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JP7469285B2 - 標的化されたゲノム修飾を増強するためのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインの使用 - Google Patents

標的化されたゲノム修飾を増強するためのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインの使用 Download PDF

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Description

本開示は、標的化されたゲノム修飾、標的化された転写調節、または標的化されたエピジェネティックな修飾の効率を増加させるための組成物および方法に関する。
プログラム可能なエンドヌクレアーゼは、真核生物における標的化されたゲノム操作または修飾のための重要なツールになりつつある。最近、ＲＮＡガイドクラスター化規則的散在短パリンドローム反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、ゲノム修飾ツールの新世代として現れた。これらの新しいプログラム可能なエンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等のヌクレアーゼの前世代と比較して、前例のないシンプルさおよび汎用性を提供した。しかしながら、真核細胞におけるクロマチン障壁は、原核生物由来のＣＲＩＳＰＲシステムによる標的へのアクセスおよび開裂を妨げる可能性がある（Hinz et al, Biochemistry, 2015, 54:7063-66; Horlbeck et al., eLife, 2016, 5:e12677）。
実際、これまでで最も活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと考えられているStreptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)を使用する場合、特定の哺乳動物ゲノム部位での全く無いかまたは低い編集活性が観察された。さらに、特徴づけられたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの多くは、バクテリア中または精製されたＤＮＡ基質上で活性であっても、ここまでのところ哺乳動物細胞中では活性を示さない。したがって、真核生物における標的化されたゲノムまたはエピジェネティックな修飾の効率を増加させるために、クロマチン阻害を克服するために、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムおよび他のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の能力を改善する必要がある。
要約
本開示の種々の局面には、融合タンパク質の提供があり、各融合タンパク質は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に連結される少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む。
少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２、またはＨＭＧＢ３から選択される高移動度群（ＨＭＧ）ボックス（ＨＭＧＢ）タンパク質からのＤＮＡ結合ドメイン；ＨＭＧＮ１、ＨＭＧＮ２、ＨＭＧＮ３ａ、ＨＭＧＮ３ｂ、ＨＭＧＮ４、またはＨＭＧＮ５から選択されるＨＭＧヌクレオソーム結合（ＨＭＧＮ）タンパク質；ヒストンＨ１バリアントからの中央グロビュールドメイン；スイッチ／スクロース非発酵性（ＳＷＩ／ＳＮＦ）複合体、模倣スイッチ（ＩＳＷＩ）複合体、クロモドメイン－ヘリカーゼ－ＤＮＡ結合（ＣＨＤ）複合体、ヌクレオソームリモデリングおよびデアセチラーゼ（ＮｕＲＤ）複合体、ＩＮＯ８０複合体、ＳＷＲ１複合体、ＲＳＣ複合体、またはそれらの組み合わせから選択されるクロマチンリモデリング複合体タンパク質からのＤＮＡ結合ドメインであることができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン、ＨＭＧＮ１タンパク質、ＨＭＧＮ２タンパク質、ＨＭＧＮ３ａタンパク質、ＨＭＧＮ３ｂタンパク質、ヒストンＨ１中央グロビュールドメイン、ＩＳＷＩタンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、ＣＨＤ１タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの組み合わせであることができる。
いくつかの実施形態において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有し、そして該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、クラスター化規則的散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼまたはニッカーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼドメインに連結されるプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質であることができる。
他の実施形態において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は非ヌクレアーゼ活性を有し、そして該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、非ヌクレアーゼドメインに連結されるプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質であることができる。該キメラタンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、全てのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾されたＣＲＩＳＰＲタンパク質、ジンクフィンガータンパク質、または転写活性化因子様エフェクターであることができ、該キメラタンパク質の非ヌクレアーゼドメインは、以下を有することができる：アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱エニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、シトルリン化活性、ヘリカーゼ活性、アミノ化活性、脱アミノ化活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、酸化活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性。特定の実施形態において、キメラタンパク質の非ヌクレアーゼドメインは、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有することができる。
少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、化学結合を介して直接的に、リンカーを介して間接的に、またはそれらの組み合わせにより、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に連結されることができる。該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および／または内部位置に連結されることができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に連結される少なくとも２つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む。
本明細書において開示される融合タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。
本開示の別の局面は、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインに連結されるＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む融合タンパク質を包含する。
一般に、前記融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１タンパク質であることができる。特定の実施形態において、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）、Streptococcus thermophilus Cas9（StCas9）、Streptococcus pasteurianus（SpaCas9）、Campylobacter jejuni Cas9（CjCas9）、Staphylococcus aureus（SaCasFvics）、Francisella novicida Cas9 (FnCas9)、 Neisseria cinerea Cas9（NcCas9）、Neisseria meningitis Cas9（NmCas9）、Francisella novicida Cpf1（FnCpf1）、Acidaminococcus sp. Cpf1（AsCpf1）、またはLachnospiraceae 細菌ND2006 Cpf1（LbCpf1）であることができる。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質はヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有する。例えば、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼ、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼまたはニッカーゼであることができる。他の実施形態において、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質は非ヌクレアーゼ活性を有する。かかる繰り返しにおいて、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、全てのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾され、かつ非ヌクレアーゼドメインに連結されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質、または全てのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾され、かつ非ヌクレアーゼドメインに連結されるＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１タンパク質であることができ、ここで該非ヌクレアーゼドメインは、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有することができる。
ＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質の少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、高移動度群（ＨＭＧ）ボックス（ＨＭＧＢ）ＤＮＡ結合ドメイン、ＨＭＧヌクレオソーム結合（ＨＭＧＮ）タンパク質、ヒストンＨ１バリアントからの中央グロビュールドメイン、クロマチンリモデリング複合タンパク質からのＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの組み合わせであることができる。特定の実施形態において、該ＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質の少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン、ＨＭＧＮ１タンパク質、ＨＭＧＮ２タンパク質、ＨＭＧＮ３ａタンパク質、ＨＭＧＮ３ｂタンパク質、ヒストンＨ１中央グロビュールドメイン、模倣スイッチ（ＩＳＷＩ）タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、クロモドメイン－ヘリカーゼ－ＤＮＡタンパク質１（ＣＨＤ１）ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの組み合わせであることができる。
少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、化学結合を介して直接的に、リンカーを介して間接的に、またはそれらの組み合わせによりＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結されることができる。該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および／または内部位置に連結されることができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結される少なくとも２つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む。
本明細書において開示されるＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質は、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号６９、：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、または配列番号：７９と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。
他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質は、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、または配列番号：７９に記載のアミノ酸配列を有することができる。
本開示の別の局面は、本明細書において開示されるＣＲＩＳＰＲ含有融合タンパク質の少なくとも１つおよび少なくとも１つのガイドＲＮＡを含むタンパク質－ＲＮＡ複合体を包含する。
本開示のさらなる局面は、本明細書において開示される融合タンパク質のいずれかをコードする核酸を提供する。該核酸は、真核細胞における翻訳のためにコドン最適化されることができる。いくつかの実施形態において、該核酸は、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、または自己複製ＲＮＡ等のベクターの一部であることができる。
本開示のさらに別の局面は、真核細胞における標的化されたゲノムまたはエピジェネティックな修飾の効率を増加させるための方法を提供する。該方法は、真核細胞中へ、（ａ）本明細書において開示される少なくとも１つの融合タンパク質または該融合タンパク質をコードする核酸を導入することを含み、ここで、該少なくとも１つの融合タンパク質の該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヌクレオソームまたはクロマチン構造を変え、その結果該少なくとも１つの融合タンパク質が標的染色体配列への増加したアクセスを有し、それにより標的化されたゲノムまたはエピジェネティックな修飾の効率が増加する。
いくつかの繰り返しにおいて、前記方法は、真核細胞中へ、（ａ）本明細書において開示される少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質または該ＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質をコードする核酸、ここで、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、（ｉ）ヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有するか、または（ｉｉ）全てのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾され、かつ非ヌクレアーゼドメインに連結される；および（ｂ）少なくとも１つのガイドＲＮＡまたは少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする核酸を導入することを含み；ここで、該少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質の該ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、標的染色体配列に標的化され、そして該少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質の該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヌクレオソームまたはクロマチン構造を変え、その結果該少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質が標的染色体配列への増加したアクセスを有し、それにより標的化されたゲノムまたはエピジェネティックな修飾の効率が増加する。
特定の実施形態において、前記方法は、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを真核細胞中に導入することをさらに含むことができ、該ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも１つのドナー配列を含む。
本明細書において開示される方法において使用される真核細胞は、哺乳動物細胞であることができる。いくつかの実施形態において、該細胞はヒト細胞であることができる。該細胞は、インビトロまたはインビボであることができる。
本開示の他の局面および特徴が以下に詳述される。
図１は、野生型ｓｇＲＮＡ骨格または修飾ｓｇＲＮＡ骨格の存在下、野生型ＣｊＣａｓ９（ＣｊｅＣａｓ９）、ＨＭＧＮ１およびＨＭＧＢ１ボックスＡ（ＣｊｅＣａｓ９－ＨＮ１ＨＢ１）に連結されるＣｊＣａｓ９を含む融合タンパク質、およびＨＭＧＮ１およびヒストンＨ１中央グロビュールドメイン（ＣｊｅＣａｓ９－ＨＮ１Ｈ１Ｇ）に連結されるＣｊＣａｓ９を含む融合タンパク質の開裂効率（インデルのパーセントとして）を示す。
詳細な説明
本開示は、ＣＲＩＳＰＲシステムを含むプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質への染色体ＤＮＡのアクセシビリティを増加させるための組成物および方法を提供する。特に、本開示は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に連結される少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む融合タンパク質を提供する。該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヌクレオソームおよび／またはクロマチン構造を変えるかまたは改造し、その結果該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が標的化された染色体配列への増加したアクセスを有し、それにより標的化されたゲノム修飾、標的化された転写調節、または標的化されたエピジェネティックな修飾の効率が増加する。
（Ｉ）融合タンパク質
本開示の１つの局面は、融合タンパク質を提供し、ここで各融合タンパク質は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に連結される少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む。該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、ヌクレアーゼ活性（以下のセクション（Ｉ）（ｂ）（ｉ）を参照）または非ヌクレアーゼ活性（以下のセクション（Ｉ）（ｂ）（ｉｉ）を参照）を有することができる。ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは以下のセクション（Ｉ）（ａ）で、該ドメイン間の連結は以下のセクション（Ｉ）（ｃ）で記載される。
（ａ）ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメイン
ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヌクレオソーム再配列および／またはクロマチンリモデリングを促進するために、ヌクレオソームおよび／または染色体タンパク質と相互作用する染色体タンパク質またはその断片を指す。いくつかの実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、高移動度群（ＨＭＧ）ボックス（ＨＭＧＢ）タンパク質由来であることができる。他の実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＨＭＧヌクレオソーム結合（ＨＭＧＮ）タンパク質またはその断片であることができる。さらなる実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、リンカーヒストンＨ１バリアント由来であることができる。さらに他の実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、クロマチンリモデリング複合体タンパク質由来であることができる。
（ｉ）ＨＭＧＢタンパク質
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＨＭＧＢタンパク質由来であることができる。ＨＭＧＢタンパク質は、ヌクレオソームおよび他の染色体タンパク質と相互作用して、クロマチン構造および機能を調節する。適切なＨＭＧＢタンパク質は、哺乳動物ＨＭＧＢ１、哺乳動物ＨＭＧＢ２、および哺乳動物ＨＭＧＢ３を含む。例えば、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヒトＨＮＧＢ１（ＲｅｆＳｅｑ遺伝子、Ｕ５１６７７）、ヒトＨＭＧＢ２（ＲｅｆＳｅｑ遺伝子、Ｍ８３６６５）、またはヒトＨＭＧＢ３（ＲｅｆＳｅｑ遺伝子、ＮＭ＿００５３４２）由来であることができる。他の実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、他の脊椎動物、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエＤＳＰ１）、植物、酵母、または他の単一の細胞真核生物からのＨＭＧＢタンパク質またはＨＭＧＢ様タンパク質由来であることができる。
特異的な実施形態において、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインはＨＭＧＢタンパク質の断片であることができる。特に、該ＨＭＧＢタンパク質の断片はＤＮＡ結合ドメインである。典型的に、ＨＭＧＢタンパク質は、ボックスＡおよびボックスＢと呼ばれる２つのＤＮＡ結合ドメインを含有する。いくつかの実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用ドメインは、ＨＭＧＢタンパク質からのボックスＡドメインまたはボックスＢドメインであることができる。特異的な実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用ドメインは、ＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン、ＨＭＧＢ２ボックスＡドメイン、またはＨＭＧＢ３ボックスＡドメインであることができる。
（ｉｉ）ＨＭＧＮタンパク質
他の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＨＭＧＮタンパク質またはその断片であることができる。ＨＭＧＮタンパク質は、クロマチンの構造および機能を調節する染色体タンパク質である。適切な哺乳動物ＨＭＧＮタンパク質は、ＨＭＧＮ１、ＨＭＧＮ２、ＨＭＧＮ３、ＨＭＧＮ３、ＨＭＧＮ４、およびＨＭＧＮ５を含む。種々の実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヒトＨＭＧＮ１（ＲｅｆＳｅｑ遺伝子、Ｍ２１３３９）、ヒトＨＭＧＮ２（ＲｅｆＳｅｑ遺伝子、Ｘ１３５４６）、ヒトＨＭＧＮ３ａまたはヒトＨＭＧＮ３ｂ（ＲｅｆＳｅｑ遺伝子、Ｌ４０３５７）、ヒトＨＭＧＮ４（ＲｅｆＳｅｑ遺伝子、ＮＭ＿０３０７６３）、ヒトＨＭＧＮ５（ＲｅｆＳｅｑ遺伝子、ＮＭ＿０１６７１０）、その断片、またはその誘導体であることができる。他の実施形態において、ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、非ヒトＨＭＧＮタンパク質、その断片、またはその誘導体であることができる。ＨＭＧＮタンパク質は比較的小さいタンパク質である。そのため、ＨＭＧＮタンパク質全体が、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に連結されることができる。しかしながら、いくつかの実施形態において、ＨＭＧＮタンパク質の断片（例えば、中央に位置するヌクレオソーム結合ドメイン）は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に連結されることができる。
（ｉｉｉ）ヒストンＨ１バリアント
さらに他の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、リンカーヒストンＨ１バリアント由来であることができる。例えば、ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヒストンＨ１バリアントからの中央グロビュールドメインであることができる。ヒストンＨ１バリアントは、ヌクレオソーム間のリンカーＤＮＡに結合し、該中央グロビュールドメイン（約８０アミノ酸の）は、ヌクレオソームダイアドに近いヌクレオソームの入口および出口部位で該リンカーＤＮＡに結合する。ヒストンＨ１バリアントは、組織、発生段階、およびそれらが発現される生物に対して明確な特異性を有する関連タンパク質の大きなファミリーを含む。例えば、ヒトおよびマウスは、１１個のヒストンＨ１バリアントを含有し、ニワトリは６個のバリアント（ヒストンＨ５と呼ばれる）を有し、カエルは５個のバリアントを有し、線虫は８個のバリアントを有し、ミバエ種は１から３個のバリアントを有し、そしてタバコは６つのバリアントを有する。いくつかの実施形態において、該ヒストンＨ１バリアントは、以下に示すようなヒトバリアントであることができる。

（ｉｖ）クロマチンリモデリング複合体タンパク質
さらなる実施形態において、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、クロマチンリモデリング複合タンパク質由来であることができる。例えば、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、クロマチンリモデリング複合タンパク質からのＤＮＡ結合ドメインであることができる。クロマチンリモデリング複合体は、クロマチンの構造を改造する能力を有するマルチサブユニット酵素複合体である。これらのリモデリング複合体は、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを使用して、ヌクレオソームを移動、不安定化、排出、または再構築する。
クロマチンリモデリング複合体の例は、ＳＷＩ／ＳＮＦ（ＳＷＩｔｃｈ／Ｓｕｃｒｏｓｅ Ｎｏｎ－Ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅ）、ＩＳＷＩ（Ｉｍｉｔａｔｉｏｎ ＳＷＩｔｃｈ）、ＣＨＤ（Ｃｈｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ－Ｈｅｌｉｃａｓｅ－ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｍｉ－２／ＮｕＲＤ（Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）、ＩＮＯ８０、ＳＷＲ１、およびＲＳＣ複合体を含む。種々の実施形態において、ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、クロマチンリモデリング複合体におけるＡＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、および／またはＤＮＡ結合タンパク質由来であることができる。いくつかの実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＩＳＷＩ複合体からのＡＴＰアーゼＩＳＷＩ、ＣＨＤ複合体からのＤＮＡ結合タンパク質ＣＨＤ１、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体からのＡＴＰ依存性ヘリカーゼＳＭＡＲＣＡ４またはＡＴＰアーゼＳｎｆ２、Ｍｉ－１／ＮｕＲＤ複合体のＡＴＰアーゼＭｉ－２αまたはＡＴＰアーゼＭｉ２－β、ＩＮＯ８０複合体からのＲｕｖＢ様ＡＡＡＡＴＰアーゼ１またはＲｕｖＢ様ＡＡＡＡＴＰアーゼ２、ＳＷＲ１複合体からのＡＴＰアーゼＳｗｒ１、またはＲＳＣ複合体からのＡＴＰアーゼＲｓｃ１またはＡＴＰアーゼＲｃｓ２由来であることができる。特異的な実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＩＳＷＩタンパク質からのＤＮＡ結合ドメインまたはＣＨＤ１タンパク質からのＤＮＡ結合ドメインであることができる。
（ｂ）プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、染色体ＤＮＡにおける特異的配列に結合するように標的化されたタンパク質であり、標的化された配列でのまたはその近くのＤＮＡまたは該ＤＮＡと関連するタンパク質を修飾する。ゆえに、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよび触媒的に活性な修飾ドメインを含む。
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質のＤＮＡ結合ドメインはプログラム可能であり、このことは、それが異なるＤＮＡ配列を認識して結合するように設計または操作されることができることを意味する。いくつかの実施形態において、例えば、ＤＮＡ結合は、ＤＮＡ修飾タンパク質および標的ＤＮＡとの間の相互作用により媒介される。ゆえに、該ＤＮＡ結合ドメインは、タンパク質操作により目的のＤＮＡ配列に結合するようにプログラムされることができる。他の実施形態において、例えば、ＤＮＡ結合は、該ＤＮＡ修飾タンパク質および該標的ＤＮＡと相互作用するガイドＲＮＡにより媒介される。かかる場合、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、適切なガイドＲＮＡを設計することにより、目的のＤＮＡ配列に標的化されることができる。
