JP7573001B2 - 弱毒化表現型を有するヒト呼吸器多核体ウイルス（ｒｓｖ）のためのワクチン候補 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月２３日出願の米国仮出願番号６２／３９９,１３３および２０１６年９月２７日出願の米国仮出願番号６２／４００,４７６に基づく優先権を主張し、この両者とも、引用によりその全体を全ての目的のために本明細書に包含させる。

配列表への言及
本出願は、９８kbサイズを有し、２０１７年９月２０日に作成した、“Sequence_Listing_6137NIAID-65-PCT_ST25.txt”なる名称の電子テキストファイルとして提出した配列表を含む。該電子ファイルに含まれる情報は、その全体を37 CFR §1.52(e)(5)に従い本明細書に包含させる。

政府権限
米国政府は、本発明に一定の権利を有する。

発明の分野
ここに開示される主題は、ワクチンとして使用するのに適する、呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)およびその弱毒化、変異株である。

発明の背景
ヒト呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)は、幼児期に世界中のほぼ全員が感染し、相当な死亡率および罹病率の原因である(一般的レビューについて、Collins and Graham, 2008, J Virol. 82:2040-2055; Collins and Melero, 2011, Virus Res 162: 80-99; Collins and Karron, 2013, Fields Virology 6th Edition, pp 1086-1123; Collins, et al., 2013, Curr Top Microbiol Immunol 372:3-38参照)。米国単独で、ＲＳＶは、年間７５,０００～１２５,０００の入院を担い、控えめに見積もっても、ＲＳＶが毎年世界中で６,４００万の小児感染および１６０,０００以上の小児死亡を引き起こすことが示される。ＲＳＶの他の顕著な特徴は、乳児期の重篤な感染が、一部個体では、しばしば、数年持続し、思春期以降にまで及び得る、気道反応性に対する素因を含む長引く気道機能不全が続くことである。ＲＳＶ感染は喘息を悪化させ、喘息の誘発に関与し得る。

ＲＳＶは、ニューモウイルスファミリーのマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ＲＳＶのゲノムは、１５.２キロベースのＲＮＡの単一、ネガティブセンス鎖であり、これは、ゲノムの３’末端で単一ウイルスプロモーターを開始する連続的スタート・ストップ機構により、ウイルスポリメラーゼにより１０個のｍＲＮＡに転写される。各ｍＲＮＡは、２つの別々のタンパク質Ｍ２－１およびＭ２－２をコードする２つの重複オープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を有するＭ２ ｍＲＮＡ以外、１個の主要タンパク質をコードする。１１個のＲＳＶタンパク質は、ＲＮＡ結合核タンパク質(Ｎ)、リンタンパク質(Ｐ)、大ポリメラーゼタンパク質(Ｌ)、付着糖タンパク質(Ｇ)、融合タンパク質(Ｆ)、小疎水性(ＳＨ)表面糖タンパク質、内部マトリックスタンパク質(Ｍ)、２個の非構造的タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２ならびにＭ２－１およびＭ２－２タンパク質である。ＲＳＶ遺伝子順序は、３’－ＮＳ１－ＮＳ２－Ｎ－Ｐ－Ｍ－ＳＨ－Ｇ－Ｆ－Ｍ２－Ｌである。各遺伝子は、各遺伝子の上流末端に存在し、それぞれの遺伝子の転写に関与する遺伝子開始(ＧＳ)シグナルおよび各遺伝子の下流末端に存在し、ポリＡテイルの合成と続くｍＲＮＡ遊離に関与する遺伝子終始(ＧＥ)シグナルと称される短保存転写シグナルが隣接する。

ＲＳＶ ＦおよびＧタンパク質は、ＲＳＶ中和抗体を誘発することが知られる唯一のＲＳＶタンパク質であり、主要保護抗原である。Ｆタンパク質は、一般にＧタンパク質より有効な中和および保護抗原であると考えられる。ＦはまたＲＳＶ株で比較的良く保存されており、Ｇタンパク質は実質的に相違し得る。Ｇにおける相違は、ＲＳＶ株を２つの抗原サブグループ、ＡおよびＢに分離する主要因子である(ＧおよびＦについて２サブグループでそれぞれ約５３％および約９０％アミノ酸配列同一性)。本発明のツールおよび方法は、サブグループＡのＲＳＶ株Ａ２に焦点を絞っているが、何れかのサブグループの他株に容易に適用され得る。

ＲＳＶに対するワクチンおよび抗ウイルス剤は、多数の研究者により前臨床および臨床開発中である；しかしながら、ＲＳＶに対する日常的な使用に供するワクチンまたは抗ウイルス剤は、商業的に入手可能ではない。

ＲＳＶワクチンの開発は１９６０年代から進行中であるが、多数の因子により複雑化している。例えば、不活性化ＲＳＶでのＲＳＶ無感作乳児の免疫化は、その後の自然のＲＳＶ感染による疾患増悪の呼び水となり、実験動物での試験は、疾患増悪がまた精製ＲＳＶサブユニットワクチンとも関連することを示す。しかしながら、ＲＳＶ疾患増悪は、生存または生存ベクター化ＲＳＶワクチンに関連して観察されておらず、この重要な観察は、多数の臨床試験で確認されている(Wright, et al., 2007, Vaccine 25:7372-7378)。それ故に、不活性化およびサブユニットワクチンは、乳児および幼児には禁忌であり、一方で主要なワクチン標的集団であるこの集団に使用するために、適切に弱毒化された生存および生存ベクター化ワクチンが許容される。

免疫保護に対する他の障害は、ＲＳＶが、免疫保護の有効性が減少している場所である呼吸気道管腔の表在性細胞で複製し、疾患を引き起こすことである。それ故に、ＲＳＶ感染の免疫制御は、非効率的であり、しばしば不完全であり、ＲＳＶワクチンが可能な限り免疫原性であることが重要である。ＲＳＶワクチンに対する他の障害は、保護免疫応答の強度がウイルス複製(および抗原産生)の程度とほぼ比例することである。それ故に、生存ワクチンを作製するために必要なＲＳＶの弱毒化は、一般に複製および抗原合成の減少、そして同時の免疫原性の減少を伴い、従って十分に免疫原性でありながら、良好な耐容性を示す複製レベルを特定することが必須である。

ＲＳＶワクチン開発の他の態様は、該ウイルスが齧歯類およびサルなどの大部分の実験動物で効率的に複製しないことである。チンパンジーは、より許容されるが、ＲＳＶ研究にはもはや利用可能ではない。従って、ＲＳＶワクチン開発は、開発の初期段階から臨床試験に大きく依存する。さらに、ＲＳＶは、細胞培養で中程度の力価にまでしか増殖せず、しばしば精製が困難な長い線維で存在する。さらに、ＲＳＶは、取り扱い中に容易に感染力を失い得る。

他の障害は、弱毒化変異の同定および開発の困難性である。適切な変異は、インビボで弱毒化でなければならないが、インビトロでの複製は、これが効率的ワクチン製造に必須であるため、限定が最小であるべきである。さらに他の障害は、ＲＮＡウイルスの特徴である遺伝的不安定性であり、それによって弱毒化変異は、野生型(ｗｔ)割り当てまたは非弱毒化表現型を付与する別の割り当てに復帰し得る。

配列設計および合成生物学の複合アプローチは、広範な標的修飾を伴うＤＮＡ分子の産生を可能にする。病原性微生物の１以上のＯＲＦがアミノ酸コード化に影響することなくヌクレオチドレベルで修飾される同義ゲノム再コード化は、現在、特にＲＮＡウイルスについて、病原体適応度減少および有望な生存弱毒化ワクチン作製のために、広範に評価されている。同義ゲノム再コード化による弱毒化の主な戦略は、コドン脱最適化(ＣＤ)、コドン対脱最適化(ＣＰＤ)およびジヌクレオチドＣｐＧおよびＵｐＡ含量増加(これは、通常ＣＤおよびＣＰＤの結果である)である。

脱最適化ウイルスゲノムは、１以上のＯＲＦに数十から数千のサイレントヌクレオチド変異を含む。おそらく、弱毒化は多数の個々の変異の和である。この変異多様性は、多数の変異が病原性への復帰に対する相当な障壁を呈するため、実質的脱弱毒化に対する安定性を付与すると予測される。原則として、数千の弱毒化変異の背景として、何らかの単一部位復帰が、非常に小さい選択的利点しか生じない。このモデル下で想像できる復帰への最も可能性のある進路は、脱弱毒化へのゆっくりした進行を提供する、多数の個々の変異の漸進的蓄積である。

今日まで、大規模脱最適化ウイルスの遺伝的安定性試験は、脱弱毒化が実際低いように見えることを示しており、これらのウイルスが遺伝的に安定であることを示唆する。しかしながら、これらの試験の重要な制限は、脱最適化ウイルスが、一般に、脱弱毒化変異を有するウイルスの増殖に好都合である、強い選択圧に付されていないことである。

それ故に、インビトロで効率的に複製し、最大限免疫原性であり、弱毒化され、インビボ脱弱毒化に抵抗性である、生存弱毒化ＲＳＶ株に対する要求が続いている。

発明の概要
ここに開示するのは、インビボで弱毒化表現型を示すヒト呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)の組み換え株産生に単独でまたは他の既知変異と組み合わせて有用である、インビトロ推定的脱弱毒化変異(presumatively de-attenuating mutation in vitro)である。さらにここに開示するのは、ＲＳＶワクチンとして使用するのに適する新規生存弱毒化ＲＳＶ株である。またここに提供されるのは、開示するウイルスの発現に関連する方法および組成物である。例えば、記載するウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド分子が開示される。

ある実施態様において、本発明は、呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)ゲノムまたはアンチゲノム配列を含む弱毒化表現型を有する組み換えＲＳＶバリアントをコードする単離ポリヌクレオチド分子を含み、ここで、該ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、Ｌタンパク質のＬ ＯＲＦにおける配列番号１１のＴ１１６６に対応する位置での変異により修飾されている。

ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、(ｉ)Ｍ２－１タンパク質のＭ２－１ ＯＲＦにおける配列番号９のＮ８８またはＡ７３に対応する位置での変異；(ii)Ｎタンパク質のＮ ＯＲＦにおける配列番号３のＫ１３６に対応する位置での変異；(iii)Ｐタンパク質のＰ ＯＲＦにおける配列番号４のＥ１１４に対応する位置での変異；および(iv)これらの組み合わせからなる群から選択される変異によりさらに修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、(ｉ)Ｍ２－１タンパク質のＭ２－１ ＯＲＦにおける配列番号９のＮ８８に対応する位置での変異；(ii)Ｎタンパク質のＮ ＯＲＦにおける配列番号３のＫ１３６に対応する位置での変異；(iii)Ｐタンパク質のＰ ＯＲＦにおける配列番号４のＥ１１４に対応する位置での変異；および(iv)これらの組み合わせからなる群から選択される変異によりさらに修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、(ｉ)Ｍ２－１タンパク質のＭ２－１ ＯＲＦにおける配列番号９のＡ７３に対応する位置での変異；(ii)Ｎタンパク質のＮ ＯＲＦにおける配列番号３のＫ１３６に対応する位置での変異；(iii)Ｐタンパク質のＰ ＯＲＦにおける配列番号４のＥ１１４に対応する位置での変異；および(iv)これらの組み合わせからなる群から選択される変異によりさらに修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、変異(ｉ)～(iii)の少なくとも２つにより修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、変異(ｉ)～(iii)の全てにより修飾されている。

ある実施態様において、Ｌタンパク質のＬ ＯＲＦにおける配列番号１１のＴ１１６６に対応する位置での変異はＴ１１６６Ｉである。ある実施態様において、(ａ)Ｍ２－１タンパク質のＭ２－１ ＯＲＦにおける配列番号９のＮ８８に対応する位置での変異はＮ８８Ｋであり、Ｍ２－１タンパク質のＭ２－１ ＯＲＦにおける配列番号９のＡ７３に対応する位置での変異はＡ７３Ｓであり；(ｂ)Ｎタンパク質のＮ ＯＲＦにおける配列番号３のＫ１３６に対応する位置での変異はＫ１３６Ｒであり；そして(ｃ)Ｐタンパク質のＰ ＯＲＦにおける配列番号４のＥ１１４に対応する位置での変異はＥ１１４Ｖである。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、変異ａ～ｃの少なくとも２つにより修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、変異ａ～ｃの全てにより修飾されている。ある実施態様において、Ｌタンパク質のＬ ＯＲＦにおける配列番号１１のＴ１１６６に対応する位置での変異はＴ１１６６Ｉである。

ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、Ｌタンパク質における配列番号１１のＴ１１６６Ｉ、Ｍ２－１タンパク質における配列番号９のＮ８８Ｋ、Ｎタンパク質における配列番号３のＫ１３６ＲおよびＰタンパク質における配列番号４のＥ１１４Ｖに対応する変異により修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、Ｌタンパク質における配列番号１１のＴ１１６６Ｉ、配列番号９におけるＭ２－１タンパク質のＡ７３Ｓ、Ｎタンパク質における配列番号３のＫ１３６ＲおよびＰタンパク質における配列番号４のＥ１１４Ｖに対応する変異により修飾されている。

他の実施態様において、本発明は、呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)ゲノムまたはアンチゲノム配列を含む弱毒化表現型を有する組み換えＲＳＶバリアントをコードする単離ポリヌクレオチド分子を含み、ここで、該ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ１に示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ１－Ａに示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ１－Ｂに示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。

他の実施態様において、本発明は、呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)ゲノムまたはアンチゲノム配列を含む弱毒化表現型を有する組み換えＲＳＶバリアントをコードする単離ポリヌクレオチド分子を含み、ここで、該ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ２に示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ２－Ａに示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ２－Ｂに示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。

他の実施態様において、本発明は、呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)ゲノムまたはアンチゲノム配列を含む弱毒化表現型を有する組み換えＲＳＶバリアントをコードする単離ポリヌクレオチド分子を含み、ここで、該ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ３に示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ３－Ａに示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ３－Ｂに示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。

ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、Ｍ２－２、ＮＳ１およびＮＳ２から選択されるタンパク質の少なくとも一つにおいて欠失を含む。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、コドン対脱最適化されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムのＬ－ＯＲＦは、コドン対脱最適化されている。

ある実施態様において、本発明は、配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む。ある実施態様において、本発明は、配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一である、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む。ある実施態様において、本発明は、配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも約９５％同一である、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む。ある実施態様において、本発明は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む。

ある実施態様において、本発明は、上記単離ポリヌクレオチド分子を含む、ベクターを含む。ある実施態様において、本発明は、上記単離ポリヌクレオチド分子を含む、細胞を含む。

ある実施態様において、本発明は、免疫有効量の上記単離ポリヌクレオチド分子によりコードされる組み換えＲＳＶバリアントを含む医薬組成物を含む。ある実施態様において、本発明は、該医薬組成物を投与することを含む、対象にＲＳＶに対してワクチン接種する方法を含む。ある実施態様において、本発明は、該医薬組成物を投与することを含む、免疫応答を誘発する方法を含む。ある実施態様において、医薬組成物は、鼻腔内投与される。ある実施態様において、医薬組成物は、注射、エアロゾル送達、経鼻スプレーまたは点鼻により投与される。

ある実施態様において、本発明は、上記単離ポリヌクレオチドによりコードされる組み換えＲＳＶバリアントを含む、生存弱毒化ＲＳＶワクチンを含む。ある実施態様において、本発明は、ＲＳＶワクチンを含む医薬組成物を含む。ある実施態様において、本発明は、上記単離ポリヌクレオチド分子を発現させることを含む、ワクチンを製造する方法を含む。

図１Ａ～Ｇは、Ｍｉｎ＿ＦＬＣが温度ストレス試験の間表現型的に安定であったが、Ｍｉｎ＿Ｌはそうではなかったことを示す。(Ａ)ｗｔ(灰色)またはＣＰＤ(黒色)であるＯＲＦを示す、Ｍｉｎ＿ＬおよびＭｉｎ＿ＦＬＣの遺伝子地図。ベロ細胞における各ウイルスに導入した変異数および遮断温度(Ｔ_ＳＨ)を示す。(Ｂ～Ｅ)温度ストレス試験における連続継代の間の各継代レベルでのインキュベーション温度およびウイルス収量を示す。Ｔ２５フラスコにおけるベロ細胞の同型培養を、記載するウイルスでＭＯＩ ０.１で感染させ、ウイルス細胞傷害性効果が広範であったときまたは細胞が脱離し始めたとき(３７℃以降でのＭｉｎ＿ＦＬＣの継代について、Ｃ)、フラスコを集め、浄化培養液を、新しいフラスコで１：５で継代させた。各開始同型フラスコは、個々の一連の継代を開始した(系譜)。浄化培養液の一定量を、力価測定および配列分析のために凍結させた。(Ｂ、Ｃ)Ｍｉｎ＿ＦＬＣの温度ストレス試験である。Ｍｉｎ＿ＦＬＣを接種した２つの対照フラスコ(Ｂ)を、３２℃の許容される温度で１８回継代した。１０のさらなる複製(Ｃ)を、３２～４０℃で、各温度２継代で継代した。(Ｄ、Ｅ)Ｍｉｎ＿Ｌの温度ストレス試験である。Ｍｉｎ＿Ｌを接種した２つの対照フラスコ(Ｄ)を、３２℃の許容される温度で８回継代した。１０のさらなる複製(Ｅ)を、３７～４０℃で、各温度２継代で継代した。分化系列＃３および８を示す。(Ｆ、Ｇ)ディープシークエンシングにより決定した継代シリーズの間の分化系列＃３(Ｆ)および＃８(Ｇ)における最も豊富な変異(少なくとも１継代で読み取りデータの＞３０％)の蓄積である(詳細なデータについては、表Ｓ２およびＳ３参照)。 同上。

図２Ａ～Ｃは、異なるウイルス亜集団に分離したＭ２－１変異[Ａ７３Ｓ]および[Ｎ８８Ｋ]を示す。(Ａ)図１Ｅにおける実験からの１０分化系列の各々のＰ６(３９℃での第二継代)でのＭ２－１変異[Ａ７３Ｓ]または[Ｎ８８Ｋ]を含むディープシークエンシング読み取りデータのパーセンテージを示す。(Ｂ)同じ読み取りデータにおけるコドン７３(ｗｔ対[Ａ７３Ｓ])および８８(ｗｔ対[Ｎ８８Ｋ])での意図する割り当ての組み合わせを含むディープシークエンシング読み取りデータのパーセンテージにより説明される、Ｍ２－１変異[Ａ７３Ｓ]と[Ｎ８８Ｋ]の関連喪失；両コドンにまたがる図１Ｆにおける実験からの読み取りデータに基づく。(Ｃ)Ｍ２－２ ＯＲＦの３’末端から中央までのＲＳＶゲノムの８.２kb領域に対応する連続的読み取りデータのPacBioシークエンシングにより決定した系譜＃３の最初の４継代の間のＭ２－１変異[Ａ７３Ｓ]と[Ｎ８８Ｋ]および他の変異の連関の程度(図１ＥおよびＦ)。４つの主要なウイルス亜集団が同定され、同じゲノム上に関連する変異を示す。 同上。 同上。

図３Ａ～Ｄは、Ｍｉｎ＿Ｌ誘導体の温度感受性およびインビトロ複製に対する特異的変異の効果を示す。系譜＃３で同定された５つの主要な変異(Ｎ[Ｋ１３６Ｒ]、Ｐ[Ｅ１１４Ｖ]、Ｌ[Ｔ１１６６Ｉ]、Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]およびＭ２－１[Ａ７３Ｓ]、図１Ｆ)を、表現型解析のためにＭｉｎ＿Ｌに個々におよび組み合わせで部位特異的変異導入および逆遺伝学により挿入した。Ｍｉｎ＿Ｌ由来ウイルスを、導入変異を担持する遺伝子名に基づき名付け、Ｍ２－１変異を括弧内に特定した。(Ａ)変異をウイルスゲノム地図に示す。(Ｂ)公開された方法を使用して、３２℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃および４０℃でのプラーク形成の効率により決定したＴ_ＳＨ。実験をウイルス＃１、５、１２および１４で４回、ウイルス＃２、３、７、８および９で３回、ウイルス＃４および１１で２回、そしてウイルス＃６、１０および１３で１回実施した(棒グラフ：中央および範囲)。(Ｃ、Ｄ)インビトロでのＭｉｎ＿Ｌ由来変異体複製を示す。ベロ細胞を３２℃および３７℃で感染させた(０.０１のＭＯＩ)。力価は、各時点での２複製の２反復力価測定の平均に対応する。標準偏差を示す。ウイルスの数が多いため、分析を実験＃１(Ｃ)および＃２(Ｄ)に分けた。 同上。

図４Ａ～Ｇは、Ｍｉｎ＿Ｌ誘導体のＲＮＡ合成およびプラークサイズに対する特異的変異の効果を示す。(Ａ～Ｅ)ベロ細胞の同型培養を、記載するウイルスで感染させた(３のＭＯＩ)。細胞関連ＲＮＡ、タンパク質およびウイルスのために、感染後４～２４時間、４時間毎に培養物を採取した。(Ａ)ポジティブセンスウイルスＲＮＡ(すなわち、ｍＲＮＡ＋アンチゲノム)を、鎖特異的ＲＴ－ｑＰＣＲによりトリプリケートで定量した。Ｐについてのデータを示す。ＱＰＣＲ結果を比較閾値サイクル(ΔＣｔ)方法を使用して分析し、１８Ｓ ｒＲＮＡに対して正規化し、４時間時点でＭｉｎ＿Ｌを超えるｌｏｇ_２増加倍率として表した。(Ｂ)ウェスタンブロッティングによるＰタンパク質発現の定量。(Ｃ)鎖特異的ＲＴ－ｑＰＣＲによる、Ｌ ｍＲＮＡ＋アンチゲノムの定量(感染後４時間時点に対する増加倍率、ｗｔ ｒＲＳＶにおけるｗｔ Ｌ遺伝子とＭｉｎ＿Ｌおよびその誘導体に存在するＣＰＤ Ｌ遺伝子で異なるプライマー－プローブセットが必要であったため、各ウイルスについて別々に計算)。Ｗｔ ＬおよびＣＰＤ Ｌについて、データは、Ｌ ＯＲＦに添って設計したそれぞれ３つおよび４つの異なるプライマー－プローブセットに由来し、中央値と範囲を示す。(Ｄ)Ｍｉｎ＿Ｌの感染後４時間時点を超える増加倍率として表す、鎖特異的ＲＴ－ｑＰＣＲによる細胞関連ゲノムＲＮＡの定量である。(Ｅ)３２℃および３７℃でインキュベートし、３２℃でアッセイした培養からのウイルス力価を示す。(Ｆ－Ｇ)ウイルスプラークサイズ。ベロ細胞を、３０pfu／２cm^２ウェルのｗｔ ｒＲＳＶ、Ｍｉｎ＿ＬおよびＭｉｎ＿Ｌ由来変異体で感染させ、メチルセルロース下、３２℃で１２日間インキュベートした。プラークを免疫染色により可視化し、Image Jを使用するＩＲ造影(Licor)により定量した。Ｆ)ウイルスプラークサイズの代表図。Ｇ)示すウイルスのプラークサイズ分布。最小１０００プラーク／ウイルスを測定した(＊＝ｐ≦０.０５)。 同上。

