個の原子であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個の原子である。
いくつかの実施形態において、ｊ１は２～１０の整数であり、いくつかの実施形態において、ｊ１は３～５の整数である。いくつかの実施形態において、ｊ２は２～１０の整数であり、いくつかの実施形態において、ｊ２は３～５の整数である。Ｒ’はＣ１－Ｃ４のアルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒ’は、メチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つである。Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つであり、いくつかの実施形態において、Ｒａは、Ａ２７又はＡ２８である。Ｒｂは、Ｃ１－Ｃ５のアルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒｂは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の１つである。いくつかの実施形態において、式Ａ１～Ａ２６においてそれぞれｊ１、ｊ２、Ｒ’、Ｒａ、Ｒｂを選択することにより、Ｍ１標的基と窒素含有骨格上のＮとの結合を実現し、Ｍ１標的基間の空間位置をＭ１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合にさらに適合させる。
いくつかの実施形態において、該複合体は、式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する。
Figure 0007507495000029
Figure 0007507495000030
Figure 0007507495000031
Figure 0007507495000032
Figure 0007507495000033
Figure 0007507495000034
Figure 0007507495000035
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡ配列における任意の可能な位置に結合されてもよく、例えば、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合されてもよく、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の端部に結合される。前記端部とは、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖においてその一端から前の４個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖の上記位置に結合される場合に、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体は、細胞に入り込んだ後、巻き戻されるときに、単独のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を放出し、ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡがタンパク質を翻訳する過程を遮断し、アンジオポエチン様タンパク質３の遺伝子発現を抑制することができる。
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチド上の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチドの５’位、ヌクレオチドの２’位、ヌクレオチドの３’位又はヌクレオチドの塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’ヒドロキシ基を脱水素した酸素原子に結合され（このとき、Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡに含まれるリン酸基のＰと見なすこともできる）、或いは、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖における１つのヌクレオチドの２’－ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合され、或いは、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合される。
本開示の発明者は、本開示のｓｉＲＮＡ複合体が、顕著に向上した血漿中安定性、低いオフターゲット効果を有するとともに、明らかに低下していないＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡサイレンシング活性をさらに示し、さらに高い脂質抑制作用を有することを意外にも見出した。したがって、いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡは、表１、表２、表３、表４、表５に示される。
Figure 0007507495000036
Figure 0007507495000037
Figure 0007507495000038
Figure 0007507495000039
Figure 0007507495000040
Figure 0007507495000041
Figure 0007507495000042
Figure 0007507495000043
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Figure 0007507495000052
Figure 0007507495000053
Figure 0007507495000054
本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体において、各隣接するヌクレオチド間がリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合により結合され、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、負電荷を帯び、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐ）として存在してもよく、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基における水素イオンは、一部又は全部がカチオンで置換されてもよい。前記カチオンは、任意のカチオン、例えば、金属カチオン、アンモニウムイオンＮＨ４ ＋、有機アンモニウムカチオンの１つであってもよい。溶解性の向上を考慮し、１つの実施形態において、前記カチオンは、アルカリ金属イオン、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン及び４級アンモニウムカチオンから選択される１種又は複数種である。アルカリ金属イオンは、Ｋ＋及び／又はＮａ＋であってもよく、第３級アミンにより形成されたカチオンは、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン、及び／又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンであってもよい。したがって、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体は、少なくとも一部が塩として存在してもよい。１つの態様において、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、少なくとも一部がナトリウムイオンに結合され、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体は、ナトリウム塩又は部分ナトリウム塩として存在する。
当業者であれば明らかに知っているように、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入することができる。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。全ての修飾ヌクレオシドモノマーは、市販品として購入されてもよく、既知の方法により調製されてもよい。
＜式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製＞
任意の合理的な合成経路により式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を調製してもよい。
いくつかの実施形態において、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体は、以下の方法により調製することができる。当該方法は、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、それぞれｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、アニールを行うことを含み、前記ｓｉＲＮＡは、上記本開示のｓｉＲＮＡである。
また、当該方法は、カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、ヌクレオシドモノマー又は固相担体に結合されたヌクレオチド配列と接触させ、式（３２１）に示される化合物をカップリング反応させてヌクレオチド配列に結合することをさらに含む。以下に、式（３２１）に示される化合物は、複合分子とも呼ばれる。
Figure 0007507495000055
 式中、
Ｒ４は、式（３０８）に示される化合物におけるＮｕに示されるｓｉＲＮＡに結合可能な基である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、共有結合によりＮｕに示されるｓｉＲＮＡに結合可能な基である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、反応を経てリン酸ジエステル結合によりＮｕに示されるｓｉＲＮＡの任意の官能基に複合可能な基であり、
各Ｓ１は、独立してＭ１において全ての活性ヒドロキシ基がＹＣＯＯ－基で置換された基であり、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される１つであり、いくつかの実施形態において、Ｙはメチル基である。
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｍ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
Ｒ４は、窒素含有骨格上のＮとの結合を実現し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の合成に適切な反応部位を提供するために選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ４には、Ｒ２リンカー基又は保護されたＲ２リンカー基、及び反応させることによりｓｉＲＮＡとＡ５９に示される構造を形成することができる官能基が含まれる。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡ又はヌクレオシドモノマー上の基と亜リン酸エステルを形成することができる第１の官能基と、ヒドロキシ基又はアミノ基と反応させて共有結合を形成することができる第２の官能基または前記共有結合により結合された固相担体とを含む。いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基である。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、ホスホルアミダイト、カルボキシ基又はカルボン酸塩である。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、共有結合を介して分子の他の部分に結合される固相担体であり、前記共有結合は、ヒドロキシ基又はアミノ基により形成されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は、リン酸エステル結合、カルボン酸エステル結合又はアミド結合を介して結合されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は樹脂である。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基、－ＯＲｋ又は式（Ｃ３）に示される基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）、（Ｃ３）、（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を含む。
Figure 0007507495000056
 式中、ｑ１は１～４の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
Figure 0007507495000057
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、式（Ｃ３）に示されるように、ホスホルアミダイト基を含み、当該ホスホルアミダイト基は、ヌクレオチド上の任意位置のヒドロキシ基、例えば、２’位のヒドロキシ基又は３’位のヒドロキシ基とカップリング反応させて亜リン酸エステルを形成し、酸化又は硫化されて式Ａ５９に示されるリン酸ジエステル結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、複合分子をｓｉＲＮＡに複合することができる。この場合、前記第２の官能基が存在しなくても、式（３２１）の化合物は、ヌクレオチドに複合することができ、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の取得に影響することはない。この場合に、ホスホルアミダイト固相合成等の方法によりｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得た後、式（３２１）の化合物と、ヌクレオチド配列において末端ヌクレオチド上のヒドロキシ基を反応させ、後の酸化又は硫化過程においてリン酸ジエステル結合結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、式（３２１）の化合物をｓｉＲＮＡに複合させる。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、保護されたヒドロキシ基を含む。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、固相担体と反応できる基を含み、前記反応により固相担体を含む複合分子を提供する。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）又は（Ｃ３）に示されるように、カルボキシ基、カルボン酸塩又はホスホルアミダイトを含む。前記第２の官能基がカルボキシ基又はカルボン酸塩を含む場合、式（３２１）の化合物と固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基又はアミノ基をエステル化反応又はアミド化反応させ、カルボン酸エステル結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。前記第２の官能基がホスホルアミダイト官能基を含む場合、式（３２１）の化合物と汎用の固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基をカップリング反応させ、酸化されてリン酸ジエステル結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。その後、上記固相担体が結合された生成物を出発とし、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る。ホスホルアミダイト固相合成過程において、前記第１の官能基は、脱保護され、その後、カップリング反応条件下でヌクレオシドモノマーにおけるホスホルアミダイト基とカップリングさせる。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示されるように、カルボン酸エステル結合により結合された固相担体又はアミド結合により結合された固相担体、又はリン酸エステル結合により結合された固相担体を含む。この場合、出発として固相担体の代わりに式（３２１）の化合物を用い、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る。
いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、－ＣＯＯ－Ｍ＋で表されてもよく、ここで、Ｍ＋はカチオンであり、例えば、金属カチオン、アンモニウムカチオンＮＨ４ ＋、有機アンモニウムカチオンから選択される１つである。１つの実施形態において、前記金属イオンは、アルカリ金属イオンから選択される１つであり、例えば、Ｋ＋又はＮａ＋である。溶解性を向上させ、反応をスムーズに行うことを考慮して、いくつかの実施形態において、有機アンモニウムイオンは、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン又は４級アンモニウムカチオン、例えば、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンである。いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、トリエチルアミンカルボン酸塩又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンカルボン酸塩である。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ９’）、（Ｂ１０’）、（Ｂ１１）、（Ｂ１２）、（Ｂ１１’）又は（Ｂ１２’）に示される構造を含む。
Figure 0007507495000058
 式中、ｑ１は１～４の整数であり、ｑ２は１～１０の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
Figure 0007507495000059
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。いくつかの実施形態において、ｑ１は１又は２である。いくつかの実施形態において、ｑ２は１～５の整数である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）又は（Ｂ１０）に示される構造を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ１１）又は（Ｂ１２）に示される構造を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒｋは、Ｔｒ（トリチル基）、ＭＭＴｒ（４－メトキシトリチル基）、ＤＭＴｒ（４，４’－ビスメトキシトリチル基）、ＴＭＴｒ（４，４’，４’－トリメトキシトリチル基）の１又は複数である。いくつかの実施形態において、Ｒｋは、ＤＭＴｒ、即ち、４，４’－ビスメトキシトリチル（４，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）であってもよい。
Ｌ１の定義は、前述したとおりである。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ｍ１標的基を窒素含有骨格上のＮ原子に結合し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体に肝標的機能を提供するために用いられる。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１～Ａ２６のいずれか１つ又はその組合せを含む。
上記記載により、当業者であれば容易に理解できるように、本分野で公知のホスホルアミダイト固相合成方法と比較して、上記第１の官能基及び任意の第２の官能基により、複合分子がヌクレオチド配列の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチド配列の端部、ヌクレオチド配列の末端に結合された、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。これに応じて、特に説明がない限り、以下に複合体及び／又は複合分子の調製に関する記載において、「脱保護」、「カップリング」、「キャッピング」、「酸化」、「硫化」等の反応に言及する場合、本分野で公知のホスホルアミダイト核酸の固相合成方法に係る反応条件と試薬もまた同様にこれらの反応に適用されると理解すべきである。例示的な反応条件と試薬は、以下に詳細に説明する。
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１である。いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１において少なくとも１つの活性ヒドロキシ基がヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１に存在する活性ヒドロキシ基が全てヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、当業者に既知のあらゆるヒドロキシ保護基を、Ｍ１における活性ヒドロキシ基を保護するために用いることができる。いくつかの実施形態において、保護されたヒドロキシ基は、式ＹＣＯＯ－で表されてもよく、各Ｙは、独立してＣ１－Ｃ１０アルキル基及びＣ６－Ｃ１０アリール基からなる群から選択され、前記Ｃ１－Ｃ１０アルキル基及びＣ６－Ｃ１０アリール基は、１又は複数の置換基で任意に置換され、前記置換基は、ハロゲン及びＣ１－Ｃ６アルキル基からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、各Ｙは、独立して、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びＣ１－Ｃ６アルキルフェニル基からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、それぞれ独立して式Ａ４６～Ａ５４からなる群から選択される。
Figure 0007507495000060
いくつかの実施形態において、Ｓ１は式Ａ４９又はＡ５０である。
いくつかの実施形態において、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される１つであり、いくつかの実施形態において、Ｙはメチル基である。
前述したように、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、ｓｉＲＮＡの他方の鎖を合成し（例えば、上記工程で、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖を合成した場合、固相合成方法に従いｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成することをさらに含み、その逆も同様である）、センス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、かつ、アニールを行う工程をさらに含む。具体的には、単離工程において、ヌクレオチド配列及び／又は複合分子に結合される固相担体が切断されるとともに、必要な保護基が除去され（この場合、式（３２１）の化合物における各Ｓ１基が、対応するＭ１標的基に変換される）、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖（又はアンチセンス鎖）及び対応するアンチセンス鎖（又はセンス鎖）が得られ、センス鎖とアンチセンス鎖をアニールして二本鎖ＲＮＡ構造を形成し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得る。
