JP7581264B2 - 細胞および組織への薬剤の送達のための新規ペプチド、組成物および方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／８６９，８３１号、２０１９年７月２日出願の優先権の利益を主張する。
連邦政府支援の研究に関する記載
本発明は、米国陸軍によって与えられた認可番号Ｗ８１ＸＷＨ－１６－１－０６５０により政府の支援で行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

配列表
配列表は、本出願に付随し、サイズ２．０９ＫＢであり、２０２０年６月１５日に作成された「１６６１１８＿００９４９＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられた配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルとして提供される。配列表は、アプリケーションを用いてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

導入
大部分の薬物にとって、細胞膜は細胞の細胞質または核への移行の不浸透性障壁である。この障壁を克服するために、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の開発に著しい関心がある（Guidotti et al., 2017）。タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび小分子薬物を含む生物学的に活性なコンジュゲートの細胞および組織への送達を可能にする種々のＣＰＰが記載されている（Bechara and Sagan, 2013）。ＣＰＰは、さまざまなクラス：ａ）陽イオン性、例えば、ＨＩＶ ＴＡＴ、ペネトラチンまたはポリアルギニン；ｂ）両親媒性、例えば、トランスポータンおよびＰｅｐ－１、ならびにｃ）疎水性、例えば、Ｐｅｐ－７に分類されており、これらのＣＰＰおよびそれらの一般的特性は他所に概説されている（Guidotti et al., 2017）。細胞膜を越える分子の送達のために有用な特性を有するＣＰＰが同定されているが、個々のペプチドの効率は、標的化される組織の種類に応じて変動する。
眼（ｏｃｕｌａｒ）の疾患および損傷は、医薬品部門の進歩にも関わらず重要な医学的問題のままである。国立保健研究所によると、失明に至る眼（ｏｃｕｌａｒ）の疾患は、合衆国における身体障害の最も一般的な原因の１つである［National Eye Institute (1999-2003). A Report of the National Eye Council, National Institutes of Health］。眼（ｏｃｕｌａｒ）の組織に薬物を送達することは、眼の天然の防御システムによって複雑化される。眼のまばたき動作は、眼（ｏｃｕｌａｒ）の表面を洗浄し、免疫グロブリンおよび抗菌タンパク質を含有する涙膜を再生させる。涙膜による薬物の急速なクリアランスは、眼の表面への分子の局所送達を困難にし、所与の薬物の９５％を超える損失を生じる。さらに、眼の内側の区画に透過することを管理する薬物の半減期は、眼房水の再循環のために通常短い。このため、眼（ｏｃｕｌａｒ）の組織に薬物を送達するための方法の改善は、重要な医薬的要求である。
本出願では、網膜および角膜を高効率で標的化するＣＰＰが提供される。これらのＣＰＰは、細胞膜を越えて異種性分子を送達するためにＣＰＰと異種性分子との間に化学的コンジュゲーションを必要としないという点で独特であり、それにより、疾患および傷害の処置のために網膜に治療薬を送達する有望な手段を提供する。

本明細書で提供するペプチドは、細胞または組織への薬剤の送達ために有効である細胞透過性ペプチドとして作用できる。一部の実施形態ではペプチドは、薬剤にコンジュゲートまたは連結されておらず、細胞膜を通過し、薬剤を送達することがいまだ可能である。本発明は、配列番号１を含む、または配列番号１に９０％配列同一性を有するペプチドであって、配列番号１中のＸが任意の可動性リンカー領域を表すペプチドを提供する。本発明は、配列番号２もしくは配列番号４を含むか、またはそれからなるアミノ酸配列を有するペプチド、または配列番号２もしくは配列番号４に９０％配列同一性を有するペプチドであって、配列番号２中の各Ｘが任意の可動性リンカー領域を表すペプチドも提供する。
薬剤および本発明のペプチドを含む医薬組成物が提供される。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび核酸構築物も提供される。

本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスも提供される。本発明のペプチドは、ウイルスカプシドタンパク質内に挿入され得る。ＡＡＶ９を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も使用され得る。
さらに本発明は、細胞または組織を本開示の組成物に、または薬剤および本開示のペプチドもしくはペプチドを含む組成物に接触させるステップによって、細胞または組織に薬剤を送達する方法を提供する。

最初に薬剤および本発明のペプチドを含む医薬を製剤化するステップ、および次に医薬を対象に投与するステップによって対象の細胞または組織に薬剤を送達するための方法も提供される。
細胞または組織を本発明のウイルスおよびペプチドの両方に接触させるステップによって、細胞または組織にウイルスを送達するための方法も提供される。

本明細書で提供する組成物、ペプチドおよびウイルス送達機構は、状態または疾患について処置を必要とする対象を処置するために使用され得る。状態または疾患は、変性性の眼（ｏｃｕｌａｒ）の疾患、炎症もしくは酸化ストレスに関連する疾患、血管新生または線維症および眼（ｏｃｕｌａｒ）の損傷を含むものから選択され得る。

硝子体内注射後にＮｕｃ１ペプチドが網膜組織および細胞に透過することを実証する蛍光顕微鏡画像である。ＦＡＭ－標識Ｎｕｃ１は、硝子体内注射後にＧＣＬ、ＩＮＬ、ＩＳおよびＯＳを含む網膜のすべての層に局在化する（Ａ）。チューブリン（Ｂ）、ＰＫＣ（Ｃ）、桿体オプシン（Ｄ）およびグルタミン合成酵素（Ｅ）を用いた免疫染色。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＯＮＬ、外顆粒層；ＩＳ、内節；ＯＳ、外節。一部のパネルについて、さらに高倍率の画像も示されている。 Ｎｕｃ １が網膜細胞への組換えタンパク質透過を促進することを実証する代表的な蛍光顕微鏡画像である。成体マウスの硝子体へのｍＣｈｅｒｒｙ／ＲＦＰおよびＦＡＭ標識Ｎｕｃ１の同時注射は、種々の網膜細胞型、最も豊富にはＯＮＬでのｍＣｈｅｒｒｙの取込みをもたらす（Ａ）。高倍率のＯＮＬが示されている（Ａ）。ｍＣｈｅｒｒｙおよび非標識Ｎｕｃ１を同時注射したマウスの凍結切片は、神経節細胞（Ｂ）に対してチューブリン、双極細胞（Ｃ）に対してＰＫＣ、ミュラー細胞（Ｄ）または錐体オプシン（Ｅ）に対してグルタミン合成酵素について染色された。注目すべきことに、組換えｍＣｈｅｒｒｙ／ＲＦＰタンパク質は、単独で硝子体内に注射された場合に、中央パネルでのＲＦＰシグナルの欠如によって示されるとおり網膜に顕著には透過しない（Ｆ）。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＯＮＬ、外顆粒層；ＩＳ、内節；ＯＳ、外節。一部のパネルについて、さらに高倍率の画像も示されている。 Ｎｕｃ１が網膜への機能性タンパク質の送達を促進することを実証する図である。アポトーシス細胞についてのＴＵＮＥＬ染色は、正常、ＭＮＵ、ＭＮＵ＋ＸＩＡＰまたはＭＮＵ＋ＸＩＡＰ＋Ｎｕｃ１注射マウスで実施された。マウスは、アポトーシス細胞の正常レベルの決定のために、またはＭＮＵ誘発アポトーシスのためにＰＢＳを用いて検証された。ＸＩＡＰと同時注射されたＮｕｃ１は、ＸＩＡＰのみを注射されたマウスと比較してアポトーシスに対する有意な保護を付与する（Ａ）。Ｎｕｃ１＋ＸＩＡＰ後のアポトーシスの有意な抑制が網膜剥離モデルで観察された（Ｂ）。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＯＮＬ、外顆粒層；ＩＮＬ；内顆粒層。 Ｎｕｃ１が網膜への抗体の送達を促進することを実証する図である。抗ＶＥＧＦ抗体は、レーザー誘発血管新生（ＣＮＶ）を抑制し、それは硝子体内に注射された（Ａ）または１０日間毎日の局所滴下剤として送達された（Ｂ）抗ＶＥＧＦ抗体とＮｕｃ１との同時投与によって増強され得る。ＦＩＴＣにコンジュゲートしたグリフォニア・シンプリシフォリア（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）レクチンＩで染色されたＲＰＥ／脈絡膜フラットマウントの蛍光顕微鏡画像を上に示し、レーザースポットの面積は下の散布図で定量される。 Ｎｕｃ１がアルカリによる熱傷および脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の処置についてのデコリンの効力を増強することを実証する図である。アルカリによる熱傷のマウスモデルから回収された角膜凍結切片は、α－アクチン、線維症のマーカーについて染色（赤）され、核はＤＡＰＩで染色（青）される（Ａ）。デコリン単独またはＮｕｃ１ペプチドとの組合せ（デコリン＋Ｎｕｃ１）での硝子体内注射を用いて処置されたレーザー誘発ＣＮＶを有するマウスの眼におけるイソレクチンおよびアルファ平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）染色の蛍光顕微鏡画像（Ｂ）。デコリン単独またはＮｕｃ１ペプチドとの組合せ（デコリン＋Ｎｕｃ１）のいずれかで硝子体内注射を用いて処置されたレーザー誘発ＣＮＶを有するマウスの眼において測定されたイソレクチン（左）およびα－ＳＭＡ（右）染色の面積の（Ｂ）において示されたデータのドットプロット（Ｃ）。 Ｎｕｃ１が網膜への小分子の送達を促進することを実証する図である。蛍光標識ＢＨ４ペプチドが網膜に透過しない一方で、Ｎｕｃ１と硝子体内に同時注射されたＢＨ４は網膜に透過する（Ａ）。Ｎｕｃ１は、蛍光標識デキサメタゾンの透過も顕著に増強した（Ｄｅｘ－Ｆｌ；Ｂ）。核は、ＤＡＰＩによって染色（青）される。ＧＣＬ：神経節細胞層；ＯＮＬ：外顆粒層；ＩＮＬ：内顆粒層。 Ｎｕｃ１がｉｎ ｖｉｖｏで網膜細胞のアデノ随伴ウイルス感染を増強することを実証する図である。Ｎｕｃ１は、網膜下注射（Ａ）または硝子体内注射（Ｂ）後にＡＡＶ９の送達を増強した。感染の増強は、眼底撮影法によって測定されるとおり網膜にわたって均一でなかった（Ｃ）。凍結切片は、双極細胞（ＰＫＣ）について同時染色された。核は、ＤＡＰＩで染色（青）された。ＧＣＬ：神経節細胞層；ＯＮＬ：外顆粒層；ＩＮＬ：内顆粒層。 ＡＡＶカプシドへのＮｕｃ１の組込みは、感染を顕著に増強しないことを実証する図である。ＡＡＶ－Ｎｕｃｌ－ＣＡＧ－ＧＦＰの網膜下注射は、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰと比較してＧＦＰ発現の顕著な増強を生じなかった（Ａ）。さらに、このベクターは、硝子体内注射後に網膜に透過しなかった（Ｂ）。対照的に、ＡＡＶ－Ｎｕｃ１－ＣＡＧ－ＧＦＰは、Ｎｕｃ１と同時注射された場合に網膜に透過できた（Ｃ）。核は、ＤＡＰＩで染色（青）された。ＧＣＬ：神経節細胞層；ＯＮＬ：外顆粒層；ＩＮＬ：内顆粒層。 網膜下注射後のＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰ感染の結果を示す図である。ＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰは、網膜下注射後の光受容体の顕著な感染をもたらす。切片は、桿体オプシン（Ａ）、錐体オプシン（Ｂ）、グルタミン合成酵素（Ｃ）、ＰＫＣ（Ｄ）で同時染色された。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＯＮＬ、外顆粒層；一部のパネルについて、さらに高倍率の画像も示されている。 硝子体内注射後のＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰ感染の結果を示す図である。ＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰは、硝子体内注射後に種々の網膜細胞の顕著な感染をもたらす。切片は、錐体オプシン（Ａ）、桿体オプシン（Ｂ）、ＰＫＣ／双極細胞（Ｃ）チューブリン（Ｄ）またはグルタミン合成酵素（Ｅ）で同時染色された。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＯＮＬ、外顆粒層。一部のパネルについて、さらに高倍率の画像も示されている。パネルＡ～Ｄに示された発現のパターンは一貫して観察された一方で；パネルＥに示されたパターンはまれに見出された。 最大の導入遺伝子発現は、ＡＡＶ－ＩＫＶがＮｕｃ１と同時注射された場合に達成されることを実証する図である。Ｎｕｃ１とのＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰの同時注射は、硝子体内注射後に最大の導入遺伝子発現を網膜表面全体に生じてもたらした（Ａ）。さらに高倍率の画像（Ｂ）は、光受容体が網膜色素上皮および脈絡膜を含め、高度にＧＦＰ陽性であったことを示している。生存動物の眼底画像も導入遺伝子発現が網膜表面全体にわたって生じたことを明らかにした（Ｃ）。網膜内部のより高度な露出は、一部のミュラー細胞を含めＧＦＰ陽性内網状層（ＩＰＬ）および神経節細胞層（ＧＣＬ）を明らかにした（Ｄ）。網膜切片の長時間露出画像は、双極細胞についてＰＣＫで同時染色した内顆粒層（ＩＮＬ）中の細胞も陽性であったことを明らかにした（Ｅ）。ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰと比較して、Ｎｕｃ１の同時注射はｍＲＮＡレベルをおよそ４．３倍増強した。Ｎｕｃ１もＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰの発現をおよそ８．５倍増強した。ＡＡＶ－ＧＦＰと比較して、ＩＫＶ－ＧＦＰ＋Ｎｕｃ１はおよそ３００倍多い量のｍＲＮＡを有した（Ｆ）。 硝子体内ＡＡＶ送達が網膜の外側における酸化ストレスを抑制することを実証する図である。ＡＡＶ－ＩＫＶ－Ｎｒｆ２を注射されたＣ５７／Ｂｌ６Ｊマウスの眼は、ＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰの眼と比較して顕著に少ない８－ＯＨｄＧ染色を示した（Ａ）。同様に、ＡＡＶ－ＩＫＶ－Ｎｒｆ２を注射されたＮＲＦ２ノックアウトマウスは、ＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰの眼と比較して顕著に少ない８－ＯＨｄＧ染色を示した（Ｂ）。これらの網膜の定量は、ＯＮＬにおける８－ＯＨｄＧ染色の有意な低減を実証した（Ｃ）。 硝子体内ＡＡＶ送達が、脈絡膜血管新生および網膜の外側における線維症を抑制することを実証する図である。ＡＡＶ－ＩＫＶ－デコリンは、イソレクチンおよび平滑筋アクチン（ＳＭＡ）染色によってそれぞれ測定されるとおり、レーザー誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）における血管新生および線維症に対する有効性に関してＡＡＶ－ＩＫＶ－アイリーアまたはＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰよりも顕著に優れていることが見出された。 Ｎｕｃ１と同時送達されるデコリン（デコリン＋Ｎｕｃ１）の局所適用がアルカリによる熱傷後の角膜混濁を低減し、角膜肥厚を減弱させることを示す図である。パネルＡは、アルカリによる熱傷および処置に曝露されていない（対照）またはアルカリによる熱傷および局所処置：リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、デコリン単独またはデコリン＋Ｎｕｃ１のうちの１種、に曝露されたマウスの眼の代表的な画像を示している。パネルＢは、アルカリによる熱傷および処置に曝露されていない（対照）またはアルカリによる熱傷および局所処置：ＰＢＳ、デコリン単独またはデコリン＋Ｎｕｃ１のうちの１種、に曝露されたマウスの角膜のヘマトキシリン（核；青）ならびにエオシン（細胞外基質および細胞質；ピンク）染色横断パラフィン切片（１０倍および２０倍拡大）を示している。Ｅｐ、上皮；Ｓｔ、角膜実質；Ｅｎ、内皮。 デコリン＋Ｎｕｃ１の局所的適用が、アルカリによる熱傷に曝露されたマウスの角膜における血管新生および線維症を有意に低減することを示す図である。図１５パネルＡは、アルカリによる熱傷および処置に曝露されていない（対照）またはアルカリによる熱傷および局所処置：ＰＢＳ、デコリン単独またはデコリン＋Ｎｕｃ１のうちの１種、に曝露されたマウスの角膜の凍結切片の代表的な画像である。凍結切片は、ＧＳＬ Ｉ（イソレクチン；緑、上パネル）または平滑筋アクチン（ＳＭＡ、α－アクチン；赤、中央パネル）のいずれかについて染色された。マージ画像が下パネルに示されている。角膜細胞の核は、ＤＡＰＩで染色（青）される。Ｅｐｉ、上皮（ｅｐｔｈｅｌｉｕｍ）；Ｓｔｒ、角膜実質；Ｅｎｄｏ、内皮。図１５パネルＢは、染色を定量する棒グラフを示している。第１のグラフは、３個の処置群：ＰＢＳ、デコリン単独およびデコリン＋Ｎｕｃ１のそれぞれ由来の角膜における、血管新生および血管新生の指標であるＧＳＬ Ｉ（イソレクチン）染色の定量を示している。第２のグラフは、３個の処置群：ＰＢＳ、デコリン単独およびデコリン＋Ｎｕｃ１のそれぞれ由来の角膜における、線維症の指標であるＳＭＡ（α－アクチン）染色の定量を示している。＊ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定） デコリン＋Ｎｕｃ１がアルカリによる熱傷に曝露されたマウスの角膜の炎症性細胞の浸潤を有意に低減することを示す図である。図１６パネルＡは、アルカリによる熱傷および処置に曝露されていない（対照）またはアルカリによる熱傷および局所処置：ＰＢＳ、デコリン単独またはデコリン＋Ｎｕｃ１のうちの１種、に曝露されたマウスの角膜の凍結切片の代表的な画像を示している。凍結切片は、炎症マーカーＣＤ４５（緑、上パネル）およびＦ４／８０（赤、下パネル）について染色された。角膜細胞の核も、ＤＡＰＩで染色（青）された。Ｅｐｉ、上皮；Ｓｔｒ、角膜実質；Ｅｎｄｏ、内皮。図１６パネルＢは、染色を定量する棒グラフを示している。第１のグラフは、３個の処置群：ＰＢＳ、デコリン単独およびデコリン＋Ｎｕｃ１のそれぞれ由来の角膜におけるＣＤ４５染色の定量を示している。第２のグラフは、３個の処置群：ＰＢＳ、デコリン単独およびデコリン＋Ｎｕｃ１のそれぞれ由来の角膜におけるＦ４／８０染色の定量を示している。 アルカリによる熱傷に曝露されたマウスの角膜において、デコリン＋Ｎｕｃ１がサイトカイン（ＩＬ－１βについてを除く）の発現を有意に低減することを示す図である。グラフは、アルカリによる熱傷および処置に曝露されていない（対照）またはアルカリによる熱傷および局所処置：ＰＢＳ、デコリン単独またはデコリン＋Ｎｕｃ１のうちの１種、に曝露されたマウスの角膜から抽出された溶解物中のサイトカインインターロイキン（ＩＬ）－１ベータ（ＩＬ－１β）、ＩＬ－６、ＩＬ－１７、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－Ｇ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）の発現レベル（ピコグラム／ミリリットル、ｐｇ／ｍｌ）を示す図である。 アルカリによる熱傷および処置に曝露されていない（対照）またはアルカリによる熱傷および局所処置：ＰＢＳ、デコリン単独、デコリン＋Ｎｕｃ１のうちの１種、に曝露されたマウスの角膜の凍結切片の代表的な画像である。凍結切片は、炎症性サイトカイントランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β１、赤）に対する抗体で染色された。Ｅｐｉ、上皮；Ｓｔｒ、角膜実質；Ｅｎｄｏ、内皮。 デコリン＋Ｎｕｃ１が、アルカリによる熱傷に曝露されたマウスの角膜におけるＣａｓｐａｓｅ－３の活性化を有意に低減したことを示す図である。アルカリによる熱傷および処置に曝露されていない（対照）またはアルカリによる熱傷および局所処置：ＰＢＳ、デコリン単独またはデコリン＋Ｎｕｃ１のうちの１種、に曝露されたマウスの角膜の凍結切片の代表的な画像は左に示されている。凍結切片は、活性化Ｃａｓｐａｓｅ－３に対する抗体で染色された（赤）。角膜細胞の核は、ＤＡＰＩで染色（青）された。右の棒グラフは、３個の処置群：ＰＢＳ、デコリン単独およびデコリン＋Ｎｕｃ１のそれぞれ由来の角膜における活性化Ｃａｓｐａｓｅ－３染色の定量を示している。 デコリン＋Ｎｕｃ１が、アルカリによる熱傷に曝露されたマウスの角膜における細胞死を有意に低減することを示す図である。図１９Ａは、アルカリによる熱傷および処置に曝露されていない（対照）またはアルカリによる熱傷および局所処置：ＰＢＳ、デコリン単独およびデコリン＋Ｎｕｃ１のうちの１種、に曝露されたマウスの角膜の凍結切片の代表的な画像を示す。凍結切片は、ＴＵＮＥＬアッセイによって染色された（赤）。角膜細胞の核は、ＤＡＰＩで染色（青）された。それぞれの処置について、ＤＡＰＩおよびＴＵＮＥＬ染色のオーバーレイは左パネルに示されており、ＴＵＮＥＬ染色のみは右パネルに示されている。Ｅｐｉ、上皮（ｅｐｔｈｅｌｉｕｍ）；Ｓｔｒ、角膜実質；Ｅｎｄｏ、内皮。図１９Ｂは、３個の処置群：ＰＢＳ、デコリン単独およびデコリン＋Ｎｕｃ１のそれぞれ由来の角膜におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞を定量する棒グラフを示している。 デコリン＋Ｎｕｃ１がアルカリによる熱傷に曝露されたマウスの網膜において神経膠症を顕著に低減することを示す図である。アルカリによる熱傷および処置に曝露されていない（対照）またはアルカリによる熱傷および局所処置：ＰＢＳ、デコリン単独またはデコリン＋Ｎｕｃ１のうちの１種、に曝露されたマウスの網膜の凍結切片の代表的な画像が示されている。凍結切片は、グリア線維酸性タンパク質について染色された（ＧＦＡＰ、赤）。網膜細胞の核は、ＤＡＰＩで染色（青）された。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＮＬ／ＯＮＬ、内／外顆粒細胞層（ｏｕｔｅｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｌａｙｅｒ）。 Ｎｕｃ１（１μｇ）を含むまたは含まない４μｇのＣｒｅリコンビナーゼの硝子体内注射後のＡｉ９マウスの網膜の凍結切片の代表的な共焦点顕微鏡画像である。レポーター導入遺伝子からのｔｄＴｏｍａｔｏ発現（赤）によって示される取込みは、神経節細胞層（ＧＣＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）、外顆粒層（ＯＮＬ）および網膜色素上皮（ＲＰＥ）において観察された。Ｎｕｃ１＋Ｃｒｅを用いて処置された網膜のさらに高倍率の画像は、右に示されている。 Ｎｕｃ１を含むまたは含まないＣａｓ９－ＧＦＰを用いた硝子体内注射の４時間後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの網膜の凍結切片の代表的な共焦点顕微鏡画像である。ＧＦＰシグナルは、神経節細胞層（ＧＣＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）および外顆粒層（ＯＮＬ）において観察された。 リボ核タンパク質粒子にカップリングしたＣａｓ９（Ｃａｓ９－ＲＮＰ）の網膜下注射後のＡｉ９マウスの網膜の凍結切片の代表的な共焦点顕微鏡画像である。Ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ発現は、注射後６週間で網膜色素上皮（ＲＰＥ）およびわずかな光受容体に局在化していた。図２３Ａは１０倍拡大画像を示し、図２３Ｂは４０倍画像を示す。 リボ核タンパク質粒子にカップリングしたＣａｓ９（Ｃａｓ９－ＲＮＰ）の硝子体内注射後のＡｉ９マウスの網膜の凍結切片の代表的な共焦点顕微鏡画像である。Ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ発現は、神経節細胞層（ＧＣＬ）および内顆粒層（ＩＮＬ）に局在化されていた。