図５Ａ～Ｄは、齧歯類におけるＭｉｎ＿Ｌ誘導体の分析を示し、これは、Ｍ２－１変異Ａ７３ＳおよびＮ８８Ｋの異なる効果を示し、改善されたワクチン候補ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌを特定する。マウスにおける感染後４日目(Ａ)および５日目(Ｂ)またはハムスターにおける感染後３日目(Ｃ)のＭｉｎ＿Ｌ、Ｍｉｎ＿Ｌ変異体およびｗｔ ｒＲＳＶの複製を示す。２０マウス(Ａ－Ｂ)または１８ハムスター(Ｃ)の群を、１０^６pfuの示すウイルス／動物で鼻腔内感染させた。マウス試験では感染後４日目(Ａ)、５日目(Ｂ)および１０日目(データは示していない)またはハムスター試験では３日目(Ｃ)、鼻甲介(ＮＴ)および肺におけるＲＳＶ力価を、実験法セクションに記載のとおり決定した。検出限界を点線により示す。Ｄ)９ハムスター／群からのハムスターにおける２６日目のＲＳＶ中和抗体。６０％プラーク減少中和抗体力価(ＰＲＮＴ_６０)を、先に記載のとおり決定した。ｗｔ ｒＲＳＶと比較した統計的差異を各グラフの上部に示した；Ｍｉｎ＿ＬとＭｉｎ＿Ｌ由来変異体の間の統計的差異を括弧で示した(＊ｐ≦０.０５、＊＊ｐ≦０.０１、＊＊＊ｐ≦０.００１および＊＊＊＊ｐ≦０.０００１)。 同上。

図６Ａ～Ｄは、Ｍ２－１四量体に対する脱弱毒化変異の影響の分子モデリングを示す。(Ａ)ｗｔ Ｍ２－１四量体の平面図。(Ｂ)アミノ酸Ａ７３およびＮ８８を含むｗｔ四量体の１領域の拡大。(Ｃ)Ｓ７３変異近位領域の分子動態スナップショット。[Ａ７３Ｓ]変異が示され、矢印は、予測新規水素結合を示す。(Ｄ)Ｋ８８変異体領域の分子動態スナップショット。[Ｎ８８Ｋ]変異が示され、矢印は、予測される新規塩架橋を示す。 同上。

図７Ａ～Ｂは、３２℃で１８継代中のＭｉｎ＿ＦＬＣにおける不定変異の最小蓄積を示す。Ｍｉｎ＿ＦＬＣを、３２℃で１８継代に付した。１８継代目の最後に、ウイルスＲＮＡを系譜＃１(Ａ)および＃２(Ｂ)から抽出し、完全ゲノムを重複ＲＴ－ＰＣＲにより増幅し、ディープシークエンシング(Ion Torrent)により分析した。不定変異(これは特異的には示していない)は、それらのゲノム位置および相対的存在量を示す棒により示す。ＷＴ遺伝子を灰色で着色し、ＣＰＤ遺伝子を黒色で着色した。 同上。

図８Ａ～Ｂは、３２℃で６継代中のＭｉｎ＿Ｌにおける不定変異の最小蓄積を示す。Ｍｉｎ＿Ｌを、ベロ細胞で３２℃で連続６回継代した。６継代目の最後に、ウイルスＲＮＡを系譜＃１(Ａ)および＃２(Ｂ)から抽出し、完全ゲノムを重複ＲＴ－ＰＣＲにより増幅し、ディープシークエンシング(Ion Torrent)により分析した。不定変異を、それらのゲノム位置および相対的存在量を示す棒により示す；特異的ヌクレオチド変化は示していない。ＷＴ遺伝子を灰色で着色し、ＣＰＤ遺伝子を黒色で着色した。 同上。

図９は、Ｍｉｎ＿Ｌ誘導体の表現型に対する特異的変異の寄与を示す：細胞関連ポジティブセンスＲＮＡ(ｍＲＮＡ＋アンチゲノム)のＲＴ－ｑＰＣＲ。ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、ＦおよびＭ２ ｍＲＮＡについてベロ細胞のｗｔ ｒＲＳＶ、Ｍｉｎ＿ＬおよびＭｉｎ＿Ｌ－誘導体での感染中のＲＴ－ｑＰＣＲデータがここに示される。 同上。

図１０は、Ｍｉｎ＿Ｌ誘導体の表現型に対する特異的変異の寄与を示す：Ｍｉｎ＿ＬおよびＭｉｎ＿Ｌ由来変異体のタンパク質発現。ベロ細胞を、３２℃または３７℃で、Ｍｉｎ＿Ｌ、Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]、Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]、ＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]、ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌまたはｗｔ ｒＲＳＶで３pfu／細胞のＭＯＩで感染させた。感染４～２４時間後まで４時間毎、総細胞ライセートを、６ウェルプレートの１ウェルから、NuPage LDSサンプル緩衝液(Life Technologies)中に採取した。ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｇ、ＦおよびＭ２－１のウェスタンブロット分析を、材料および方法セクションに記載のとおり、実施した。ＧＡＰＤＨタンパク質を充填対照として使用した。膜を、Odyssey(登録商標)Infrared Imaging Systemでスキャンした。所得データを、Odysseyソフトウェア、バージョン３.０を使用して分析した。目的の同定されたＲＳＶタンパク質の定量のために、背景蛍光を補正した。記載する値は、タンパク質バンドあたりの中央蛍光強度を示す。 同上。

図１１Ａ～Ｂは、Ｍｉｎ＿ＦＬＣ由来変異体のＴ_ＳＨを示す。Ｍｉｎ＿ＦＬＣ温度感受性に対するＭｉｎ＿Ｌの温度感受性喪失に関与する変異の効果を試験した。Ａ)そうするために、Ｍｉｎ＿Ｌ系譜＃３(Ｎ、Ｐ、Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]およびＬ遺伝子において)または＃８(Ｍ２－１変異[Ａ７３Ｓ])において同定された変異を、単独でまたは記載する組み合わせでＭｉｎ＿ＦＬＣ主鎖に再導入し、由来ｃＤＮＡを、サンガー・シークエンシングにより完全に配列決定した。ウイルスを逆遺伝学によりレスキューし、１回継代し、Ｐ２のウイルスストックを力価測定した。大部分のウイルスストックの低ウイルス力価のため、変異体ウイルスＭｉｎ＿ＦＬＣ＿Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]のみを、サンガー・シークエンシングにより完全に配列決定した。Ｂ)これらＭｉｎ＿ＦＬＣ由来変異体のいくつかのｔｓ表現型を、３２℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃および４０℃でのプラーク形成高率により評価した。プラークアッセイをベロ細胞でデュプリケートで実施し、先に記載のとおり、種々の温度で温度制御水浴中、密封桶でインキュベートした。実験を２回実施した。中央値および標準偏差を示す。

図１２Ａ～Ｃは、ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌが温度ストレス試験下表現型的に安定であることを示す。Ａ)ＲＳＶゲノム組織の略図。略された遺伝子名を示す。ｗｔまたはＣＰＤ ＯＲＦを伴う遺伝子を、それぞれ灰色および黒色で示す。系譜＃３で同定され、ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌウイルスを作製するためにＭｉｎ＿Ｌ主鎖に導入されたＮ、Ｐ、Ｍ２－１およびＬにおける変異を、ウイルスゲノムにおける棒により示す。Ｂ)３２℃でのおよびＣ)温度ストレス継代からの最終ウイルス力価(増加温度は、ｘ軸の下に示す)。各記号は、１複写物を示す。 同上。

図１３は、ＲＳＶタンパク質ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２－１、Ｍ２－２およびＬのアミノ酸配列を示す。これらは、それぞれ配列番号１～１１により表される。 同上。

図１４は、組み換えＲＳＶ Ｍｉｎ＿Ｌ－ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌのヌクレオチド配列を示す。これは、配列番号１４により示される。 同上。 同上。 同上。

詳細な記載
ここに提供されるのは、ヒトにおける弱毒化、生存ワクチンとして使用するのに適する組み換えＲＳＶ株である。ＲＳＶ株は、下記および表Ｓ１、Ｓ２およびＳ３に挙げる位置から選択されるＲＳＶゲノムまたはアンチゲノム配列における１以上の変異の導入により産生され得る。これらの変異は、強い選択圧の状況で、脱最適化ヒト呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)ワクチン候補の表現型復帰の評価により、特定された。

ＲＳＶのコドン対脱最適化(ＣＰＤ)バージョンは、弱毒化および温度感受性であった。徐々に温度を上げながら連続継代中、Ｍｉｎ＿ＦＬＣと命名した、１１ ＯＲＦ中９に２,６９２同義変異を含むＣＰＤ ＲＳＶは温度感受性を失わず、３２℃の許容される温度、ならびに継代中の温度上昇条件下、７か月の継代インビトロの間遺伝的におよび表現型的に安定であった。これは、Ｍｉｎ＿ＦＬＣの安定性の強い証拠であり、広範なＣＰＤが用いられる限り、ＲＳＶおよび関連ウイルスの生存弱毒化ワクチン開発のための複数遺伝子のＣＰＤの安全性を確認する。

しかしながら、Ｍｉｎ＿Ｌと命名した、ポリメラーゼＬ ＯＲＦのみを脱最適化したＣＰＤ ＲＳＶは、３２℃で高度に安定であったが、驚くべきことに、そのＣＰＤに関与する多数の変化にもかかわらず、実質的弱毒化を急速に喪失し、温度感受性制限を回避するように進化した。ウイルス集団の包括的配列分析は、Ｌ ＯＲＦにおける、多数の異なる脱弱毒化されている可能性がある変異を同定し、驚くべきことにその多くは、ＣＰＤに付されていない他のＯＲＦに現れた。特に、Ｍｉｎ＿Ｌ分化系列のディープシークエンシングは、予測されたとおり、ＣＰＤ Ｌ ＯＲＦに特異的にではなく、むしろＮＳ２ ＯＲＦ以外の全てに変異を同定した。驚くべきことに、Ｌにおける変異の多くは、ＣＰＤに関与しなかったヌクレオチドおよびコドンで生じた。これらを表Ｓ１、Ｓ２およびＳ３に示す。

これらの推定的脱弱毒化変異の一部は、インビトロで脱弱毒化であるものの、他の推定的脱弱毒化変異とＭｉｎ＿Ｌに導入したとき、インビボでＭｉｎ＿Ｌよりさらに弱毒化されているという、驚くべき効果を有することが判明した。

ある例示的実施態様において、下に詳述する(ヌクレオチド配列は図１４に示す)、Ｍｉｎ＿Ｌ－ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌ(ここではＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌとも称する)は、インビボで、脱弱毒化であるよりむしろ、Ｍｉｎ＿Ｌより弱毒化であった。さらに、ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌウイルスはインビボで高度に弱毒化であるが、驚くべきことに野生型ＲＳＶと同程度に免疫原性であった。さらに、それは、さらなるストレス試験中、何ら顕著な変異を獲得せず(図１２参照)、それ故に、Ｍｉｎ＿Ｌより遺伝的に安定であった。それ故に、Ｍｉｎ＿Ｌ－ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌは、次の理由により、ワクチン候補としてＭｉｎ＿Ｌを超える相当な改善を示す。それは、ｗｔ ＲＳＶと同程度の免疫原性でありながら、Ｍｉｎ＿Ｌより有意にインビボでより弱毒化された。それは、３９～４０℃でストレス試験において継代したとき、付加的変異を蓄積しなかった。それは、ベロ細胞においてＭｉｎ＿Ｌと比較して複製の増加を示し、これはワクチン製造に重要である。さらに、下に詳述するとおり、Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]および[Ａ７３Ｓ]変異が不適合性であるため、このウイルスは、ハムスターモデルにおいて脱弱毒化されたＭ２－１[Ａ７３Ｓ]変異の獲得に高度に抵抗性である。

従って、ここに提供されるのは、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノム配列を含む弱毒化表現型を有する組み換えＲＳＶ株であり、ここで、該ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ１、Ｓ２またはＳ３から選択される１以上の変異により修飾されている。表Ｓ１、Ｓ２またはＳ３に挙げた変異は推定的脱弱毒化変異であるが、驚くべきことにインビボで弱毒化表現型を付与し得る。≧２５％読み取りデータに存在する表Ｓ１、Ｓ２およびＳ３に挙げた変異を、それぞれ表Ｓ１－Ａ、Ｓ２－ＡおよびＳ３－Ａに示し、≧５０％読み取りデータに存在する最も豊富な変異を、それぞれ表Ｓ１－Ｂ、Ｓ２－ＢおよびＳ３－Ｂに示す。

ある実施態様において、本発明は、呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)ゲノムまたはアンチゲノム配列を含む弱毒化表現型を有する組み換えＲＳＶバリアントをコードする単離ポリヌクレオチド分子を含み、ここで、該ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ１に示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ１－Ａに示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ１－Ｂに示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。

ある実施態様において、本発明は呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)ゲノムまたはアンチゲノム配列を含む弱毒化表現型を有する組み換えＲＳＶバリアントをコードする単離ポリヌクレオチド分子を含み、ここで、該ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ２に示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ２－Ａに示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ２－Ｂに示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。

ある実施態様において、本発明は呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)ゲノムまたはアンチゲノム配列を含む弱毒化表現型を有する組み換えＲＳＶバリアントをコードする単離ポリヌクレオチド分子を含み、ここで、該ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ３に示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ３－Ａに示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、表Ｓ３－Ｂに示す位置から選択される１以上の変異により修飾されている。

ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、Ｌタンパク質のＬ ＯＲＦにおいてアミノ酸残基１１６６に対応する位置またはそれをコードするコドンにおける変異により修飾され得る。ある実施態様において、Ｌ ＯＲＦにおける変異は、図１３の配列(配列番号１１)に示すＬタンパク質のＴ１１６６に対応する位置であり得る。ある実施態様において、変異は、その位置でスレオニン以外のアミノ酸をコードさせ得る。ある実施態様において、変異は、その位置でイソロイシンをコードさせ得る。この変異、Ｔ１１６６Ｉは表Ｓ１、Ｓ１－ＡおよびＳ１－Ｂに挙げる。

ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、１以上の付加的変異によりさらに修飾され得る。付加的変異は、Ｌ ＯＲＦまたは他のＯＲＦの何れかにおいて行われ得る。例えば、ある実施態様において、１以上の付加的変異は、Ｍ２－１ ＯＲＦ、Ｎ ＯＲＦまたはＰ ＯＲＦにおいて行われ得る。

ある実施態様において、付加的変異は、Ｍ２－１タンパク質のＭ２－１ ＯＲＦにおけるアミノ酸残基８８または７３に対応する位置またはそれをコードするコドンにおい行われ得る。ある実施態様において、Ｍ２－１ ＯＲＦにおける変異は、図１３の配列に示すＭ２－１タンパク質のＮ８８またはＡ７３に対応する位置で行われ得る(配列番号９)。ある実施態様において、Ｍ２－１ ＯＲＦにおける付加的変異は、Ｍ２－１タンパク質の位置Ｎ８８に対応する位置であり得て、その位置でアスパラギン以外のアミノ酸をコードさせ得る。ある実施態様において、それは、その位置でリシンをコードさせ得る(Ｎ８８Ｋ)。ある実施態様において、Ｍ２－１ ＯＲＦにおける付加的変異は、Ｍ２－１タンパク質の位置Ａ７３に対応する位置であり得て、その位置でアラニン以外のアミノ酸をコードさせ得る。ある実施態様において、Ｍ２－１タンパク質のアミノ酸残基７３をコードするコドンにおける変異は、その位置でセリンをコードさせ得る(Ａ７３Ｓ)。

ある実施態様において、付加的変異は、Ｎタンパク質のＮ ＯＲＦにおけるアミノ酸残基１３６に対応する位置またはそれをコードするコドンにおいてなされ得る。ある実施態様において、Ｎ ＯＲＦにおける変異は、図１３の配列(配列番号３)に示すＮタンパク質のＫ１３６に対応する位置であり得て、その位置でリシン以外のアミノ酸をコードさせ得る。ある実施態様において、Ｎタンパク質のアミノ酸残基１３６をコードするコドンにおける変異は、その位置でアルギニンをコードさせ得る(Ｋ１３６Ｒ)。

ある実施態様において、付加的変異は、Ｐタンパク質のＰ ＯＲＦにおけるアミノ酸残基１１４をコードするコドンにおいて行われ得る。ある実施態様において、Ｐ ＯＲＦにおける変異は、図１３の配列(配列番号４)に示すＰタンパク質のＥ１１４に対応する位置であり得て、その位置でグルタミン酸以外のアミノ酸をコードさせ得る。ある実施態様において、Ｐタンパク質のアミノ酸残基１３６をコードするコドンにおける変異は、その位置でバリンをコードさせ得る(Ｅ１１４Ｖ)。

ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、上記変異の少なくとも２つを含むように修飾され得る。例えば、それは、Ｍ２－１タンパク質におけるＮ８８またはＡ７３、Ｎタンパク質におけるＫ１３６、Ｐタンパク質におけるＥ１１４およびＬタンパク質におけるＴ１１６６に対応する位置で少なくとも２つの変異を含み得る。ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、上記の全４変異を含むように修飾され得る。それ故に、例えば、ある実施態様において、それは、Ｍ２－１タンパク質におけるＮ８８、Ｎタンパク質におけるＫ１３６、Ｐタンパク質におけるＥ１１４およびＬタンパク質におけるＴ１１６６に対応する位置に変異を含み得る。ある実施態様において、それは、Ｍ２－１タンパク質におけるＡ７３、Ｎタンパク質におけるＫ１３６、Ｐタンパク質におけるＥ１１４およびＬタンパク質におけるＴ１１６６に対応する位置に変異を含み得る。

ある実施態様において、単離ポリヌクレオチド分子は、Ｍ２－１タンパク質におけるＮ８８Ｋ、Ｎタンパク質におけるＫ１３６Ｒ、Ｐタンパク質におけるＥ１１４ＶおよびＬタンパク質におけるＴ１１６６Ｉに対応するまたはそれをコードする変異により修飾されたＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムを含み得る。ある実施態様において、単離ポリヌクレオチド分子は、Ｍ２－１タンパク質におけるＡ７３Ｓ、Ｎタンパク質におけるＫ１３６Ｒ、Ｐタンパク質におけるＥ１１４ＶおよびＬタンパク質におけるＴ１１６６Ｉに対応するまたはそれをコードする変異により修飾されたＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムを含み得る。

ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、脱最適化され得る。それ故に、ある実施態様において、ここに記載する弱毒化ＲＳＶは、ウイルスゲノムにおいて宿主細胞により最適に処理されないコドン変化の導入により、産生される。これらの変異の大部分は、ウイルスゲノムによりコードされて得られたタンパク質のアミノ酸を変化させず、そうして野生型ウイルスと同じ抗原特性を有するウイルスの産生が可能となる。しかしながら、ウイルスゲノムのコドンへの広範な非コード化変化は、ここに記載するウイルスに１以上のアミノ酸変異を発生させる選択圧をもたらし得ることは理解されるべきである。

同義コドンのこの置換は、ゲノムにおける、コドンバイアス、コドン対バイアス、脱最適化コドンおよび脱最適化コドン対の密度、ＲＮＡ二次構造、ＣｐＧジヌクレオチド含量、Ｃ＋Ｇ含量、翻訳フレームシフト部位、翻訳休止部位、組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列の存在または非存在またはこれらの任意の組み合わせを含む、種々のパラメータを変える。同義ゲノム再コード化による弱毒化のための主戦略は、コドン脱最適化(ＣＤ)、コドン対脱最適化(ＣＰＤ)およびジヌクレオチドＣｐＧおよびＵｐＡ含量増加(これは、通常ＣＤおよびＣＰＤの結果である)である。

ある実施態様において、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２－１、Ｍ２－２およびＬを含むＲＳＶのＯＲＦの任意の一つがコドン対脱最適化され得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＯＲＦの任意の２以上がコドン対脱最適化され得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＯＲＦの任意の３以上がコドン対脱最適化され得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＯＲＦの任意の４以上がコドン対脱最適化され得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＯＲＦの任意の５以上がコドン対脱最適化され得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＯＲＦの任意の６以上がコドン対脱最適化され得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＯＲＦの任意の７以上がコドン対脱最適化され得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＯＲＦの任意の８以上がコドン対脱最適化され得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＯＲＦの任意の９以上がコドン対脱最適化され得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＯＲＦの任意の１０以上がコドン対脱最適化され得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＯＲＦの任意の全てがコドン対脱最適化され得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＬ ＯＲＦがコドン対脱最適化され得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、ＭおよびＳＨ ＯＲＦがコドン対脱最適化され得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＧおよびＦ ＯＲＦがコドン対脱最適化され得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、ＦおよびＬ ＯＲＦがコドン対脱最適化され得る。

ある実施態様において、単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号１４のヌクレオチド配列に少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性(またはその間の任意の同一性％)であるヌクレオチド配列を含み得る。ある実施態様において、単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。ある実施態様において、単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。ある実施態様において、単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも約９５％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。ある実施態様において、単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを含み得る。

ある実施態様において、記載するウイルスは、ＲＳＶおよび関連ウイルスの既知弱毒化変異と組み合わせて、段階的弱毒化表現型を産生し得る。多数のこのような変異が当分野で知られ、本発明に包含される。例えば、ある実施態様において、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、Ｍ２－２ ＯＲＦ、ＮＳ１ ＯＲＦまたはＮＳ２ ＯＲＦにおける欠失により修飾され得る。

種々のＲＳＶ株が存在することを考えると(例えば、ＲＳＶ Ａ２、ＲＳＶ Ｂ１、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ)、当業者は、ＲＳＶのある株が、ある残基の位置を変えるヌクレオチドまたはアミノ酸挿入または欠失を有し得ることを認識する。例えば、他のＲＳＶ株のタンパク質が、株Ａ２と比較して、タンパク質の上流末端に２個の付加的アミノ酸を有するならば、これは、下流残基のアミノ酸ナンバリングを株Ａ２と比較して、２つ増やすことになる。しかしながら、これらの株の配列同一性の程度が大きいため、当業者は、Ａ２対照株のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と問題の株の配列を、単にアラインすることにより、対応配列の位置を決定できる。従って、ここに記載するアミノ酸およびヌクレオチド位置は、本開示で特異的に番号付けされているが、配列シフトが生じたときまたはウイルス株間の配列多様性により、他の位置に対応し得ることは理解されるべきである。２以上の関連ウイルスのタンパク質もしくはタンパク質セグメントまたは遺伝子またはゲノムもしくはゲノムセグメントの比較において、“対応”アミノ酸またはヌクレオチド残基は、異なる種において機能が正確にまたはおおよそ同等であると考えられるものである。

本開示に使用するナンバリングは、野生型ＲＳＶ Ａ２株のアミノ酸配列(ここに明示的に包含させるGenBank accession number M74568)に対応し、記載する全てのヌクレオチド配列はポジティブセンスである。１１個のＲＳＶタンパク質ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２－１、Ｍ２－２およびＬのアミノ酸配列は図１３に示し、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１に示す。

本発明のある実施態様において、組み換えＲＳＶ株は、Ｄ４６と称される株Ａ２の組み換え体に由来し得る。Ｄ４６の完全配列は、米国特許６,７９０,４４９に示される(明示的に本明細書に組み込むGenBank accession number KT992094)。(ある状況および刊行物において、親ウイルスおよび配列はＤ４６ではなくＤ５３と称されるが、アンチゲノムｃＤＮＡの繁殖に使用した細菌の株を言う記載上の差異(book-keeping difference)であり、他の意義または効果は知られていない。本発明の目的では、Ｄ４６およびＤ５３は相互交換可能である。)Ｄ４６のヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ａ２株Ｍ７４５６８の配列と、１０９９位での１ｎｔ挿入を含む、２５ヌクレオチド位置異なる。

