JP7407112B2 - べと病抵抗性の花蕾または頭部を有するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物 - Google Patents

Description

ATCC PTA-124338

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月８日出願の米国仮出願第６２／５９６，６０１号の優先権の利益を主張し、この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は農業の分野に関し、より具体的には、べと病に対する改善された抵抗性を示す花蕾または頭部を有するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を生産するための方法及び組成物に関する。

配列表の組み込み
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ基本ソフトで測定したとき５．４キロバイトであり、２０１８年１２月６日に生成された「ＳＥＭＢ０３１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と命名されたファイルに含有されている配列表はここに電子出願し、参照によって本明細書に組み入れられる。

病害抵抗性は、農業において重要な形質である。病害抵抗性は、特に食用作物の生産に使用される品種にとって重要である。病害抵抗性対立遺伝子の同定に加えて、抵抗性対立遺伝子に連鎖した特異的なマーカーは、栽培品種の系統への対立遺伝子の導入を容易にする。植物の育種法におけるマーカー利用選抜（ＭＡＳ）によって、目的の形質、この場合、病害抵抗性に連鎖した遺伝子マーカーに基づいて植物を選抜することが可能となった。しかし、植物に望ましい形質を追跡及び／または導入するためのマーカーの同定には多大な努力が必要であり、そのため、形質に関連する遺伝子が特性決定されているとしても、マーカーを利用できないことが多い。マーカーを同定することの困難さはまた、多因子遺伝または量的遺伝、エピスタシス、及び多くの場合所望の表現型の発現の基礎となる遺伝的背景の不完全な理解などの因子により、複雑化している。

本開示は、栽培品種のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を提供し、この植物は、第３染色体上に第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含み、第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子が、植物の花蕾または頭部に、第１の遺伝子移入された対立遺伝子も第２の遺伝子移入された対立遺伝子も含まない植物と比較して、べと病に対する増加した抵抗性を付与する。特定の実施形態では、植物は第３染色体上に第１の遺伝子移入された対立遺伝子及び第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含み、第１の遺伝子移入された対立遺伝子及び第２の遺伝子移入された対立遺伝子が、植物の花蕾または頭部に、これらの対立遺伝子を含まない植物と比較して、べと病に対する増加した抵抗性を付与する。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子移入された対立遺伝子及び第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含む種子の試料は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２４３３８の下で寄託された。他の実施形態では、第１の遺伝子移入された対立遺伝子は、植物のゲノム中で、第３染色体上のマーカー遺伝子座Ｍ１９（配列番号２）及びマーカー遺伝子座Ｍ２０（配列番号３）に隣接する。さらに他の実施形態では、第２の遺伝子移入された対立遺伝子は、植物のゲノム中で、第３染色体上のマーカー遺伝子座Ｍ３１（配列番号４）及びマーカー遺伝子座Ｍ４４（配列番号１６）に隣接する。追加の実施形態では、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物は、ブロッコリー、カリフラワー、発芽ブロッコリー、芽キャベツ、白キャベツ、赤キャベツ、サボイキャベツ、カーリーケールキャベツ、カブカンランまたはポルトガルキャベツ植物である。特定の実施形態では、植物は、第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子に対してホモ接合性である。

本開示はまた、栽培品種のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を生産する種子を提供し、この植物は、第３染色体上に第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含み、第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子が、植物の花蕾または頭部に、第１の遺伝子移入された対立遺伝子も第２の遺伝子移入された対立遺伝子も含まない植物と比較して、べと病に対する増加した抵抗性を付与する。特定の実施形態では、種子は栽培品種のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を生産し、この植物は、第３染色体上に第１の遺伝子移入された対立遺伝子及び第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含み、第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子が、植物の花蕾または頭部に、第１の遺伝子移入された対立遺伝子及び第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含まない植物と比較して、べと病に対する増加した抵抗性を付与する。

さらに、本開示は、栽培品種のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物の植物部位を提供し、この植物は、第３染色体上に第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含み、第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子が、植物の花蕾または頭部に、第１の遺伝子移入された対立遺伝子も第２の遺伝子移入された対立遺伝子も含まない植物と比較して、べと病に対する増加した抵抗性を付与する。特定の実施形態では、植物部位は栽培品種のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物由来であり、この植物は、第３染色体上に第１の遺伝子移入された対立遺伝子及び第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含み、第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子が、植物の花蕾または頭部に、第１の遺伝子移入された対立遺伝子及び第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含まない植物と比較して、べと病に対する増加した抵抗性を付与する。特定の実施形態では、植物部位は、細胞、種子、根、茎、葉、果実、花、花蕾、頭部または花粉である。

さらに、本開示はマーカーＭ１９（配列番号２）及びマーカーＭ２０（配列番号３）に隣接するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ＭＹＣＯＣＬＰ由来の第３染色体上の第１の染色体セグメントならびにマーカーＭ３１（配列番号４）及びマーカーＭ４４（配列番号１６）に隣接するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ＭＹＣＯＣＬＰ由来の第３染色体上の第２の染色体セグメントを含む遺伝子移入断片を提供する。特定の実施形態では、断片は、べと病に対する増加した抵抗性を付与する。他の実施形態では、第１の染色体セグメント及び第２の染色体セグメントを含む種子の試料は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２４３３８の下で寄託された。

本開示はまた、べと病に対する抵抗性が改善された花蕾または頭部を有するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物の栽培品種を生産するための方法であって、遺伝子移入を欠く植物と比較してべと病に対する改善された抵抗性を付与するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ＭＹＣＯＣＬＰの第３染色体由来の第１の染色体セグメントまたは第２の染色体セグメントを、植物品種に遺伝子移入することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、遺伝子移入することは、１つ以上の子孫植物を生産するために、第１の染色体セグメントまたは第２の染色体セグメントを含む植物をそれ自体とまたは異なる遺伝子型の第２のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物と交配すること、及びその染色体セグメントを含む子孫植物を選抜することを含む。他の実施形態では、子孫植物を選抜することは、マーカーＭ１９（配列番号２）及びマーカーＭ２０（配列番号３）に隣接する第１の対立遺伝子、またはマーカーＭ３１（配列番号４）及びマーカーＭ４４（配列番号１６）に隣接する第２の対立遺伝子を少なくとも検出することを含む。いくつかの実施形態では、植物品種は、ブロッコリー、カリフラワー、発芽ブロッコリー、芽キャベツ、白キャベツ、赤キャベツ、サボイキャベツ、カーリーケールキャベツ、カブカンランまたはポルトガルキャベツの植物品種である。追加の実施形態では、子孫植物は、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５またはＦ６子孫植物である。特定の実施形態では、交配は戻し交配を含む。さらに他の実施形態では、戻し交配は、２世代～７世代の戻し交配、例えば２世代、３世代、４世代、５世代、６世代または７世代の戻し交配を含む。さらなる実施形態では、交配はマーカー利用選抜を含む。さらに別の実施形態では、第１の染色体セグメント及び第２の染色体セグメントを含む種子の試料は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２４３３８の下で寄託された。

本開示はさらに、べと病に対する抵抗性が改善された花蕾または頭部を有するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物の栽培品種を生産するための方法により生産されたＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を提供し、この方法は、遺伝子移入を欠く植物と比較してべと病に対する改善された抵抗性を付与するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ＭＹＣＯＣＬＰの第３染色体由来の第１の染色体セグメントまたは第２の染色体セグメントを、植物品種に遺伝子移入することを含む。さらに、本開示は、食品もしくは飼料を生産する方法であって、栽培品種のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物であり、第３染色体上に第１の遺伝子移入された対立遺伝子もしくは第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含み、第１の遺伝子移入された対立遺伝子もしくは第２の遺伝子移入された対立遺伝子が、植物の花蕾もしくは頭部に、第１の遺伝子移入された対立遺伝子も第２の遺伝子移入された対立遺伝子も含まない植物と比較して、べと病に対する増加した抵抗性を付与する植物、または遺伝子移入を欠く植物と比較してべと病に対する改善された抵抗性を付与するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ＭＹＣＯＣＬＰの第３染色体由来の第１の染色体セグメントもしくは第２の染色体セグメントを植物品種に遺伝子移入することを含む、べと病に対する抵抗性が改善された花蕾もしくは頭部を有するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物の栽培品種を生産するための方法によって生産されたＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物、またはその部位を得ることを含む方法、及び植物もしくはその部位から食品もしくは飼料を生産する方法を提供する。