いくつかの実施形態において、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖の３’端の１番目のヌクレオシドモノマーと接触させ、式（３２１）に示される化合物を配列における１番目のヌクレオチドに結合させ、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、所望のセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を合成する工程であって、（３２１）の化合物は、Ｒ４に、保護されたヒドロキシ基を含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有する第２の官能基が含まれる、式（３２１）に示される化合物であり、１番目のヌクレオシドモノマーと結合する前に、式（３２１）の化合物を脱保護し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、複合基が結合された核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る工程；ホスホルアミダイト固相合成の条件で、アンチセンス鎖又はセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、核酸のアンチセンス鎖又はセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、保護基を除去して固相担体から切断し、単離精製して核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
いくつかの実施形態において、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、当該二本鎖ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、センス鎖及びアンチセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、固相担体に結合されたセンス鎖、及び固相担体に結合されたアンチセンス鎖を得る工程；カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、固相担体に結合されたセンス鎖又は固相担体に結合されたアンチセンス鎖と接触させ、Ｒ４にホスホルアミダイト基である第１の官能基が含まれる式（３２１）の化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合させる工程；保護基を除去して固相担体から切断し、それぞれ単離精製し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖の３’末端に結合され、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、
（１）式（３２１）の化合物（式（３２１）の化合物は、Ｒ４に、保護されたヒドロキシ基ＯＲｋを含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有する第２の官能基が含まれる化合物である）におけるヒドロキシ保護基Ｒｋを除去し、カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、脱保護された生成物をヌクレオシドモノマーと接触させ、複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得ること、
（２）当該複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’－５’の方向に、ホスホルアミダイト固相合成方法によりｓｉＲＮＡのセンス鎖を合成すること、
（３）ホスホルアミダイト固相合成方法により、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成すること、
（４）ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることを含む。
工程（１）において、式（３２１）の化合物における保護基Ｒｋを除去する方法は、脱保護条件で、式（３２１）の化合物を脱保護試薬と接触させることを含む。脱保護条件としては、温度は０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間は３０～３００秒、いくつかの実施形態では５０～１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態ではジクロロ酢酸である。脱保護試薬と式（３２１）の化合物とのモル比は１０：１～１０００：１であり、いくつかの実施形態では５０：１～５００：１である。
前記カップリング反応条件とカップリング試薬としては、上記カップリング反応に適した任意の条件と試薬を用いてもよい。いくつかの実施形態において、採用される固相合成方法におけるカップリング反応と同じ条件と試薬を用いてもよい。
いくつかの実施形態において、前記カップリング反応の条件として、反応温度は０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃である。式（３２１）の化合物とヌクレオシドモノマーとのモル比は１：１～１：５０であり、いくつかの実施形態では１：２～１：５である。式（３２１）の化合物とカップリング試薬とのモル比は１：１～１：５０であってもよく、いくつかの実施形態では１：３～１：１０であり、反応時間は２００～３０００秒、いくつかの実施形態では５００～１５００秒である。カップリング試薬は、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾール、５－ベンジルチオ１Ｈ－テトラゾールから選択される１種又は複数種であり、いくつかの実施形態では５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、いくつかの実施形態では無水アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量は３～５０Ｌ／ｍｏｌ、いくつかの実施形態では５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
工程（２）において、ホスホルアミダイト核酸固相合成方法により、上記工程で調製された複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’－５’の方向に、第２のｓｉＲＮＡ複合体のセンス鎖Ｓを合成する。この場合、複合基は、得られたセンス鎖の３’末端に結合される。
工程（２）及び（３）における前記固相合成の他の条件としては、ヌクレオシドモノマーの脱保護条件、脱保護試薬の種類と用量、カップリング反応条件、カップリング試薬の種類と用量、キャッピング反応の条件、キャッピング試薬の種類と用量、酸化反応条件、酸化試薬の種類と用量、硫化反応条件、硫化試薬の種類と用量を含み、本分野で通常用いられる各種の試薬、用量及び条件を採用する。
例えば、いくつかの実施形態において、工程（２）及び（３）において、前記固相合成では、以下の条件を用いてもよい。
ヌクレオシドモノマーの脱保護条件としては、温度は０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間は３０～３００秒、いくつかの実施形態では５０～１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態ではジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における４，４’－ジメトキシトリチル保護基とのモル比は２：１～１００：１であってもよく、いくつかの実施形態では３：１～５０：１である。
カップリング反応条件としては、温度は０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比は１：１～１：５０であってもよく、いくつかの実施形態では１：５～１：１５であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比は１：１～１：１００、いくつかの実施形態では１：５０～１：８０であり、反応時間とカップリング試薬の選択は、前記と同じである。
キャッピング反応条件としては、温度は０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間は５～５００秒、いくつかの実施形態では１０～１００秒であり、キャッピング試薬の選択は、前記と同じである。キャッピング試薬の総量と固相担体に結合される核酸配列とのモル比は１：１００～１００：１、いくつかの実施形態では１：１０～１０：１である。キャッピング試薬として等モル量の酢酸無水物とＮ－メチルイミダゾールを用いる場合、酢酸無水物、Ｎ－メチルイミダゾール及び固相担体に結合される核酸配列のモル比は１：１：１０～１０：１０：１であり、いくつかの実施形態では１：１：２～２：２：１である。
酸化反応条件としては、温度は０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間は１～１００秒、いくつかの実施形態では５～５０秒であり、酸化試薬は、いくつかの実施形態ではヨウ素である（いくつかの実施形態ではヨウ素水として提供する）。酸化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比は、１：１～１００：１であってもよく、いくつかの実施形態では５：１～５０：１である。いくつかの実施形態では、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１～１：１：３の混合溶剤で行われる。硫化反応条件としては、温度は０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間は５０～２０００秒、いくつかの実施形態では１００～１０００秒であり、硫化試薬は、いくつかの実施形態ではキサンタンヒドリドである。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比は１０：１～１０００：１であり、いくつかの実施形態では１０：１～５００：１である。いくつかの実施形態では、前記硫化反応は、アセトニトリル：ピリジン＝１：３～３：１の混合溶剤で行われる。
全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、アニールする前に、当該方法は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離することをさらに含む。単離方法は、当業者に公知であり、一般的に、合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去し、精製し脱塩することを含む。
合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去するには、ｓｉＲＮＡ合成において通常の切断と脱保護方法により行われてもよい。例えば、得られた固相担体が結合されたヌクレオチド配列を濃アンモニア水と接触させ、脱保護過程において、Ａ４６～Ａ５４基の保護基ＹＣＯＯ－をヒドロキシ基に変換させ、Ｓ１基を対応するＭ１基に変換させ、式（３０８）に示される複合体を生成する。ここで、前記濃アンモニア水は、２５～３０重量％のアンモニア水であってもよく、濃アンモニア水の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．２ｍｌ／μｍｏｌ～０．８ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。
合成されたヌクレオチド配列に少なくとも１つの２’－ＴＢＤＭＳ保護がある場合、前記方法は、固相担体が除去されたヌクレオチド配列をトリエチルアミン三フッ化水素酸塩と接触させることにより、当該２’－ＴＢＤＭＳ保護を除去することをさらに含む。この場合、得られた目的とするｓｉＲＮＡ配列には、遊離の２’－ヒドロキシ基の対応するヌクレオシドを有する。純粋なトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．４ｍｌ／μｍｏｌ～１．０ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。このように式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
精製及び脱塩する方法は、当業者によく知られている。例えば、分取用イオンクロマトグラフィー精製カラムを用いて、ＮａＢｒ又はＮａＣｌの勾配溶出によって、核酸の精製を完成し、生成物を回収して合わせた後、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩することができる。
このように得られた式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体において、ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、基本的にナトリウムイオンに結合されており、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体は、基本的にナトリウム塩として存在する。よく知られたイオン交換方法により、水素イオン及び／又は他のカチオンで前記ナトリウムイオンを置換し、他の形式の式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。前記カチオンは、前述したとおりである。
合成過程において、常に核酸配列の純度と分子量を検出し、合成品質をよりよく制御することができる。このような検出方法は、当業者に公知である。例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより核酸純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析により分子量を測定することができる。
アニール方法も、当業者によく知られているものである。例えば、簡単に合成されたセンス鎖（Ｓ鎖）とアンチセンス鎖（ＡＳ鎖）を等モル比で注射用水に混合して７０～９５℃に加熱し、その後、室温で冷却し、水素結合により二本鎖構造を形成させることができる。このように式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
前記複合体を得た後、いくつかの実施形態において、例えば、液体クロマトグラフィータンデム質量分析等の方法を用いて、分子量検出等により合成された式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の特徴を明らかにし、合成されたｓｉＲＮＡ複合体が、目的設計の式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体であるとともに、合成されたｓｉＲＮＡの配列が、所望のｓｉＲＮＡの配列、例えば表１～表５に示される配列の１つであると確認することもできる。
式（３２１）に示される化合物は、有機溶剤において、エステル化反応条件下及び塩基とエステル化触媒の存在下で、式（３１３）に示される化合物を環状酸無水物と接触させ、イオン交換を行い、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることができる。
Figure 0007507495000061
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりであり、
Ｒ６は、式（３２１）におけるＲ４を提供する基である。いくつかの実施形態において、Ｒ６は、式（Ａ６１）に示される構造を有する。
Figure 0007507495000062
 式中、Ｒｉは、窒素含有骨格上のＮとの結合を実現できる、ＲｋＯと結合して１つの遊離ヒドロキシ基が結合されている任意の基であり、Ｒｋはヒドロキシ保護基である。この場合、Ｒ４にヒドロキシ保護基としての第１の官能基と第２の官能基が含まれ、前記第２の官能基が式（Ｃ１）又は（Ｃ２）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
前記エステル化反応条件としては、反応温度は０～１００℃であり、反応時間は８～４８時間であり、いくつかの実施形態において、前記エステル化反応条件としては、反応温度は１０～４０℃であり、反応時間は２０～３０時間である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種を含む。いくつかの実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。前記式（３１３）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記環状酸無水物は、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水物又はピメリン酸無水物の１つであり、いくつかの実施形態において、コハク酸無水物である。前記環状酸無水物と前記式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１～５：１である。
前記エステル化触媒は、当該エステル化反応を触媒する任意の触媒であってもよく、例えば、当該触媒は、４－ジメチルアミノピリジンであってもよい。前記触媒と式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記塩基は、任意の無機塩基、有機塩基又はこれらの組合せであってもよい。溶解性及び生成物の安定性を考慮すると、前記塩基は、例えば、第３級アミン類有機塩基であってもよい。いくつかの実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミン類有機塩基と式（３１３）に示される化合物とのモル比は１：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１～１０：１である。
前記イオン交換作用は、式（３２１）の化合物を所望のカルボン酸又はカルボン酸塩の形式に変換することであり、イオン交換方法は、当業者に公知であり、適切なイオン交換溶液と交換条件を用い、前述したカチオンがＭ＋である複合分子を得ることができ、ここでは詳しい説明を省略する。いくつかの実施形態において、前記イオン交換反応は、トリエチルアミンリン酸塩溶液を用いて行われ、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度は０．２～０．８Ｍであり、いくつかの実施形態においては、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度は０．４～０．６Ｍであり、式（３１３）の化合物に対して、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の用量は３～６Ｌ／ｍｏｌであり、更なる実施形態においては４～５Ｌ／ｍｏｌである。
任意の適切な単離方法によって、反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３２１）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出すること、又は、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出することという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、縮合反応条件下で、有機溶剤において、縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下で、上記イオン交換反応により得られた生成物を、さらにアミノ基又はヒドロキシ基を含む固相担体と接触させることをさらに含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ１’）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
前記固相担体は、ｓｉＲＮＡの固相合成に用いられる担体の１つであり、そのうちのいくつかは、当業者に公知である。例えば、前記固相担体は、活性ヒドロキシ基又はアミノ官能基を含む固相担体から選択されてもよく、いくつかの実施形態において、前記固相担体は、アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂である。いくつかの実施形態において、前記アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂は、粒子径１００～４００メッシュ（ｍｅｓｈ）、表面におけるアミノ基又はヒドロキシ基の担持量０．２～０．５ｍｍｏｌ／ｇというパラメーターを有する。前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比は１０～４００μｍｏｌ化合物／グラムの固相担体（μｍｏｌ／ｇ）である。いくつかの実施形態において、前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比は５０～２００μｍｏｌ／ｇである。
前記有機溶剤は、当業者に既知の任意の適切な溶剤又は混合溶剤であってもよい。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量は２０～２００Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５０～１００Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記縮合剤は、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ－ｏｘｙｔｒｉｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰｙＢｏｐ）、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン及び／又はＯ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エステルであってもよく、いくつかの実施形態において、前記縮合剤は、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エステルである。前記縮合剤と式（３２１）に示される化合物とのモル比は１：１～２０：１であり、更なる実施形態において１：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン及び／又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、前記第３級アミン類有機塩基と式（３２１）に示される化合物とのモル比は１：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、１：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、キャッピング反応条件下で、有機溶剤において、得られた縮合生成物をキャッピング試薬及びアシル化触媒と接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることをさらに含んでもよい。前記キャッピング反応の作用は、後の反応において不必要な副生成物が生じることを避けるために、まだ完全に反応していないあらゆる活性反応官能基を除去することである。前記キャッピング反応の条件としては、反応温度は０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間は１～１０ｈ、いくつかの実施形態では３～６ｈである。キャッピング試薬としては、当業者に公知の、ｓｉＲＮＡ固相合成に用いられるキャッピング試薬を用いてもよい。
いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬は、キャッピング試薬１（ｃａｐ１）及びキャッピング試薬２（ｃａｐ２）からなり、キャッピング試薬１は、Ｎ－メチルイミダゾールであり、いくつかの実施形態において、Ｎ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液として提供され、ピリジンとアセトニトリルとの体積比は１：１０～１：１であり、いくつかの実施形態において、１：３～１：１であり、ピリジンとアセトニトリルの総体積とＮ－メチルイミダゾールとの体積比は１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１～７：１である。前記キャッピング試薬２は、酢酸無水物である。いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬２は、酢酸無水物のアセトニトリル溶液として提供され、酢酸無水物とアセトニトリルとの体積比が１：１～１：１０であり、更なる実施形態において１：２～１：６である。
いくつかの実施形態において、前記Ｎ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液の体積と式（３２１）の化合物の質量との比は５ｍｌ／ｇ～５０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態では１５ｍｌ／ｇ～３０ｍｌ／ｇである。前記酢酸無水物のアセトニトリル溶液の体積と式（３２１）の化合物の質量との比は０．５ｍｌ／ｇ～１０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態では１ｍｌ／ｇ～５ｍｌ／ｇである。
いくつかの実施形態において、キャッピング試薬としては、等モル量の酢酸無水物とＮ－メチルイミダゾールを用いる。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤はアセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量は１０～５０Ｌ／ｍｏｌ、いくつかの実施形態では５～３０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、エステル化縮合又はアミド化縮合に使用できる任意の触媒、例えばアルカリ複素環化合物から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、４－ジメチルアミノピリジンである。前記触媒と式（３２１）に示される化合物との質量比は０．００１：１～１：１であり、いくつかの実施形態では０．０１：１～０．１：１である。
いくつかの実施形態において、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、有機溶剤で十分に洗浄し、濾過し、未反応の反応物、過剰なキャッピング試薬及び他の不純物を除去することにより、式（３２１）の化合物を得ることができる。前記有機溶剤は、アセトニトリル、ジクロロメタン、メタノールから選択され、いくつかの実施形態において、アセトニトリルである。
いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される複合分子の調製方法は、有機溶剤において、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３１３）に示される化合物をホスホルジアミダイトと接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能が式（Ｃ３）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
いくつかの実施形態において、カップリング反応条件としては、温度は０～５０℃であってもよく、例えば１５～３５℃である。式（３１３）の化合物とホスホルジアミダイトとのモル比は１：１～１：５０であってもよく、例えば１：５～１：１５であり、式（３１３）の化合物とカップリング試薬とのモル比は１：１～１：１００であってもよく、例えば１：５０～１：８０である。反応時間は２００～３０００秒であってもよく、例えば５００～１５００秒である。前記ホスホルジアミダイトは、例えばビス（ジイソプロピルアミノ）（２－シアノエトキシ）ホスフィンを用いてもよく、市販品を購入してもよく、又は本分野で公知の方法により合成されてもよい。カップリング試薬は、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾール、５－ベンジルチオ１Ｈ－テトラゾールから選択される１種又は複数種であり、例えば、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、例えば無水アセトニトリルである。いくつかの実施形態において、式（３１３）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、例えば、５～２０Ｌ／ｍｏｌであってもよい。当該カップリング反応を行うことにより、式（３１３）の化合物におけるヒドロキシ基とホスホルジアミダイトを反応させてホスホルアミダイト基を形成する。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、カップリング反応条件下で、有機溶剤において、カップリング試薬の存在下で、単離して得られた生成物を、さらにヒドロキシ基含有固相担体と接触させる工程をさらに含む。その後、キャッピング反応、酸化反応を行い、単離して式（３２１）の化合物を得る。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ３’）に示される構造を有する式（３２１）の化合物が得られる。
いくつかの実施形態において、前記固相担体は、本分野で公知の核酸固相合成に使用できる固相担体であり、例えば、脱保護反応された市販の汎用の固相担体（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ３００ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、構造が式Ｂ８０に示される）であってもよい。
Figure 0007507495000063
脱保護反応は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、脱保護条件としては、温度は０～５０℃、例えば１５～３５℃であり、反応時間は３０～３００秒、例えば５０～１５０秒である。脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態において、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固定相における－ＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）保護基とのモル比が２：１～１００：１であり、例えば３：１～５０：１である。前記脱保護を行うことにより、前記固相担体の表面に反応活性を有する遊離ヒドロキシ基が得られ、次のカップリング反応を行いやすくする。
カップリング反応条件及びカップリング試薬の選択は、以上のとおりである。当該カップリング反応を行うことにより、脱保護反応で形成された遊離ヒドロキシ基とホスホルアミダイト基を反応させて亜リン酸エステル結合を形成する。
いくつかの実施形態において、キャッピング反応条件としては、温度は０～５０℃、例えば１５～３５℃であり、反応時間は５～５００秒、例えば１０～１００秒であり、前記キャッピング反応をキャッピング試薬の存在下で行う。キャッピング試薬の選択と用量は、以上のとおりである。
酸化反応条件としては、温度は０～５０℃、例えば１５～３５℃であってもよく、反応時間は１～１００秒、例えば５～５０秒であってもよく、酸化試薬は、例えばヨウ素であってもよい（いくつかの実施形態ではヨウ素水として提供する）。いくつかの実施形態では、酸化試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比は１：１～１００：１であり、例えば、５：１～５０：１であってもよい。いくつかの実施形態では、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１～１：１：３の混合溶剤で行われる。
いくつかの実施形態において、Ｒ６は、式Ｂ７又はＢ８の基の１つである。
Figure 0007507495000064
 式中、ｑ２の定義は、前述したとおりである。
この場合、式（３１３）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応条件下及びアミド化反応縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下で、式（３１４）に示される化合物を式（Ａ－１）に示される化合物又は式（Ａ－２）の化合物と接触させ、その後、単離する、という調製方法により得ることができる。
Figure 0007507495000065
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１、ｑ２及びＲｋそれぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
前記アミド化反応条件としては、反応温度は０～１００℃であり、反応時間は１～４８時間であってもよく、いくつかの実施形態では、前記アミド化反応条件としては、反応温度が１０～４０℃であり、反応時間が２～１６時間である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アルコール類溶剤、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記アルコール類溶剤は、いくつかの実施形態において、メタノール、エタノール、プロパノールの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、エタノールである。前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランである。前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルである。前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１４）の化合物に対して、有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、更なる実施形態において３～２０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン、４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩（４－（４，６－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉａｚｉｎ－２－ｙｌ）－４－ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）又はＯ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エステルであり、更なる実施形態において、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オンである。前記アミド化反応縮合剤と式（３１４）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２．５：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、更なる実施形態において、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミン類有機塩基と式（３１４）に示される化合物とのモル比が３：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、５：１～１０：１である。
いくつかの実施形態において、式（Ａ－１）及び式（Ａ－２）の化合物は、任意の適当な方法により調製されてもよい。例えば、ＲｋがＤＭＴｒ基である場合、グリセリン酸カルシウムとＤＭＴｒＣｌを反応させて式（Ａ－１）の化合物を調製することができる。同様に、３－アミノ－１，２－プロパンジオールと環状酸無水物を接触させた後、ＤＭＴｒＣｌと反応させて式（Ａ－２）の化合物を調製することができ、前記環状酸無水物は、炭素原子数４～１３、いくつかの実施形態において４～８の環状酸無水物であってもよい。当業者であれば容易に理解できるように、前記環状酸無水物の選択は、（Ａ－２）の化合物におけるｑ２の異なる値に対応しており、例えば、前記環状酸無水物がコハク酸無水物である場合、ｑ２＝１であり、前記環状酸無水物がグルタル酸無水物である場合、ｑ２＝２であり、類推してもよい。
いくつかの変形において、式（３１４）に示される化合物を、前記環状酸無水物、３－アミノ－１，２－プロパンジオール及びＤＭＴｒＣｌと順に反応させることにより、式（３１３）の化合物を調製することもできる。当業者であれば容易に理解できるように、これらの変形は、式（３１３）の化合物の構造と機能に影響を与えることがなく、かつ、当業者が上記方法により容易に実現するものである。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１３）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１３）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５～１：１：１：０．６で勾配溶出すること、及び、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出することという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３１３）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３１４）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下で、縮合反応条件下で、式（３２０）に示される化合物を式（３１６）に示される化合物と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
Figure 0007507495000066
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
式（３１６）の化合物としては、例えば、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１４，１３６，１６９５８－１６９６１に開示された化合物を用いてもよく、或いは、式（３１６）の化合物は、当業者が各種の方法により調製することができ、例えば、米国特許ＵＳ ８，１０６，０２２ Ｂ２の実施例１に開示された方法を参照していくつかの式（３１６）の化合物を調製することができ、引用により上記文献の全ての内容が全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記縮合反応条件としては、反応温度は０～１００℃であり、反応時間は０．１～２４時間であり、いくつかの実施形態では、反応温度が１０～４０℃であり、反応時間が０．５～１６時間である。
所望の生成物である式（３１４）の化合物の構造を考慮すると、前記式（３１６）に示される化合物と前記式（３２０）に示される化合物とのモル比は、式（３２０）におけるｎ１とｎ３の和に基づいて決定されるべきである。いくつかの実施形態において、例えば、ｎ１＋ｎ３＝３の場合、反応が完全であり、過剰ではないことを確保するために、式（３１６）に示される化合物と式（３２０）に示される化合物とのモル比が３：１～３．５：１であってもよく、いくつかの実施形態において、３．０１：１～３．１５：１である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種であり、前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３２０）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量は３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル、４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩又は１－ヒドロキシベンゾトリアゾールの１種又は複数種であり、更なる実施形態において、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステルと１－ヒドロキシベンゾトリアゾールの混合物であり、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステルと１－ヒドロキシベンゾトリアゾールが等モル量で使用される。前記全アミド化反応縮合剤と式（３１６）に示される化合物とのモル比は１：１～３：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１．０５：１～１．５：１である。
前記第３級アミン類有機塩基は、Ｎ－メチルモルホリン、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであってもよく、いくつかの実施形態において、Ｎ－メチルモルホリンであり、前記第３級アミン類有機塩基と式（３１６）に示される化合物とのモル比は２：１～１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２：１～５：１である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１４）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１４）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５～１００：７で勾配溶出すること、及び、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出することという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３１４）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
式（３２０）の化合物は、市販品として購入し、又は、当業者により既知の方法を用いて得ることができる。例えば、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３＝３、ｎ１＝１、ｎ３＝２であり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５がいずれもＨである場合、式（３２０）の化合物は、アルファ・エイサー社から市販品として購入することができる。
本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、薬学的に許容できる他の添加剤と併用してもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であってもよく、詳細は、上述した本開示の薬物組成物に関する記載を参照のこと。
＜本開示のｓｉＲＮＡ、当該ｓｉＲＮＡを含む薬物組成物及び複合体の使用＞
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の、脂質異常の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む脂質異常の予防及び／又は治療方法を提供する。
本開示のｓｉＲＮＡ活性成分を、それを必要とする被験体に投与することにより、ＲＮＡ干渉機構により脂質異常を予防及び／又は治療する目的を達成することができる。したがって、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体は、脂質異常の予防及び／又は治療に用いられ、又は脂質異常の予防及び／又は治療のための薬物の調製に用いることができる。
前記脂質異常とは、肝細胞においてＡＰＯＣ３遺伝子の過剰発現による脂質異常を指し、通常、血中トリグリセリド、コレステロール等の脂質及び／又はリポタンパクのいずれか１つ又は全てのレベルの向上として表され、レベルの高い脂質は、高血圧、心血管疾患、糖尿病及び他の病理学的疾患に高度に関連する。高トリグリセリド血症は、アテローム性動脈硬化に関連し、膵炎にもつながる。本開示に記載された脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化を含むが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる用語「薬剤投与／投与」とは、本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を少なくとも一部、所望の部位に局在化して所望の効果を生じさせる方法又は経路により、本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を被験体の体内に入れることを指す。本開示の方法に適した投与経路は、局所投与と全身投与を含む。一般的には、局所投与により、被験体全身よりも多くのｓｉＲＮＡ複合体が特定の部位に送達されるが、全身投与により、本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体が被験体のほぼ全身に送達される。本開示が脂質異常の予防及び／又は治療手段を提供することを意図することを考慮すると、いくつかの実施形態において、薬物を肝臓に送達することができる投与方法である。
本分野で既知の任意の適切な経路で被験体に投与することができ、前記経路としては、経口投与又は胃腸外経路、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気管内投与（エアロゾル）、肺部投与、鼻部投与、直腸投与及び局所投与（口腔内投与と舌下投与を含む）を含むが、これらのみに限定されない。投与頻度は、１日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、四半期、半年又は１年に１回又は複数回であってもよい。
本開示に記載されたｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体の用量は、本分野における通常の用量であってもよく、前記用量は、各種のパラメーター、特に被験体の年齢、体重及び性別により決定してもよい。細胞培養又は実験動物で標準薬学的手順により毒性と治療効果を測定し、例えば、ＬＤ５０（５０％の群体を死亡させる用量）及びＥＤ５０（定量的反応において、５０％の最大反応強度を引き起こすことができる用量を指し、定性的反応において、５０％の実験対象に陽性反応が発生する場合の用量を指す）を測定してもよい。細胞培養分析及び動物研究により得られたデータに基づいて、ヒト用量の範囲を得ることができる。
