JP7476067B2 - 撮像装置および撮像方法 - Google Patents

Description

この発明は、励起光を入射させた撮像対象物から出射される蛍光を受光して撮像を行う技術に関し、特に撮像対象物を走査しつつ撮像を行う技術に関するものである。

例えば培養された細胞や病理組織の分析等を行う目的で、これらを撮像して得られた画像データを解析することが行われる。撮像すべき領域が撮像視野に対し十分に広い場合には、ＣＣＤカメラ等の撮像素子と撮像対象物とを相対的に移動させる、いわゆる走査移動を行いながら撮像対象物の全体を撮像することが行われる。

例えば特許文献１に記載の撮像装置は、試料を保持するウェルプレートに対し撮像ユニットを走査移動させながら撮像を行うことで、ウェルプレートに設けられた複数のウェルそれぞれの画像を一括取得する。このように撮像素子と撮像対象物とを走査移動させながら間欠的な撮像を行うことで、広い範囲を高速に撮像することができる。より具体的には、上記のように走査移動を行いつつ、照明光の間欠的な点灯とこれに同期した撮像とを行う。例えば明視野撮像であれば、１回の照明光の照射時間は数十マイクロ秒程度とすることができる。

一方、撮像対象物に例えば紫外線等の励起光を照射し、これにより撮像対象物から励起された蛍光を受光する蛍光撮像においては、撮像対象物へのダメージを抑えつつ蛍光を励起させるのに十分な露光量を与えるために、励起光の照射時間はより長く、例えばミリ秒単位となる。

このように照明光または励起光の照射時間や露光時間が長くなると、照射中における撮像対象物の走査移動量が大きくなり、撮像された画像にボケを生じることになる。また照射時間や露光時間が短くても、走査移動速度が大きくなれば同様の現象が生じる。この問題に対応するため、特許文献２に記載の技術では、複数回の露光で撮像された画像に対し、露光中の走査移動量を加味した画像処理を行うことで画像ボケの低減が図られている。

特開２０２０－０５２１１９号公報 米国特許出願公開第２０１７／０３３０３１０号

上記従来技術のような画像処理による方法では、処理に時間がかかり、特に撮像範囲が広い場合には実効的な撮像速度が低下してしまう。画像のボケをハードウェアで解決する方法としては、例えば撮像素子としてＴＤＩ（Time Delay Integration）センサを用いることが考えられる。しかしながら、ＴＤＩセンサは高価であり、またエリアセンサとしての用途に適したものがないため汎用性は高くない。また露光やフォーカス調整に時間がかかってしまうため、高速撮像という目的からは実用的とは言い難い。

この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、撮像対象物を走査しつつ蛍光撮像を行う技術において、比較的簡単な構成でありながら、広い撮像範囲を高速に撮像することのできる技術を提供することを目的とする。

この発明に係る撮像装置の一の態様は、上記目的を達成するため、撮像対象物に励起光を入射させて前記撮像対象物から出射される蛍光を受光し、前記撮像対象物を撮像する撮像部と、前記撮像対象物に対し相対的に、前記撮像部を前記励起光の入射方向と交わる方向に一定速度で走査移動させる走査移動機構とを備えている。ここで、前記撮像部は、前記励起光を出射する励起光源と、前記撮像対象物から出射される蛍光を間欠的に受光する受光素子と、前記撮像対象物の一点から前記受光素子に至る蛍光の光路が前記走査移動に伴って移動する方向を追従方向として、前記追従方向およびその逆方向に前記受光素子を所定範囲内で移動可能な追従移動機構とを有している。そして、前記受光素子は、二次元イメージセンサであり、前記追従移動機構は、前記受光素子が前記蛍光を受光する期間、前記受光素子を、所定の初期位置から前記追従方向に沿って前記走査移動速度に対応する速度で移動させることで、前記撮像対象物が前記撮像部に結像する結像位置の移動に前記受光素子を追従させ、前記受光素子が前記蛍光を受光しない期間、前記受光素子を前記逆方向に移動させて前記初期位置に戻す。

また、この発明に係る撮像方法の一の態様は、撮像対象物に励起光を入射させ、前記撮像対象物から出射される蛍光を受光することで前記撮像対象物を撮像する撮像方法であって、上記目的を達成するため、励起光源および二次元イメージセンサである受光素子を有する撮像部と前記撮像対象物とを相対的に、前記励起光の入射方向と交わる方向に一定速度で走査移動させ、前記撮像対象物の一点から前記受光素子に至る蛍光の光路が前記走査移動に伴って移動する方向を追従方向として、前記追従方向およびその逆方向に前記受光素子を所定範囲内で往復移動させながら、前記受光素子が前記追従方向に移動している期間に前記撮像対象物からの蛍光を受光し、前記受光素子の前記追従方向への移動では、前記受光素子を前記追従方向に沿って前記走査移動速度に対応する速度で移動させることで、前記撮像対象物が前記撮像部に結像する結像位置の移動に前記受光素子を追従させる。