大部分の薬物にとって、細胞膜は不浸透性障壁となる。しかしながら、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と呼ばれる特定のクラスのタンパク質は、未処理の細胞膜を越えることができ、カーゴ分子の取込みを促進できる。それによりＣＰＰは、細胞および組織へのタンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび小分子薬物を含む生物学的に活性なコンジュゲートの送達を可能にする（Bechara and Sagan、2013）。ＣＰＰは、容易な透過、急速な取込みならびに低い毒性および免疫応答を提供する［Jones et al. 2005 Br J Pharmacol 145: 1093-1102］。十分に研究されたＣＰＰとして、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）Ｔａｔタンパク質［Frankel et al. 1988 Cell 55: 1189-1193］、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＶＰ２２タンパク質［Phelan et al. 1998 Nat Biotechnol 16: 440-443］およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）アンテナペディアホメオドメインタンパク質［Derossi et al. 1994 J Bioi Chem 269: 10444-10450］が挙げられる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔは、ＤＮＡをコンパクトにし、それを培養中の細胞に送達するＣＰＰとして機能することが示されている［Ignatovich I A et al. 2003 J Biol Chem 278: 42625-42636］。しかしながら、ＨＩＶ ＴＡＴの他にｉｎ ｖｉｖｏでの神経組織におけるＣＰＰの能力について入手できる情報は非常に限られている。さらにＣＰＰは、細胞膜を越える送達のためにカーゴ分子への化学的コンジュゲーションを一般に必要とし、そのような改変はカーゴ分子の機能に悪影響を与える場合がある。

本発明は、細胞または組織への、特に眼（ｏｃｕｌａｒ）の細胞および組織への薬剤の送達のためのペプチドを提供する。本発明のペプチドは、配列番号１および配列番号２ならびに本明細書で提供する他のペプチドを含む。この能力を有するペプチドは、以前、例えば米国特許第８，７７８，８８６号に記載されているが、本発明のペプチドは、細胞または組織に薬剤を効果的に送達するために薬剤に化学的にコンジュゲートまたは連結される必要がないことにおいて例外的である。実施例は、「Ｎｕｃ１」と称され、配列番号３によって表される１種のそのようなペプチドが、今日までに記載された網膜の透過のための最も効率的なペプチドであり得ることを実証する。さらに、Ｎｕｃ１は、組換えタンパク質、抗体、プロテオグリカン、ステロイド、ウイルスおよびリボ核タンパク質を含む多様な薬剤を眼（ｏｃｕｌａｒ）の組織に送達できる。

本明細書において使用されるペプチドは、カスタムペプチドの商業的供給者によって合成された。ペプチド合成は、固相技術［Roberge et al. 995 Science 269:202］を使用して実施でき、例えば４３１Ａペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して自動化合成が達成される。当業者は、化学合成に加えてタンパク質およびペプチド発現系の使用をこれだけに限らないが含む他の手段もペプチドを生成するために使用され得ることを理解する。

実施例において記載されるＣＰＰ、Ｎｕｃ１は、眼（ｏｃｕｌａｒ）の細胞を標的化するそれらの可能性がある能力について選択される２種のアミノ酸配列を含む。これらの第１の配列ＡＳＩＫＶＡＶＳＡ（配列番号４）は、基底膜糖タンパク質ラミニン－１のヌクレオリン結合領域を表す、より長い配列ＣＳＲＡＲＫＱＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲ（配列番号８）由来である。第２の配列ＤＫＰＲＲ（配列番号５）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ１６５）の特定のアイソフォームのヘパラン硫酸結合ドメインを形成するわずかにより長い配列ＣＤＫＰＲＲ（配列番号７）由来である。重要なことに、ヌクレオリンおよびヘパラン硫酸の両方は、網膜組織の表面に見出され、この組織に接近するためのこれらの「標的化ペプチド」の能力の主要因であると考えられる。

本発明のペプチドは、可動性リンカー領域を任意に含む。Ｎｕｃ１（配列番号３）は、２個のグリシン残基を含むアミノ酸リンカーによって配列番号５に連結された配列番号４を含み、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）として機能すると実施例において示されている。当業者は、リンカー領域がＣＰＰの機能に影響を与えることなく変更され得ることを理解する。それにより本明細書で提供されるペプチドは、配列中のＸａａアミノ酸が可動性リンカー領域を表して配列番号１によって表される。Ｎｕｃ１は、標的化ペプチド配列（ラミニン－１およびＶＥＧＦ１６５由来ペプチド）間に可動性リンカー領域を含むように設計された。「リンカー」は、任意にペプチド結合を介してペプチドを繋ぐために役立つアミノ酸残基の配列である。本発明により可動性リンカー領域は、１個または複数個のアミノ酸残基、好ましくは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、もしくは２０個またはこれより多い残基を含む。本発明の好ましい実施形態では、リンカーは、残基２個を含む。「可動性」リンカーは、溶液中で固定された構造（二次または三次構造）を有さないアミノ酸配列である。したがって、そのような可動性リンカーは、種々のコンホメーションを自由に許容し、種々のアミノ酸からなる。リンカーは、標的化ペプチドの既存のリンカー配列として、または標的化ペプチド間の１個または複数個のアミノ酸残基の挿入によって提供され得る。リンカーは、標的化ペプチドとそれらの対応する標的分子との相互作用を実質的に妨げない任意のアミノ酸配列を含み得る。可動性リンカー配列のための好ましいアミノ酸残基として、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、リシン、アルギニン、グルタミンおよびグルタミン酸が挙げられるがこれらに限定されない。実施例では、可動性リンカー配列は、Ｎｕｃ１ペプチドが配列番号３を含むアミノ酸配列を有するように２個のグリシン残基を含む。当業者は、他の残基も使用され得、リンカーの長さはペプチドの機能に悪影響を与えることなく変更され得ることを理解する。ある特定の実施形態では、ペプチドはリンカー領域を含まない。典型的にはリンカーは、リンカーおよび標的化ペプチドの両方をコードする組換え核酸の一部として調製される。リンカーは、ペプチド合成によっても調製され、続いて標的化ペプチドと組み合わされ得る。核酸を操作する方法およびペプチド合成の方法は、当技術分野において周知である。

本出願では、用語「タンパク質」または「ペプチド」または「ポリペプチド」は、アミノ酸配列を指して互換的に用いられる。本明細書に記載のペプチドは、天然ではなく、むしろ操作されたペプチド配列である。「アミノ酸」および「アミノ酸配列」は、天然に存在する構成成分および天然に存在しない構成成分（すなわち、アミノ酸誘導体またはアミノ酸アナログが１個または複数個の天然に存在するアミノ酸を置換している）の両方を含み得る。さらに、２個の隣接している残基間に１個または複数個の非ペプチドまたはペプチド模倣結合を有するアミノ酸配列は、この定義に含まれる。

本明細書に記載のペプチドに関して、句「％配列同一性」、「パーセント同一性」または「％同一性」は、標準化されたアルゴリズムを使用してアライメントされた少なくとも２種のアミノ酸配列間で一致する残基のパーセンテージを指す。アミノ酸配列アライメントの方法は、周知である。一部のアライメント方法は、保存的アミノ酸置換を考慮する。そのような保存的置換は、下により詳細に説明され、一般に置換の部位での電荷および疎水性を保存し、それによりポリペプチドの構造（およびそれにより機能）を保存する。アミノ酸配列についてのパーセント同一性は、当技術分野において理解されるとおりに決定され得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，３９６，６６４号を参照されたい）。一連の一般に使用され、自由に入手できる配列比較アルゴリズムは、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）によって提供され、ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．ウエブサイトにて、を含むいくつかの供給元から利用可能である。ＢＬＡＳＴソフトウェア一式は、公知のアミノ酸配列を種々のデータベース由来の他のアミノ酸配列とアライメントするために使用される「ｂｌａｓｔｐ」を含む種々の配列分析プログラムを含む。

ポリペプチド配列同一性は、例えば、特定の配列番号によって定義される、定義されたポリペプチド配列全長にわたって測定され得る、またはより短い長さ、例えば、より長い定義されたポリペプチド配列から取った断片の長さ、例えば、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個もしくはさらなる近接残基の断片にわたって測定され得る。そのような長さは、例示のみであり、本明細書において、表、図または配列表において示された配列によって支持される任意の断片長が、それにわたってパーセンテージ同一性が測定され得る長さを記載するために使用され得ることは理解される。

実施例は、Ｎｕｃ１が、神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞ならびに光受容体桿体および錐体を含む網膜のすべての層に送達され得ることを実証している（図１）。注目すべきことに、Ｎｕｃ１の網膜への透過は、本発明者らが以前に記載した網膜透過ペプチドのいずれよりも実質的に優れており、Ｎｕｃ１をいくつかの眼（ｏｃｕｌａｒ）の状態の処置のための有望な候補にしている。例えば、光受容体の形質導入は、網膜色素変性症などの疾患の処置において適用を有し、網膜色素上皮細胞の形質導入は加齢性黄斑変性症の処置において適用を有し、神経節細胞の形質導入は緑内障の処置において適用を有する。しかしながら、本発明の標的化細胞または組織は、Ｎｕｃ１が、口腔、生殖器、軟骨（軟骨細胞）、肝臓、腎臓、神経、脳、上皮、心臓性および筋肉組織を含む他の組織において使用され得ることから眼に限定されない。特に、網膜神経細胞の性質に基づいて、本発明者らは、本発明の方法が脳などの他の神経組織に拡張され得ることを予想している。実施例ではＣＰＰは、光受容体、網膜色素上皮、神経節細胞、双極細胞、ミュラー細胞、脈絡膜内皮細胞、水晶体上皮、角膜内皮、角膜実質（ｃｏｒｎｅａｌ ｓｔｒｏｍａ）、線維柱帯網または虹彩への薬剤の送達を可能にできる。

細胞および組織に接近するこの能力を用いて、本発明のＣＰＰは、標的化部位への多様な薬剤の送達を可能にする。ある特定の実施形態では、薬剤は、治療剤、検出剤または細胞傷害剤である。一部の実施形態では、薬剤は次の：低分子量薬物、ペプチド、脂質、炭水化物、タンパク質、抗体、免疫原、遺伝子治療もしくは遺伝子操作構築物、ウイルスもしくはウイルスベクターまたはワクチンから選択される。他の実施形態では薬剤は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡまたは小分子干渉ＲＮＡなどの核酸である。好ましい実施形態では、薬剤は、抗アポトーシス剤、抗炎症剤、抗血管新生剤、抗線維化剤である。薬剤は、実施例において示されるとおり、Ｘ連鎖アポトーシス抑制タンパク質、デコリン、血管内皮増殖因子に対する抗体、Ｂｃｌ－ｘＬ由来ＢＨ４－ドメインペプチド、ＮＲＦ２またはデキサメタゾンであり得るが、多数の他の薬剤が当業者に明らかである。他の好ましい実施形態では、薬剤は、遺伝子治療剤または遺伝子編集剤である。薬剤は、組換えウイルスまたはＣａｓ９リボ核タンパク質であり得る。例えば、血管内皮増殖因子またはロドプシンは、遺伝子編集のための好適な標的であり得る。簡潔には遺伝子治療では、遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの分子として一般に細胞に送達される。遺伝子は、標的細胞内の遺伝子の発現を方向づけるプロモーター／エンハンサーエレメントも含む発現構築物の一部として含まれる。遺伝子が発現されると、生じたタンパク質産物は、標的細胞内で望ましい機能を提供する。この機能は、欠損または異常（突然変異、異常な発現など）を補正でき、治療価値がある別のタンパク質の発現を確実にできる。遺伝子治療は、改変後に再導入される身体から抽出された細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで実施され得る、または適切な組織においてｉｎ ｖｉｖｏで直接実施され得る。それにより遺伝子編集では、選択された組織の１個または複数個の細胞内の遺伝子は、改変される遺伝子を含む遺伝子の細胞性コピーを置き換えるように変更される。

本発明の好ましい実施形態では、薬剤は、ＣＰＰに化学的にコンジュゲートも連結もされていない。コンジュゲーションは、ＣＰＰに結合されたカーゴまたは薬剤の機能に悪影響を与える場合がある。それにより、コンジュゲートされていないカーゴ分子を送達する本発明のＣＰＰの能力は、先行技術を超える大きな改善を表す。さらにこの能力は、産生物の容易さのためにＣＰＰを極めて多用途にしている。例えばそれは、多数のカーゴ分子または可能性がある薬剤の有効性がタンデムで検査されるようにする。可能性があるカーゴ分子を検査するたびに、新規のコンジュゲートされた分子を産生するために使われる時間と費用も節約する。

加えて、本発明のＣＰＰをコードするポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結されている核酸構築物も提供される。本明細書で使用される場合、句「プロモーターに作動可能に連結されている」は、遺伝子発現がプロモーターで開始された場合に、生じた遺伝子産物にポリヌクレオチドが含まれているように、ポリヌクレオチドがプロモーターに並置されていることを意味する。

本発明は、ＣＰＰをコードするポリヌクレオチドおよび核酸構築物を含むウイルスも提供する。好ましい実施形態では、ウイルスはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶベクターは、ヒト組織、特に眼（ｏｃｕｌａｒ）、神経系および肝臓組織に遺伝子を送達する実行可能で、効果的な方法であることが示されている。しかしながら、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、麻疹ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ポックスウイルス、ピコルナウイルスおよび単純ヘルペスウイルスを含む、遺伝子治療適用における使用のために改変された他のウイルスも本発明において使用され得る。実施例では、ＡＡＶ９カプシド（ＡＡＶ２／９）を用いてシュードタイプ化されたＡＡＶ２ベクターが使用された。しかしながら、これだけに限らないがＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／５を含む任意のＡＡＶ血清型が、本発明において利用され得る［Khabou et al. 2016 Biotechnol Bioeng 113(12): 2712-2724］。

一部の実施形態ではＣＰＰは、ウイルスカプシドタンパク質に組み込まれる。ここで、挿入されるペプチドは、好ましくは、ラミニン－１由来の標的化ペプチド、ＡＳＩＫＶＡＶＳＡ（配列番号４）だけを含むＮｕｃ１の短い一部分である。実施例ではこの配列は、配列ＧＡＳＩＫＶＡＶＳＡＧ（配列番号６）を形成するように２個のグリシン残基によって隣接されており、ＡＡＶ血清型９カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９との間にクローニングされる。ＡＡＶカプシドまたは他のウイルスベクターの外膜もしくはカプシドタンパク質への異種性配列の組込みのための他の部位は、以前に記載されている。いずれかの末端上のグリシン残基は、異なるアミノ酸残基を含むために当業者によって変更され得る、または長さにおいて１個より多いアミノ酸であり得る可動性リンカー領域である。それにより、本明細書で提供されるペプチドは、配列中のＸａａアミノ酸が、長さにおいて１個または複数個のアミノ酸であり得、異なるアミノ酸残基を使用できる可動性リンカー領域（上に定義されるとおり）を表す配列番号２によって表される。

