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JP7565620B2 - Ｄｍｐｋ遺伝子を標的とした筋ジストロフィーの治療方法 - Google Patents

Ｄｍｐｋ遺伝子を標的とした筋ジストロフィーの治療方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願第６２／８５３，３７３号（２０１９年５月２８日出願）及び米国仮出願第６３／０２５，４１７号（２０２０年５月１５日出願）（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）の利益を請求する。
発明の背景
発明の分野
本発明は、ヒトミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ；dystrophia myotonica protein kinase）遺伝子を標的とした筋ジストロフィーの治療方法等に関する。より詳細には、本発明は、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の特定の配列を標的としたガイドＲＮＡ及び転写抑制因子とＣＲＩＳＰＲ（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）エフェクタータンパク質との融合タンパク質を用いてヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現を抑制することにより、筋ジストロフィーを治療又は予防する方法及びその為の医薬組成物等に関する。
背景の考察
筋ジストロフィーは進行性の筋萎縮と筋力低下を伴う遺伝性疾患の総称である。現在でも筋ジストロフィーに対して有効な根本治療薬は存在せず、対症療法のみがおこなわれている。筋ジストロフィーのうち、ＤＭＰＫ遺伝子の変異に起因するものとして、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）がある。
ＤＭ１は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）中のＣＴＧリピートの伸長により引き起こされる常染色体優性遺伝病であり、トリプレットリピート病の一種である。ＤＭ１では、伸長したＣＵＧリピートを含むＲＮＡが、ＭＢＮＬ（Muscleblind-like）等のＣＵＧリピート結合タンパク質を内在性ＲＮＡターゲットから隔離し、それにより異常なスプライシングパターンやＲＮＡ安定性／局在性の変化等を引き起こすことが報告されている。これらの知見から、伸長したリピート座位のサイレンシングが治療的価値を持つことが示唆され、毒性のあるＲＮＡをサイレンシングするために、アンチセンスオリゴヌクレオチド、スモールＲＮＡ、低分子等、様々なアプローチがとられている（Pinto B et al., Mol Cell. 2017 Nov 2, 68(3):479-490を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
例えば、Ｊａｕｖｉｎらは、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲをターゲットとしたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いて、ＤＭ１のマウスモデルであるＤＭＳＸＬマウスを処置したところ、ＤＭＰＫ ｍＲＮＡレベルが低下し、核内ＲＮＡ凝集体（ＲＮＡ ｆｏｃｉ）が減少し、筋力が増大したこと、その一方で明白な毒性は検出されなかったことを示した（Jauvin D et al., Mol Ther Nucleic Acids. 2017 Jun 16, 7:465-474を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
ＷＯ２０１８／００２８１２には、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム等を用いた、細胞内でゲノム編集によりＤＭＰＫ遺伝子を編集する方法（ＤＭ１等のＤＭＰＫに関連した状態や障害を治療する為に用いられる）が開示されている（ＷＯ２０１８／００２８１２を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
また、Ｐｉｎｔｏら及びＢａｔｒａらは、ヌクレアーゼ活性を非活性化／失活させたＣａｓ９（ｄＣａｓ９）の、ＤＭ１の治療への応用の可能性を示した。具体的には、Ｐｉｎｔｏらは、ｄＣａｓ９と、ＣＴＧリピート領域に対するｇＲＮＡとを組み合わせることにより、ｄＣａｓ９が伸長したマイクロサテライトリピートの転写を効果的にブロックすること、それによりｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ（ＤＭ１のマウスモデルであるＨＳＡＬＲマウスにおいて）でリピート伸長に起因するＤＭ１に特徴的な表現型を改善できることを示した（Pinto B et al., Mol Cell. 2017 Nov 2, 68(3):479-490を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。一方、Ｂａｔｒａらは、ＲＮＡエンドヌクレアーゼを融合させたｄＣａｓ９と、ＤＭＰＫ ｍＲＮＡのＣＵＧリピート領域に対するｇＲＮＡとを組み合わせることにより、ＤＭ１患者細胞において、ＣＵＧリピートが伸長したＲＮＡレベルを低下でき、スプライシング異常を改善できることを示した（Batra R et al., Cell. 2017 Aug 24, 170(5):899-912を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
発明の概要
従って、本発明の目的の１つは、筋ジストロフィー（特にＤＭ１）の新規治療方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、筋ジストロフィーの治療に有効な新規剤を提供することにある。
以下の詳細な説明の中で明らかになるであろう、これらの目的及びその他の目的は、本発明者らが、ヒトＤＭＰＫ遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：１７６０）の特定の配列を標的としたガイドＲＮＡ及び転写抑制因子とヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との融合タンパク質を用いることにより、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現を強力に抑制できることを見出したことによって達成された。これらの知見に基づいて、本発明者らは本願発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下を提供する：
（１）以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡをコードする塩基配列。
（２）以下の塩基配列を含む、上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号６６、配列番号６８、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１３４、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡをコードする塩基配列。
（３）以下の塩基配列を含む、上記（１）又は（２）に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号６３、配列番号１３６、配列番号８３、配列番号９９、配列番号１３５、配列番号１０９、又は配列番号１１１で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡをコードする塩基配列。
（４）ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、若しくは配列番号１１９で表される塩基配列、又は配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、若しくは配列番号１１９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）ガイドＲＮＡをコードする塩基配列を少なくとも２つ含み、該少なくとも２つのガイドＲＮＡは異なっている、上記（１）～（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）転写抑制因子が、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＭＢＤ２Ｂ、ＮＩＰＰ１、及びＨＰ１Ａからなる群より選択される、上記（１）～（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（７）転写抑制因子が、ＫＲＡＢである、上記（６）に記載のポリヌクレオチド。
（８）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、上記（１）～（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（９）ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来する、上記（８）に記載のポリヌクレオチド。
（１０）ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列及び／又はヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列をさらに含む、上記（１）～（９）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（１１）ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、上記（１０）に記載のポリヌクレオチド。
（１２）ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターである、上記（１１）に記載のポリヌクレオチド。
（１３）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、ユビキタスなプロモーター又は筋特異的プロモーターである、上記（１０）～（１２）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（１４）ユビキタスなプロモーターが、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択される、上記（１３）に記載のポリヌクレオチド。
（１５）筋特異的プロモーターが、ＣＫ８プロモーター、ミオシン重鎖キナーゼ（ＭＨＣＫ）プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ５－１２（Ｓｙｎ）プロモーター、及びＤｅｓプロモーターからなる群より選択される、上記（１３）に記載のポリヌクレオチド。
（１６）筋特異的プロモーターが、ＣＫ８プロモーターである、上記（１５）に記載のポリヌクレオチド。
（１７）ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、配列番号７０、配列番号８１、配列番号８３、若しくは配列番号９９で表される塩基配列、又は配列番号７０、配列番号８１、配列番号８３、若しくは配列番号９９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含み、
転写抑制因子がＫＲＡＢであり、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９であり、
ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターであり、そして
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、ＣＫ８プロモーターである、
上記（１０）～（１６）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（１８）ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、配列番号８３で表される塩基配列、又は配列番号８３で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、上記（１７）記載のポリヌクレオチド。
（１９）上記（１）～（１８）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（２０）ベクターが、プラスミドベクター又はウイルスベクターである、上記（１９）に記載のベクター。
（２１）ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、上記（２０）に記載のベクター。
（２２）ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５８７ＭＴＰ、ＡＡＶ５８８ＭＴＰ、ＡＡＶ－Ｂ１、ＡＡＶＭ４１、及びＡＡＶｒｈ７４からなる群から選択される、上記（２１）記載のベクター。
（２３）ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ９である、（２２）記載のベクター。
（２４）上記（１）～（１８）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は上記（１９）～（２３）のいずれかに記載のベクターを含む、医薬組成物。
（２５）筋強直性ジストロフィー１型の治療又は予防用の、上記（２４）記載の医薬組成物。
（２６）上記（１）～（１８）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は上記（１９）～（２３）のいずれかに記載のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、筋強直性ジストロフィー１型の治療又は予防方法。
（２７）筋強直性ジストロフィー１型の治療又は予防のための、上記（１）～（１８）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は上記（１９）～（２３）のいずれかに記載のベクターの使用。
（２８）筋強直性ジストロフィー１型の治療又は予防用医薬組成物の製造における、上記（１）～（１８）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は上記（１９）～（２３）のいずれかに記載のベクターの使用。
（２９）以下を含む、リボヌクレオプロテイン：
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ。
（３０）以下を含む、上記（２９）に記載のリボヌクレオプロテイン：
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号６６、配列番号６８、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１３４、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ。
（３１）以下を含む、上記（２９）又は（３０）に記載のリボヌクレオプロテイン：
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号６３、配列番号１３６、配列番号８３、配列番号９９、配列番号１３５、配列番号１０９、又は配列番号１１１で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ。
（３２）ガイドＲＮＡが、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、若しくは配列番号１８６で表される塩基配列、又は配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、若しくは配列番号１８６で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、上記（２９）記載のリボヌクレオプロテイン。
（３３）転写抑制因子が、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＭＢＤ２Ｂ、ＮＩＰＰ１、及びＨＰ１Ａからなる群より選択される、上記（２９）～（３２）のいずれかに記載のリボヌクレオプロテイン。
（３４）転写抑制因子が、ＫＲＡＢである、上記（２９）～（３３）のいずれかに記載のリボヌクレオプロテイン。
（３５）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、上記（２９）～（３４）のいずれかに記載のリボヌクレオプロテイン。
（３６）ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌に由来する、上記（３５）に記載のリボヌクレオプロテイン。
（３７）ガイドＲＮＡが、配列番号１６４、配列番号１６９、配列番号１７１、若しくは配列番号１７７で表される塩基配列、又は配列番号１６４、配列番号１６９、配列番号１７１、若しくは配列番号１７７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含み、
転写抑制因子がＫＲＡＢであり、そして
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９である、
上記（２９）～（３６）のいずれかに記載のリボヌクレオプロテイン。
（３８）ガイドＲＮＡが、配列番号１７１で表される塩基配列、又は配列番号１７１で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、上記（３７）に記載のリボヌクレオプロテイン。
（３９）以下を含む、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現を抑制するための組成物又はキット：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
（４０）以下を含む、上記（３９）に記載の組成物又はキット：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号６６、配列番号６８、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１３４、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
（４１）以下を含む、上記（３９）又は（４０）に記載の組成物又はキット：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号６３、配列番号１３６、配列番号８３、配列番号９９、配列番号１３５、配列番号１０９、又は配列番号１１１で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
（４２）ガイドＲＮＡが、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、若しくは配列番号１８６で表される塩基配列、又は配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、若しくは配列番号１８６で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、上記（３９）に記載の組成物又はキット。
（４３）少なくとも２つの異なるガイドＲＮＡ、又は少なくとも２つの異なるガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又はガイドＲＮＡをコードする少なくとも２つのポリヌクレオチド（ここで、該少なくとも２つのポリヌクレオチドは異なっている）を含む、上記（３９）～（４２）に記載の組成物又はキット。
（４４）転写抑制因子が、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＭＢＤ２Ｂ、ＮＩＰＰ１、及びＨＰ１Ａからなる群より選択される、上記（３９）～（４３）のいずれかに記載の組成物又はキット。
（４５）転写抑制因子が、ＫＲＡＢである、上記（４４）に記載の組成物又はキット。
（４６）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、上記（３９）～（４５）のいずれかに記載の組成物又はキット。
（４７）ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌に由来する、上記（４６）に記載の組成物又はキット。
（４８）組成物又はキットが融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含み、