このように構成された発明では、撮像を行う間、撮像対象物の走査移動に応じて受光素子が移動する。撮像対象物と受光素子とが相対的に走査移動される場合、露光時間が長いと撮像対象物から出射される光の受光素子への入射位置が移動することにより画像のボケが生じる。蛍光撮像の場合、露光時間が長くなることは蛍光発生の原理上避けられない。そこで、この発明では、撮像対象物の一点から出射される蛍光の入射位置に移動に追従するように受光素子を移動させる。こうすることで、受光の期間においては受光素子と撮像対象物との間の相対移動をなくすことが可能である。これにより、画像のボケ発生を防止することができる。なお、画像のボケが許容範囲内に抑えられる限りにおいて、受光素子と撮像対象物との相対移動速度は完全にゼロとならなくてもよい。

受光素子は、間欠的な撮像において受光を行わない期間に最初の位置に戻される。これにより、次の受光期間では、先の受光の期間と同じ位置から受光を開始することができる。すなわち、受光素子は、撮像対象物に対し、連続した受光の期間中には撮像対象物の相対移動に応じて移動しつつ、全体としては撮像対象物に対する相対位置を順次変えてゆく。

受光素子の追従移動に必要とされる移動量は、受光期間中に撮像対象物が相対移動する移動量と同程度であり、非常に小さい。例えば蛍光撮像の一般的な数値として受光期間の長さを１ミリ秒、走査移動速度を毎秒１０ミリメートルとすると、必要とされる移動量は１０マイクロメートル程度である。したがって、一般的なアクチュエータを用いて高速での移動を実現することは十分に可能である。

なお、ここでいう「受光素子が蛍光を受光する期間、受光しない期間」とは、受光素子が蛍光を信号光として有効に受光する期間およびこれを受光しない期間を意味する。例えば受光素子側で受光・非受光を能動的に選択する方法としては、励起光源が連続的に点灯した状態で、適宜のシャッタ機構の開閉により受光素子への蛍光の入射を間欠的なものとする方法がある。また例えば給電を停止するなど受光素子の稼働を一時的に停止させる、あるいは、一定期間受光素子からの信号の読み出しを行わないもしくは読み出した信号を後の処理に使用しない等の方法により、実質的に受光素子が受光を行わない期間を設けることができる。

一方、励起光源側で励起光の照射を間欠的に行うことで、生試料から蛍光が出射されない期間を創出し、結果として蛍光が受光素子に受光される期間とされない期間とが生じるようにする方法がある。例えば光源の点灯自体を間欠的に行う場合や、連続的に点灯する光源とその出射光を一時的に遮蔽するシャッタ機構とを組み合わせた場合である。これらの場合には、受光素子自体は常時受光可能な状態であっても、受光すべき蛍光が受光素子に入射しないことで、受光が行われない。細胞等の生試料が光照射によりダメージを受ける光毒性を考慮すると、ダメージ低減のためにはこのように生試料への励起光の入射が間欠的に行われる方法がより好ましいといえる。

上記のように、本発明によれば、受光素子が受光を行う間、撮像対象物から入射する光の入射位置の移動に追従させて受光素子を移動させる。これにより、画像のボケを抑えつつ、広い撮像範囲を高速で撮像することが可能となる。

本発明に係る撮像装置の一実施形態を示す図である。 間欠撮像の原理を示す図である。 点灯パルス幅に起因する画像のボケを説明する図である。 本実施形態における撮像動作を示すタイミングチャートである。 明視野撮像と蛍光撮像とを同時処理する場合の動作を示すタイミングチャートである。

図１は本発明に係る撮像装置の一実施形態を示す図である。具体的には、図１（ａ）はこの実施形態の撮像装置１の主要構成を模式的に示す図であり、図１（ｂ）は撮像装置１の電気的構成を示すブロック図である。図１（ａ）に示された座標軸において、ＸＹ平面は水平面であり、Ｚ方向が上下方向を表している。

撮像装置１は、試料容器Ｃに担持された生試料Ｓを撮像するための装置である。試料容器Ｃとしては例えば、ディッシュと呼ばれる平底の浅皿、培地を保持する窪み（ウェル）が複数配列されたウェルプレート、スライドガラス、フラスコ等各種のものを用いることができる。試料容器Ｃの底面は平坦かつ透明であることが望ましい。その材料としては、例えばガラス、透明樹脂等を用いることができる。

生試料Ｓとしては例えば、生体から採取された標本組織、人工的に培養された細胞やその集塊などを適用可能である。後述する蛍光撮像に供される生試料Ｓについては、予め蛍光試薬等を用いた染色（ラベリング）が行われる。必要に応じ、生試料Ｓは適宜の培地Ｍとともに試料容器Ｃに担持される。試料容器Ｃ内の培地Ｍ中に分布する生試料Ｓの全体が、本実施形態における撮像対象物となる。

撮像装置１は、主要な構成としてホルダ１０と、撮像ユニット２０と、走査移動機構３０と、制御ユニット５０とを備えている。ホルダ１０は、試料容器Ｃを、その下面を開放した状態で略水平姿勢に保持する。撮像ユニット２０は、ホルダ１０に保持された試料容器Ｃ内の試料Ｓを撮像する。走査移動機構３０は、ホルダ１０と撮像ユニット２０とを相対的に水平方向（この例ではＹ方向）に移動させることにより、ホルダ１０に保持された試料容器Ｃに対する撮像ユニット２０の走査移動を実現する。制御ユニット５０は、装置各部の動作を制御することで、後述する撮像処理を実行する。