本明細書に記載のウイルスは、組換えウイルスまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり得、遺伝子治療ベクターまたはＶＬＰを含む。上に記載のとおり、ＣＰＰ配列は、種々のウイルスまたはウイルスベクターに挿入され得、これらは標的化細胞中のポリペプチドの送達および発現を可能にするように操作され得る。本明細書に記載のウイルスベクターおよびウイルスが目的のポリヌクレオチドを送達することにさらに有効であり、本明細書で提供するペプチドの挿入または発現を有さない類似のウイルスベクターと比較した場合に、標的組織または標的組織の細胞への送達の割合を増加させる遺伝子治療の目的ためにポリペプチドの発現を可能にすることは検討される。加えて、ＣＰＰを発現するまたは組み込むこれらの組換えウイルスまたはウイルスベクターは、標的細胞または組織への送達をさらに増加させるように可溶性ＣＰＰとも送達され得る。一実施形態では、配列番号４または６のラミニンペプチド配列は、ウイルスベクターに組み込まれ、可溶性Ｎｕｃ１（配列番号１または３）ペプチドは、ウイルスおよびそのカーゴの送達を増加させるようにウイルスと同時送達される。

関連する実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸を含む異なる可動性リンカー領域によって隣接される。実施例において実証されるとおり、ＡＡＶのカプシド中にＮｕｃ１のこの部分を含むこと（実施例においてＡＡＶ－ＩＫＶと称される）は、網膜下にまたは硝子体内に注射された場合に網膜細胞の感染を顕著に改善する。注目すべきことに、この組換えウイルスによる感染は、ウイルスが（ウイルスのカプシド中の配列番号４または配列番号６の含有の有無に関わらず）Ｎｕｃ１と同時注射される場合にさらに増強され得る。

本発明は、細胞または組織に薬剤を送達するための方法を提供する。これらの方法は、薬剤および本発明のＣＰＰの両方と細胞または組織を接触させるステップを含む。細胞は、薬剤と直接または間接的にｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで接触され得る。接触させるステップは、細胞、組織、哺乳動物、患者またはヒトへの投与を包含する。さらに、細胞に接触させるステップは、薬剤を細胞培養物または局所的に加えることを含む。他の好適な方法は、本明細書において定義される適切な手順および投与の経路を使用して薬剤を細胞、組織、哺乳動物または患者に導入するまたは投与することを含み得る。方法のある特定の実施形態では、細胞または組織は培養物中である。代替的に、細胞または組織は、ｉｎ ｖｉｖｏである。

分子のペプチド媒介送達は、ヒトにおける眼（ｏｃｕｌａｒ）の疾患および他の疾患の処置において適用を有する。したがって、本発明は、対象の細胞または組織に薬剤を送達するための方法も提供する。これらの方法は、薬剤および本発明のＣＰＰを含む医薬を製剤化するステップ、およびそれを対象に投与するステップを含む。滲出型加齢性黄斑変性症を処置するための現在の標準治療は、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ラニビズマブまたはアバスチン）の毎月の硝子体内注射を含む（Comparison of Age-related Macular Degeneration Treatments Trials Research et al., 2012）。実施例において実証されるとおり、これらの抗体をＮｕｃ１と同時送達することは、それらの効力を増強し有効用量のために必要な抗体の濃度を低減する、または投薬の頻度を低減すると考えられる。一部の実施形態では、硝子体内または網膜下注射は、局所投与に置き換えることができる。Ｎｕｃ１の添加は、費用のかかる来院および煩わしい医学的手順の必要なく処置をもたらすように薬剤が角膜を越えて細胞に到達できるようにする。薬物の効力を増強するこの能力は、処置の費用を低減することおよびオフターゲット活性による潜在的な毒性を低減することの両方について意義を有する。対象としては、これだけに限らないが、脊椎動物、適切には哺乳動物、適切にはヒト、ウシ、ネコ、イヌ、ブタまたはマウスが挙げられる。感染の他の動物モデルも使用され得る。

本発明の医薬または医薬組成物は、１種または複数種の適切な薬学的に許容される担体と任意に製剤化され得る。薬学的に許容される担体としては、任意およびすべての溶媒、希釈剤または他の液体ビヒクル、分散または懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、濃化剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤（ｓｏｌｉｄ ｂｉｎｄｅｒ）および潤滑剤が挙げられる。Remington’s Pharmaceutical Sciences [Ed. by Gennaro, Mack Publishing, Easton, Pa., 1995]は、医薬組成物を製剤化することにおいて使用される種々の異なる担体およびそれらを調製するための公知の技術を記載している。医薬は、１種または複数種の追加的治療剤も任意に含み得る。追加的治療剤は、次の：増殖因子、抗炎症剤、昇圧剤、コラーゲナーゼ阻害剤、局所ステロイド、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、アルコルベート、アンジオテンシンＩＩ、アンジオテンシンカルレティキュリン、テトラサイクリン、フィブロネクチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、ビタミンＢおよびヒアルロン酸からなる群から選択され得る。

提供される方法は、対象を処置するために有効な任意の量および任意の投与の経路を使用して医薬を投与することを含む。正確な投薬量は、処置される患者を考慮して個々の医師によって選択される。投薬量および投与は、十分なレベルの活性剤を提供するために、または望ましい効果を維持するために調整される。考慮される追加の因子としては、疾患状態の重症度、例えば、状態の程度、状態の経緯；患者の年齢、体重および性別；食事、投与の時期および頻度；併用薬物；反応感度；ならびに治療への耐性／応答が挙げられる。任意の活性剤について、治療有効用量は、細胞培養アッセイにおいて、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタにおいてのいずれかで最初に概算され得る。動物モデルは、望ましい濃度範囲および投与の経路を決定するためにも使用される。

標的組織が眼（ｏｃｕｌａｒ）である実施形態では、医薬は、経眼（ｔｒａｎｓ－ｏｃｕｌａｒ）、硝子体内、局所、経脈絡膜、前房内、上脈絡膜、経皮的、網膜下、腹腔内、皮下および静脈内経路を含むいくつかの経路によって対象の眼に投与され得る。注目すべきことに、眼への薬物の局所送達は眼の天然の防御によって困難にされる。しかしながら、実施例において実証したとおり、Ｎｕｃ１の局所投与は、角膜への薬物の送達を増強できる。本出願は、局所投与後に、利用可能な薬物の１％未満が眼（ｏｃｕｌａｒ）の組織に透過することから特に有用である［Shell J W 1984 Surv Opthalmol 29: 117-128］。追加的、代替的な投与の経路として：経口、直腸内、非経口、大槽内、腟内、腹腔内、バッカル（ｂｕｃａｌ）または経鼻の経路が挙げられる。

眼（ｏｃｕｌａｒ）投与のために、液体投薬形態は、緩衝液および可溶化剤、水などの好ましい希釈剤、チモソール（ｔｈｙｍｏｓｏｌ）などの保存剤、および、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウムまたはタマリンドガムなどの溶液をコンディショニングするための１種または複数種のバイオポリマーまたはポリマー、を含む。医薬の局所または経皮的投与のための剤型としては、滴下剤、軟膏、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、粉剤、液剤、スプレー剤、吸入剤またはパッチ剤が挙げられる。軟膏、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、本発明の活性剤に加えて、動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、酸化亜鉛またはこれらの混合物などの賦形剤を含有し得る。粉剤およびスプレー剤は、本発明の薬剤に加えて、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリイミドパウダーまたはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有し得る。スプレー剤は、クロロフルオロヒドロカーボンなどの通例の噴霧剤を追加的に含有する場合がある。

注射可能な調製物、例えば、滅菌注射可能水または油性懸濁物は、好適な分散または湿潤剤および懸濁剤を使用して当技術分野において公知のとおり製剤化される。滅菌注射可能な調製物は、滅菌注射可能な溶液、無毒性の非経口に許容される希釈剤または溶媒中の懸濁剤または乳剤、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液などである。許容されるビヒクルおよび溶媒としては、水、リンゲル溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。加えて、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、合成モノ－またはジグリセリドを含む任意の無菌（ｂｌａｎｄ）固定油も使用され得る。加えて、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製のために使用される。注射可能な製剤は、例えば、細菌保持フィルター（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ）を通す濾過によって、滅菌水または他の滅菌注射可能な媒体に溶解または分散され得る固形組成物の形態での滅菌剤を組み込むことによって使用前に無菌化され得る。活性剤のｉｎ ｖｉｖｏ効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの薬剤の吸収を遅くすることはしばしば望ましい。非経口で投与された活性剤の吸収の遅延は、油性ビヒクルに薬剤を溶解するまたは懸濁することによって達成される。注射可能なデポ形態は、ポリ乳酸－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で薬剤のマイクロカプセル化基質（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌｅ ｍａｔｒｉｃｅｓ）を形成することによって行われる。活性剤のポリマーに対する比および使用される具体的なポリマーの性質に応じて活性剤放出の速度はs制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）が挙げられる。デポ注射可能製剤は、体組織に適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬剤を封入することによっても調製される。

医薬または医薬組成物の投与は、治療的または予防的であってよい。予防的製剤は、創傷の可能性がある部位または、コンタクトレンズ、コンタクトレンズクリーニングおよびリンス溶液、コンタクトレンズの保存または輸送のための容器、コンタクトレンズを扱うためのデバイス、点眼剤、外科的洗浄溶液、点耳薬、眼帯ならびにクリーム、ローション、マスカラ、アイライナーおよびアイシャドウを含む眼の周囲のための化粧品ならびに眼科（ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａｌ）デバイス、外科的デバイス、聴能学デバイスなどの創傷の原因に適用される。

一部の実施形態では、対象は眼（ｏｃｕｌａｒ）の疾患、障害または傷害を有する。網膜のいくつかの一般的な疾患としては、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症および緑内障が挙げられ、それぞれ網膜色素上皮、光受容体および 網膜神経節細胞の変性に関連する［Hartong, et al. 2006 Lancet 368:1795-1809; Rattner et al. 2006 Nat Rev Neurosci 7: 860-872］。対象は、網膜裂孔、網膜剥離、糖尿病性網膜症、網膜上膜、黄斑円孔、黄斑変性症、眼球突出、白内障、ＣＭＶ網膜炎、網膜芽細胞腫、糖尿病黄斑浮腫、眼（ｏｃｕｌａｒ）高血圧、眼（ｏｃｕｌａｒ）片頭痛、網膜剥離、アルカリまたは他の化学物質での熱傷、前房出血、角膜擦過傷、角膜炎、円錐角膜、結膜下出血、増殖性硝子体網膜症、アッシャー症候群およびぶどう膜炎が挙げられる他の疾患および状態を有する場合がある。他の感染、ジストロフィーを有するまたは移植された角膜の拒絶に苦しんでいる対象も処置され得る。

本開示は、本明細書に記載される構築物、構成成分の配置または方法ステップの具体的な詳細に限定されない。本明細書において開示される組成物および方法は、続く開示に照らして当業者に明らかである種々の方法で、作製、実施、使用、実行および／または形成され得る。本明細書において使用される表現法および用語法は、記載のみの目的のためであり、特許請求の範囲の範囲の限定として見なされるべきでない。種々の構造または方法ステップを指すために記載および特許請求の範囲において使用される場合、第１の、第２のおよび第３のなどの序数表示は、そのような構造もしくはステップについていかなる特定の構造もしくはステップまたはいかなる特定の順序もしくは立体配置を指すと解釈されることを意味しない。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書において別に示される、または別に文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書において提供される任意のおよびすべての例または，例示的用語（例えば、「などの」）の使用は、単に開示を容易にする意図であり、別に特許請求されない限り本開示の範囲へのいかなる限定も意味しない。明細書におけるいかなる語および図に示されるいかなる構造も、任意の特許請求されていない要素が開示される主題の実行に不可欠であることを示すとして解釈されるべきでない。用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびこれらの変形の本明細書における使用は、そのあとに列挙される要素およびその等価物ならびに追加的要素を包含することを意味する。ある特定の要素を「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」として列挙される実施形態は、これらのある特定の要素「から本質的になる」および「からなる」としても検討される。

本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別に述べられない限り、この範囲内のそれぞれ別々の値を個々に参照する短縮法として役立つことを単に意図し、それぞれ別々の値は、本明細書において個々に引用されたのと同様に明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲が１％～５０％として述べられる場合、例えば２％～４０％、１０％～３０％または１％～３％などの値が本明細書において明確に挙げられていることが意図される。これらは、具体的に意図されるものの単なる例であり、列挙される最低値および最高値を含めてその間の数値のすべての可能な組合せは、本開示において明確に述べられていると見なされる。具体的に列挙された量または量の範囲を記載するための語「約」の使用は、測定を成すことにおける製作公差、器械誤差および人的誤差などにより考慮され得るまたは必然的に考慮される値などの列挙される値に非常に近い値がその量に含まれることを示して意味する。量を参照するすべてのパーセンテージは、別に示されない限り質量による。

本明細書に引用されるいかなる非特許または特許文献を含む任意の参考文献が先行技術を構成することは承認されていない。特に、別に示されない限り本明細書において任意の文書を参照することが、これらの文書のいずれも米国または任意の他の国における当技術分野の一般的知識の一部を形成するとの承認を構成しないことは理解される。参考文献の任意の考察は著者が主張するものを述べ、出願人は本明細書において引用されるいずれの文書の正確度および妥当性を検証する権利を保持する。本明細書に引用されるすべての参考文献は、明確にそうでないと示されない限り全体が参照により組み込まれる。引用される文献に見出される任意の定義および／または記載の間に相違点がある事象においては、本開示が支配するものとする。

本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕配列番号１に少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１中のＸが任意の可動性リンカー領域を表すアミノ酸配列、または可動性リンカーを介して配列番号５に任意に連結されている配列番号４からなるペプチドに９０％同一性を有するポリペプチドを含むペプチド。
〔２〕アミノ酸配列が配列番号３または、配列番号３に少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記〔１〕に記載のペプチド。
〔３〕配列番号２もしくは配列番号４を含むか、もしくはそれからなるアミノ酸配列を有するペプチドまたは、配列番号２もしくは配列番号４に９０％配列同一性を有するペプチドであって、配列番号２中の各Ｘが任意の可動性リンカー領域を表す、ペプチド。
〔４〕アミノ酸配列が配列番号６または、配列番号６に少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記〔３〕に記載のペプチド。
〔５〕可動性リンカー領域が少なくとも１つのアミノ酸を含む、前記〔１〕または前記〔３〕に記載のペプチド。
〔６〕前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載のペプチドおよび薬剤を含む医薬組成物。
〔７〕薬剤が、ペプチド、組換えタンパク質、抗体、プロテオグリカン、ステロイド、ウイルス、核酸、リボ核タンパク質、低分子治療剤および検出可能な標識からなる群から選択される、前記〔６〕に記載の医薬組成物。
〔８〕薬剤が、抗アポトーシス剤、抗炎症剤、抗血管新生剤および抗線維化剤からなる群から選択される、前記〔６〕～〔７〕のいずれか１項に記載の医薬組成物。
〔９〕薬剤が、Ｘ連鎖アポトーシス抑制タンパク質、デコリン、血管内皮細胞増殖因子に対する抗体、Ｂｃｌ－ｘＬ由来ＢＨ４－ドメインペプチド、ＮＲＦ２およびデキサメタゾンからなる群から選択される、前記〔６〕～〔８〕のいずれか１項に記載の医薬組成物。
〔１０〕薬剤が、遺伝子治療剤または遺伝子編集剤である、前記〔６〕～〔９〕のいずれか１項に記載の医薬組成物。
〔１１〕薬剤が、ウイルスまたは遺伝子治療ベクター、ＣｒｅおよびＣａｓ９タンパク質からなる群から選択される、前記〔１０〕に記載の医薬組成物。
〔１２〕前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔１３〕ウイルスカプシドタンパク質をコードする配列内に挿入されている、前記〔１２〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１４〕前記〔１２〕～〔１３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結されている核酸構築物。
〔１５〕前記〔１４〕に記載の核酸構築物または前記〔１２〕～〔１３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むウイルスであって、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載のペプチドがウイルスカプシドタンパク質内で発現されるウイルス。
〔１６〕ポリヌクレオチドが、ウイルスカプシドタンパク質をコードする配列内に挿入された配列番号２、配列番号３または配列番号６のペプチドをコードする、前記〔１５〕に記載のウイルス。
〔１７〕アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である前記〔１５〕または〔１６〕に記載のウイルス。
〔１８〕ＡＡＶがＡＡＶ９である、前記〔１７〕に記載のウイルス。
〔１９〕ポリペプチド剤をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、前記〔１５〕～〔１８〕のいずれか１項に記載のウイルス。
〔２０〕ポリペプチド剤が、デコリンおよびＮＲＦ２からなる群から選択される、前記〔１９〕に記載のウイルス。
〔２１〕ポリペプチド剤が、抗アポトーシス剤、抗炎症剤、抗血管新生剤、抗線維化剤、遺伝子治療剤および遺伝子編集剤からなる群から選択される、前記〔１９〕に記載のウイルス。
〔２２〕細胞を、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載のペプチドに接触させるステップを含む、細胞または組織への送達の方法であって、ペプチドが細胞透過性ペプチドであり、細胞に進入する方法。
〔２３〕方法が、細胞または組織を薬剤に接触させるステップをさらに含み、ペプチドの非存在下における細胞への送達と比較して、ペプチドが細胞もしくは組織への薬剤の送達を増加させる、または細胞もしくは組織への薬剤の形質導入を可能にする、前記〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕細胞または組織に薬剤を送達するための方法であって、細胞または組織を、前記〔６〕～〔１１〕のいずれか１項に記載の組成物または前記〔１５〕～〔２１〕のいずれか１項に記載のウイルスと接触させるステップを含み、薬剤が細胞または組織の細胞に送達または形質導入される方法。
〔２５〕ペプチドが薬剤にコンジュゲートされておらず、物理的にも連結されていない前記〔２２〕～〔２４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２６〕接触させるステップがｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて行われる、前記〔２２〕～〔２５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２７〕接触させるステップがｉｎ ｖｉｖｏにおいて行われる、前記〔２２〕～〔２５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２８〕接触させるステップが、網膜下注射、硝子体内注射または局所的適用によって行われる、前記〔２７〕に記載の方法。
〔２９〕（ｉ）薬剤および前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載のペプチド；前記〔６〕～〔１１〕のいずれか１項に記載の医薬組成物；前記〔１４〕に記載の核酸；または前記〔１５〕～〔２１〕のいずれか１項に記載のウイルスを含む医薬を製剤化するステップ、ならびに（ｉｉ）細胞または組織の細胞に薬剤を送達または形質導入するための有効量で対象に医薬を投与するステップを含む、対象の細胞または組織に薬剤を送達するための方法。
〔３０〕医薬が、経眼、硝子体内、局所、経脈絡膜、前房内、上脈絡膜、経皮的、網膜下、腹腔内、皮下および静脈内経路からなる群から選択される経路によって投与される、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３１〕対象が眼の変性疾患または眼の傷害を有する、前記〔２９〕～〔３０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔３２〕眼の変性疾患が加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、ぶどう膜炎、緑内障または糖尿病性網膜症である、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３３〕眼の傷害が、アルカリによる熱傷または網膜剥離である、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３４〕細胞または組織が、眼、光受容体、網膜色素上皮、神経節細胞、双極細胞、ミュラー細胞、脈絡膜内皮細胞、水晶体上皮、角膜内皮、角膜実質、線維柱帯網および虹彩からなる群から選択される、前記〔２２〕～〔３３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔３５〕眼の細胞または眼の組織が、網膜または角膜である、前記〔３４〕に記載の方法。
〔３６〕薬剤単独と比較して細胞または組織の細胞への薬剤の送達をペプチドが増加させる、前記〔２２〕～〔３５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔３７〕細胞または組織を、前記〔１５〕～〔２１〕のいずれか１項に記載のウイルスに接触させるステップを含む、細胞または組織にウイルスを送達するための方法であって、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載のペプチドを発現しないウイルスに接触された細胞または組織と比較して、増加した割合で細胞または組織の細胞にウイルスが送達または形質導入される方法。
〔３８〕細胞または組織を、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載のペプチド、およびウイルスに接触させるステップをさらに含む、前記〔３７〕に記載の方法。
〔３９〕（ｉ）前記〔１５〕～〔２１〕のいずれか１項に記載のウイルスを含む医薬を製剤化するステップ、および（ｉｉ）医薬を対象に投与するステップを含む、対象の細胞または組織にウイルスを送達するための方法であって、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載のペプチドを発現しないウイルスに接触された細胞または組織と比較して、増加した割合で細胞または組織の細胞にウイルスが送達または形質導入される方法。
〔４０〕細胞または組織を、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載のペプチド、およびウイルスに接触させるステップをさらに含む、前記〔３９〕に記載の方法。
以下の実施例は、例示的であるのみ意味し、本発明の範囲または添付の特許請求の範囲への限定を意味しない。