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが融合タンパク質に対するプロモーター配列をさらに含む、及び／又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドがガイドＲＮＡに対するプロモーター配列をさらに含む、上記（３９）～（４７）のいずれかに記載の組成物又はキット。
（４９）ガイドＲＮＡに対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、上記（４８）に記載の組成物又はキット。
（５０）融合タンパク質に対するプロモーター配列が、ユビキタスなプロモーター又は筋特異的プロモーターである、上記（４８）に記載の組成物又はキット。
（５１）ユビキタスなプロモーターが、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択される、上記（５０）に記載の組成物又はキット。
（５２）筋特異的プロモーターが、ＣＫ８プロモーター、ミオシン重鎖キナーゼ（ＭＨＣＫ）プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ５－１２（Ｓｙｎ）プロモーター、及びＤｅｓプロモーターからなる群より選択される、上記（５０）に記載の組成物又はキット。
（５３）ガイドＲＮＡが、配列番号１６４、配列番号１６９、配列番号１７１、若しくは配列番号１７７で表される塩基配列、又は配列番号１６４、配列番号１６９、配列番号１７１、若しくは配列番号１７７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含み、
転写抑制因子がＫＲＡＢであり、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９であり、
ガイドＲＮＡに対するプロモーター配列がＵ６プロモーターであり、そして
融合タンパク質に対するプロモーター配列がＣＫ８プロモーターである、
上記（４８）～（５２）のいずれかに記載の組成物又はキット。
（５４）ガイドＲＮＡが、配列番号１７１で表される塩基配列、又は配列番号１７１で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、上記（５３）に記載の組成物又はキット。
（５５）以下（ｅ）及び（ｆ）を投与することを含む、筋強直性ジストロフィー１型の治療又は予防方法：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
（５６）以下（ｅ）及び（ｆ）を投与することを含む、上記（５５）に記載の方法：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号６６、配列番号６８、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１３４、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
（５７）以下（ｅ）及び（ｆ）を投与することを含む、上記（５５）又は（５６）に記載の方法：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号６３、配列番号１３６、配列番号８３、配列番号９９、配列番号１３５、配列番号１０９、又は配列番号１１１で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
（５８）ガイドＲＮＡが、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、若しくは配列番号１８６で表される塩基配列、又は配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、若しくは配列番号１８６で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、上記（５５）に記載の方法。
（５９）少なくとも２つの異なるガイドＲＮＡ、又は少なくとも２つの異なるガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又はガイドＲＮＡをコードする少なくとも２つのポリヌクレオチド（ここで、該少なくとも２つのポリヌクレオチドは異なっている）を含む、上記（５５）～（５８）に記載の方法。
（６０）転写抑制因子が、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＭＢＤ２Ｂ、ＮＩＰＰ１、及びＨＰ１Ａからなる群より選択される、上記（５５）～（５９）に記載の方法。
（６１）転写抑制因子が、ＫＲＡＢである、上記（６０）に記載の方法。
（６２）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、上記（５５）～（６１）のいずれかに記載の方法。
（６３）ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌に由来する、上記（６２）に記載の方法。
（６４）融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが融合タンパク質に対するプロモーター配列をさらに含む、及び／又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドがガイドＲＮＡに対するプロモーター配列をさらに含む、上記（５５）～（６３）のいずれかに記載の方法。
（６５）ガイドＲＮＡに対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、上記（６４）に記載の方法。
（６６）融合タンパク質に対するプロモーター配列が、ユビキタスなプロモーター又は筋特異的プロモーターである、上記（６４）に記載の方法。
（６７）ユビキタスなプロモーターが、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択される、上記（６６）に記載の方法。
（６８）筋特異的プロモーターが、ＣＫ８プロモーター、ミオシン重鎖キナーゼ（ＭＨＣＫ）プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ５－１２（Ｓｙｎ）プロモーター、Ｄｅｓプロモーターからなる群より選択される、上記（６６）に記載の方法。
（６９）ガイドＲＮＡが、配列番号１６４、配列番号１６９、配列番号１７１、若しくは配列番号１７７で表される塩基配列、又は配列番号１６４、配列番号１６９、配列番号１７１、若しくは配列番号１７７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含み、
転写抑制因子がＫＲＡＢであり、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９であり、
ガイドＲＮＡに対するプロモーター配列がＵ６プロモーターであり、そして
融合タンパク質に対するプロモーター配列がＣＫ８プロモーターである、
上記（６４）～（６８）のいずれかに記載の方法。
（７０）ガイドＲＮＡが、配列番号１７１で表される塩基配列、又は配列番号１７１で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、上記（６９）に記載の方法。
（７１）筋強直性ジストロフィー１型の治療又は予防用医薬組成物の製造における、
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
の使用。
（７２）筋強直性ジストロフィー１型の治療又は予防用医薬組成物の製造における、以下（ｅ）及び（ｆ）の使用である、上記（７１）に記載の使用：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号６６、配列番号６８、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１３４、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
（７３）筋強直性ジストロフィー１型の治療又は予防用医薬組成物の製造における、以下（ｅ）及び（ｆ）の使用である、上記（７１）又は（７２）に記載の使用：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号６３、配列番号１３６、配列番号８３、配列番号９９、配列番号１３５、配列番号１０９、又は配列番号１１１で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
（７４）ガイドＲＮＡが、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、若しくは配列番号１８６で表される塩基配列、又は配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、若しくは配列番号１８６で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、上記（７１）に記載の使用。
（７５）少なくとも２つの異なるガイドＲＮＡ、又は少なくとも２つの異なるガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又はガイドＲＮＡをコードする少なくとも２つのポリヌクレオチド（ここで、該少なくとも２つのポリヌクレオチドは異なっている）の使用を含む、上記（７１）～（７４）に記載の使用。
（７６）転写抑制因子が、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＭＢＤ２Ｂ、ＮＩＰＰ１、及びＨＰ１Ａからなる群より選択される、上記（７１）～（７５）に記載の使用。
（７７）転写抑制因子が、ＫＲＡＢである、上記（７６）に記載の使用。
（７８）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、上記（７１）～（７７）のいずれかに記載の使用。
（７９）ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌に由来する、上記（７８）に記載の使用。
（８０）融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用及びガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの使用を含み、
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが融合タンパク質に対するプロモーター配列をさらに含む、及び／又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドがガイドＲＮＡに対するプロモーター配列をさらに含む、上記（７１）～（７９）のいずれかに記載の使用。
（８１）ガイドＲＮＡに対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、上記（８０）に記載の使用。
（８２）融合タンパク質に対するプロモーター配列が、ユビキタスなプロモーター又は筋特異的プロモーターである、上記（８０）に記載の使用。
（８３）ユビキタスなプロモーターが、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択される、上記（８２）に記載の使用。
（８４）筋特異的プロモーターが、ＣＫ８プロモーター、ミオシン重鎖キナーゼ（ＭＨＣＫ）プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ５－１２（Ｓｙｎ）プロモーター、及びＤｅｓプロモーターからなる群より選択される、上記（８２）に記載の使用。
（８５）ガイドＲＮＡが、配列番号１６４、配列番号１６９、配列番号１７１、若しくは配列番号１７７で表される塩基配列、又は配列番号１６４、配列番号１６９、配列番号１７１、若しくは配列番号１７７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含み、
転写抑制因子がＫＲＡＢであり、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９であり、
ガイドＲＮＡに対するプロモーター配列がＵ６プロモーターであり、そして
融合タンパク質に対するプロモーター配列がＣＫ８プロモーターである、
上記（８０）～（８４）に記載の使用。
（８６）ガイドＲＮＡが、配列番号１７１で表される塩基配列、又は配列番号１７１で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、上記（８５）に記載の使用。
本発明によると、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現を抑制することができ、結果としてＤＭ１を治療及び／又は予防することができると期待される。
本発明とそれに付随する多くの利点は、以下の詳細な説明を参照し、添付の図面と併せて理解することで、より完全に理解することができるであろう。
図１は、配列番号４～１２６で表される、ターゲット配列の位置を表す。黒色のボックスは、ヒトＤＭＰＫ遺伝子発現の５０％以上の抑制を示したターゲット配列の位置を表す。 図２は、配列番号４～１２６で表されるターゲット配列によりコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡと、ｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢとを用いて、ヒトＤＭＰＫ遺伝子に対する発現抑制作用を評価した結果を示す図である。横軸は、各ターゲット配列によりコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡを示し、縦軸は、コントロールｓｇＲＮＡを用いた時のＤＭＰＫ遺伝子の発現量（１００％）に対する各ｓｇＲＮＡを用いた時のＤＭＰＫ遺伝子の発現量の比を表し、エラーバーは標準偏差を示す。 図３は、配列番号４～１２６で表されるターゲット配列によりコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡと、ｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢとを用いてヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現をコントロールした時の、当該ターゲット配列の位置とヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現量との関係を示す図である。 図４は、ヒト筋肉細胞におけるＤＭＰＫダウンレギュレーションを示す。 図５は、ＤＭＳＸＬマウスにおいて、ＡＡＶ９－６９５がＤＭＰＫの発現を抑制したことを示す（Ａ；前脛骨筋、Ｂ；心臓、Ｃ；肝臓）。 図６は、ＤＭＳＸＬマウスにおいて、ＡＡＶ９－２４５がＤＭＰＫの発現を抑制したことを示す（Ａ；前脛骨筋、Ｂ；心臓、Ｃ；肝臓）。 図７は、ＤＭＳＸＬマウスにおいて、ＡＡＶ９－２５７がＤＭＰＫの発現を抑制したことを示す（Ａ；前脛骨筋、Ｂ；心臓、Ｃ；肝臓）。 図８は、ＤＭＳＸＬマウスにおいてＲＮＡ凝集体形成を改善したことを示す。 図９は、ｈＤＭＰＫ ｓｇＲＮＡを発現しているｉＤＭ細胞におけるＤＭＰＫ遺伝子発現の抑制を示したものである。 図１０は、ｈＤＭＰＫ ｓｇＲＮＡを発現しているｉＤＭ細胞におけるＲＮＡ凝集体形成の改善を示す（Ａ；ｉＤＭ－６９５細胞とｉＤＭ－Ｃｔｒｌ細胞の代表的なイメージ、Ｂ；各細胞におけるＲＮＡ凝集体陽性核の割合）。 図１１は、ｈＤＭＰＫ ｓｇＲＮＡを発現しているｉＤＭ細胞におけるスプライシング障害の改善を示す（Ａ；遺伝子のゲル像とエクソンパターン、Ｂ；正常にスプライシングされた生成物の割合）。
好ましい実施形態の詳細な説明
１．ポリヌクレオチド
本発明は、以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」とも称することがある）を提供する：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域（すなわち１８～２４の連続するヌクレオチド）を標的とするガイドＲＮＡをコードする塩基配列。
本発明のポリヌクレオチドは、所望の細胞内に導入され、転写されることにより、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質及びヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域中の特定の領域を標的とするガイドＲＮＡを生じる。これら融合タンパク質及びガイドＲＮＡが複合体（以下、該複合体を「リボヌクレオプロテイン（ribonucleoprotein；ＲＮＰ）」と称することがある）となって協同的に前記特定の領域に作用することにより、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の転写を抑制することができる。本発明の一態様において、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現を、例えば、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、又は約１００％、抑制することができる。
（１）定義
本明細書において「ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域」とは、ＲＮＰがその領域へ結合することによりヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現が抑制され得る、あらゆる領域を意味する。即ち、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域とは、ＲＮＰの結合によりヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現が抑制される限り、ヒトＤＭＰＫ遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン、エクソン、及びヒトＤＭＰＫ遺伝子の周辺遺伝子（例えばヒトＤＭＷＤ（DM1 locus, WD repeat containing）遺伝子）等のいずれの領域に存在してもよい。本明細書中、ある特定の配列により発現制御領域を表す場合、発現制御領域とは、そのセンス鎖配列及びアンチセンス鎖配列の両方を含む概念である。
本発明において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質は、ガイドＲＮＡによりヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域中の特定の領域へリクルートされる。本明細書において、「～を標的とするガイドＲＮＡ」とは、「～へ融合タンパク質をリクルートするガイドＲＮＡ」を意味する。
本明細書において、「ガイドＲＮＡ（『ｇＲＮＡ』とも称することがある）」とは、ゲノム特異的ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」と称する）を含むＲＮＡである。ｃｒＲＮＡは、ターゲット配列（後述）の相補配列に結合するＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣｐｆ１を用いる場合には、「ガイドＲＮＡ」とは、ｃｒＲＮＡとその５’末端に付した特定の配列（例えばＦｎＣｐｆ１の場合、配列番号１３８で表されるＲＮＡ配列）からなるＲＮＡを含むＲＮＡを指す。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣａｓ９を用いる場合には、「ガイドＲＮＡ」とは、ｃｒＲＮＡとその３’末端に連結されたｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」と称する）を含むキメラＲＮＡ（「ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）」と称する）を指す。（例えば、Zhang F. et al., Hum Mol Genet. 2014 Sep 15;23(R1):R40-6及びZetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759-71を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