撮像ユニット２０は、光源２１，２２と、撮像光学系２３と、焦点制御機構２４と、フィルタ交換機構２５と、撮像素子２６と、追従移動機構２７とを備えている。光源２１は、生試料Ｓにこれを明視野撮像するための可視照明光を照射するものであり、例えば白色ＬＥＤ（Light Emitting Diode）光源を用いることができる。光源２１はホルダ１０の上方に配置され、試料容器Ｃの上面側から生試料Ｓに照明光を照射する。

一方、光源２２は、生試料Ｓから蛍光を励起するための短波長の光、例えば紫外線を生試料Ｓに照射する。例えば紫外線レーザーを光源２２として用いることができる。生試料Ｓが複数種の蛍光試薬を投与されたものである場合には、互いに異なる複数の波長の励起光が光源２２から出射される。後述するように、光源２２から出射される励起光は撮像光学系２３を介して生試料Ｓに入射する。

撮像光学系２３は、対物レンズ２３１と、フィルタ部２３２と、反射ミラー２３３と、結像レンズ２３４とを備えている。対物レンズ２３１は、試料容器Ｃの下面から出射される光を集光する。対物レンズ２１は焦点調整機構２４に結合されており、焦点調整機構２４は対物レンズ２３１を上下方向に移動させることでその焦点位置を調整する。

フィルタ部２３２は、対物レンズ２３１により集光される光の光路上に配置されたダイクロイックミラー２３２ａと、光源２２とダイクロイックミラー２３２ａとの間に配置された励起フィルタ２３２ｂと、ダイクロイックミラー２３２ａと反射ミラー２３３との間に配置された蛍光フィルタ２３２ｃとを備える。ダイクロイックミラー２３２ａは、光源２２から出射される励起光を反射させて試料容器Ｃに入射させる一方、生試料Ｓから出射させる光を通過させる。励起フィルタ２３２ｂは、光源２２から出射される光のうち励起光として作用する特定の波長成分を選択的に通過させる。なお、光源２２が出射する光自体が特定の波長成分のみを含む場合には、励起フィルタは省略可能である。

蛍光フィルタ２３２ｃは、蛍光撮像時に生試料Ｓから出射される光のうち検出対象の蛍光を通過させる一方、それ以外の成分を吸収する。蛍光フィルタ２３２ｃとしては、発光波長が異なる複数種の蛍光試薬に対応して通過波長の異なる複数種が用意されており、フィルタ交換機構２５はこれらを切り替えて選択的に光路に配置する機能を有する。

光源２２から出射され励起フィルタ２３２ｂを通過した光は所定の波長成分のみを有する励起光となり、ダイクロイックミラー２３２ａで光路を折り返された励起光が対物レンズ２３１を介して生試料Ｓに入射する。励起光によって生試料Ｓから励起された蛍光は、対物レンズ２３１により集光され、蛍光フィルタ２３２ｃおよび光路折り返し用の反射ミラー２３３を介して結像レンズ２３４に入射する。結像レンズ２３４は、入射した光を集光して、撮像素子２６の受光面２６１に生試料Ｓの像を結像させる。

撮像素子２６は二次元イメージセンサ（エリアセンサ）であり、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device）センサやＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）センサ等を用いることができる。撮像素子２６は、結像レンズ２３４により受光面２６１に結像される生試料Ｓの二次元像を撮像する。より具体的には、試料容器Ｃの底面から見た培地Ｍのうち生試料Ｓを含む所定の撮像視野内の二次元画像を撮像し、その内容に応じた画像信号を出力する。

光源２１から白色照明光が照射されているとき、撮像素子２６は生試料Ｓの明視野画像を撮像することができる。また、光源２２から励起光が照射されているとき、撮像素子２６は生試料Ｓの蛍光画像を撮像することができる。

撮像素子２６は、追従移動機構２７により上下動可能に支持されている。より詳しくは、追従移動機構２７は、適宜のフレームに固定された固定部２７１と、固定部２７１に対し上下動自在に取り付けられた可動部２７２とを有しており、撮像素子２６は可動部２７２に取り付けられている。適宜のアクチュエータの作動により可動部２７２が上下動することで、撮像素子２６が上下動する。すなわち、撮像素子２６は、矢印方向Ｄｒ、Ｄｔに交互に移動することで、所定の可動範囲を往復移動する。

撮像素子２６に必要とされる可動範囲は、最大でも数百マイクロメートル程度である。また、必要とされる移動速度は、走査移動機構３０による走査移動速度と同程度であり、これは後述するように例えば１０ミリメートル／秒程度である。これより高速での移動を実現できることがより好ましい。このような移動を実現するためのアクチュエータとしては例えば、圧電素子、リニアモータ、ソレノイド等各種のものを適用可能である。

走査移動機構３０は、試料容器Ｃに対する撮像ユニット２０の走査移動を実現する。具体的には、試料容器Ｃを保持するホルダ１０および撮像ユニット２０の少なくとも一方を水平方向に移動させる。これにより実現されるホルダ１０と撮像ユニット２０との間の相対移動が、試料容器Ｃに対する撮像ユニット２０の走査移動に相当する。

ホルダ１０、撮像ユニット２０のいずれを移動させても技術的には等価である。試料容器Ｃ内の生試料Ｓに振動等の刺激を与えないという点では、ホルダ１０を固定し、撮像ユニット２０を移動させるのが現実的である。この場合、撮像ユニット２０のうち、少なくとも光源２１、撮像光学系２３および撮像素子２６を一体的に移動させる必要がある。なお、光源２１が試料容器２１の全面を均一に照明する場合には、光源２１を移動させる必要はない。