本開示に記載されたｓｉＲＮＡ、薬物組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を投与する場合、例えば、雄性又は雌性、６～１２週齢、体重１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊ又は３０～４５ｇのｏｂ／ｏｂマウスに対して、ｓｉＲＮＡの量として、（ｉ）ｓｉＲＮＡ複合体について、そのｓｉＲＮＡ用量は０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、更なる実施形態では０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、より更なる実施形態では０．０５～２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、いくつかの実施形態においては０．１～１５ｍｇ／ｋｇ体重であり、さらにいくつかの実施形態においては０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、（ｉｉ）ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成物について、そのｓｉＲＮＡ用量は０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、更なる実施形態では０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、より更なる実施形態では０．０５～５ｍｇ／ｋｇ体重であり、また更なる実施形態では０．１～３ｍｇ／ｋｇ体重である。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を肝細胞と接触させ、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を前記肝細胞に導入し、ＲＮＡ干渉機構により肝細胞におけるＡＰＯＣ３遺伝子の発現を抑制する目的を達成することを含む、前記肝細胞におけるＡＰＯＣ３遺伝子の発現の抑制方法を提供する。前記肝細胞は、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７等の肝がん細胞系又は単離した初代肝細胞から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、前記細胞は、Ｈｕｈ７肝がん細胞である。
本開示により提供される方法により細胞におけるＡＰＯＣ３遺伝子の発現を抑制する。提供される修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡ用量は、一般的に、標的遺伝子の発現を低減でき、標的細胞表面では１ｐＭ～１μＭ、０．０１ｎＭ～１００ｎＭ、０．０５ｎＭ～５０ｎＭ、又は０．０５ｎＭ～約５ｎＭの細胞外濃度となる量である。当該局所濃度を達成するのに必要な量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞又は組織との間の細胞層の数、送達するのが局所か全身か等を含む、各種の因子により変化する。送達部位における濃度は、標的細胞又は組織の表面における濃度よりも顕著に高くてもよい。
＜キット＞
本開示は、本開示の修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体の少なくとも１種の有効量を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、容器で修飾ｓｉＲＮＡを提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、薬学的に許容できる賦形剤を提供する容器を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットには、他の成分、例えば、安定化剤又は防腐剤等が含まれてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、本明細書に記載された修飾ｓｉＲＮＡを提供する容器とは別の容器で少なくとも１種の他の治療剤を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットは、修飾ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤又は他の成分（存在する場合）を混合するための説明書を含んでもよい。
本開示のキットにおいて、前記修飾ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体及び／又は複合体、及び／又は薬学的に許容できる添加剤は、任意の形式、例えば、液体形式、乾燥形式又は凍結乾燥形式として提供されてもよい。いくつかの実施形態において、前記修飾ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記薬物組成物、及び／又は複合体及び薬学的に許容できる任意の添加剤は、基本的にクリーン及び／又は無菌である。いくつかの実施形態において、本開示のキットで無菌水を提供することができる。
以下に実施例により本開示をさらに説明するが、本開示は、これによって何ら制限されない。
特に説明がない限り、以下の実施例で用いられる試薬、培地は、いずれも市販品であり、用いられる核酸電気泳動、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ等の操作は、いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載された方法を参照して行われる。
Ｈｕｈ７細胞は、中国科学院幹細胞バンクから購入され、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）で細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
本開示により合成されたＡＰＯＣ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ複合体又は陰性対照であるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ複合体で細胞をトランスフェクションした場合、トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、具体的な操作については、メーカーにより提供される説明書を参照のこと。
別に説明がない限り、以下で提供される試薬割合は、いずれも体積比（ｖ／ｖ）として計算される。
用いられる動物モデルは以下のとおりである。
ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス：Ｂ６、ＣＢＡ－Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅｓ／Ｊ、米国Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入される。
実験データは、いずれも
Figure 0007507495000067
で表され、データ分析では、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ５．０統計分析ソフトウェアを採用した。
調製例１：複合体１～１１の調製
本調製例で、複合体１～１１を合成し、これらの複合体は、Ｌ－９複合分子がそれぞれ表７に示されるｓｉＲＮＡと複合した後に形成された複合体であった。
（１－１）Ｌ－１０化合物の合成
以下の方法に従い、Ｌ－１０化合物を合成した。
Figure 0007507495000068
（１－１－１）複合末端セグメントＧＡＬ－５の合成
Figure 0007507495000069
（１－１－１ａ）ＧＡＬ－２の合成
１００．０ｇのＧＡＬ－１（Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン塩酸塩、ＣＡＳ番号：１７７２－０３－８、寧波弘翔生化公司から購入、４６３．８ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で５４０ｍｌの酢酸無水物（Ｅｎｏｘ社から購入、５５６５．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌反応した。反応液を１０Ｌの氷水に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを２Ｌの氷水で洗浄した後、完全に溶解するまでアセトニトリル／トルエン混合溶剤（アセトニトリル：トルエンの体積比＝１：１）を加え、溶剤を蒸発乾固し、１３０．０ｇの白色固形製品ＧＡＬ－２を得た。
（１－１－１ｂ）ＧＡＬ－３の合成
工程（１－１－１ａ）で得られたＧＡＬ－２（３５．１ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を２１３ｍｌの無水１，２－ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴下で、窒素保護条件で、２４．０ｇのＴＭＳＯＴｆ（ＣＡＳ番号：２７６０７－７７－８、マックリン社から購入、１０８．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。
反応液に４００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、１Ｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、均一に攪拌し、有機相を分離し、水相をジクロロエタンにより１回あたり３００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、２６．９ｇの淡黄色の粘稠な水飴状製品ＧＡＬ－３を得た。
（１－１－１ｃ）ＧＡＬ－４の合成
工程（１－１－１ｂ）で得られたＧＡＬ－３（２６．９ｇ、８１．７ｍｍｏｌ）を１３６ｍｌの無水１，２－ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した４Å分子篩粉３０ｇを加え、９．０ｇの５－ヘキセン－１－オール（ＣＡＳ番号：８２１－４１－０、Ａｄａｍａｓ－ｂｅｔａ社から購入、８９．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌し、氷浴下で窒素保護下で９．０８ｇのＴＭＳＯＴｆ（４０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌反応させた。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に３００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて１０分間攪拌し洗浄し、有機相を分離し、水相を３００ｍｌのジクロロエタンで１回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、４１．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ－４を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
（１－１－１ｄ）ＧＡＬ－５の合成
工程（１－１－１ｃ）に記載された方法により得られたＧＡＬ－４（１４．９ｇ、３４．７ｍｍｏｌ）を７７ｍｌのジクロロメタンと７７ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ１０３ｍｌの脱イオン水及び２９．７ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（ＣＡＳ番号：７７９０－２８－５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、１３８．８ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴下で１０分間攪拌し、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（ＣＡＳ番号：１４８９８－６７－０、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２３８ｍｇ、１．１４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。反応液に３００ｍｌの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを約７．５に調整し、有機相を分離して捨て、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相を捨てた。水相を固形クエン酸でｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．８５ｇの白色泡状固形製品ＧＡＬ－５を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ １２．０１ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．８３ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．９６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．２， ３．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０７－３．９５ （ｍ， ３Ｈ）， ３．９２－３．８５ （ｍ， １Ｈ）， ３．７４－３．６７ （ｍ， １Ｈ）， ３．４８－３．３９ （ｍ， １Ｈ）， ２．２０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１１ （ｓ， ３Ｈ）， ２．００ （ｓ， ３Ｈ）， １．９０ （ｓ， ３Ｈ）， １．７７ （ｓ， ３Ｈ）， １．５５－１．４５ （ｍ， ４Ｈ）．
（１－１－２）Ｌ－８の合成
Figure 0007507495000070
 Ｊ－０（９．８８６ｇ、５２．５ｍｍｏｌ、アルファ・エイサー社から購入）と工程（１－１－１）で得られたＧＡＬ－５（７２．８１９ｇ、１６２．７５ｍｍｏｌ、複数のロットの製品を組み合わせた）を５２５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、４４．７８２ｇ、３４６．５０ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル（ＰｙＢＯＰ、９０．１５８ｇ、１７３．２５ｍｍｏｌ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、２３．４１０ｇ、１７３．２５ｍｍｏｌ）を加え、室温で４ｈ反応させ、２０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム及び２００ｍｌの飽和食塩水を加えて洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。精製には、２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：２５～１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して３８．８ｇの純粋なＬ－８を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ７．８４ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．２７－７．２３ （ｍ， １Ｈ）， ７．１３－７．１８ （ｍ， １Ｈ）， ５．２２ （ｄ， Ｊ ＝ ３．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．９７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．３， ３．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．４８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．０９－３．９８ （ｍ， ９Ｈ）， ３．８８ （ｄｄ， Ｊ ＝ １９．３， ９．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， ３．７５－３．６６ （ｍ， ３Ｈ）， ３．４４－３．３８ （ｍ， ３Ｈ）， ３．１７－３．３０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．１０－２．９７ （ｍ， ４Ｈ）， ２．３５－２．２０ （ｍ， ６Ｈ）， ２．１５－２．０８ （ｍ， ９Ｈ）， ２．０７－１．９８ （ｍ， １３Ｈ）， １．９４－１．８７ （ｍ， ９Ｈ）， １．８１－１．７４ （ｍ， ９Ｈ）， １．６５－１．４２ （ｍ， １８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ７Ｏ３０，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４７７．５９、実測値：１４７７．２３。
（１－１－３）
（１－１－３ａ）Ａ－１の合成
Figure 0007507495000071
 ＤＭＴｒＣｌ（４，４’－ビスメトキシトリチルクロリド、１０１．６５ｇ、３００ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、ＤＬ－グリセリン酸カルシウム水和物（２８．６３ｇ、１００ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で２０ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケーキを２００ｍｌのＤＣＭでリンスし、濾液を乾燥まで減圧濃縮し、残りを５００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩（ｐＨ＝７～８）で１回あたり２００ｍｌで２回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．３５～１：１：１：０．５５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、６００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、２００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で１回洗浄し、水相を２００ｍｌのジクロロメタンで１回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩減圧し、５０．７ｇの白色固形製品Ａ－１を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．４６ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ６．５， ２．３， １．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４０－７．２８ （ｍ， ７Ｈ）， ６．８９－６．８１ （ｍ， ４Ｈ）， ４．８４ （ｄ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３６－４．２４ （ｍ， １Ｈ）， ４．２９ （ｓ， ６Ｈ）， ３．９２ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．４， ７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．３， ７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．５２ （ｑ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， ６Ｈ）， １．０３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ２３Ｏ６，［Ｍ－Ｈ］－、理論値：４０７．１５、実測値：４０６．９２。
（１－１－３ｂ）Ｌ－７の合成
Figure 0007507495000072
 工程（１－１－２）で得られたＬ－８（４０ｇ、２７．０９ｍｍｏｌ、複数のロットの製品を組み合わせた）と工程（１－１－３ａ）で得られたＡ－１（４１．４１８ｇ、８１．２７ｍｍｏｌ）とを混合し、２７１ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）（２４．３１８ｇ、８１．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（２１．００７ｇ、１６２．５４ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１．５ｈ攪拌反応させ、８００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで３回抽出し、１５０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相を５０ｍｌのジクロロメタンで１回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、粗製品を得た。カラム精製には、２ｋｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２００ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５～１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して４０．４ｇの純粋なＬ－７を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ７．９０－７．７８ （ｍ， ４Ｈ）， ７．７５－７．６４ （ｍ， １Ｈ）， ７．３８－７．１８ （ｍ， ９Ｈ）， ６．９１－６．８３ （ｍ， ４Ｈ）， ５．２５－５．１０ （ｍ， ４Ｈ）， ４．９７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．２， ３．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．４８－４．３０ （ｍ， ４Ｈ）， ４．０２ （ｓ， ９Ｈ）， ３．９３－３．８４ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７６－３．６６ （ｍ， ９Ｈ）， ３．４５－３．３５ （ｍ， ３Ｈ）， ３．２４－２．９８ （ｍ， １０Ｈ）， ２．３０－２．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１１－１．８８ （ｍ， ３１Ｈ）， １．８０－１．４０ （ｍ， ２８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ９０Ｈ１２８Ｎ７Ｏ３５，［Ｍ－ＤＭＴｒ］＋、理論値：１５６４．６５、実測値：１５６４．８８。
（１－１－４）Ｌ－９の合成
Figure 0007507495000073