本明細書において、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域中で、ｃｒＲＮＡが結合する配列に対する相補配列を「ターゲット配列（targeting sequence）」と称する。すなわち、本明細書において、「ターゲット配列」とは、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域中に存在し、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif））が隣接するＤＮＡ配列である。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣｐｆ１を用いる場合にはターゲット配列の５’側に隣接する。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣａｓ９を用いる場合にはターゲット配列の３’側に隣接する。ターゲット配列は、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域のセンス鎖配列側及びアンチセンス鎖配列側のいずれに存在してもよい（例えば、上述のZhang F. et al., Hum Mol Genet. 2014 Sep 15;23(R1):R40-6及びZetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759-71を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
（２）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質
本発明では、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を用いて、それに融合させた転写抑制因子をヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域にリクルートさせる。本発明に用いられるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（以下では単に「ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質」とも称することがある）としては、ｇＲＮＡと複合体を形成して、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域にリクルートされる限り特に制限はないが、例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（以下「ｄＣａｓ９」とも称することがある）又はヌクレアーゼ欠損Ｃｐｆ１（以下「ｄＣｐｆ１」とも称することがある）が挙げられる。
上記ｄＣａｓ９としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ又はＣ。以下同じ））、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）由来のＣａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＡＧＡＡＷ（ＷはＡ又はＴ。以下同じ）、Ｓｔ３Ｃａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＧＧＮＧ）、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）由来のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、又は黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus））由来のＣａｓ９(ＳａＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＧＲＲＴ（ＲはＡ又はＧ。以下同じ））のヌクレアーゼ欠損改変体等が挙げられるが、これらに限定されない（例えばNishimasu et al., Cell. 2014 Feb 27; 156(5): 935-49、Esvelt KM et al., Nat Methods. 2013 Nov;10(11):1116-21、Zhang Y. Mol Cell. 2015 Oct 15;60(2):242-55、及びFriedland AE et al., Genome Biol. 2015 Nov 24;16:257を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基に変換し、且つ、８４０番目のＨｉｓ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体（「ｄＳｐＣａｓ９」と称することがある）を用いることができる（例えば上述のNishimasu et al., Cell. 2014を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。或いは、ＳａＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５８０番目のＡｓｎ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体（配列番号１３９）、又は、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５５７番目のＨｉｓ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体（配列番号１４０）（以下、いずれの二重変異体についても「ｄＳａＣａｓ９」と称することがある）を使用することができる（例えば上述のFriedland AE et al., Genome Biol. 2015を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
また、本発明の一態様において、ｄＣａｓ９として、前記ｄＣａｓ９のアミノ酸配列の一部をさらに改変させた改変体であって、ｇＲＮＡと複合体を形成してヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域にリクルートされる改変体を用いてもよい。かかる改変体としては、例えば、アミノ酸配列の一部を欠失させた短縮型の改変体が挙げられる。本発明の一態様において、ｄＣａｓ９として、ＷＯ２０１９／２３５６２７及びＷＯ２０２０／０８５４４１（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）において開示された改変体を用いることができる。具体的には、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５８０番目のＡｓｎ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体であるｄＳａＣａｓ９の７２１番目～７４５番目のアミノ酸を欠失したｄＳａＣａｓ９（配列番号１４１）、若しくは該欠失部分をペプチドリンカーで置換したｄＳａＣａｓ９（例えば、該欠失部分をＧＧＳＧＧＳリンカー（配列番号１４２）で置換したものを配列番号１４３で示す（以下、いずれの二重変異体についても「ｄＳａＣａｓ９[－２５]」と称することがある）、又は前記二重変異体であるｄＳａＣａｓ９の４８２番目～６４８番目のアミノ酸を欠失したｄＳａＣａｓ９（配列番号１４４）、若しくは該欠失部分をペプチドリンカーで置換したｄＳａＣａｓ９（該欠失部分をＧＧＳＧＧＳリンカーで置換したものを配列番号１４５で示す）を用いてもよい。
また、上記ｄＣｐｆ１としては、例えば、フランシセラ・ノヴィシダ（Francisella novicida）由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＴＴＮ）、アシダミノコッカス ｓｐ．（Acidaminococcus sp.）由来のＣｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＴＴＴＮ）、又はラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）由来のＣｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＴＴＴＡ， ＴＣＴＡ， ＴＣＣＡ， 又はＣＣＣＡ）のヌクレアーゼ活性を欠損した改変体等が挙げられるが、それらに限定されない（例えば、Zetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71、Yamano T et al., Cell. 2016 May 5;165(4):949-62、及びYamano T et al., Mol Cell. 2017 Aug 17;67(4):633-45を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合、９１７番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基に、且つ、１００６番目のＧｌｕ残基をＡｌａ残基に変換した二重変異体を用いることができる（例えば、上述のZetsche B et al., Cell. 2015を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。本発明の一態様において、ｄＣｐｆ１として、前記ｄＣｐｆ１のアミノ酸配列の一部を改変させた改変体であって、ｇＲＮＡと複合体を形成してヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域にリクルートされる改変体を用いてもよい。
本発明の一態様において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としては、ｄＣａｓ９が使用される。一態様において、ｄＣａｓ９はｄＳａＣａ９であり、特定の態様において、ｄＳａＣａｓ９はｄＳａＣａｓ９[－２５]である。
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、それらのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、当該タンパク質の所望の部分をコードする領域をカバーするようにオリゴＤＮＡプライマーを合成し、当該タンパク質を産生する細胞より調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、ＰＣＲ法によって増幅することにより、クローニングすることができる。また、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、クローン化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列に、公知の部位特異的変異誘発法を用いて、ＤＮＡ切断活性に重要な部位のアミノ酸残基（例えば、ＳａＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基、５５７番目のＨｉｓ残基、及び５８０番目のＡｓｎ残基；ＦｎＣｐｆ１の場合、９１７番目のＡｓｐ残基や１００６番目のＧｌｕ残基等が挙げられるが、これらに限定されない）を他のアミノ酸で変換するように変異を導入することにより、取得することができる。
あるいはヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、それらのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、化学合成により、又は化学合成とＰＣＲ法もしくはギブソン・アッセンブリー（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）法との組み合わせにより取得することができ、さらに、ヒトでの発現に適したコドンとなるようコドン最適化を行った塩基配列として構築することもできる。
（３）転写抑制因子
本発明において、ヒトＤＭＰＫ遺伝子発現の抑制は、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に融合された転写抑制因子の作用により達成される。本明細書において、「転写抑制因子」とは、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の転写抑制能を有するタンパク質又はその機能を保持するペプチド断片を意味する。本発明に用いられる転写抑制因子としては、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現を抑制し得るものである限り特に限定されない。例えば、クルッペル関連ボックス（Kruppel-associated box：ＫＲＡＢ）、ＭＢＤ２Ｂ、ｖ－ＥｒｂＡ、ＳＩＤ（ＳＩＤの鎖状態（ＳＩＤ４Ｘ）を含む）、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリー（例えばＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、ＭｅＣＰ２、ＲＯＭ２、ＬＳＤ１、ＡｔＨＤ２Ａ、ＳＥＴ１、ＨＤＡＣ１１、ＳＥＴＤ８、ＥＺＨ２、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＰＨＦ１９、ＳＡＬＩ、ＮＵＥ、ＳＵＶＲ４、ＫＹＰ、ＤＩＭ５、ＨＤＡＣ８、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ６、ＭＥＳＯＬＯ４、ＳＥＴ８、ＨＳＴ２、ＣＯＢＢ、ＳＥＴ－ＴＡＦ１Ｂ、ＮＣＯＲ、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＮＩＰＰ１、ＨＰ１Ａ、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、及び転写抑制能を有するそれらの改変体、並びにそれらの融合体等が含まれる。本発明の一態様において、転写抑制因子としては、ＫＲＡＢが使用される。
転写抑制因子をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、化学合成により、又は化学合成とＰＣＲ法もしくはＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法との組み合わせにより構築することができる。さらに、転写抑制因子をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ヒトでの発現に適したコドンとなるようコドン最適化を行ったＤＮＡ配列として構築することもできる。
転写抑制因子をコードする塩基配列に、直接又はリンカー、ＮＬＳ（核移行シグナル）（例えば、配列番号１８９又は配列番号１９１の塩基配列）、タグ、及び／又はその他等をコードする塩基配列を付加した後に、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列にライゲーションすることで、転写抑制因子とヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との融合タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを調製することができる。本発明において、転写抑制因子はヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のＮ末端又はＣ末端のいずれに融合させてもよい。また、リンカーとしては、アミノ酸数が２から５０個程度のリンカーを用いることができ、具体的には、グリシン（Ｇ）とセリン（Ｓ）が交互に連結したＧ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカー等が例示されるが、これらに限定されるものではない。本発明の一態様において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、融合タンパク質としてＳＶ４０ ＮＬＳ、ｄＳａＣａｓ９、ＮＬＳ及びＫＲＡＢをコードする配列番号１５１に記載の塩基配列を使用することができる。
（４）ガイドＲＮＡ
本発明において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質のヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域へのリクルートは、ガイドＲＮＡにより達成される。前記「（１）定義」の項に記載の通り、ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含み、該ｃｒＲＮＡはターゲット配列の相補配列に結合する。ガイドＲＮＡが融合タンパク質を標的とする領域へリクルートすることができる限り、ｃｒＲＮＡは、ターゲット配列の相補配列と完全に相補的でなくてもよく、少なくとも１～３個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。
ターゲット配列は、例えば、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣａｓ９を用いる場合、公開されているｇＲＮＡ設計ウェブサイト（CRISPR Design Tool、CRISPR direct等）を用いて設定することが出来る。具体的には、目的遺伝子（即ち、ヒトＤＭＰＫ遺伝子）及びその周辺遺伝子の配列の中から、ＰＡＭ（例えば、ＳａＣａｓ９の場合、ＮＮＧＲＲＴ）が３’側に隣接している約２０ヌクレオチド長の候補ターゲット配列をリストアップし、これらの候補ターゲット配列の中から、ヒトのゲノム中のオフターゲットサイト数が少ないものをターゲット配列として使用することができる。ターゲット配列の塩基長は、１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは１８～２３ヌクレオチド長、より好ましくは１８～２２ヌクレオチド長である。オフターゲットサイト数の予測をする一次スクリーニングとして、多数のバイオインフォマティクスツールが公知且つ公衆に利用可能であり、最もオフターゲット効果が小さいターゲット配列を予測するために使用することができる。Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ（https://benchling.com）やＣＯＳＭＩＤ（CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions and Deletions）（インターネット上のhttps://crispr.bme.gatech.eduで利用可能）等のバイオインフォマティクスツールが例示され、これらによりｇＲＮＡが標的とする塩基配列に対する類似性をまとめることができる。使用するｇＲＮＡ設計ソフトウェアに対象ゲノムのオフターゲットサイトを検索する機能がない場合、例えば、候補ターゲット配列の３’側の８～１２ヌクレオチド（標的ヌクレオチド配列の識別能の高いシード（ｓｅｅｄ）配列）について、対象のゲノムに対してＢｌａｓｔ検索をかけることにより、オフターゲットサイトを検索することができる。
本発明の一態様において、ヒト染色体１９番（Ｃｈｒ１９）のＧＲＣｈ３８．ｐ１２ポジションに存在する領域中、ＤＭＰＫ遺伝子の転写開始点付近の領域：４５，７７７，３４２－４５，７８４，７１５が、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域となり得る。実施例にて示す通り、本発明者らは、上記領域のうち、４５，７７８，８８４－４５，７８３，９８５（図３のゾーン２）の領域を標的とすると、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現を調節し得ることを見出した。よって、本発明の一態様において、ターゲット配列は、ヒト染色体１９番（Ｃｈｒ１９）のＧＲＣｈ３８．ｐ１２ポジションに存在する領域中、以下の領域：４５，７７８，８８４－４５，７８３，９８５にある連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは１８～２３ヌクレオチド長、より好ましくは１８～２２ヌクレオチド長の塩基配列とすることができる。
さらに、本発明者らは、ＤＭＰＫ遺伝子の発現を抑制するためのターゲット配列を設計する領域として、上記領域４５，７７８，８８４－４５，７８３，９８５に存在する配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域が、好適であることを見出した。よって、本発明の一態様において、ターゲット配列は、これら領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは１８～２３ヌクレオチド長、より好ましくは１８～２２ヌクレオチド長の塩基配列とすることができる。各配列のヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域内における位置は、表１及び図１に記載の通りである。
本発明の一態様において、ターゲット配列は、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現を５０％以上抑制できると考えられる、上記領域４５，７７８，８８４－４５，７８３，９８５に存在する配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号６６、配列番号６８、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１３４、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは１８～２３ヌクレオチド長、より好ましくは１８～２２ヌクレオチド長の塩基配列とすることができる。各配列のヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域内における位置は、表１及び図１に記載の通りである。