ただし以下では説明の便宜上、静止する撮像ユニット２０に対しホルダ１０が移動するものとして説明する。このときのホルダ１０の移動方向、つまり撮像ユニット２０から見た試料容器Ｃの走査移動方向を符号Ｄｓにより表すこととする。この例では走査移動方向Ｄｓは（＋Ｙ）方向である。

必要とされる走査移動速度は、例えば１０ミリメートル／秒程度である。このような移動を実現するための駆動機構としては、例えば、ボールねじ機構、リニアモータ、ベルトドライブ機構等、適宜のものを用いることができる。

制御ユニット５０は、上記した装置各部を制御する。この目的のために、制御ユニット５０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）５１、メモリ５２、ストレージ５３およびインターフェース（ＩＦ）５４を備えている。

ＣＰＵ５１は、予めストレージ５３に記憶されている制御プログラムを実行し装置各部に所定の動作を行わせることで各種の処理を実現する。メモリ５２は、ＣＰＵ５１の処理中に生成されるデータを一時的に記憶する。ストレージ５３は、ＣＰＵ５１が実行すべき制御プログラムや、撮像により得られた原画像データやこれを加工して得られる加工後の画像データを記憶保存する。

ＣＰＵ５１が制御プログラムを実行することで、各種の機能ブロックがソフトウェア的に実現される。このようにして実現される機能ブロックとしては、光源２１，２２を点灯制御する光源制御部、撮像素子２６による撮像処理を制御する撮像制御部、原画像データに対し各種の画像処理を実行して所望の画像を作成する画像処理部、および、焦点調整機構２４や走査移動機構３０等に設けられた可動機構を制御するメカ制御部等が含まれる。なお、これらの一部がハードウェア的に実現されてもよい。

インターフェース部５４は、ユーザからの操作入力の受け付けや、ユーザへの処理結果等の情報提示を行うユーザインターフェース機能のほか、通信回線を介して接続された外部装置との間でのデータ交換を行う機能を有する。ユーザインターフェース機能を実現するために、インターフェース部５４には、ユーザからの操作入力を受け付ける入力受付部５４１と、ユーザへのメッセージや処理結果などを表示出力する表示部５４２とが接続されている。

なお、制御ユニット５０は、パーソナルコンピュータやワークステーション等の汎用処理装置と同等のハードウェア構成を有している。そのため、これらの汎用処理装置に、後述する処理機能を実現するための制御プログラムを組み込んだものを制御ユニット５０としてもよい。すなわち、この撮像装置１の制御ユニット５０として、汎用のコンピュータを利用することが可能である。汎用処理装置を用いる場合、撮像装置１には、撮像ユニット２０等の各部を動作させるために必要最小限の制御機能が備わっていれば足りる。

以下、上記のように構成された撮像装置１における撮像処理について説明する。この撮像装置１は、１回の撮像で撮像視野に収まる領域よりも広い領域を撮像するために、試料容器Ｃに対し撮像ユニット２０を走査移動させながら撮像を行う。撮像素子２６は二次元イメージセンサであるため、撮像ユニット２０を走査移動させながら間欠的に撮像を行うことで、撮像対象領域を順次撮像してゆくことができる。

図２は間欠撮像の原理を示す図である。図２（ａ）に示すように、撮像対象領域Ｒｔのうち一部領域Ｒ１が撮像ユニット２０の撮像視野に収められた状態で１回の撮像を行った後、撮像視野を他の一部領域Ｒ２に移動させて撮像を行う。これを繰り返すことで、撮像視野よりも広い領域の全体を、いずれかの画像に収めることができる。それらの画像をつなぎ合わせることで、撮像対象領域Ｒｔの全体を１つの画像に含ませることができる。スムーズなつなぎ合わせのためには、隣り合う位置で撮像された画像同士が一部オーバーラップしていることが望ましい。

例えば、撮像対象領域Ｒｔに対し撮像視野を一定速度で走査移動させながら、一定の時間間隔で照明光を入射させてその都度撮像を行うことで、このような画像を取得することができる。例えば光源を一定の周期Ｔｃでパルス点灯させるようにすればよい。可視光を照明光とし、その一部を直接受光する明視野撮像や位相差撮像、暗視野撮像等においては、図２（ａ）に示すように、パルス点灯において必要とされる点灯時間Ｔｖは比較的短く、例えば数十マイクロ秒程度とすることができる。

一方、蛍光撮像においては、励起光を直接受光するのではなく、励起光によって励起された蛍光物質が放射する蛍光を受光する。このため、対象を励起するのに十分な露光量を確保する必要があり、図２（ｂ）に示すように、パルス点灯において必要な点灯時間Ｔｅは例えば１ミリ秒程度となる。このように点灯時間（パルス幅）が長くなると、得られる画像にボケが発生する。

図３は点灯パルス幅に起因する画像のボケを説明する図である。図において上段は照明光の点灯パルス幅を、中段は点灯期間中の光の経路を示す光路図を、下段は得られる画像の例を、それぞれ示している。なお、中段の図では、図を見やすくするために、反射ミラー２３３による光路の折り返しはないものとしている。この図は、上段に示されるパルス幅で照明光が入射したときに、撮像対象平面Ｓｔにある一点Ｐの像がどのような形状となるかを示している。