本開示はまた、べと病抵抗性を示すＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を選抜する方法であって、栽培品種のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物であり、第３染色体上に第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含み、第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子が、植物の花蕾または頭部に、第１の遺伝子移入された対立遺伝子も第２の遺伝子移入された対立遺伝子も含まない植物と比較してべと病に対する増加した抵抗性を付与する植物を、１つ以上の子孫植物を生産するためにそれ自体とまたは異なる遺伝子型の第２のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物と交配すること、及び第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含む子孫植物を選抜することを含む、べと病抵抗性を示すＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を選抜する方法を提供する。特定の実施形態では、子孫植物を選抜することは、第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子に遺伝的に連鎖した遺伝子マーカーを同定することを含む。他の実施形態では、子孫植物を選抜することは、第３染色体上のマーカー遺伝子座Ｍ１９（配列番号２）とマーカー遺伝子座Ｍ２０（配列番号３）との間のゲノム領域内の遺伝子マーカーもしくはゲノム領域に遺伝的に連鎖した遺伝子マーカーを同定すること、または第３染色体上のマーカー遺伝子座Ｍ３１（配列番号４）とマーカー遺伝子座Ｍ４４（配列番号１６）との間のゲノム領域内の遺伝子マーカーもしくはゲノム領域に遺伝的に連鎖した遺伝子マーカーを同定することを含む。追加の実施形態では、子孫植物を選抜することはさらに、マーカー遺伝子座Ｍ３３（配列番号５）、マーカー遺伝子座Ｍ３４（配列番号６）、マーカー遺伝子座Ｍ３５（配列番号７）、マーカー遺伝子座Ｍ３６（配列番号８）、マーカー遺伝子座Ｍ３７（配列番号９）、マーカー遺伝子座Ｍ３８（配列番号１０）、マーカー遺伝子座Ｍ３９（配列番号１１）、マーカー遺伝子座Ｍ４０（配列番号１２）、マーカー遺伝子座Ｍ４１（配列番号１３）、マーカー遺伝子座Ｍ４２（配列番号１４）、及びマーカー遺伝子座Ｍ４３（配列番号１５）からなる群から選択される遺伝子座において少なくとも１つの遺伝子多型を検出することを含む。いくつかの実施形態では、子孫植物は、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５またはＦ６子孫植物である。さらなる実施形態では、子孫植物を生産することは戻し交配を含む。特定の実施形態では、戻し交配は、２世代～７世代の戻し交配、例えば２世代、３世代、４世代、５世代、６世代または７世代の戻し交配を含む。

本開示はまた、栽培品種のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物であって、第３染色体上に第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含み、第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子が、植物の花蕾または頭部に、第１の遺伝子移入された対立遺伝子も第２の遺伝子移入された対立遺伝子も含まない植物と比較して、べと病に対する増加した抵抗性を付与する植物を、１つ以上の子孫植物を生産するために、それ自体とまたは異なる遺伝子型の第２のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物と交配する方法、及び第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含む子孫植物を選抜する方法により得られるＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を提供する。

花蕾におけるべと病抵抗性のＱＴＬマッピングの結果である。２つのＱＴＬが第３染色体上に同定され、これらは合わせて表現型変異の４８．１％を説明する。

べと病（ＤＭ）は、真菌様病原体である卵菌（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａとしても知られ、Ｈｙａｌｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａとしても知られるＨｙａｌｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）によって引き起こされる。ＤＭは、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、マスタード、ラディッシュ、及びカブを含むがこれらに限定されない多くのＢｒａｓｓｉｃａ種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）において世界中で見出される病害である。ＤＭは、涼しく湿った気候、高湿度、及び高レベルの結露を伴う地域及び季節において、より多く見られる。ＤＭは生育のどの段階でも植物に感染し得るが、実生段階及び成熟植物で最も頻繁に確認される。感染は子葉段階、実生生産、成熟または成体植物段階、ならびにカリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ．Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）及びブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ．Ｉｔａｌｉｃａ）の花蕾で起こり得る。殺菌剤はべと病感染を制御するために使用され得るが、各植物段階でＤＭによる被害を制限するために、抵抗性を備えた品種を有することが好ましい。特に、収穫段階に近い殺菌剤の適用は規制により制限されるため、花蕾の抵抗性が望ましい。

カリフラワーにおけるべと病抵抗性の特定の供給源が文献に記載されているが、これらの供給源は一般に、子葉の抵抗性についてのみ試験され、成体植物または花蕾の抵抗性については試験されていなかった。植物発育の異なる段階での抵抗性の間に相関はなく、ある段階での抵抗性は、他の段階での抵抗性を予測することができない。特に、子葉段階での抵抗性及び／または成体植物段階での抵抗性は、花蕾における抵抗性を予測することができない。結果として、子葉または成体植物段階のいずれにおいても葉面試験に基づいて花蕾の抵抗性の供給源を選抜することができない。子葉及び成体植物段階での抵抗性を示唆するいくつかの供給源が同定されているが、これらの同一の供給源が花蕾の抵抗性をもたらすかどうかは不明である。さらに、特定のべと病抵抗性遺伝子が同定されているが、これらの遺伝子の遺伝的位置及び分子マーカーは同定または記載されていない。

カリフラワーの花蕾における抵抗性をアッセイする実験は長期間を要し、かつ著しくコストがかかる。このアッセイは植物が圃場で完全に発育し、カリフラワーの通常の収穫期間を過ぎて植物が維持されている必要がある。この試験は、実施するのに１年の大部分を必要とする場合がある。さらに、べと病の選択圧は季節間及び季節内でしばしば変化する。したがって、有意義で信頼性のある結果を得るためには、いくつかの実験的試験を、いくつかの異なる期間にわたって栽植しなければならない。これらの様式の実験的試験は非常に労働集約的であり、大きな圃場の利用を必要とする。

供給源が同定されると、マーカーを利用した育種は、形質の正常な遺伝子移入及びべと病抵抗性の花蕾を有するカリフラワーの育種を改善しかつ増加させることになる。形質に連鎖したマーカーは、形質の遺伝現象が比較的単純であり、形質が少数、好ましくは１つまたは２つの遺伝子座によって制御される場合に主に有用である。

本発明は、花蕾のべと病に対する増加した抵抗性をもたらす２つの抵抗性ＱＴＬを提供するという点で、大幅な進歩を示す。さらに、形質に連鎖したマーカーを提供し、これらは形質を遺伝子移入するために、及びべと病抵抗性の花蕾を有するカリフラワーの育種中に使用され得る。ＱＴＬは、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａの栽培作物のエリート系統に遺伝子移入することができる。これらの作物としては、ブロッコリー、カリフラワー、発芽ブロッコリー、芽キャベツ、白キャベツ、赤キャベツ、サボイキャベツ、カーリーケールキャベツ、カブカンラン、及びポルトガルキャベツの栽培品種を挙げることができるが、これらに限定されない。