本発明の別の一態様において、ターゲット配列は、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現を７５％以上抑制できると考えられる、上記領域４５，７７８，８８４－４５，７８３，９８５に存在する配列番号６３、配列番号１３６、配列番号８３、配列番号９９、配列番号１３５、配列番号１０９、又は配列番号１１１で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは１８～２３ヌクレオチド長、より好ましくは１８～２２ヌクレオチド長の塩基配列とすることができる。各配列のヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域内における位置は、表１及び図１に記載の通りである。
本発明のさらに別の態様において、ターゲット配列は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される塩基配列とすることができる。配列番号４３及び４４で表される塩基配列は、配列番号１２７で表される領域中に含まれるターゲット配列である。配列番号６２及び６３で表される塩基配列は、配列番号１２８で表される領域中に含まれるターゲット配列である。配列番号６６～６８で表される塩基配列は、配列番号１２９で表される領域中に含まれるターゲット配列である。配列番号７０～７３で表される塩基配列は、配列番号１３０で表される領域中に含まれるターゲット配列である。配列番号８０～８３で表される塩基配列は、配列番号１３１で表される領域中に含まれるターゲット配列である。配列番号８５及び８６で表される塩基配列は、配列番号１３２で表される領域中に含まれるターゲット配列である。配列番号９５～１００で表される塩基配列は、配列番号１３３で表される領域中に含まれるターゲット配列である。配列番号１０３、１０５及び１０６で表される塩基配列は、配列番号１３４で表される領域中に含まれるターゲット配列である。配列番号１０５及び１０６で表される塩基配列は、配列番号１３５で表される領域中に含まれるターゲット配列である。配列番号７０及び７１で表される塩基配列は、配列番号１３６で表される領域中に含まれるターゲット配列である。配列番号１０３～１１２で表される塩基配列は、配列番号１３７で表される領域中に含まれるターゲット配列である。各配列のヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域内における位置は、表１及び図１に記載の通りである。
本発明の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列は、ターゲット配列と同じ塩基配列であり得る。例えば、配列番号５で表されるターゲット配列（ＣＣＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡ）を、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として細胞に導入した場合、係る配列から転写されるｃｒＲＮＡはＣＣＣＡＧＵＣＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡ（配列番号１４６）となり、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域中に存在する、配列番号５で表される塩基配列の相補配列であるＴＣＴＴＣＴＴＴＧＧＣＣＴＣＧＡＣＴＧＧＧ（配列番号１４７）に結合する。さらに別の態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、ガイドＲＮＡが融合タンパク質を標的とする領域へリクルートすることができる限り、ターゲット配列に対して少なくとも１～３個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を使用することができる。よって、本発明の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、若しくは配列番号１１９で表される塩基配列、又は配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、若しくは配列番号１１９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を使用し得る。本発明の別の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、配列番号６３、配列番号７０、配列番号７１、配列番号８３、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０９、若しくは配列番号１１１で表される塩基配列、又は配列番号６３、配列番号７０、配列番号７１、配列番号８３、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０９、若しくは配列番号１１１で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を使用し得る。本発明のさらなる別の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、配列番号７０、配列番号８１、配列番号８３、若しくは配列番号９９で表される塩基配列、又は配列番号７０、配列番号８１、配列番号８３、若しくは配列番号９９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を使用し得る。本発明の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、配列番号８３で表される塩基配列、又は配列番号８３で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を使用し得る。
本発明の一態様において、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、若しくは配列番号１１９で表される塩基配列、又は配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、若しくは配列番号１１９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として使用して、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、若しくは配列番号１８６で表されるｃｒＲＮＡ、又は配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、若しくは配列番号１８６で表される塩基配列においてそれぞれ１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをそれぞれ産生させることができる。本発明の別の一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、若しくは配列番号１８６で表される塩基配列、又は配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、若しくは配列番号１８６で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含み得る。本発明の一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号１６１、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１７１、配列番号１７７、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８３、若しくは配列番号１８４で表される塩基配列、又は配列番号１６１、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１７１、配列番号１７７、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８３、若しくは配列番号１８４で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含み得る。本発明の別の一態様において、ｇＲＮＡは、配列番号１６４、配列番号１６９、配列番号１７１、若しくは配列番号１７７で表される塩基配列、又は配列番号１６４、配列番号１６９、配列番号１７１、若しくは配列番号１７７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含み得る。本発明のさらなる態様において、ｇＲＮＡは、配列番号１７１で表される塩基配列、又は配列番号１７１で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含み得る。
ｇＲＮＡをコードする塩基配列は、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣｐｆ１を用いる場合、５’末端に特定のＲＮＡを付したｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列として設計することができる。このようなｃｒＲＮＡの５’末端に付するＲＮＡ及び該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、使用するｄＣｐｆ１に応じて当業者に適宜選択され得、例えば、ｄＦｎＣｐｆ１を用いる場合、ｇＲＮＡをコードする塩基配列としては、ターゲット配列の５’側に配列番号１４８；ＡＡＴＴＴＣＴＡＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴを付した塩基配列を用いることができる（ＲＮＡに転写されると、下線部分の配列同士が塩基対を形成しステム－ループ構造をとる）。このような５’末端に付する配列は、転写後にｇＲＮＡが融合タンパク質を発現制御領域へリクルートすることができる限り、各種のＣｐｆ１タンパク質に対して一般的に使用される配列に対して少なくとも１～６個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。
また、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣａｓ９を用いる場合、ｇＲＮＡをコードする塩基配列は、ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の３’末端に既知のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列として設計することが出来る。このようなｔｒａｃｒＲＮＡ及び該ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、使用するｄＣａｓ９に応じて当業者に適宜選択され得、例えば、ｄＳａＣａｓ９を用いる場合、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列として、配列番号１４９で表される塩基配列が使用される。ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、転写後にｇＲＮＡが融合タンパク質を発現制御領域へリクルートすることができる限り、各種のＣａｓ９タンパク質に対して一般的に使用されるｔｒａｃｒＲＮＡをコードする塩基配列に対して少なくとも１～６個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。
このように設計されたｇＲＮＡをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成方法を用いて、化学的に合成することができる。
本発明の別の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域中に存在する配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１１７又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするｇＲＮＡをそれぞれコードする、少なくとも２つの異なる塩基配列を含んでいてもよい。例えばそのようなポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡをそれぞれコードする少なくとも２つの異なる塩基配列を含み得、ここで、少なくとも２つの異なる塩基配列は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７若しくは配列番号１１９で表される塩基配列、又は配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７若しくは配列番号１１９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む塩基配列から選択される。本発明の一態様において、そのようなポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡをそれぞれコードする少なくとも２つの異なる塩基配列を含み得、ここで、少なくとも２つの異なる塩基配列は、配列番号６３、配列番号７０、配列番号７１、配列番号８３、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０９、若しくは配列番号１１１、又は配列番号６３、配列番号７０、配列番号７１、配列番号８３、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０９、若しくは配列番号１１１で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む塩基配列から選択される。本発明の一態様において、そのようなポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡをそれぞれコードする少なくとも２つの異なる塩基配列を含み得、ここで、少なくとも２つの異なる塩基配列は、配列番号７０、配列番号８１、配列番号８３、若しくは配列番号９９、又は配列番号７０、配列番号８１、配列番号８３、若しくは配列番号９９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む塩基配列から選択される。
（５）プロモーター配列
本発明の一態様において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列及び／又はｇＲＮＡをコードする塩基配列のそれぞれの上流部分に、プロモーター配列が作動可能に連結されていてもよい。連結され得るプロモーターとしては、対象の細胞内においてプロモーター活性を示すものであれば特に限定されない。例えば、ｇＲＮＡをコードする塩基配列の上流に連結され得るプロモーター配列としては、ｐｏｌ ＩＩＩ系のプロモーターである、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、Ｈ１プロモーター、及びｔＲＮＡプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一態様において、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列の為のプロモーター配列として、Ｕ６プロモーターが使用される。本発明の一態様において、ポリヌクレオチドがそれぞれガイドＲＮＡをコードする２以上の塩基配列を含む場合、２以上の塩基配列の上流に１つのプロモーター配列が作動可能に連結していてもよい。本発明の別の態様において、ポリヌクレオチドがそれぞれガイドＲＮＡをコードする２以上の塩基配列を含む場合、２以上の塩基配列のそれぞれの上流にプロモーター配列が作動可能に連結していてもよく、それぞれの塩基配列に作動可能に連結しているプロモーターは同一であっても異なっていてもよい。
融合タンパク質をコードする塩基配列の上流に連結され得る前記プロモーター配列としては、ユビキタスなプロモーター又は筋特異的プロモーターを使用してもよい。例えば、ユビキタスなプロモーターとしては、ＥＦ－１αプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＡＧプロモーター、及びＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一態様において、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター又はＣＡＧプロモーターがユビキタスなプロモーターとして使用され得る。筋特異的プロモーターとしては、例えば、ＣＫ８プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＣＫ９プロモーター、心筋トロポニンＣプロモーター、α－アクチンプロモーター、ミオシン重鎖キナーゼ（ＭＨＣＫ）プロモーター（例えばＭＨＣＫ７プロモーター等）、ＭＨＣプロモーター、ミオシン軽鎖２Ａプロモーター、ジストロフィンプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、ｅｎｈ３４８ＭＣＫプロモーター、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ５－１２（Ｓｙｎ）プロモーター、Ｍｙｆ５プロモーター、ＭＬＣ１／３ｆプロモーター、ＭＬＣ－２プロモーター、ＭＹＯＤプロモーター、Ｍｙｏｇプロモーター、Ｐａｘ７プロモーター、Ｄｅｓプロモーター、ｃＴｎＣプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない（筋特異的プロモーターの詳細は米国特許出願公開第２０１１／０２１２５２９号明細書、McCarthy JJ et al.,Skeletal Muscle.2012 May;2(1):8;及びWang B.et al., Gene Ther.2008 Nov;15(22):1489-99等を参照のこと。その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。本発明の一態様において、ＣＫ８プロモーター、ミオシン重鎖キナーゼ（ＭＨＣＫ）プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ５－１２（Ｓｙｎ）プロモーター、又はＤｅｓプロモーターが筋特異的プロモーターとして使用され得る。本発明の一態様において、ＣＫ８プロモーターが筋特的プロモーターとして使用され得る。上述のプロモーターは、対象の細胞内においてプロモーター活性を有する限り、あらゆる修飾及び／又は改変が加えられていてもよい。
本発明の一態様において、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列としてＵ６プロモーターを用いることができ、融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列としてＣＫ８プロモーターを用いることができる。具体的には、Ｕ６プロモーターについては、以下の塩基配列を用いることができる；（ｉ）配列番号１５５で表される塩基配列、（ｉｉ）配列番号１５５で表される塩基配列において１又は数個（例えば、２、３、４、５又はそれ以上）の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された、標的となる細胞中でのプロモーター活性を有する塩基配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１５５で表される塩基配列に９０％以上（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）同一である、標的となる細胞中でのプロモーター活性を示す塩基配列。ＣＫ８プロモーターについては、以下の塩基配列を用いることができる；（ｉ）配列番号１８７で表される塩基配列、（ｉｉ）配列番号１８７で表される塩基配列において１又は数個（例えば、２、３、４、５又はそれ以上）の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された、標的となる細胞中でのプロモーター活性を有する塩基配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１８７で表される塩基配列に９０％以上（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）同一である、標的となる細胞中でのプロモーター活性を示す塩基配列。
（６）その他の塩基配列