（実施例１）
網膜細胞および組織への小および大分子の送達のための新規細胞透過性ペプチドＮｕｃ１
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、問題の組織の生物学的特性を考慮して設計され得る。例えば、ＰＯＤ（眼（ｏｃｕｌａｒ）への送達のためのペプチド）と称される以前に記載されたペプチドは、網膜に豊富に存在するタンパク質、具体的には酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子のグルコサミノグリカン結合領域をモデルとした（Johnson et al., 2010）。グルコサミノグリカンコンドロイチン硫酸は、成体の網膜に豊富に存在することが公知であり（Clark et al., 2011)、ヘパラン硫酸は発生中に網膜に豊富に存在する。タンパク質－グルコサミノグリカン相互作用の分子モデリングは、網膜において検査された最も効率的なＣＰＰの１種であると見出されたＰＯＤの開発をもたらした（Johnson et al., 2010）。競合研究は、ＰＯＤの細胞透過特性が細胞の表面のヘパラン硫酸のレベルによって顕著に影響を受けることが見出されたこと（Johnson et al., 2010）を示し、網膜組織上のヘパラン硫酸プロテオグリカンを網膜のＣＰＰ標的化のための候補成分として同定している。ＣＰＰ機能のためのヘパラン硫酸の重要性は、ベクトセルペプチド（Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）としても公知のＣＰＰの代替形態についても記載されている（De Coupade et al., 2005）。

血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、網膜恒常性において重要な役割を果たしている（Jin et al., 2002; Robinson et al., 2001）。ＶＥＧＦのＶＥＧＦＡ１６５アイソフォームは、高度に塩基性のドメインを含有し、ＶＥＧＦのこのアイソフォームがヘパラン硫酸に富む細胞外基質と相互作用し、局在化することを可能にしている（Krilleke et al., 2009）。ＶＥＧＦＡスプライスバリアント、腎臓上皮細胞由来ＶＥＧＦＡ１６５ｂは、最後の６アミノ酸を除いてＶＥＧＦＡ１６５と同一である。ＶＥＧＦＡ１６５ｂおよびＶＥＧＦＡ１６５は、同様の親和性でＶＥＧＦ受容体１および２に結合する。しかしながら、ＶＥＧＦＡ１６５ｂはヘパラン硫酸に弱く結合するだけであり（Cebe Suarez et al., 2006）、ヘパラン硫酸結合にはＶＥＧＦ１６５のＣ末端（配列番号７ ＣＤＫＰＲＲ）が関連している。

ラミニンは、細胞外基質の大きな基底膜糖タンパク質である。ラミニンは、組織発生、細胞分化、遊走および接着に影響を与える（Aumailley, 2013）。ラミニンは、それぞれα鎖、β鎖およびγ鎖を含有するヘテロ三量体タンパク質である。三量体タンパク質は、他の細胞膜および細胞外基質分子に結合できる十字架様構造を形成するように交差する。これまでに５個のα、４個のβおよび３個のγバリアントが同定された。これらの鎖の異なる組合せは、多数のラミニン分子を生じる。これまでに、およそ１６種のラミニン分子が哺乳動物において同定された。少なくとも７種のラミニン鎖、α３、α４、α５、β２、β３、γ２およびγ３は、光受容体の周囲の基質および第１のシナプス層、網膜介在神経細胞を含む光受容体シナプスに局所していた（Libby et al., 2000）。ラミニンは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む他の基底膜構成分にも結合し、基底層との細胞性相互作用を媒介する。ラミニン－１のカルボキシルグロビュール（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｌｏｂｕｌｅ）に近位の領域（配列番号８ ＣＳＲＡＲＫＱＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲ）は、細胞接着についての活性部位である（Tashiroet al., 1989）。興味深いことに、この領域は、ヌクレオリン（Kibbey et al., 1995）、核および急速に分割する細胞の表面において典型的には見出されるタンパク質にも結合する（Hovanessian et al., 2010; Koutsioumpa and Papadimitriou, 2014; Mongelard and Bouvet, 2007）が、光受容体を含む網膜でも見出される（Hollander et al., 1999）。

本発明者らは、可動性ポリグリシンリンカーを通じて連結されたラミニン－１由来のヌクレオリン結合領域の一部とＶＥＧＦＡ１６５のヘパラン硫酸プロテオグリカン結合領域との組合せからなる新規ペプチド配列が細胞接着および細胞透過特性を有すると仮定した。それにより本発明者らは、そのような特性について配列ＡＳＩＫＶＡＶＳＡＧＧＤＫＰＲＲ（配列番号３）を検証した。本発明者らは、このペプチド、Ｎｕｃ１（配列番号３）が網膜において効率的に機能できることを本明細書において実証したが、それは、細胞外基質および細胞表面特性を網膜組織と共有する他の組織、例えば脳においても機能できる。

材料および方法：
ペプチド合成：蛍光標識されたＮｕｃ１ペプチド配列Ｆｌｕｏ（５／６ＦＡＭ）－ＡＳＩＫＶＡＶＳＡＧＧＤＫＰＲＲ［ＣＯＯＨ］（配列番号３）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって＞９９％の純度で合成された。蛍光標識を持たない同じ配列も合成した。

動物：この試験は、視覚と眼科学研究協会会議（ＡＲＶＯ）によって設定された、視覚および眼科研究における動物の使用についての宣言に従って実施され、タフツ大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、メイン州）から購入し、１２時間の明／暗サイクル下で飼育した。
硝子体内および網膜下注射：ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）、セントジョセフ、ミズーリ州）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｌｌｏｙｅｄ、シェナンドア、アイオワ州）を含むカクテル混合物を腹腔内注射した後、角膜の局所的鎮痛のために０．５％塩酸プロパラカイン（Ａｋｏｒｎ Ｉｎｃ．、レイクフォレスト、イリノイ州、米国）を局所的に適用することにより、マウスを麻酔した。麻酔中、マウスを保温した。硝子体内および網膜下注射は、以前に記載されたように（Cashman et al., 2015）、３２ゲージの針と５μｌのガラス製シリンジを使用して実行した。Ｎｕｃ１取込み実験については、注射されたペプチドの量が結果に示されている。ｍＣｈｅｒｒｙの取込みに対するＮｕｃ１の効果を試験するために、結果に記載されているようにして、１μｌのｍＣｈｅｒｒｙ（４μｇ）をＮｕｃ１と共に、またはＮｕｃ１を伴わずに硝子体内注射した。注射の４時間後（表示のように）、眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。１眼あたり合計１μｌのＡＡＶ（結果に記載されている用量）をＮｕｃ１と共に、またはＮｕｃ１を伴わずに硝子体内および網膜下に注射した。Ｍｉｃｒｏｎ ５５０クライオスタットを用いて網膜凍結切片を取得した。

レーザー誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）：レーザー光凝固術を以前に記載されたようにして行った。簡単に説明すると、鎮静させたマウスの瞳孔を２．５％フェニレフリンＨＣｌ（Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ）および１％トロピカミド（Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ）で拡張させた。角膜の不快感を最小限に抑えるために、２．５％のハイパーメロース（Ｇｏｎｉｏｖｉｓｃ）を適用した。直径７５μｍのスポットサイズ、３３０ｍＨ、パルス時間１００ｍｓに設定したアルゴンレーザー（５３２ｎｍ、ＩＲＩＳ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ＩＲＩＤＥＭ；ＩＲＩＤＥＸ）を使用して、眼ごとに４つのレーザースポットを生成した。

レクチンおよびα－アクチン染色：光凝固の７日後、動物をＣＯ₂で安楽死させ、眼を摘出した。眼杯を固定し、水晶体と角膜を除去した。０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した後、網膜を除去し、強膜／脈絡膜／ＲＰＥ複合体をＰＢＳで洗浄した。眼杯をＰＢＳ中の５％ＢＳＡでブロックし、ＰＢＳ中１００μｇ／μＬのフルオレセインをコンジュゲートしたイソレクチン（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）で１時間染色した。次に、眼杯をＰＢＳで５分間３回洗浄し、１：２００希釈のＣｙ３をコンジュゲートした抗α－ＳＭＡマウスモノクローナル抗体（Ｃ６１９８、Ｓｉｇｍａ）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、眼杯をＰＢＳで５分間３回洗浄し、スライドガラスにフラットに載せ、関連するフィルターを備えた倒立顕微鏡（ＩＸ５１；Ｏｌｙｍｐｕｓ）、デジタルカメラ（Ｒｅｔｉｇａ ２０００Ｒ－ＦＡＳＴ；Ｑ－Ｉｍａｇｉｎｇ）、およびＱＣａｐｔｕｒｅ Ｐｒｏソフトウェア（Ｑ－Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用して画像化した。ＣＮＶ領域の画像は蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で撮影した。ＣＮＶの面積はＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して測定した。

細胞培養：継代ＨＥＫ２９３細胞培養は１５ｃｍプレート上、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｉｅｓ、サウスローガン、ユタ州）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。指数関数的増殖期を維持するために細胞を３～４日ごとに継代した。

ベクター構築物：ＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰおよびＡＡＶ－Ｎｕｃｌ－ＧＦＰウイルスを生成するために、ｐＡＡＶ９／ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドをＤｒａｌｌｌで消化し、１．４ｋｂのｃａｐ ＤＮＡフラグメントをゲル抽出してｐＢＳｘ中にクローニングし、ｐＢＳｘ１．４を生成した。ペプチドのためのＤＮＡ配列は商業的に合成した。これらの配列をＴｔｈｌｌｌ１およびＢａｍＨＩを用いた制限酵素消化によってｐＢＳｘ１．４（１．４ｋｂキャップ領域を含む）中にクローニングし、ｐＰＢＳｘ１．４８およびｐＢＳｘ１．４Ｎを生成した。最後に、ｐＰＢＳｘｌ．４８とｐＢＳｘ１．４ＮをＳｂｆｌとＢｓｉＷＩで消化し、１．４ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル抽出して、逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含むｐＡＡＶ２／９ｒｅｐ－ｃａｐ中にクローニングし、ｐＡＡＶ２／９ＩＫＶとｐＡＡＶ２／９Ｎｕｃ１を生成した。

組換えＡＡＶの産生および精製：ＡＡＶウイルスは、以前に記載されたプロトコルの修正版を使って生成した（Birke et al., 2014）。トランスフェクションは、上記のＡＡＶプラスミドのリン酸カルシウムトリプルトランスフェクションを使用して行った。簡単に説明すると、１５ｃｍプレートで増殖させた８０～９０％コンフルエントのＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの２時間前にＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳに変更した。２：１：１の比率の適切な量のプラスミド（ヘルパープラスミド：シスプラスミド：トランスプラスミド）を、リン酸カルシウム法を使用して沈殿させ、２０枚のプレートに滴下して加えた。トランスフェクションの２４時間後に培地をＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳに交換した。トランスフェクションの９６時間後に細胞と培地を回収した。収集した細胞ペレットを溶解し、１４ｍｌの清澄化した溶解物を次の順序で充填したイオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）溶液の勾配に適用した：４ｍｌの１５％、９ｍｌの２５％、９ｍｌの４０％、および５ｍｌの５４％イオジキサノールを４０ｍｌのＱｕｉｃｋ－Ｓｅａｌ遠心分離チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、パロアルト、カリフォルニア州）に充填。チューブを７０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中、１８℃、６９，０００ｒｐｍで遠心分離し、４０％イオジキサノール層から４ｍｌの分画溶液を除去した。画分をさらにダイアフィルトレーションし、最終乳酸リンガー溶液を使用して濃縮し、グリセロールを５％まで添加した。次に、画分を等分し、将来の使用のために－８０℃で保存した。

ＡＡＶの滴定：ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰプラスミドをＳｍａｌで消化し、ゲル抽出して、ＧＦＰ導入遺伝子の標準曲線を作成した。ＡＡＶをＤＮａｓｅｌで消化してゲノムＤＮＡを除去し、さらにプロテイナーゼＫと共にインキュベートしてＡＡＶカプシドを消化した。ＤＮＡはフェノール－クロロホルム法を使用して抽出および精製し、ＴＥ緩衝液中に溶解させた。２×１０⁴ゲノムコピーから２×１０⁸ゲノムコピーまでの範囲の標準曲線を作成した。標準曲線に対してウイルスを定量化するために定量的ＰＣＲを行った。

免疫組織化学：網膜細胞の免疫組織化学を行うために、クリオスタット網膜切片をＰＢＳで１５分間再水和し、ＰＢＳ中の６％正常ヤギ血清でブロックするか、Ｍｏｕｓｅ Ｏｎ Ｍｏｕｓｅ Ｋｉｔを使用して１時間ブロックし、ＰＫＣ（双極細胞）に対する適切な一次抗体と共に湿室中で一晩インキュベートした。続いて、切片を洗浄し、Ａｌｅｘ－ｆｌｕｏｒ ５４４または４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州）で標識した二次抗体と共にインキュベートして、それぞれの抗体を網膜切片中で局在化させた。スライドをＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ－ＤＡＰＩ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を含む退色防止培地中にマウントして核を対比染色し、Ｌｅｉｃａ共焦点顕微鏡で画像を撮影した。

結果
Ｎｕｃ１は硝子体内注射後に網膜組織と細胞に透過する
Ｎｕｃ１ペプチドが硝子体内注射後に網膜に透過して網膜細胞内に入ることができるかどうかを調べるために、発明者らはＮｕｃ１を蛍光色素ＦＡＭで蛍光標識し、１μｌのＨ₂Ｏに懸濁した合計１μｇのＮｕｃ１を成体（６週齢）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの硝子体に注射した。注射の４時間後に、これらのマウスの眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。網膜凍結切片はＭｉｃｒｏｎ ５５０クライオスタットを使用して作製し、蛍光顕微鏡を用いて切片を画像化した。発明者らは、６－ＦＡＭは網膜に透過できないが（データは示さず）、ＦＡＭで標識したＮｕｃ１は神経節細胞層（ＧＣＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）、外顆粒層（ＯＮＬ）、内側セグメント（ＩＳ）および外側セグメント（ＯＳ）を含む網膜のすべての層に局在化することを見出した（図１Ａ）。これらの凍結切片をチューブリン（図１Ｂ）、プロテインキナーゼＣ（図１Ｃ）、桿体オプシン（図１Ｄ）、またはグルタミン合成酵素（図１Ｅ）を標的とする抗体で共染色したところ、Ｎｕｃ１が神経節細胞、双極細胞、光受容体、ミュラー細胞をそれぞれ標的にすることが明らかになった。興味深いことに、Ｎｕｃ１の網膜への透過は、ＰＯＤを含む発明者らが以前に記載した網膜透過ペプチドのいずれよりも実質的に優れていた（Binder et al., 2011; Johnson et al., 2010）。発明者らの知る限り、Ｎｕｃ１は以前に記載された網膜の細胞透過性ペプチドと比較して、優位な網膜透過性を有している。

Ｎｕｃ１は組換えタンパク質の網膜への透過を促進する
硝子体に注射された大きな機能性タンパク質は一般に、網膜の奥深くまで透過せず、網膜細胞の原形質膜を通過しない。異種タンパク質に物理的に結合したＰＯＤなどの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の使用は、この固有の制限を克服しうる（Johnson et al., 2010）。しかしながら、ＰＯＤおよびその他のＣＰＰは一般に、原形質膜を横切る送達のために異種タンパク質への化学的なコンジュゲーションを必要とするが、タンパク質へのそのような改変はタンパク質の機能に悪影響を与えるおそれがある。発明者らは、異種タンパク質がＮｕｃ１へのコンジュゲーションを必要とせずに網膜細胞に送達されうると仮定した。この仮説をテストするために、４μｇの組換え赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ）と１μｇのＦＡＭ標識Ｎｕｃ１を成体（６週齢）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの硝子体に同時注射した。４時間後、組織を上記のように処理した。単独で注射した場合、網膜組織または細胞へのｍＣｈｅｒｒｙの有意な透過は見られなかったが（図２Ｆ）、ＦＡＭ標識Ｎｕｃ１と同時注射したｍＣｈｅｒｒｙは、さまざまな網膜細胞、最も大量にはＯＮＬへのｍＣｈｅｒｒｙの有意な取込みを示した（図２Ａ）。特に、ＦＡＭのシグナル（緑）とｍＣｈｅｒｒｙのシグナル（赤）の共局在（黄色）が、網膜のＯＮＬ内の多くの細胞で検出された（図２Ａ）。

ＦＡＭで標識されたＮｕｃ１を非標識のＮｕｃ１に置き換えてｍＣｈｅｒｒｙと同時注射すると、ｍＣｈｅｒｒｙの強い取込みが再び観察され、ＲＦＰのシグナルがＦＡＭチャネルからのブリードスルーの結果ではないことが示された（図２Ｂ～２Ｅ）。網膜切片をチューブリン（図２Ｂ）、ＰＫＣ（図２Ｃ）、グルタミン合成酵素（図２Ｄ）または錐体オプシン（図２Ｅ）に対する抗体で共染色したところ、ｍＣｈｅｒｒｙが神経節細胞、双極細胞、ミュラー細胞、錐体光受容体にそれぞれ局在化することが明らかになった。マウスの眼のサイズが小さいため、動物間で多少のばらつきが見られたが、すべての網膜がＯＮＬにおいて最も強いシグナルを示した。