Ｉ．Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物
Ｂｒａｓｓｉｃａはｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ（以前はｃｒｕｃｉｆｅｒａｅと称された）科の植物属である。この属のメンバーはキャベツまたはマスタードとしても知られる。Ｂｒａｓｓｉｃａ属は多数の商業的及び農業的に重要な種を含む。これらの種すべてのうちでＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａは、ブロッコリー、カリフラワー、発芽ブロッコリー、芽キャベツ、白キャベツ、赤キャベツ、サボイキャベツ、カーリーケールキャベツ、カブカンラン、及びポルトガルキャベツを含む少なくとも１０種の異なる商業的栽培品種を含有する最も多様なものである。これらの類型の間での育種は、これらの類型が表現型上高度に多様である一方で、いかなる遺伝的な種の壁も克服する必要がなく異なる類型間の交配を行うことができることを意味する同一種であるため、一般的であり、かつ容易に行われる。しかしながら、栽培品種間交配、特に（遺伝的に）遠い栽培品種間で交配する場合（例えば、白キャベツとブロッコリーまたはカリフラワーとの交配）については、重大な連鎖引きずりが依然として発生し得る。したがって、種の壁が存在しないことによりあらゆる栽培品種間で交配を行うことが可能となる一方で、連鎖引きずりがそのような交配に伴う可能性がある。

ＩＩ．Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物におけるべと病抵抗性に関連するゲノム領域、対立遺伝子及び多型
本発明の２つのべと病抵抗性ＱＴＬは、第３染色体上で同定された。各ＱＴＬは、それ自体でべと病に対する抵抗性をもたらし、組み合わせた場合、抵抗性は相加的である。マーカー利用育種法を用いて組換え遺伝子移入断片を同定し、生成された遺伝子移入断片は約１１センチモルガン（ｃＭ）のサイズ及び１５ｃＭのサイズであった。これらの染色体セグメントのマッピングは、べと病抵抗性の第１のＱＴＬが、マーカーＭ１９（１５，８９０，２８５ｂｐでのＳＮＰ変化［Ｇ／Ａ］、配列番号２）及びＭ２０（１０，１８４，７６２ｂｐでのＳＮＰ変化［Ｔ／Ｃ］、配列番号３）に隣接し、第２のＱＴＬがマーカーＭ３１（３，２２６，１７２ｂｐでのＳＮＰ変化［Ｔ／Ａ］、配列番号４）及びＭ４４（１，２２１，８１０ｂｐでのＳＮＰ変化［Ｃ／Ｔ］、配列番号１６）に隣接することを見出した。介在マーカー、例えば、Ｍ３３（３，１７８，０２６ｂｐでのＳＮＰ変化［Ｇ／Ａ］（配列番号５））、Ｍ３４（２，８７４，６６３ｂｐでのＳＮＰ変化［Ｔ／Ｃ］（配列番号６））、Ｍ３５（２，３５４，３４２ｂｐでのＳＮＰ変化［Ａ／Ｇ］（配列番号７））、Ｍ３６（２，１６８，４８６ｂｐでのＳＮＰ変化［Ｃ／Ｔ］（配列番号８））、Ｍ３７（２，２１２，４４０ｂｐでのＳＮＰ変化［Ａ／Ｃ］（配列番号９））、Ｍ３８（１，９７３，１７５ｂｐでのＳＮＰ変化［Ｃ／Ａ］（配列番号１０））、Ｍ３９（１，３９１，１４１ｂｐでのＳＮＰ変化［Ｔ／Ｇ］（配列番号１１））、Ｍ４０（１，９３２，１６７ｂｐでのＳＮＰ変化［Ａ／Ｇ］（配列番号１２））、Ｍ４１（２，０９１，７７１ｂｐでのＳＮＰ変化［Ａ／Ｇ］（配列番号１３））、Ｍ４２（１，２２０，０２０ｂｐでのＳＮＰ変化［Ａ／Ｇ］（配列番号１４））、及びＭ４３（１，２１９，３９２ｂｐでのＳＮＰ変化［Ａ／Ｇ］（配列番号１５））を、第３染色体上の第２の抵抗性ＱＴＬを選抜するための隣接マーカーに加えて使用することができる。特定の実施形態では、第２の抵抗性ＱＴＬの隣接マーカーの一方または両方が、Ｍ３１とＭ４４との間、例えば、Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、Ｍ３６、Ｍ３７、Ｍ３８、Ｍ３９、Ｍ４０、Ｍ４１、Ｍ４２またはＭ４３などの介在マーカーである。公開ゲノムの位置は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａゲノムのバージョン２．１（ｐｌａｎｔｓ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｂｒａｓｓｉｃａ＿ｏｌｅｒａｃｅａ／Ｉｎｆｏ／ｉｎｄｅｘ）に基づく。

当業者は、区間値が、使用される参照マップ、配列決定範囲及びアセンブリソフトウェア設定などの要因に基づいて変化し得ることを理解するであろう。しかしながら、そのようなパラメータ及びマッピングのプロトコルは当該技術分野で既知であり、当業者は本明細書で提供されるマーカー配列を使用して、本明細書に記載されている遺伝子移入をそのような方法を用いた任意の所与のマップに物理的にかつ遺伝的に固定することができる。本発明の新規の遺伝子移入は、既に開示されたべと病抵抗性の遺伝子移入よりも独特で顕著に改善された農学的特性を付与する。

したがって、特定の実施形態では、本開示は、マーカーＭ１９及びＭ２０またはマーカーＭ３１及びＭ４４に隣接する遺伝子移入されたゲノム区間を含むＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を提供する。他の実施形態において、本開示は、マーカーＭ３１及びＭ４３、Ｍ３１及びＭ４２、Ｍ３１及びＭ４１、Ｍ３１及びＭ４０、Ｍ３１及びＭ３９、Ｍ３１及びＭ３８、Ｍ３１及びＭ３７、Ｍ３１及びＭ３６、Ｍ３１及びＭ３５、Ｍ３１及びＭ３４、Ｍ３１及びＭ３３、Ｍ３３及びＭ４４、Ｍ３４及びＭ４４、Ｍ３５及びＭ４４、Ｍ３６及びＭ４４、Ｍ３７及びＭ４４、Ｍ３８及びＭ４４、Ｍ３９及びＭ４４、Ｍ４０及びＭ４４、Ｍ４１及びＭ４４、Ｍ４２及びＭ４４、Ｍ４３及びＭ４４、Ｍ３１及びＭ４４、Ｍ３３及びＭ４３、Ｍ３４及びＭ４２、Ｍ３５及びＭ４１、Ｍ３６及びＭ４０、またはＭ３７及びＭ３９に隣接する遺伝子移入されたゲノム区間を含むＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、上記のマーカーのいずれかを用いて選抜することによってＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を生産する方法を提供する。

ＩＩＩ．病害抵抗性に関連するゲノム領域の遺伝子移入
マーカー利用の遺伝子移入には、１つ以上のマーカーによって規定される染色体領域の第１の遺伝的背景から第２の遺伝的背景への移行が関与する。遺伝子移入されたゲノム領域を含有する交配の子孫は、第１の遺伝的背景に由来する所望の遺伝子移入されたゲノム領域に特徴的であるマーカーと、第２の遺伝的背景に特徴的である連鎖した及び連鎖していないマーカー双方との組み合わせによって同定することができる。

本発明は、本明細書に開示されるＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ＭＹＣＯＣＬＰ（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２４３３８）から、栽培されたＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ系統への１つ以上のゲノム領域の遺伝子移入を同定及び追跡するための新規マーカーを提供する。本発明はさらに、本明細書に開示される新規の遺伝子移入を植物育種中に同定及び追跡するためのマーカーを提供する。

本発明のいずれかのゲノム区間内のまたはいずれかのゲノム区間に連鎖したマーカーは、病害抵抗性に関連するゲノム領域の所望の遺伝的背景への遺伝子移入を含む種々の育種の試みで使用することができる。例えば、本明細書に記載されている病害抵抗性に関連するマーカーの２０ｃＭ、１５ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、２ｃＭ、または１ｃＭの範囲内でのマーカーは、耐病性の表現型に関連するゲノム領域のマーカー利用の遺伝子移入に使用することができる。