 工程（１－１－３ｂ）で得られたＬ－７（４０ｇ、２１．４２４７ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（４．２８８ｇ、４２．８４９４ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、５．２３５ｇ、４２．８４９４ｍｍｏｌ）を混合して２１５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１３．８４５ｇ、１０７．１２３５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌し、８００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、１ｋｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して３１．０ｇの純粋なＬ－９複合分子を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ８．５８ （ｄ， Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９４－７．８２ （ｍ， ３Ｈ）， ７．４１－７．２９ （ｍ， ５Ｈ）， ７．２２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， ５Ｈ）， ６．８９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ， ４Ｈ）， ５．４９－５．３７ （ｍ， １Ｈ）， ５．２１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．０ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．９７ （ｄ， Ｊ ＝ １１．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．４９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．０２ （ｓ， ９Ｈ）， ３．８８ （ｄｄ， Ｊ ＝ １９．４， ９．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ３．７７－３．６５ （ｍ， ９Ｈ）， ３．５０－３．３９ （ｍ， ６Ｈ）， ３．１１－２．９０ （ｍ， ５Ｈ）， ２．６１－２．５４ （ｍ， ４Ｈ）， ２．４７－２．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２６－２．１７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１５－１．９５ （ｍ， ２２Ｈ）， １．９２－１．８４ （ｍ， ９Ｈ）， １．８０－１．７０ （ｍ， １０Ｈ）， １．６５－１．３５ （ｍ， １７Ｈ）， １．３１－１．１９ （ｍ， ４Ｈ）， ０．９６ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ９４Ｈ１３２Ｎ７Ｏ３８，［Ｍ－ＤＭＴｒ］＋、理論値：１６６４．７２、実測値：１６６５．０３。
（１－１－５）Ｌ－１０化合物の合成
Figure 0007507495000074
 この工程において、Ｌ－９複合分子を固相担体に結合することにより、Ｌ－１０化合物を調製した。
工程（１－１－４）で得られたＬ－９複合分子（２２．７５１ｇ、１１ｍｍｏｌ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル（ＨＢＴＵ、６．２５７ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、２．８４３ｇ、２２ｍｍｏｌ）を混合し、９００ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、室温で５分間攪拌し、反応液にアミノメチル樹脂（８８ｇ、１００～２００メッシュ、アミノ基担持量４００μｍｏｌ／ｇ、南開和成社から購入）を加え、２５℃でシェーカーで反応を行い、回転数１５０回転／分間、１８ｈ反応させた後で濾過し、ケーキをＤＣＭで１回あたり３００ｍｌで２回リンスし、アセトニトリルで１回あたり３００ｍｌで３回リンスし、真空油ポンプで１８ｈ乾燥させ、その後、表６に示す配合割合に従い原料（ＣａｐＡ、ＣａｐＢ、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及びアセトニトリル）を加えてキャッピング反応を行った。２５℃でシェーカーに放置し、回転数１５０回転／分間で５ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケーキをアセトニトリルで１回あたり３００ｍｌで３回リンスし、乾燥まで溶剤を減圧蒸発させ、真空油ポンプで一晩減圧乾燥させ、１０２ｇ、担持量９０．８μｍｏｌ／ｇのＬ－１０化合物（即ち、固相担体に結合されたＬ－９複合分子）を得た。
Figure 0007507495000075
 ここで、ＣａｐＡとＣａｐＢは、キャッピング試薬溶液であり、ＣａｐＡは、２０体積％のＮ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液であり、ピリジンとアセトニトリルとの体積比が３：５であり、ＣａｐＢは、２０体積％酢酸無水物のアセトニトリル溶液であった。
（１－２）複合体１～１１のセンス鎖の合成
固相ホスホルアミダイト法により、上記工程で調製されたＬ－１０化合物を出発として循環させ、複合体１～１１のセンス鎖のヌクレオチドの並び順に従い３’－５’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を行った。２個のヌクレオチド間がリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行った。２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、硫化の４つの反応を行った。合成条件は、以下のように規定された。
ヌクレオシドモノマーを０．１Ｍ濃度のアセトニトリル溶液で提供し、各脱保護反応の条件が同じであり、即ち、温度が２５℃であり、反応時間が７０秒であり、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液（３％ｖ／ｖ）であり、ジクロロ酢酸と固相担体における４，４’－ジメトキシトリチル保護基とのモル比が５：１であった。
各カップリング反応条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１０であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：６５であり、反応時間が６００秒であり、カップリング試薬は、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（５－（Ｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）－１Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｅ、ＥＴＴ）の０．５Ｍアセトニトリル溶液であった。
各キャッピング条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒であった。キャッピング試薬溶液は、モル比が１：１であるＣａｐＡとＣａｐＢの混合溶液であり、キャッピング試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、酢酸無水物：Ｎ－メチルイミダゾール：固相担体に結合される核酸配列＝１：１：１であった。
各酸化反応条件は同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒であり、酸化試薬が濃度０．０５Ｍのヨウ素水であった。ヨウ素と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が３０：１であった。反応をテトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１の混合溶剤で行った。
各硫化反応の条件は同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が３００秒であり、硫化試薬がキサンタンヒドリドであった。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１２０：１であった。反応をアセトニトリル：ピリジン＝１：１の混合溶剤で行った。
切断と脱保護条件は以下のとおりである。合成された担体が結合されたヌクレオチド配列を、濃度２５ｗｔ％のアンモニア水に加え、アンモニア水の用量が０．５ｍｌ／μｍｏｌであり、５５℃で１６ｈ反応させ、液体を除去し、残りを乾燥まで真空濃縮した。
精製と脱塩：分取用イオンクロマトグラフィー精製カラム（Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ）により、ＮａＣｌによる勾配溶出で、核酸の精製を完成した。具体的には、溶出剤Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出剤Ｂ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出勾配：溶出剤Ａ：溶出剤Ｂ＝１００：０～５０：５０で勾配溶出した。製品溶出液を回収してからあわせ、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、デキストランゲルカラムにより脱塩し、充填剤がデキストランゲルＧ２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）であり、脱イオン水で溶出した。
検出：イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）を用いて純度を検出し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により得られた生成物の分子量をそれぞれ分析した。実測値が理論値に一致しており、３’末端にＬ－９複合分子が複合された複合体１～１１のセンス鎖Ｓが合成されたことを示した。
（１－３）アンチセンス鎖の合成
（１－３Ａ）複合体１～５のアンチセンス鎖の調製
固相ホスホルアミダイト法により、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ｌｏａｄｅｄ ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を出発として循環させ、複合体１～５のアンチセンス鎖のヌクレオチドの並び順に従い３’－５’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合し、それぞれ複合体１～５のアンチセンス鎖ＡＳを合成した。固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、センス鎖の合成と同じであった。
検出：純度をイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）により検出し、分子量を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分析した。実測値が理論値に一致しており、目的配列を有するアンチセンス鎖ＡＳが合成されたことを示した。
ここで、ビニルリン酸エステルで修飾された２’－メトキシ修飾ウラシルヌクレオシドモノマー（ＶＰ－Ｕｍ）は、以下の方法に従い合成された。
Figure 0007507495000076
（１－３－１）ＶＰ－Ｕ－２の合成
以下の方法に従い、ＶＰ－Ｕ－２分子を合成した。
Figure 0007507495000077
 ２’－メトキシ修飾ウラシルヌクレオシド（２’－ＯＭｅ－Ｕ、５１．３０ｇ、９１．６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルクロロシラン（ＴＢＤＰＳＣｌ、５０．３５ｇ、１８３．２ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１２．４７ｇ、１８３．２ｍｍｏｌ）を混合して４５０ｍｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、室温で２０ｈ攪拌反応させた。ＤＭＦを留去し、６００ｍｌのジクロロメタンで溶解した後３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて洗浄し、水相をジクロロメタン（ＤＣＭ）で１回あたり３００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、５％シュウ酸で水相をｐＨ＜５になるまで洗浄し、乾燥まで溶剤を蒸発させた後ＶＰ－Ｕ－１粗製品を得、そのまま後のＶＰ－Ｕ－２の合成に用いた。
ＶＰ－Ｕ－１粗製品を１００ｍｌのジクロロメタンで溶解した後、氷浴を施して１０分間攪拌し、さらに、予め４℃の冷蔵庫で冷蔵された４５０ｍｌの２％ｐ－トルエンスルホン酸溶液（溶剤が、体積比３：７のメタノール－ジクロロメタン混合溶剤である）を加え、１０分間反応させた。さらに２００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて反応をクエンチングし、有機相に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝８になるまで洗浄した。水相をあわせ、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、さらに２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥まで溶剤を蒸発させた。２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．０５～１：１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて計４０．００ｇの純粋なＶＰ－Ｕ－２を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６４ （ｄｔｄ， Ｊ ＝ ５．１， ４．０， ２．２ Ｈｚ， ４Ｈ）， ７．４１－７．３０ （ｍ， ６Ｈ）， ６．７９ （ｄ， Ｊ ＝ ４．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．７３ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．９４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１２ （ｔｄ， Ｊ ＝ ４．６， ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．８， ４．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９６ （ｔ， Ｊ ＝ ４．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６８ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １１．８， ７．０， ４．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５７－３．４６ （ｍ， １Ｈ）， ３．３９ （ｓ， ３Ｈ）， １．０５ （ｓ， ８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２６Ｈ３３Ｎ２Ｏ６Ｓｉ，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４９７．２１、実測値：４９７．４５。
（１－３－２）ＶＰ－Ｕ－４の合成
Figure 0007507495000078
 ＶＰ－Ｕ－２（１９．８４ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、１６．４８ｇ、８０．０ｍｍｏｌ）、ピリジン（４．２０ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（６．６１ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）を混合して２００ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、室温で２０ｈ攪拌反応させた。別に、メチレンジホスホン酸テトラエチル（２１．４４ｇ、７４．４ｍｍｏｌ）を１２０ｍｌのＴＨＦに溶解させ、氷浴で降温させ、氷浴温度でｔ－ＢｕＯＫ（１１．３６ｇ、１０１．２ｍｍｏｌ）を加え、氷浴温度で１０ｍｉｎ反応させた後、室温まで昇温して０．５ｈ反応させ、その後、約１ｈかけて前述した反応液に加え、氷浴温度で１ｈ反応させた後、室温まで昇温して１８ｈ反応させた。水を加えて反応をクエンチングし、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出した。有機相をあわせ、２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄した後、乾燥まで溶剤を蒸発させた。２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル＝１：１～１：４で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて計１４．００ｇの純粋なＶＰ－Ｕ－４を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６４ （ｄｔｄ， Ｊ ＝ ５．１， ４．０， ２．２ Ｈｚ， ４Ｈ）， ７．４１－７．３０ （ｍ， ６Ｈ）， ６．８２－６．７１ （ｍ， ２Ｈ）， ５．９０ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ２５．９， １５．０， １．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．７３ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３６－４．２１ （ｍ， ３Ｈ）， ４．１８ （ｔ， Ｊ ＝ ４．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｄｄｑ， Ｊ ＝ ９．７， ８．５， ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３９ （ｓ， ３Ｈ）， １．３２ （ｔｄ， Ｊ ＝ ６．９， ０．７ Ｈｚ， ６Ｈ）， １．０５ （ｓ， ８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ３１Ｈ４２Ｎ２Ｏ８ＰＳｉ，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：６２９．２４、実測値：６２９．５１。
（１－３－３）ＶＰ－Ｕ－５の合成
Figure 0007507495000079
 ＶＰ－Ｕ－４（１４．００ｇ、２２．２９ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのテトラヒドロフランに溶解させ、トリエチルアミン三フッ化水素酸（１７．９６ｇ、１１１．４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌して完全に反応させた。そのまま乾燥まで溶剤を蒸発させ、５０ｍｌのジクロロメタンで溶解した後で蒸発乾固する操作を２回繰り返し、粗製品を得た。２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．０５～１：１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて計６．７０ｇの純粋なＶＰ－Ｕ－５を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １５．０， ６．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．９９－５．８２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．７３ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２７ （ｄ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ５．３， ４．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２９ （ｄｄｑ， Ｊ ＝ ９．８， ８．６， ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．１７ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ６．２， ５．２， １．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１２－３．９８ （ｍ， ３Ｈ）， ３．３９ （ｓ， ２Ｈ）， １．３２ （ｔｄ， Ｊ ＝ ６．９， ０．６ Ｈｚ， ６Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ１５Ｈ２４Ｎ２Ｏ８Ｐ，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：３９１．１３、実測値：３９１．３８。
（１－３－４）ＶＰ－Ｕ－６の合成
Figure 0007507495000080
 アルゴン保護条件で１０ｍｌの無水ジクロロメタンにＶＰ－Ｕ－５（３９１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ピリジントリフルオロアセテート（０．２３２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルイミダゾール（０．０９９ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ビス（ジイソプロピルアミノ）（２－シアノエトキシ）ホスフィン（０．４５２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間攪拌反応させた。乾燥まで溶剤を留去し、カラムクロマトグラフィーにより精製し（２００～３００メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン：アセトニトリル（０．５ｗｔ％トリエチルアミンを含む）＝３：１～１：３で勾配溶出した）、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計５０８ｍｇの目的生成物ＶＰ－Ｕ－６を得た。３１Ｐ ＮＭＲ （１６１ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ １５０．３４， １５０．２９， １７．０７， １５．５０． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ４１Ｎ４Ｏ９Ｐ２，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：５９１．２３、実測値：５９１．５５。ＶＰ－Ｕ－６が目的生成物ＶＰ－Ｕｍであり、ヌクレオシドモノマーとしてＲＮＡ鎖の合成に関与することを示した。
（１－３Ｂ）複合体６、８～１１のアンチセンス鎖の調製
表７に示される核酸配列に従って対応するヌクレオシドモノマーを一つずつ結合することを除いて、複合体６及び８～１１のアンチセンス鎖と複合体４のアンチセンス鎖の合成方法の区別は、５’－末端の１番目のヌクレオチド修飾が異なることのみにあった。固相ホスホルアミダイト法によりアンチセンス鎖を調製する場合、最後に結合されたヌクレオシドモノマーが２’－メトキシ修飾グアニンヌクレオシドモノマー（Ｇｍ）であり、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行ってＣＰＲ－Ｉモノマー（蘇州吉瑪、番号Ｃａｔ＃１３－２６０１－ＸＸ）をアンチセンス鎖の５’末端に結合し、５’－リン酸エステル修飾を形成した。
Figure 0007507495000081
 合成において用いられた汎用の固相担体、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、センス鎖の合成と同じであった。
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）により純度を検出し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を分析した。実測値が理論値に一致しており、目的配列を有するアンチセンス鎖ＡＳが合成されたことを示した。
（１－３Ｃ）複合体７のアンチセンス鎖の調製
ＣＰＲ－Ｉモノマーを結合する場合、上記酸化反応条件の代わりに硫化反応条件を用いたこと以外、（１－３Ｂ）と同じ合成プロセスを採用した。５’－チオリン酸エステル修飾を有する複合体７のアンチセンス鎖を調製した。
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）により純度を検出し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を分析した。実測値が理論値に一致しており、目的配列を有するアンチセンス鎖ＡＳが合成されたことを示した。