まず（ａ）欄に示されるように、比較的パルス幅の短い、つまり点灯時間の短い照明光が照射された場合について考える。照射開始時における点Ｐの像は、撮像素子２６の受光面２６１上の位置Ｑに現れる。矢印方向Ｄｓへの走査移動に伴って点Ｐは移動し、照射終了時には図に点Ｐ’として示される位置まで移動してきている。これに対応する像は受光面２６１上の位置Ｑ’に現れる。この間、連続的に照明光が照射されるため、撮像された画像においては、一点となるべき像が走査移動方向に対応する方向に長く延び、これが画像のボケの原因となる。図の（ｂ）欄に示すように、パルス幅が広くなると画像のボケもより大きくなる。

このことは、蛍光撮像に限らず、可視光照明下での撮像においても起こり得る。例えば位相差撮像や暗視野撮像において十分な光量を確保するために照明光の点灯時間を長くすると、同様の問題が生じ得る。このような問題を解消するためにも、以下の方法を適用可能である。

ここで、（ｃ）欄に示すように、走査移動による点Ｐの移動に伴う像の位置Ｑの移動に追従するように、その移動方向Ｄｔに沿って、かつその移動速度と等速で撮像素子２６を変位させたとする。そうすると、点Ｐが移動しても、それが結像する受光面２６１上の位置は変わらない。つまり、点Ｐの像は画像ボケのない鮮明な点として画像に記録される。このように、走査移動に伴う結像位置の移動に追従させるように撮像素子２６を移動させることで、画像ボケのない像を得ることが可能である。このような撮像素子２６の移動を、本明細書では「追従移動」と称する。また、走査移動に伴う結像位置の移動方向に沿った方向を「追従方向Ｄｔ」と称し、その反対方向を「逆方向Ｄｒ」と称する。

本実施形態では、上記のような追従移動を実現するために、撮像素子２６は追従移動機構２７により支持されている。以下、試料容器Ｃの走査移動、励起光の間欠照射および撮像素子２６の追従移動を組み合わせた本実施形態の撮像動作について説明する。なお、以下の説明のために、図３（ｃ）に示される撮像素子２６の位置のうち、実線で示される点灯開始時における位置を符号Ｐ１により、また点線で示される点灯終了時における位置を符号Ｐ２により表す。

図４は本実施形態における撮像動作を示すタイミングチャートである。前記したように、撮像ユニット２０に対し試料容器Ｃを一定速度で走査移動させながら、一定周期Ｔｃで間欠的に励起光を試料容器Ｃに入射させる。このとき、追従移動機構２７により、撮像素子２６を周期Ｔｃで往復移動させる。すなわち、追従移動機構２７は、撮像素子２６の可動範囲のうち所定の移動開始位置Ｐｓと移動終了位置Ｐｅとの間で撮像素子２６を往復移動させる。移動開始位置Ｐｓから移動終了位置Ｐｅへ向かう方向が追従方向Ｄｔであり、これと反対の方向が逆方向Ｄｒである。

励起光の点灯と追従移動とは次のように同期が取られている。すなわち、追従移動の往復周期は励起光の点灯周期Ｔｃと同じである。また、励起光が点灯している期間においては、撮像素子２６が追従方向Ｄｔに向かって移動するようにする。励起光がオンとなる時刻における撮像素子２６の位置が、図３（ｃ）に示す位置Ｐ１であり、励起光がオフとなる時刻における撮像素子２６の位置が、図３（ｃ）に示す位置Ｐ２である。少なくとも撮像素子２６が位置Ｐ１から位置Ｐ２へ向かって移動するときの速度は、走査移動速度に対応した速度とされる。

励起光がオンとなっている期間に撮像素子２６に入射する光が、有効な信号光として受光される。この間、撮像素子２６は位置Ｐ１から位置Ｐ２に向かって一定速度で移動し、走査移動に伴う結像位置の移動に追従する。これにより、生試料Ｓの一点から出射される光は、走査移動による変位によらず、撮像素子２６の受光面２６１上の同一点に入射することになる。したがって画像のボケは生じない。

励起光がオフになってから次にオンになるまでの期間内の任意のタイミングで、撮像素子２６から画像信号を読み出すことができる。また、この期間内に、追従移動機構２７は撮像素子２６を逆方向Ｄｒへ移動させて移動開始位置Ｐｓに戻す。そして、励起光が次にオンになる前に、追従方向Ｄｔへの移動を再開する。

このような動作を繰り返しながら撮像を行うことで、巨視的には撮像対象たる生試料Ｓに対し撮像素子２６が走査移動しつつ、微視的には励起光がオンになっている短い期間については撮像素子２６と生試料Ｓとの間の相対位置は実質的に不変となる。これにより、励起光の照射中に生試料Ｓと撮像素子２６との位置関係が走査移動により変化することに起因して生じる画像のボケを防止することができる。

なお、図４における撮像素子２６は、移動開始位置Ｐｓから移動終了位置Ｐｅまで一定速度で移動し、その後一定速度で移動開始位置Ｐｓに戻る。しかしながら、画像のボケを防止する上での要件は、少なくとも位置Ｐ１から位置Ｐ２までの移動（追従移動）が、追従方向Ｄｔに向けて、しかも走査移動速度に対応する一定速度で行われることと、次の励起光の点灯までの間に元の位置に戻っていることとの二点である。したがって、他の区間における移動の態様はこれに限定されない。例えば、移動終了位置Ｐｅおよび移動開始位置Ｐｓの少なくとも一方で、撮像素子２６が一定期間停止していてもよい。また、逆方向Ｄｒの移動については一定速度でなくてもよい。このことから、追従移動機構２７としては、一方向への移動速度と反対方向への移動速度とが同じになるような機構、同じにならない機構のいずれも使用可能である。