Ｎｕｃ１は網膜へのＸＩＡＰタンパク質の送達を促進し、アポトーシスを減弱させる
次に、発明者らはＮｕｃ１の特性が潜在的に治療的な意義を有する異種タンパク質に適用できるかどうかを調査した。プログラム細胞死またはアポトーシスは、網膜色素変性症などの疾患における網膜変性の結果として活性化される一般的な経路である（Cottet and Schorderet, 2009）。トランスジェニック動物またはウイルス遺伝子送達を使用した以前の研究は、Ｘ連鎖アポトーシス阻害タンパク質（ＸＩＡＰ）などのアポトーシス阻害因子の発現の上昇が、網膜変性のさまざまな動物モデルで網膜変性を減弱させることを見出している（Leonard et al., 2007）。導入遺伝子送達の代替策として、網膜変性疾患の治療のためのＸＩＡＰタンパク質の送達が想定されうる。この治療法は、組換えタンパク質（例えば、アフリベルセプト）を硝子体内に注射してＶＥＧＦを標的化する、滲出型の加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ、以下を参照）の現在の標準治療に類似している。遺伝子送達と比較して、タンパク質送達は投薬レジメンに関して、より容易に用量設定されうる。マウスにＮ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素（ＭＮＵ）を腹腔内注射すると、網膜の外顆粒層（ＯＮＬ）にアポトーシスが選択的に誘導されるため、このモデルはアポトーシス阻害剤の有効性をテストするために役立つ（Petrin et al., 2003）。

精製した機能的組換えヒトＸＩＡＰを硝子体内注射によって網膜細胞に送達し、網膜におけるＭＮＵ誘導アポトーシスを阻害しうるという仮説をテストするために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、６～８週齢）に１．４μｇの組換えヒトＸＩＡＰ（ｎ＝６眼）を硝子体内注射、またはＸＩＡＰを０．４μｇのＮｕｃ１と同時注射した（ｎ＝６眼）。４時間後、マウスに５０ｍｇ／１ｋｇのＭＮＵを腹腔内注射した。一部のマウスには、網膜におけるバックグラウンドのアポトーシスの基準として、ＰＢＳのみを腹腔内注射した。さらに２４時間後、マウスの眼を摘出し、上記のように処理した。アポトーシス細胞を検出するために、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＴＭＲ Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ）を使用し、製造元の指示に従って、末端デオキシヌクレオチド転移酵素媒介ｄＵＴＰ－ビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）法を凍結切片に対して行った。以前に記載されているようにして眼の切片を画像化し、ＩｍａｇｅＪ（ＦＩＪＩバージョンおよびプラグイン）を使用して、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の定量化に使用した（Maidana et al., 2015）。

予想された通り、ＭＮＵの腹腔内注射は、ＰＢＳを注射した動物と比較して、この群の動物のＴＵＮＥＬ陽性細胞の数が多いことから明らかなように、ＯＮＬに広範なアポトーシスを誘導した（図３）。ＭＮＵ注射の前にＸＩＡＰタンパク質のみを（硝子体内に）注射した眼は、ＭＮＵのみと比較して、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数に有意な減少（２．２％、ｐ＝０．９９０２）を示さなかった（図３Ａ）。言い換えれば、ＸＩＡＰ自体はＯＮＬにおけるアポトーシスを有意に減弱させなかった。対照的に、ＭＮＵ注射の前に組換えＸＩＡＰタンパク質とＮｕｃ１を（硝子体内に）同時注射した動物は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数の有意な減少（６５．７％、ｐ＜０．０００１）を示した。これは、機能的なＸＩＡＰタンパク質が網膜に透過し、ＯＮＬのアポトーシスを阻害することをＮｕｃ１が可能とすることを実証している。特に、発明者らは以前の研究において組換えＸＩＡＰタンパク質を網膜に送達し、ＭＮＵ誘導アポトーシスを阻害できることを示しているが、この現行の研究では、試薬の送達のためにＸＩＡＰを化学的にコンジュゲートする必要がなかった。したがって、この研究は、網膜細胞への機能的タンパク質送達の開発における重要な進歩を明らかにしている（Talreja et al., 2018）。

Ｎｕｃ１と同時注射すると機能的なＸＩＡＰが網膜に送達されうることを実証したので、発明者らは、網膜アポトーシスの別のモデルに発明者らの発見を適用できるかどうかをテストしたいと考えた。裂孔原性、牽引性、および滲出性の網膜剥離は、失明のリスクと関連している。網膜剥離は、網膜の外側と内側の網膜細胞のアポトーシスを引き起こす（Arroyo et al., 2005）。発明者らは、Ｎｕｃ１と組換えＸＩＡＰの組合せが、網膜剥離のマウスモデルにおいて網膜細胞のアポトーシスを阻害しうるという仮説を検証したいと考えた。発明者らは、この仮説をテストするために５μｌのガラス製シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）に接続した３２Ｇの針を使用して、網膜下腔に３μｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）のヒアロウロン酸ナトリウム（Ｈｅａｌｏｎ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ、スウェーデン）を注射することにより、マウスの網膜に剥離を生じさせた。網膜剥離の翌日、動物に１．４μｇのＸＩＡＰと０．４μｇのＮｕｃ１を硝子体内に同時注射した。７２時間後、眼を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｍｉｃｒｏｎ ５５０クリオスタットを使用して凍結切片を採取し、上記のようにＴＵＮＥＬで染色した。Ｎｕｃ１とＸＩＡＰの組合せを網膜に注射した場合、Ｈｅａｌｏｎのみの対照と比較して、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数がおよそ６０％（ｐ＝０．００６１）減少することを発明者らは見出した（図３Ｂ）。

Ｎｕｃ１は網膜への抗体の送達を促進する
上記の発明者らの結果は、組換えタンパク質が網膜疾患の潜在的な治療に容易に利用できることを示唆しているが、滲出型の加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療のための現在の臨床標準治療は、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ラニビズマブまたはアバスチン）の毎月の硝子体内注射を含んでいる（Comparison of Age-related Macular Degeneration Treatments Trials Research et al., 2012）。Ｎｕｃ１が網膜の細胞または組織への抗体の送達を改善できるかどうかを決定するために、発明者らは滲出型ＡＭＤのマウスモデルにおける抗ＶＥＧＦ抗体の治療有効性を調べた。３３０ｍＷの出力と１００ｍｓの持続時間で視神経乳頭の周りに４つのレーザースポットを適用することによって、レーザー誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を発生させた。続いて、０．３ｎｇの抗ＶＥＧＦ抗体のみ、または０．３μｇの抗ＶＥＧＦ抗体と１μｇのＮｕｃ１を組み合わせてマウスに硝子体内注射した。これらの試験で利用した抗ＶＥＧＦ抗体の量は、パイロット試験によって決定した（すなわち、３μｇから０．３μｇの抗ＶＥＧＦの滴定、データは示さず）。用量は、抗ＶＥＧＦ抗体単独ではレーザー誘発ＣＮＶを有意に阻害できないように計算した。レーザー処置の７日後に眼を採取し、ＦＩＴＣにコンジュゲートしたグリフォニアシンプリシフォリアレクチンＩで染色したＲＰＥ／脈絡膜のフラットマウントを調製した。レーザースポットは蛍光顕微鏡で画像化し、レーザースポットの面積はｌｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。発明者らは、抗ＶＥＧＦ抗体単独と比較して、抗ＶＥＧＦ抗体をＮｕｃ１と同時注射した場合、ＣＮＶスポットのサイズが有意に減少すること（＞６０％；ｐ＜０．０００１）を見出した（図４Ａ）。したがって、Ｎｕｃ１の硝子体内投与は、レーザー誘発ＣＮＶに対する抗ＶＥＧＦ抗体の透過と有効性を大幅に向上させる。Ｎｕｃ１のこの特性は、より多く、またはより少ない量が治療効果を達成するために必要とされるように、抗体の所与の用量の効力を変更して、抗体の有効性を増強または低減するために有用となりうる。

抗体の硝子体内注射は、滲出型ＡＭＤの現在の臨床標準治療であるが、患者にとっては侵襲的で「不快な」処置であり、網膜剥離および眼内炎と関連している。さらに、それは一般的に高齢者である患者の眼科医への頻繁な訪問を必要とし、患者のコンプライアンスの低下を導く。したがって、薬物の局所的投与が、好ましい薬物送達へのアプローチとなるであろう。発明者らは、Ｎｕｃ１が局所的に適用された抗ＶＥＧＦ抗体の効力を増強できるかどうかを調べた。眼に局所的に適用した場合の抗体の透過が著しく制限されることを説明するために、発明者らは、硝子体内注射と比較して、より高用量の抗体を利用した。具体的には、１．８μｇの抗ＶＥＧＦ抗体単独または１．８μｇの抗ＶＥＧＦ抗体と４μｇのＮｕｃ１を組み合わせて投与した。レーザー誘発ＣＮＶに続いて、抗体とＮｕｃ１を含む局所点眼剤を１日２回、１０日間にわたって角膜に適用した。Ｎｕｃ１の局所的送達は、局所的に適用された抗ＶＥＧＦ抗体の有効性を有意に高め、抗体単独と比較して、レーザー誘発ＣＮＶのサイズを約６０％（ｐ＜０．０２）縮小させた（図４Ｂ）。したがってＮｕｃ１は、滲出型ＡＭＤのレーザー誘発モデルにおいて局所的に適用された抗体の効力を有意に増強する。

Ｎｕｃ１は角膜へのデコリンタンパク質の送達を促進し、線維症を抑制する
眼の組織へのタンパク質送達のプラットフォームとしてのＮｕｃ１の潜在性をさらに評価するために、発明者らは眼疾患の別のモデルを調査した。角膜のアルカリによる熱傷は、線維症、血管新生、および炎症を引き起こし、治療せずに放置した場合には、視力の著しい喪失が生じる。デコリンは、抗血管新生および抗線維化特性を有することが知られているプロテオグリカンである（Gubbiotti et al., 2016; Jarvelainen et al., 2015）。

線維症の治療のために角膜へのデコリンの透過を助けるＮｕｃ１の能力をテストするために、マウスを麻酔し、右眼の中心角膜に１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を染み込ませた２ｍｍ濾紙ディスクを３０秒間適用することにより、角膜にアルカリによる熱傷を誘発した。濾紙を穏やかに取り除き、角膜をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０回すすいだ。ＮａＯＨへの曝露の２４時間後にＰＢＳ、デコリン（０．５μｇ）、またはデコリン（０．５μｇ）＋Ｎｕｃ１（０．５μｇ）の局所的適用を開始した。処置は７日間、１日１回局所的に適用した。７日後、ＣＯ₂吸入によりマウスを屠殺した。眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。Ｍｉｃｒｏｎ ５５０クリオスタットを使用して角膜凍結切片を採取し、線維症のマーカーであるα－アクチンについて染色した。発明者らは、デコリン単独の局所的適用が、ＰＢＳと比較してα－アクチン染色を３３．３％（ｐ＜０．０２５）減少させる一方、デコリン＋Ｎｕｃ１の適用は、ＰＢＳと比較して４６．２％（ｐ＜０．００２８）のα－アクチン染色の減少をもたらすことを見出し、Ｎｕｃ１がデコリンの抗線維化効力を増強することが実証された（図５Ａ）。これらの有望な結果をふまえ、角膜への化学熱傷後の血管新生、線維症および炎症を治療する目的で、角膜へのデコリンの送達のためのＮｕｃ１の使用に関する、より詳細な試験を引き続き行った（実施例２を参照）。

さらに発明者らは、前のセクションで説明した滲出型ＡＭＤのマウスモデルであるレーザー誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を使用して、Ｎｕｃ１がマウスのデコリンの効力を高めることができるかどうかを調べた。レーザー処置の直後に、マウスに０．５μｇのヒト組換えデコリンを単独で、またはＮｕｃ１ペプチド（０．５μｇ）と組み合わせて硝子体内注射し、７日後に眼を採取した。網膜色素上皮（ＲＰＥ）をグリフォニアシンプリシフォリアイソレクチンで染色することによりＣＮＶ増殖のサイズを測定し、α－アクチンを染色することにより線維症を測定した（α－ＳＭＡ、図５Ｂ）。発明者らは、対応のないＴ検定を使用して、デコリンおよびデコリン＋Ｎｕｃ１処置群で、ＣＮＶ領域（イソレクチン、ｐ＜０．００７２）および線維症（α－ＳＭＡ、ｐ＜０．０００１）の統計的に有意な減少を発見した（図５Ｃ）。特に、デコリン単独と比較して、Ｎｕｃ１の存在下ではＣＮＶと線維症がおよそ７０％減少し、これは、Ｎｕｃ１がレーザー誘発ＣＮＶと線維症の影響を改善する際にデコリンの透過と効力を高めることを強く示唆している。

Ｎｕｃ１は網膜へのペプチドと低分子の送達を促進する
タンパク質全体よりも大幅に小さな分子は、治療剤として働く可能性がある。例えば、Ｂｃｌ－ｘＬのＢＨ４ドメインペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗アポトーシス活性を持つことが知られている（Rong et al., 2009）。しかしながら、ＢＨ４は細胞に透過する重要な特性を有しているようには見えない。したがって、いくつかのグループが、細胞透過性ペプチドＴＡＴとの化学的結合によって、ＢＨ４を細胞に送達した（Donnini et al., 2009; Hotchkiss et al., 2006; Park, 2011）。Ｎｕｃ１が化学結合を必要とせずに網膜におけるＢＨ４の取込みを促進できるかどうかを調べるために、発明者らは６週齢のＣ５７ＢＵ６Ｊマウスに４μｇの蛍光標識ＢＨ４ペプチドのみ、または４μｇの標識ＢＨ４ペプチドを４μｇのＮｕｃ１と組み合わせて、硝子体内に注射した。ＢＨ４ペプチド自体は網膜への取込みが制限されていたが、ＢＨ４をＮｕｃ１と組み合わせると、蛍光標識されたＢＨ４ペプチドの取込みに有意な定性的増加が見られた（図６Ａ）。

ステロイドを含む低分子は、抗炎症剤として働くことができる。しかしながら、デキサメタゾンなどのステロイドは、硝子体に注射すると、白内障の形成や眼圧上昇の誘発を含む、重大な副作用を生じる（Phulke et al., 2017; Pleyer et al., 2013; Zhang et al., 2018）。発明者らは、Ｎｕｃ１がステロイドの組織への透過を促進し、有効性を失うことなくステロイドを低用量で適用できるようにしうると仮定した。この仮説をテストするために、発明者らは１μｇの蛍光標識デキサメタゾンを単独で、または１μｇの蛍光標識デキサメタゾンを１μｇＮｕｃ１と組み合わせて注射した。発明者らは、デキサメタゾン単独とＮｕｃ１を含むデキサメタゾンの両方が、網膜に取り込まれることを見出した。しかしながら、デキサメタゾンの取込みは、Ｎｕｃ１と同時注射した場合のほうが定性的に大きかった（図６Ｂ）。

Ｎｕｃ１はｉｎ ｖｉｖｏにおいて網膜細胞のウイルス感染を促進する
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの組換えウイルスは、組換え遺伝子を網膜に送達するための優れたビヒクルである（Bennett, 2017）。しかしながら、「治療的」なレベルで細胞の形質導入を達成するには、一般に高力価のウイルスが必要とされる。網膜下および硝子体内の区画の免疫隔離的性質にもかかわらず、これらの領域における組換えＡＡＶに対する免疫応答がこれまでに多く記述されている（Boyd et al., 2016; Kotterman et al., 2015; Reichel et al., 2017）。ウイルスの投与量が少ないほど、一般的に免疫応答が低下する。発明者らは、Ｎｕｃ１がＡＡＶ感染の効力を高め、その結果、高用量（より高い用量）のウイルスの必要性を減らすことができるかどうかを判断するために、ＧＦＰ（ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ）を発現する組換えＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ９カプシドシュードタイプ；ＡＡＶ２／９）を成体Ｃ５７／Ｂｌ６Ｊマウスの眼に注射した。予想された通り、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰの網膜下送達は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）および光受容体における導入遺伝子（ＧＦＰ）の発現を可能とした（図７Ａ）。驚いたことに、ＡＡＶ２／９を１μｇのＮｕｃ１と同時注射した場合、導入遺伝子の発現はＡＡＶ２／９を単独で注射した場合よりも定性的に優れていた（図７Ａ）。

対照的に、ＡＡＶ２／９を硝子体内に注射した場合、網膜の内側または外側に感染は生じなかった（図７Ｂ）。しかしながら発明者らは、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ懸濁液に１μｇのＮｕｃ１を添加すると、ＯＮＬを含む網膜の内側と外側への感染力が増強されることを見出した（図７Ｂ）。感染におけるこの改善は、生存動物の眼底撮影法（図７Ｃ）で観察できるように、網膜の全域で変動し、まだらに生じていた。ウイルス感染の定量化は、ＲＴ－ＰＣＲによって行った（以下を参照）。

ＡＡＶカプシドへのＮｕｃ１の組込みは感染を有意に増強しない
Ｎｕｃ１配列をＡＡＶカプシドの外被に組み込み、外部ペプチドの必要性を排除した場合にＡＡＶ２／９がより効果的となるかどうかを決定するために、発明者らはＡＡＶ９のＶＰ１カプシド中にＮｕｃ１配列（両端にグリシンを隣接させたもの）を含むＧＦＰ発現組換えＡＡＶ２／９を生成した。Ｎｕｃ１配列を（Khabou et al., 2016）の定義によるアミノ酸５８８と５８９の間に挿入し、ＡＡＶ－Ｎｕｃ１－ＣＡＧ－ＧＦＰを生成した。この改変は、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰと比較して、網膜下経路によるウイルスの感染力の有意な増強を導かなかった（図８Ａ）。さらに、ＡＡＶ－Ｎｕｃ１－ＣＡＧ－ＧＦＰは、硝子体内注射後に網膜の内側または外側に感染しなかった（図８Ｂ）。しかしながら、硝子体内経路を介してＮｕｃ１ペプチドと同時注射すると、ＡＡＶ－Ｎｕｃ１－ＣＡＧ－ＧＦＰの感染を増強できたが（図８Ｃ）、調査した網膜のいくつかでは、網膜の外側におけるＧＦＰの発現が非常に限られており、この結果は非常にむらのあるものであった（図８Ｃ、ＧＦＰ挿入図）。この結果の考えられる説明の１つは、Ｎｕｃ１ペプチドとウイルスカプシド中のＮｕｃ１配列との間の競合である。実際、Ｎｕｃ１の量が多いと、全体的なＡＡＶ－Ｎｕｃ１－ＣＡＧ－ＧＦＰの感染力の低下が導かれた（データは示さず）。