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列が転写されて生じるｍＲＮＡの翻訳効率を向上させる目的で、ポリアデニル化（ポリＡ（ｐｏｌｙＡ））シグナル、コザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列等の公知の配列をさらに含んでもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、リンカー配列をコードする塩基配列、ＮＬＳをコードする塩基配列、及び／又はタグをコードする塩基配列を含んでもよい。
（７）本発明の例示的な態様
本発明の一態様では、以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列、
１又は２の、それぞれガイドＲＮＡをコードする塩基配列（ここで、１又は２の塩基配列は、配列番号６３、配列番号７０、配列番号７１、配列番号８３、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０９、若しくは配列番号１１１で表される配列を含む塩基配列、又は配列番号６３、配列番号７０、配列番号７１、配列番号８３、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０９、若しくは配列番号１１１で表される配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された配列を含む塩基配列から選択される）、及び
ｇＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列、
ここで、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はｄＳａＣａｓ９又はｄＳａＣａｓ９［－２５］であり、
ここで、転写抑制因子は、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＭＢＤ２Ｂ、ＮＩＰＰ１、及びＨＰ１Ａから選択され、
ここで、融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列は、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＫ８プロモーター、ミオシン重鎖キナーゼ（ＭＨＣＫ）プロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ５－１２（Ｓｙｎ）プロモーター、及びＤｅｓプロモーターからなる群より選択され、そして、
ｇＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列は、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される。
本発明の一態様では、以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するＣＫ８プロモーター、
１又は２の、それぞれガイドＲＮＡをコードする塩基配列（ここで、１又は２の塩基配列は、配列番号７０、配列番号８１、配列番号８３、若しくは配列番号９９で表される配列を含む塩基配列、又は配列番号７０、配列番号８１、配列番号８３、若しくは配列番号９９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された配列を含む塩基配列から選択される）、及び
ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するＵ６プロモーター、
ここで、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はｄＳａＣａｓ９であり、
ここで、転写抑制因子はＫＲＡＢである。
本発明の一態様では、以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するＣＫ８プロモーター、
配列番号８３で表される塩基配列、又は配列番号８３において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含むガイドＲＮＡをコードする塩基配列、及び
ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するＵ６プロモーター、
ここで、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はｄＳａＣａｓ９であり、
ここで、転写抑制因子はＫＲＡＢである。
本発明のポリヌクレオチドの一態様では、ポリヌクレオチドは、５’末端から順に、（ｉ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、及び（ｉｉ）ｇＲＮＡをコードする塩基配列を含む。別の態様では、ポリヌクレオチドは、５’末端から順に、（ｉｉ）ｇＲＮＡをコードする塩基配列、及び（ｉ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列を含む。
２．ベクター
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター（以下、「本発明のベクター」と称することがある）を提供する。本発明のベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり得る。
本発明のベクターがプラスミドベクターである場合、使用されるプラスミドベクターとしては、特に限定されず、クローニングプラスミドベクターや発現プラスミドベクター等のあらゆるプラスミドベクターであってよい。当該プラスミドベクターは、公知の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドをプラスミドベクターに挿入することにより調製される。
また、本発明のベクターがウイルスベクターである場合、使用されるウイルスベクターとしては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において「ウイルスベクター（virus vector）」又は「ウイルスベクター（viral vector）」には、その派生物も含まれる。遺伝子治療における利用を考慮すれば、導入遺伝子を長期にわたり発現させられる点や非病原性ウイルス由来で安全性が高い等の理由から、ＡＡＶベクターが好適に用いられる。
本発明のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、公知の方法により調製することができる。簡潔には、本発明のポリヌクレオチドを挿入したウイルス発現用プラスミドベクターを調製し、これを適切な宿主細胞にトランスフェクトし、本発明のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを一過性に産生させ、該ウイルスベクターを回収する。
本発明の一態様において、ＡＡＶベクターを用いる場合、ＡＡＶベクターの血清型としては、対象においてヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現を抑制できる限り特に限定されず、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ．１０等のいずれを用いてもよい（ＡＡＶの多様な血清型に関しては、例えばＷＯ２００５／０３３３２１及びＥＰ２３４１０６８（Ａ１）を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。本発明の別の態様において、サルから単離されたＡＡＶ（例えば、ＡＡＶｒｈ７４(Mol Ther. 2017 Apr 5; 25(4): 855-869等を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる)、ブタから単離されたＡＡＶ（例えば、ＡＡＶｐｏ１(例えば、Gene Ther. 2009 Nov; 16(11): 1320-8を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる)、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９の祖先と予測されるＡｎｃ ８０（Cell Rep. 2015 Aug 11; 12(6):1056-68を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）等を、対象においてヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現を抑制できる限り用いることができる。尚、ＡＡＶのバリアントとしては、例えば、キャプシド改変した新規血清型（例えば、ＷＯ２０１２／０５７３６３、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）等が挙げられるが、これに限定されない。例えば、本発明の一態様では、ＡＡＶ５８７ＭＴＰ、ＡＡＶ５８８ＭＴＰ、ＡＡＶ－Ｂ１、ＡＡＶＭ４１等、筋肉細胞への感染性が向上しているキャプシド改変された新規血清型を用いることができる（Yu et al., Gene Ther. 2009 Aug;16(8):953-62, Choudhury et al., Mol Ther. 2016 Aug;24(7):1247-57, Yang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Mar 10;106(10):3946-51を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる)。
ＡＡＶベクターを調製する場合、（１）プラスミドを用いる方法、（２）バキュロウイルスを用いる方法、（３）単純ヘルペスウイルスを用いる方法、（４）アデノウイルスを用いる方法、（５）酵母を用いる方法など、公知の方法を用いることができる（例えば、Appl Microbiol Biotechnol. 2018; 102(3): 1045-1054等、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、プラスミドを用いてＡＡＶベクターを調製する場合、まず、野生型のＡＡＶのゲノム配列のうち両端の末端逆位配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ(ＩＴＲ)）と、Ｒｅｐタンパク質及びキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡの代わりに挿入された、本発明のポリヌクレオチドとを含むベクタープラスミドを作製する。一方で、ウイルス粒子の形成に必要とされるＲｅｐタンパク質及びキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡは、別のプラスミドに挿入する。さらに、ＡＡＶの増殖に必要なアデノウイルスのヘルパー作用を担う遺伝子（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、ＶＡ、及びＥ４ｏｒｆ６）を含むプラスミドを、アデノウイルスヘルパープラスミドとして作製する。これら３種のプラスミドを、宿主細胞にコトランスフェクションすることにより、該細胞内において組換えＡＡＶ（即ち、ＡＡＶベクター）が産生されるようになる。宿主細胞としては、前記ヘルパー作用を担う遺伝子の遺伝子産物（タンパク質）のうちの一部を供給し得る細胞（例えば、２９３細胞等）を用いることが好ましく、そのような細胞を用いる場合には、該宿主細胞より供給され得るタンパク質をコードする遺伝子を、前記アデノウイルスヘルパープラスミドに搭載する必要がない。産生されたＡＡＶベクターは培養培地及び／又は細胞内に存在する。よって、宿主細胞を凍結融解などで破壊した後の培養培地からウイルスを回収し、そのウイルス画分を塩化セシウムを用いた密度勾配超遠心法やカラム法等で分離精製を行うことにより、所望のＡＡＶベクターを調製する。
ＡＡＶベクターは、安全性や遺伝子導入効率等の点から大きな利点があり、遺伝子治療に利用されている。しかしながら、ＡＡＶベクターに搭載可能なポリヌクレオチドのサイズに制限があることが知られている。例えば、本発明の一態様では、ｄＳａＣａｓ９とＫＲＡＢとの融合タンパク質をコードする塩基配列、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域を標的とするｇＲＮＡをコードする塩基配列、並びにプロモーター配列としてＣＫ８プロモーター及びＵ６プロモーター配列を含むポリヌクレオチドの塩基長と、ＩＴＲ部とを含む全長は、約４.９ｋｂであるので、単一のＡＡＶベクターに搭載することが出来る。
３．ＤＭ１を治療又は予防するための医薬組成物
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを含む、医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」と称することがある）を提供する。本発明の医薬組成物は、ＤＭ１の治療や予防に用いることができる。
本発明の医薬組成物は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを有効成分として含み、かかる有効成分（即ち、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクター）と、通常、医薬的に許容される担体を含む製剤として調製され得る。
一態様において、本発明の医薬組成物は、非経口に投与され、また局所的又は全身的に投与され得る。本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、又は筋肉内投与することができる。
本発明の医薬組成物の対象への投与量は、治療及び／又は予防有効量である限り特に限定されない。有効成分、剤形、対象の年齢及び体重、投与スケジュール、並びに投与方法等に応じて適宜最適化すればよい。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物は、ＤＭ１に罹患している対象だけでなく、遺伝的バックグラウンド解析等に基づき、将来的にＤＭ１を発症する可能性のある対象に対して予防的に投与することもできる。本明細書における「治療」との用語には、疾患の治癒に加えて、疾患の寛解も含まれる。また、「予防」との用語には、疾患の発症を防ぐことに加えて、疾患の発症を遅らせることも含まれ得る。また、本発明の医薬組成物は、「本発明の剤」等とも言い換えることができる。
４．ＤＭ１の治療又は予防方法
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、ＤＭ１の治療又は予防方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。また、本発明には、ＤＭ１の治療又は予防に使用するための、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターが含まれる。さらに、本発明には、ＤＭ１の治療又は予防用医薬組成物の製造における、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターの使用が含まれる。
本発明の方法は、上述した本発明の医薬組成物をＤＭ１を罹患する対象に投与することにより実施することができ、その投与量、投与経路、対象等は上記したものと同一である。
症状の測定は本発明の方法を用いた治療の開始前に行ってよく、また、治療に対する対象の応答を判定するための治療後の任意のタイミングでおこなってよい。
本発明の方法により、限定するものではないが、骨格筋及び／又は心筋の機能等のＤＭ１の任意の症状が改善され得る。機能が改善される筋肉又は組織としては、特に限定はなく、あらゆる筋肉や組織、及び筋肉群が例示される。
５．リボヌクレオプロテイン
本発明は、以下を含む、リボヌクレオプロテイン（以下、「本発明のＲＮＰ」と称することがある。）を提供する：
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ。
本発明のＲＮＰに含まれるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写抑制因子、及びガイドＲＮＡとしては、上記「１．ポリヌクレオチド」の項目において詳細に説明される、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写抑制因子、及びガイドＲＮＡを使用することができる。本発明のＲＮＰに含まれるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞や細菌、その他の生物体に導入して発現させることにより、あるいは該ポリヌクレオチドを用いて、インビトロ翻訳システムにより作製することができる。また、本発明のＲＮＰに含まれるガイドＲＮＡは、例えば、化学的に合成するか、あるいはガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを用いて、インビトロ翻訳システムを用いて作製することができる。このようにして作製された融合タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合することで、本発明のＲＮＰを調製することができる。必要に応じて、金粒子などの他の物質を混合してもよい。本発明のＲＮＰを標的細胞や組織等に直接送達するために、公知の方法により、該ＲＮＰは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化してもよいし、あるいは細胞外ベシクル中にロードさせてもよい。本発明のＲＮＰは、公知の方法により、標的細胞や組織等に導入することができる。ＬＮＰへのカプセル化や導入方法については、例えばLee K., et al., Nat Biomed Eng. 2017; 1:889-901, ＷＯ２０１６／１５３０１２等（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）を参酌することができる。
本発明の一態様において、本発明のＲＮＰに含まれるガイドＲＮＡは、ヒト染色体１９番（Ｃｈｒ１９）のＧＲＣｈ３８．ｐ１２ポジションに存在する以下の領域４５，７７８，８８４－４５，７８３，９８５にある連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは１８～２３ヌクレオチド長、より好ましくは１８～２２ヌクレオチド長を標的とする。
１つの態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは１８～２３ヌクレオチド長、より好ましくは１８～２２ヌクレオチド長の塩基配列を標的とする。別の態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号６６、配列番号６８、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１３４、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは１８～２３ヌクレオチド長、より好ましくは１８～２２ヌクレオチド長の塩基配列を標的とする。本発明のさらに別の態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号６３、配列番号１３６、配列番号８３、配列番号９９、配列番号１３５、配列番号１０９、又は配列番号１１１で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは１８～２３ヌクレオチド長、より好ましくは１８～２２ヌクレオチド長の塩基配列を標的とする。さらに別の実施態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、若しくは配列番号１１９で表される配列の全部又は一部を含む領域を標的とする。本発明の別の態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号６３、配列番号７０、配列番号７１、配列番号８３、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０９、若しくは配列番号１１１で表される配列の全部又は一部を含む領域を標的とする。本発明のさらなる別の態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号７０、配列番号８１、配列番号８３、若しくは配列番号９９で表される配列の全部又は一部を含む領域を標的とする。本発明の一態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号８３で表される配列の全部又は一部を含む領域を標的とする。