（１－４）複合体１～１１の合成
複合体１に対して、Ｓ鎖とＡＳ鎖をそれぞれ注射用水に溶解させ、４０ｍｇ／ｍＬの溶液を得、等モル比で混合し、５０℃で１５ｍｉｎ加熱し、室温で冷却した後、アニールを行った生成物を得、凍結乾燥させて、凍結乾燥粉末を得た。超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超純水装置で自作、抵抗率１８．２ＭΩ＊ｃｍ（２５℃））を用いて複合体を濃度が０．２ｍｇ／ｍＬになるまで希釈した後、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。実測値が理論値と一致しており、合成された複合体１が、Ｌ－９複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であることが示された。
複合体１のセンス鎖の代わりにそれぞれ上記調製された複合体２～１１のセンス鎖を用い、複合体１のアンチセンス鎖の代わりにそれぞれ上記調製された複合体２～１１のアンチセンス鎖を用いたこと以外、同じ方法で複合体２～１１を調製した。得られた複合体２～１１の分子量をそれぞれ検出し、実測値が理論値に一致しており、合成された複合体が、Ｌ－９複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であることが示された。複合体１～１１の構造は、式（４０３）に示される。
Figure 0007507495000082
Figure 0007507495000083
調製例２：比較複合体１及び比較複合体２の調製
本調製例で、比較複合体１及び比較複合体２を合成し、当該複合体に複合されたｓｉＲＮＡの配列が表７に示され、複合された複合分子が以下の（２－１）に合成された（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子であった。前記複合体は、それぞれＷＯ２０１６０８１４４４Ａ１における化合物ＡＤ－６５７０４及びＡＤ－６９５３５とは構造が同じである。
（２－１）（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子の合成
ＷＯ２０１４０２５８０５Ａ１の実施例１７に記載された方法により化合物３０、即ち、以上のようなリンカー－（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン－ＬＢ－及び標的基であるＮ－アセチルガラクトサミン分子（ここで、各ＬＡに１つのＮ－アセチルガラクトサミン分子が結合できるので、１つのリンカーに３個のＮ－アセチルガラクトサミン分子が結合できる）を含む複合分子（（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子とも呼ばれる）を合成し、合成の化学反応式と（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子の構造は、下式に示される。
Figure 0007507495000084
（２－２）固相担体に結合された（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子の調製
Ｌ－９複合分子の代わりに（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子を用い、固相担体に結合された（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子を得たこと以外、調製例１における工程（１－１－５）と同じ方法により、固相担体に結合された複合分子を調製した。
（２－３）比較複合体１及び比較複合体２の合成
１）工程（２－２）で得られた化合物を出発としてセンス鎖を合成し、２）固相ホスホルアミダイト法によりアンチセンス鎖を調製する場合、最後に結合されるヌクレオシドモノマーが２’－メトキシ修飾ウラシルヌクレオシドモノマー（Ｕｍ）であり、３）複合ｓｉＲＮＡがそれぞれ表７において番号（ＧａｌＮＡｃ）３－６５７０４及び（ＧａｌＮＡｃ）３－６９５３５に示される配列を有すること以外、調製例１における工程（１－２）、（１－３Ａ）、（１－４）と同じ方法により、比較複合体１及び比較複合体２を調製した。
液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。実測値が理論値に一致しており、合成された複合体は、構造が式（３０５）に示される目的設計の化合物であることが確認された。
実験例１：ｓｉＲＮＡ複合体の体外細胞系における活性抑制の検出
実験例１－１：ｓｉＲＮＡ複合体によるＨｕｈ７細胞系におけるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率
本実験例では、複合体１～５の体外Ｈｕｈ７細胞でのＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を考察した。
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００を用いて複合体１～５をヒト肝がん細胞株Ｈｕｈ７にトランスフェクションし、ｓｉＲＮＡ複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡの量として）がそれぞれ０．５ｎＭ、０．１２５ｎＭ及び０．０３１２５ｎＭであった。前記ｓｉＲＮＡ複合体が溶液として提供され、具体的には、実験を行う前に、ＤＥＰＣ化水を用いて、ｓｉＲＮＡ複合体を所望の濃度の溶液に溶解させた。ｓｉＲＮＡ複合体がトランスフェクションされていない細胞をブランク対照とした。各濃度につき２つの複製ウェルがあった。
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）によりそれぞれ各濃度の複合体１～５がトランスフェクションされたＨｕｈ７細胞におけるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの発現量を検出した。具体的な工程としては、トランスフェクションした細胞を２４時間培養した後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により細胞における全ＲＮＡを抽出し、それぞれ１μｇの全ＲＮＡをとり、逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、番号Ａ３５００）を用いてその説明書の操作方法により逆転写してｃＤＮＡを得た。２×Ｕｌｔｒａ ＳＹＢＲ Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｗｉｔｈ ＲＯＸ）（北京康為世紀生物科技有限公司、番号ＣＷ０９５６）キットを用い、ｃＤＮＡをテンプレートとして説明書の手順によりＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量を検出した。ＡＰＯＣ３及び内因性参照遺伝子であるＧＡＰＤＨの増幅のためのＰＣＲプライマーは、表８に示される。
Figure 0007507495000085
ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量は、ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量＝［（試験群ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの発現量／試験群ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量）／（対照群ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの発現量／対照群ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量）］×１００％という等式により算出された。
複合体によるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制率は、抑制率＝（１－ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量）×１００％という等式により算出された。各試験群は、それぞれ各濃度の複合体１～５で処理されたＨｕｈ７細胞であり、対照群は、複合体で処理されていないＨｕｈ７細胞であった。
図１は、トランスフェクションされていないＨｕｈ７と、Ｈｕｈ７細胞において異なる複合体を異なる最終濃度までトランスフェクションしたときのＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量（発現量については、ヒトＧＡＰＤＨを参照とし、ブランク対照を標準化する）のヒストグラムを示している。
図１から分かるように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、Ｈｕｈ７細胞系において高い抑制活性を有し、０．５ｎＭの複合体によるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制率は、いずれも６０％以上であった。本開示により提供される各ｓｉＲＮＡ複合体の各濃度での抑制活性は、いずれも比較複合体１よりも高かった。
実験例１－２：Ｈｕｈ７細胞系におけるｓｉＲＮＡ複合体のＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡに対するＩＣ５０の測定
本実験例では、Ｈｕｈ７細胞系における複合体６、８～１１のＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡに対するＩＣ５０値を測定した。
実験例１－１と同じ方法を用いて複合体６及び８～１１をトランスフェクションし、各群のＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量を検出した。異なる点は、複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡの濃度として計算された）を３ｎＭから０．００４ｎＭまで３倍ごとに希釈し、計７種の濃度としたことである。異なる濃度の複合体を用いて測定したＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量から、Ｇｒａｐｈｐａｄ ５．０ソフトウェアｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ） ｖｓ． ｒｅｓｐｏｎｓｅ－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ機能により用量－効果曲線をフィッティングし、用量－効果曲線から各複合体のＩＣ５０値を算出した。
Figure 0007507495000086
 式中：
Ｙは、残存ｍＲＮＡの発現レベルであり、
Ｘは、トランスフェクション複合体の濃度の対数値であり、
Ｂｏｔは、定常期の最低のＹ値であり、
Ｔｏｐは、定常期の最高のＹ値であり、
ＬｏｇＩＣ５０は、Ｙが最低と最高との間の半分にある場合のＸ値であり、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅは、曲線の傾きである。
複合体６及び８～１１の体外Ｈｕｈ７細胞におけるＩＣ５０がそれぞれ０．０１００２ｎＭ、０．００８１５９ｎＭ、０．０５３７５ｎＭ、０．０１９３３ｎＭ及び０．０１９４９ｎＭであったことを検出し、本開示のｓｉＲＮＡ複合体が体外において高い標的ｍＲＮＡ発現量抑制活性を有することを示した。
実験例２：本実験は、体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）における本開示のｓｉＲＮＡ複合体による血中脂質含有量の低下作用について考察した。
実験例２－１：本実験例では、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内において、複合体２、４及び５が血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量を低下させる作用について考察した。
血清ＴＧの含有量＞２ｍｍｏｌ／ＬのヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス（Ｂ６、ＣＢＡ－Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅｓ／Ｊ）を７匹／群で次のようにランダムに分けた。（１）生理食塩水対照群、（２）複合体２ ３ｍｇ／ｋｇ用量群、（３）複合体２ １ｍｇ／ｋｇ用量群、（４）複合体４ ３ｍｇ／ｋｇ用量群、（５）複合体４ １ｍｇ／ｋｇ用量群、（６）複合体５ ３ｍｇ／ｋｇ用量群、（７）複合体５ １ｍｇ／ｋｇ用量群。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、ｓｉＲＮＡ複合体はそれぞれ０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌ濃度の０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供され、具体的には、実験を行う前に、０．９％塩化ナトリウム水溶液を用いてｓｉＲＮＡ複合体を所望の濃度の溶液に溶解させ、生理食塩水及びｓｉＲＮＡ複合体の投与体積はいずれも５ｍＬ／ｋｇであった。
それぞれ薬剤投与前（０日目と記す）、及び薬剤投与後７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、６３、７７、９１、１１２、１３３、１４７、１６１、１７５、１８９日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＣＨＯ及びＴＧの含有量を検出した。
１回あたり約１００μＬで眼窩採血を行い、遠心して２０μＬ以上の血清を得、さらにＰＭ１Ｐ０００／３全自動血清生化学分析装置（ＳＡＢＡ）を用いて血清における総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量を検出した。
標準化された脂質レベル＝（薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の試験群における脂質の含有量）×１００％。
脂質レベルの抑制率＝（１－薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の試験群における脂質の含有量）×１００％。脂質は、総コレステロール又はトリグリセリドを指す。
図２Ａ～２Ｄは、生理食塩水および異なる用量の複合体２、４及び５を投与したヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスにおける血清総コレステロール（ＣＨＯ）レベル及びトリグリセリド（ＴＧ）レベルの経時的変化図を示す。試験群に対して、薬剤投与前を０日目（Ｄ０）と記し、各血清におけるＣＨＯレベル及びＴＧレベルをＤ０日の数値に対して標準化した。
図２Ａから分かるように、単回投与３ｍｇ／ｋｇ用量群の３つの複合体によるＴＧに対する抑制率は、７７日間と長期間にわたって７０～９０％に維持され、かつＴＧに対する抑制率が約５０％以下に維持された期間は１４７日間に達した。
図２Ｂから分かるように、単回投与後７日目に、１ｍｇ／ｋｇ用量群の３つの複合体によるＴＧに対する抑制率はいずれも約８０％に達し、かつ４９日間と長期間にわたって、５０％を上回るＴＧ含有量の低減効果が持続的に示された。
図２Ｃから分かるように、単回投与３ｍｇ／ｋｇ用量群の３つの複合体によるＣＨＯに対する抑制率は、７７日間と長期間にわたってほぼ常に５０％程度に維持された。
図２Ｄから分かるように、単回投与３５日後に、１ｍｇ／ｋｇ用量群の３つの複合体は、依然として少なくとも約５０％のＣＨＯ含有量の低減効果を示した。
図２Ａ～２Ｄの結果から明らかなように、薬剤投与後の異なる時点で、複合体２、４及び５は、マウス血清におけるＴＧ及びＣＨＯを明らかに低下させる効果を示した。本開示のｓｉＲＮＡ複合体が長期間にわたって、脂質レベルを安定的且つ効率よく低下させることができることを示した。
実験例２－２：本実験例では、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内において、複合体１が血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量を低下させる作用について考察した。
各試験群が６匹のマウスを含み、投与された複合体が複合体１及び比較複合体２であり、薬剤投与後１１２日目まで試験を行ったこと以外、実験例２－１と同じ方法で検出した。
図３Ａ～３Ｂは、生理食塩水および異なる用量の複合体１及び比較複合体２をヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスに投与した後、マウスの血清における総コレステロール（ＣＨＯ）レベル及びトリグリセリド（ＴＧ）レベルの経時的変化図を示す。試験群に対して、薬剤投与前を０日目（Ｄ０）と記し、各血清におけるＣＨＯレベル及びＴＧレベルをＤ０日の数値に対して標準化した。
図３Ａ及び３Ｂの結果から明らかなように、複合体１は、３ｍｇ／ｋｇ用量群か１ｍｇ／ｋｇ用量群かにかかわらず、いずれも１１２日間と長期間にわたってトランスジェニックマウスのＴＧ及びＣＨＯレベルを顕著に低下させることができ、かつその低下効果は比較複合体２より明らかに優れていた。単回薬剤投与して５６日間は、３ｍｇ／ｋｇ用量群か１ｍｇ／ｋｇ用量群かにかかわらず、複合体１によるＴＧ及びＣＨＯに対する抑制率がいずれも５０％以上であり、かつＴＧに対する抑制作用がより顕著であって、１１２日間と長期間にわたり、２つの用量作用でのＴＧレベルは常に５０％程度に維持された。
実験例２－３：本実験例は、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内において、複合体３が血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量を低下させる作用について考察した。
各試験群が６匹のマウスを含み、投与された複合体が複合体３であり、生理食塩水（ＮＳ）の代わりに１×ＰＢＳ緩衝液を用いて複合体３を所望の濃度の溶液に溶解させ、かつブランク対照試験で１×ＰＢＳ緩衝液が用いられ、薬剤投与後１１２日目まで試験を行ったこと以外、実験例２－１と同じ方法で検出した。
図４Ａ及び４Ｂは、ＰＢＳおよび異なる用量の複合体３をヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスに投与した後、マウスの血清おける総コレステロール（ＣＨＯ）レベル及びトリグリセリド（ＴＧ）レベルの経時的変化図を示す。試験群に対して、薬剤投与前を０日目（Ｄ０）と記し、各血清におけるＣＨＯレベル及びＴＧレベルをＤ０日の数値に対して標準化した。
図４Ａから分かるように、３ｍｇ／ｋｇ用量群については、単回薬剤投与後１４日目に、ＴＧに対する抑制率が９３．６％に達し、薬剤投与後９８日目でも、ＴＧに対する抑制率は６６．４％であった。１ｍｇ／ｋｇ用量群については、単回薬剤投与後１４日目に、ＴＧに対する抑制率が９３．３％に達し、薬剤投与後９８日目でも、ＴＧに対する抑制率は３７．７％であった。
図４Ｂから分かるように、３ｍｇ／ｋｇ用量群については、単回薬剤投与後７日目に、ＣＨＯに対する抑制率が６３．０％に達し、薬剤投与後９８日目でも、ＣＨＯに対する抑制率は４９．２％であった。１ｍｇ／ｋｇ用量群については、単回薬剤投与後７日目に、ＣＨＯに対する抑制率が５２．２％に達した。
図４Ａ及び４Ｂの結果から明らかなように、複合体３は、９８日間と長期間にわたり、トランスジェニックマウスにおけるＴＧ及びＣＨＯレベルを顕著に低下させることができ、かつその低下効果は明らかな用量依存効果を示した。
実験例２－４：本実験例では、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内において、異なる用量の複合体４が血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量を低下させる作用について考察した。
各試験群が８匹のマウスを含み、投与された複合体が複合体４であり、０．３、１、３ｍｇ／ｋｇの３つの用量群でそれぞれ投与され、投与体積を変化させず、薬剤投与後１３３日目まで試験を行ったこと以外、実験例２－１と同じ方法で検出した。
図５Ａ及び５Ｂは、生理食塩水および異なる用量の複合体４をヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスに投与した後、マウスの血清における総コレステロール（ＣＨＯ）レベル及びトリグリセリド（ＴＧ）レベルの経時的変化図を示す。試験群に対して、薬剤投与前を０日目（Ｄ０）と記し、各血清におけるＣＨＯレベル及びＴＧレベルをＤ０日の数値に対して標準化した。図５Ａ及び５Ｂの結果から分かるように、複合体４は、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスに対して３つの用量のいずれも顕著な脂質低下作用を有し、かつ用量依存性があり、３ｍｇ／ｋｇ用量群では、１３３日目でもＴＧに対する抑制率が５０％に達していた。
実験例２－５：本実験例では、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内において、複合体４、６、７が血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量を低下させる作用について考察した。
各試験群が６匹のマウスを含み、投与された複合体が複合体４、６、７及び比較複合体２であり、薬剤投与後１１２日目まで試験を行ったこと以外、実験例２－１と同じ方法で検出した。
図６Ａ～６Ｄは、生理食塩水および異なる用量の複合体４、６、７及び比較複合体２をヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスに投与した後、マウスの血清における総コレステロール（ＣＨＯ）レベル及びトリグリセリド（ＴＧ）レベルの経時的変化図を示す。試験群に対して、薬剤投与前を０日目（Ｄ０）と記し、各血清におけるＣＨＯレベル及びＴＧレベルをＤ０日の数値に対して標準化した。
図６Ａ～６Ｄの結果から分かるように、複合体４、６、７は、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスに対して２つの用量のいずれも顕著な脂質低下作用を有し、３ｍｇ／ｋｇ用量群では、薬剤投与後８４日間は、ＴＧに対する抑制率が常に５０％以上に維持され、ＣＨＯに対する抑制率が３０％以上に維持された。３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇでは、複合体４、６及び７によるＴＧに対する抑制作用は常に比較複合体２より強く、ＣＨＯに対する抑制も同様の傾向があることに注意すべきである。
実験例２－６：本実験例では、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内において、異なる用量の複合体８及び９が血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量を低下させる作用について考察した。
各群が８匹のマウスを含み、投与された複合体が複合体８及び９であり、０．１、０．３、１、３、９ｍｇ／ｋｇの５つの用量群でそれぞれ投与され、投与体積を変化させず、複合体溶液の濃度を相応に調整し、薬剤投与後１４７日目まで試験を行ったこと以外、実験例２－１と同じ方法で検出した。
図７Ａ～７Ｄは、生理食塩水および異なる用量の複合体８及び９をヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスに投与した後、マウスの血清における総コレステロール（ＣＨＯ）レベル及びトリグリセリド（ＴＧ）レベルの経時的変化図を示す。試験群に対して、薬剤投与前を０日目（Ｄ０）と記し、各血清におけるＣＨＯレベル及びＴＧレベルをＤ０日の数値に対して標準化した。