様々な修飾ドメインは、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に含まれることができる。いくつかの実施形態において、修飾ドメインはヌクレアーゼ活性を有し、二本鎖ＤＮＡ配列の一方または両方の鎖を開裂することができる。次いで、ＤＮＡ破壊は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性指向修復（ＨＤＲ）等の細胞ＤＮＡ修復プロセスにより修復されることができ、その結果該ＤＮＡ配列は、欠失、挿入、および／または少なくとも１つの塩基対の置換により修飾されることができる。ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の例は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（またはニッカーゼ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびヌクレアーゼドメインに連結されるプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含むが、これらに限定されない。ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、以下のセクション（Ｉ）（ｂ）（ｉ）で詳述される。
他の実施形態において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の修飾ドメインは、非ヌクレアーゼ活性（例えば、エピジェネティックな修飾活性または転写調節活性）を有し、その結果該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、ＤＮＡと関連するＤＮＡおよび／またはタンパク質の構造および／または活性を修飾する。ゆえに、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、非ヌクレアーゼドメインに連結されるプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含むことができる。かかるタンパク質は、以下のセクション（Ｉ）（ｂ）（ｉｉ）で詳述される。
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、野生型または天然のＤＮＡ結合および／または修飾ドメイン、天然のＤＮＡ結合および／または修飾ドメインの修飾されたバージョン、合成または人工ＤＮＡ結合および／または修飾ドメイン、およびそれらの組み合わせを含むことができる。
（ｉ）ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質
ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の例は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびヌクレアーゼドメインに連結されるプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含むが、これらに限定されない。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、種々の細菌および古細菌において存在する、Ｉ型、ＩＩ型（すなわち、Ｃａｓ９）、ＩＩＩ型、Ｖ型（すなわち、Ｃｐｆ１）、またはＶＩ型（すなわち、Ｃａｓ１３）ＣＲＩＳＰＲタンパク質由来であることができる。さらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、古細菌のＣＲＩＳＰＲシステム、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＸシステム、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹシステム(Bursteinetal.,Nature,2017,542(7640):237-241)由来であることができる。種々の実施形態において、該ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Streptococcus sp.(例えばS. pyogenes、S. thermophilus、S. pasteurianus)、Campylobacter sp. (例えばCampylobacter jejuni)、Francisella sp. (例えば、Francisella novicida)、Acaryochloris sp.、Acetohalobium sp.、Acidaminococcus sp.、 Acidithiobacillus sp.、Alicyclobacillus sp.、Allochromatium sp.、Ammonifex sp.、Anabaena sp.、 Arthrospira sp.、Bacillus sp.、Burkholderiales sp.、Caldicelulosiruptor sp.、Candidatus sp.、 Clostridium sp.、Crocosphaera sp.、Cyanothece sp.、Exiguobacterium sp.、Finegoldia sp.、 Ktedonobacter sp.、Lachnospiraceae sp.、Lactobacillus sp.、Lyngbya sp.、Marinobacter sp.、 Methanohalobium sp.、Microscilla sp.、Microcoleus sp.、Microcystis sp.、Natranaerobius sp.、 Neisseria sp.、Nitrosococcus sp.、Nocardiopsis sp.、Nodularia sp.、Nostoc sp.、Oscillatoria sp.、Polaromonas sp.、Pelotomaculum sp.、Pseudoalteromonas sp.、Petrotoga sp.、 Prevotella sp.、Staphylococcus sp.、Streptomyces sp.、Streptosporangium sp.、 Synechococcus sp.、Thermosipho sp.、またはVerrucomicrobia spからであることができる。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、野生型または天然のタンパク質であることができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、改善された特異性、変えられたＰＡＭ特異性、減少されたオフターゲット効果、増加された安定性等を有するように操作されることができる。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質であることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)、 Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9)、Streptococcus pasteurianus (SpaCas9)、 Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9)、Staphylococcus aureus (SaCas9)、Francisella novicida Cas9 (FnCas9)、Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9)、またはNeisseria meningitis Cas9 (NmCas9)であることができる。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１タンパク質、例えば、Francisella novicida Cpf1 (FnCpf1)、Acidaminococcus sp. Cpf1 (AsCpf1)、またはLachnospiraceae 細菌ND2006 Cpf1 (LbCpf1)であることができる。さらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３タンパク質、例えば、Leptotrichia wadei Cas13a (LwaCas13a)またはLeptotrichia shahii Cas13a (LshCas13a)であることができる。
一般に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ相補鎖を開裂するＨＮＨドメインおよび、非相補鎖を開裂するＲｕｖＣドメインを含み、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＲｕｖＣドメインおよびＮＵＣドメインを含み、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼは２つのＨＮＥＰＮドメインを含む。いくつかの実施形態において、両方のヌクレアーゼドメインが活性であり、該ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは二本鎖開裂活性を有する（すなわち、二本鎖核酸配列の両方の鎖を開裂する）。他の実施形態において、該ヌクレアーゼドメインの１つは、１以上の変異および／または欠失により不活性化され、ＣＲＩＳＰＲバリアントは二本鎖核酸配列の１本の鎖を開裂するニッカーゼである。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のＲｕｖＣドメインにおける１以上の変異（例えば、Ｄ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａ）は、ガイドＲＮＡ相補鎖にニックを入れるＨＮＨニッカーゼをもたらし；Ｃａｓ９タンパク質のＨＮＨドメインにおける１以上の変異（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８５６Ａ、および／またはＮ８６３Ａ）は、ガイドＲＮＡ非相補鎖にニックを入れるＲｕｖＣニッカーゼをもたらす。同等な変異は、Ｃｐｆ１およびＣａｓ１３ａヌクレアーゼをニッカーゼに変換できる。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ。さらに他の実施形態において、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であることができる。ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ジンクフィンガー領域およびヌクレアーゼドメインを含む。該ジンクフィンガー領域は、約２から７つのジンクフィンガー、例えば、約４から６つのジンクフィンガーを含むことができ、ここで各ジンクフィンガーは３つの連続塩基対に結合する。該ジンクフィンガー領域は、いかなるＤＮＡ配列をも認識しそれに結合するように操作されることができる。ジンクフィンガー設計ツールまたはアルゴリズムは、インターネットでまたは商業的なソースから入手できる。ジンクフィンガーは、適切なリンカー配列を使用して一緒に連結されることができる。