残りのゲノム配列の少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９０％または９９％が遺伝資源に特徴的なマーカーを保有する、所望の表現型に関連する１つ以上の遺伝子移入された領域を含むＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物も提供される。本明細書で提供され、かつべと病抵抗性表現型に関連するゲノム領域及びマーカーに密接に連鎖するかまたは隣接する領域を含む遺伝子移入された領域を含むＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物も提供される。

ＩＶ．病害抵抗性Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ品種の開発
ほとんどの育種目的については、商業育種家は「栽培品種」または「エリート」である遺伝資源の範囲内で作業する。この遺伝資源は、園芸上の性能で評価した場合一般に良好な性能を発揮するため、育種しやすい。ブロッコリー、カリフラワー、発芽ブロッコリー、芽キャベツ、白キャベツ、赤キャベツ、サボイキャベツ、カーリーケールキャベツ、カブカンラン、及びポルトガルキャベツを含むが、これらに限定されない多数のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ作物の栽培品種（ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｖａｒｉｅｔｙ）（栽培品種（ｃｕｌｔｉｖａｒ））が開発されている。しかしながら、栽培された遺伝資源またはエリート遺伝資源が提供する性能の優位性は、対立遺伝子の多様性の欠如によって相殺される場合がある。遺伝的に多様性である供給源で育種する場合よりも栽培された材料で作業する場合の方が進行が速いため、育種家はこの相反関係を一般に受け入れる。

連鎖引きずりまたは低い遺伝率による課題を回避しながら、望ましい抵抗性遺伝子を非栽培系統からエリート栽培系統に遺伝子移入する過程は、長く、多くの場合困難な過程である。したがって、野生型近縁種に由来する対立遺伝子の配置における成功は、有害な影響のない最小限のまたは切り詰めた遺伝子移入及び表現型スクリーニングに取って代わる信頼できるマーカーアッセイに強く依存する。成功はさらに、病害抵抗性などの量的形質についての遺伝的獲得量に焦点を当てることができるように、重要な特質に関する遺伝情報を簡略化することによって定義される。さらに、非栽培系統からのゲノム領域を遺伝子移入する過程は、情報提供マーカーの利用性によって大きく促進することができる。

したがって、当業者は、本発明によって提供される対立遺伝子、多型及びマーカーは、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ種と交配することができる任意の遺伝的背景への、本明細書で同定されるゲノム領域のいずれかの追跡及び導入を可能にすることを理解することになる。加えて、本明細書で開示されている病害抵抗性に関連するゲノム領域は、１つの遺伝子型から別の遺伝子型に遺伝子移入することができ、表現型的にまたは遺伝的に追跡することができる。したがって、病害抵抗性の選抜のためのマーカーの本出願らの開発は、有益な表現型を有するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物の開発を容易にする。例えば、所望の病害抵抗性を含む品種を開発するために、本発明のマーカーを用いて植物及び種子の遺伝子型を同定することができる。さらに、マーカー利用選抜（ＭＡＳ）によって所望の遺伝子移入についてホモ接合性またはヘテロ接合性である植物の同定が可能になる。

減数分裂組換えは、遺伝的背景全体にわたる好ましい対立遺伝子の導入、有害なゲノム断片の除去、及び遺伝的に密接に連鎖している形質の集積を可能にすることから、植物育種には必須である。正確なマーカーが存在しない場合、限られた組換えによって、育種家は子孫選抜のための分離集団を拡大せざるを得なくなる。さらに、表現型の評価は、時間がかかり資源集約的であり、かつあらゆる環境で、特に病害抵抗性のような形質について再現性がない。本発明によって提供されるマーカーは効果的な代替物を提供し、したがって、当該技術における大幅な進歩を表す。

遺伝子移入を介して正常に導入される多くの望ましい形質は、分子技術の使用によって植物へ直接導入することもできる。本発明の一態様は、部位特異的ゲノム改変技術を使用する任意の方法によって変化したゲノムを有する植物を含む。部位特異的ゲノム改変の技術には、エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヘリカーゼ及びそれらの任意の組み合わせなどの酵素の使用が含まれる。一態様では、エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、アルゴノート、及びＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼから選択される。

別の態様では、エンドヌクレアーゼはｄＣａｓ９－リコンビナーゼ融合タンパク質である。本明細書で使用される場合、「ｄＣａｓ９」は、エンドヌクレアーゼ活性を有さないがＲＮＡ誘導部位特異的ＤＮＡ結合を保持するＣａｓ９タンパク質をもたらす１つ以上のアミノ酸変異を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質を指す。本明細書で使用する場合、「ｄＣａｓ９－リコンビナーゼ融合タンパク質」は、リコンビナーゼがＤＮＡ上で触媒的に活性であるような方法でｄＣａｓ９に融合したタンパク質を有するｄＣａｓ９である。

リコンビナーゼの非限定的な例には、本明細書で提供されるＤＮＡ認識モチーフに結合したチロシンリコンビナーゼが含まれ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｇｉｎリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、及びＴｎｐ１リコンビナーゼからなる群から選択される。一態様では、本明細書で提供されるＣｒｅリコンビナーゼまたはＧｉｎリコンビナーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、またはＣａｓ９ヌクレアーゼに繋ぎ止められている。別の態様では、本明細書で提供されるＤＮＡ認識モチーフに結合したセリンリコンビナーゼは、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、及びＴＰ－９０１インテグラーゼからなる群から選択される。別の態様では、本明細書で提供されるＤＮＡ結合ドメインに結合したＤＮＡトランスポザーゼは、ＴＡＬＥ－ｐｉｇｇｙＢａｃ及びＴＡＬＥ－Ｍｕｔａｔｏｒからなる群から選択される。

部位特異的ゲノム改変酵素は、その後に相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然のプロセスによって修復される、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）または一本鎖ＤＮＡ切断などのゲノム改変をゲノム配列の標的部位に誘導する。次いで、配列改変が切断部位で生じ、これには、ＮＨＥＪの場合に遺伝子破壊を生じさせる挿入もしくは欠失、または相同組換えによる外来配列の組み込みが含まれ得る。

本発明の別の態様は、本発明によって提供される組換えＤＮＡ分子及び改変タンパク質を含むトランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物組織、トランスジェニック植物、及びトランスジェニック種子を含む。組換えＤＮＡ分子及び改変タンパク質を含む植物、または細胞、組織もしくは種子から生産された植物は、べと病に対する増加した抵抗性を示す花蕾または頭部を有する。本開示と共に使用するための宿主植物細胞の形質転換の好適な方法は、ＤＮＡを細胞に導入することができる実質的にあらゆる方法（例えば、組換えＤＮＡ構築物が植物染色体に安定的に組み込まれる場合）を含み、当該技術分野で既知である。組換えＤＮＡ構築物を植物に導入するための例示的で広く利用されている方法はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換系であり、これは当業者に既知である。組換えＤＮＡ構築物を植物に導入するための別の例示的な方法は、部位特異的組み込みの方法による、予め定められた部位での植物ゲノムへの組換えＤＮＡ構築物の挿入である。トランスジェニック植物は、植物細胞培養の方法により形質転換植物細胞から再生することができる。導入遺伝子に対してホモ接合性のトランスジェニック植物（すなわち、導入遺伝子の２つの対立遺伝子コピー）は、それ自体が単一の導入遺伝子の対立遺伝子を含むトランスジェニック植物、例えばＲ０植物を自家受粉（自家生殖）させて、Ｒ１種子を生産することによって得ることができる。生産されるＲ１種子の４分の１は、導入遺伝子に対してホモ接合性である。発芽したＲ１種子から生長した植物は、ＳＮＰアッセイ、ＤＮＡ配列決定、または接合状態アッセイと称される、ヘテロ接合体とホモ接合体の区別を可能にする熱増幅アッセイを用いて接合状態について試験できる。