網膜透過性ＡＡＶ
Ｎｕｃ１中のＶＥＧＦＡ１６５のヘパラン硫酸結合領域がウイルスの感染性に干渉するかどうかを決定するために、発明者らはヘパラン硫酸結合配列を削除したバージョンのＡＡＶ－Ｎｕｃ１－ＣＡＧ－ＧＦＰを生成し、ラミニン－１由来の部分配列ＡＳＩＫＶＡＶＳＡ（配列番号４）をウイルスが含むようにした。この短い配列の両端にグリシン残基を隣接させて、配列ＧＡＳＩＫＶＡＶＳＡＧ（配列番号６）を形成し、上記のように、ＡＡＶカプシドのアミノ酸５８８と５８９の間に同様にクローニングして、ＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰと呼ばれるウイルスを形成した。６週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰを網膜下注射すると、網膜細胞の感染が有意に改善することを発明者らは見出した（図９Ａ～９Ｄ）。桿体オプシン（図９Ａ）、錐体オプシン（図９Ｂ）、グルタミン合成酵素（図９Ｃ）、ＰＫＣ（図９Ｄ）によるＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰ感染網膜切片の対比染色は、ＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰが桿体細胞、錐体細胞、ミュラー細胞、双極細胞にそれぞれ感染することを明らかにした。

驚いたことに、ＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰを６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに硝子体内注射した場合、錐体オプシン（図１０Ａ）、桿体オプシン（図１０Ｂ）、ＰＫＣ（図１０Ｃ）またはチューブリン（図１０Ｄ）で対比染色した切片は、ＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰが錐体光受容体、桿体光受容体、双極細胞、および神経節細胞にそれぞれ感染することを明らかにした。いくつかの網膜では、グルタミン合成酵素との共染色に基づき、一部の領域においてミュラー細胞も陽性であることが観察された（図１０Ｅ）。

発明者らは次に、Ｎｕｃ１との同時投与により、ＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰの硝子体内注射をさらに強化できるかどうかを検討した。上記の発明者らの研究は、ウイルスカプシドに組み込まれた完全なＮｕｃ１配列が、Ｎｕｃ１ペプチドと同時投与された場合には、おそらく細胞侵入の競合のために阻害されることを示唆していた。不完全なＮｕｃ１配列をカプシドに組み込んだ場合には、硝子体内注射されたＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰが、これまでに観察された最も強力な網膜への感染を示し、網膜全体で強力な発現が生じることを発明者らは見出した（図１１Ａ）。図１１Ａの四角で囲まれた領域を詳しく調べると、高密度の光受容体、ＲＰＥ、そして驚くべきことに脈絡膜がＧＦＰ陽性であることが明らかになった（図１１Ｂ）。生存動物の眼底撮影法は網膜のかなりの領域にわたるＧＦＰを明らかにしており、ＧＦＰ発現のこのパターンは特定の領域に限定されたものではなかった（図１１Ｃ）。さらに、図１１Ｂの四角で囲まれた領域のより長い露出は、ＯＮＬやＲＰＥよりは大幅に少ないものの、内網状層（ＩＰＬ）と神経節細胞層（ＧＣＬ）もＧＦＰ陽性であることを明らかにした（図１１Ｄ）。双極細胞のＰＫＣによる対比染色は、ＯＮＬおよびＲＰＥに加えて、ＧＦＰ陽性の豊富な数の双極細胞を明らかにした（図１１Ｅ）。

硝子体内に注射したさまざまなウイルス構築物から発現されるｍＲＮＡのレベルを測定するために、発明者らは網膜組織において定量ＲＴ－ＰＣＲを行った。発明者らは、Ｎｕｃ１が試験した各ウイルスからのｍＲＮＡ発現レベルを有意に増強することを見出した。ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ単独から発現されたレベルと比較して、Ｎｕｃ１の同時注射はｍＲＮＡレベルをおよそ４．３倍増強した。Ｎｕｃ１はまた、ＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰの発現もおよそ８．５倍増強した。（図１１Ｆ）。ＡＡＶ－ＧＦＰと比較して、ＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰ＋Ｎｕｃ１はおよそ３００倍高いｍＲＮＡレベルを有していた。したがって、Ｎｕｃ１は組換えＡＡＶの感染を増強し、ＡＡＶカプシドに部分的なＮｕｃ１配列を組み込むことと組み合わせた場合に、発明者らは硝子体内経路を介した感染の最大の相対的増加を観察した。

硝子体内ＡＡＶ送達を介した網膜の外側における酸化ストレスの阻害
ＮＲＦ２（核因子赤血球２ ｐ４５関連因子２）は、傷害および炎症によって引き起こされる酸化的損傷から保護する抗酸化タンパク質の発現を調節するマスター転写因子である。２５０以上の遺伝子がＮＲＦ２の標的とされる。ホメオスタシス状態においてＮＲＦ２は、ユビキチン化によってＮＲＦ２を分解するケルク様ＥＣＨ関連タンパク質１（ＫＥＡＰ１）およびカリン３によって細胞質に隔離されている。酸化ストレスはユビキチン化を妨害し、ＮＲＦ２はその後、核に移行して、多くの抗酸化遺伝子の上流プロモーター領域にある抗酸化応答エレメント（ＡＲＥ）に結合し、それらの転写を開始させる。ＮＲＦ２の発現は、ＡＭＤ、網膜色素変性症、緑内障、ブドウ膜炎、および糖尿病性網膜症を含む網膜変性のさまざまな動物モデルにおいて、ならびにアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、およびフリードライヒ運動失調症を含む多くの老化疾患において、治療に役立つことが以前に見出されている。

ＭＮＵの腹腔内注射は、網膜において重大な酸化ストレスを引き起こす。核およびミトコンドリアのＤＮＡでは、８－ヒドロキシ－２－デオキシグアノシン（８－ＯＨｄＧ）がフリーラジカル誘発性酸化病変の主要な形態の１つであるため、このマーカーは酸化ストレスのバイオマーカーとして広く使用されている。発明者らは、Ｎｕｃ１と組み合わせたＡＡＶ－ＩＫＶバックボーンが、硝子体内経路を介してマウスの網膜の外側にヒトＮｒｆ２導入遺伝子を送達し、ＭＮＵによって誘発される酸化ストレスを阻害できるかどうかを決定したいと考えた。この仮説をテストするために、成体Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスにＡＡＶ－ＩＫＶ－Ｎｒｆ２（プラスＮｕｃ１）、または陰性対照としてＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰ（プラスＮｕｃ１）を硝子体内注射した。導入遺伝子発現の３週間後、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのＭＮＵを注射した。眼を２４時間後に採取し、上記のようにして処理し、８－ＯＨｄＧ、ＧＦＰ、またはＮｒｆ２の存在について染色した。発明者らは、ＡＡＶ－ＩＫＶ－Ｎｒｆ２を注射したＣ５７／Ｂｌ６Ｊの眼がＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰの眼と比較して、有意に少ない８－ＯＨｄＧ染色を示すことを見出した（図１２Ａ）。同様に、ＡＡＶＩＫＶ－Ｎｒｆ２を注射したＮＲＦ２ノックアウト（ＮＲＦ２－／－）マウスも、ＡＡＶ－ＩＫＶ－ＧＦＰの眼と比較して有意に少ない８－ＯＨｄＧ染色を示した（図１２Ｂ）。これらの網膜の定量化は、ＯＮＬにおいて８－ＯＨｄＧ染色に有意な減少が見られることを確認した（図１２Ｃ）。

硝子体内ＡＡＶ送達を介した脈絡膜血管新生および網膜の外側における線維症の抑制
上記のように、デコリンプロテオグリカンは、細胞外基質におけるＶＥＧＦおよびＴＧＦ－βの同時阻害という既知の特性のために、レーザー誘発ＣＮＶを阻害できることを発明者らは見出した。発明者らは、網膜の外側におけるデコリンの発現が、対照のＧＦＰまたはＡＭＤの治療に使用される組換え抗ＶＥＧＦ分子であるアイリーア（アフリベルセプト）の発現と比較して、非常に効果的であるという仮説を検証したいと考えた。ＧＦＰ、アイリーア、またはデコリンのいずれかを発現する組換えＩＫＶ－ＡＡＶベクターを、成体Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの硝子体内にＮｕｃ１と同時注射した。３週間後、マウスをレーザー誘発ＣＮＶに曝露させ、１週間後にデコリンと抗ＶＥＧＦ抗体について上記の試験と同様に調査した。イソレクチンとα－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）によるＣＮＶの定量化は、ＣＮＶと線維症の両方の抑制において、ＡＡＶ－ＩＫＶ－デコリンがＡＡＶ－ＩＫＶ－アイリーアよりも有意に優れていることを明らかにした（図１３）。

考察
本研究において発明者らは、Ｎｕｃ１と呼ばれる新規ペプチドについて記載した。このペプチドは、ラミニン－１のヌクレオリン結合特性とＶＥＧＦ１６５Ａのヘパラン硫酸結合特性に基づいて設計された。発明者らの知る限り、Ｎｕｃ１は網膜への透過についてこれまでに記載された最も効率的なペプチドである。重要なことに、以前に網膜において使用された細胞透過性ペプチド（Johnson et al., 2008）またはアプタマー（Leaderer et al., 2015, 2016; Talreja et al., 2018）の大部分とは異なり、Ｎｕｃ１は輸送のためにペプチドの化学的なコンジュゲーションを必要としない。物理的な結合を必要とせずに網膜細胞および組織にタンパク質を送達する能力は、治療目的でのＣＰＰの有用性を実質的に拡大する。タンパク質とペプチドの間の物理的または化学的な結合は多く記載されているが、そのような結合はタンパク質の機能に悪影響を与えうる。（Zhang et al., 2018）。本発明の送達系は、理論的には、機能的に活性であることが知られている任意のタンパク質を採用して、複雑な化学反応を必要とせずにそれを原形質膜横断的に細胞内に送達することを可能にする。

発明者らはＮｕｃ１が網膜送達を促進した後、異種タンパク質が機能を保持することを実証した。例えば組換えＸＩＡＰは、ＭＮＵ誘発性および網膜剥離誘発性の網膜アポトーシスを抑制した。さらにＮｕｃ１は、化学的熱傷の後に角膜に適用した場合、デコリンなどの抗線維化タンパク質の効力を増強した。Ｎｕｃ１が網膜を考慮して特別に設計されたことを考えると、この観察は予想外であった。したがって、Ｎｕｃ１は網膜と角膜以外の組織で機能する可能性があるが、これについてはまだ明らかになっていない。
硝子体内注射による抗体の送達は、現在の臨床の標準治療である（Comparison of Age-related Macular Degeneration Treatments Trials Research et al., 2012）。Ｎｕｃ１と同時送達した場合には、低用量（より低い用量）における抗体の効力が増強されうることを発明者らは実証した。これは「製品原価」だけでなく、薬物のオフターゲット活性による潜在的な毒性を低減することにも含みを有する。例えば、硝子体からの抗ＶＥＧＦ抗体の全身への漏出は、患者にとって有害である（Christoforidis et al., 2017; Hwang et al., 2012; Michalska-Malecka et al., 2016）。硝子体での有効性を達成するために必要な抗体の用量の削減は、そのような全身性の副作用を減少させる可能性がある。ステロイドは、副作用によって治療的使用が妨げられてきた別の薬物の典型である。デキサメタゾンを硝子体内に注射すると、白内障が形成され、眼圧が上昇する（Zhang et al., 2018）。Ｎｕｃ１と組み合わせた場合、効果的となるために必要な用量の削減により、これらの副作用が軽減される可能性もあるが、これについてはまだ明らかになっていない。

Ｎｕｃ１は網膜細胞、特に光受容体への組換えＡＡＶの取込みを促進することもできた。ＡＡＶおよびその他のウイルスは、高用量で注射すると免疫応答を生じる（Boyd et al., 2016; Reichel et al., 2017）。感染を増強する能力は、遺伝子治療用途のための治療効果を達成するために必要なウイルスの総投与量を減らす。さらに、Ｎｕｃ１配列またはその誘導体のより短い配列をＡＡＶカプシドに組み込む能力は、「薬物」として使用するための組換えＡＡＶの生成を単純化する。おそらく感染に必要な細胞表面受容体の競合のために、Ｎｕｃ１配列を含むＡＡＶとＮｕｃ１ペプチドを同時注射した場合、発明者らはＡＡＶ感染における有意な増加を見出さなかった。発明者らの研究では、ＡＡＶカプシドにラミニン－１を含む配列を有するＡＡＶと組み合わせたＮｕｃ１ペプチドが、最大の感染を導いた。硝子体内経路を介してＡＡＶの感染を増強する以前の試みは、一般に複雑な選択手順によるバイオパニングを必要としていた（Dalkara et al., 2013）。発明者らのより「デザイン指向」のアプローチは非常に単純であり、少なくとも同等に効果的であることが証明されている。これらのベクターの安全性はまだ決定されていないが、網膜下または硝子体内経路を介して感染を増強する能力は、眼の遺伝子治療の分野を大幅に進歩させる。網膜ニューロンの性質に基づき、発明者らは、本稿で記載されている方法が脳などの他の神経細胞組織に拡張される可能性があると予想しているが、それについてはまだ明らかになっていない。

参考文献

（実施例２ － 細胞透過性ペプチドＮｕｃ１を使用したデコリンの局所的送達はマウスのアルカリによる熱傷誘発性角膜傷害の回復を促進する）
角膜傷害は、全視力喪失の全症例のうちおよそ４％を占めている。眼の損傷のおよそ８０％は本質的に化学的な性質のものであり、そのうちアルカリおよび酸性物質は眼の外傷のおよそ１１～２２％、すべての職業上の傷害の４％を引き起こしている［１～３］。角膜上皮は、外部環境と眼の内部との間のバリアとして働く［４］。角膜の表面が損傷すると、傷害を癒すと共に、さらなる損傷から眼を保護するために、線維症、血管新生、および炎症を含むいくつかの応答が活性化される。しかしながら、過剰な場合、これらの応答自体がさらなる損傷をもたらす可能性がある［５］。前眼部における急性炎症および血管新生は、上皮組織の異常な治癒と角膜瘢痕をもたらしうる。アルカリ剤は親油性であるために眼の組織に急速に透過し、壊死と虚血を引き起こす［６］。アルカリによる熱傷による角膜傷害を有する患者は、緑内障および不可逆的な視力喪失のリスクが高い。

アルカリによる熱傷は、角膜におけるマクロファージおよび白血球の浸潤、ならびにＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６および血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）などの炎症促進性サイトカインの上方調節をもたらす。角膜における血管新生促進分子と血管新生阻害分子の不均衡は、血管新生の引き金を引く［７、８］。角膜実質細胞の細胞増殖とアポトーシスを通した上皮再生は、熱傷／傷害部位に隣接して起こる［９］。角膜の損傷に加えて、アルカリによる熱傷は網膜神経節細胞のアポトーシス、さらには視神経の損傷を引き起こしうることが報告されている。
まぶたは眼の防御の第一線であり、アレルゲン、異物、病原体から眼を保護している。眼のまばたき作用は、眼の表面を洗浄し、免疫グロブリンＡおよびＧと、リゾチーム、β－リシン、金属キレート剤などの抗菌タンパク質から成る涙液膜を再生させる［１０、１１］。しかしながら、眼の表面への分子の局所的送達に関連する課題の１つは、涙液膜による表面からの薬物の急速なクリアランスであり、これは薬物の９５％以上の喪失をもたらす。眼房水の再循環のために、内側の区画にうまく透過する薬物の半減期は通常短い。発明者らの知る限り、アルカリによる熱傷の治療のために角膜にタンパク質を局所的に送達したという報告は無い。

デコリンは、ロイシンリッチな小さなプロテオグリカンであり、角膜におけるＴＧＦ－βなどのさまざまな増殖因子の調節を通じて、細胞増殖、生存、および分化の調節に重要な役割を果たす［１２～１６］。デコリンはまた、瘢痕形成と血管増殖を阻害することにより、角膜の透明性の維持にも重要な役割を果たす。デコリンの変異は、先天性角膜実質ジストロフィーと相関することが示されている［１７］。
デコリンの過剰発現は、脳および脊髄傷害のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて線維症を有意に減少させることが示されている。本研究において発明者らは、角膜のアルカリによる熱傷のマウスモデルにおける線維症、血管新生、アポトーシス、および炎症のレベルに対する、デコリン単独の局所的送達およびデコリンと細胞透過性ペプチドＮｕｃ１の局所的同時送達の効果を試験した。

材料および方法：
ペプチド合成：Ｎｕｃ１ペプチド、配列ＡＳＩＫＶＡＶＳＡＧＧＤＫＰＲＲ（配列番号３）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって＞９９％の純度で合成された。

動物：６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、メイン州）から購入し、１２時間の明／暗サイクル下で飼育した。この試験は、視覚と眼科学研究協会会議（ＡＲＶＯ）によって設定された、視覚および眼科研究における動物の使用についての宣言に従って実施され、タフツ大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
傷害の動物モデル：マウスを０．１ｍｇ／ｇ体重のケタミン（Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）、セントジョセフ、ミズーリ州）および０．０１ｍｇ／ｇ体重のキシラジン（Ｌｌｌｏｙｅｄ、シェナンドア、アイオワ州）を含む混合物の腹腔内注射によって麻酔した後、角膜の局所的鎮痛のために０．５％塩酸プロパラカイン（Ａｋｏｒｎ Ｉｎｃ．、レイクフォレスト、イリノイ州、米国）を局所的に適用した。麻酔中、マウスを保温した。右眼の中心角膜に１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を染み込ませた２ｍｍの濾紙ディスクを３０秒間適用することにより、角膜にアルカリによる熱傷を誘発させた。濾紙を角膜から穏やかに取り除き、角膜をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１０回すすぎ、残留ＮａＯＨを除去した。左眼はＮａＯＨに曝露せずに残し、対照として使用した。ＮａＯＨへの曝露の２４時間後に、ＰＢＳ、組換えデコリン（０．５μｇ）、デコリン（０．５μｇ）＋Ｎｕｃ１（０．５μｇ）の局所的適用を開始した。処置は７日間、１日１回局所的に適用した。眼の画像は、デジタルカメラを使用して７日目に記録した。７日後、マウスをＣＯ₂吸入とその後の頸椎脱臼により屠殺した。眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。Ｍｉｃｒｏｎ ５５０クライオスタットを用いて角膜凍結切片を取得した。

免疫化学：凍結切片を１０分間風乾し、ＰＢＳで５分間洗浄した。続いて、透過処理とブロッキングのために、６％正常ヤギ血清とＰＢＳ－Ｔｒｉｔｏｎ中で１時間、室温でインキュベートした。ＦＩＴＣをコンジュゲートしたイソレクチンまたは次のいずれかに対する一次抗体と共にスライドをインキュベートした：α－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ＣＤ４５、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β１）、Ｆ４／８０、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β１）（Ａｂｃａｍ；ａｂ９２４８６）、または活性化カスパーゼ－３。このインキュベーションは４℃で一晩、湿室中で行った。抗体で処置した試料について、検出はＣｙ３をコンジュゲートした二次ヤギ抗ウサギ／抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ウェストグローブ、ペンシルベニア州）と共に室温で１時間インキュベートすることによって行った。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、核を対比染色するためにＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ退色防止封入剤中に封入した。染色された切片のイメージングは、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ５１顕微鏡と適切なフィルターを用いて行った。画像はＲｅｔｉｇａ ２０００ｒカメラを用いて記録した。抗体特異的染色の強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。

組織病理学：処置の７日後に組織学のために眼を採取し、Ｈａｒｔｍａｎ固定液で固定した。４８時間後、検体をアルコールステップで脱水し、パラフィン中に包埋した。視神経領域を含む様々な平面で５ｍｍの切片を切断し、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。染色された切片のイメージングは、Ｒｅｔｉｇａ ２０００ｒカメラを用いてＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡を使用して行った。