ＺＦＮは、いかなるエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼからも得ることができるヌクレアーゼドメインをも含む。ヌクレアーゼドメインが由来できるエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型－Ｓ制限エンドヌクレアーゼ由来であることができる。ＩＩ型－Ｓエンドヌクレアーゼは、認識／結合部位から典型的に数塩基対離れている部位でＤＮＡを開裂し、そのため分離可能な結合および開裂ドメインを有する。これらの酵素は一般に、一時的に結びついて二量体を形成し、互い違いの位置でＤＮＡの各鎖を開裂するモノマーである。適切なＩＩ型－Ｓエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩ、およびＳａｐＩを含む。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたはその誘導体であることができる。該ＩＩ型－Ｓヌクレアーゼドメインは、２つの異なるヌクレアーゼドメインの二量化を促進するように修飾されることができる。例えば、ＦｏｋＩの開裂ドメインは、特定のアミノ酸残基を変異させることにより修飾されることができる。非限定的な例として、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８でのアミノ酸残基は、修飾の標的である。特異的な実施形態において、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、Ｑ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ、および／またはＮ４９６Ｄ変異を含む第１のＦｏｋＩハーフドメイン、およびＥ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ、および／またはＨ５３７Ｒ変異を含む第２のＦｏｋＩハーフドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＺＦＮは二本鎖開裂活性を有する。他の実施形態において、ＺＦＮはニッカーゼ活性を有する（すなわち、ヌクレアーゼドメインの１つが不活化されている）。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ。代替的な実施形態において、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であることができる。ＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼドメインに連結される転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）由来である高度に保存された反復で構成されるＤＮＡ結合ドメインを含む。ＴＡＬＥは、植物病原体Xanthomonasにより分泌され、宿主植物細胞における遺伝子の転写を変えるタンパク質である。ＴＡＬＥ反復アレイは、いかなる目的のＤＮＡ配列をも標的にするように、モジュラータンパク質設計を介して操作されることができる。ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインは、ＺＦＮを記載するサブセクションにおいて上に記載されるように、いかなるヌクレアーゼドメインでもあることができる。特異的な実施形態において、ヌクレアーゼドメインはＦｏｋＩ由来である（Sanjana et al., 2012, Nat Protoc, 7(1):171-192）。ＴＡＬＥＮは、二本鎖開裂活性またはニッカーゼ活性を有することができる。
メガヌクレアーゼまたはレア切断エンドヌクレアーゼ。さらに他の実施形態において、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、メガヌクレアーゼまたはその誘導体であることができる。メガヌクレアーゼは、長い認識配列、すなわち一般に約１２塩基対から約４５塩基対までの範囲である認識配列を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼである。該要件の結果として、該認識配列は、一般に、いかなる所与のゲノムにおいても一度のみ生じる。メガヌクレアーゼの中で、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧなる名前のホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーは、ゲノムの研究およびゲノム操作のための貴重なツールになった。いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、またはそれらのバリアントであることができる。メガヌクレアーゼは、当業者に周知の技術を使用してその認識配列を修飾することにより、特異的染色体配列に標的化されることができる。代替的な実施形態において、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、レア切断エンドヌクレアーゼまたはその誘導体であることができる。レア切断エンドヌクレアーゼは、その認識配列はゲノムにおいてはめったに生じず、好ましくはゲノムにおいて一度のみ生じる、部位特異的エンドヌクレアーゼである。レア切断エンドヌクレアーゼは、７－ヌクレオチド配列、８－ヌクレオチド配列、またはより長い認識配列を認識してもよい。レア切断エンドヌクレアーゼの非限定的な例は、ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＳｂｆＩ、およびＦｓｅＩを含む。
ヌクレアーゼドメインに連結されるプログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン。さらに追加の実施形態において、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、ヌクレアーゼドメインに連結されるプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質であることができる。ヌクレアーゼドメインは、ＺＦＮ（例えば、ヌクレアーゼドメインはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインであることができる）、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ由来であるヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９のＲｕｖＣまたはＨＮＨヌクレアーゼドメイン）、またはメガヌクレアーゼまたはレア切断エンドヌクレアーゼ由来であるヌクレアーゼドメインを記載するサブセクションにおいて上に記載されるもののいずれかであることができる。
キメラタンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、例えば、ジンクフィンガータンパク質または転写活性化因子様エフェクター等のいかなるプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質でもあることができる。あるいは、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、全てのヌクレアーゼ活性を欠くように欠失または変異により修飾された触媒的に不活性な（死んだ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質であることができる。例えば、該触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＲｕｖＣドメインが、Ｄ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａ変異を含み、ＨＮＨドメインが、Ｈ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６５Ａ、および／またはＮ８６３Ａ変異を含む触媒的に不活性な（死んだ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であることができる。あるいは、該触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ヌクレアーゼドメインにおいて同等な変異を含む触媒的に不活性な（死んだ）Ｃｐｆ１タンパク質であることができる。さらに他の実施形態において、該プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性が変異および／または欠失により取り除かれた、例えばＣ末端トランケーションを含むことができる触媒的に不活性なメガヌクレアーゼであることができる。
（ｉｉ）非ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質
代替的な実施形態において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、非ヌクレアーゼドメインに連結されるプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質であることができる。該プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター、触媒的に不活性な（死んだ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質、または触媒的に不活性な（死んだ）メガヌクレアーゼであることができる。例えば、該触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＲｕｖＣドメインが、Ｄ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａ変異を含み、ＨＮＨドメインが、Ｈ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６５Ａ、および／またはＮ８６３Ａ変異を含む触媒的に不活性な（死んだ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であることができる。あるいは、該触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ヌクレアーゼドメインにおける同等な変異を含む触媒的に不活性な（死んだ）Ｃｐｆ１タンパク質であることができる。