図７Ａ～７Ｄの結果から分かるように、複合体８及び９は、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスに対して５つの用量のいずれも顕著な脂質低下作用を有し、かつ用量依存性があった。
さらに、異なる用量で、異なる時点での上記複合体８及び９によるＴＧに対する抑制率に基づいて、異なる時点での複合体８及び９によるヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスにおけるＴＧレベル抑制のＥＤ５０値を測定した。
異なる用量の複合体８及び９を用いて異なる時点で測定された血清ＴＧレベルから、Ｇｒａｐｈｐａｄ ５．０ソフトウェアｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ） ｖｓ． ｒｅｓｐｏｎｓｅ－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ機能により用量－効果曲線をフィッティングし、用量－効果曲線から各複合体のＥＤ５０値を算出した。
Figure 0007507495000087
 式中：
Ｙは、測定された血清ＴＧレベル（Ｄ０日のＴＧレベルに対して標準化した）であり、
Ｘは、同じ時点でのトランスフェクション複合体の用量の対数値であり、
Ｂｏｔは、定常期の最低のＹ値であり、
Ｔｏｐは、定常期の最高のＹ値であり、
ＬｏｇＥＤ５０は、Ｙが最低と最高との間の半分にある場合のＸ値であり、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅは、曲線の傾きである。
計算により、複合体８及び９を単回投与した後、異なる時点でのＴＧ抑制のＥＤ５０値は、表９に示される。
Figure 0007507495000088
表９の結果から、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスに対して、複合体８を０．１６ｍｇ／ｋｇ又は複合体９を０．１１ｍｇ／ｋｇで単回皮下注射するだけで、投与後半月の時点でも半分のＴＧ含有量の低減が可能であるという治療効果を達成できること、本開示の複合体を１ｍｇ／ｋｇ未満で単回皮下注射するだけで、投与後１ヶ月の時点でも半分のＴＧ含有量の低減が可能であるという効果を達成できることを、予期し得る。
実験例３：本実験例では、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内における複合体４による肝臓組織中のＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制率について考察した。
実験前に、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス（Ｂ６、ＣＢＡ－Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅｓ／Ｊ）の血清におけるトリグリセリド含有量を検出し、血清におけるトリグリセリド含有量が２ｍｍｏｌ／Ｌより大きいトランスジェニックマウスを選択してランダムに分け、試験群ごとに５匹のマウスを含み、ブランク群（ＮＳを投与する）に４匹のマウスを含み、それぞれ各群のマウスに複合体４及び生理食塩水ＮＳを投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、ｓｉＲＮＡ複合体の投与量（ｓｉＲＮＡの量として）は１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇの２つの用量群であり、複合体はそれぞれ０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌ濃度の０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は５ｍＬ／ｋｇであった。薬剤投与１４日後にマウスを死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、その後、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）で全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して肝組織の全ＲＮＡを得た。
実験例１－１と同じ蛍光定量的リアルタイムＰＣＲ法により肝組織におけるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの発現量を検出した。当該蛍光定量的リアルタイムＰＣＲ法では、β－ａｃｔｉｎ遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＡＰＯＣ３に対するプライマー及びβ－アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれＡＰＯＣ３及びβ－アクチンの発現量を検出したことが異なる。
検出プライマーの配列は、表１０に示される。
Figure 0007507495000089
肝組織におけるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの発現量と複合体によるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡに対する抑制率の計算は実験例１－１と同じである。対照群は、本実験において生理食塩水（ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ、ＮＳ）が投与された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なる濃度のｓｉＲＮＡ複合体が投与された投与群マウスであった。
図８は、生理食塩水および異なる用量の複合体４をヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスに投与した後、マウス体内の肝臓組織におけるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量の散布図を示す。（発現量について、マウスのβ－ａｃｔｉｎを参照とし、ブランク対照ＮＳを標準化とする）
その結果、複合体４を０．１ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇで単回投与すると、トランスジェニックマウスにおけるヒトＡＰＯＣ３遺伝子に対して顕著な抑制作用を有することが示された。なお、１ｍｇ／ｋｇの複合体４によるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡに対する抑制率は８２．０％に達し、０．１ｍｇ／ｋｇの複合体４によるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡに対する抑制率は４０．４％であった。
以上、本開示のいくつかの実施形態を詳しく記載したが、本開示は、上記実施形態の具体的な細部に限定されず、本開示の技術的思想の範囲で、本開示の技術的解決手段に対して複数種の簡単な変形をすることができ、これらの簡単な変形は、いずれも本開示の保護範囲に属する。
このほかに説明すべきこととして、上記いくつかの実施形態に記載された各具体的な技術的特徴は、矛盾がない場合、任意の適切な方法により組み合わせることができ、不必要な重複を避けるために、本開示では各種の可能な組合せ方法を別途説明しない。
また、本開示の各種の異なる実施形態は任意に組み合わせることもでき、本開示の精神から逸脱しない限り、その組み合わせも同様に、本開示に開示された内容とみなすべきである。
＜引用による本明細書への組み込み＞
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許及び特許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。

Claims (29)

  1. 式（３０８）に示される構造を有するｓｉＲＮＡ複合体：
    （式中、ｎ１は、１～２から選択される整数であり、ｎ３は、０～１から選択される整数であり、ｎ１＋ｎ３＝２～３であり、ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２～１０から選択される整数であり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈ、メチル基又はエチル基であり、
    Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基であり、
    式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、
    ＮｕはｓｉＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｓｉＲＮＡのうちの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、ｉ）～ｖ）から選択される１組の配列であり、
    ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺａ１に対応するヌクレオチドＺａ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺａ２に対応するヌクレオチドＺａ４が含まれ、前記Ｚａ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである、
    ５’－ＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＺａ１－３’（配列番号１）、
    ５’－Ｚａ２ＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡ－３’（配列番号２）；又は、
    ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１３に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１４に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｂ１に対応するヌクレオチドＺｂ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｂ２に対応するヌクレオチドＺｂ４が含まれ、前記Ｚｂ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである、
    ５’－ＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＺｂ１－３’（配列番号１３）、
    ５’－Ｚｂ２ＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵ－３’（配列番号１４）；又は、
    ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２５に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２６に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｃ１に対応するヌクレオチドＺｃ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｃ２に対応するヌクレオチドＺｃ４が含まれ、前記Ｚｃ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである、
    ５’－ＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＣＵＺｃ１－３’（配列番号２５）、
    ５’－Ｚｃ２ＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡ－３’（配列番号２６）；又は、
    ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３７に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３８に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｄ１に対応するヌクレオチドＺｄ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｄ２に対応するヌクレオチドＺｄ４が含まれ、前記Ｚｄ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである、
    ５’－ＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＺｄ１－３’（配列番号３７）、
    ５’－Ｚｄ２ＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵ－３’（配列番号３８）；又は、
    ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号４９に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号５０に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺｅ１に対応するヌクレオチドＺｅ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺｅ２に対応するヌクレオチドＺｅ４が含まれ、前記Ｚｅ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである、
    ５’－ＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＺｅ１－３’（配列番号４９）、
    ５’－Ｚｅ２ＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣ－３’（配列番号５０）；
    Ｒ２は、長さ１～２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
    Ｒ２が式（Ｂ５）、（Ｂ６）、（Ｂ５’）又は（Ｂ６’）に示される基から選択され、
    は、基が共有結合で結合されている部位を表し、ｑ ２ が１～１０の整数であり、
    各Ｌ１は、長さ１～７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
    は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、
    Ｍ１は標的基を表し、
    各Ｌ １ が、独立して、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びそれらの任意の結合の組み合わせからなる群より選ばれ、
    各ｊ１は、独立して１～２０の整数であり、
    は基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、
    Ｌ １ の長さが３～２５個の原子であり、
    各Ｍ １ は、独立して、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－ガラクトース、ガラクトサミン及びＮ－アセチルガラクトサミンからなる群より選ばれる）。
  2. Ｌ １の長さが４～１５個の原子である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  3. ｊ１は２～１０の整数、又はｊ１は３～５の整数である、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  4. ｍ１、ｍ２及びｍ３がそれぞれ独立して２～５の整数であり、及び／又はｍ１＝ｍ２＝ｍ３である、請求項１～３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  5. 前記標的基の少なくとも１つ又は各々が、ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミンである、請求項１～４のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  6. Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、Ｈである、請求項１～５のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  7. 式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）
    に示される構造を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  8. 式Ａ５９におけるＰが、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合されており、前記端部とは、前記センス鎖又はアンチセンス鎖においてその一端から前の４個のヌクレオチドを指す、
    或いは、式Ａ５９におけるＰが前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に結合され、或いは、式Ａ５９におけるＰが前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される、
    或いは、式Ａ５９におけるＰが、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合される、請求項１～７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  9. ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、或いは、
    ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１３に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１４に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、或いは、
    ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２５に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２６に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、或いは、
    ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３７に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３８に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、或いは、
    ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号４９に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号５０に示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド差異が１つ以下である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  10. Ｉ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚａ４の位置での差異を含み、Ｚａ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される；或いは、
    ＩＩ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１４に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚｂ４の位置での差異を含み、Ｚｂ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される；或いは、
    ＩＩＩ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２６に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚｃ４の位置での差異を含み、Ｚｃ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される；或いは、
    ＩＶ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３８に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚｄ４の位置での差異を含み、Ｚｄ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される；或いは、
    Ｖ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号５０に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚｅ４の位置での差異を含み、Ｚｅ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される、請求項１又は９に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  11. Ｚａ３がＺａ４と相補的なヌクレオチドである、或いは、
    Ｚｂ３がＺｂ４と相補的なヌクレオチドである、或いは、
    Ｚｃ３がＺｃ４と相補的なヌクレオチドである、或いは、
    Ｚｄ３がＺｄ４と相補的なヌクレオチドである、或いは、
    Ｚｅ３がＺｅ４と相補的なヌクレオチドである、請求項１０に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  12. 前記センス鎖がヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶの長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩがヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、ヌクレオチド配列ＩＶがヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記実質的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指し、
    ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＣであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＣであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＧＣであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵＧＣであり、
    ５’－ＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＺ ａ３ －３’（配列番号３）、
    ５’－Ｚ ａ４ ＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡ－３’（配列番号４）；或いは、
    ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１５に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号１６に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧＧＧであり、