Ｖ．分子利用育種法
本発明の実施に使用することができる遺伝子マーカーとしては、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、単純配列反復（ＳＳＲ）、単純配列長多型（ＳＳＬＰ）、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、挿入／欠失多型（インデル）、変数縦列反復（ＶＮＴＲ）、及び無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、アイソザイム、及び当業者に既知の他のマーカーが挙げられるが、これらに限定されない。植物育種家は分子マーカーを使用して作物のゲノムを調べ、表現型の差異ではなく遺伝的差異に基づいて材料を分類する。進歩したマーカー技術はゲノム配列、異なるヌクレオチド順、種内の多型遺伝子型に基づく。そのようなプラットフォームは、ゲノム全体を通して無作為に分布するマーカーを用いた遺伝資源の組織化に加えて、好ましい対立遺伝子に連鎖したマーカーによる園芸形質の選抜を可能にする。従来、ゲノムの先験的な知識は、今や配列決定されている主要な植物作物については欠けていた。科学者らは既知の多型現象ではなく、配列相同性を活用してマーカーのプラットフォームを開発した。ＤＮＡポリメラーゼ酵素の存在下で対ごとにハイブリダイズさせる場合、人工的なＤＮＡ分子を使用してゲノム断片の複製をプライムする。この合成は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーション及び複製を制御して、各プライマー対間の距離に応じた長さのＤＮＡ断片を増幅する熱サイクル条件によって調節される。次いで、これらの断片はマーカーとして検出され、一般に知られている例としてはＡＦＬＰ及びＲＡＰＤが挙げられる。第３の技法であるＲＦＬＰはＤＮＡ増幅工程を含まない。増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）法はゲノムの複雑性を軽減させる。まず、消化酵素を介して配列特異的にＤＮＡ鎖を切断すること。次いでサイズに対して断片を選抜し、最後に、それぞれゲノム断片のサブセットに相同の選択的オリゴヌクレオチドを用いて複製する。その結果、ＡＦＬＰ技術は遺伝子型、実験及び研究室の全体にわたってばらつきなくＤＮＡ断片を増幅する。

わずか１つのヌクレオチドの変化を含む多型を、多くの方法でアッセイすることができる。例えば、一本鎖構造多型（Ｏｒｉｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：２７１－２７８，１９８９）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（Ｍｙｅｒｓ，ＥＰ ０２７３０８５）、または切断断片長多型（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む電気泳動法によって検出を行うことができるが、ＤＮＡ配列決定の幅広い利用性によって、増幅産物を単に直接配列決定することがさらに容易になることが多い。多型配列の差異が判明すると、特定の対立遺伝子のＰＣＲ増幅（ＰＡＳＡ；Ｓｏｍｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１２：８２－８７，１９９２）または複数の特定の対立遺伝子のＰＣＲ増幅（ＰＡＭＳＡ；Ｄｕｔｔｏｎ ａｎｄ Ｓｏｍｍｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１１：７００－７０２，１９９１）のいくつかのバージョンが通常含まれる、後代検定のための迅速なアッセイを設計することができる。

多型マーカーは、系統または品種の同一性の程度を決定するために植物をアッセイするための有用なツールとして機能する（米国特許第６，２０７，３６７号）。これらのマーカーは表現型との関連を判定する基準を形成し、遺伝的獲得量を押し上げるのに使用することができる。本発明の方法の特定の実施形態では、多型の核酸を用いて、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物にて病害抵抗性に関連する遺伝子型を検出し、病害抵抗性に関連する遺伝子型を持つＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を同定し、病害抵抗性に関連する遺伝子型を持つＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を選抜することができる。本発明の方法の特定の実施形態では、多型の核酸を用いて、そのゲノムに病害抵抗性に関連する遺伝子移入された遺伝子座を含むＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を生産することができる。本発明の特定の実施形態では、多型の核酸を用いて、病害抵抗性に関連する遺伝子座を含む子孫Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を育種することができる。

遺伝的マーカーは、「優性」または「共優性」マーカーを含み得る。「共優性の」マーカーは２つ以上の対立遺伝子（二倍体個体当たり２つ）の存在を明らかにする。「優性」は１つの対立遺伝子のみの存在を明らかにする。二倍体遺伝子座での双方の対立遺伝子、または三倍体もしくは四倍体の遺伝子座における複数の対立遺伝子の存在が容易に検出できるように、マーカーは共優性の様式で遺伝することが好ましく、それらは環境変異を含まず、すなわち、その遺伝率は１である。マーカーの遺伝子型は通常、二倍体生物における各遺伝子座で２つのマーカー対立遺伝子を含む。各遺伝子座のマーカー対立遺伝子の組成は、ホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかであり得る。ホモ接合性は、遺伝子座の双方の対立遺伝子が同一のヌクレオチド配列によって特徴付けられる状態である。ヘテロ接合性は遺伝子座における対立遺伝子の異なる状態を指す。

遺伝子多型の存在または非存在を判定するための（すなわち、遺伝子型同定のための）核酸ベースの解析を、同定、選抜、遺伝子移入などのための育種プログラムで使用することができる。遺伝子多型の解析のための多種多様な遺伝子マーカーが利用でき、当業者に既知である。解析は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物における病害抵抗性に連鎖したもしくは関連した遺伝子マーカーを含むもしくは遺伝子マーカーに連鎖した遺伝子、遺伝子の一部、ＱＴＬ、対立遺伝子またはゲノム領域の選抜に使用され得る。

本明細書で使用する場合、核酸解析法には、ＰＣＲベースの検出法（例えば、ＴａｑＭａｎアッセイ）、マイクロアレイ法、質量分析ベースの方法、及び／または全ゲノム配列決定を含む核酸配列決定法が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡの試料中の多型部位の検出は、核酸増幅法の使用を通じて容易になり得る。そのような方法は、多型部位にまたがる、またはその部位及びその遠位もしくは近位のいずれかに位置する配列を含むポリヌクレオチドの濃度を特異的に増加させる。そのような増幅された分子は、ゲル電気泳動、蛍光検出法、または他の手段によって容易に検出することができる。

そのような増幅を達成する方法の１つは、その二本鎖形態での多型を定義する近位配列にハイブリダイズできるプライマー対を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３－２７３，１９８６、欧州特許第５０，４２４号、欧州特許第８４，７９６号、欧州特許第２５８，０１７号、欧州特許第２３７，３６２号、欧州特許第２０１，１８４号、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第４，５８２，７８８号、及び米国特許第４，６８３，１９４号）を利用する。質量分析に基づいてＤＮＡをタイピングする方法も使用することができる。そのような方法は米国特許第６，６１３，５０９号及び同第６，５０３，７１０号ならびにそれらの中に見出される文献にて開示されている。

ＤＮＡ配列における多型は、そのすべてが全体として本明細書に参照により組み込まれる米国特許第５，４６８，６１３号、同第５，２１７，８６３号；同第５，２１０，０１５号；同第５，８７６，９３０号；同第６，０３０，７８７号；同第６，００４，７４４号；同第６，０１３，４３１号；同第５，５９５，８９０号；同第５，７６２，８７６号；同第５，９４５，２８３号；同第５，４６８，６１３号；同第６，０９０，５５８号；同第５，８００，９４４号；同第５，６１６，４６４号；同第７，３１２，０３９号；同第７，２３８，４７６号；同第７，２９７，４８５号；同第７，２８２，３５５号；同第７，２７０，９８１号及び同第７，２５０，２５２号に開示されているものを含むが、これらに限定されない当該技術で既知の種々の有効な方法によって検出またはタイピングすることができる。しかしながら、本発明の組成物及び方法は、任意の多型タイピング法と併せて使用して、ゲノムＤＮＡ試料における多型をタイピングすることができる。使用されるこれらのゲノムＤＮＡ試料には、植物から直接単離したゲノムＤＮＡ、クローニングしたゲノムＤＮＡ、または増幅したゲノムＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。