付加的変異を、所望の特徴を有するさらなるウイルス株を構築するために、上に定義した変異と組み合わせてさらに導入し得る。例えば、加えた変異は、異なる弱毒化強度を特定し、それ故に、弱毒化の漸増をもたらし得る。それ故に、候補ワクチン株は、少なくとも１、好ましくは２以上の種々の弱毒化変異、例えば既知の、生物学的に誘導された変異ＲＳＶ株の一団から同定された変異の取り込みによりさらに弱毒化され得る。多数のこのような変異を、ここに例として記載する。この例示的一団から、弱毒化変異の大きな“一覧”を作ることができ、ここで、各変異を、弱毒化および他の望ましい表現型のレベルの目盛り定めのために、一団内の任意の他の変異と組み合わせ得る。付加的弱毒化変異は、非ＲＳＶネガティブ鎖ＲＮＡウイルスにおいて同定され、本発明のＲＳＶ変異体に、レシピエントＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムにおける対応する、相同部位に変異をマッピングし、レシピエントにおける既存配列を変異体遺伝子型に変異(同一または保存的変異)させることにより、組み込み得る。さらなる有用な変異を、ここに組み込む参考文献に記載のとおり組み換えミニゲノムシステムおよび感染性ウイルスを使用して、変異解析により経験的に決定し得る。

本発明の組み換えＲＳＶワクチン株は、逆遺伝学(Collins, et al. 1995. Proc Natl Acad Sci USA 92:11563-11567)と称される組み換えＤＮＡベースの技法を使用して製造した。この系は、規定の条件下、適正な細胞基質におけるｃＤＮＡからの完全な感染性ウイルスのデノボ取得を可能にする。逆遺伝学は、ｃＤＮＡ中間体を介するＲＳＶゲノムへの予定された変異の導入のための手段を提供する。特異的弱毒化変異は、前臨床試験で特徴付けられ、所望のレベルの弱毒化を達成するために組み合わせられた。ｃＤＮＡからのワクチンウイルスの誘導は、偶発的混入物による汚染のリスクを最小化し、継代履歴を簡潔かつ十分に文書化することを助ける。一旦取得されたら、操作されたウイルス株を、生物学に誘導されたウイルスと同様の方法で繁殖させる。継代および増幅の結果、ワクチンウイルスは、最初の取得物からの組み換えＤＮＡを含まない。

ここに記載する変異の種々の組み合わせを含む組み換えウイルス株は、例示のみの目的であり、かつ本発明の範囲を限定する意図はない。例えば、ある実施態様において、本発明の組み換えＲＳＶ株は、さらに非翻訳配列の欠失を含む。ある実施態様において、このような欠失はＳＨ遺伝子の下流末端で生じ、ここで“６１２０変異”と称する変異をもたらす。それは、ＳＨ遺伝子の下流非翻訳領域の１１２ヌクレオチドの欠失およびＳＨ遺伝子の最後の３コドンおよび終止コドンにおける５つの翻訳的にサイレントな点変異の導入を含む(Bukreyev, et al. 2001. J Virol 75:12128-12140)。組み換えウイルス名における用語“ＬＩＤ”または“６１２０”の存在は、該組み換えウイルスが６１２０変異を含むことを示す。

６１２０変異は、細菌においてアンチゲノムｃＤＮＡを安定化し、それ故に、より容易に操作および調製される。ｗｔ ＲＳＶにおいて、この変異は、インビトロで複製効率の５倍増加に寄与することが以前判明したが(Bukreyev, et al. 2001. J Virol 75:12128-12140)、インビボ複製効率を高めるとは考えられていなかった。

６１２０変異は、血清陰性乳児および小児における複製増加と関係した。それ故に、６１２０変異は、弱毒化レベルのシフトのための他の手段を提供した。また、配列の欠失は、ＳＨ遺伝子の下流非翻訳領域の６１２０変異が例であるが、原則として重要なシス作用性シグナルを含まない任意の同等なゲノム配列を含み得る(Collins and Karron. 2013. Fields Virology 6th Edition, pp 1086-1123)。欠失の候補であるゲノム領域は、他の遺伝子、遺伝子間領域およびトレーラー領域における非翻訳領域を含むが、これらに限定されない。

ある実施態様において、組み換えＲＳＶ株は、“ｃｐ”変異を含み得る。この変異は、一緒になって(それら自体)、血清陰性チンパンジーにおける複製の約１０倍減少および病気の減少に寄与する、３タンパク質(Ｎ(Ｖ２６７Ｉ)、Ｆ(Ｅ２１８ＡおよびＴ５２３Ｉ)およびＬ(Ｃ３１９ＹおよびＨ１６９０Ｙ))における一連の５アミノ酸置換をいう(Whitehead, et al. 1998. J Virol 72:4467-4471)。我々は、先にｃｐ変異が中程度の弱毒化表現型と関係することを示した(Whitehead, et al. 1999. J Virol 72:4467-4471)。

さらに、ｃｐＲＳＶの化学的変異によって誘導され、温度感受性(ｔｓ)表現型について選択された、６種の生物学的ウイルスの先の分析は、各々ｔｓ弱毒化表現型を付与し、種々の組み合わせで使用できた、計６つの独立した変異をもたらした。これらのうち５種はＬタンパク質におけるアミノ酸置換をもたらし、これらは、配列位置ではなく、ウイルス番号により名付けられた：“９５５”(Ｎ４３Ｉ)、“５３０”(Ｆ５２１Ｌ)、“２４８”(Ｑ８３１Ｌ)、“１００９”(Ｍ１１６９Ｖ)および“１０３０”(Ｙ１３２１Ｎ)(Juhasz, et al. 1999. Vaccine 17:1416-1424; Collins, et al. 1999. Adv Virus Res 54:423-451; Firestone, et al. 1996. Virology 225:419-422; Whitehead, et al. 1999. J Virol 73:871-877)。６番目の変異(“４０４”と称する)は、Ｍ２遺伝子の遺伝子開始転写シグナルにおける単一ヌクレオチド変化であった(ＧＧＧＧＣＡＡＡＴＡからＧＧＧＧＣＡＡＡＣＡ、ｍＲＮＡセンス)(Whitehead, et al. 1998. Virology 247:232-239)。我々は、最近逆遺伝学を使用して、２４８および１０３０変異の遺伝的安定性を増加させた(Luongo, et al. 2009. Vaccine 27:5667-5676; Luongo, et al. 2012. J Virol 86:10792-10804)。さらに、我々は、Ｌタンパク質におけるコドン１３１３を欠失し、それとＩ１３１４Ｌ置換を組み合わせて、遺伝的安定性を増加させることにより、新規弱毒化変異を作製した(Luongo, et al. 2013. J Virol 87:1985-1996)。

ある実施態様において、組み換え株は、Ｆタンパク質に１以上の変化、例えば“ＨＥＫ”変異を含み得て、これは、Ｆタンパク質における２アミノ酸置換、すなわちＫ６６ＥおよびＱ１０１Ｐを含む(Connors, et al. 1995. Virology 208:478-484; Whitehead, et al. 1998. J Virol 72:4467-4471に記載)。本発明の株Ａ２ Ｆ配列へのＨＥＫアミノ酸割り当ての導入は、株Ａ２の元の臨床単離体の初期継代(ヒト胚性腎細胞継代７、ＨＥＫ－７)と同一のＦタンパク質アミノ酸配列をもたらす(Connors, et al. 1995. Virology 208:478-484; Whitehead, et al. 1998. J Virol 72:4467-4471)。それは、遙かに融合性が低いＦタンパク質をもたらし、元のＡ２株臨床単離体の表現型を表すと考えられる(Liang et al. J Virol 2015 89:9499-9510)。ＨＥＫ Ｆタンパク質はたより安定な三量体も形成する(Liang et al. J Virol 2015 89：9499-9510)。これは、ＲＳＶ Ｆタンパク質の、おそらく高度に免疫原性の前融合立体構造が富化された、より信頼のおけるかつ免疫原性の形態を提供し得る(McLellan et al. Science 2013 340(6136):1113-7; Science 2013 342(6158):592-8)。それ故に、ウイルス複製の強度に対する効果に加えて、効果を有する変異を導入し得る。

ある実施態様において、組み換え株は、Ｌタンパク質における１以上の変化、例えば１３２１Ｋ(ＡＡＡ)／Ｓ１３１３(ＴＣＡ)を含む安定化１０３０または“１０３０ｓ”変異を含み得る(Luongo, et al. 2012. J Virol 86：10792-10804)。

ある実施態様において、組み換え株は、Ｎタンパク質における１以上の変化、例えばＴ２４Ａなどのアミノ置換を含み得る。個々におよび組み合わさったＳＨ、ＮＳ１およびＮＳ２遺伝子の欠失は、細胞培養において複製する能力を保持するが、次の順序で、増進的にインビボで弱毒化されたウイルスを生じる：ＳＨ＜ＮＳ２＜ＮＳ１(Bukreyev, et al. 1997. J Virol 71:8973-8982; Whitehead, et al. 1999. J Virol 73:3438-3442; Teng, et al. 2000. J Virol 74:9317-9321)。従って、ＳＨ、ＮＳ２またはＮＳ１遺伝子またはそれらのＯＲＦ部分の欠失または他の変異を、ここに記載する変異と組み合わせ得る。例えば、ある実施態様において、組み換え株は、ＳＨタンパク質の消失または除去を含む、ＳＨタンパク質における１以上の変化を含み得る。ある実施態様において、ウイルス株は、ＳＨ遺伝子に欠失を含み得る。例えば、ある実施態様において、ウイルス株は、４１９７～４６１５位(４１９８～４６１６)に４１９ヌクレオチド欠失を含み、ここで、“ΔＳＨ”変異と称する。この欠失は、図６に示すとおり、Ｍ遺伝子末端欠失、Ｍ／ＳＨ遺伝子間領域およびＳＨ ＯＲＦの欠失をもたらす。ある実施態様において、組み換え株は、ＮＳ１またはＮＳ２タンパク質において、これらタンパク質の消失または除去を含む１以上の変化を含み得る。ある実施態様において、変異は、ＮＳ２タンパク質におけるＫ５１Ｒなどのアミノ置換であり得る。

本発明のＲＳＶ株に、弱毒化以外の方法でウイルスの特徴を変化させる、種々の特性を導入し得る。例えば、タンパク質をコードするＯＲＦのコドン最適化が実施され得る。主要保護抗原ＦおよびＧは、抗原合成増加をもたらし得る。Ｆおよび／またはＧタンパク質遺伝子を上流(プロモーターの近く)にシフトさせて、発現を増加させ得る。Ｆおよび／またはＧタンパク質アミノ酸配列を、多様なＧタンパク質の場合に特に重要であり得る現在循環している株を表すようにまたは初期継代臨床単離体を表すように、修飾し得る。欠失または置換をタンパク質に導入して、免疫原性または他の所望の性質を改善し得る。例えば、Ｇタンパク質におけるＣＸ３Ｃフラクタルカイン(fractalkine)モチーフは、免疫原性改善のために除去すべきである(Chirkova et al. J Virol 2013 87:13466-13479)。

例えば、ある実施態様において、ＲＳＶのＧタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、臨床単離体A/Maryland/001/11のヌクレオチド配列と置き換え得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、臨床単離体A/Maryland/001/11のヌクレオチド配列、例えばＦ００１と置き換え得る。

ある実施態様において、ＲＳＶのタンパク質をコードする天然のまたは天然に存在するヌクレオチド配列を、選択宿主、特にヒトにおける発現を増加させるように設計されたコドン最適化配列と置き換え得る。例えば、ある実施態様において、ＲＳＶのＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列をコドン最適化配列で置き換え得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、臨床単離体A/Maryland/001/11からのコドン最適化配列で置き換え得る。ある実施態様において、ＲＳＶのＧタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、臨床分離株A/Maryland/001/11からのコドン最適化ヌクレオチド配列で置き換え得る。

本発明のさらに別の態様は、遺伝子位置の変更または遺伝子順序の変更を含む。例えば、ＮＳ１、ＮＳ２、ＳＨおよびＧ遺伝子を個々に欠失してよくまたはＮＳ１とＮＳ２遺伝子を共に欠失してよく、それによりウイルスプロモーターに対する各下流遺伝子の位置をシフトさせる。例えば、ＮＳ１およびＮＳ２を共に欠失させるとき、Ｎは遺伝子３位から遺伝子１位に、Ｐは遺伝子４位から遺伝子２位に移動するなどである。あるいは、遺伝子順序内の任意の他の遺伝子の欠失は、さらに下流に位置する遺伝子の位置(プロモーターに対して)のみに影響する。例えば、ＳＨは、野生型ウイルスにおける６位を占め、その欠失は５位のＭ(または任意の他の上流遺伝子)に影響しないが、Ｇをプロモーターに対して７位から６位に移動させる。生物学的に誘導された変異体ウイルスにおいて遺伝子欠失も生じ得る(希である)ことも注意されるべきである。例えば、細胞培養において広範に継代されているサブグループＢ ＲＳＶは、ＳＨおよびＧ遺伝子を自然に欠失している(Karron et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:13961 13966, 1997；引用により本明細書に包含させる)。

遺伝子順序シフト修飾(すなわち、組み換えウイルスゲノムにおける１以上の遺伝子をよりプロモーター近位またはプロモーター遠位位置に移動させる位置的修飾)は、変更された生物学的性質を有するウイルスをもたらす。例えば、ＮＳ１、ＮＳ２、ＳＨ、Ｇ、ＮＳ１およびＮＳ２を共にまたはＳＨおよびＧを共に欠くＲＳＶは、インビトロ、インビボまたは両者で弱毒化であることが示されている。特に、ＧおよびＦ遺伝子を、単独でおよび直列で、その野生型遺伝子順序に対してよりプロモーター近位位置にシフトさせ得る。これらの２つのタンパク質は、通常ＲＳＶ遺伝子順序における７位(Ｇ)および８位(Ｆ)を占める(ＮＳ１－ＮＳ２－Ｎ－Ｐ－Ｍ－ＳＨ－Ｇ－ＦＭ２－Ｌ)。ある実施態様において、ＧおよびＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列の順序は、天然に存在する順序に対して逆であり得る。

上記変異に加えて、本発明の弱毒化ウイルスは、任意のＲＳＶまたはＲＳＶ様ウイルス、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、マウス(マウス肺炎ウイルス)またはトリ(シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス)ニューモウイルスまたは他のエンベロープウイルス、例えば、パラインフルエンザウイルス(ＰＩＶ)からの異種、コード化または非コード化ヌクレオチド配列を取り込み得る。異種配列の例は、異なるヒトＲＳＶ株からの配列と組み合わせたあるヒトＲＳＶ株からのＲＳＶ配列である。あるいは、ＲＳＶは、２以上の野生型または変異体ヒトＲＳＶサブグループからの配列、例えばヒトＲＳＶサブグループＡ配列とサブグループＢ配列の組み合わせを取り込んでよい。さらに他の態様において、１以上のヒトＲＳＶコード化または非コード化ポリヌクレオチドは、新規弱毒化ワクチン株を作製するために、異種ＲＳＶまたは非ＲＳＶウイルスからのカウンターパート配列で置換される。

ここに記載する特定の変異およびこれらの変異の組み合わせを有する組み換えＲＳＶに加えて、開示するウイルスは、当業者に認識されるとおりさらに修飾され得る。例えば、組み換えＲＳＶは、そのタンパク質の１以上が欠失しているかまたは他に変異されていてよくまたは異なる生物からの異種遺伝子を、ゲノムまたはアンチゲノムに加えてよく、それにより、組み換えＲＳＶは、細胞に感染し、複製したとき、そのタンパク質を発現するかまたは組み込まれる。さらに、当業者は、ＲＳＶに効果を有することが知られる他の先に報告された変異を、ここに記載する変異の任意の１以上と組み合わせて、望ましい弱毒化または安定性特性を有する組み換えＲＳＶを産生し得ることを認識する。

ある実施態様において、ここに記載する変異は、単独でまたは他の変異と組み合わせて使用したとき、種々のレベルのウイルス弱毒化を提供でき、弱毒化と免疫原性の間のバランスを調整する能力を提供し、親ウイルスより安定な遺伝子型を提供する。

本明細書に記載のものからのさらなる代表的ウイルスを、例示的組み換え株を使用して実施例においてここに記載し、説明される方法を使用して、感染力、複製動態、収量、タンパク質発現効率および遺伝的安定性について細胞培養において評価し得る。さらなる代表的株を、感染力、複製動態、収量、免疫原性および遺伝的安定性について齧歯類および非ヒト霊長類において評価し得る。これらの不完全試験系は、複製における全ての差異を確実に検出しないかもしれないが、特別な実質的差異は検出され得る。また組み換え株を、成体および血清陽性仔体における評価の前段階なしで、血清陰性仔体において直接評価し得る。これは、例えば、１０ワクチンレシピエントおよび５プラセボレシピエントの群で実施でき、これは、複数候補の同時評価を可能にする少数である。候補を、免疫化直後、ワクチンウイルス感染力、複製動態、排出、忍容性、免疫原性および遺伝的安定性について評価でき、ワクチンを次のＲＳＶ流行期の間に安全性、ＲＳＶ疾患およびＲＳＶ特異的血清抗体における変化について、全体を引用により本明細書に包含させるKarron, et al. 2015, Science Transl Med 2015 7(312):312ra175に記載のとおり、調査し得る。それ故に、選択した代表的ウイルスの分析は、最も至適なものを特定する候補のトリアージのための、比較的速い選別を提供し得る。

タンパク質またはペプチドの記載は、その天然に存在する形態およびそのようなタンパク質の任意のフラグメント、ドメインまたはホモログを含む。ここで使用する用語“ホモログ”は、天然に存在するタンパク質またはペプチドの小さな修飾により、天然に存在するタンパク質またはペプチド(すなわち、“プロトタイプ”または“野生型”タンパク質)とは異なるが、天然に存在する形態の基本的タンパク質および側鎖構造を保持する、タンパク質またはペプチドをいうために使用する。このような変化は、１個または数個のアミノ酸側鎖の変化；欠失(例えば、タンパク質またはペプチドの切断型)、挿入および／または置換を含む１個または数個のアミノ酸の変化；１個または数個の原子の立体化学の変化；および／またはメチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミテーション、アミド化を含むが、これらに限定されない小さな誘導体化を含むが、これらに限定されない。ホモログは、天然に存在するタンパク質またはペプチドと比較して、増強した、低下したまたは実質的に類似の性質を有する。あるタンパク質のホモログは、対照タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約５０％または少なくとも約５５％または少なくとも約６０％または少なくとも約６５％または少なくとも約７０％または少なくとも約７５％または少なくとも約８０％または少なくとも約８５％または少なくとも約９０％または少なくとも約９５％または少なくとも約９６％または少なくとも約９７％または少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一(または４５％～９９％の間の整数増分での任意の％同一性)であるアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるものであり得る。

本発明のある態様において、ＲＳＶからの選択タンパク質またはタンパク質領域(例えば、細胞質テイル、膜貫通ドメインまたは外部ドメイン、エピトープ部位または領域、結合部位または領域、活性部位または活性部位含有領域など)をコードするもののような選択遺伝子セグメントを、同一または異なるＲＳＶまたは他の源からのカウンターパート遺伝子セグメントで置き換えて、野生型または親ＲＳＶ株と比較して、所望の表現型変化を有する新規組み換えを作製し得る。例えば、このタイプの組み換えは、他のＲＳＶの外部ドメインに融合した、あるＲＳＶの細胞質テイルおよび／または膜貫通ドメインを有するキメラタンパク質を発現し得る。このタイプの組み換えの他の例は、デュプリケート免疫原性領域などのデュプリケートタンパク質領域を発現する。ここで使用する“カウンターパート”遺伝子、遺伝子セグメント、タンパク質またはタンパク質領域は、一般に異種源からである(例えば、異なるＲＳＶ遺伝子からまたは異なるＲＳＶ株における同一(すなわち、相同または対立形質)遺伝子または遺伝子セグメントを表す)。本発明において選択される典型的カウンターパートは、全体的構造特性を共有し、例えば、各カウンターパートは、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、外部ドメイン、結合部位または領域、エピトープ部位または領域などなどの同等な構造“ドメイン”をコードし得る。カウンターパートドメインおよびそのコード化遺伝子セグメントは、広範なサイズおよびアミノ酸(またはヌクレオチド)配列多様性を有する種の集合体を包含し、その範囲は、ドメインまたは遺伝子セグメントバリアント内の共通生物学的活性により規定される。例えば、本発明内のカウンターパート遺伝子セグメントによりコードされる２つの選択タンパク質ドメインは、膜貫通機能、特異的結合活性、免疫学的認識部位の提供などのような、実質的に同じ質的活性を共有し得る。より一般に、カウンターパート間、例えば、選択タンパク質セグメントまたはタンパク質間で共有される特異的生物学的活性は、量的観点で実質的に類似であり、すなわち、定量的活性プロファイルにおいて３０％を超えて、好ましくは２０％を超えて、より好ましくは５～１０％を超えて変わらない。

本発明の別の態様において、ｃＤＮＡ発現ゲノムまたはアンチゲノムから産生された感染性ＲＳＶは、任意のＲＳＶまたはＲＳＶ様株、例えば、ヒト、ウシ、マウスなどまたは任意のニューモウイルスまたはメタニューモウイルス、例えば、マウス肺炎ウイルスまたはトリメタニューモウイルスであり得る。保護免疫応答を生じるために、ＲＳＶ株は、免疫化する対象に内在性のものであってよく、例えば、ヒトＲＳＶをヒトの免疫化に使用する。内在性ＲＳＶのゲノムまたはアンチゲノムは、いずれにしても、種々の起源の組み合わせからのＲＳＶ遺伝子または遺伝子セグメント、例えば、異なるＲＳＶ種、サブグループまたは株からのまたはＲＳＶおよびヒトパラインフルエンザウイルス(ＰＩＶ)などの他の呼吸器病原体からの遺伝子または遺伝子セグメントの組み合わせを発現するように修飾し得る(例えば、Hoffman et al. J. Virol. 71:4272-4277 (1997); Durbin et al. Virology 235(2):323-32 (1997)；１９９７年５月２３日出願のMurphy et al. 米国特許出願６０／０４７,５７５および感染性ＰＩＶクローン作製のための次のプラスミドｇ：ｐ３／７(１３１)(ＡＴＣＣ ９７９９０)；ｐ３／７(１３１)２Ｇ(ＡＴＣＣ ９７８８９)；およびｐ２１８(１３１)(ＡＴＣＣ ９７９９１)参照；各々、10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209, USA.のAmerican Type Culture Collection (ATCC)にブタベスト条約に基づき１９９７年４月１８日に寄託し、上記受託番号を付与された)。

本発明のある実施態様において、ヒトＲＳＶの個々の内部遺伝子が、例えば、ウシまたは他のＲＳＶカウンターパートまたはＰＩＶなどの他の呼吸器病原体からのカウンターパートまたは外来遺伝子で置き換えられている、組み換えＲＳＶを提供する。本発明におけるＲＳＶ遺伝子または遺伝子セグメントの置換、欠失などは、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨおよびＬ遺伝子またはＭ２－１オープンリーディングフレームまたはＧおよびＦ遺伝子の非免疫原性部分の１以上の一部または全てを含み得る。また、プロモーターまたは転写シグナルなどのヒトＲＳＶシス作用性配列を、例えば、そのウシＲＳＶカウンターパートで置き換え得る。相反的に、ヒト弱毒化遺伝子またはシス作用性配列をウシＲＳＶゲノムまたはアンチゲノム背景に挿入することにより、生存弱毒化ウシＲＳＶを産生する手段が提供され得る。