上記説明では、撮像素子２６が位置Ｐ１から位置Ｐ２へ追従移動するときの速度は、「走査移動速度に対応する速度」としている。すなわち、このときの速度は、走査移動速度と必ずしも同じではない。あくまで、走査移動によって試料容器Ｃ中の一点が走査移動速度で移動するときの、撮像素子２６の受光面２６１における結像位置の移動速度が、追従移動の速度となるべきである。例えば撮像光学系２３が拡大光学系あるいは縮小光学系である場合には、その倍率により結像位置の移動速度も変わる。したがって、実際の結像速度の移動速度に応じて、追従移動の速度が定められる必要がある。

なお、結像位置の移動速度と追従移動の速度とは厳密に同じでなくてもよい。これらの速度が同じであるとき、撮像素子２６上での結像位置は不変であるため、原理的に画像のボケは全く生じない。一方、ある程度の画像ボケが許容される場合には、多少の速度差は許容されることがある。例えば結像位置のずれが撮像素子２６の画素サイズよりも小さければ、実質的にそのずれは無視することが可能である。

また、追従方向Ｄｔについても、走査移動方向とは必ずしも同じではない。上記のように光路の折り返しや、撮像光学系２３が正立系か倒立系かによっても、追従方向Ｄｔは変わる。あくまで、走査移動によって撮像素子２６上での結像位置が変化する方向が、追従方向Ｄｔとなる。

なお、上記の説明では、原理の理解を容易にするために、１周期Ｔｃの間に１回の蛍光撮像のみを行う例を採り上げた。しかしながら、医療や研究の現場においては、明視野画像等の目視観察に適した画像と蛍光画像とを対比させて観察することもよく行われる。この目的のために、同一試料の明視野画像と蛍光画像とが共に取得されることが望ましい。明視野撮像のための走査と蛍光撮像のための走査とがそれぞれ個別に行われてもよいが、これらの一連の走査で同時に取得することができれば、撮像に要する時間を短縮することができて便宜である。これは以下のようにして実現することができる。

図５は明視野撮像と蛍光撮像とを同時処理する場合の動作を示すタイミングチャートである。まず白色光源を用いた明視野撮像に着目する。一定速度での走査移動が行われている状態で、明視野撮像用の白色照明光は、周期Ｔｃのうち一定期間のみ点灯される。点灯ごとに撮像素子２６に入射する光を受光することで、それぞれ１つの撮像視野における明視野画像Ｉｖ１，Ｉｖ２，Ｉｖ３，…，が順に取得される。これらの明視野画像において撮像視野が少しずつオーバーラップするように、点灯周期Ｔｃが走査移動速度との関係から定められている。

白色照明光の消灯後、青色（Ｂ）蛍光を励起するための励起光（ここでは「励起光Ｂ」と略記）が一定期間点灯する。このとき青色に対応する蛍光フィルタ２３２ｃが、信号光の光路に配置される。撮像素子２６に入射する信号光から、青色蛍光画像（ここでは「蛍光画像Ｂ」と略記）Ｉｂ１，Ｉｂ２，Ｉｂ３，…，が取得される。なお、必要に応じ、フィルタ部２３２の全体が交換される、つまりダイクロイックミラー２３２ａおよび励起フィルタ２３２ｂが蛍光フィルタ２３２ｃとともに切り替えられる態様であってもよい。

同様に、励起光Ｂの消灯後に、フィルタ交換機構２５により蛍光フィルタ２３２ｃが緑色（Ｇ）に対応したものに切り替えられ、緑色蛍光を励起するための励起光（ここでは「励起光Ｇ」と略記）が一定期間点灯する。その消灯後に、蛍光フィルタ２３２ｃが赤色（Ｒ）に対応したものに切り替えられ、赤色蛍光を励起するための励起光（ここでは「励起光Ｇ」と略記）が一定期間点灯する。これらの点灯期間において、それぞれ緑色蛍光画像（ここでは「蛍光画像Ｇ」と略記）Ｉｇ１，Ｉｇ２，Ｉｇ３，…，と、赤色蛍光画像（ここでは「蛍光画像Ｒ」と略記）Ｉｒ１，Ｉｒ２，Ｉｒ３，…，とが取得される。

これらの明視野画像および蛍光画像それぞれの撮像視野は、点灯タイミングの違いに起因して少しずつずれている。しかしながら、互いにオーバーラップする画像を合成することで連続した画像を得ることができるため、撮像位置のずれは実質的に問題にならない。また画像間の位置ずれ量も既知であるため、その情報に基づいて各色の画像の位置合わせを行うことも容易である。

この間、上記原理に基づき、撮像素子２６は追従方向Ｄｔおよび逆方向Ｄｒに往復移動する。より具体的には、各色の蛍光撮像を行う度に、撮像素子２６は追従方向Ｄｔに移動し、撮像終了後、次の色の撮像開始前に逆方向Ｄｒに移動する。いずれの色の撮像においても、撮像素子２６は、励起光の点灯開始時には位置Ｐ１に、点灯終了時には位置Ｐ２にある。これにより各色の蛍光画像における画像のボケの発生が防止される。また、撮像時における撮像光学系２３と撮像素子２６との位置関係はどの色でも同じであり、撮像光学系２３および撮像素子２６の視野を有効に利用することができる。