いくつかの実施形態において、キメラタンパク質の非ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡまたはクロマチン構造を変える（およびＤＮＡ配列を変えても変えなくてもよい）エピジェネティックな修飾ドメインであることができる。適切なエピジェネティックな修飾ドメインの非限定的な例は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、シトシンメチルトランスフェラーゼ）、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ＤＮＡ脱アミノ化（例えば、シトシンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グアニンデアミナーゼ）、ＤＮＡアミノ化、ＤＮＡ酸化活性、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性（例えば、ＨＡＴドメイン由来であるＥ１Ａ結合タンパク質ｐ３００）、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ活性、ヒストンキナーゼ活性、ヒストンホスファターゼ活性、ヒストンユビキチンリガーゼ活性、ヒストン脱ユビキチン化活性、ヒストンアデニル化活性、ヒストンデデニル化活性、ヒストンＳＵＭＯ化活性、ヒストン脱ＳＵＭＯ化活性、ヒストンリボシル化活性、ヒストン脱リボシル化活性、ヒストンミリストイル化活性、ヒストン脱ミリストイル化活性、ヒストンシトルストンアルキル化活性、ヒストン脱アルキル化活性、またはヒストン酸化活性を有するものを含む。特異的な実施形態において、該エピジェネティックな修飾ドメインは、シチジンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含むことができる。
他の実施形態において、キメラタンパク質の非ヌクレアーゼ修飾ドメインは、転写活性化ドメインまたは転写抑制因子ドメインであることができる。適切な転写活性化ドメインは、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体）、ＶＰ１６０、ＮＦκＢｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、ヒト熱ショック因子１（ＨＳＦ１）からの活性化ドメイン、またはＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）活性化ドメインを含むが、これらに限定されない。適切な転写抑制因子ドメインの非限定的な例は、誘導性ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）リプレッサードメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサー、ＩκＢリプレッサー、またはメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）リプレッサーを含む。転写活性化または転写抑制因子ドメインは、非共有結合的タンパク質－タンパク質、タンパク質－ＲＮＡ、またはタンパク質－ＤＮＡ相互作用を介して、ＤＮＡ結合タンパク質に遺伝的に融合されるか結合されることができる。
特定の実施形態において、キメラタンパク質の非ヌクレアーゼドメインは、シチジンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を含むことができる。
いくつかの実施形態において、非ヌクレアーゼ活性を有するキメラタンパク質は、少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含むことができる。検出可能な標識は、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、Ｈａｌｏタグ、または適切な蛍光色素）、検出タグ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン等）、量子ドット、または金粒子であることができる。
（ｃ）連結
本明細書において開示される融合タンパク質は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に連結される少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む。少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインおよびプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質との間の連結は、化学結合を介して直接的であることができ、または該連結は、リンカーを介して間接的であることができる。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、共有結合（例えば、ペプチド結合、エステル結合等）によりプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に直接連結されることができる。あるいは、化学結合は非共有結合的であることができる（例えば、イオン、静電、水素、疎水性、ファンデル相互作用、またはπ効果）。
他の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、リンカーによりプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に連結されることができる。リンカーは、１以上のその他の化学基を、少なくとも１つの共有結合を介して接続する化学基である。適切なリンカーは、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、核酸、有機リンカー分子（例えば、マレイミド誘導体、Ｎ－エトキシベンジルイミダゾール、ビフェニル－３，４’,５－トリカルボン酸、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル等）、ジスルフィドリンカー、およびポリマーリンカー（例えばＰＥＧ）を含む。リンカーは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル等を含むがこれらに限定されない１以上のスペーシング基を含むことができる。リンカーは、ニュートラルであるか、正または負の電荷を運ぶことができる。加えて、リンカーは、切断可能であり、その結果リンカーを別の化学基に接続するリンカーの共有結合は、ｐＨ、温度、塩濃度、光、触媒、または酵素を含む特定の条件下で破壊または開裂されることができる。
さらに他の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ペプチドリンカーによりプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に連結されることができる。該ペプチドリンカーは、柔軟なアミノ酸リンカー（例えば、小さい、非極性または極性アミノ酸を含む）であることができる。柔軟なリンカーの非限定的な例は、ＬＥＧＧＧＳ（配列番号：１）、ＴＧＳＧ（配列番号：２）、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号：３）、（ＧＧＧＧＳ）１－４（配列番号：４）、および（Ｇｌｙ）６－８（配列番号：５）を含む。あるいは、ペプチドリンカーは、剛性アミノ酸リンカーであることができる。かかるリンカーは、（ＥＡＡＡＫ）１－４（配列番号：６）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）２－５Ａ（配列番号：７）、ＰＡＰＡＰ（配列番号：８）、および（ＡＰ）６－８（配列番号：９）を含む。適切なリンカーの例は、当技術分野で周知であり、リンカーを設計するためのプログラムは容易に入手できる（Crasto et al., Protein Eng., 2000, 13(5):309-312）。
少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および／または内部位置に連結されることができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質のＮ末端に連結されることができる。他の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質のＣ末端に連結されることができる。さらに他の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、Ｎ末端に連結されることができ、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質のＣ末端に連結されることができる。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含むことができる。他の実施形態において、融合タンパク質は、２つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含むことができる。さらに他の実施形態において、融合タンパク質は、３つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含むことができる。追加の実施形態において、融合タンパク質は、４、５、または５つを超えるヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含むことができる。１以上のヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは同じでも異なっていてもよい。