例えば、ＤＮＡ配列における多型は、米国特許第５，４６８，６１３号及び同第５，２１７，８６３号で開示されているように、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブへのハイブリダイゼーションによって検出することができる。米国特許第５，４６８，６１３号は、ヌクレオチド変異を含む配列を増幅し、膜上にスポットし、標識した配列特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて処置するプロセスによって、核酸配列における単一のまたは複数のヌクレオチド変異を核酸中に検出することができる対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを開示している。

標的核酸配列はまた、例えば、目的の配列を増幅し、プローブにハイブリダイズして、続いてライゲーションによってプローブの標識された部分を検出する、米国特許第５，８００，９４４号で開示されたようなプローブライゲーション法によっても検出することができる。

マイクロアレイを使用して多型検出することもでき、この場合、オリゴヌクレオチドプローブのセットをオーバーラップするようにアセンブリングして単一の配列を表し、これにより、標的配列の１点における差異が部分的なプローブのハイブリダイゼーションを生じさせる（Ｂｏｒｅｖｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３：５１３－５２３，２００３、Ｃｕｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２１：３８５２－３８５８，２００５）。任意の１つのマイクロアレイ上に、遺伝子及び／または非コード領域を表し得る複数の標的配列が存在することが予想され、各標的配列は単一のプローブによってではなく、一連のオーバーラップするオリゴヌクレオチドによって表される。このプラットフォームは、複数の多型の高スループットなスクリーニングを提供する。マイクロアレイベースの方法による標的配列のタイピングは米国特許第６，７９９，１２２号、同第６，９１３，８７９号、及び同第６，９９６，４７６号にて開示されている。

ＳＮＰ及びインデルを検出する他の方法としては、一塩基伸長（ＳＢＥ）法が挙げられる。ＳＢＥ法の例としては、米国特許第６，００４，７４４号、同第６，０１３，４３１号、同第５，５９５，８９０号、同第５，７６２，８７６号、及び同第５，９４５，２８３号にて開示されたものが挙げられるが、これらに限定されない。

多型を検出する別の方法では、オリゴヌクレオチドプローブがプローブの５’末端及び３’末端に共有結合した５’蛍光レポーター色素及び３’クエンチャー色素を有する米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，８７６，９３０号、及び同第６，０３０，７８７号にて開示された方法によってＳＮＰ及びインデルを検出することができる。プローブがインタクトである場合、レポーター色素の消光色素への近接は、例えば、Ｆｏｒｓｔｅｒ型のエネルギー移動によってレポーター色素蛍光の抑制を生じる。ＰＣＲの間、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、多型に隣接する標的ＤＮＡの特異的配列にハイブリダイズし、一方でハイブリダイゼーションプローブは、増幅されたＰＣＲ産物内の多型含有配列にハイブリダイズする。その後のＰＣＲサイクルでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼがプローブを切断してレポーター色素をクエンチャー色素から分離させることで、レポーターの蛍光の増加が生じる。

別の実施形態では、１つ以上の目的の遺伝子座は、核酸配列決定技術を使用して直接配列決定され得る。核酸配列決定方法は、当該技術分野で既知であり、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ， ＣＴ）、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及びＶｉｓｉＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によって提供される技術が挙げられる。そのような核酸配列決定技術は、並列ビーズアレイ、ライゲーションによる配列決定、キャピラリー電気泳動、電子マイクロチップ、「バイオチップ」、マイクロアレイ、並列マイクロチップ及び単一分子アレイのなどの方式を含む。

定義
以下の定義は、本発明をより明確に定義し本発明の実施において当業者を導くために提供される。特に明記しない限り、用語は関連分野の当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。

本明細書で使用する場合、「植物」という用語には、植物細胞、植物プロトプラスト、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を再生することができる組織培養物の植物細胞、植物カルス、植物凝集塊、及び植物または植物の一部、例えば、花粉、花、花蕾、頭部、種子、葉、茎などにおいてインタクトである植物細胞が含まれる。

本明細書で使用する場合、「集団」という用語は、共通の親起源を共有する植物の遺伝的に異質なコレクションを意味する。

本明細書で使用する場合、「品種」及び「栽培品種」という用語は、それらの遺伝的系統及び性能によって、同一種内の他の品種と識別できる類似の植物の群を意味する。

本明細書中で使用する場合、「対立遺伝子」は、染色体上の所与の遺伝子座におけるゲノム配列の２つ以上の代替形態のうちの１つを指す。

「量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）」は、表現型の表現度に影響を与える少なくとも第１の対立遺伝子をコードする染色体の位置である。

本明細書で使用する場合、「マーカー」は、生物間の識別に使用できる検出可能な特性を意味する。そのような特性の例には、遺伝子マーカー、生化学マーカー、代謝産物、形態学的特徴、及び農学的特徴が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する場合、「表現型」という用語は、遺伝子発現によって影響を受け得る細胞または生物の検出可能な特徴を意味する。

本明細書で使用する場合、「遺伝子型」という用語は、植物の特定の対立遺伝子構成を意味する。

本明細書で使用する場合、「エリート」または「栽培」品種は、優れた農業成績のための育種及び選抜から生じた任意の植物または品種を意味する。「エリート植物」は、エリート品種に属する植物を指す。多数のエリート品種が利用でき、それらはＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ育種の当業者に既知である。「エリート集団」は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ系統などの所与の作物種の農学的に優れた遺伝子型に関して、現況技術を代表するために使用することができるエリート個体または系統の種別である。同様に、「エリート遺伝資源」または遺伝資源のエリート系統は農学的に優れた遺伝資源である。

本明細書で使用する場合、「遺伝子移入された」という用語は遺伝子座に関して使用するとき、戻し交配などを介して新しい遺伝的背景に導入された遺伝子座を指す。遺伝子座の遺伝子移入は、植物育種法及び／または分子遺伝学的手法を介して達成することができる。そのような分子遺伝学的手法としてはマーカー利用選抜が挙げられるが、これに限定されない。

本明細書で使用される場合、染色体セグメントの文脈における用語「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」または「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ）」は、例えば、減数分裂中の相同染色体間の組換え事象の結果として、天然に見出されない配置で１つ以上の遺伝子座を含む組換えＤＮＡ配列を指す。

本明細書で使用する場合、「連鎖した」という用語は、核酸マーカー及び／またはゲノム領域の文脈で使用されるとき、マーカー及び／またはゲノム領域が減数分裂で一緒に分離する傾向にあるように、それらが同じ連鎖群または染色体に位置することを意味する。

本明細書で使用する場合、「抵抗性遺伝子座」は、病害に対する抵抗性または耐性に関連する遺伝子座を意味する。例えば、本発明による抵抗性遺伝子座は、一実施形態では、べと病に対する植物の花蕾または頭部の抵抗性または感受性を制御し得る。

本明細書で使用する場合、「抵抗性対立遺伝子」は、病害に対する抵抗性または耐性に関連する核酸配列を意味する。

本明細書で使用する場合、病害状態に対する植物における「抵抗性」または「改善された抵抗性」は、より抵抗性に劣りより「感受性」である植物と比較して、収量、生存性及び／または他の関連する農学的基準に関して、植物が病害状態による影響を受けにくいことを示す。抵抗性は相対的な用語であり、「抵抗性の」植物は類似の病害状態で生育する異なる（抵抗性に劣る）植物と比較して、病害状態で生き延び、及び／または良好な収量を生産することを示す。当該技術で使用される場合、病害「耐性」は病害「抵抗性」と互換的に使用されることがある。当業者は、病害状態に対する植物の抵抗性は広く変化し、より抵抗性のある、またはより抵抗性に劣る表現型のスペクトルを表し得ることを理解するであろう。しかしながら、単純な観察によって当業者は一般に、病害状態下の異なる植物、植物系統または植物科の相対的な抵抗性または感受性を判定することができ、さらに「抵抗性」の表現型の段階的変化も認識するであろう。