それ故に、ヒトへの投与を意図する感染性組み換えＲＳＶは、弱毒化の目的などで、例えば、ウシＲＳＶまたはＰＩＶからの、遺伝子を含むように修飾されている、ヒトＲＳＶである。例えば、ＰＩＶからの遺伝子または遺伝子セグメントの挿入により、ＰＩＶおよびＲＳＶ両者への二価ワクチンが提供される。あるいは、異種ＲＳＶ種、サブグループまたは株またはＰＩＶなどの別の呼吸器病原体を、例えば、ヒトＲＳＶ感染に対する保護を誘発するエピトープまたはタンパク質をコードする遺伝子を含むように修飾し得る。例えば、ヒトＲＳＶ糖タンパク質遺伝子をウシ糖タンパク質遺伝子の代替とし、ヒトＲＳＶ表面糖タンパク質を担持し、残存ウシ遺伝的背景のためにヒト宿主における複製能が制限されるようになった、得られたウシＲＳＶが、ヒトＲＳＶ株に対してヒトにおいて保護免疫応答を誘発し得る。

ワクチン開発のための感染性ＲＳＶに他のタイプの弱毒化変異を解析し、組み込む能力は、ＲＳＶクローンにおける標的変化の広い集合体にまで拡大している。例えば、本質的に増殖のためではない任意のＲＳＶ遺伝子を、病原性、病因、免疫原性および他の表現型特徴に対する所望の効果を得るために、除去するかまたはまたは他の修飾をし得る。さらに、多様な他の遺伝的改変を、感染性組み換えＲＳＶに単独でまたは生物学的に誘導された変異体ＲＳＶから採用された１以上の弱毒化点変異と共に取り込むために、組み換えＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムに行い得る。

ここで使用する“異種遺伝子”は、異なるＲＳＶ株またはタイプまたは非ＲＳＶ源から取った遺伝子をいう。これらの異種遺伝子を、全体でまたは一部、変化した遺伝子の順序、除去された遺伝子重複、そのアンチゲノムカウンターパートと置き換えたＲＳＶゲノムプロモーター、除去または置換した遺伝子の部分および欠失した全遺伝子であり得る。配列における異なるまたは付加的な修飾を、種々の遺伝子間領域(例えば、Ｇ遺伝子とＦ遺伝子間の独特なＳｔｕｌ部位)または他のどこかにおける独特な制限部位の挿入など、操作を容易にするようになし得る。非翻訳遺伝子配列を、外来配列挿入のための容積を増加させるために除去し得る。

本発明の組み換えＲＳＶにおけるウイルス遺伝子または遺伝子セグメント全体の変化に関与する欠失、挿入、置換および他の変異は、高度に安定なワクチン候補を生じ、これは、免疫抑制個体の場合、特に重要である。これらの変異の多くは、得られたワクチン株の弱毒化をもたらし、他方では、異なるタイプの所望の表現型変化を特定する。例えば、宿主免疫を特異的に妨害するタンパク質をコードするあるウイルス遺伝子が知られる(例えば、Kato et al., EMBO. J. 16:578-87 (1997)参照)。ワクチンウイルスにおけるこのような遺伝子の除去が、病原性および病因を増強するおよび／または免疫原性を改善することが予期される。

本発明のＲＳＶ内の他の変異は、ＲＮＡ複製および転写の変化と関係する、ゲノムの３’末端の、アンチゲノムからのそのカウンターパートでの置き換えである。さらに、ここに記載する方法で遺伝子間領域(Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4594-4598 (1986))を短縮または伸長するかまたは配列含量を変化させてよく、天然に存在する遺伝子重複(Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5134-5138 (1987))を除去するかまたは異なる遺伝子間領域に変えてよい。

他の実施態様において、選択ＲＳＶ遺伝子の翻訳開始部位(好ましくは－３位のヌクレオチドを含む)周辺の配列を、単独でまたは上流開始コドンの導入と組み合わせて修飾し、翻訳の上方または下方制御の特定により、ＲＳＶ遺伝子発現を調節する。

あるいはまたはここに開示する他のＲＳＶ修飾と組み合わせて、ＲＳＶ遺伝子発現を、ウイルスの選択遺伝子の転写ＧＳシグナルの改変により調節し得る。ある例示的実施態様において、ＮＳ２のＧＳシグナルを修飾して、ウイルス複製にｔｓ制限を重ねるために、一定の変異を包含させる。

本発明内のなおさらなるＲＳＶクローンは、転写ＧＥシグナルへの修飾を組み込む。例えば、ＮＳ１およびＮＳ２遺伝子のＧＥシグナルをそのＮ遺伝子について置換または変異し、リードスルーｍＲＮＡレベルの減少および下流遺伝子からのタンパク質発現増加をもたらす、ＲＳＶクローンが提供される。得られた組み換えウイルスは、増殖動態増加およびプラークサイズ増加を示し、一例として、ＲＳＶゲノムにおけるシス作用性調節エレメントの修飾により、ＲＳＶ増殖性質の改変を提供する。

他の態様において、Ｇタンパク質の発現を、Ｇ ｍＲＮＡの修飾により増加させ得る。Ｇタンパク質は、膜結合形態および分泌型形態の両者として発現され、後者の形態は、Ｇ遺伝子翻訳オープンリーディングフレーム内の開始部位での翻訳開始により発現される。分泌型形態は、発現Ｇタンパク質の半分ほどを占め得る。単独でまたは上流開始部位の配列構成と同時の内部開始部位(例えば、配列改変、欠失などにより)の欠失は、Ｇタンパク質発現の所望の変化をもたらす。Ｇタンパク質の分泌型形態の欠失も、Ｇタンパク質の可溶性形態が、中和抗体捕捉のための“デコイ”として働くと考えられるため、例示的組み換えＲＳＶへの宿主免疫応答の質を改善する。また、可溶性Ｇタンパク質は、Ｔｈ２偏向応答の優先的刺激により、免疫病理の増強と関連付けられている。

関連態様において、ＲＳＶ遺伝子発現レベルは、転写レベルで修飾され得る。ある態様において、ＲＳＶ遺伝子地図における選択遺伝子位置を、よりプロモーター近位またはプロモーター遠位位置に変化させ、それによって該遺伝子を、それぞれ効率を下げてまたは上げて、発現させ得る。この態様によって、特異的遺伝子の発現調節を、野生型レベルと比較して、遺伝子発現の２倍、より一般に４倍、最大１０倍またはそれ以上の減少または増加を生じるように達成できる。一例において、ＮＳ２遺伝子(ＲＳＶ遺伝子地図の順序で２番目)を、ＳＨ遺伝子(順序で６番目)の位置に置き換え、予測されるＮＳ２発現の減少をもたらす。位置的変化による選択ＲＳＶ遺伝子発現増加は、最大１０倍、３０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上達成でき、しばしば置換された遺伝子の相反的に均衡する発現レベル減少を伴う。

ある例示的実施態様において、ＦおよびＧ遺伝子を、単独でまたは一緒に、(組み換え)ＲＳＶ遺伝子地図内のよりプロモーター近位またはプロモーター遠位部位に転位させ、それぞれ、より高いまたはより低いレベルの遺伝子発現を達成し得る。これらおよび他の転位変化は、例えばＲＮＡ複製に関与する選択ウイルスタンパク質の発現減少により、弱毒化表現型を有する新規ＲＳＶクローンを生じる。さらに他の実施態様において、ワクチン製剤に有用なＲＳＶを、循環ウイルスに抗原ドリフトを収容させることにより、簡便に修飾し得る。一般に、該修飾はＧおよび／またはＦタンパク質にである。ＧまたはＦ遺伝子全体またはその特定の免疫原性領域をコードするセグメントを、数個の抗原形態となるように、感染性クローンにおける対応する領域の置換または遺伝子の以上のコピーの付加によりＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡに組み込む。

修飾ＲＳＶ ｃＤＮＡから産生された子孫ウイルスを、次いで、出現株に対するワクチン接種プロトコールに使用する。さらに、遺伝子付加としてのＲＳＶサブグループＢのＧタンパク質遺伝子の包含は、ヒト集団に存在する比較的多様なサブグループＡおよびＢ株のより広いスペクトルをカバーするように応答を広げる。

本発明の感染性ＲＳＶクローンを、その免疫原性を増大し、野生型ＲＳＶまたは不完全に弱毒化された親ウイルスまたはクローンでの感染により提供されるより大きな保護レベルを誘発するように、ここに開示する方法および組成物により操作され得る。例えば、異種ＲＳＶ株またはタイプまたはＰＩＶなどの非ＲＳＶ源からの免疫原性エピトープを、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列における適切なヌクレオチド変化に加え得る。組み換えＲＳＶはまた望ましくない免疫病理学的反応と関係する(例えば、アミノ酸挿入、置換または欠失による)エピトープの同定および除去のために操作され得る。他の実施態様において、付加的遺伝子を、独立したセットの転写シグナルの制御下にあるＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムに挿入できまたは近接させ得る。目的の遺伝子は、サイトカイン(例えば、ＩＬ－２～ＩＬ－１５、特にＩＬ－２、ＩＬ－６およびＩＬ－１２など)、ガンマ－インターフェロンをコードするものを含み得るが、これらに限定されず、サイトカイン(例えば、ＩＬ－２～ＩＬ－１５、特にＩＬ－２、ＩＬ－６およびＩＬ－１２など)、ガンマ－インターフェロンおよびＴヘルパー細胞エピトープに富むタンパク質を含む。付加的タンパク質を、別々のタンパク質としてまたはＳＨなどのＲＳＶタンパク質の一つの第二コピーから操作されたキメラとして発現させ得る。これは、量的および質的両者で、ＲＳＶに対する免疫応答の修飾および改善をする能力を提供する。

組み換えＲＳＶへの上記修飾に加えて、ＲＳＶクローンにおける異なるまたは付加的な修飾を、種々の遺伝子間領域(例えば、Ｇ遺伝子とＦ遺伝子間の独特なＳｔｕｌ部位)またはのどこかへの独特な制限部位の挿入など、操作を容易にするようになし得る。非翻訳遺伝子配列を、外来配列挿入のための容積を増加させるために除去し得る。

感染性ＲＳＶクローンへの前記の、変異導入は、多様な周知方法により達成され得る。“感染性クローン”は、感染性ウイルスを産生できるゲノムまたはアンチゲノムＲＮＡに転写され得る合成されたまたは他の、ｃＤＮＡまたはその産物をいう。用語“感染性”は、同じ活性であり得る子孫ウイルスまたはウイルス構造を産生するように培養細胞または動物またはヒト宿主で複製できる、ウイルスまたはウイルス構造をいう。それ故に、変異を、慣用の技法(例えば、部位特異的変異導入)で、ゲノムまたはアンチゲノムのｃＤＮＡコピーに導入し得る。完全アンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡを構築するためのアンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡサブフラグメントの使用は当業者に周知であり、各領域が別々に操作でき(小さいｃＤＮＡは、大きなものより操作が容易である)、次いで完全ｃＤＮＡに容易に集合される利点を有する。それ故に、完全アンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡまたはその任意のサブフラグメントを、オリゴヌクレオチド指向変異誘発の鋳型として使用できる。次いで、変異サブフラグメントを完全アンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡに集合させ得る。変異は、単一ヌクレオチド変化から、１以上の遺伝子またはゲノム領域を含む大ｃＤＮＡ片まで多様であり得る。

組み換えＲＳＶを、ＲＳＶゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡと、転写、複製ヌクレオカプシド産生に必要なウイルスタンパク質の細胞内共発現により産生し得る。他のＲＳＶタンパク質をコードするプラスミドも、これら必須タンパク質に包含させ得る。あるいは、ＲＮＡをインビトロ転写反応で合成し、培養細胞にトランスフェクトし得る。

従って、またここに記載するのは、変異ウイルスをコードする、ゲノムまたはアンチゲノムを作製する、ゲノムまたはアンチゲノムを発現するまたはインビトロでの組み換えＲＳＶ作製に有用な種々のタンパク質をコードする、単離ポリヌクレオチドである。ここに記載する配列番号の何れかの配列を含むポリヌクレオチドは、本発明に包含される。さらに包含されるのは、前記配列の何れかからなるまたは本質的にそれを含む配列、前記配列番号の何れかと少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性(またはその間の任意の同一性％)である配列を有するポリヌクレオチド、ならびに前記分子とハイブリダイズするまたは補体であるポリヌクレオチドである。

これらのポリヌクレオチドを、組み換えＲＳＶを産生するために、ベクターに包含させるか、ベクターにより発現させ得る。従って、単離ポリヌクレオチドまたはベクターでトランスフェクトされた細胞も本発明の範囲内であり、ここに例示される。それ故に、ある実施態様において、本発明は、上記単離ポリヌクレオチド分子を含む、ベクターを含む。ある実施態様において、本発明は、上記単離ポリヌクレオチド分子を含む、細胞を含む。

本発明の関連態様において、弱毒化変異を担持する単離感染性組み換えＲＳＶを産生するための組成物(例えば、ＲＳＶコード化ｃＤＮＡを組み込んだ単離ポリヌクレオチドおよびベクター)および方法が提供される。本発明のこれらの態様に包含されるのは、ここに記載のとおり修飾されたＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムを含む、新規、単離ポリヌクレオチド分子およびそのような分子を組み込んだベクターである。また提供されるのは、１以上のＲＳＶタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド分子を含む同一または異なる発現ベクターである。これらのタンパク質はまたゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡから直接発現される。ベクターは、好ましくは細胞または無細胞ライセートで発現または共発現され、それにより変異体ＲＳＶ粒子またはウイルス成分粒子を産生する。

ある態様において、本発明は、感染細胞におけるＲＳＶ繁殖を可能とする条件化で、ＲＳＶ感染が許容される宿主細胞を組み換えＲＳＶ株で感染させることを含む、１以上の精製ＲＳＶタンパク質を製造する方法を含む。培養における複製期間の後、細胞を溶解し、組み換えＲＳＶをそこから単離する。１以上の所望のＲＳＶタンパク質を、ウイルス単離後精製し、ワクチン、診断および他の使用のための１以上のＲＳＶタンパク質を得る。

弱毒化組み換えＲＳＶ変異体を産生するための上記方法および組成物は、感染性ウイルスまたはウイルス成分粒子またはその誘導体を得る。感染性ウイルスは、信頼のおけるＲＳＶウイルス粒子と同程度であり、同様に感染性である。新鮮細胞に直接感染させ得る。感染性ウイルス成分粒子は、一般に適切な条件下で感染を開始できる、ウイルス粒子の小成分である。例えば、ゲノムまたはアンチゲノムＲＮＡおよびＮ、Ｐ、ＬおよびＭ２－１タンパク質を含むヌクレオカプシドが、細胞の細胞質に導入されたならば、感染を開始できる、ウイルス成分粒子の例である。本発明内で提供されるウイルス成分粒子は、感染力に必須ではない１以上のタンパク質、タンパク質セグメントまたは他のウイルス成分を欠くウイルス粒子を含む。

他の実施態様において、本発明は、上記弱毒化組み換えＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターおよびＲＳＶのＮ、Ｐ、ＬおよびＲＮＡポリメラーゼ伸長因子タンパク質をコードする１以上の単離ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター(同一または異なるベクター)を含む、細胞または無細胞ライセートを提供する。これらのタンパク質の１以上を、ゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡから発現もさせ得る。発現により、ゲノムまたはアンチゲノムおよびＮ、Ｐ、ＬおよびＲＮＡポリメラーゼ伸長因子タンパク質は、組み合わさって、感染性ＲＳＶウイルスまたはウイルス成分粒子を産生する。

本発明の組み換えＲＳＶは、ＲＳＶ感染に感受性の宿主においてＲＳＶに対する所望の免疫応答を産生するために種々の組成物において有用である。本発明の弱毒化ｒＲＳＶ株は、免疫化宿主において重篤な呼吸器疾患の許容されない症状を引き起こさないように、十分な弱毒化で感染ヒト宿主において保護免疫応答を誘発できる。弱毒化ウイルスまたはウイルス成分粒子は細胞培養上清に存在し、培養から単離されまたは部分的にまたは完全に精製されていてよい。ウイルスはまた凍結乾燥もでき、所望により、保存または宿主への送達のための多様な他の成分と組み合わせ得る。

本発明の他の態様において、組み換えＲＳＶ株を、他の病原体、特にパラインフルエンザウイルス(ＰＩＶ)などの呼吸器管病原体の保護抗原のための“ベクター”として用い得る。例えば、Ｔ１１６６Ｉ変異を有する組み換えＲＳＶを、感染性、弱毒化ワクチンウイルスを産生するために、ＰＩＶからの保護抗原をコードする配列を組み込むように操作され得る。

ある実施態様において、本発明は、免疫有効量の上記単離ポリヌクレオチド分子によりコードされる組み換えＲＳＶバリアントを含む医薬組成物を含む。ある実施態様において、本発明は、該医薬組成物を投与することを含む、対象にワクチン接種をする方法または免疫応答を誘発する方法を含む。組成物を、注射、エアロゾル送達、経鼻スプレー、点鼻、経口接種または局所適用を含むが、これらに限定されない任意の適当な方法で投与し得る。ある実施態様において、注射、エアロゾル送達、経鼻スプレー、点鼻により投与し得る。組成物を、鼻腔内または皮下または筋肉内に投与し得る。ある実施態様において、鼻腔内投与し得る。投与方法および経路は、下にさらに詳述する。

関連態様において、本発明は、哺乳動物対象においてＲＳＶに対する免疫応答を誘発するために、個体の免疫系を刺激する方法を提供する。方法は、、生理学的に許容される担体および／またはアジュバント中の免疫学的に十分なまたは有効量の弱毒化ＲＳＶの免疫原性製剤を投与することを含む。

ある実施態様において、本発明は、上記単離ポリヌクレオチド分子によりコードされる組み換えＲＳＶバリアントを含む、生存弱毒化ＲＳＶワクチンを含む。ある実施態様において、本発明は、ＲＳＶワクチンを含む医薬組成物を含む。関連態様において、本発明は、上記単離ポリヌクレオチド分子を発現させることを含む、ワクチンを製造する方法を含む。

ワクチンは、生理学的に許容される担体および／またはアジュバントおよび単離弱毒化組み換えＲＳＶ粒子またはウイルス成分粒子を含み得る。ある実施態様において、ワクチンは、弱毒化と免疫原性の適当なバランスを達成するために、少なくとも１つおよび好ましくは２以上のここに記載する変異または他のヌクレオチド修飾を有する弱毒化組み換えＲＳＶからなる。

ここに提供する組み換えＲＳＶ株の宿主から候補ワクチンウイルスを選択するために、生存能、インビトロ効率的複製、インビボ弱毒化、免疫原性および表現型安定性の基準を、周知方法により決定する。本発明のワクチンに最も望まれるウイルスは、生存能を維持しなければなず、ワクチン製造を可能とするためにインビトロで許容される条件下で十分複製しなければならず、安定な弱毒化表現型を有しなければならず、良好な耐容性でなければならず、免疫化宿主で複製できなければならず(たとえ低レベルでも)、そして野生型ウイルスのその後の感染により引き起こされる重篤な疾患に対する保護を付与するために十分な免疫応答の産生をワクチンにおいて効率的に誘発しなければならない。明らかに、これまで知られ、報告されているＲＳＶ変異体は、これらの基準を全ては満たさない。実際、既知弱毒化ＲＳＶで報告されている結果からの予測に反して、本発明のウイルスは、先の変異体より生存可能であり、弱毒化であるだけでなく、先に試験された変異体よりインビボで遺伝的に安定である。

ワクチン使用および他の目的のためにＲＳＶウイルスを繁殖させるために、ＲＳＶ増殖を可能とする多数の細胞株を使用し得る。ＲＳＶは、多様なヒトおよび動物細胞で増殖する。ワクチン使用のために弱毒化ＲＳウイルスを繁殖させるための好ましい細胞株は、ＤＢＳＦＲｈＬ－２、ＭＲＣ－５およびベロ細胞を含む。最高ウイルス収量は、通常ベロ細胞などの上皮性細胞株で達成される。細胞は、一般に約０.００１～１.０またはそれ以上の範囲の感染効率でウイルスを接種し、ウイルスの複製に許容される条件下、例えば、約３０～３７℃で、約３～１０日またはウイルスが適切な力価を達成するのに必要な時間、培養する。温度感受性ウイルスは、しばしば“許容される温度として３２℃を使用して、増殖する。ウイルスを細胞培養から取り、細胞成分を、一般に周知の浄化方法、例えば、遠心分離により分離し、当業者に周知方法で所望によりさらに精製し得る。

ここに記載のとおり弱毒化されているＲＳＶを、種々の周知のおよび一般に許容されるインビトロおよびインビボモデルで試験して、妥当な弱毒化、表現型復帰への抵抗性およびワクチン使用のための免疫原性を確認し得る。インビトロアッセイにおいて、弱毒化した、生物学的に誘導されたまたは組み換えＲＳＶを増殖できる修飾ウイルスを、ウイルス複製の温度感受性または“ｔｓ表現型”についておよび小プラーク表現型について試験する。修飾ウイルスを、ＲＳＶ感染の動物モデルでさらに試験する。種々の動物モデル(例えば、マウス、コットンラットおよび霊長類)が記載されており、当業者に知られる。

上の記載および下記実施例により、本発明は、またワクチン使用のための単離、感染性ＲＳＶ組成物を提供する。ワクチンの成分である弱毒化ウイルスは、単離および一般に精製形態である。単離は、感染個体の上咽頭などの野生型ウイルスの自然環境以外にあるＲＳＶを意味する。より一般に、単離は、細胞培養または他の人工媒体の成分としての弱毒化ウイルスを含むことを意図する。例えば、本発明の弱毒化ＲＳＶは、細胞培養から単離され、スタビライザーに加えられた、感染細胞培養により産生され得る。

本発明のＲＳＶワクチンは、活性成分として、ここに記載のとおり産生された免疫原として有効量のＲＳＶを含む。生物学的に誘導されたまたは組み換えＲＳＶを、ワクチン製剤に直接使用し得る。生物学的に誘導されたまたは組み換え修飾ウイルスを、生理学的に許容される担体および／またはアジュバントと共に宿主に導入し得る。有用な担体は当分野で周知であり、例えば、水、緩衝化水、０.４％食塩水、０.３％グリシン、ヒアルロン酸などを含む。得られた水溶液を、上記のとおり、そのままでまたは使用前に解凍する凍結形態でまたは凍結乾燥して使用するために包装し、凍結乾燥調製物は、投与前に無菌溶液と組み合わせられる。組成物は、生理学的条件に近似させるために必要に応じて薬学的に許容される補助物質を含み、これは、ｐＨ調節および緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、スクロース、硫酸マグネシウム、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ(４－(２－ヒドロキシエチル)－１－ピペラジンエタンスルホン酸)緩衝液、ソルビタンモノラウレートおよびトリエタノールアミンオレアートを含むが、これらに限定されない。許容されるアジュバントは、当業者に周知の物質である不完全フロインドアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバンを含む。好ましいアジュバントはまた、Stimulon^TM QS-21(Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worchester, Mass.)、ＭＰＬ^TM(３－０－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.)およびインターロイキン－１２(Genetics Institute, Cambridge, Mass.)を含む。

ＲＳＶワクチン組成物での免疫化により、宿主はＲＳＶウイルスタンパク質、例えば、ＦおよびＧ糖タンパク質に特異的な抗体の産生によりワクチンに応答する。さらに、自然かつ細胞介在の免疫応答が誘発され、これは抗ウイルスエフェクターを提供し、免疫応答を調節できる。ワクチン接種の結果として、宿主はＲＳＶ感染に少なくとも部分的にまたは完全に免疫されまたは、特に下部呼吸器管の中程度または重篤なＲＳＶ疾患発症に抵抗性となる。