マルチプレックスＥＬＩＳＡ：ＩＬ－６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１０、ＩＦＮ－Ｇ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－１βを検出するために、Ｂｉｏ－ｐｌｅｘ ｐｒｏ ｍｏｕｓｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅＴｈ１７ Ａ ６ ｐｌｅｘ ｇｒｏｕｐ Ｉ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｍ６０００００７ＮＹ）を使用し、製造元の使用説明書に従って、マルチプレックスＥＬＩＳＡを行った。簡単に述べると、アルカリによる熱傷を上記のようにして誘発した。７日目にマウスを屠殺し、角膜を摘出した。角膜を細かく切り刻み、Ｂｉｏｐｌｅｘ細胞溶解緩衝液中、－８０℃で保存した。各試料について２つの角膜を一緒にプールし、各試料について５０μｌの溶解物を２回使用した。試料をＢｉｏ ｐｌｅｘ ｍａｎａｇｅｒ ＭＰソフトウェアを使用して試験し、データをＢｉｏｐｌｅｘ ｍａｎａｇｅｒ ６．０を用いて解析した。

ＴＵＮＥＬアッセイ：細胞死を検出するために、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＴＭＲ Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ）を使用し、製造元の指示に従って、末端デオキシヌクレオチド転移酵素媒介ｄＵＴＰ－ビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）法を角膜凍結切片に対して行った。上記のようにして切片を画像化し、以前に記載されているようにＩｍａｇｅＪ（ＦＩＪＩバージョンおよびプラグイン）を使用して、画像をＴＵＮＥＬ陽性細胞の定量化に使用した［１８］。

統計分析：実験値は平均±ＳＥＭとして提示されている。３群以上の群間の統計的差異は一元配置分散分析を使用して分析し、２群間の差異は対応のないＴ検定を使用して分析した。０．０５以下のｐ値を統計的に有意であると見なした。

結果
Ｎｕｃ１は角膜混濁と細胞浸潤を減らすデコリンの能力を高める
デコリンのみ、およびＮｕｃ１とカップリングしたデコリン（デコリン＋Ｎｕｃ１）の局所的適用の角膜混濁に対する効果を試験するために、方法に記載されているようにして、マウスをアルカリによる熱傷に曝露した。アルカリによる熱傷の２４時間後に、デコリンのみ、デコリン＋Ｎｕｃ１、またはＰＢＳを１日１回、７日間適用した。７日目に、角膜のイメージングのためにマウスを屠殺した（図１４Ａ）。アルカリによる熱傷または薬物処置に曝されていない対照マウスの角膜は、滑らかで透明であることが観察された（図１４Ａ）。対照的に、アルカリによる熱傷に曝露させ、ＰＢＳで７日間処理したマウスの角膜は、角膜の表面全体に散在性の「曇り」を有することが観察された。さらに、角膜は不規則な表面を有しており、血管が目立っていた（図１４Ａ）。アルカリによる熱傷の後にデコリン単独の局所的適用に曝露したマウスは、ＰＢＳで処置したものと外観が似た角膜を示し、明らかな不透明性、不規則な表面および血管を有していた（図１４Ａ）。しかしながら、アルカリによる熱傷の後にデコリン＋Ｎｕｃ１に曝露したマウスは、アルカリによる熱傷に曝露させ、ＰＢＳで処置したマウスと比較して、より滑らかな角膜表面と角膜混濁の明らかな減少を示し、目立った血管を有していなかった（図１４Ａ）。Anderson et al.［１９］によって記載された方法に基づき、臨床的不透明度についてマウスをスコアリングした。スコアリングシステムによると、アルカリによる熱傷後にＰＢＳ処置を受けたマウスは４点（瞳孔が見えない完全な不透明）、デコリンを投与されたマウスは２．８点（不透明、瞳孔はほとんど検出されない）、そしてデコリン＋Ｎｕｃ１を投与されたマウスは１．５点（わずかにかすんでいる、虹彩と瞳孔はまだ検出可能）であった。

上記のそれぞれで処置したアルカリによる熱傷曝露マウスの角膜の横断切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（Ｈ＋Ｅ；図１４Ｂ）。未処置の対照マウスの角膜と比較して、ＰＢＳで処置したアルカリによる熱傷曝露マウスの角膜は、より薄い角膜と上皮細胞層の細胞の喪失を示した（図１４Ｂ）。さらに、角膜内および角膜の下に顕著な細胞浸潤があった。ＰＢＳで処置した角膜と比較して、デコリンで処置したアルカリによる熱傷曝露マウスの角膜においては、上皮の厚さの増加が観察された（図１４Ｂ）。しかしながら、デコリンで処置した角膜では空胞化が明らかであった。対照的に、デコリン＋Ｎｕｃ１で処置したアルカリによる熱傷曝露マウスの角膜では、上皮の上部細胞層の回復が明らかであり、角膜表面の完全性が高められていた（図１４Ｂ）。

デコリン＋Ｎｕｃ１はアルカリによる熱傷角膜における血管新生と線維症を有意に軽減する
アルカリによる熱傷の後、角膜は血管新生と線維症を生じやすい。トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）の上方調節は、アルカリによる熱傷部位への角膜上皮細胞と角膜実質細胞の移動を促進し、そこで角膜実質細胞は筋線維芽細胞に分化する［２０］。筋線維芽細胞の制御されていない持続的な活性化は、病的な線維症を導く。発明者らは、アルカリによる熱傷後の角膜における血管内皮細胞の存在と筋線維芽細胞のマーカーであるアルファ平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の発現を記述した［２１］。アルカリによる熱傷によって誘発された角膜血管新生と線維症に対するデコリン単独またはデコリン＋Ｎｕｃ１の効果を決定するために、マウスをアルカリによる熱傷に曝露させ、上記のように処置した。処置後７日目にマウスを屠殺し、その角膜を凍結切片化のために採取し、ＦＩＴＣをコンジュゲートしたグリフォニアシンプリフィコリアレクチン－１（ＧＳＬ Ｉ）／イソレクチンとアルファ平滑筋アクチン（ＳＭＡ）に対する抗体で染色した。未処置の対照マウスの角膜では、イソレクチン（緑）またはＳＭＡ（赤）のいずれについても染色はほとんど、またはまったく観察されなかった（図１５Ａ）。しかしながら、ＰＢＳで処置したアルカリ曝露マウスの角膜は、角膜のすべての層にわたって広範なイソレクチンとＳＭＡの染色を示し、広範な血管新生と線維症が示唆された。アルカリによる熱傷に曝露させた角膜へのデコリンの局所的適用は、角膜の上皮、間質および内皮、ならびに眼房水（図１５Ａ）におけるイソレクチン染色の明らかな減少を示し、血管新生の減少が指し示された。デコリンで処置した角膜、特に角膜後部および眼房水では、ＳＭＡ染色におけるいくらかの適度な減少が明らかであった。しかしながら、アルカリによる熱傷に曝露させた角膜へのデコリン＋Ｎｕｃ１の局所的適用は、角膜実質、内皮、眼房水におけるイソレクチンとＳＭＡの両方の染色のほぼ完全な除去を示し、上皮においても両方の染色が大幅に減少していた（図１５Ａ）。これは、デコリン＋Ｎｕｃ１が、アルカリによる熱傷に曝露させた角膜における血管新生と線維症からの非常に重要な保護を媒介することを示唆している。

角膜のイソレクチン染色の定量化（図１５Ｂ）は、デコリン単独の局所的適用が角膜におけるイソレクチン染色を目に見えて減少させたものの、ＧＳＬ Ｉ染色の量はＰＢＳで処置した角膜のものと有意に異ならないことを示した。しかしながら、アルカリによる熱傷に曝露させた角膜へのデコリン＋Ｎｕｃ１の局所的適用は、ＰＢＳで処置した角膜と比較して、イソレクチン染色における有意な８３．９％（ｐ＜０．０４２）の減少を示し、血管新生の有意な減少が指し示された。角膜のＳＭＡ染色の定量化は、デコリン単独の局所的適用が、ＰＢＳで処置した角膜と比較して、ＳＭＡ染色を有意に３３．２５％（ｐ＜０．０２５）減少させたことを示した。しかしながら、アルカリによる熱傷に曝露させた角膜へのＮｕｃ１＋デコリンの局所的適用は、ＰＢＳで処置した角膜と比較して、ＳＭＡ染色のより有意な４６．２２％（ｐ＜０．００２８）の減少をもたらし（図１５Ｂ）、デコリン単独と比較して、線維症から保護するためのデコリン＋Ｎｕｃ１の増強された能力が示唆された。

デコリン＋Ｎｕｃ１はアルカリによる熱傷モデルの角膜における炎症細胞の浸潤を有意に減少させる
発明者らは次に、ＰＢＳ、デコリン単独、またはデコリン＋Ｎｕｃ１による処置に続いて、アルカリによる熱傷に曝露させたマウスの角膜の炎症を調べた。角膜の横断面をＣＤ４５およびＦ４／８０で染色して、白血球、特にマクロファージの存在を判定した。未処置の対照マウスの角膜では、予想通り、角膜においてＣＤ４５またはＦ４／８０抗体による染色はほとんど、またはまったく見られなかった（図１６Ａ）。アルカリによる熱傷に曝露させた後にＰＢＳで処置したマウスの角膜では、角膜実質全体にＣＤ４５（緑チャネル）およびＦ４／８０（赤チャネル）抗体による広範な染色が見られ（図１６Ａ）、これらの角膜における炎症細胞のかなりの浸潤が指し示された。アルカリによる熱傷に曝露させた後にデコリン単独またはデコリン＋Ｎｕｃ１のいずれかで局所的に処置したマウスの角膜は、上皮に近い角膜実質の前部領域においてＣＤ４５およびＦ４／８０染色の減少を示した。角膜におけるＣＤ４５染色の定量化は、ＰＢＳで処置した角膜と比較して、デコリン単独で処置した角膜におけるＣＤ４５陽性細胞の数の有意な３９．６％（ｐ＜０．０１４７）の減少を示した（図１６Ｂ）。デコリン＋Ｎｕｃ１で局所的に処置した角膜もまた、ＰＢＳで処置した角膜と比較して、ＣＤ４５染色に５９．８％（ｐ＜Ｏ．００１７）の有意な減少を示した（図１６Ｂ）。しかしながら、デコリン単独で処置した角膜とデコリン＋Ｎｕｃ１で処置した角膜の間に、ＣＤ４５染色における有意な差は見られなかった（図１６Ｂ）。角膜におけるＦ４／８０染色の定量化は、ＰＢＳで処置した角膜と比較して、デコリン＋Ｎｕｃ１で処置した角膜において染色の有意な５７．９％（ｐ＜０．００５２）の減少を示し（図１６Ｂ）、これらの角膜におけるマクロファージ浸潤の顕著な減少が指し示された。対照的に、ＰＢＳで処置した角膜と比較して、デコリン単独で処置した角膜では、Ｆ４／８０染色の有意な減少は見られなかった（図１６Ｂ）。このデータは、アルカリによる熱傷に曝露させたマウスの角膜における炎症細胞の浸潤に対する局所的に適用されたデコリン＋Ｎｕｃ１の改善効果が、特にマクロファージに関して、デコリン単独の局所的適用の改善効果よりも効率的であることを示唆している。

炎症マーカーのＣＤ４５およびＦ４／８０は、傷害部位におけるサイトカイン／ケモカインの産生に重要な役割を果たし、組織のさらなる破壊と瘢痕化の原因となる。よって、発明者らはさらに、Ｂｉｏｐｌｅｘアッセイを使用してＴｈ１７サイトカインの発現レベルを決定した。アルカリによる熱傷に曝露させたマウスの処置の７日後に角膜溶解物を採取し、ＩＬ－１ベータ（ＩＬ－１β）、ＩＬ－６、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－Ｇ）、ＩＬ－１７およびＩＬ１０のレベルをアッセイした。５種のサイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１７およびＩＦＮ－Ｇ）が、アルカリによる熱傷に曝露させていない未処置の対照マウスの角膜と比較して、アルカリによる熱傷に曝露させ、ＰＢＳで処置したマウスの角膜では上昇していることが観察された（図１７Ａ）。サイトカインＩＬ－１０のレベルは、対照群と治療群のアッセイの検出限界を下回っていた（データは示さず）。ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－Ｇ、ＩＬ－１７、およびＩＬ－６については、ＰＢＳで処置したマウスと比較して、デコリン単独またはデコリン＋Ｎｕｃ１のいずれかで処置した後に発現の低下が観察された（図１７Ａ）。特に、デコリン＋Ｎｕｃ１で処置したマウスでは、デコリン単独で処置したマウスよりも発現が大幅に減少していた。興味深いことに、ＩＬ－１βの発現の増加が、デコリン単独とデコリン＋Ｎｕｃ１で処置したマウスの角膜において観察された（図１７Ａ）。

アルカリによる熱傷はまた、炎症性サイトカインのトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β１）の産生も招くが、これは、角質細胞の筋線維芽細胞への分化に重要な役割を果たし、サイトカインのさらなる発現を誘導することによって角膜組織の損傷を悪化させ、ひいては炎症フィードバックループを形成する。ＴＧＦ－β１の抗体染色を使用して、発明者らはＰＢＳで処置したマウスの角膜におけるアルカリによる熱傷後の角膜の上皮、角膜実質、および内皮におけるＴＧＦ－β１の有意な発現を観察した（図１７Ｂ）。デコリン単独による処置はＴＧＦ－β１の発現低下をもたらしたが、デコリン＋Ｎｕｃ１で処置したマウスは、デコリン単独と比較して実質的により低いレベルのＴＧＦ－β１を有していた（図１７Ｂ）。

Ｎｕｃ１デコリン＋Ｎｕｃ１はアルカリによる熱傷マウスモデルの角膜における細胞死を有意に減少させる
アルカリによる熱傷に曝露させたマウスの角膜では、カスパーゼ－３を媒介したアポトーシスが生じることが示されている。デコリン単独またはデコリン＋Ｎｕｃ１がアルカリによる熱傷誘発性の細胞死に影響を与えるかどうかを判定するために、処置後７日目に採取したマウスの角膜の横断凍結切片を活性化カスパーゼ－３で染色した（図１８）。アルカリによる熱傷に曝露させていない未処置の対照マウスの角膜では、検出可能な活性化カスパーゼ－３は見られなかった（図１８）。しかしながら、アルカリによる熱傷に曝露させ、ＰＢＳで処置したマウスの角膜のすべての層（上皮、角膜実質、および内皮）において、活性化されたカスパーゼ－３染色が観察された（図１８）。アルカリによる熱傷に曝露させ、デコリン単独の局所的適用によって処置したマウスでは、ＰＢＳで処置したマウスの角膜と比較して、角膜実質および角膜の内皮における活性化カスパーゼ－３の染色がかなり減少しており、上皮においても減少している可能性があった（図１８）。しかしながら、アルカリによる熱傷に曝露させ、デコリン＋Ｎｕｃ１で局所的に処置したマウスの角膜では、ＰＢＳで処置したマウスと比較して、上皮を含む角膜の３層すべてで活性化カスパーゼ－３染色が大幅に減少していた。各処置群および「未処置」群の角膜における活性化カスパーゼ－３染色からの蛍光シグナルの定量化は、デコリン単独（５１．５％）またはデコリン＋Ｎｕｃ１で処置したマウスの角膜における活性化カスパーゼ－３染色の有意な減少を明らかした（７４．６％、ｐ＜０．０００１、図１８）。デコリン＋Ｎｕｃ１で処置した角膜における活性化カスパーゼ－３染色の量は、デコリン単独で処置した角膜と比較しても、有意に減少していた（４７．６％、ｐ＝０．０００１）（図１８）。

一般的な細胞死も、ＴＵＮＥＬ染色によって角膜の凍結切片において評価した（図１９Ａ）。アルカリによる熱傷に曝露させていない未処置の対照マウスの角膜では、ＴＵＮＥＬ染色はほとんど、またはまったく観察されなかった（図１９Ａ）。アルカリによる熱傷に曝露させた後ＰＢＳで処置したマウスの角膜実質および角膜の上皮においては、細胞死を指し示すＴＵＮＥＬ染色が観察された（図１９Ａ）。アルカリによる熱傷に曝露させ、デコリン単独で処置したマウスの角膜実質におけるＴＵＮＥＬ染色には、かなりの減少が見られたが（図１９Ａ）、これらのマウスの上皮におけるＴＵＮＥＬ染色の明らかな減少はほとんど、またはまったく見られなかった。アルカリによる熱傷に曝露させ、デコリン＋Ｎｕｃ１で処置したマウスの角膜では、角膜層のいずれにもＴＵＮＥＬ染色はほとんど、またはまったく見られず、これらのマウスの角膜の細胞死に対するほぼ完全な保護が示唆された（図１９Ｂ）。これらの角膜におけるＴＵＮＥＬ染色の定量化は、アルカリによる熱傷に曝露させ、デコリン単独で処置したマウスの角膜において、ＰＢＳで処置したものと比較して、ＴＵＮＥＬ染色の有意な減少を指し示した（４４．８％、ｐ＜０．０８８２）（図１９Ｂ）。しかしながら、アルカリによる熱傷に曝露させ、デコリン＋Ｎｕｃ１で処置した角膜（９０４５％、ｐ＜０．００６）では、ＰＢＳで処置した角膜と比較して、ＴＵＮＥＬ染色のより実質的かつ有意な減少が観察された（図１９Ｂ）。

デコリン＋Ｎｕｃ１はアルカリによる熱傷マウスモデルの網膜における神経膠症を大幅に軽減する
網膜におけるミュラーグリア細胞の活性化である神経膠症は、アルカリ傷害に対する急速なストレス応答である。グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現の増加が神経膠症の特徴である。以前の研究は、アルカリによる熱傷に反応した炎症性サイトカインＴＮＦ－Ａの増加が、網膜における神経膠症の誘発をもたらすことを示している［２２］。デコリン単独またはデコリン＋Ｎｕｃ１のいずれかによるアルカリによる熱傷に曝露させたマウスの角膜の局所的処置が、グリア細胞活性化に対する網膜の保護をもたらすかどうかを決定するために、発明者らは角膜のアルカリによる熱傷を受けたマウスの網膜の横断凍結切片をＧＦＡＰについて染色し、また、それらをＰＢＳ、デコリン単独、またはデコリン＋Ｎｕｃ１で７日間、局所的に処置した（図２０）。アルカリによる熱傷に曝露させていない対照マウスの網膜は、グリア細胞の活性化の欠如と一致するＧＦＡＰ染色のパターンを有することが観察された（図２０）。対照の網膜では、ＧＦＡＰは前網膜の星状細胞とミュラー細胞のエンドフィートでのみ観察された。アルカリによる熱傷に曝露させ、ＰＢＳで処置したマウスの網膜は、ミュラーグリアの活性化と一致するＧＦＡＰ染色のパターンを有することが観察され（図２０）、ＧＦＡＰは神経節細胞層（ＧＣＬ）から内顆粒層を通して、そして外顆粒層（ＩＮＬ／ＯＮＬ）にまで及ぶミュラー細胞全体で観察された。アルカリによる熱傷に曝露させ、デコリン単独で処置したマウスの網膜も、ミュラー細胞の活性化と一致するＧＦＡＰ染色のパターンを示したが、ＰＢＳで処置したマウスの網膜に比べて染色が減少していた（図２０）。これらの網膜では、ＧＦＡＰ染色がミュラー細胞を通ってＧＣＬから内網状層に広がることが観察されたが、これらの網膜のＩＮＬまたはＯＮＬでは観察されなかった。しかしながら、アルカリによる熱傷に曝露させ、デコリン＋Ｎｕｃで処置したマウスの網膜では、ＧＦＡＰ染色は、デコリン単独で処置したマウスの網膜と比較して、大幅に減少していた。これらの網膜では、染色は主にＧＣＬのミュラー細胞のエンドフィートに限定されており、時折、内網状層でミュラー細胞の染色が見られた（図２０）。これらのデータは、デコリン単独とデコリン＋Ｎｕｃ１の両方が、アルカリによる熱傷に曝露させたマウスにおける網膜神経膠症の減少を媒介したことを示唆している。しかしながら発明者らは、網膜ミュラー細胞の活性化に対するデコリン単独とデコリン＋Ｎｕｃ１の直接的な影響の可能性を排除することはできなかった。