「約」という用語は、値を決定するのに使用されている装置または方法に関して、その値が誤差の標準偏差を含むことを指し示すために使用される。特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すよう明示的に示されない限り、または選択肢が相互排他的でない限り「及び／または」を意味するよう使用されるが、本開示は、唯一の選択肢及び「及び／または」を指す定義を支持する。特許請求の範囲において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または他のオープンランゲージと組み合わせて使用される場合、「ａ」及び「ａｎ」という語は、特に明記されていない限り、「１つ以上」を表す。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は非制限の連結動詞である。これら動詞の１つ以上のあらゆる形態または時制、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」もまた、非制限である。例えば、１つ以上のステップを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」いかなる方法も、それらの１つ以上のステップのみを有することに限定されず、列挙されていない他のステップも包含する。同様に、１つ以上の形質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」いかなる植物も、それらの１つ以上の形質のみを有することに限定されず、列挙されていない他の形質も包含する。

ＶＩ．寄託情報
本明細書に記載されているような第３染色体上の２つのべと病抵抗性ＱＴＬを含むカリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）系統ＭＹＣＯＣＬＰのａ２４－２９ｔの最小２５００の種子の寄託を行った。寄託は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０－２２０９ ＵＳＡで行った。寄託はＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２４３３８を割り当てられ、寄託日は２０１７年７月２８日であった。寄託へのアクセスは、本出願の係属中、その権利を有する者が請求に基づいて利用可能である。寄託は公的な寄託機関であるＡＴＣＣ寄託機関において、３０年間、または直近の請求から５年間、または特許の実施可能期間のうちいずれか長い方の期間維持され、この期間中に生育不能である場合には差し替えられる。本出願人は、本特許または植物品種保護法（７Ｕ．Ｓ．Ｃ．２３２１以下参照）を含む品種保護のあらゆる他の形態の下で許諾されたその権利の一切の侵害を放棄しない。

実施例１
べと病抵抗性対立遺伝子の同定及びマッピング
抵抗性の供給源であるＭＹＣＯＣＬＰをＡＴＣＣに寄託し、受入番号ＰＴＡ－１２４３３８が割り当てられた。ＭｙｃｏＣＬＰをべと病感受性のブリリアントホワイトカリフラワー系統ＢＳＣＬＰＮと交配させて、マッピング集団を作成した。得られたＦ１植物を、倍加半数体集団の発育に使用した。合計で１９８の第１世代倍加半数体（ＤＨ）系統を発育し、感受性及び抵抗性の対照として親系統と共に試験評価及び遺伝子型マッピングに使用した。

このマッピング集団のべと病抵抗性を、圃場場所で決定した。各試験には３回の反復が含まれ、各反復には、ＤＨ系統ごとに１０個体の植物を用いた。これらの試験では、植物への感染は、天然のべと病単離菌によるものであった。変動し得る自然感染率を予測するために、また異なる系統間の異なる出穂率に対応するために、時期をずらして播種して試験した。このマッピング集団では、環境条件に依存して異なる系統間で頭部の変異に約１ヶ月の差異が観察された。第１の実験では、４月及び５月の６週間にわたる６日の播種日、ならびに６月の６週間にわたる６日の栽植日を用いて、時期をずらした６回の試験を実施した。この実験の評価を８月から１１月にかけて行った。第２の実験では、２つの場所に同時に栽植して試験し、場所ごとに３回試験した。これらの試験のために、４月及び５月の３週間にわたる３日の播種日、ならびに６月の３週間にわたるそれぞれの栽植日を用いて、材料を栽植した。これらの試験を、８月から１１月にかけて評価した。

べと病の感染率を決定するため、栽培者が通常作物を収穫する１週間後、すなわち栽植後３～４ヶ月の間に成熟した花蕾を評価した。花蕾を収穫して数回スライスして開き、存在するべと病の程度を判定した。続いて各植物を、１（無症状）、５（多少の症状）、または９（複数の感染部位及び／または花蕾の１／３超が感染）によってスコア付けした。各系統について、２つの実験的試験の結果を組み合わせてべと病のスコアを最小二乗平均に集約した。

各ＤＨ系統の遺伝子型を同定し、１ｃＭのマッピング刻み幅のインターバルマッピングを用いたＭａｐＱＴＬ５によってＱＴＬ解析を実施した。それぞれ１０００回の並べ替え、及びｐ＝０．０５の閾値を用いた並べ替え検定によって有意閾値を決定した。ＱＴＬマッピング解析では、カリフラワーの花蕾におけるべと病抵抗性の周囲の表現型変異の合わせて４８．１％を説明する、第３染色体上の２つのＱＴＬを同定した（図１）。

第１のＱＴＬ（マーカーＭ１３～Ｍ２０の間）のサイズを削減するために、ＱＴＬマッピングに用いたものと同じ親間で交配したＦ２世代において、隣接マーカーＭ１３及びＭ２０を用いて組換え体を同定した。これらの組換え体を、Ｆ３世代の組換え切断点に対してホモ接合体とした。Ｆ４世代の組換え体ファミリーを、べと病抵抗性の試験において栽植した。試験を６回の時期をずらした播種及び栽植で反復し、２つの場所にわたり栽植した。これらの組換え体ファミリーの各々について抵抗性の最小二乗平均レベルを、Ｍ１３とＭ２０との間のそれらのそれぞれの組換え切断点にアラインメントすることによって、本発明者らは、マーカーＭ１９とＭ２０との間の領域が、マッピングされたＱＴＬによって伝達された抵抗性をもたらすことを同定した。

本明細書に記載のマーカーの配列を表１に示す。

本明細書で開示され、請求されている組成物及び／または方法のすべては、本開示の観点で過度の実験を行うことなく行い、実行することができる。本発明の組成物及び方法は好ましい実施形態に関して記載されてきたが、本発明の概念、趣旨、または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている組成物及び／または方法に対して及びステップにおいてまたは方法のステップの順序において変形が適用されてもよいことが、当業者には明らかであろう。より具体的には、同一または類似の結果が達成される限り、化学的及び生理学的の両方に関連する特定の作用物質が、本明細書に記載される作用物質に置換されてもよいことが明らかであろう。当業者に明らかなすべてのこうした類似の置換及び改変は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨、範囲、及び概念の範囲内にあるとみなされる。

Claims (28)