ワクチンが投与される宿主は、ＲＳＶまたは密接に関連するウイルスの感染に感受性であり、ワクチン接種株の抗原に対して保護免疫応答を産生できる、あらゆる哺乳動物であり得る。それ故に、適当な宿主は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ類、齧歯類、例えば、マウスまたはコットンラットなどを含む。従って、本発明は、多様なヒトおよび動物使用のためのワクチンを作製する方法を提供する。

本発明の弱毒化ＲＳＶを含むワクチン組成物を、ＲＳＶ感染に感受性のまたは他にリスクのある対象に、ＲＳＶに対する個体の免疫応答能力を誘発または増強するのに十分である“免疫原として有効な用量”で投与する。ＲＳＶワクチン組成物を、注射、エアロゾル送達、経鼻スプレー、点鼻、経口接種または局所適用を含むが、これらに限定されない任意の適当な方法で投与し得る。ヒト対象の場合、本発明の弱毒化ウイルスを、十分に確立されたヒトＲＳＶワクチンプロトコールにより投与する(Karron et al. JID 191:1093-104, 2005)。すなわち、成体または小児に、一般に０.５mlの生理学的に許容される希釈剤または担体の体積で、免疫原として有効な用量のＲＳＶワクチンの液滴を鼻腔内接種する。これは、非複製ワクチンでの非経腸免疫化と比較して、簡便さおよび安全性の利点を有する。それはまた、ＲＳＶへの抵抗性に主要な役割を有する、局所呼吸器管免疫直接刺激も提供する。さらに、このワクチン接種方式は、効率的に、これは、一般に極めて若い時季に見られる、ＲＳＶ特異的母系性由来血清抗体の免疫抑制性効果を迂回する。また、ＲＳＶ抗原の非経腸投与は、免疫病理学的合併症を伴うことがあるが、これは、生存ウイルスでは観察されていない。

ある実施態様において、ワクチンを、鼻腔内または皮下または筋肉内に投与し得る。ある実施態様において、上部呼吸器管に投与し得る。これは、スプレー、液滴またはエアロゾル送達によるものを含むが、これらに限定されない、任意の適当な方法で実施し得る。しばしば、組成物を、ＲＳＶに対する抗体が血清陰性であるまたはＲＳＶに対する経胎盤性に獲得した移行抗体を有する個体に投与する。

全ての対象において、投与するＲＳＶワクチンの厳密な量ならびに投与のタイミングおよび反復は、患者の健康状態および体重、投与方式、製剤の性質などを含む、種々の因子により決定される。投与量は、一般に患者あたりウイルスの約３.０ｌｏｇ_１０～約６.０ｌｏｇ_１０プラーク形成単位(“ＰＦＵ”)またはそれ以上の範囲、より一般に患者あたり約４.０ｌｏｇ_１０～５.０ｌｏｇ_１０ ＰＦＵウイルスである。ある実施態様において、患者あたり約５.０ｌｏｇ_１０～６.０ｌｏｇ_１０ ＰＦＵを、１～６か月などの乳児期に投与し、１以上のさらなる追加免疫用量を、２～６か月以上後で投与し得る。他の実施態様において、年少乳児は、患者あたり約５.０ｌｏｇ_１０～６.０ｌｏｇ_１０ ＰＦＵの用量を、おおよそ２か月、４か月および６か月で与え、これは、多数の他の小児ワクチンの推奨投与時季である。さらに他の実施態様において、さらなる追加免疫用量を、おおよそ１０～１５か月で投与する。いずれにしても、ワクチン製剤は、抗ＲＳＶ免疫応答の効率的刺激または誘発に十分量(“有効量”)の本発明の弱毒化ＲＳＶを提供すべきである。

ある実施態様において、ワクチンは、単一ＲＳＶ株または抗原サブグループ、例えば、ＡもしくはＢまたは複数ＲＳＶ株またはサブグループに対する免疫応答を誘発する弱毒化組み換えＲＳＶウイルスを含む。これに関して、ｒＲＳＶを、単一または複数ＲＳＶ株またはサブグループに対するより有効な保護のために、異なる免疫原性特徴を有する他のＲＳＶワクチン株またはサブグループとワクチン製剤で組み合わせ得る。それらを、単一ＲＳＶ株または複数のＲＳＶ株またはサブグループに対するより有効な保護を誘発するために、ワクチン混合物で投与してよくまたは協調処置プロトコールで別々に投与してよい。

得られた免疫応答を、多様な方法で特徴付けし得る。これらは、補体結合試験、プラーク中和、酵素結合免疫吸着検定法、ルシフェラーゼ免疫沈殿アッセイおよびフローサイトメトリーで検出できる、ＲＳＶ特異的抗体の分析のために鼻洗浄液または血清のサンプルを取ることを含む。さらに、免疫応答を、鼻洗浄液または血清におけるサイトカインアッセイ、いずれかの源からの免疫細胞のＥＬＩＳＰＯＴ、鼻洗浄液または血清サンプルの定量的ＲＴ－ＰＣＲまたはマイクロアレイ分析およびインビトロでウイルス抗原に再暴露することにより鼻洗浄液または血清からの免疫細胞を再刺激し、サイトカイン、表面マーカーまたは他の免疫相関物の産生または提示についてまたはＲＳＶ抗原を提示する指標標的細胞に対する細胞毒性活性についてフローサイトメトリーにより分析することにより検出できる。これに関して、個体を、上部呼吸器疾病の徴候および症状についてもモニターする。

ある実施態様において、新生児および乳児に、十分なレベルの免疫を誘発させるために、複数用量のＲＳＶワクチンを与える。投与は、生後最初の１か月以内に与え、そして天然ＲＳＶ感染に対する十分なレベルの保護が維持されるのに必要な限り、２か月、４か月、６か月、１年および２年などの一定間隔で、小児期の間与える。他の実施態様において、例えば、医療従事者、保育士、幼児、高齢者、心肺機能不全の個体の家族などの、頻回のまたは重篤なＲＳＶ感染に特に感受性の成体に、複数用量のＲＳＶワクチンを与え、保護免疫応答を確立および／または維持させる。誘発された免疫のレベルを、中和分泌および血清抗体の量を測定することによりモニターでき、所望のレベルの保護を維持ために、必要に応じて、投与量を調節するかまたはワクチン接種を繰り返す。さらに、異なるワクチンウイルスが、異なるレシピエント群への投与のために指示される。例えば、サイトカインまたはＴ細胞エピトープに豊富なさらなるタンパク質を発現する操作されたＲＳＶ株は、乳児ではなく、成体に特に有利であり得る。本発明により産生したワクチンを、ＲＳＶの他のサブグループまたは株のウイルスと組み合わせ、複数ＲＳＶサブグループまたは株に対する保護を提供するかまたはこれらの株の、例えば、保護エピトープをコードする選択遺伝子セグメントを、ここに記載のとおり、あるＲＳＶクローンに操作していれることができる。このような実施態様において、異なるウイルスを混合し、同時に投与するかまたは別の調製物で提供し、別々に投与し得る。例えば、２つのＲＳＶサブグループのＦ糖タンパク質が、アミノ酸配列で約１１％しか異ならないため、この類似性は、ＲＳＶまたはＦ抗原で免疫化し、異種株で攻撃した動物で見られる、交差保護免疫応答の基礎である。それ故に、単一株での免疫化は、同一または異なるサブグループの異なる株に対する保護もし得る。

ワクチンウイルスの弱毒化レベルを、例えば、免疫化宿主の呼吸管に存在するウイルスの量を定量し、野生型ＲＳＶまたは候補ワクチン株として評価されている他の弱毒化ＲＳウイルスの量と比較することにより、決定し得る。例えば、本発明の弱毒化ウイルスは、野生型ウイルスの複製レベルと比較して、チンパンジーなどの高度に感受性の宿主の上部呼吸器管における複製の制限の程度が大きく、例えば、１０～１０００倍少ない。上部呼吸器管におけるウイルスの複製と関係する鼻漏をさらに減少させるために、理想的ワクチン候補ウイルスは、上部および下部両方の呼吸器管で複製レベルの制限を示さなければならない。しかしながら、本発明の弱毒化ウイルスは、ワクチン接種個体における保護を提供するために、ヒトにおいて十分に感染性および免疫原性でなければならない。感染宿主の上咽頭におけるＲＳＶレベルを決定する方法は、文献において周知である。検体を吸引または鼻咽頭分泌物の洗浄により得て、ウイルスを組織培養または他のに実験室法により定量する。例えば、Belshe et al., J. Med. Virology 1:157-162 (1977), Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694 (1968); Gharpure et al., J. Virol. 3:414-421 (1969);およびWright et al., Arch. Ges. Virusforsch. 41:238-247 (1973)参照。ウイルスを、簡便にはチンパンジーなどの宿主動物の上咽頭で特定し得る。

本発明はまた、１以上の単離ポリヌクレオチド、例えば、１以上のｃＤＮＡから感染性ＲＳＶを産生する方法も提供する。本発明によると、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムをコードするｃＤＮＡを、感染性ＲＳＶ形成のために必要なウイルスタンパク質との細胞内またはインビトロ共発現により構築する。“ＲＳＶアンチゲノム”は、子孫ＲＳＶゲノムの合成のための鋳型として役立つ、単離ポジティブセンスポリヌクレオチド分子を意味する。好ましくは、転写、複製ヌクレオカプシドをコードする配列を産生するために必要なタンパク質、すなわち、Ｎ、Ｐ、ＬおよびＭ２－１タンパク質をコードする相補配列のポジティブセンス転写物とハイブリダイズする可能性を最小化するために、複製的中間体ＲＮＡまたはアンチゲノムに対応する、ＲＳＶゲノムのポジティブセンスバージョンである、ｃＤＮＡを構築する。

天然ＲＳＶゲノムは、一般にネガティブセンスポリヌクレオチド分子を含み、これは、実質的にMink et al., Virology 185: 615-624 (1991), Stec et al., Virology 183: 273-287 (1991)およびConnors et al., Virol. 208:478-484 (1995)に記載のとおり、相補的ウイルスｍＲＮＡを介して、１１種のウイルスタンパク質、すなわち、非構造的タンパク質ＮＳｌおよびＮＳ２、Ｎ、Ｐ、マトリクス(Ｍ)、小疎水性(ＳＨ)、糖タンパク質(Ｇ)、融合(Ｆ)、Ｍ２－１、Ｍ２－２およびＬをコードする。本発明の目的で、本発明の組み換えＲＳＶのゲノムまたはアンチゲノムは、それによりコードされるウイルスまたはウイルス成分粒子を感染性とするのに必要な遺伝子またはその一部しか必要ではない。さらに、遺伝子またはその一部は、１を超えるポリヌクレオチド分子により提供され、すなわち、遺伝子は、別のヌクレオチド分子からの補完などにより提供され得る。

組み換えＲＳＶは、組み換え発現系またはそれから産生されたウイルスまたはウイルス成分粒子に直接的または間接的に由来するまたは繁殖された、ＲＳＶまたはＲＳＶ様ウイルスまたはウイルス成分粒子を意味する。組み換え発現系は、ＲＳＶ遺伝子発現に制御役割を有する少なくとも１遺伝要素または複数要素、例えば、プロモーター、ＲＳＶＲＮＡに転写される構造的またはコード化配列および適切な転写開始および停止配列の集合を含む、操作可能に結合した転写単位を含む、組み換え発現ベクターを用いる。

ｃＤＮＡ発現ゲノムまたはアンチゲノムから感染性ＲＳＶを産生するために、ゲノムまたはアンチゲノムを、(ｉ)ＲＮＡ複製が可能ヌクレオカプシドを産生するおよび(ii)子孫ヌクレオカプシドをＲＮＡ複製および転写の両者に適格性とするのに必要なＲＳＶタンパク質と共発現させる。ゲノムヌクレオカプシドによる転写は他のＲＳＶタンパク質を提供し、生産的感染を開始する。生産的感染に必要なさらなるＲＳＶタンパク質も、共発現により供給し得る。

その一部をコードするｃＤＮＡを構築する別の手段は、サブユニットｃＤＮＡ成分数を、１片または２片まで減らす、改善されたＰＣＲ条件を使用する、逆転写ＰＣＲである(例えば、Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :5695-5699 (1994); Samal et al., J. Virol 70:5075-5082 (1996)に記載のとおり)。他の実施態様において、異なるプロモーター(例えば、Ｔ３、ＳＰ６)または異なるリボザイム(例えば、デルタ肝炎ウイルスのもの)を使用できる。異なるＤＮＡベクター(例えば、コスミド)を、大きなサイズのゲノムまたはアンチゲノムの良好な収容のために繁殖に使用し得る。

Ｎ、Ｐ、ＬおよびＭ２－１タンパク質は、ゲノムまたはアンチゲノムをコードするものと同一のまたは分離し得る１以上の発現ベクターおよび種々のこれらの組み合わせによりコードされ得る。それ自体のベクターまたはＮ、Ｐ、ＬまたはＭ２－１タンパク質または完全ゲノムまたはアンチゲノムをコードするベクターによりコードされる、付加的タンパク質を所望により包含できる。トランスフェクトプラスミドからのゲノムまたはアンチゲノムおよびタンパク質の発現は、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現系での感染トランスフェクションまたは形質導入、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスＭＶＡ株組み換え体により提供される、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの制御下に各ｃＤＮＡを置くことにより達成され得る(Wyatt et al., Virology, 210:202-205 (1995))。ウイルスタンパク質および／またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼも、形質転換哺乳動物細胞からまたは予め形成したｍＲＮＡまたはタンパク質のトランスフェクションにより提供され得る。

要約すると、本明細書に記載する材料、情報および方法は、段階的弱毒化表現型を有する一連の弱毒化株を提供し、臨床的ベンチマークに基づき、適当なワクチン候補株を選択するガイダンスを提供する。

本発明の種々の実施態様が詳細に記載されているが、これらの実施態様の修飾および適応が当業者により成されることは明らかである。しかしながら、このような修飾および適応が、添付する特許請求の範囲に示すとおり、本発明の範囲内であることは、明確に理解されるべきである。下記実施例は、説明の目的で提供し、本発明の範囲を限定する意図はない。

本明細書の下記および他の箇所に開示する各刊行物、配列または他の引用は、本開示と矛盾がない程度に、その全体を引用により本明細書に包含させる。２０１６年９月２３非出願の、「Improved codon-pair-deoptimized vaccine candidates for human respiratory syncytial virus」なる名称の米国仮出願６２／３９９,１３３；２０１６年９月２７日出願の、「Vaccine candidates for respiratory syncytial virus (RSV) having attenuated phenotypes」なる名称の米国仮出願６２／４００,４７６；「Attenuation of human respiratory syncytial virus by genome scale codon-pair deoptimization」なる名称の米国公開２０１５－０３６８６２は、その全体を引用により本明細書に包含させる。

材料および方法
次の材料および方法を、下記実施例で使用した。

ウイルス収集および力価測定。ベロ細胞を組織培養培地に掻き取り、３０秒間ボルテックス処理し、低速遠心分離により浄化し、瞬間凍結した。浄化流体のウイルス力価を、３２℃でベロ細胞の免疫プラークアッセイにより決定した。

ウイルスストックを、感染細胞を培地に掻き取り、続いて３０秒間ボルテックス処理し、遠心分離により上清を浄化することにより、作製した。ウイルスアリコートを瞬間凍結し、－８０℃で保存した。ウイルス力価を、０.８％メチルセルロース重層を用いるベロ細胞でのプラークアッセイにより決定した。３２℃で１０～１２日インキュベーション後、プレートを８０％冷メタノールで固定し、プラークを、３ＲＳＶ特異的モノクローナル抗体のカクテルでの免疫染色により可視化した。力価をpfu／mlとして表した。ウイルスＲＮＡを全ウイルスストックから単離し、ウイルスゲノムの配列分析を、サンガー・シークエンシングにより重複ＲＴ－ＰＣＲフラグメントから実施し、組み換えウイルスのゲノム配列が正しく、不定変異がないことを確認した。各ゲノムについて直接確認しなかった唯一の配列は、最も外側のプライマーの位置、すなわちヌクレオチド１～２３および１５,１７４～１５,２２２であった。

Ion Torrentディープシークエンシング。浄化培養液からの精製ウイルスＲＮＡを、ウイルスゲノムにまたがる８重複フラグメントにコピーした。ライブラリーをIon Torrentプロトコールに従い調製し、半導体シークエンシングチップに充填し、Personal Genome Machine(Ion Torrent)で配列決定した。ヌクレオチドバリアントは、１０００×平均読み深度およびＰ値＜１０－７(品質スコア＞７０)で、＞５０倍生じたら、コールした。

ウイルスＲＮＡを、QiagenウイルスＲＮＡ抽出キットを使用して、ウイルスの示すアリコートを抽出し、これはＭｉｎ＿ＬまたはＭｉｎ＿ＦＬＣの温度ストレス試験の間継代した。ウイルスＲＮＡを、製造業者の推奨に従いsuperscript II RT(Life Technologies)を使用して逆転写した。次いで、ｃＤＮＡをウイルスゲノム全体を覆う８重複フラグメントのＲＳＶ特異的プライマーおよびｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ酵素(Life Technologies)を使用するＰＣＲにより増幅した。各ＰＣＲ産物をQIAquick PCR精製キット(Qiagen)を使用して精製した。

８ＰＣＲ反応の各々からの等量のＤＮＡを、１.５ml LoBindチューブ(Eppendorf)にプールした。ＤＮＡを、ヒートブロックで３０分、３７℃でShearEnzyme(Ion Torrent)を使用する酵素剪断に付した。次いで、剪断ＤＮＡを、１.８体積のAgencourt磁気ビーズ(Beckman)を使用して、精製した。Agencourtビーズを０.２mlの７０％エタノールで２回洗浄し、５分空気乾燥させ、２０～３０μlの１０mM Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７.５緩衝液に再懸濁し、続いてインキュベーション室温で５分インキュベートした。ＤＮＡを、２分磁気ラック上のAgencourtビーズを含む１.５ml LoBindチューブに入れることにより、上清から回収した。ＤＮＡを、製造業者の指示に従い末端修復酵素(Ion Torrent)で処理した。末端修復ＤＮＡを、上記のとおり、１.８体積のAgencourtビーズで精製し、磁気ラックで回収した。

各サンプルからのおおよそ１００ngの修復ＤＮＡを使用した、製造業者の指示に従い、リガーゼおよび緩衝液(Ion Torrent)を含む２０μl反応体積で特異的バーコードアダプターおよびシークエンシングアダプターでライゲートした。ライゲーション反応を室温で３０分実施し、４μlの０.５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０を加えて、停止させた。次いで等体積の異なるライゲートＤＮＡライブラリーを１.５ml LoBindチューブで合わせ、上記のとおり、１.８体積のAgencountで精製し、ＤＮＡライブラリーを得た。さらにＤＮＡを、Ｂｓｔ ２.０ ＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝液(ＮＥＢ)を使用するニック翻訳に付した。消化ＤＮＡをスピンカラムMinEluteキット(Qiagen)を使用して精製した。

次いで、おおよそ１００ngのＤＮＡライブラリーを、Platinum High Fidelity DNAポリメラーゼマスターミックス(Life Technologies)を使用してＰＣＲミックスに加え、続いて９５℃で１０分２サイクル、続いて９５℃で３０秒２サイクル、５８℃で３０秒および７２℃で３０秒のＰＣＲ増幅をした。ＰＣＲ産物を上記のとおり、１.８体積のAgencourtでさらに精製し、ＤＮＡを磁気ラックを使用して得た。ＤＮＡを、Qubitシステム(Invitrogen)を使用して定量した。

１mlのＰＣＲ溶液中のおおよそ７０００万ＤＮＡ分子を、固定比(０.５～１.０)のIon球粒子(ＩＳＰ)(Ion Torrent)と、ＰＣＲ反応ミックスおよび油(Ion Torrent)存在下で混合し、数千万のエマルジョン粒子の液滴を形成させた。これらの液滴を、OneTouch(Ion Torrent)の密閉キャピラリーＰＣＲプレートをとおし、これは、液体および粒子がプレートを連続的にとおるため、エマルジョンＰＣＲ増幅を実施した。ＩＳＰをOneTouchの遠心分離で、１対の収集チューブに取得した。OneTouchエマルジョンＰＣＲ終了時、収集チューブを３分、１５,０００ｇで遠心分離して、大部分の上清を除去した。ＩＳＰを１ml 洗浄緩衝液(Ion Torrent)で１回洗浄し、３分、１５,５００ｇで遠心分離して、大部分の上清を除去した。増幅ＤＮＡを含むＩＳＰを、ＤＮＡがないＩＳＰから、Dynabeads(登録商標)MyOne^TMストレプトアビジンＣ１磁気ビーズと室温で１０分、回転ラックでインキュベートすることによりさらに富化した。富化ＩＰＳを、チューブを磁気ラックに２分置き、０.２mlの洗浄緩衝液でピペッティングにより２回洗浄し、磁気ラックに２分置き、上清を廃棄することより取得した。ＩＳＰをDynabeads(登録商標)MyOne^TM Streptavidin C1磁気ビーズから、０.４ml ０.１２５Ｎ ＮａＯＨおよび０.１％Ｔｗｅｅｎ ２０と７分、室温で回転ラック中でインキュベーションすることにより、溶出した。溶出ＩＳＰを洗浄緩衝液で２回洗浄し、４分、１５,５００ｇで遠心分離して、大部分の上清を除去した。ＩＳＰをピペッティングにより再懸濁し、Dynabeads(登録商標)MyOne^TMビーズの最後の痕跡を除去するために、２分、磁気ラックに置いた。

１００μlの溶液を、ＩＳＰの最終ライブラリーがＱＣ試験およびシークエンシングの準備ができたら、新規チューブに移した。シークエンシングのために、ＩＳＰを３分、１５,５００ｇで遠心分離して、大部分の上清を除去した。ＩＳＰをピペッティングにより再懸濁し、１５０μlアニーリング緩衝液を含む０.２ml ＰＣＲチューブに移した。５μl対照Ion Spheres^TM(Ion Torrent)をＩＳＰミックスに加え、３分、１５,５００ｇで遠心分離して、大部分の上清を上部から除去しで、１５μlを底に残し、続いて１２μlシークエンシングプライマーを添加し、変性させ、９５℃で２分および２分、３７℃でアニールした。３μl ＤＮＡポリメラーゼ(Ion Torrent)を加え、サンプルを半導体シークエンシングチップ３１６または３１８(Ion Torrent)に載せて、Personal Genome Machine(ＰＧＭ)(Ion Torrent)でＤＮＡシークエンシングを実施した。

ＤＮＡ配列をＭｉｎ＿ＦＬＣまたはＭｉｎ＿Ｌ対照配列に対して、Ion Torrent ServerでIon TorrentからのVariantCaller 3.2ソフトウェアを使用して分析した。分析パイプラインは、デフォルト体細胞バリアント配置に設定した。ヌクレオチドバリアントを、先に記載のとおり、バリアントが平均読み深度１０００×およびＰ値＜１０^－７(品質スコア＞７０)で＞５０倍で生じたならば、コールした。生読み取りデータも、ゲノムブラウザーＩＶＧ(The Broad Institute)を使用して手動で確認した。