本発明の一態様において、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、若しくは配列番号１８６で表される塩基配列、又は配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、若しくは配列番号１８６で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含むガイドＲＮＡを使用することができる。本発明の一態様において、配列番号１６１、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１７１、配列番号１７７、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８３、若しくは配列番号１８４で表される塩基配列、又は配列番号１６１、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１７１、配列番号１７７、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８３、若しくは配列番号１８４で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含むガイドＲＮＡを使用することができる。本発明の別の一態様において、配列番号１６４、配列番号１６９、配列番号１７１、若しくは配列番号１７７で表される塩基配列、又は配列番号１６４、配列番号１６９、配列番号１７１、若しくは配列番号１７７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含むガイドＲＮＡを使用することができる。本発明のさらなる別の一態様において、配列番号１７１で表される塩基配列、又は配列番号１７１で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含むガイドＲＮＡを使用することができる。
６．その他
本発明はまた、以下を含む、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現を抑制するための組成物又はキットを提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１１７、若しくは配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
本発明はまた、以下の（ｅ）及び（ｆ）を投与することを含む、筋強直性ジストロフィー１型の治療又は予防方法を提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１１７、若しくは配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
本発明はまた、ＤＭ１の治療又は予防用医薬組成物の製造における、以下（ｅ）及び（ｆ）の使用を提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域における、配列番号１２７、配列番号４６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号８８、配列番号９１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１１７、若しくは配列番号１１９で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
これらの発明で使用されるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写抑制因子、ガイドＲＮＡ、並びにこれらをコードするポリヌクレオチド及びそれらが搭載されるベクターとしては、上記「１．ポリヌクレオチド」、「２．ベクター」や「５．リボヌクレオプロテイン」の項目において詳細に説明されるものが使用できる。上記（ｅ）及び（ｆ）の投与量、投与経路、対象、製剤等は「３．ＤＭ１を治療又は予防するための医薬組成物」の項目において説明したものと同様である。
本発明の他の特徴は、本発明の説明のために与えられた以下の例示的な態様の記載によって明らかになるであろうが、それらに限定されることを意図するものではない。
実施例１ ｉＣＭ及びｉＤＭ細胞を用いたヒトＤＭＰＫ遺伝子に対するｇＲＮＡのスクリーニング
（１）実験方法
ＤＭＰＫターゲット配列の選択
ヒトＤＭＰＫ遺伝子（Ｃｈｒ１９：ＧＲＣｈ３８．ｐ１２；４５，７７７，３４２－４５，７８４，７１５）のプロモーター領域周辺の約７．４ｋｂの配列をスキャンし、ｇＲＮＡ（本明細書でターゲット配列として定義されている）と複合体を形成したヌクレアーゼ欠損ＳａＣａｓ９（Ｄ１０Ａ及びＮ５８０Ａ変異体；ｄＳａＣａｓ９（配列番号１３９））によって標的化され得る配列を探した。ターゲット配列は、まず、配列ＮＮＧＲＲＴを有するＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）に隣接する１９－２１ヌクレオチドセグメント（５’－１９－２１ヌクレオチドターゲット配列－ＮＮＧＲＲＴ－３’）で特定し、次いでカニクイザル（Macaca fascicularis）ゲノムの対応する領域と完全に一致するもの（ターゲット配列とＰＡＭ配列）だけを含めるようにフィルタリングした（表１では「ＴＲＵＥ」と記載）。また、ＥＮＣＯＤＥプロジェクトによってキュレートされたＤＮａｓｅ－Ｓｅｑ実験において高いＤＮａｓｅ感受性を示す領域にＲＮＰを誘導する２１ヌクレオチドのターゲット配列を、追加で選択した(The ENCODE Project Consortium, Nature. 2012 Sep 6; 489(7414): 57-74; https://www.encodeproject.org)。
レンチウイルストランスファープラスミド（ｐＥＤ１６２）の構築
ｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社（https://www.genscript.com）から購入し、以下の変更を加えた：ＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列をＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列（配列番号１５０）に置き換え、ＳｐＣａｓ９を、２つのＮＬＳがｄＳａＣａｓ９を挟むＫｒｕｐｐｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｏｘ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ（ＫＲＡＢ）に融合したｄＳａＣａｓ９に置き換え（ＳＶ４０ ＮＬＳ－ｄＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－ＫＲＡＢ［配列番号１５１（ＤＮＡ）及び１５２（タンパク質）］）、そしてｐｕｒｏＲカセットをｂｌａｓｔＲカセットで置き換えた［（配列番号１５３（ＤＮＡ）及び配列番号１５４（タンパク質）］。ｄＳａＣａｓ９には、核にエフェクター分子を効率的に局在させるために、２つの核局在シグナル（ＮＬＳ）を、Ｎ末端（配列番号１８８で示すアミノ酸配列、配列番号１８９で示すＤＮＡ配列）とＣ末端（配列番号１９０で示すアミノ酸配列、配列番号１９１で示すＤＮＡ配列）に付加した。ＫＲＡＢはプロモーターに局在すると、転写を阻害することで遺伝子発現を抑制することができる（Gilbert LA, et al., Cell, 2013 Jul 18; 154(2):442-51）。ＫＲＡＢはｄＳａＣａｓ９（Ｄ１０Ａ及びＮ５８０Ａ変異体）のＣ末端に結合され（以下、ｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢと称する）、ターゲット配列によって導かれ（directed）、ヒトＤＭＰＫプロモーター領域にターゲティングされる（図１）。調製したプラスミドをｐＥＤ１６２と命名した。
ｇＲＮＡクローニング
３つのコントロールノンターゲット配列（表１、配列番号１～３）と１２３のターゲット配列（表１、配列番号４～１２６）をｐＥＤ１６２にクローニングした。フォワード及びリバースオリゴは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により以下のフォーマットで合成された；フォワード；５’ＣＡＣＣ（Ｇ）－１９～２１塩基対ターゲット配列－３’、及びリバース；５’ＡＡＡＣ－１９～２１塩基対の逆相補ターゲット配列－（Ｃ）－３’。ターゲットがＧで始まらない場合は括弧内の塩基が追加された。オリゴはトリス－ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に１００μＭで再懸濁した。各相補オリゴ１．５μｌをＮＥ Ｂｕｆｆｅｒ ３．１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ （ＮＥＢ） ＃Ｂ７２０３Ｓ）で５０μｌの反応液（reaction）に添加した（combined）。１ＬのＨ２Ｏ中、この反応液を９５℃まで加熱し、次いで２５℃まで冷却することで、ｐＥＤ１６２へのクローニングに適合する粘着末端オーバーハングを持つオリゴをアニーリングした。アニーリングしたオリゴを、ＢｓｍＢＩで切断してゲル精製したレンチウイルストランスファープラスミドｐＥＤ１６２とあわせ、製造元のプロトコールに従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０２Ｓ）でライゲーションした。２μｌのライゲーション反応液で、製造元のプロトコールに従って、ＮＥＢ（登録商標） Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（ＮＥＢ ＃Ｃ３０４０Ｉ）を形質転換した。このようにして得られたコンストラクトは、個々のターゲット配列がコードするｃｒＲＮＡを含み、その３’末端にＵ６ポリメラーゼの終止シグナルＴＴＴＴＴＴが付加されたＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列からコードされるｔｒａｃｒＲＮＡ（ＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＡＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵＵＵ（配列番号１５６））が融合しているｓｇＲＮＡの発現を、Ｕ６プロモーター（配列番号１５５）によって駆動する。
レンチウイルス調製
Ｌｅｎｔｉ－Ｐａｃ ２９３Ｔａ細胞株（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ ＃ＬＴ００８）を６ウェル細胞培養皿（ＶＷＲ ＃１００６２－８９２）に０．８－１．０ｘ１０６細胞／ウェルで播種し、２ｍｌの増殖培地（１０％ＦＢＳと２ｍＭの新鮮なＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及びＭＥＭ非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃１１１４００５０））中で、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間培養した。翌日、１．５μｇのパッケージングプラスミドミックス［１μｇのパッケージングプラスミド（ｐＣＭＶ ｄｅｌｔａ Ｒ８．２； ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド ＃１２２６３）と０．５μｇのエンベロープ発現プラスミド（ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ； ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド ＃８４５４）］、及びｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢと示されたｓｇＲＮＡをコードする配列を含む１μｇのトランスファープラスミドｐＥＤ１６２を用いて、ＴｒａｎｓＩＴ－ＶｉｒｕｓＧＥＮ（登録商標）トランスフェクション反応（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＃ＭＩＲ６７００）を製造元のプロトコールに従ってセットアップした。トランスフェクションから４８時間後に、０．４５μｍのＰＥＳフィルター（ＶＷＲ ＃１０２１８－４８８）に培地の上清を通すことにより、レンチウイルスを回収した。
ｉＣＭ及びｉＤＭ細胞への遺伝子導入
不死化非ＤＭコントロール（Ｃｔｒｌ）筋芽細胞（ｉＣＭと称する）及び不死化ＤＭ１筋芽細胞（ｉＤＭと称する）は、これらの細胞株をDis Model Mech. 2017 Apr 1; 10(4):487-497に記載の方法（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）で樹立したＩｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｍｙｏｌｏｇｉｅから入手した。遺伝子導入にあたっては、細胞を、１２ウェル細胞培養皿（ＶＷＲ＃１００６２－８９４）において、増殖培地［ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔ；ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ：Ｃ－２３１６０（注：培地は、キットの指示通りの５％ではなく、２０％ＦＢＳと３０μｇ／ｍｌゲンタマイシンＳを添加した）］を含む１ｍｌの培地中に０．０５×１０６細胞／ウェルで播種し、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間培養した。翌日、培地を１０μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ ＃ＴＲ－１００３－Ｇ）を添加した１ｍｌの増殖培地に交換し、ｔｒａｃｒＲＮＡと融合した個々のターゲット配列（表１）にコードされたｃｒＲＮＡを含む各ｓｇＲＮＡに対応する０．３ｍｌレンチウイルス上清（上記参照）を各ウェルに添加した。細胞をレンチウイルスとともに４８時間インキュベートした後、ウイルス培地を除去し、選択培地［１０μｇ／ｍｌブラストサイジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃Ａ１１１３９０３）を添加した増殖培地］に置き換えた。選択培地で４８時間培養した後、細胞の１／３を、増殖培地中で新しいウェル（１２ウェルプレートのもの）に移した。細胞を播種し、２４時間後、増殖培地を選択培地に交換した。選択培地で４８時間培養後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）９６ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＃７４１８２）を用いて製造元の指示通りにＲＮＡを抽出した。
遺伝子発現解析
遺伝子発現解析のために、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃４３６８８１３）のプロトコールに従って、約０．２μｇの全ＲＮＡから２０μｌの容量でｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡを１０倍に希釈し、ＴａｑｍａｎＴＭ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃４４４４５５７）を用いて製造元のプロトコールに従って解析した。Ｔａｑｍａｎプローブ（ＤＭＰＫ： Ａｓｓａｙ Ｉｄ Ｈｓ０１０９４３３６＿ｍ１ ＦＡＭ； ＨＰＲＴ： Ａｓｓａｙ Ｉｄ Ｈｓ９９９９９９０９＿ｍ１ ＶＩＣ＿ＰＬ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社から入手した。Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘのプロトコールに従って、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムでＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ－ｂａｓｅｄ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ反応を進め解析した。
データ解析
各サンプルと３つのコントロールについて、３回の技術的反復実験から得られたＤＭＰＫプローブのＣｔ値の平均値からＨＰＲＴプローブの平均値を差し引くことにより、ｄｅｌｔａＣｔ値を算出した（平均Ｃｔ ＤＭＰＫ－平均Ｃｔ ＨＰＲＴ）。発現値（expression value）は、各サンプルについて、２－（ｄｅｌｔａＣｔ）の式を用いて求めた。次に、サンプルの発現値（表１；配列番号４～１２６）を、各実験について３つのコントロールの発現値（表１；配列番号１～３）の平均値で標準化し、各サンプルの相対的なＤＭＰＫ発現量を求めた。各細胞株から２つの生物学的反復実験を分析し、すべての実験の平均値を算出した（表１）。
（２）結果
ＲＮＰによるＤＭＰＫ遺伝子発現の抑制
ｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢの発現カセットと各ターゲット配列のｓｇＲＮＡを、ｉＣＭ及びｉＤＭ細胞に送達させるレンチウイルスを作製した。遺伝子導入された細胞は、ブラストサイジンに対する耐性で選択され、Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙを用いてＤＭＰＫの発現量を定量した（表１）。各サンプルの発現値を、コントロールのｓｇＲＮＡを導入した細胞のＤＭＰＫ発現量の平均値で標準化した（表１、配列番号１、２及び３）。ｉＣＭ及びｉＤＭ細胞株の２回の実験で平均発現値を測定した（表１；全ＤＭＰＫ平均、図２）。
表１ ＤＭＰＫ遺伝子の発現制御領域のスクリーニングに使用されたターゲット配列
Figure 0007565620000005
表１において、「座標」は、配列番号４～１２６で表される各配列の５’末端の座標を示している。
３０個のターゲット配列が５０％以上のＤＭＰＫ発現の減少を示し（配列番号４３、４４、４６、６２、６３、６６、６８、７０、７１、７２、７３、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８８、９１、９６、９９、１００、１０３、１０５、１０６、１０８、１０９、１１１、１１７及び１１９）、９個のターゲット配列が７５％以上のＤＭＰＫ発現の減少を示し（配列番号６３、７０、７１、８３、９９、１０５、１０６、１０９及び１１１）、そして１つのターゲット配列が、８０％以上のＤＭＰＫ発現の減少を示した（配列番号１０９）。
ＤＭＰＫの発現を抑制する上記のシステムの可能性に基づき、ゾーンを特定し、特徴を明らかにした。ゾーン１（図３：Ｃｈｒ１９：ＧＲＣｈ３８．ｐ１２；４５，７７７，３４２－４５，７７８，８８４）では、ターゲット配列がＤＭＰＫの発現を調節するのに有効でないことがわかった。しかしながら、ゾーン２（図３：ＧＲＣｈ３８．ｐ１２；４５，７７８，８８４－４５，７８３，９８５）ターゲティングでは、ｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢはＤＭＰＫ発現を抑制することができた。予想通り、この領域はＤＭＰＫプロモーターと転写開始部位を包含しており、この領域を標的とすることがＤＭＰＫの発現に最も大きな影響を及ぼすことが示唆された。最後に、ゾーン３（図３；Ｃｈｒ１９：ＧＲＣｈ３８．ｐ１２；４５，７８３，９８５－４５，７８４，７１５）はＤＭＰＫ発現への影響が少なく、ＤＭＰＫプロモーター領域からより離れている。
実施例２ アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）製造
（１）実験方法
ｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢ：ｇＲＮＡの送達及び発現の為のプラスミドの構築とＡＡＶの調製
ｐＡＡＶ－ＣＭＶをＴａｋａｒａ（＃６２３０）から購入し、ＥＦＳプロモーター配列（配列番号２０４）及び末端終止コドンを付加したＳＶ４０ ＮＬＳ－ｄＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－ＫＲＡＢ（配列番号１５１）［配列番号２００（ＤＮＡ）及び配列番号１５２（タンパク質）］をｐＥＤ１６２からサブクローニングした（実施例１参照）。ベータグロビンポリＡ配列（配列番号２０１）、Ｕ６プロモーター配列（配列番号２０２）及びＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列（配列番号１５０）をｐＥＤ０００１（配列番号２０３）からサブクローニングし、このようにしてＩＴＲ間のｐＡＡＶ－ＣＭＶの全ての機能的成分（すなわちＣＭＶプロモーター、ベータグロビンイントロン、ＭＣＳ及びｈＧＨポリＡ）をコードする配列を置き換えた。最後に、制限クローニング（ＸｈｏＩ及びＡｇｅＩ）により、ＥＦＳプロモーターをＣＫ８プロモーター（配列番号１８７）に置換し、プラスミドｐＥＤ１４８を得た。ｐＥＤ１４８をＢｓａＩで切断することにより、配列番号８３、７０、８１、又は９９で表されるターゲット配列をクローニングし、アニーリングした合成オリゴに適合するオーバーハングを生成した。フォワードプライマーは５’末端にＣＡＣＣ（Ｇ）配列を持ち［５’ＣＡＣＣ－（Ｇ）－ターゲット配列－３’］、リバースプライマーは５’末端にさらにＡＡＡＣ配列を含むように［５’ＡＡＡＣ－リバース相補ターゲット配列－（Ｃ）－３’］、合成オリゴを設計した。Ｕ６プロモーターからの発現を高めるために、ターゲット配列の先頭にさらにＧを追加した。調製したプラスミドを、それぞれｐＥＤ１４８－ｈ６９５（配列番号８３で表されるターゲット配列を含む）、ｐＥＤ１４８－ｈ２４５（配列番号７０で表されるターゲット配列を含む）、ｐＥＤ１４８－ｈ２５７（配列番号８１で表されるターゲット配列を含む）、及びｐＥＤ１４８－ｈ２６９（配列番号９９で表されるターゲット配列を含む）と命名した。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生
アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）粒子は、Ｈｙｐｅｒｆｌａｓｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃１００３０）あたり０．８６×１０７細胞の密度で播種し、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ５７９６）で培養した２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ－３２１６）を用いて調製した。播種４日後、培地を２％ＦＢＳと６３ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ ＃１５６３０－０８０）を添加したＤＭＥＭ培地に変更した。ｐＲＣ９プラスミドは以下のように構築した：ＡＡＶ９のキャプシド配列（ＪＰ５０５４９７５Ｂを参照）を、ＡＡＶ２のキャプシド配列に置き換えてｐＲＣ２－ｍｉ３４２ベクター（Ｔａｋａｒａ ＃６２３０）にサブクローニングした。細胞に、Ｈｙｐｅｒｆｌａｓｋあたり、ｐＲＣ９プラスミド（１３５μｇ）、ＡＡＶｐｒｏ（登録商標）Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ ＃６２３０）に含まれるｐＨｅｌｐｅｒベクター（１２１μｇ）、及びｐＥＤ１４８－ｈ６９５の１つ（１３３μｇ）を、ＰＥＩｐｒｏ（登録商標） ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ＃１１５－０１０）（３８８μｌ）を用いてトランスフェクトした。３日後、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００をＨｙｐｅｒｆｌａｓｋに加え、細胞を回収した。
回収後、その上清と細胞ライセートをカートリッジフィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃ＫＧＦ－Ａ－０５０６ＧＧ，ＫＭＰ－ＤＣ９２０６ＧＧ）で清澄化した。清澄化後、ＸａｍｐｌｅｒＴＭ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，７５０ｋＤ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃ＵＦＰ－７５０－Ｃ－６ＭＡ）を用いて、中空糸によるタンジェンシャルフローろ過で限外ろ過を行った。減量後、サンプルをアフィニティークロマトグラフィー（ＰＯＲＯＳＴＭ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ ＡＡＶＸ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃Ａ３６７３９））に供し、ＡＡＶの精製を行った。アフィニティークロマトグラフィー工程に続いて、溶出したサンプルを密度勾配遠心分離に付し、ＡＡＶと中間体ＡＡＶ粒子を分離した。ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離で分離したＡＡＶ粒子を、リン酸緩衝生理食塩水の透析でバッファー交換を行った。バッファー交換後、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標） Ｕｌｔｒａ－４ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（Ｍｅｒｃｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＃ＵＦＣ８０１０２４）を用いてＡＡＶサンプルを濃縮し、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ，０．２２μｍ（Ｍｅｒｃｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＃ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を用いて滅菌した。ＡＡＶゲノムはＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ ＃６９５０６）を用いて精製した。ＡＡＶｐｒｏ（登録商標）Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（リアルタイムＰＣＲ用） （Ｔａｋａｒａ ＃６２３３）を用いて精製したＡＡＶゲノムの力価を測定した。得られたＡＡＶをＡＡＶ９－６９５と表記する。
ｐＥＤ１４８－ｈ２４５、ｐＥＤ１４８－ｈ２５７、又はｐＥＤ１４８－ｈ２６９を用いたＡＡＶを上記のように製造し、それぞれＡＡＶ９－２４５、ＡＡＶ９－２５７、及びＡＡＶ９－２６９と命名した。ＡＡＶ９－６９５、ＡＡＶ９－２４５、及びＡＡＶ９－２５７をそれぞれ２回製造し、インビトロ及びインビボの実験に使用した。
（２）結果
ＡＡＶのゲノム力価を表２に示す。
実施例３ ｄＳａＣａｓ９、転写抑制因子及びｓｇＲＮＡをコードする塩基配列を搭載した組換えＡＡＶ９のＤＭＰＫ遺伝子抑制に対するインビトロ薬理学的評価
（１）実験方法
細胞培養とＡＡＶ感染
ｉＣＭ細胞を骨格筋細胞増殖培地キット（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ ＃Ｃ２３０６０）に懸濁し（注：培地はキットの指示通りの５％ではなく２０％のＦＢＳと５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンＳを添加）、コラーゲンタイプＩでコートされた２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ ＃４８２０－０１０）にウェルあたり９００μｌの培地に２０，０００細胞の密度で播種した。ＡＡＶ感染には、２．８、３．６、４．５、又は５．５×１０１２ｖｇ／ｍｌのＡＡＶ９－６９５、ＡＡＶ９－２４５、ＡＡＶ９－２５７、又はＡＡＶ９－２６９を含有する０．００１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ Ｆ－６８（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃ＳＨ３０５９４．０１）を含むＰＢＳ１００μｌを培地に加え、３７℃／５％ＣＯ２で２日間培養・インキュベーションをした。コントロールのウェルには、０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を含むＰＢＳ１００μｌを培地に添加した。実験は３連で行った。培地を分化培地（１０μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｉ９２７８）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃６１９６５－０２６））に交換し、３７℃、５％ ＣＯ２で４日間、細胞を培養した。５００μｌのＰＢＳで洗浄後、製造元の指示に従い、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＃７４１３４）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＡＡＶを感染させていない細胞からのＲＮＡをコントロールとし、図４ではＣｔｒ１として示した。
遺伝子発現解析
Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲでは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＶＩＬＯＴＭ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃１１７５４２５０）を用いて、８０ｎｇの全ＲＮＡを２０μｌの反応容量でｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡは水で１６０倍希釈し、２μｌをｑＰＣＲに使用した。ＤＭＰＫ用のＴａｑｍａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃Ｈｓ０１０９４３２９＿ｍ１，ＦＡＭ）又はＧＡＰＤＨ用のＴａｑｍａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１，ＦＡＭ）、及びＴａｑｍａｎＴＭ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃４３６９０１６）を含む５μｌの最終容量で、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ １２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてｑＰＣＲを実施した。ｑＰＣＲのサイクル条件は以下の通り：５０℃で２分間の後に９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４５サイクル。データは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ １２Ｋ Ｆｌｅｘ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で解析した。発現値は、各遺伝子の標準曲線を用いて解析し、ＤＭＰＫ遺伝子の発現レベルをＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルで標準化した。
（２）結果
ＡＡＶ９－６９５、ＡＡＶ９－２４５、ＡＡＶ９－２５７、又はＡＡＶ９－２６９をｉＣＭ細胞に適用したところ、ＤＭＰＫ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションが見られたことから、ｄＳａＣａｓ９、ＫＲＡＢ、及び配列番号８３、７０、８１又は９９で表されるターゲット配列によってコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡの導入遺伝子を搭載したＡＡＶ９が、ヒト筋細胞におけるＤＭＰＫダウンレギュレーションに対して薬理作用を持つことが示唆された（図４）。
実施例４ ＤＭＳＸＬマウスにおけるＤＭＰＫ遺伝子発現の抑制
（１）実験方法
動物の処置
ＡＡＶ９－６９５、ＡＡＶ９－２４５、又はＡＡＶ９－２５７を、ヒトＤＭ１遺伝子座と１０００を超える非常に大きなＣＴＧの増大を有するトランスジェニックマウス（PloS Genet. 2012;8(11):e1003043）であるＤＭＳＸＬホモマウス（ＤＭＳＸＬマウスと称する）に静脈内注射した（それぞれ雄性ｎ＝２と雌性ｎ＝２、計ｎ＝４）。投与量は、ＡＡＶ９－６９５、ＡＡＶ９－２４５、及びＡＡＶ９－２５７について、それぞれ１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、及び５×１０１４ｖｇ／ｋｇであった。コントロールとして、０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃ＳＨ３０５９４．０１）を含むＰＢＳが注入された。４週間後、ＤＭＳＸＬマウスを安楽死させ（sacrificed）、これらのマウスからサンプル（前脛骨筋（ＴＡ）、心臓、及び肝臓）を採取した。これらのサンプルについて、以下のように遺伝子発現解析を行った。サンプルはＲＮＡ抽出まで－８０℃の冷凍庫で保存した。
ＲＮＡ抽出と遺伝子発現解析
組織サンプルは、１ｍｌのアイソジェン（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ ＃３１９－９０２１１）中、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いてホモジナイズした。遠心分離後、上清７００μｌを１５０μｌのクロロホルム（Ｗａｋｏ＃０３４－０２６０３）が入った１．５ｍｌチューブに移した。ボルテックス及び遠心分離後、水層１８７μｌをイソプロパノール（ＷＡＫＯ ＃１６６－０４８３６）１５０μｌに加え、混合した。ＲＮＡ抽出物をＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ ＃７４１３４）のＲＮｅａｓｙスピンカラムに移し、さらに製造元のプロトコールに従って精製した。
Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲでは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＶＩＬＯＴＭ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃ １１７５４２５０）を用いて、７００－１０００ ｎｇの全ＲＮＡを２０ μｌの反応量でｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡは水で２０倍希釈し、３－４μｌをｑＰＣＲに使用した。ｑＰＣＲは、ＤＭＰＫ用のＴａｑｍａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃Ｈｓ０１０９４３２９＿ｍ１，ＦＡＭ）又はＧＡＰＤＨ用のＴａｑｍａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１，ＦＡＭ）、及びＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃４３６９０１６）を含む１０μｌ最終容量でＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ １２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて実施した。ｑＰＣＲのサイクリング条件は以下の通りである：５０℃２分の後、９５℃１０分、続いて９５℃１５秒、６０℃１分のサイクルを４０－４５回繰り返した。データはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ １２Ｋ Ｆｌｅｘソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で解析した。発現値は各遺伝子の標準曲線で解析し、ＤＭＰＫ遺伝子の発現量はＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量に対して標準化した。
（２）結果
ＡＡＶ９－６９５、ＡＡＶ９－２４５、及びＡＡＶ９－２５７は、それぞれの導入遺伝子をマウスで発現させた。ＤＭＰＫ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションは肝臓では認められず、骨格筋と心筋で認められたことから、ｄＳａＣａｓ９、ＫＲＡＢ及び配列番号８３、７０又は８１で表されるターゲット配列によってコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡを導入したＡＡＶ９が、ＤＭＳＸＬマウスにおけるＤＭＰＫダウンレギュレーションに対して薬理効果があることが示された（図５～図７）。
実施例５． ＤＭＳＸＬマウスへのＡＡＶ９－６９５投与によるＲＮＡ凝集体形成の改善
（１）実験方法
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：ＦＩＳＨ
ＤＭＳＸＬマウスへのＡＡＶ９－６９５（５×１０１４ｖｇ／ｋｇ）又は対照としての溶媒（０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を含むＰＢＳ）の投与は、実施例４に記載したようにして実施した。投与４週間後にＤＭＳＸＬマウスの前脛骨筋（ＴＡ）筋肉を摘出・採取した。直ちにＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ Ｊａｐａｎ， ＃４５８３）に包埋した後、組織を液体窒素であらかじめ冷却した冷イソペンタンで凍結し、－８０℃で保存した。
クライオスタットミクロトームで１０μｍの凍結切片を作成し、その薄切片をスライドグラスに乗せた。スライドを風乾し、４％パラホルムアルデヒドで１５分間、室温で固定し、ＰＢＳで２分間２回洗浄し、４℃で保存した。
２％アセトンを含むＰＢＳで５分間、室温でインキュベートした後、スライドを３０％ホルムアミドを含む２×ｓａｌｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＳＳＣ）（３００ｍＭ ＮａＣｌ及び３０ｍＭ クエン酸ナトリウム）中、室温で１０分間インキュベートした。スライドをプローブ溶液（３０％ホルムアミドを含む２×ＳＳＣ中、０．０２％ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ ＃Ａ７０３０－１００Ｇ）、０．０６６ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃１５４０１－０１１）、２ｍＭリボヌクレオシドバナジル錯体（ＳＩＧＭＡ ＃Ｒ３３８０－５ＭＬ）、及び１ｎｇ／μｌ Ｃｙ３－（ＣＡＧ）５－２’－ＯＭｅ プローブ（ｙ＿Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ），ｙはＣｙ３，Ｎ（Ｍ）は２’－ＯＭｅ ＲＮＡを意味する、このプローブはＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．Ｊａｐａｎ．で合成された）中で、３７℃で２時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、プローブ溶液を除去し、スライドを、３０％ホルムアミドを含む２×ＳＳＣ中で５０℃、３０分間インキュベートした。スライドを１×ＳＳＣで１回洗浄し、１×ＳＳＣで３０分間、室温でインキュベートした。スライドをＰＢＳで１０分間３回洗浄し、ＤＡＰＩ入りＰｒｏＬｏｎｇＴＭ Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃Ｐ３６９７１）を添加した。スライドはカバースリップで覆い、４℃で保存した。
共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ７００（ＺＥＩＳＳ）を用いて、ＲＮＡ凝集体の形成を観察した。
（２）結果
溶媒又はＡＡＶ９－６９５を投与したＤＭＳＸＬマウスのＴＡ筋肉切片の典型的な画像を、図８に示す。矢印はＲＮＡ凝集体を示す（ＲＮＡ凝集体は、青色に着色された核に局在する明確に検出可能な赤い点と定義される）。
ＡＡＶ９－６９５を投与したＤＭＳＸＬマウスのＴＡ筋肉で観察されたＲＮＡ凝集体の数は、溶媒を投与したＤＭＳＸＬマウスのＴＡ筋肉における数よりも少なく、ＡＡＶ９－６９５投与によりＤＭＳＸＬマウスにおけるＲＮＡ凝集体形成が改善されることが示唆された。
実施例６．ｈＤＭＰＫ ｓｇＲＮＡ発現ｉＤＭ細胞におけるＤＭＰＫ遺伝子発現の抑制
（１）実験方法
レンチウイルス調製
Ｌｅｎｔｉ－ＸＴＭ ２９３Ｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｔａｋａｒａ ＃６３２１８０）を、１０％ＦＢＳとＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃１１１４００５０）を加えた１０ｍｌ ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃１０５６９－０１０）の入ったコラーゲンＩコートディッシュ１００ｍｍ（ＩＷＡＫＩ ＃４０２０－０１０）に、５×１０６細胞／ディッシュで播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、７μｇのＬｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ ＃６１９４）と、ｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢ及び配列番号１又は８３で表される表示の（indicated）ターゲット配列（実施例１）をコードする配列を含むトランスファープラスミドｐＥＤ１６２（５．５μｇ）を用い、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ３０００ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃Ｌ３０００００８）を製造者のプロトコールに従ってセットアップした。プラスミドは表3に記載のように命名した。レンチウイルスを含む培地１０ｍｌを、トランスフェクションの４８時間後に、培地上清を０．４５μｍのフィルターに通すことによって回収した。ウイルス液を濃縮するため、１／４容量のＰＥＧ－ｉｔＴＭ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＢＩ ＃ＬＶ８１０Ａ－１）を加え、４℃で一晩インキュベートした。上清を１，５００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を捨てた後、２００μｌのＤＭＥＭをチューブに加え、ウイルス溶液を穏やかに再懸濁し、－８０℃で保存した。