1. 栽培品種のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物であって、
   第３染色体上に第１の遺伝子移入された対立遺伝子または第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含み、
   前記第１の遺伝子移入された対立遺伝子または前記第２の遺伝子移入された対立遺伝子が、前記植物の花蕾または頭部に、前記第１の遺伝子移入された対立遺伝子も前記第２の遺伝子移入された対立遺伝子も含まない植物と比較して、べと病に対する増加した抵抗性を付与し、
   前記第１の遺伝子移入された対立遺伝子が、マーカー遺伝子座Ｍ１９（配列番号２）およびマーカー遺伝子座Ｍ２０（配列番号３）からなる群より選択されるマーカー遺伝子座を含み、
   前記第２の遺伝子移入された対立遺伝子が、マーカー遺伝子座Ｍ３１（配列番号４）、マーカー遺伝子座Ｍ３３（配列番号５）、マーカー遺伝子座Ｍ３４（配列番号６）、マーカー遺伝子座Ｍ３５（配列番号７）、マーカー遺伝子座Ｍ３６（配列番号８）、マーカー遺伝子座Ｍ３７（配列番号９）、マーカー遺伝子座Ｍ３８（配列番号１０）、マーカー遺伝子座Ｍ３９（配列番号１１）、マーカー遺伝子座Ｍ４０（配列番号１２）、マーカー遺伝子座Ｍ４１（配列番号１３）、マーカー遺伝子座Ｍ４２（配列番号１４）、マーカー遺伝子座Ｍ４３（配列番号１５）およびマーカー遺伝子座Ｍ４４（配列番号１６）からなる群より選択されるマーカー遺伝子座を含み、
   前記第１の遺伝子移入された対立遺伝子および前記第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含む種子の試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２４３３８の下で寄託されている、前記植物。
2. 第３染色体上に第１の遺伝子移入された対立遺伝子及び第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含み、
   前記第１の遺伝子移入された対立遺伝子及び前記第２の遺伝子移入された対立遺伝子が、前記植物の花蕾または頭部に、前記対立遺伝子を含まない植物と比較して、べと病に対する増加した抵抗性を付与する、請求項１に記載のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物。
3. 前記第１の遺伝子移入された対立遺伝子が、前記植物のゲノム中で、第３染色体上のマーカー遺伝子座Ｍ１９（配列番号２）及びマーカー遺伝子座Ｍ２０（配列番号３）に隣接し、
   前記第２の遺伝子移入された対立遺伝子が、前記植物のゲノム中で、第３染色体上のマーカー遺伝子座Ｍ３１（配列番号４）及びマーカー遺伝子座Ｍ４４（配列番号１６）に隣接する、請求項１に記載のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物。
4. 前記Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物が、ブロッコリー、カリフラワー、発芽ブロッコリー、芽キャベツ、白キャベツ、赤キャベツ、サボイキャベツ、カーリーケールキャベツ、カブカンラン、またはポルトガルキャベツ植物である、請求項１に記載のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物。
5. 前記植物が、前記第１の遺伝子移入された対立遺伝子または前記第２の遺伝子移入された対立遺伝子に対してホモ接合性である、請求項１に記載のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物。
6. 請求項１に記載のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を生産する種子。
7. 請求項１に記載のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物の植物部位。
8. 前記植物部位が、細胞、種子、根、茎、葉、果実、花、花蕾、頭部または花粉である、請求項７に記載の植物部位。
9. マーカーＭ１９（配列番号２）及びマーカーＭ２０（配列番号３）に隣接するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ由来の第３染色体上の第１の染色体セグメントと、
   マーカーＭ３１（配列番号４）及びマーカーＭ４４（配列番号１６）に隣接するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ由来の第３染色体上の第２の染色体セグメント
   とを含み、
   前記第１の染色体セグメント及び前記第２の染色体セグメントを含む種子の試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２４３３８の下で寄託されている、遺伝子移入断片。
10. 前記断片が、べと病に対する増加した抵抗性を付与する、請求項９に記載の遺伝子移入断片。
11. べと病に対する抵抗性が改善された花蕾または頭部を有するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物の栽培品種を生産するための方法であって、
    遺伝子移入を欠く植物と比較してべと病に対する改善された抵抗性を付与するＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａの第３染色体由来の第１の染色体セグメントまたは第２の染色体セグメントを、前記品種に遺伝子移入することを含み、
    前記第１の染色体セグメントが、マーカー遺伝子座Ｍ１９（配列番号２）およびマーカー遺伝子座Ｍ２０（配列番号３）からなる群より選択されるマーカー遺伝子座を含み、
    前記第２の染色体セグメントが、マーカー遺伝子座Ｍ３１（配列番号４）、マーカー遺伝子座Ｍ３３（配列番号５）、マーカー遺伝子座Ｍ３４（配列番号６）、マーカー遺伝子座Ｍ３５（配列番号７）、マーカー遺伝子座Ｍ３６（配列番号８）、マーカー遺伝子座Ｍ３７（配列番号９）、マーカー遺伝子座Ｍ３８（配列番号１０）、マーカー遺伝子座Ｍ３９（配列番号１１）、マーカー遺伝子座Ｍ４０（配列番号１２）、マーカー遺伝子座Ｍ４１（配列番号１３）、マーカー遺伝子座Ｍ４２（配列番号１４）、マーカー遺伝子座Ｍ４３（配列番号１５）およびマーカー遺伝子座Ｍ４４（配列番号１６）からなる群より選択されるマーカー遺伝子座を含み、
    前記第１の染色体セグメント及び前記第２の染色体セグメントを含む種子の試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２４３３８の下で寄託されている、前記方法。
12. 前記遺伝子移入することが、
    ａ）前記第１の染色体セグメントまたは前記第２の染色体セグメントを含む植物を、１つ以上の子孫植物を生産するために、それ自体とまたは異なる遺伝子型の第２のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物と交配することと、
    ｂ）前記染色体セグメントを含む子孫植物を選抜することと
    を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 子孫植物を選抜することが、少なくとも、
    マーカーＭ１９（配列番号２）及びマーカーＭ２０（配列番号３）に隣接する第１の対立遺伝子、または
    マーカーＭ３１（配列番号４）及びマーカーＭ４４（配列番号１６）に隣接する第２の対立遺伝子
    を検出することを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記品種が、ブロッコリー、カリフラワー、発芽ブロッコリー、芽キャベツ、白キャベツ、赤キャベツ、サボイキャベツ、カーリーケールキャベツ、カブカンランまたはポルトガルキャベツの植物品種である、請求項１１に記載の方法。
15. 前記子孫植物がＦ２～Ｆ６子孫植物である、請求項１２に記載の方法。
16. 前記交配することが戻し交配を含む、請求項１２に記載の方法。
17. 前記戻し交配が２世代～７世代の戻し交配を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記交配することがマーカー利用選抜を含む、請求項１２に記載の方法。
19. 請求項１１に記載の方法によって生産されたＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物。
20. 食品または飼料を生産する方法であって、
    請求項１または１９に記載の植物またはその部位を得ることと、
    前記植物または前記部位から前記食品または前記飼料を生産することと
    を含む、前記方法。
21. ａ）１つ以上の子孫植物を生産するために、請求項１に記載のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を、それ自体とまたは異なる遺伝子型の第２のＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物と交配することと、
    ｂ）前記第１の遺伝子移入された対立遺伝子または前記第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含む子孫植物を選抜することと
    を含む、べと病抵抗性を示すＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物を選抜する方法。
22. 前記子孫植物を選抜することが、前記第１の遺伝子移入された対立遺伝子または前記第２の遺伝子移入された対立遺伝子に遺伝的に連鎖した遺伝子マーカーを同定することを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記子孫植物を選抜することが、
    ａ）第３染色体上のマーカー遺伝子座Ｍ１９（配列番号２）とマーカー遺伝子座Ｍ２０（配列番号３）との間のゲノム領域内の遺伝子マーカーもしくはゲノム領域に遺伝的に連鎖した遺伝子マーカーを同定すること、または
    ｂ）第３染色体上のマーカー遺伝子座Ｍ３１（配列番号４）とマーカー遺伝子座Ｍ４４（配列番号１６）との間のゲノム領域内の遺伝子マーカーもしくはゲノム領域に遺伝的に連鎖した遺伝子マーカーを同定すること
    を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 子孫植物を選抜することがさらに、
    マーカー遺伝子座Ｍ３３（配列番号５）、マーカー遺伝子座Ｍ３４（配列番号６）、マーカー遺伝子座Ｍ３５（配列番号７）、マーカー遺伝子座Ｍ３６（配列番号８）、マーカー遺伝子座Ｍ３７（配列番号９）、マーカー遺伝子座Ｍ３８（配列番号１０）、マーカー遺伝子座Ｍ３９（配列番号１１）、マーカー遺伝子座Ｍ４０（配列番号１２）、マーカー遺伝子座Ｍ４１（配列番号１３）、マーカー遺伝子座Ｍ４２（配列番号１４）、及びマーカー遺伝子座Ｍ４３（配列番号１５）からなる群から選択される遺伝子座において少なくとも１つの遺伝子多型を検出することを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記子孫植物がＦ２～Ｆ６子孫植物である、請求項２１に記載の方法。
26. 前記子孫植物を生産することが戻し交配を含む、請求項２１に記載の方法。
27. 戻し交配が２世代～７世代の戻し交配を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 請求項２１に記載の方法によって得られる、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ植物であって、前記第１の遺伝子移入された対立遺伝子または前記第２の遺伝子移入された対立遺伝子を含む、植物。