長ＰＣＲフラグメントのディープシークエンシング。培養液からの精製ウイルスＲＮＡを、Maxima H minus first strand cDNA synthesis kit(Thermo Scientific)を使用して、逆転写した。ＲＳＶ特異的プライマーおよびSequalPrep long PCR kit(Life Technologies)を使用して、ｃＤＮＡを、Ｍ２－２ ＯＲＦの３’末端から中央に伸びる８.２kbゲノムのＰＣＲ産物を作製した。ＤＮＡ鋳型ライブラリーを調製し、配列決定し、PacBioキットおよび器具類およびCluConソフトウェア(https://github.com/mpsbpbi/clusteringConsensus)を使用して、分析した。

３８℃および３９℃でＭｉｎ＿Ｌ系譜＃３の最初の４継代中の共存またはＭ２－１およびＰ遺伝子に生じた変異のものではない変異を、ディープシークエンシングにより調べた。そうするために、これら継代からのウイルスのアリコートからのウイルスＲＮＡを、上記のとおりQiagenウイルス抽出キットを使用して、抽出した。次いで、ウイルスＲＮＡを、製造業者の推奨により、Maxima H minus first strand cDNA synthesis kit(Thermo Scientific)を使用して、逆転写した。ＲＳＶ特異的プライマーおよびSequalPrep long PCR kit(Life Technologies)を使用して、次いでｃＤＮＡを使用して、Ｍ２－２遺伝子に対してゲノムの３’末端からの領域をカバーする、８.２kbのＰＣＲ産物を作製した。

PacBio SMRTbell DNA鋳型ライブラリーを調製するために、ＰＣＲ産物を上記のとおり精製し、次いで０.４５体積のAMPure PB磁気ビーズを使用して濃縮した。ＤＮＡをビーズに結合させるために、混合物を、ＶＷＲボルテックスミキサーで２０００rpmで１０分、室温で混合した。ビーズをペレット化するための短時間回転の後、各チューブを磁気ビーズラックに入れ、上清を注意深く廃棄した。次いでビーズを１.５mlの新たに調製した７０％エタノールで２回洗浄した。エタノール除去後、ビーズペレットを約１分乾燥させた。次いで、チューブを磁気ビーズラックから取り、ビーズをペレット化するために遠心分離した。次いで、ＤＮＡをPacific Biosciences Elution緩衝液を使用して溶出した。何らかのＤＮＡ損傷を修復するために、濃縮ＤＮＡを、３７℃で２０分、LoBindチューブで、ＤＮＡ損傷修復緩衝液、ＮＡＤ＋、ＡＴＰ高、ｄＮＴＰおよびＤＮＡ損傷修復酵素ミックス中、インキュベートした。次いで、ＤＮＡを２５℃で５分、ＤＮＡ末端修復ミックスとインキュベートした。反応後、ＤＮＡを上記のとおりAMPure PBビーズを使用して精製し、ビーズを３０μlの溶出緩衝液に溶出した。

次いで、末端修復ＤＮＡを、平滑末端アダプターと、該アダプター、緩衝液、ＡＴＰおよびリガーゼを含む反応中、１５分、２５℃アニールした。リガーゼを、６５℃で１０分不活性化した。最終に１時間、３７℃のエキソヌクレアーゼ段階を、すべての失敗ライゲーション産物の除去のために含めた。次いで、SMRTbell DNA鋳型ライブラリーを、上記のとおり、AMPure PBビーズを使用して３倍精製した。

精製後、SMRTbellライブラリー鋳型を、PacBio RSII装置で、PacBio DNA Polymerase Binding Kit P6を使用して、ＳＭＲＴ細胞で配列決定した。各サンプルライブラリーを、MagBead充填を使用して、動画収集時間２４０分で２ ＳＭＲＴ細胞で配列決定した。

データを、CluConソフトウェア(https://github.com/mpsbpbi/clusteringConsensus)を使用して分析した。全読み取りデータを、対照Ｍｉｎ＿Ｌ配列とアラインした。完全標的の９９％(８１６１塩基以上)に及ぶ読み取りデータのみ分析した；読み取り時点あたり平均３２,７３８(最小読み取りデータ２４,１３１、最大読み取りデータ４１,１１８)のほぼ完全長読み取りデータを生じた。アルゴリズムは、アラインメントを試験し、統計的に偶発的ノイズにより説明できない少ない頻度が観察された位置を発見することにより、バリアント位置を同定する。次いで、完全位相ハプロタイプを、バリアント位置でのほぼ完全長読み取りデータの各々で、何が配列されたかを符合させることにより、概算する。統計検定を、“ノイジー”ハプロタイプまたはシークエンシングノイズにより変造されている他の真に観察されたハプロタイプにより単純に説明されるものの廃棄に使用する。

ＣＰＤ ｒＲＳＶの温度遮断の決定。ｒＲＳＶウイルスの各々のｔｓ表現型を、３２℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃および４０℃でのプラーク形成効率により評価した。プラークアッセイをベロ細胞でデュプリケートで実施し、先に記載のとおり、種々の温度で温度制御水浴中、密封カスケットでインキュベートした。遮断温度(Ｔ_ＳＨ)は、この２温度でｗｔ ＲＳＶで観察されるより１００倍以上である、３２℃と比較したプラーク数の減少がある最低制限温度として定義される。

インビトロウイルス複製動態。多サイクルおよび単サイクル増殖動態を、６ウェルプレートで、３２℃および３７℃両方で、ベロ細胞のコンフルエント単層で実施した。

多サイクル増殖動態実験において、ベロ細胞を、記載するウイルスの０.０１pfu／細胞のＭＯＩでデュプリケートで感染させた。０～１４日目、ウイルスを感染細胞を培地に掻き取ることにより取得し、続いて３０秒間ボルテックス処理し、遠心分離により上清を浄化した。ウイルス接種材料および日々のアリコートを瞬間凍結し、－８０℃で保存した。ウイルス力価を、上記のとおりプラークアッセイにより決定した。

単サイクル増殖動態実験において、６ウェルプレート中３ウェルのベロ細胞を、記載するウイルスで、３２℃または３７℃で３pfu／ウェルのＭＯＩで感染させた。感染後４～２４時間まで４時間毎に、細胞関連ＲＮＡを、製造業者の指示に従いRNeasyミニキット(Qiagen)を使用して１ウェルから取得した。ウェスタンブロット分析のために、総細胞ライセートをNuPage LDSサンプル緩衝液(Life Technologies)に回収し、次いでQIAshredderスピンカラム(Qiagen)を使用してホモジナイズした。最後に、最後のウェルを、上記のとおりウイルス取得およびウイルス力価決定に使用した。

鎖特異的ｒＲＳＶＲＮＡ定量。単サイクル複製実験由来細胞関連ＲＮＡを使用して、先のとおり、ウイルスネガティブセンス(ゲノム)およびポジティブセンス(ｍＲＮＡおよびアンチゲノム)ＲＮＡを特異的に定量した。ｑＰＣＲ結果を比較閾値サイクル(ΔＣｔ)方法を使用して分析し、１８Ｓ ｒＲＮＡに対して正規化し、次いで、示す対照サンプルを超えるｌｏｇ_２増加倍率として表した。

単サイクル複製実験由来細胞関連ＲＮＡを使用して、先に記載のとおりウイルスネガティブセンス(ゲノム)およびポジティブセンス(ｍＲＮＡおよびアンチゲノム)ＲＮＡを特異的に定量した。１１個のｗｔ ＲＳＶ遺伝子の各々に特異的なアンチゲノム／ｍＲＮＡのためのTaqmanアッセイを、Primer Express 3.0ソフトウェア(Life Technologies)を使用して設計した。特に、Ｌ遺伝子について、３つの異なるTaqmanアッセイをｗｔ配列についておよびＣＰＤ配列について４つを設計した。

１μgのＤＮＡ消化ＲＮＡを、ゲノムまたはアンチゲノム／ｍＲＮＡに特異的なダグ付第一鎖プライマーを使用して、２０μl反応でSuperscript III(Life Technologies)を使用して逆転写した。５倍希釈後、ｃＤＮＡの各々を、タグ特異的プライマー、第二遺伝子特異的プライマーおよびプローブでトリプリケートで増幅させた。それ故に、タグ付ＲＴプライマー配列を含むｃＤＮＡのみが増幅された。プローブ配列はＲＳＶ遺伝子特異的であった。結果を正規化するために、１８Ｓ ｒＲＮＡを、ランダムプライマーで産生した第一鎖ｃＤＮＡおよび標準１８Ｓ ｒＲＮＡ Taqmanアッセイ(Applied Biosystems)を使用して並行で定量した。ｑＰＣＲ結果を比較閾値サイクル(ΔＣｔ)方法を使用して分析し、１８Ｓ ｒＲＮＡに対して正規化し、次いで、データを４時間時点でｗｔを超える増加倍率として表したｗｔ Ｌ定量以外、４時間時点でＭｉｎ＿Ｌを超えるｌｏｇ_２増加倍率として表した。第一鎖プライマーのないネガティブ対照を、第一鎖ｃＤＮＡ合成中の非特異的プライミングの非存在を示すため、鎖特異的ｑＰＣＲの各々に含ませた。

ウェスタンブロット分析。上記単サイクル感染実験から調製した細胞ライセートを、Odyssey Two-Color Protein Molecular Weight Marker(Li-Cor)と並行して、ＭＥＳ電気泳動緩衝液(Life Technologies)でＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離した。３０μgのタンパク質をＰＶＤＦ－Ｆ膜(Millipore)に、１×ＮｕＰＡＧＥ緩衝液中で移した。膜をOdyssey遮断緩衝液(LI-COR)で遮断し、０.１％Ｔｗｅｅｎ－２０存在下、一次抗体とインキュベートした。使用した一次抗体および希釈は次のとおりであった：マウス抗ＲＳＶＮ、Ｐ、Ｇ、ＦおよびＭ２－１モノクローナル抗体(１：１,０００)をAbcamから購入した；ＮＳ１およびＮＳ２の両者を認識するウサギポリクローナル抗血清を、ウサギ(Abgent)をＮＳ２のＣ末端１４アミノ酸(ＮＳ２およびＮＳ１のＣ末端は、最後の４アミノ酸が同一であり、これはおそらく交差反応性を説明する)を表す合成ペプチドでペプチド免疫化することにより産生した；ウサギ抗ＧＡＰＤＨポリクローナル抗体(１：２００)を負荷対照として使用した(Santa-Cruz Biotechnologies, Inc.)。１：１５,０００希釈で使用した二次抗体は、ヤギ抗ウサギIgG IRDye 680(Li-Cor)およびヤギ抗マウスIgG IRDye 800(Li-Cor)であった。膜を、Odyssey(登録商標)Infrared Imaging Systemでスキャンした。データをOdysseyソフトウェア、バージョン３.０(Li-Cor)を使用して分析した。目的の同定されたＲＳＶタンパク質の定量のために、蛍光シグナルを背景補正した。数値は、各タンパク質バンドの中央蛍光強度を示す。

プラークサイズ決定。ウイルスプラークサイズを、２４ウェルプレートを使用して、ベロ細胞でのプラークアッセイにより決定した。ベロ細胞単層を、３０pfu／ウェルの予め力価測定し、配列決定したウイルスストックに接種した。２時間吸着後、０.８％メチルセルロース重層を各ウェルに加えた。３２℃で１２日インキュベーション後、プレートを８０％冷メタノールで固定した。次いで、ウェルを、３つのＲＳＶ特異的モノクローナル抗体のカクテル(Bukreyev et al. 2001)と、遮断緩衝液(Odyssey緩衝液、Licor)中、１時間インキュベートした。遮断緩衝液で洗浄後、プラークをヤギ抗マウスIRdye 680LT(Licor)二次抗体で染色し、プラークをOdyssey(登録商標)Infrared Imaging Systemを使用して、可視化した。画像をImage Jを使用して分析し、ウイルスあたり１０００プラークを超える面積を測定し、ピクセル２で表した。ウイルスプラークサイズの分布を、コルモゴロフ・スミルノフ検定、続いてボンフェローニ補正(Prism 6.0、GraphPad)を使用して統計的意義を比較した。データのセットは、ｐ≦０.０５でのみ統計的有意差を考慮した。

マウスおよびハムスターにおけるＣＰＤ ｒＲＳＶ複製評価。動物試験は、NIAID Animal Care and Use Committeeにより承認され、先に記載の方法を使用して実施した。

全動物試験は、National Institutes of Health (NIH) Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC)に承認された。ＣＰＤウイルスの複製を、先に記載のとおり６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの上部および下部呼吸器管で評価した。２０マウスの群に、イソフルラン麻酔下、１０^６pfuのｗｔ ｒＲＳＶ、Ｍｉｎ＿Ｌ、Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]、Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]またはＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌを鼻腔内接種した。４日目および５日目、各群からの８マウスを二酸化炭素吸入により屠殺した。各群の残った４マウスを、１０日目に屠殺した。鼻介骨(ＮＴ)および肺組織を採取し、１×ＳＰＧ、２％Ｌ－グルタミン、０.０６mg／mLシプロフロキサシン、０.０６mg／mL リン酸クリンダマイシン、０.０５mg／mL ゲンタマイシンおよび０.００２５mg／mL アンホテリシンＢを含むライボビッツ(Ｌ)－１５培地に別々にホモジナイズした。ウイルス力価を、上記のとおり、ベロ細胞で３２℃でインキュベートすることによりデュプリケートで決定した。ウイルス検出限界は、ＮＴおよび肺検体でそれぞれ１００および５０pfu／ｇであった。

ＣＰＤウイルスの複製を、６週齢Golden Syrianハムスターの上部および下部呼吸器管で評価し、免疫原性も試験した。０日目に、１８ハムスターの群に、メトキシフルラン麻酔下、１０^６pfuのｗｔ ｒＲＳＶ、Ｍｉｎ＿Ｌ、Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]、Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]またはＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌを鼻腔内接種した。

ハムスターでのｗｔ ｒＲＳＶの複製ピークに相当する３日目に、各群からの９ハムスターを二酸化炭素吸入により屠殺した。ＮＴおよび肺組織を採取し、上記のとおりhomogenaイズした。ウイルス力価を、上記のとおり、ベロ細胞で３２℃でインキュベートすることによりデュプリケートで決定した。ウイルス検出限界は、ＮＴおよび肺で５０pfu／ｇであった。

免疫化２日前および免疫化後２６日目、９ハムスター／群の血液を血清収集およびＲＳＶ抗体力価測定のために集めた。３１日目、ハムスターに１０^６pfuのｗｔ ｒＲＳＶを鼻腔内投与により負荷した。負荷３日後、ハムスターを二酸化炭素吸入により屠殺した。ＮＴおよび肺組織を採取し、ｗｔ ｒＲＳＶ力価を、上記のとおり、ベロ細胞で３２℃でインキュベートすることによりデュプリケートで決定した。

Ｍ２－１四量体の分子動力学分析。変異を、ＳＹＢＹＬプログラム(Certara)を使用するヒトＲＳＶの転写終結構造Ｍ２－１タンパク質(ＰＤＢ ＩＤ ４Ｃ３Ｄ)の結晶構造に行った。分子動力学シミュレーションをＮＡＭＤプログラム(ｖ.２.９)を使用して実施した。

ＳＹＢＹＬプログラム(Certara, St. Louis, MO)を使用して、変異をヒトＲＳＶの転写終結構造Ｍ２－１タンパク質(ＰＤＢ ＩＤ ４Ｃ３Ｄ)の結晶構造に行った。変異体またはｗｔ ＲＳＶＭ２－１は、ＶＭＤプログラムを使用して、ＴＩＰ３Ｐ水分子およびＮａ^＋およびＣｌ^-カウンターイオンと明確に溶媒和した。全原子、等圧－等温(１気圧、３１０Ｋ)分子動力学シミュレーションを、明確に溶媒和およびエネルギー最小化後に、National Institutes of Health, Bethesda, MD (http://hpc.nih.gov)でBiowulf LinuxクラスターでＮＡＭＤプログラム(ｖ.２.９)を使用する周期的境界条件で実施し、続いて３１０Ｋまで１０Ｋ増分で温めた。静電気的相互作用を、Particle-Mesh Ewald合計を使用して計算した。CHARMM27力場をCHARMM原子タイプおよび荷電と共に使用した。全シミュレーションについて、２フェムト秒組込み時間段階を、１２Åカットオフと共に使用した。ランジュバン動力学を使用して、３１０Ｋの温度に維持し、修飾能勢・フーバー・ランジュバンを使用して、圧を制御した。シミュレーションを１００ナノ秒流した。

統計的分析。プラークサイズ分布を、コルモゴロフ・スミルノフ検定、続いてボンフェローニ補正により分析した。動物実験におけるウイルス複製および抗体応答を、ノンパラメトリッククラスカル・ウォリス検定と、ダン事後検定を使用して分析した。ｌｏｇ_１０変換を、群間で等しい標準偏差を得ることが必要なとき、データセットに使用した。統計をPrism 6(GraphPadソフトウェア)を使用して、実施した。データは、ｐ＜０.０５のときのみ有意と見なした。

実施例１：Ｍｉｎ＿ＬおよびＭｉｎ＿ＦＬＣ ＲＳＶ構築物の産生。
ＣＰＤ ＲＳＶ遺伝子の設計ならびにＭｉｎ＿ＬおよびＭｉｎ＿ＦＬＣの構築およびレスキューは、米国公開ＵＳ２０１５－０３６８６２２およびLe Nouen et al. (2014)に先に記載されている。すなわち、先に記載された計算アルゴリズム(Coleman et al. 2008およびMueller et al. 2010)を使用して、ＲＳＶ株Ａ２に基づきＣＰＤ ＯＲＦを設計した。Ｍｉｎ＿Ｌは、野生型(ｗｔ)Ｌ ＯＲＦと比較して１,３７８サイレント変異を示す、ＣＰＤ Ｌ ＯＲＦを含む。Ｍｉｎ＿ＦＬＣ(完全長クローンについて)は、Ｍ２－１およびＭ２－２以外全てのＣＰＤ ＯＲＦを含み、Ｍ２－１およびＭ２－２は、これらの重複ＯＲＦが、現在定義が不完全である配列(およびおそらく二次構造)に依存する組み合わさった停止－開始翻訳に参加するため、修飾しないままとした。Ｍｉｎ＿ＦＬＣは、ｗｔ ＲＳＶと比較して、２,６９２サイレント変異を含む(図１Ａ)。Ｍｉｎ＿ＬおよびＭｉｎ＿ＦＬＣのアミノ酸配列はｗｔ ＲＳＶのものと同一である。ウイルスを、Ｈ遺伝子の下流ＮＴＲにおける１１２－ｎｔ欠失ならびにＳＨ ＯＲＦの最後の３コドンおよび終止コドンに関与する５サイレントヌクレオチド点変異を有するＲＳＶ６１２０主鎖を使用して、構築した。ＳＨ遺伝子におけるこれらの変化は、大腸菌での繁殖中ＲＳＶｃＤＮＡを安定化する(Bukreyev et al. 2004)。本試験のｗｔ ＲＳＶは６１２０ウイルスであった。Ｍｉｎ＿ＬおよびＭｉｎ＿ＦＬＣウイルスストックを、サンガーおよびIon Torrentディープシークエンシングで完全配列決定し、不定変異がないことが判明した。Ｍｉｎ＿ＦＬＣのヌクレオチド配列を配列番号１２に示し、Ｍｉｎ＿Ｌのヌクレオチド配列を配列番号１３に示す。

実施例２：３２～３４℃での複製に制限された極めて安定な温度感受性(Ｔｓ)表現型を生じる、複数ＲＳＶ遺伝子のコドン対脱最適化(ＣＰＤ)。
上記のとおり、Ｍｉｎ＿ＦＬＣ(完全長クローンについて)は、１１のＲＳＶＯＲＦ中９(Ｍ２－１およびＭ２－２以外)がＣＰＤである変異体であり、計２,６９２サイレント変異(図１Ａ)をもたらした。Ｍｉｎ＿ＦＬＣは高度に温度感受性であり、遮断温度(Ｔ_ＳＨ)３５℃でプラーク形成し、一方野生型(ｗｔ)ｒＲＳＶは、４０℃でプラークを容易に形成する。Ｔ_ＳＨは、この２温度でｗｔ ＲＳＶで観察される力価の差異と比較して、３２℃と比較した力価の差異が≧１００倍減少である、最低制限温度として定義される。

Ｍｉｎ＿ＦＬＣ安定性を試験するために、ウイルス複製中の遺伝的安定性のサロゲートモデルを代表し、低温の上部呼吸器管から温かい下部呼吸器管に広がる温度ストレス試験を用いた。ベロ細胞の１０の独立した２５cm^２複製フラスコを、０.１プラーク形成単位(pfu)／細胞の初期ＭＯＩのＭｉｎ＿ＦＬＣで感染させ、７か月の連続的培養を表す、計１８継代段階で温度を徐々に上げながら連続継代した(フラスコを、記載する開始温度で、広範な細胞病理が観察されるまでインキュベートした。ウイルスを収集し、制限温度を上昇させながら連続的に継代した(継代１つおきに１℃温度上昇)。)。２つのさらなる複製フラスコを、対照として感染させ、並行して３２℃の許容される温度で継代した(図１Ｂ～Ｃ)。１ml(計５ml中)の上清を使用して、次の継代を接種した。各継代後、アリコートを、記載するとおり力価測定およびサンガー・シークエンシングおよび／またはディープシークエンシングによる配列分析のために凍結させた。ウイルス力価を、許容される温度(３２℃)でプラークアッセイにより決定した。

３２℃で、Ｍｉｎ＿ＦＬＣは、１０^６～１０^７pfu／mlの力価まで複製し続けた(図１Ｂ)。１８継代後の２つの対照分化系列の完全ゲノムのディープシークエンシングは、低レベルの、孤発性変異しか示さず(図７)、Ｍｉｎ＿ＦＬＣが許容される条件下で遺伝的に安定であることを示した。温度を上げながらインキュベートしたフラスコにおいて、Ｍｉｎ＿ＦＬＣは、３２℃および３３℃で効率的に複製した(１０^６～１０^７pfu／ml、図１Ｃ)。しかしながら、３４℃での第一継代後(Ｐ５)、ウイルス複製は全１０分化系列で２００倍減少し、３５℃での第二継代終了時(Ｐ８)、ウイルスは、９分化系列で検出不可能であった。１０番目の系譜において、ウイルスは３７℃での第一継代終了時検出されなかった(Ｐ１１)。対照的に、記載するとおり、ｗｔ ｒＲＳＶは少なくとも４０℃までの温度で増殖制限は示さなかった。

それ故に、Ｍｉｎ＿ＦＬＣは、３４～３５℃を超える温度では、不活性ではなくても、高度に制限された(後者はそのＴ_ＳＨである)。結果として、Ｍｉｎ＿ＦＬＣは、ストレス条件下でそのＴｓ表現型を逃れることができず、表現型的に安定である。シークエンシングは、力価の急速な減少のため、制限温度上昇下で継代したＭｉｎ＿ＦＬＣ検体で行わなかった。これらの結果は、ＣＰＤウイルスについて表現型安定性の期待を満たす。

実施例３：Ｍｉｎ＿Ｌウイルスに対する温度ストレスは、複数遺伝子における複数変異の出現を促進した。
Ｌ ＯＲＦ単独(集合ＲＳＶＯＲＦの４８％を表す)がＣＰＤであったＭｉｎ＿Ｌウイルスは、１,３７８サイレント変異をもたらした(Ｍｉｎ＿ＦＬＣにおける５１％ほど多い変化)。Ｍｉｎ＿Ｌは３７℃のＴ_ＳＨを有する。１０複製フラスコをＭｉｎ＿Ｌで感染させ、２か月の連続的培養に対応する計８継代で温度を徐々に上げながら連続的に継代し、対照として２つのさらなる複製フラスコを感染させ、並行して３２℃で継代した(図１Ｄ～Ｅ)。