明視野撮像における撮像素子２６の追従移動は必須ではない。このため撮像素子２６は停止させておくことができる。このときの位置を位置Ｐ１としておけば、明視野画像と蛍光画像との間においても、撮像光学系２３と撮像素子２６との位置関係を同じにすることができる。なお、原理的には明視野撮像の場合にも結像位置の移動に撮像素子２６を追従させることは有効である。光源２１の点灯時間が十分に短いとはいえ、その間にも走査移動は行われているからである。

なお、上記はＲＧＢ各色の蛍光画像をそれぞれ個別に撮像する場合の動作である。このように使用する蛍光フィルタを切り替えながら各色の蛍光撮像を行う方法では、撮像素子２６としては例えばモノクロ撮像用のものを使用することが可能である。一方、カラー撮像用の撮像素子２６を使用する場合には、撮像後にＲＧＢを分版することができる。これにより観察対象となる個々の蛍光色を分離できる場合には、色の区別をせずカラー画像として一括撮像してもよい。この場合、蛍光フィルタの切り替えは必要ない。また、ダイクロイックフィルタ２３２ａ、励起フィルタ２３２ｂおよび蛍光フィルタ２３２として例えばマルチバンド対応のものを用いれば、各色を個別に撮像する場合でもフィルタ部の交換は不要である。

以上のように、上記実施形態の撮像装置１では、走査移動に伴う結像位置の変位に追従するように撮像素子２６を移動させることで、照明光（励起光）が比較的長い期間照射される蛍光撮像においても、画像ボケの発生を防止することができる。撮像素子２６に求められる移動量は微小であり、また単なる往復移動でよいため、比較的小規模の簡単な機構部品により追従動作を実現可能である。

以上説明したように、上記実施形態においては、撮像ユニット２０が本発明の「撮像部」として機能しており、そのうち光源２２、撮像素子２６および追従移動機構２７が、本発明の「励起光源」、「受光素子」および「追従移動機構」としてそれぞれ機能している。また、光源２１が本発明の「照明光源」として機能している。

なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、前記したように試料容器Ｃと撮像ユニット２０との間の走査移動は、どちらを移動させてもよく、また両方を移動させてもよい。

また、上記実施形態では撮像素子２６を追従移動機構２７により上下動させて追従移動を実現しているが、撮像光学系２３に含まれるレンズやミラー等の光学素子を駆動することで、光学系に対し相対的な撮像素子の移動が実現されてもよい。

また、上記実施形態における追従動作では、励起光の点灯期間中に撮像素子２６を位置Ｐ１から位置Ｐ２まで移動させるのに際して、より外側の移動開始位置Ｐｓと移動終了位置Ｐｅとの間で往復移動を行わせている。これは、位置Ｐ１から位置Ｐ２までの移動を一定速度で安定的に行わせるためである。しかしながら、例えば同様に安定した移動速度が実現可能である、またはある程度の速度変動が許容されるのであれば、移動は位置Ｐ１から開始されてもよく、また位置Ｐ２で終了されてもよい。

また例えば、上記実施形態では光源をパルス点灯させることで間欠撮像を行っているが、撮像素子による受光を間欠的に実行することによっても同様の効果が得られる。例えばグローバルシャッタを備える撮像ユニットを使用し、一定周期の一部期間のみシャッタを開くことで間欠撮像を行うことが可能である。ただし、生試料Ｓに対し強い光を長時間照射することは生試料Ｓにダメージを与える（光毒性）から、上記のように撮像時以外には光源を点灯させないことが望ましい。また、ローリングシャッタを備える撮像ユニットを使用し、ローリングシャッタと光源の点灯とを同期させることで、生試料Ｓへの照射時間を短くし、また撮像素子の追従精度の向上を図ることが可能である。

また、上記実施形態では、明視野撮像と蛍光撮像とを組み合わせてこれらを同時に実行するようにしているが、原理説明の通り、明視野撮像を伴わない蛍光撮像においても本発明は有効に機能する。また、明視野撮像に代えて、位相差撮像や暗視野撮像等、他の撮像方式での撮像が組み合わされてもよい。

以上、具体的な実施形態を例示して説明してきたように、本発明においては、例えば励起光源は励起光を間欠的に撮像対象物に入射させるものであってもよい。このような構成によれば、励起光の間欠的な点灯によって蛍光の発生も間欠的となり、受光素子に蛍光を間欠的に受光させることができる。

この場合、例えば、励起光源から撮像対象物への励起光の入射と同期させて、追従移動機構が受光素子を移動させる構成であってもよい。このような構成によれば、間欠的な励起光の照射に同期して受光素子が移動することになるので、照射ごとに撮像される画像のそれぞれで画像ボケの発生を防止することができる。

また例えば、受光素子は二次元イメージセンサであってもよい。このような構成によれば、一回の撮像で広い二次元領域を撮像することができるので、撮像位置を順次変化させることで広い撮像対象領域を高速に撮像することができる。この場合、連続的な撮像では走査移動により画像が流れてしまうが、間欠的な撮像を行うことでこの問題を抑制することができる。