    ５’－ＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＺ ｂ３ －３’（配列番号１５）、
    ５’－Ｚ ｂ４ ＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵ－３’（配列番号１６）；或いは、
    ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号２８に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣＡＧであり；
    ５’－ＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＣＵＺ ｃ３ －３’（配列番号２７）；
    ５’－Ｚ ｃ４ ＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡ－３’（配列番号２８），
    或いは、
    ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３９に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号４０に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＣであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＡＣであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧＡＣであり；
    ５’－ＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＺ ｄ３ －３’（配列番号３９）、
    ５’－Ｚ ｄ４ ＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵ－３’（配列番号４０）；或いは、
    ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号５１に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号５２に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＡＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＡＡＧである；
    ５’－ＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＺ ｅ３ －３’（配列番号５１）、
    ５’－Ｚ ｅ４ ＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣ－３’（配列番号５２）；
    請求項９に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  13. 前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、完全に逆相補的である請求項１２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  14. 前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列Ｖをさらに含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１～３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、アンチセンス鎖の３’オーバーハング末端を構成し、或いは、前記ヌクレオチド配列Ｖは、長さが２ヌクレオチドであり、或いは、前記ヌクレオチド配列Ｖは、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド又は連続した２個のウラシルリボヌクレオチドであり、或いは、前記ヌクレオチド配列Ｖは、標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと相補的である、請求項９～１３のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  15. 前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含む：
    ５’－ＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＺａ３－３’（配列番号５）、
    ５’－Ｚａ４ＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡＧＣ－３’（配列番号６）；或いは、
    前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含む、
    ５’－ＧＣＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＺａ３－３’（配列番号７）、
    ５’－Ｚａ４ＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡＧＣＡＡ－３’（配列番号８）；或いは、
    前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を含む、
    ５’－ＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＺｂ３－３’（配列番号１７）、
    ５’－Ｚｂ４ＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣ－３’（配列番号１８）；或いは、
    前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号１９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号２０に示されるヌクレオチド配列を含む、
    ５’－ＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＺｂ３－３’（配列番号１９）、
    ５’－Ｚｂ４ＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵ－３’（配列番号２０）；或いは、
    前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号２９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号３０に示されるヌクレオチド配列を含む、
    ５’－ＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＣＵＺｃ３－３’（配列番号２９）、
    ５’－Ｚｃ４ＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵ－３’（配列番号３０）；或いは、
    前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号３１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号３２に示されるヌクレオチド配列を含む、
    ５’－ＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＣＵＺｃ３－３’（配列番号３１）、
    ５’－Ｚｃ４ＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵ－３’（配列番号３２）；或いは、
    前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号４１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号４２に示されるヌクレオチド配列を含む、
    ５’－ＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＺｄ３－３’（配列番号４１）、
    ５’－Ｚｄ４ＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵ－３’（配列番号４２）；或いは、
    前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号４３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号４４に示されるヌクレオチド配列を含む、
    ５’－ＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＵＣＺｄ３－３’（配列番号４３）、
    ５’－Ｚｄ４ＧＡＧＡＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣ－３’（配列番号４４）；或いは、
    前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号５３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号５４に示されるヌクレオチド配列を含む、
    ５’－ＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＺｅ３－３’（配列番号５３）、
    ５’－Ｚｅ４ＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵ－３’（配列番号５４）；或いは、
    前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号５５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号５６に示されるヌクレオチド配列を含む、
    ５’－ＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＧＵＧＣＺｅ３－３’（配列番号５５）
    ５’－Ｚｅ４ＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵ－３’（配列番号５６）、請求項９～１４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  16. 前記ｓｉＲＮＡが、ｓｉＡＰａ１、ｓｉＡＰａ２、ｓｉＡＰｂ１、ｓｉＡＰｂ２、ｓｉＡＰｃ１、ｓｉＡＰｃ２、ｓｉＡＰｄ１、ｓｉＡＰｄ２、ｓｉＡＰｅ１又はｓｉＡＰｅ２である、請求項９～１５のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  17. 前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の少なくとも１つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び／又は少なくとも１つのリン酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である、請求項９～１６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  18. 前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドが、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、
    或いは、前記フルオロ修飾ヌクレオチドがヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、
    或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１７に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  19. 各非フルオロ修飾ヌクレオチドが、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つであり；或いは、
    ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチドが、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドから選択される１つであり、ヌクレオチドアナログがイソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択される１つであり；或いは、
    各非フルオロ修飾ヌクレオチドがいずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドが、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項１７又は１８に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  20. ５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、８、９、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり；或いは、
    ５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり；或いは、
    ５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである、請求項１７～１９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  21. 前記ｓｉＲＮＡが、ｓｉＡＰａ１－Ｍ１、ｓｉＡＰａ２－Ｍ１、ｓｉＡＰａ１－Ｍ２、ｓｉＡＰａ２－Ｍ２、ｓｉＡＰａ１－Ｍ３、ｓｉＡＰａ２－Ｍ３、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ１、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ１、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ２、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ２、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ３、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ３、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ１、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ１、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ２、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ２、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ３、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ３、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ１、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ１、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ２、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ２、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ３、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ３、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ１、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ１、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ２、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ２、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ３及びｓｉＡＰｅ２－Ｍ３のいずれか１つである、請求項９～２０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  22. 前記修飾基を有するリン酸エステル基が、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基であり、或いは、前記修飾基を有するリン酸エステル基が、式（１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である、
    請求項９～２１のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  23. 前記ｓｉＲＮＡにおいて、チオリン酸エステル基が、
    前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
    前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する、請求項２２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  24. 前記ｓｉＲＮＡが、ｓｉＡＰａ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰａ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰａ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰａ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰａ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰａ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ３Ｓ及びｓｉＡＰｅ２－Ｍ３Ｓのいずれか１つである、請求項９～２３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  25. 前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであり、
    或いは、前記５’－リン酸ヌクレオチドが、式（２）に示される構造を有するヌクレオチドであり、前記５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが、式（３）～式（６）のいずれか１つに示される構造のヌクレオチドから選択され、
    ただし、ＲはＨ、ＯＨ、メトキシ基又はフッ素から選択され、Ｂａｓｅは塩基を表し、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される、請求項９～２４のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  26. 前記ｓｉＲＮＡが、ｓｉＡＰａ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰａ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰａ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰａ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰａ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰａ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰａ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰａ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰａ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰａ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰａ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰａ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰａ１Ｕ－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰａ２Ｕ－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ１Ｕ－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｂ２Ｕ－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｃ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｃ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ１Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｄ１Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｄ１Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｄ１Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ１Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ１Ｕ－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｄ２Ｕ－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＡＰｅ１Ｕ－Ｍ３ＳＰ１及びｓｉＡＰｅ２Ｕ－Ｍ３ＳＰ１のいずれか１つである、請求項９～２５のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  27. 請求項１～２６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体を含有する、脂質異常の治療及び／又は予防のための組成物。
  28. 前記脂質異常が、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である、請求項２７に記載の組成物。
  29. 請求項１～２６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体を含有する、肝細胞におけるＡＰＯＣ３遺伝子の発現を抑制するための、組成物。
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