予想どおり、Ｍｉｎ＿Ｌは、３２℃で各継代で効率的に(１０^７pfu／ml)複製した(図１Ｄ)。Ｐ６でのディープシークエンシング(図８)およびＰ８でのサンガー・シークエンシング(データは示していない)による対照分化系列からのＲＮＡの配列分析は、孤発性の、低レベル変異しか示さなかった。温度を上げながら継代した１０分化系列において、９フラスコにおけるＭｉｎ＿Ｌの力価は、Ｐ１(３７℃)の最後に約２０倍減少した(図１Ｅ)。しかしながら、３７℃での第二継代中、同じ９分化系列の力価は約２００倍増加し、温度順応変異体の選択および成長が既に起こったことを示した。Ｐ３(３８℃)後、全１０分化系列のウイルス力価は一定して減少した：Ｐ８(４０℃で第二継代)で、ウイルスは７分化系列で検出不可能であり、他の２分化系列で、力価は極めて低かった(各２０pfu／ml)。残った系譜(＃３、緑色に着色)は、５００pfu／mlの力価を有した。それ故に、種々のＭｉｎ＿Ｌ分化系列は、温度感受性表現型の一部喪失に付されたように見えるが、最終的に４０℃で極めて強く制限された。

温度を上げながら継代した１０分化系列の各々において、全ゲノムディープシークエンシングを、ウイルス複製が各系譜でなお検出可能であったＰ６(３９℃での第二継代)で実施した。シークエンシング読み取りデータの≧４５％に存在する変異を表１に示す。顕著なことに、これらの顕著な変異の多くが、ＣＰＤに付されなかった遺伝子にであった。特に、これら２３の顕著な変異のうち、２１個が６ＯＲＦ(Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｍ２－１およびＬ)および２個が遺伝子外領域に分布した。２３変異のうち、１１(４８％)および５(２２％)がそれぞれＭ２－１およびＬ ＯＲＦで生じた。ＯＲＦに存在する２１変異のうち、１つの除く全てがミスセンス変異であり、アミノ酸変化の偏りを示唆した。アミノ酸変化のこのポジティブ選択は、選択的ストレスに対するＭｉｎ＿Ｌの適応の少なくとも一部が、種々のウイルスタンパク質における構造／機能変化に関与することを示唆する。一部変異は、数分化系列で共通した。特に、抗終結転写因子Ｍ２－１における変異[Ａ７３Ｓ]は、１０分化系列中８において顕著であった。他のＭ２－１変異(Ｎ８８Ｋ)およびＬ(Ａ１４７９Ｔ)における変異は、２分化系列で顕著であった。Ｍ２－１は、全ての系譜で１以上の顕著な変異を有する唯一の遺伝子であった。

表Ｓ１は、同じ実験からのＰ６検体の読み取りデータの≧５％に存在した変異を示す。この低いカットオフで、より多くの変異がＮＳ２以外の全遺伝子で顕著であった。表１に示す顕著な変異に類似して、これらのあまり顕著でない変異は、大部分ミスセンス変異であった。ＣＰＤ Ｌ ＯＲＦにおいて、全３１変異中１７のみ(５５％)が、ＣＰＤ中に修飾されているｎｔまたはコドンに関与した(表Ｓ１)。

全ゲノムディープシークエンシング分析を実施して、ストレス試験中最高力価を維持し(図１Ｅ)、それ故に、最大脱弱毒化を有するために、最も興味深い、分化系列＃３および＃８の完全継代シリーズにおける変異の一過性出現を評価した。より豊富な変異の出現および頻度を、図１Ｆ(系譜＃３)およびＧ(系譜＃８)にグラフで示す。変異のより詳細なリストを表Ｓ２およびＳ３に示す。

両分化系列において、単一変異(Ｍ２－１における[Ａ７３Ｓ])はＰ１(各系譜の１３％)で現れ、Ｐ２で増加した(系譜＃３および８でそれぞれ３７％および５１％)。Ｐ２から、２分化系列は、異なる進化の軌跡をたどった。系譜＃３において、Ｐ２とＰ３の間に、Ｍ２－１変異[Ａ７３Ｓ]の頻度は減少を初めていたが(３０％)、Ｍ２－１の他の１０変異は現れ、集団のおおよそ１５～３０％をしめた(表Ｓ２)。これらのＭ２－１変異の一つ、すなわち[Ｎ８８Ｋ]は、Ｐ４で豊富となり(７１％)、Ｐにおける等しく豊富な(６６％)変異[Ｅ１１４Ｖ]と密接に同時発生した(図１Ｆ)。他のＭ２－１変異は減少し、Ｐ５以降では検出不可能となり、選択的スイープを示唆した。２つの付加的な顕著な変異が、Ｐ６(Ｎ[Ｋ１３６Ｒ])およびＰ７(Ｌ[Ｔ１１６６Ｉ])で獲得された。系譜＃８において、Ｍ２－１における変異[Ａ７３Ｓ]はＰ４で固定された(８８％)。Ｐ２で、２つの付加的変異(５’トレーラー領域およびＬ)が獲得され、Ｐ４の最後までに顕著となり、固定された。４０℃での第一継代後(Ｐ７)、一部付加的変異が獲得され、そのうち３つがＰ８の最後までに顕著となった；Ｌにおける１サイレント、Ｎにおける１サイレントおよびＰにおける１[Ｅ１１３Ｇ]。

実施例４：抗終結転写因子Ｍ２－１における２つの変異Ｎ８８ＫおよびＡ７３Ｓは顕著であるが、不適合性である。
Ｐ６での全１０分化系列はＭ２－１変異[Ａ７３Ｓ]または[Ｎ８８Ｋ]を有した(表１、図２Ａ)。それ故に、これら２つのＭ２－１変異は、隔離されたと考えられた。さらに、系譜＃３の継代シリーズ中の[Ａ７３Ｓ]変異の消失は、[Ｎ８８Ｋ]の出現および増加と、後者が完全集団に存在するまで併存した(図１Ｆ)。系譜＃３のディープシークエンシング結果を再評価し、Ｍ２－１における７３位および８８両者に及ぶ読み取りデータのみをスコアリングし、そうして結合分析を提供した。Ｐ３およびＰ４で、読み取りデータのわずか１％しか両変異を有さず(図２Ｂ)、Ｍ２－１におけるこれら２変異が同じゲノムで不適合性であり、それ故に、２つの別のウイルス集団を構成することが示唆される。

系譜＃３における主ウイルス集団の動力学をさらに特徴付けするために、最初の４継代中に出現した主要変異の結合を、Ｍ２－２ ＯＲＦの３’ゲノム末端から中央部までの８.２kb領域全体の完全読み取りデータを提供する単一分子シークエンシングである、PacBio長読み取りを使用して調査した。これは、最初の４継代が４つの主要なウイルス亜集団を含むことを示した(図２Ｃ)。一つは、継代と共に徐々に減少した元のＭｉｎ＿Ｌウイルスであった。Ｍ２－１変異[Ａ７３Ｓ]単独を有した他の亜集団は、Ｐ２がピークであり、Ｐ４でほぼ消滅した。他は、Ｍ２－１において７変異(３同義、４非同義)を有し、これは、Ｐ２で共に現れ、Ｐ３で最大に達し(約２０％)、次いで消失した。最後に、第四亜集団はＰ[Ｅ１１４Ｖ]およびＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]変異を有し、これはＰ３で共に現れ、Ｐ４で顕著となった。

実施例５：Ｍｉｎ＿Ｌへの変異Ｎ[Ｋ１３６Ｒ]、Ｐ[Ｅ１１４Ｖ]、Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]、Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]およびＬ[Ｔ１１６６Ｉ]導入。
Ｍｉｎ＿Ｌの温度感受性を担う変異の直接同定を、系譜＃３において同定されている主要変異、すなわちＮ[Ｋ１３６Ｒ]、Ｐ[Ｅ１１４Ｖ]、Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]およびＬ[Ｔ１１６６Ｉ](図１Ｆ)、ならびに複製＃８における顕著な変異の一つであるＭ２－１変異[Ａ７３Ｓ](図１Ｇ)をＭｉｎ＿Ｌに、個々におよび組み合わせで、導入することにより探索した。得られた１２ウイルス(図３Ａ)を回収し、完全配列決定し、正確な配列およびさらなる変異の非存在を確認した。

これは、製造業者の推奨に従いQuickchange Lightning Site-directed Mutagenesisキット(Agilent)を使用して、実施した。ｃＤＮＡを、特異的プライマーのセットを使用してサンガー・シークエンシングにより完全配列決定した。次いで標的変異を有するＣＰＤウイルスを先に記載のとおりｃＤＮＡからレスキューした。すなわち、ＢＳＲ Ｔ７／５細胞を、Lipofectamine 2000(Life Technologies)および５μgの完全長ｃＤＮＡ、各２μgのｐＴＭ１－ＮおよびｐＴＭ１－Ｐおよび各１μgのｐＴＭ１－Ｍ２－１およびｐＴＭ１－Ｌを含むプラスミド混合物を使用して、トランスフェクトした。３７℃で一夜インキュベーション後、トランスフェクト細胞を培地に掻き出すことにより収集し、ベロ細胞のサブコンフルエント単層に添加し、３２℃でインキュベートした。レスキューウイルスを、トランスフェクション後１１～１４日に収集した。

Ｎ[Ｋ１３６Ｒ]またはＰ[Ｅ１１４Ｖ]変異単独の導入は、Ｍｉｎ＿Ｌと比較して、Ｔ_ＳＨのおおよそ１℃上昇をもたらし(図３Ｂ)、Ｌ[Ｔ１１６６Ｉ]単独は効果を有しなかった。興味深いことに、Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]または[Ｎ８８Ｋ]単独の導入はＴ_ＳＨの２℃上昇を誘発し、これら２つのＭ２－１変異単独のいずれかが、Ｍｉｎ＿Ｌの脱弱毒化に最大の役割を有することが示唆された。ＮまたはＰ変異とＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]の組み合わせは、Ｔ_ＳＨのさらなる、小さな上昇を与えた(３つの独立した実験の平均２.５℃)。Ｎ、ＰおよびＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]変異の組み合わせは、Ｍｉｎ＿Ｌと比較して、Ｔ_ＳＨの３℃上昇を誘発し(４０℃)、Ｌ変異の付加によりさらに上昇はしなかった。これは、系譜＃３のＴ_ＳＨ上昇におけるＮ、ＰおよびＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]変異の相加的役割を説明した。Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]と[Ｎ８８Ｋ]の組み合わせは、Ｍｉｎ＿ＬのＴ_ＳＨにいかなる上昇も付与せず、ディープシークエンシング結果に基づき予測されたとおり、それらの不適合性を示唆する。

ベロ細胞におけるＭｉｎ＿Ｌ複製の動態および効率に対するこれらの変異の効果を試験した(図３Ｃ～Ｄ)。変異の効果は、温度感受性変異から予測されるとおり、３７℃(図３Ｃ、Ｄ、右パネル)で、３２℃(左パネル)より顕著であった。ＮおよびＰ変異単独および組み合わせは、Ｍｉｎ＿Ｌと比較して、ウイルス複製にわずかな効果しかなかった。対照的に、Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]または[Ａ７３Ｓ]変異単独いずれかの導入は、複製の実質的増加をもたらし、これはＮ、ＰおよびＬ変異のさらなる付加でほとんど影響されなかった。さらに、不適合性Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]および[Ｎ８８Ｋ]変異の両者を担持するウイルスは、３７℃および３２℃それぞれで、Ｍｉｎ＿Ｌと同等または低効率で複製した(図３Ｄ、左および右パネル)。それ故に、Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]または[Ａ７３Ｓ]変異は、ベロ細胞でＭｉｎ＿Ｌが複製する能力の回復に主要な役割を有するが、それらは不適合性であった。

さらに、単一感染サイクルにおけるウイルス遺伝子転写、ウイルスゲノムＲＮＡ合成、タンパク質発現およびウイルス粒子産生の動態に対する導入変異の効果(図４Ａ～Ｅ)を試験した。ベロ細胞を、記載するウイルスで３pfu／細胞のＭＯＩで感染させ、サンプルを２４時間まで分析のために４時間毎に採取した。

９の小さなＲＳＶｍＲＮＡ(すなわち、Ｌ以外全て)の蓄積の分析を、各ｍＲＮＡに特異的なポジティブセンス特異的ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイで実施した。一般に代表的であるＰ ｍＲＮＡのデータを図４Ａに示し、これら９つのｍＲＮＡの完全データセットを図９に示す。一般に、ｗｔ ｒＲＳＶと比較して、Ｍｉｎ＿Ｌで３７℃で転写は大きく減少した。Ｍｉｎ＿ＬのＭ２－１変異のいずれかの導入は、転写の実質的回復をもたらした。Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]へのＮ、ＰおよびＬ変異のさらなる付加は、さらに中程度であるが、大部分一貫した、増加を提供した。ウェスタンブロット分析は、予想どおり、ウイルスタンパク質蓄積がｍＲＮＡより後で起こるが、それ以外、パターンはｍＲＮＡ蓄積に類似したことを示した(図４Ｂおよび１０)。

ポジティブセンス特異的、Ｌ特異的ＲＴ－ｑＰＣＲによるＲＳＶＬ ｍＲＮＡの蓄積(図４Ｃ)を試験した。３２℃で、基底レベルのＬ ｍＲＮＡがＭｉｎ＿Ｌ－感染細胞で観察されたが、時間と共に実質的増加はなく、ｗｔ Ｌ ｍＲＮＡで観察された時間と共に漸進的に増加するのとは対照的であった。ｗｔおよびＣＰＤ Ｌ遺伝子における広範な配列差異は、ｗｔ ｒＲＳＶとＭｉｎ＿Ｌ誘導体で異なるプライマー対の使用を必要とし、種々の時点での相対的存在量の直接比較を妨げた。３７℃で、ＣＰＤ Ｌ ｍＲＮＡは検出不可能であり、この温度での強い制限を示した。Ｍｉｎ＿ＬへのＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]または[Ａ７３Ｓ]変異の付加は、３２℃および３７℃両者で、ＣＰＤ Ｌ遺伝子転写を一部回復させた。Ｎ、ＰおよびＬ変異のさらなる包含は、さらにＬ遺伝子発現を増加させた。

Ｍｉｎ＿Ｌによる細胞関連ゲノムＲＮＡ産生(図４Ｄ)は、３２℃または３７℃でほぼ検出不可能であったが、感染２４時間後、３２℃および３７℃でＭ２－１[Ａ７３Ｓ]およびＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]により検出され、さらに増加した量がＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌ感染細胞で検出された。ｗｔ ｒＲＳＶによるゲノムＲＮＡ産生は、３２℃および３７℃両者で感染１２時間後から検出ｓれはじめ、ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌと比較して高かった。

感染性ウイルス粒子の産生は、ゲノムＲＮＡの蓄積と併存した(図４Ｅ)。３２℃で、Ｍｉｎ＿Ｌウイルス力価は感染２４時間後のみ増加を開始し、３７℃で増加は観察されなかった。Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]およびＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]ウイルス粒子は、Ｍｉｎ＿Ｌ粒子より早期に(両温度で感染２０時間後)蓄積し始め、高いレベル(３２℃でおよび３７℃でそれぞれ６倍および１１０倍高い)であった。ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌウイルス産生は、両温度でまず感染１６時間後から検出され、またＭｉｎ＿Ｌウイルス産生より多量であった(３２℃でおよび３７℃でそれぞれ９倍および３００倍高い)。感染性ｗｔ ｒＲＳＶは、両温度でまず感染１２時間後に観察され(図４Ｅ)、ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌより高いレベルであった(３２℃および３７℃両方で１０倍高い)。

ベロ細胞で産生されたプラークサイズを、ウイルス適応度の付加的パラメータとして測定した(図４Ｆ～Ｇ)。ｗｔ ｒＲＳＶは、Ｍｉｎ＿Ｌより有意に大きなサイズのプラークを産生した(ｐ＜０.０５)。Ｍｉｎ＿ＬへのＭ２－１[Ａ７３Ｓ]または[Ｎ８８Ｋ]変異付加はウイルス適応度を増加させ、ｗｔ ｒＲＳＶと有意には異ならないプラークサイズをもたらした(ｗｔ ｒＲＳＶに対してｐ＞０.０５)。Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ][Ｎ８８Ｋ]により誘発されたプラークはＭｉｎ＿Ｌプラークより小さく、これら２つのＭ２－１変異が不適合性であることをさらに確認した。

それ故に、ストレス下で獲得した２つの最も顕著な変異は、ＲＳＶ転写抗終結因子をコードするＭ２－１ ＯＲＦにおける２つのミスセンス変異([Ａ７３Ｓ]および[Ｎ８８Ｋ])であった。逆遺伝学によるこれらの変異いずれかの再導入は、３７℃でＭｉｎ＿Ｌの複製的適応度の相当部分をレスキューし、ウイルス遺伝子転写、タンパク質発現、粒子産生およびプラークサイズを増加させた。これらの２つのＭ２－１変異は、３７℃でＣＰＤ Ｌ遺伝子の転写を一部回復させ、それ以外はこの温度で検出レベル未満であった。Ｌ遺伝子発現の部分的回復は、ポリメラーゼ産生を増加させることが予測されたが、その量の少なさおよび利用可能抗体の欠如から、ここでは直接モニターしなかった。我々はＬタンパク質産生増加が、ＲＳＶ遺伝子の全ての転写をその後増加させ、間接的にウイルスタンパク質合成を増加させ、ＲＮＡ複製を増加させ、最終的に間接的に子孫ウイルス産生を増加させると仮説立てた。ウイルスｍＲＮＡ、タンパク質、ゲノムＲＮＡおよび子孫ビリオンの蓄積に対するこれらの効果が、実際観察された。それ故に、Ｍ２－１における２つの変異のいずれかの獲得は、ＣＰＤ Ｌ遺伝子転写増加により、３７℃でＭｉｎ＿Ｌを適応させる。

２つのＭ２－１変異によるレスキューＣＰＤ Ｌ遺伝子発現の後ろにある機序は未知である。ＲＳＶＭ２－１タンパク質は完全長ｍＲＮＡの効率的合成に必要であり、これがないと早期に停止する。Ｍ２－１タンパク質はまたポリシストロニックリードスルーｍＲＮＡの合成も増加させる。これは、共転写により新生ｍＲＮＡと結合し、ウイルスポリメラーゼによる終結を阻止する。さらに、Ｍ２－１タンパク質はＰと直接結合する。ＰおよびＲＮＡのＭ２－１への結合は、部分的に重複する相互作用表面により、相互に排他的だることが判明した。Ａ７３およびＮ８８はＲＮＡ／Ｐ結合界面から離れているが、おそらく既存の新生ＲＮＡ分子の通路であり得る。単純モデルは、新生Ｌ ｍＲＮＡの転写伸長効率が減少されるように、Ｌ遺伝子鋳型に影響するＣＰＤ中に導入された１,３７８ｎｔ変化である。Ｌ転写は、ポリメラーゼ複合体へのある効果を経て、Ｍ２－１変異を一部回復させた。ストレス下で獲得した顕著な変異はＭ２－１ ＯＲＦで最も頻繁であるが、Ｐ、ＮおよびＬ ＯＲＦでも見られ、この全て、ＲＮＡ合成に関与するウイルスタンパク質をコードする。これらの付加的Ｎ、ＰおよびＬ変異は、おそらくＣＰＤ Ｌ遺伝子の転写伸長の効率も増加させることにより、ＣＰＤ Ｌ遺伝子転写効率をさらに増加させた。

実施例６：コンピューターベース分子動力学シミュレーション(ＭＤＳ)。
コンピューターベース分子動力学シミュレーション(ＭＤＳ)を使用して、Ｍ２－１構造におけるＭ２－１[Ａ７３Ｓ]および[Ｎ８８Ｋ]変異の効果の可能性を試験した(図６)。Ｍ２－１四量体を図６Ａに示し、パネルＢ、ＣおよびＤに具体的図を示す。ｗｔ Ｍ２－１四量体において、塩架橋は、ある単量体のＫ１９と隣接単量体のＤ１１６に存在することが予測される。これらのアミノ酸を赤色およびシアン単量体として示す(図６Ｂ)。ＭＤＳは、塩架橋が隣接単量体間の相互作用安定化を助けることを示唆する。第三単量体のＡ７３残基は近接であるが、相互作用に関与しないと予測される。Ａ７３がセリンに変わったとき([Ａ７３Ｓ]、図６Ｃ)、Ｋ１９とＤ１１６の間の塩架橋は維持されることが予測される。さらに、アラニンと異なり、コドン７３のセリンは、Ｋ１９と水素結合を形成し、あるＭＤＳ時間枠において、Ｄ１１６との水素結合を形成することが予測される(示していない)。それ故に、Ｓ７３は、各隣接単量体間に新規安定化結合を提供する。Ｎ８８Ｋ変異の予測される効果は、単量体間より、単量体内での安定性増加である。特に、ｗｔ Ｍ２－１四量体構造において、Ｎ８８がＳ８２と水素結合を形成することが予測される(図６Ｂ)。対照的に、コドン８８のリシン残基は、Ｅ７０と単量体内塩架橋を形成することが予測される(図６Ｄ)。Ｋ８８は、もはやＳ８２と相互作用しない。さらに、Ｋ８８の疎水性炭素鎖は、Ｌ７４との多数の単量体内ファンデルワールス相互作用を形成することが予測される。それ故に、ストレス試験中に獲得された顕著なＭ２－１変異は、Ｍ２－１単量体の(Ａ７３Ｓ)と(Ｎ８８Ｋ)および(Ｎ８８Ｋ)内の新規相互作用を形成することが予測される。この増加した安定性は、おそらくＣＰＤ Ｌ遺伝子のレスキュー転写に寄与する。興味深いことに、この増加した安定性は、両変異が一緒に存在するときは、維持されないと予測される。実際、これら２つの変異は、おそらくＳ７３およびＫ８８の側鎖間にＨ結合対を形成し、これは、Ｋ８８残基が存在するループの可動性の低下をもたらす。この可動性減少は、これら２変異の不適合性を説明する。

興味深いことに、Ｐ([Ｅ１１３Ｇ]および[Ｅ１１４Ｖ])で見られた変異は、ＰとのＭ２－１の相互作用ドメインに局在化することが見出された。これら２位置での変異は、ＰのＭ２－１への親和性を増加させることが示された。この研究は、さらに代償性変異がリボ核タンパク質複合体の安定性増加により作用するとの理論を支持し、これについて、我々は、ＣＰＤ Ｌ遺伝子の転写を促進し得ると仮説立てた。

記載のとおり、Ｍｉｎ＿Ｌの３７℃での第一継代で出現し、１０培養中８で見られたＭ２－１遺伝子における単一変異(Ａ７３Ｓ)は、その温度でＭｉｎ＿Ｌ複製をレスキューするのに十分であった。さらに、この単一変異は、ハムスターにおけるＭｉｎ＿Ｌの複製増加に寄与した。我々は、ＣＰＤ ＯＲＦの脱弱毒化が、ＣＰＤ配列の複数変化に関与し、漸増脱弱毒化をもたらすことを予期した。しかしながら、この研究は、異なる遺伝子における単一変異が実質的脱弱毒化を生じるのに十分であることを示した。従って、多数のｎｔ変化を含む脱最適化は、必ずしも安定な弱毒化表現型を提供しなかった。