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡウイルス（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ ＃７４０９５６．２５０）及びＬｅｎｔｉ－ＸＴＭ ｑＲＴ－ＰＣＲ滴定キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＃６３１２３５）を使用して測定したレンチウイルス力価は、５×１０１０～７×１０１０粒子／ｍｌの範囲であった。
ｉＤＭ細胞への遺伝子導入
ｉＤＭ細胞を、コラーゲンＩコート１２ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ ＃４８１５－０１０）において、増殖培地［ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔ；ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ：Ｃ－２３０６０（注：培地は、キットの指示通りの５％ではなく、２０％ＦＢＳと５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンＳを添加した）］を含む１ｍｌの培地中に５０，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩培養した。翌日、培地を５μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ ＃ＴＲ－１００３－Ｇ）を添加した１ｍｌの増殖培地に交換し、ｔｒａｃｒＲＮＡと融合した個々のターゲット配列（配列番号１又は８３）にコードされたｃｒＲＮＡを含む各ｓｇＲＮＡに対応する０．０３ｍｌのレンチウイルス上清（上記参照）を各ウェルに添加した。細胞をレンチウイルスとともに４８時間インキュベートした後、ウイルス培地を除去し、選択培地［１０μｇ／ｍｌブラストサイジン（Ｎａｃａｌａｉ ＃０３７５９－７１）を添加した増殖培地］に置き換えた。選択培地で２４時間培養した後、細胞の１／３を、増殖培地中で新しいウェルに移した。細胞を播種し、７２時間後、増殖培地を選択培地に交換した。選択培地で４８時間培養後、細胞を回収し、保存した。
ｉＣＭ細胞の遺伝子導入
ｉＣＭ細胞を、コラーゲンタイプＩコート６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ ＃４８１０－０１０）において、増殖培地［ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔ；ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ：Ｃ－２３０６０（注：培地は、キットの指示通りの５％ではなく、２０％ＦＢＳと５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンＳを添加した）］を含む２ｍｌの培地中に５０，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩培養した。翌日、培地を５μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ ＃ＴＲ－１００３－Ｇ）を添加した２ｍｌの増殖培地に交換し、ｔｒａｃｒＲＮＡと融合した個々のターゲット配列（配列番号１）にコードされたｃｒＲＮＡを含むコントロールｓｇＲＮＡに対応する２×１０９ｖｇのレンチウイルス上清（上記参照）を各ウェルに添加した。細胞をレンチウイルスとともに４８時間インキュベートした後、ウイルス培地を除去し、選択培地［１０μｇ／ｍｌブラストサイジン（Ｎａｃａｌａｉ ＃０３７５９－７１）を添加した増殖培地］に置き換えた。選択培地で２４時間培養した後、細胞の２／３を、増殖培地中でコラーゲンタイプＩコート培養皿１００ｍｍ（ｉｗａｋｉ ＃４０２０－０１０）に移した。細胞を播種し、７２時間後、増殖培地を選択培地に交換した。選択培地で４８時間培養後、細胞を回収し、保存した。
細胞培養、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ調製
ｄＳａＣａｓ９及び配列番号８３で表されるターゲット配列によりコードされるｃｒＲＮＡを含むｈＤＭＰＫ ｓｇＲＮＡを発現するｉＤＭ細胞、ｄＳａＣａｓ９及び配列番号１で表されるターゲット配列によりコードされるｃｒＲＮＡを含むコントロールｓｇＲＮＡを発現するｉＤＭ細胞、並びにｄＳａＣａｓ９及び配列番号１で表されるターゲット配列によりコードされるｃｒＲＮＡを含むコントロールｓｇＲＮＡを発現するｉＣＭ細胞を、それぞれｉＤＭ－６９５細胞（ｉＤＭ＿６９５）、ｉＤＭ－Ｃｔｒｌ細胞（ｉＤＭ＿Ｃｔｒｌ）、ｉＣＭ－Ｃｔｒｌ細胞（ｉＣＭ＿Ｃｔｒｌ）と名付け、それらをＩ型コラーゲンでコートした２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ ＃４８２０－０１０）に、２０％の熱非働化していないＦＢＳを添加した骨格筋細胞増殖培地キット（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ ＃Ｃ２３０６０）中、ウェルあたり２５，０００細胞／５００μｌ又は５０，０００細胞／１ｍｌの密度で播種し、３７℃／５％ ＣＯ２で２日間（５０，０００細胞／ウェルで播種した場合）又は３日間（２５，０００細胞／ウェルで播種した場合）インキュベートした。
２００μＬ ＰＢＳで洗浄後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＃７４１０６）を用いて、製造元の指示に従い全ＲＮＡを抽出した。
５００ｎｇの全ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＶＩＬＯＴＭ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃１１７５４－２５０）を製造元の指示に従って用いて、ｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡは－２０℃で保存した。
遺伝子発現解析
ｃＤＮＡを水で１００倍希釈し、２μｌをｑＰＣＲに使用した。ｑＰＣＲを、ＤＭＰＫ用Ｔａｑｍａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃Ｈｓ０１０９４３２９＿ｍ１，ＦＡＭ）又はＧＡＰＤＨ用Ｔａｑｍａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１，ＦＡＭ）とＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃４３６９０１６）を含む最終容量１０μｌでＶｉｉＡ７ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて実施した。ｑＰＣＲ条件は以下の通り：５０℃２分間及び９５℃１０分間の予熱の後、９５℃１５秒間、６０℃１分間の４５サイクル。発現値は各遺伝子の標準曲線を用いて解析し、ＤＭＰＫ遺伝子の発現レベルをＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルで標準化した。
（２）結果
ｉＤＭ－６９５細胞におけるＤＭＰＫ遺伝子の発現と－ｉＤＭ－Ｃｔｒｌ細胞におけるＤＭＰＫ遺伝子の発現を図９に示す。
ｈＤＭＰＫ ｓｇＲＮＡを発現させたｉＤＭ細胞では、ＤＭＰＫ遺伝子の発現が抑制されていた。
実施例７．ｈＤＭＰＫ ｓｇＲＮＡ発現ｉＤＭ細胞におけるＲＮＡ凝集体形成の改善
（１）実験方法
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：ＦＩＳＨ
実施例６で構築したｉＤＭ－６９５細胞、ｉＤＭ－Ｃｔｒｌ細胞及びｉＣＭ－Ｃｔｒｌ細胞をコラーゲンコート９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１５２０３８）に４つ一組で、２０％の熱非働化していないＦＢＳを添加した骨格筋細胞増殖培地キット（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ ＃Ｃ２３０６０）中、ウェルあたり２，５００細胞又は５，０００細胞の密度で播種し、３７℃／５％ ＣＯ２で２日間（５，０００細胞／ウェルで播種した場合）又は３日間（２，５００細胞／ウェルで播種した場合）インキュベートした。
細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温、１５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、４℃で保存した。
０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳで１０分間、室温でインキュベートした後、細胞を洗浄し、４０％ホルムアミドを含む２×ＳＳＣで室温で１０分間インキュベートした。５０μｌのプローブ溶液（４０％ホルムアミドを含む２×ＳＳＣ中、０．０２％ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ ＃Ａ７０３０－１００Ｇ）、０．０６６ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１５４０１－０１１）、２ｍＭリボヌクレオシドバナジル錯体（ＳＩＧＭＡ ＃Ｒ３３８０－５ＭＬ）、及び０．１ｎｇ／μｌ Ｃｙ３－（ＣＡＧ）５－ＬＮＡプローブ（ｙ＿５（Ｌ）Ａ（Ｌ）Ｇ（Ｌ）ｃａｇｃａｇｃａｇ５（Ｌ）Ａ（Ｌ）Ｇ（Ｌ），ｙはＣｙ３，５（Ｌ）はＬＮＡ－ｍＣ，Ｎ（Ｌ）はＬＮＡ，小文字はＤＮＡを意味する、このプローブはＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．で合成された）、を各ウェルに加え、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、プローブ溶液を除去し、細胞を、４０％ホルムアミドを含む２×ＳＳＣ中で３７℃、３０分間インキュベートした。細胞を１×ＳＳＣで１回洗浄し、１×ＳＳＣ中で３０分間、室温でインキュベートした。２μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩ（Ｄｏｊｉｎｄｏ ＃３４０－０７９７１）を含む５０μｌのＰＢＳを各ウェルに加え、細胞を室温で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回、室温で５分間洗浄し、４℃で保存した。
ＲＮＡ凝集体の形成は、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ６０００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出・解析した。各ウェルで９か所の画像を撮影し、各画像中のＲＮＡ凝集体陽性の核の数及び核の総数をカウントした。各ウェルの凝集体陽性の核の割合を解析し、平均値を算出した。
（２）結果
ｉＤＭ－６９５細胞とｉＤＭ－Ｃｔｒｌ細胞の典型的な画像を、図１０Ａに示す。
各細胞のＲＮＡ凝集体陽性の核の割合を、図１０Ｂに示す。
ｉＤＭ－６９５細胞におけるＲＮＡ凝集体陽性核の割合は、ｉＤＭ－Ｃｔｒｌ細胞におけるそれよりも低かった。
実施例８．ｈＤＭＰＫ ｓｇＲＮＡ発現ｉＤＭ細胞におけるスプライシング不全の改善
（１）実験方法
スプライシング解析
ｉＤＭ－６９５細胞、ｉＤＭ－Ｃｔｒｌ細胞、及びｉＣＭ－６９５細胞からのｃＤＮＡの調製は、実施例６に記載したとおりである。
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴａＫａＲａ ＃Ｒ０５０Ａ）を製造元の指示に従って用いて、ＰＣＲを実施した。ｃＤＮＡを水で１０倍希釈し、１μｌを使用した。使用したＰＣＲプライマーは以下の通りである：
ＰＣＲサイクルの条件は以下の通り：９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃３０秒を３５サイクル、その後７２℃７分。
ＰＣＲ産物をＡｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ１０００ Ｋｉｔ （Ａｇｉｌｅｎｔ ＃５０６７－１５０４）にロードして電気泳動を行い、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ｓｙｓｔｅｍを製造元の指示に従って用いて分析した。
正常スプライシング産物と異常スプライシング産物のピークのＡＵＣを測定し、各細胞における正常スプライシング産物の割合を算出した。
（２）結果
各遺伝子、すなわちＤＭＤ、ＭＢＮＬ１、ＫＩＦ１３Ａ及びＴＮＮＴ２のゲル画像とエクソンパターンを、図１１Ａに示す。
ｉＣＭ細胞でより多くｉＤＭ細胞で少ない、正常スプライシング産物の各細胞における割合を、図１１Ｂに示す。
ｉＤＭ－６９５細胞では、試験したすべての遺伝子のスプライシング不全が改善された。
本明細書において数字的な限界又は範囲が記載されている場合には、その両端も含まれる。さらに、数字的な限界又は範囲の中にあるすべての数値及びサブレンジもまた、あたかも明示的に記述されたかのように、明確に含まれる。
本明細書で使用される「ａ」や「ａｎ」等の単語は、「１以上」という意味を有する。
明らかに、上記の教示に照らして、本発明の多くの改変と変更が可能である。従って、添付の特許請求の範囲内で、本発明は、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施することができることが理解される
上述のすべての特許及びその他の文献は、この参照により、詳細に記載されている場合と同じように、ここに完全に組み入れられる。
本発明によれば、ＤＭ１患者由来の細胞及びＤＭ１モデルマウスにおいて、ＤＭＰＫ遺伝子の発現を抑制することができる。従って、本発明はＤＭ１の治療及び／又は予防に極めて有用であると期待される。

Claims (22)

  1. 以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド：
    （ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
    （ｂ）配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１７、又は配列番号１１９で表される塩基配列を含む、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列。
  2. ガイドＲＮＡをコードする塩基配列を少なくとも２つ含み、該少なくとも２つの塩基配列は異なっている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 転写抑制因子が、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＭＢＤ２Ｂ、ＮＩＰＰ１、及びＨＰ１Ａからなる群より選択される、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 転写抑制因子が、ＫＲＡＢである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  5. ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  6. ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来する、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
  7. ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列及び／又はヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  8. ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
  9. ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターである、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  10. ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、ユビキタスなプロモーター又は筋特異的プロモーターである、請求項７～９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  11. ユビキタスなプロモーターが、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択される、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  12. 筋特異的プロモーターが、ＣＫ８プロモーター、ミオシン重鎖キナーゼ（ＭＨＣＫ）プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ５－１２（Ｓｙｎ）プロモーター、及びＤｅｓプロモーターからなる群より選択される、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  13. 筋特異的プロモーターが、ＣＫ８プロモーターである、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  14. ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、配列番号７０、配列番号８１、配列番号８３、又は配列番号９９で表される塩基配列を含み、
    転写抑制因子がＫＲＡＢであり、
    ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９であり、
    ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターであり、そして
    ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、ＣＫ８プロモーターである、
    請求項７～１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  15. ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、配列番号８３で表される塩基配列を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
  16. 請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  17. ベクターが、プラスミドベクター又はウイルスベクターである、請求項１６に記載のベクター。
  18. ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１７に記載のベクター。
  19. ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５８７ＭＴＰ、ＡＡＶ５８８ＭＴＰ、ＡＡＶ－Ｂ１、ＡＡＶＭ４１、及びＡＡＶｒｈ７４からなる群から選択される、請求項１８に記載のベクター。
  20. ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ９である、請求項１９に記載のベクター。
  21. 請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１６～２０のいずれか１項に記載のベクターを含む、医薬組成物。
  22. 筋強直性ジストロフィー１型の治療又は予防用の、請求項２１に記載の医薬組成物。
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