考察
眼に送達される薬物の保持と有効性を高めることは、局所的治療に対する生体効率と治療反応の両方を高めるための鍵である。角膜前涙液膜のターンオーバーが高いことによる水性薬物の迅速な除去は、角膜に送達される薬物の有効性を低下させるため、大きな課題となっている。結膜下または硝子体内注射を含む薬物投与の集中的な局所的経路または薬物送達の侵襲的な方法は、しばしば合併症と関連する。薬物が無効な場合、結果として生じる角膜瘢痕を治療または除去するためにしばしば手術が必要となり、治療後の罹患のリスクと患者の不快感の期間が増大する。

眼の熱傷は一般に視力を脅かす合併症と関連しており、眼科医にとって臨床上の課題となっている。現在の医療処置は、コルチコステロイドまたは予防的抗生物質の慎重な使用によって炎症を制御することを目的としている。アルカリによる熱傷のマウスモデルについては、これまでに多くの記述があり、組換えヒトデコリンの抗瘢痕化および抗線維化効果を評価するための堅牢で臨床的に適切な手段を提供している。細胞透過性ペプチドＮｕｃ１の有無にかかわらず、デコリンタンパク質の局所的投与は、７日間の局所的処置後に角膜混濁のレベルを有意に低下させた。角膜混濁のそのような減少は、患者にとって長期的な利益となり、視力の維持をもたらす可能性がある。興味深いことに、発明者らは、処置が線維症を防ぐだけでなく、炎症の実質的な減少、したがって網膜における神経膠症の予防にも関連していることを観察した。発明者らの結果は、アルカリによる熱傷後の角膜による炎症促進性サイトカインＴＮＦ－αの産生が神経膠症を引き起こすことを指し示す以前の研究と一致している［２２～２４］。この炎症の減少は、カスパーゼ－３依存性アポトーシス経路の活性化を阻害することによって角膜の上皮層と角膜実質層を保護するという点でも有益である。デコリンの局所的投与はまた、おそらく損傷した角膜の破壊された微小環境を透過するその能力のために、アルカリによる熱傷に関連する病状を調節することもできた。さらに、Ｎｕｃ１と組み合わせたデコリンの使用は、アルカリによる熱傷後の曇り、混濁、線維症、および炎症の実質的な減少をもたらした。発明者らの結果は、Ｎｕｃ１が、治癒過程を早めるデコリンタンパク質の固有の能力を、おそらくその保持時間を改善し、それによって治療効率を高めることによって、増強することを実証している。

アルカリによる熱傷は、上皮層の薄化、間質性浮腫、細胞浸潤物の沈着を含む、いくつかの角膜構造破壊を引き起こす。涙液膜および頂端粘膜と共に、上皮は眼の防御の第一線である。デコリンとペプチドＮｕｃ１の局所的投与は、上皮の形態を回復させ、間質性浮腫と角膜の全体的な厚さを減少させた。さらに以前の研究は、デコリンが角膜線維芽細胞のいくつかの増殖因子とシグナル伝達経路（ＴＧＦ－βを介したＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３）をモジュレートし、よって、線維症の瘢痕形成を減弱させることを報告している。アルカリによる熱傷は本質的に急性であるため、内因性のデコリンが高活性なＴＧＦ－β分子を中和できずに、下流の線維性カスケードの活性化を許している可能性がある。

アルカリによる熱傷に起因する前眼部の大規模な炎症は、網膜の内側と外側、ならびに視神経に広範な損傷を引き起こす。最近の報告は、ボストン人工角膜の移植を受けたアルカリによる熱傷患者が眼圧の上昇（すなわち緑内障）を示したことを記述している。積極的な治療措置と手術にもかかわらず、非熱傷移植患者と比較して、熱傷患者の眼では悪化が加速していた。いくつかの研究は後部アルカリ拡散の可能性を示唆しているが、アルカリによる熱傷後の網膜への損傷のメカニズムは解明されていない。網膜への損傷が単なる拡散ではなく、炎症性サイトカイン、特にＴＮＦ－αの産生によるものであると示唆する報告もある［２５］。さらに、炎症促進性サイトカインであるＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βは、いくつかの感染性および非感染性の眼の病状における炎症に寄与する。ＩＬ－６Ｒアンタゴニストは角膜の炎症と血管新生を軽減するため、ＩＬ－６は角膜の炎症性疾患でも重要な役割を果たす［２５］。炎症の増加は、炎症促進性の遺伝子のさらなる上方調節を引き起こすフィードバックループを生じる［２６］。炎症性の環境は血液網膜関門を破壊し、血液からの免疫細胞、主に好中球とマクロファージの浸潤を引き起こす［２６］。これらの浸潤性免疫細胞は、眼の常在免疫細胞を活性化する。さらに、ミュラーグリアからのシナプスシグナル伝達［２７］は、網膜におけるサイトカイン産生の引き金を引き、眼の前部と後部において細胞ストレスを引き起こす。以前の研究は、ブドウ膜炎において炎症を引き起こす、前眼房におけるｐＨの上昇による、マウスおよびウサギの網膜のＩＮＬとＯＮＬにおけるアポトーシスを報告している［２７、２８］。発明者らの研究では、アルカリによる熱傷の７日後に網膜の強い神経膠症と角膜のアポトーシスが観察され、これには、角膜溶解物中の炎症性サイトカインＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＦＮ－Ｇのレベルの上昇が伴っていた。デコリンの局所的投与は炎症の軽減を促進し、その結果として神経膠症とアポトーシスが制御された。これらの結果は有望なものであるが、アルカリによる熱傷の治療におけるデコリンの複数の保護的役割については、さらなる調査が必要である。

まとめると、Ｎｕｃ１と組み合わせた抗線維性タンパク質デコリンの局所的送達はおそらく安全であり、また、Ｎｕｃ１は炎症を起こした角膜に透過してカーゴタンパク質を角膜組織へと送達できることを発明者らは実証しており、これは、大規模な前臨床安全性試験を行う正当な理由となる。Ｎｕｃ１とカップリングしたデコリンは、アルカリによる熱傷後の角膜表面を効率的にレスキューすることができる。アルカリによる熱傷は重度の眼の損傷のカテゴリーに分類され、現在、治療の選択肢はほとんどない。発明者らの研究では、デコリンは角膜の瘢痕を有意に減らしうるほど長く、その治療的潜在性を保持し、眼の表面と接触した状態にとどまっていた。したがって、眼の線維症、炎症および細胞死と戦う能力を備えた、Ｎｕｃ１と組み合わせたデコリンの局所的適用は、アルカリによる熱傷の治療法として有望である。

（実施例３）
Ｎｕｃ１は、遺伝子編集剤の網膜送達を増強する。
遺伝子治療およびタンパク質治療を補うために、遺伝子編集の分野において著しい関心がある。遺伝子編集のために一般に使用される１種のタンパク質は、Ｃａｓ９である。導入遺伝子の長期間の発現が望ましい遺伝子治療とは対照的に、オフターゲット効果は、Ｃａｓ９などの遺伝子編集タンパク質の一過的発現によって回避され得る。さらに、Ｃａｓ９およびその機能的近縁物は、細菌性タンパク質であり、それによりヒト細胞中において無期限で発現されると免疫原性および毒性である。導入遺伝子発現がｉｎ ｖｉｖｏで調節される遺伝子治療アプローチは、複雑である。それにより、上記課題へのさらに実践的な解決法は、細胞の核に遺伝子編集タンパク質を一過的に送達することである。これらの外来性に送達されたタンパク質がそれらの遺伝子編集の機能を実施すると、すべての細胞内タンパク質に本質的に共通する様式でそれらは当然、細胞内で自然に分解される。このアプローチを成功させるために、Ｃａｓ９が標的細胞に送達されるように細胞バリア（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｒｒｉｅｒ）を克服することが不可欠である。本発明者らは、ＣＰＰ Ｎｕｃ１をこの目的のために利用できると仮定した。

Ｎｕｃ１は、Ｃｒｅリコンビナーゼの網膜取込みを増強し、遺伝子編集を促進する。
この仮説を検証するために、本発明者らは、Ａｉ９マウスにおいてＮｕｃ１がＣｒｅリコンビナーゼタンパク質の取込みを可能にする、または増強するかどうかを最初に調査した。これらのマウスにおいてレポーターｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子発現カセットは、ｌｏｘＰが導入された停止コドンがＣｒｅリコンビナーゼによって切り出された場合に作動される。本発明者らは、成体（約６週齢）Ａｉ９マウス硝子体内に４マイクログラムのＣｒｅリコンビナーゼタンパク質をそれだけで、または１マイクログラムのＮｕｃ１との組合せでのいずれかで注射した。本発明者らは、Ｃｒｅリコンビナーゼを単独で注射されたＡｉ９マウスにも検出可能なｔｄＴｏｍａｔｏ発現はあるが、ＣｒｅリコンビナーゼがＮｕｃ１と同時注射された場合に、顕著により多い数のおよび多い種類の細胞がレポーター発現を示したことを見出した。詳細には、ＣｒｅリコンビナーゼがＮｕｃ１と同時注射された場合に、顕著により多い数のミュラー細胞がｔｄＴｏｍａｔｏ陽性であった（図２１）。実際にＣｒｅリコンビナーゼ単独では、ｔｄＴｏｍａｔｏを発現するミュラー細胞はほとんどなかった。それにより本発明者らのデータは、Ｎｕｃ１が外来性に送達されたＣｒｅリコンビナーゼの取込みを増強し、Ｎｕｃ１－送達Ｃｒｅリコンビナーゼが核において機能性であることを実証する。Ｃｒｅリコンビナーゼがそれ自体で細胞に進入できるという観察は驚くべきことであった。しかしながら、上のアッセイは、１回の遺伝子編集事象が、細胞に蓄積するタンパク質の持続的な産生を通じて実質的に増幅されることから高感度である。それにより、Ｃｒｅリコンビナーゼの取込みを増強するＮｕｃ１の能力は、機能的に重要である。

Ｎｕｃ１は、Ｃａｓ９の網膜取込みを促進し、遺伝子編集を促進する。
Ｃｒｅリコンビナーゼは、およそ３８Ｋｄの分子量を有し、およそ１６０Ｋｄの質量であるＣａｓ９よりも実質的に小さい。遺伝子編集が顕著に大きなタンパク質を用いて達成され得るかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｃａｓ９－ＧＦＰ融合タンパク質をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに硝子体内注射した。Ｃａｓ９－ＧＦＰは、それだけでは網膜に透過できず、内境界膜に局在化する（図２２）。これは、Ｃｒｅリコンビナーゼなどの小さいタンパク質は、それら自体で網膜に進入できる一方で、より大きな、より治療的な関連Ｃａｓ９－ＧＦＰタンパク質はできないことを示している。しかしながら、Ｎｕｃ１と同時注射されるとＣａｓ９－ＧＦＰは、外顆粒層（ＯＮＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）および神経節細胞層（ＧＣＬ）を含む網膜における種々の細胞型に局在化した（図２２）。

続いて、本発明者らは、Ｎｕｃ１が、Ａｉ９マウスの網膜において、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）にカップリングしたＣａｓ９の取込みを増強できるかどうかについて取り組みたいと考えた。そこで、本発明者らは、上に記載のｔｄＴｏｍａｔｏレポーター中のｌｏｘＰが導入された停止コドンを標的化するＲＮＰと複合体化したＣａｓ９をＮｕｃ１と硝子体内にまたは網膜下に同時注射した。網膜下注射に続いて、網膜色素上皮にｔｄＴｏｍａｔｏの顕著な発現があり（ＲＰＥ、図２３Ａ～２３Ｂ）、ＲＮＰの良好な標的化を示している。しかしながら、Ｃａｓ９－ＲＮＰがＮｕｃ１を含まずに注射された場合、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現はなく、Ｎｕｃ１が網膜でのＣａｓ９－ＲＮＰの効率的な送達のために必要であったことを確認している。より高い濃度での、Ｃａｓ９－ＲＮＰとのＮｕｃ１の硝子体内注射は、細胞においてｔｄＴｏｍａｔｏ発現も作動させる。硝子体内注射を用いて、レポーター発現を示す細胞型は、網膜のさまざまな部分で変化しやすいが、ミュラー細胞および光受容体を含んでいた（図２４）。

参考文献

Claims (38)

1. （１）配列番号４で示されるアミノ酸配列が（２）可動性リンカーを介して（３）配列番号５で示されるアミノ酸配列に連結されているものからなるペプチド。
2. 配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
3. 請求項１または２に記載のペプチドおよびカーゴ分子を含む医薬組成物。
4. カーゴ分子が、ペプチド、組換えタンパク質、抗体、プロテオグリカン、ステロイド、ウイルス、核酸、リボ核タンパク質、低分子治療剤および検出可能な標識からなる群から選択される、請求項３に記載の医薬組成物。
5. カーゴ分子が、抗アポトーシス剤、抗炎症剤、抗血管新生剤および抗線維化剤からなる群から選択される、請求項３または４に記載の医薬組成物。
6. カーゴ分子が、Ｘ連鎖アポトーシス抑制タンパク質、デコリン、血管内皮細胞増殖因子に対する抗体、Ｂｃｌ－ｘＬ由来ＢＨ４－ドメインペプチド、ＮＲＦ２およびデキサメタゾンからなる群から選択される、請求項３～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
7. カーゴ分子が、遺伝子治療剤または遺伝子編集剤である、請求項３～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. カーゴ分子が、ウイルスまたは遺伝子治療ベクター、ＣｒｅおよびＣａｓ９タンパク質からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 請求項１または２に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
10. ウイルスカプシドタンパク質をコードする配列内に挿入されている、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
11. 請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結されている核酸構築物。
12. 改変されたウイルスカプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、前記改変されたウイルスカプシドタンパク質が、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む、ＡＡＶ。
13. ＡＡＶ９である、請求項１２に記載のＡＡＶ。
14. ポリペプチドカーゴ分子をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１２または１３に記載のＡＡＶ。
15. ポリペプチドカーゴ分子が、デコリンおよびＮＲＦ２からなる群から選択される、請求項１４に記載のＡＡＶ。
16. ポリペプチドカーゴ分子が、抗アポトーシス剤、抗炎症剤、抗血管新生剤、抗線維化剤、遺伝子治療剤および遺伝子編集剤からなる群から選択される、請求項１４に記載のＡＡＶ。
17. 細胞または組織を、請求項１または２に記載のペプチドに接触させるステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞または組織への送達の方法であって、ペプチドが細胞透過性ペプチドであり、ペプチドが細胞または組織に進入する、方法。
18. 細胞または組織をカーゴ分子に接触させるステップをさらに含み、ペプチドの非存在下における細胞への送達と比較して、ペプチドが細胞もしくは組織へのカーゴ分子の送達を増加させる、または細胞もしくは組織へのカーゴ分子の形質導入を可能にする、請求項１７に記載の方法。
19. 細胞または組織にカーゴ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで送達するための方法であって、細胞または組織を、請求項３～８のいずれか１項に記載の医薬組成物または請求項１２～１６のいずれか１項に記載のＡＡＶと接触させるステップを含み、カーゴ分子が細胞または組織に送達または形質導入される方法。
20. ペプチドがカーゴ分子にコンジュゲートされておらず、物理的にも連結されていない請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 対象の細胞または組織にカーゴ分子を送達するための医薬の製造における、請求項１または２に記載のペプチド；請求項３～８のいずれか１項に記載の医薬組成物；請求項１１に記載の核酸構築物；または請求項１２～１６のいずれか１項に記載のＡＡＶの使用。
22. 前記医薬が眼の変性疾患または眼の傷害を治療するためのものである、請求項２１に記載の使用。
23. 請求項１または２に記載のペプチド、請求項１１に記載の核酸構築物、または請求項１２～１６のいずれか１項に記載のＡＡＶを含む医薬組成物。
24. 対象の細胞または組織へのカーゴ分子の送達における使用のための請求項３～８のいずれか１項に記載の医薬組成物または請求項２３に記載の医薬組成物。
25. 前記対象が眼の変性疾患または眼の傷害を有する、請求項２４に記載の医薬組成物。
26. 細胞または組織を、請求項１２～１６のいずれか１項に記載のＡＡＶに接触させるステップを含む、細胞または組織にｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＡＶを送達するための方法であって、前記改変されたウイルスカプシドタンパク質を含まないＡＡＶに接触された細胞または組織と比較して、増加した割合で細胞または組織にＡＡＶが送達または形質導入される方法。
27. 細胞または組織を、ＡＡＶに加えて、請求項１または２に記載のペプチドに接触させるステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
28. 対象の細胞または組織にＡＡＶを送達するための医薬の製造における、請求項１２～１６のいずれか１項に記載のＡＡＶの使用。
29. 対象の細胞または組織にカーゴ分子を送達するための医薬の製造における、（ａ）請求項１または２に記載のペプチド、及び（ｂ）請求項１２～１６のいずれか１項に記載のＡＡＶを含む組合せの使用。
30. 前記組合せが、（ａ）請求項２に記載のペプチド及び（ｂ）請求項１２に記載のＡＡＶを含む、請求項２９に記載の使用。
31. 前記医薬が眼の変性疾患または眼の傷害を治療するためのものである、請求項２９または３０に記載の使用。
32. 請求項１２～１６のいずれか１項に記載のＡＡＶを含む、対象の細胞または組織へのＡＡＶの送達における使用のための医薬組成物。
33. （ａ）請求項１または２に記載のペプチド、及び（ｂ）請求項１２～１６のいずれか１項に記載のＡＡＶを含む、対象の細胞または組織へのカーゴ分子の送達における使用のための医薬組成物。
34. 請求項１または２に記載のペプチドを含む、対象の細胞または組織へのカーゴ分子の送達において請求項１２～１６のいずれか１項に記載のＡＡＶと組み合わせて使用するための医薬組成物。
35. 請求項１２～１６のいずれか１項に記載のＡＡＶを含む、対象の細胞または組織へのカーゴ分子の送達において請求項１または２に記載のペプチドと組み合わせて使用するための医薬組成物。
36. 前記ペプチドが、請求項２に記載のペプチドであり、前記ＡＡＶが、請求項１２に記載のＡＡＶである、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
37. 前記対象が眼の変性疾患または眼の傷害を有する、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の使用。
38. 前記対象が眼の変性疾患または眼の傷害を有する、請求項３２～３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。

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