実施例７：Ｍｉｎ＿ＬからＭｉｎ＿ＦＬＣへの脱弱毒化変異導入。
Ｍｉｎ＿Ｌに導入された主要変異、すなわちＮ[Ｋ１３６Ｒ]、Ｐ[Ｅ１１４Ｖ]、Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]、Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]およびＬ[Ｔ１１６６Ｉ]を、種々の組み合わせでＭｉｎ＿ＦＬＣに導入し、回復後のウイルス力価(図１１Ａ)およびＴ_ＳＨ(図１１Ｂ)を評価した。Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]および[Ａ７３Ｓ]変異は、ウイルス力価またはＴ_ＳＨで測定して、個々にＭｉｎ＿ＦＬＣの適応度を増加させなかった。Ｎ、ＰおよびＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]変異の組み合わせは、Ｔ_ＳＨの２℃増加をもたらしたが、このウイルスは、低力価までしか増殖しなかった。

驚くべきことに、Ｍｉｎ＿ＦＬＣへのＬ[Ｔ１１６６Ｉ]変異の単独または１以上の他の変異との組み合わせででの導入は、回復を阻止した。それ故に、これらの変異のいずれも、Ｍｉｎ＿Ｌと同じＣＰＤ Ｌ遺伝子を担持しているにも係わらず、Ｍｉｎ＿ＦＬＣの全体的適応度を改善しなかった。この結果は、複数ＣＰＤ ＯＲＦが選択圧下に表現型安定性を増強することを示唆する。

実施例８：マウスおよびハムスターにおけるＭｉｎ＿Ｌ誘導体の評価。
Ｍｉｎ＿Ｌ誘導体の複製をインビボで評価した(図５)。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、各ウイルス１０^６pfuで鼻腔内感染(ＩＮ)させた。鼻介骨(ＮＴ)および肺を感染後(ｐｉ)４日目(ｎ＝８／ウイルス)、５日目(ｎ＝８)および１０日目(ｎ＝４)に収集した。ウイルス複製のピーク時(感染５日後；図５Ｂ)、ウイルスは、Ｍｉｎ＿Ｌ感染させた２マウスおよびＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]で感染させた３マウスのＮＴでのみ観察された。Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]複製は８マウス中４マウスで観察され、ｗｔ ｒＲＳＶと同等であった。ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌ複製は、何れのマウスのＮＴでも観察されたなかった。５日目の肺において、Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]およびＭ２－１[Ａ７３Ｓ]の複製はＭｉｎ＿Ｌと比較してわずかに減少したが、統計的有意ではなく、ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌの複製は、Ｍｉｎ＿Ｌと比較して、肺で強く抑制された。１０日目力価は、ウイルスが２動物からしか回収されず、Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]群で痕跡両レベルであったため、示していない。

同じセットのウイルスをハムスターで比較した(図５Ｃ)。３日目、ＮＴおよび肺をウイルスあたり９ハムスターから収集した。ＮＴにおいて、Ｍｉｎ＿Ｌ複製は、ｗｔ ｒＲＳＶと比較して、おおよそ１００倍減少した(ｐ≦０.０１)。Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]の複製は、Ｍｉｎ＿Ｌと比較して、軽度に増加したが、ｗｔ ｒＲＳＶと比較して、顕著な弱毒化を維持した。対照的に、Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]の力価は、Ｍｉｎ＿Ｌと比較してさらに増加し、ｗｔ ｒＲＳＶと統計的差異はなかった。興味深いことに、ＮＴにおけるＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌの複製は、Ｍｉｎ＿Ｌと比較して減少した。肺において、Ｍｉｎ＿ＬおよびＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]は、各ウイルスで９ハムスター中わずか１ハムスターでしか検出されず、ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌの複製は検出不可能であった。対照的に、Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]の複はＭｉｎ＿Ｌと比較して増加し、９ハムスター中５ハムスターが約１０^２pfu／ｇのウイルス複製を示した。それ故に、ハムスターにおいて、変異Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]は、脱弱毒化マーカーであるＭｉｎ＿Ｌの複製を増加し、Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]変異はＭｉｎ＿Ｌの複製に影響せず、Ｎ、Ｐ、ＬおよびＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]変異の組み合わせは、複製を減少させた。

複製の顕著な制限にも係わらず、Ｍｉｎ＿ＬおよびＭｉｎ＿Ｌ由来ウイルスは、ｗｔ ｒＲＳＶにより修道されたものと統計的差異がない抗体力価を誘発した(図５Ｄ)。Ｍ２－１[Ａ７３Ｓ]ウイルスは、Ｍｉｎ＿ＬおよびＭ２１－１[Ｎ８８Ｋ]より有意に高いレベルのＲＳＶ中和血清抗体を誘発した。興味深いことに、ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌウイルスは、高度に制限された複製にも係わらず、ＲＳＶ中和抗体誘発も、ｗｔ ｒＲＳＶと同等であった。３１日目、ハムスターをｗｔ ｒＲＳＶにＩＮで暴露し、ＮＴおよび肺を暴露３日後収集した。検出可能な暴露ウイルス複製は、Ｍｉｎ＿Ｌ群の１動物における痕跡量のウイルス以外検出されなかった(示していない)。

実施例９：Ｍｉｎ＿Ｌ－ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌウイルスの遺伝的安定性。
ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]ＬウイルスがＭｉｎ＿Ｌより高度に弱毒化であり、なおｗｔ ｒＲＳＶと同程度免疫原性であるとの観察により、このウイルスを有望なワクチン候補と特定した。従って、その安定性を、２か月の連続的継代に対応する、３９℃で４継代および４０℃で４継代を含む温度ストレス試験で評価した(図１２)。１０の異なるストレス分化系列および２対照フラスコの最終継代の完全ゲノムのサンガー・シークエンシングは、いかなる大量の変異も検出しなかった(示していない)。これは、有望なＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌウイルスを作るためのＭｉｎ＿ＬへのＮ、Ｐ、Ｍ２－１[Ｎ８８Ｋ]およびＬ変異の導入が遺伝的安定性を与えたことを示す。Ｍｉｎ＿Ｌ－ＮＰＭ２－１[Ｎ８８Ｋ]Ｌのヌクレオチド配列を図１４に示し、配列番号１４に表す。

^ａ示す変異を有する読み取りデータのパーセンテージ；読み取りデータの≧４５％に存在する変異のみを示す。ヌクレオチドナンバリングはＲＳＶ配列Ｍ７４５６８(生物学的ｗｔ ＲＳＶ株Ａ２)に基づく。同じ実験から読み取りデータの≧５％に存在する変異を表Ｓ１に示す。
^ｂＬ ＯＲＦのＣＰＤの一部として変換しているコドンを含む変異。
^ｃＬ ＯＲＦのＣＰＤの一部として変化しているヌクレオチド位置を含む変異。

^ａ示す変異を有する読み取りデータのパーセンテージ；読み取りデータの≧５％に存在する変異のみを示す。読み取りデータの≧５０％で検出された変異を黄色でハイライトし、読み取りデータの２５～４９％で検出された変異を緑色でハイライトする。ヌクレオチドナンバリングはＲＳＶ配列Ｍ７４５６８に基づく。
^ｂＬのＣＰＤの一部として変化しているコドンを含む変異。
^ｃＬのＣＰＤの一部として変化しているヌクレオチドを含む変異。
^ｄＬのＣＰＤの一部として変化しており、ｗｔ配列で回復するヌクレオチドを含む変異。

^ａ示す変異を有する読み取りデータのパーセンテージ；読み取りデータの1％に存在する変異のみを示す。ヌクレオチドナンバリングはＲＳＶ配列Ｍ７４５６８に基づく。
^ｂＬのＣＰＤの一部として変化しているコドンを含む変異。
^ｃＬのＣＰＤの一部として変化しているヌクレオチドを含む変異。

^ａ示す変異を有する読み取りデータのパーセンテージ；読み取りデータの1％に存在する変異のみを示す。ヌクレオチドナンバリングはＲＳＶ配列Ｍ７４５６８に基づく。
^ｂＬのＣＰＤの一部として変化しているコドンを含む変異。
^ｃＬのＣＰＤの一部として変化しているヌクレオチドを含む変異。

^ａ示す変異を有する読み取りデータのパーセンテージ；少なくとも２連続継代で１継代における読み取りデータの≧５％で検出された変異のみを示す。特異的継代の温度は、括弧内に示す。ある継代で読み取りデータの≧５０％で検出された変異を黄色でハイライトし、読み取りデータの２５～４９％で検出された変異を緑色でハイライトする。
ヌクレオチドナンバリングはＲＳＶ配列Ｍ７４５６８に基づく。
^ｂＬのＣＰＤの一部として変化しているコドンを含む変異。
^ｃＬのＣＰＤの一部として変化しているヌクレオチドを含む変異。
^ｄＬのＣＰＤの一部として変化しており、ｗｔ配列で回復するヌクレオチドを含む変異。

^ａ示す変異を有する読み取りデータのパーセンテージ；少なくとも２連続継代で１継代における読み取りデータの≧２５％で検出された変異のみを示す。特異的継代の温度は、括弧内に示す。
ヌクレオチドナンバリングはＲＳＶ配列Ｍ７４５６８に基づく。
^ｂＬのＣＰＤの一部として変化しているコドンを含む変異。
^ｃＬのＣＰＤの一部として変化しているヌクレオチドを含む変異。
^ｄＬのＣＰＤの一部として変化しており、ｗｔ配列で回復するヌクレオチドを含む変異。

^ａ示す変異を有する読み取りデータのパーセンテージ；少なくとも２連続継代で１継代における読み取りデータの≧５０％で検出された変異のみを示す。特異的継代の温度は、括弧内に示す。
ヌクレオチドナンバリングはＲＳＶ配列Ｍ７４５６８に基づく。
^ｂＬのＣＰＤの一部として変化しているコドンを含む変異。

^ａ示す変異を有する読み取りデータのパーセンテージ；少なくとも２連続継代で１継代における読み取りデータの≧５％で検出された変異のみを示す。特異的継代の温度は、括弧内に示す。ある継代で読み取りデータの≧５０％で検出された変異を黄色でハイライトし、読み取りデータの２５～４９％で検出された変異を緑色でハイライトする。
ヌクレオチドナンバリングはＲＳＶ配列Ｍ７４５６８に基づく。
^ｂＬのＣＰＤの一部として変化しているコドンを含む変異。
^ｃＬのＣＰＤの一部として変化しているヌクレオチドを含む変異。
^ｄＬのＣＰＤの一部として変化しており、ｗｔ配列で回復するヌクレオチドを含む変異。

^ａ示す変異を有する読み取りデータのパーセンテージ；少なくとも２連続継代で１継代における読み取りデータの≧２５％で検出された変異のみを示す。特異的継代の温度は、括弧内に示す。
ヌクレオチドナンバリングはＲＳＶ配列Ｍ７４５６８に基づく。

^ａ示す変異を有する読み取りデータのパーセンテージ；少なくとも２連続継代で１継代における読み取りデータの≧５０％で検出された変異のみを示す。特異的継代の温度は、括弧内に示す。
ヌクレオチドナンバリングはＲＳＶ配列Ｍ７４５６８に基づく。

参考文献
1. Abil Z, Xiong X, & Zhao H (2015) Synthetic biology for therapeutic applications. Mol Pharm 12(2):322-331.
2. Martinez MA, Jordan-Paiz A, Franco S, & Nevot M (2015) Synonymous Virus Genome Recoding as a Tool to Impact Viral Fitness. Trends Microbiol.
3. Gaunt E, et al. (2016) Elevation of CpG frequencies in influenza A genome attenuates pathogenicity but enhances host response to infection. Elife 5.
4. Nogales A, et al. (2014) Influenza A virus attenuation by codon deoptimization of the NS gene for vaccine development. J Virol 88(18):10525-10540.
5. Broadbent AJ, et al. (2015) Evaluation of the attenuation, immunogenicity, and efficacy of a live virus vaccine generated by codon-pair bias de-optimization of the 2009 pandemic H1N1 influenza virus, in ferrets. Vaccine.
6. Cheng BY, Ortiz-Riano E, Nogales A, de la Torre JC, & Martinez-Sobrido L (2015) Development of live-attenuated arenavirus vaccines based on codon deoptimization. J Virol 89(7):3523-3533.
7. Diaz-San Segundo F, et al. (2015) Synonymous deoptimization of the foot-and-mouth disease virus causes attenuation in vivo while inducing a strong neutralizing antibody response. J Virol.
8. Coleman JR, et al. (2008) Virus attenuation by genome-scale changes in codon pair bias. Science 320(5884):1784-1787.
9. Yang C, Skiena S, Futcher B, Mueller S, & Wimmer E (2013) Deliberate reduction of hemagglutinin and neuraminidase expression of influenza virus leads to an ultraprotective live vaccine in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 110(23):9481-9486.
10. Kunec D & Osterrieder N (2015) Codon Pair Bias Is a Direct Consequence of Dinucleotide Bias. Cell reports.
11. Tulloch F, Atkinson NJ, Evans DJ, Ryan MD, & Simmonds P (2014) RNA virus attenuation by codon pair deoptimisation is an artefact of increases in CpG/UpA dinucleotide frequencies. Elife 3:e04531.
12. Shen SH, et al. (2015) Large-scale recoding of an arbovirus genome to rebalance its insect versus mammalian preference. Proc Natl Acad Sci U S A 112(15):4749-4754.
13. Lauring AS, Jones JO, & Andino R (2010) Rationalizing the development of live attenuated virus vaccines. Nat Biotechnol 28(6):573-579.
14. Hanley KA (2011) The double-edged sword: How evolution can make or break a live-attenuated virus vaccine. Evolution (N Y) 4(4):635-643.
15. Bull JJ (2015) Evolutionary reversion of live viral vaccines: Can genetic engineering subdue it? Virus Evolution 1(1):vev005.
16. Burns CC, et al. (2006) Modulation of poliovirus replicative fitness in HeLa cells by deoptimization of synonymous codon usage in the capsid region. J Virol 80(7):3259-3272.
17. Mueller S, Papamichail D, Coleman JR, Skiena S, & Wimmer E (2006) Reduction of the rate of poliovirus protein synthesis through large-scale codon deoptimization causes attenuation of viral virulence by lowering specific infectivity. J Virol 80(19):9687-9696.
18. Bull JJ, Molineux IJ, & Wilke CO (2012) Slow fitness recovery in a codon-modified viral genome. Mol Biol Evol 29(10):2997-3004.
19. Nougairede A, et al. (2013) Random codon re-encoding induces stable reduction of replicative fitness of Chikungunya virus in primate and mosquito cells. PLoS Pathog 9(2):e1003172.
20. Vabret N, et al. (2014) Large-scale nucleotide optimization of simian immunodeficiency virus reduces its capacity to stimulate type I interferon in vitro. J Virol 88(8):4161-4172.
21. Meng J, Lee S, Hotard AL, & Moore ML (2014) Refining the balance of attenuation and immunogenicity of respiratory syncytial virus by targeted codon deoptimization of virulence genes. MBio 5(5):e01704-01714.
22. Ni YY, et al. (2014) Computer-aided codon-pairs deoptimization of the major envelope GP5 gene attenuates porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Virology 450-451:132-139.
23. Le Nouen C, et al. (2014) Attenuation of human respiratory syncytial virus by genome-scale codon-pair deoptimization. Proc Natl Acad Sci U S A 111(36):13169-13174.
24. White MD, Bosio CM, Duplantis BN, & Nano FE (2011) Human body temperature and new approaches to constructing temperature-sensitive bacterial vaccines. Cellular and molecular life sciences : CMLS 68(18):3019-3031.
25. Nielsen R (2005) Molecular signatures of natural selection. Annu Rev Genet 39:197-218.
26. Fearns R & Collins PL (1999) Role of the M2-1 transcription antitermination protein of respiratory syncytial virus in sequential transcription. J Virol 73(7):5852-5864.
27. Tanner SJ, et al. (2014) Crystal structure of the essential transcription antiterminator M2-1 protein of human respiratory syncytial virus and implications of its phosphorylation. Proc Natl Acad Sci U S A 111(4):1580-1585.
28. Tran TL, et al. (2009) The respiratory syncytial virus M2-1 protein forms tetramers and interacts with RNA and P in a competitive manner. J Virol 83(13):6363-6374.
29. Blondot ML, et al. (2012) Structure and functional analysis of the RNA- and viral phosphoprotein-binding domain of respiratory syncytial virus M2-1 protein. PLoS Pathog 8(5):e1002734.
30. Mason SW, et al. (2003) Interaction between human respiratory syncytial virus (RSV) M2-1 and P proteins is required for reconstitution of M2-1-dependent RSV minigenome activity. J Virol 77(19):10670-10676.
31. Chapman MA, et al. (2011) Initial genome sequencing and analysis of multiple myeloma. Nature 471(7339):467-472.
32. Mueller S, et al. (2010) Live attenuated influenza virus vaccines by computer-aided rational design. Nat Biotechnol 28(7):723-726.
33. Bukreyev A, Belyakov IM, Berzofsky JA, Murphy BR, & Collins PL (2001) Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor expressed by recombinant respiratory syncytial virus attenuates viral replication and increases the level of pulmonary antigen-presenting cells. J Virol 75(24):12128-12140.
34. Rothberg JM, et al. (2011) An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Nature 475(7356):348-352.
35. Buchholz UJ, Finke S, & Conzelmann KK (1999) Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J Virol 73(1):251-259.
35. Collins PL, et al. (1995) Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development. Proc Natl Acad Sci U S A 92(25):11563-11567.
37. Crowe JE, Jr., Collins PL, London WT, Chanock RM, & Murphy BR (1993) A comparison in chimpanzees of the immunogenicity and efficacy of live attenuated respiratory syncytial virus (RSV) temperature-sensitive mutant vaccines and vaccinia virus recombinants that express the surface glycoproteins of RSV. Vaccine 11(14):1395-1404.
38. Liang B, et al. (2015) Enhanced Neutralizing Antibody Response Induced by Respiratory Syncytial Virus Pre-fusion F Protein Expressed by a Vaccine Candidate. J Virol.
39. Humphrey W, Dalke A, & Schulten K (1996) VMD: visual molecular dynamics. J Mol Graph 14(1):33-38, 27-38.
40. Phillips JC, et al. (2005) Scalable molecular dynamics with NAMD. J Comput Chem 26(16):1781-1802.
41. Brooks BR, et al. (2009) CHARMM: the biomolecular simulation program. J Comput Chem 30(10):1545-1614.

Claims (23)

1. 呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)ゲノムまたはアンチゲノム配列を含む弱毒化表現型を有する組み換えＲＳＶバリアントをコードする単離ポリヌクレオチド分子であって、ここで、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムがＬタンパク質のＬ ＯＲＦにおける配列番号１１のＴ１１６６に対応する位置での変異により修飾され、その位置にイソロイシンがコードされ（Ｔ１１６６Ｉ）、かつ
   ｉ. Ｍ２－１タンパク質のＭ２－１ ＯＲＦにおける配列番号９のＮ８８またはＡ７３に対応する位置での変異
   ii. Ｎタンパク質のＮ ＯＲＦにおける配列番号３のＫ１３６に対応する位置での変異；
   iii. Ｐタンパク質のＰ ＯＲＦにおける配列番号４のＥ１１４に対応する位置での変異；および
   iv. これらの組み合わせ
   からなる群から選択される変異でさらに修飾されている、
   単離ポリヌクレオチド分子。
2. ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムが
   ｉ. Ｍ２－１タンパク質のＭ２－１ ＯＲＦにおける配列番号９のＮ８８に対応する位置での変異；
   ii. Ｎタンパク質のＮ ＯＲＦにおける配列番号３のＫ１３６に対応する位置での変異；
   iii. Ｐタンパク質のＰ ＯＲＦにおける配列番号４のＥ１１４に対応する位置での変異；および
   iv. これらの組み合わせ
   からなるから選択される変異でさらに修飾されている、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド分子。
3. ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムが
   ｉ. Ｍ２－１タンパク質のＭ２－１ ＯＲＦにおける配列番号９のＡ７３に対応する位置での変異；
   ii. Ｎタンパク質のＮ ＯＲＦにおける配列番号３のＫ１３６に対応する位置での変異；
   iii. Ｐタンパク質のＰ ＯＲＦにおける配列番号４のＥ１１４に対応する位置での変異；および
   iv. これらの組み合わせ
   からなるから選択される変異でさらに修飾されている、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド分子。
4. ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムが変異(ｉ)～(iii)の少なくとも２つにより修飾されている、請求項１～３の何れかに記載の単離ポリヌクレオチド分子。
5. ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムが変異(ｉ)～(iii)の全てにより修飾されている、請求項１～４の何れかに記載の単離ポリヌクレオチド分子。
6. 前記変異がミスセンス変異である、請求項１～５の何れかに記載の単離ポリヌクレオチド分子。
7. ａ. Ｍ２－１タンパク質のＭ２－１ ＯＲＦにおける配列番号９のＮ８８に対応する位置での変異がＮ８８Ｋであり、Ｍ２－１タンパク質のＭ２－１ ＯＲＦにおける配列番号９のＡ７３に対応する位置での変異がＡ７３Ｓであり；
   ｂ. Ｎタンパク質のＮ ＯＲＦにおける配列番号３のＫ１３６に対応する位置での変異がＫ１３６Ｒであり；そして
   ｃ. Ｐタンパク質のＰ ＯＲＦにおける配列番号４のＥ１１４に対応する位置での変異がＥ１１４Ｖである、
   請求項１～６の何れかに記載の単離ポリヌクレオチド分子。
8. ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムが変異ａ～ｃの少なくとも２つにより修飾されている、請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド分子。
9. ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムが変異ａ～ｃの全てにより修飾されている、請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド分子。
10. ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムが(１)Ｌタンパク質におけるＴ１１６６Ｉ、Ｍ２－１タンパク質におけるＮ８８Ｋ、Ｎタンパク質におけるＫ１３６ＲおよびＰタンパク質におけるＥ１１４Ｖ；および(２)Ｌタンパク質におけるＴ１１６６Ｉ、Ｍ２－１タンパク質におけるＡ７３Ｓ、Ｎタンパク質におけるＫ１３６ＲおよびＰタンパク質におけるＥ１１４Ｖからなる群から選択される対応する変異により修飾されている、請求項１～９の何れかに記載の単離ポリヌクレオチド分子。
11. ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムがＭ２－２、ＮＳ１およびＮＳ２から選択されるタンパク質の少なくとも一つにおいて欠失を含む、請求項１～１０の何れかに記載の単離ポリヌクレオチド分子。
12. ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムがコドン対脱最適化されている、請求項１～１１の何れかに記載の単離ポリヌクレオチド分子。
13. ＲＳＶのＬ ＯＲＦゲノムまたはアンチゲノムがコドン対脱最適化されている、請求項１～１２の何れかに記載の単離ポリヌクレオチド分子。
14. 請求項１～１３の何れかに記載の単離ポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。
15. 請求項１～１４の何れかに記載の単離ポリヌクレオチドを含む、細胞。
16. 免疫有効量の請求項１～１３の何れかに記載の単離ポリヌクレオチド分子によりコードされる組み換えＲＳＶバリアントを含む、医薬組成物。
17. 対象にＲＳＶに対してワクチン接種するための、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 免疫応答を誘発するための、請求項１６に記載の医薬組成物。
19. 鼻腔内投与される、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
20. 注射、エアロゾル送達、経鼻スプレーまたは点鼻により投与される、請求項１９に記載の医薬組成物。
21. 請求項１～１３の何れかの単離ポリヌクレオチドによりコードされる組み換えＲＳＶバリアントを含む、生存弱毒化ＲＳＶワクチン。
22. 請求項２１に記載のＲＳＶワクチンを含む、医薬組成物。
23. 請求項１～１３の何れかに記載の単離ポリヌクレオチド分子を発現させることを含む、請求項２１に記載のワクチンを製造する方法。