また例えば、撮像部は、撮像対象物に可視光を入射させる照明光源を備え、走査移動の間に、撮像対象物に可視光を入射させつつ行う撮像と、励起光を入射させつつ行う撮像とを交互に繰り返して実行してもよい。このような構成によれば、１回の走査で可視光域の撮像と蛍光撮像とを実行することができるので、これら種類の異なる画像を取得するために必要な時間を短縮することができる。また、撮像の時間差が小さいため、画像間で撮像対象物の状態が変化することも避けられる。

また例えば、受光素子が互いに波長の異なる複数の前記蛍光を互いに時間を異ならせて受光する場合には、追従移動機構は、受光素子が一の波長について受光する間、受光素子を初期位置から追従方向に移動させ、次の波長についての受光が開始されるよりも前に、受光素子を初期位置に戻すように構成されてもよい。このような構成によれば、発光波長の異なる複数の蛍光成分を時系列で受光するのに際して、蛍光が受光素子に入射する位置を各波長成分の間で揃えることが可能となり、画像品質の良好な画像を得ることができる。例えば、撮像光学系の視野を有効に活用して撮像を行うことができる。

また、本発明は、撮像対象物が容器内で培養された細胞、または病理組織標本であるときに、特に優れた効果を奏するものである。

この発明は、撮像対象物を走査しながら蛍光撮像する撮像技術全般に適用することができる。特に、細胞や組織標本等の生試料の観察に好適であり、医療や生化学の分野に有用なものである。

１ 撮像装置
２０ 撮像ユニット（撮像部）
２１ 光源（照明光源）
２２ 光源（励起光源）
２６ 撮像素子（受光素子）
２７ 追従移動機構
３０ 走査移動機構
Ｄｓ 走査移動方向
Ｄｔ 追従方向
Ｐｓ 移動開始位置（初期位置）
Ｓ 生試料（撮像対象物）

Claims (8)

1. 撮像対象物に励起光を入射させて前記撮像対象物から出射される蛍光を受光し、前記撮像対象物を撮像する撮像部と、
   前記撮像対象物に対し相対的に、前記撮像部を前記励起光の入射方向と交わる方向に一定速度で走査移動させる走査移動機構と
   を備え、
   前記撮像部は、
   前記励起光を出射する励起光源と、
   前記撮像対象物から出射される蛍光を間欠的に受光する受光素子と、
   前記撮像対象物の一点から前記受光素子に至る蛍光の光路が前記走査移動に伴って移動する方向を追従方向として、前記追従方向およびその逆方向に前記受光素子を所定範囲内で移動可能な追従移動機構と
   を有し、
   前記受光素子は、二次元イメージセンサであり、
   前記追従移動機構は、
   前記受光素子が前記蛍光を受光する期間、前記受光素子を、所定の初期位置から前記追従方向に沿って前記走査移動速度に対応する速度で移動させることで、前記撮像対象物が前記撮像部に結像する結像位置の移動に前記受光素子を追従させ、
   前記受光素子が前記蛍光を受光しない期間、前記受光素子を前記逆方向に移動させて前記初期位置に戻す、撮像装置。
2. 前記励起光源は、前記励起光を間欠的に前記撮像対象物に入射させる請求項１に記載の撮像装置。
3. 前記励起光源から前記撮像対象物への前記励起光の入射と同期させて、前記追従移動機構が前記受光素子を移動させる請求項２に記載の撮像装置。
4. 前記受光素子の前記追従方向への移動における速度は、前記一定速度での走査移動によって前記結像位置が移動する速度と等しい、請求項１に記載の撮像装置。
5. 前記撮像部は、前記撮像対象物に可視光を入射させる照明光源を備え、前記走査移動の間に、前記撮像対象物に前記可視光を入射させつつ行う撮像と、前記励起光を入射させつつ行う撮像とを交互に繰り返して実行する請求項１ないし４のいずれかに記載の撮像装置。
6. 前記受光素子は、互いに波長の異なる複数の前記蛍光を互いに時間を異ならせて受光し、
   前記追従移動機構は、前記受光素子が一の波長成分について受光する間、前記受光素子を前記初期位置から前記追従方向に移動させ、次の波長成分についての受光が開始されるよりも前に、前記受光素子を前記初期位置に戻す、請求項１ないし５のいずれかに記載の撮像装置。
7. 撮像対象物に励起光を入射させ、前記撮像対象物から出射される蛍光を受光することで前記撮像対象物を撮像する撮像方法において、
   励起光源および二次元イメージセンサである受光素子を有する撮像部と前記撮像対象物とを相対的に、前記励起光の入射方向と交わる方向に一定速度で走査移動させ、
   前記撮像対象物の一点から前記受光素子に至る蛍光の光路が前記走査移動に伴って移動する方向を追従方向として、前記追従方向およびその逆方向に前記受光素子を所定範囲内で往復移動させながら、前記受光素子が前記追従方向に移動している期間に前記撮像対象物からの蛍光を受光し、
   前記受光素子の前記追従方向への移動では、前記受光素子を前記追従方向に沿って前記走査移動速度に対応する速度で移動させることで、前記撮像対象物が前記撮像部に結像する結像位置の移動に前記受光素子を追従させる、撮像方法。
8. 前記撮像対象物が、容器内で培養された細胞または病理組織標本である請求項７に記載の撮像方法。

Images