融合タンパク質が２つ以上のヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む実施形態において、２つ以上のヌクレオソーム相互作用ドメインは、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質のいずれかの端、両端、および／または内部位置に連結されることができる。２つ以上のヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは同じでも異なっていてもよい。例えば、該複合体は、少なくとも２つのＨＭＧＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも２つのＨＭＧＮタンパク質、少なくとも１つのＨＭＧＤＮＡ結合ドメインおよび少なくとも１つのＨＭＧＮタンパク質、少なくとも１つのＨＭＧＤＮＡ結合ドメインまたはＨＭＧＮタンパク質およびヒストンＨ１バリアントからの少なくとも１つの中央ドメイン、少なくとも１つのＨＭＧＤＮＡ結合ドメインまたはＨＭＧＮタンパク質、少なくとも１つのヒストンＨ１バリアント中央ドメイン、およびクロマチンリモデリング複合体タンパク質からの少なくとも１つのドメイン、およびクロマチンリモデリング複合体タンパク質からの少なくとも１つのドメイン等を含むことができる。
（ｄ）所望の核局在化シグナル、細胞透過性ドメイン、および／またはマーカードメイン
本明細書において開示される融合タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、細胞透過性ドメイン、および／またはマーカードメインをさらに含むことができる。
核局在化シグナルの非限定的な例は、以下を含む：ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：１０）、ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号：１１）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号：１２）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：１３）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：１４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号：１５）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号：１６）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号：１７）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号：１８）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号：１９）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号：２０）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号：２１）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号：２２）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号：２３）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号：２４）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号：２５）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号：２６）、およびＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号：２７）。
適切な細胞透過性ドメインの例は、以下を含むが、これらに限定されない：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：２８）、ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：２９）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶＶ（配列番号：３０）、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：３１）、ＫＥＴＷＷＥＴ配列番号：３２）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号：３３）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号：３４）、ＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号：３５）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号：３６）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号：３７）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡ＝：３８）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号：３９）。
マーカードメインは、蛍光タンパク質および精製またはエピトープタグを含む。適切な蛍光タンパク質は、以下を含むが、これらに限定されない：緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＧＦＰ－２、タグＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、およびオレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）。適切な精製またはエピトープタグの非限定的な例は、６ｘＨｉｓ、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｍｙｃ等を含む。
少なくとも１つの核局在化シグナル、細胞透過性ドメイン、および／またはマーカードメインは、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および／または内部位置に位置することができる。
（ｅ）特異的融合タンパク質
一般に、融合タンパク質の少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン、ＨＭＧＮ１タンパク質、ＨＭＧＮ２タンパク質、ＨＭＧＮ３ａタンパク質、ＨＭＧＮ３ｂタンパク質、ヒストンＨ１中央グロビュールドメイン、模倣スイッチ（ＩＳＷＩ）タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、クロモドメイン－ヘリカーゼ－ＤＮＡタンパク質１（ＣＨＤ１）ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの組み合わせから選択される。
特異的な実施形態において、融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質である。例えば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)、Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9)、Streptococcus pasteurianus (SpaCas9)、 Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9)、Staphylococcus aureus (SaCas9)、Francisella novicida Cas9 (FnCas9)、Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9)、Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9)、 Francisella novicida Cpf1 (FnCpf1)、Acidaminococcus sp. Cpf1 (AsCpf1)、またはLachnospiraceae細菌ND2006 Cpf1 (LbCpf1)であることができる。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号：６１－７９のいずれかと少なくとも約８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。一般に、いかなるアミノ酸置換は保存的である、すなわち、グループ１：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；グループ２：セリン、システイン、スレオニン、およびメチオニン；グループ３：プロリン；グループ４：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；およびグループ５：アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミンのメンバー内の交換に限定される。種々の実施形態において、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：６１－７９のいずれかと、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８、または９９％配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、または配列番号：７９に記載のアミノ酸配列を有する。
（ＩＩ）複合体
本開示の別の局面は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲシステム（すなわち、ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびガイドＲＮＡ）および、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む複合体を包含する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＣＲＩＳＰＲシステムのＣＲＩＳＰＲタンパク質（すなわち、セクション（Ｉ）で上に記載されているＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質を含む複合体）に連結されることができる。他の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＣＲＩＳＰＲシステムのガイドＲＮＡに連結することができる。該連結は、セクション（Ｉ）（ｃ）で上に記載されているように、本質的に直接または間接であることができる。例えば、ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質に連結されることができ、ガイドＲＮＡは、アプタマー配列を含むことができ、その結果アプタマー結合タンパク質のＲＮＡアプタマー配列への結合は、クレオソーム相互作用タンパク質ドメインを該ガイドＲＮＡへ連結させる。
ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインはセクション（Ｉ）（ａ）で上に記載され、ＣＲＩＳＰＲタンパク質はセクション（Ｉ）（ｂ）で上に詳述される。ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有することができる（例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３であることができる）。例えば、複合体はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含むことができ、また複合体は２つのＣＲＩＳＰＲニッカーゼを含むことができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、全てのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾され、かつ非ヌクレアーゼ活性ドメインに連結されることができる（例えば、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有するドメイン）を欠くように修飾されることができる。いくつかの実施形態において、非ヌクレアーゼドメインはＲＮＡアプタマー結合タンパク質に連結されることもできる。
ガイドＲＮＡは、（ｉ）標的配列とハイブリダイズする５’末端でのガイド配列を含有するＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用するトランス活性化型（ｔｒａｎｓａｃｔｉｎｇ）ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む。各ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡガイド配列は異なる（すなわち、配列特異的である）。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一般に、特定の細菌種からのＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合するように設計されたガイドＲＮＡにおいて同じである。
ｃｒＲＮＡガイド配列は、二本鎖配列中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的配列（すなわちプロトスペーサー）とハイブリダイズするように設計されている。Ｃａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列は、５’－ＮＧＧ、５’－ＮＧＧＮＧ、５’－ＮＮＡＧＡＡＷ、および５’－ＡＣＡＹを含み、Ｃｐｆ１のＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＮを含む（ここでＮは任意のヌクレオチドとして定義され、ＷはＡまたはＴのいずれかとして定義され、そしてＹはＣまたはＴのいずれかとして定義される）。一般に、ｃｒＲＮＡガイド配列および標的配列との間の相補性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。特異的な実施形態において、該相補性は完全（すなわち１００％）である。種々の実施形態において、ｃｒＲＮＡガイド配列の長さは、約１５ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドの範囲であることができる。例えば、ｃｒＲＮＡガイド配列は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長であることができる。特異的な実施形態において、ｃｒＲＮＡは、約１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド長であることができる。
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用することができる１以上の１つのステムループ構造を形成する反復配列を含む。各ループおよびステムの長さは変動することができる。例えば、１以上のループは約３から約１０ヌクレオチドの範囲の長さであり、１以上のステムは約６から約２０塩基対の範囲の長さであることができる。１以上のステムは、１から約１０ヌクレオチドの１以上のバルジを含むことができる。
ｃｒＲＮＡは、約２５ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの範囲の長さであることができる。種々の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、約２５から約５０ヌクレオチド、約５９０から約７５ヌクレオチド、または約７５から約１００ヌクレオチドの範囲の長さであることができる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、約５０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲の長さであることができる。種々の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、約５０から約９０ヌクレオチド、約９０から約１１０ヌクレオチド、約１１０から約１３０ヌクレオチド、約１３０から約１５０ヌクレオチド、約から１５０から約１７０ヌクレオチド、約１７０から約２００ヌクレオチド、約２００から約２５０ヌクレオチド、または約２５０から約３００ヌクレオチドの範囲の長さであることができる。
一般に、ガイドＲＮＡにおけるｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、目的の細菌種における野生型ｔｒａｃｒＲＮＡのコーディング配列に基づいている。いくつかの実施形態において、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（またはｃｒＲＮＡ定常反復領域およびｃｒＲＮＡ定常反復領域と二重構造を形成するｔｒａｃｒＲＮＡの対応する５’領域）は、二次構造形成を促進し、二次構造安定性を増加させ、真核細胞における発現を促進し、編集効率を増加させる等のために修飾されることができる。例えば、１以上のヌクレオチド変化は、定常ガイドＲＮＡ配列中に導入されることができる（下記の実施例８を参照）。
ガイドＲＮＡは、単一の分子（すなわち、単一のガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）であることができ、ここで、ｃｒＲＮＡ配列はｔｒａｃｒＲＮＡ配列に連結される。あるいは、ガイドＲＮＡは２つの別個の分子であることができる。第１の分子は、５’末端でのｃｒＲＮＡガイド配列および第２の分子の５’末端と塩基対合できる３’末端での追加の配列を含み、ここで第２の分子は、第１の分子の３’末端と塩基対合できる５’配列、ならびに追加のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムのガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡのみを含むことができる。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの１以上のステムループ領域は、１以上のアプタマー配列を含むように修飾されることができる（Konermann et al., Nature, 2015, 517(7536):583-588; Zalatan et al., Cell, 2015, 160(1-2):339-50）。適切なＲＮＡアプタマータンパク質ドメインの例は、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７バクテリオファージコートタンパク質（ＰＣＰ）、ＭｕバクテリオファージＣｏｍタンパク質、ラムダバクテリオファージＮ２２タンパク質、ステム－ループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）、脆弱Ｘ精神遅滞症候群関連タンパク質１（ＦＸＲ１）、ＡＰ２０５、ＢＺ１３、ｆ１、ｆ２、ｆｄ、ｆｒ、ＩＤ２、ＪＰ３４／ＧＡ、ＪＰ５０１、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、Ｍ１２、ＭＸ１、ＮＬ９５、ＰＰ７、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ－β、ＴＷ１８、ＴＷ１９、およびＶＫ等のバクテリオファージ由来であるタンパク質、それらの断片、またはそれらの誘導体を含む。追加のアプタマー配列の長さは、約２０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチドの範囲であることができる。
ガイドＲＮＡは、標準リボヌクレオチド、修飾されたリボヌクレオチド（例えば、プソイドウリジン）、リボヌクレオチド異性体、および／またはリボヌクレオチド類似体を含むことができる。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含むことができる。検出可能な標識は、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、Ｈａｌｏタグ、または適切な蛍光色素）、検出タグ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン等）、量子ドット、または金粒子であることができる。当業者はｇＲＮＡの設計および構築に精通している；例えば、ｇＲＮＡ設計ツールは、インターネット上または商業的なソースから入手できる。
ガイドＲＮＡは、化学的に合成されるか、酵素的に合成されるか、またはそれらの組み合わせであることができる。例えばガイドＲＮＡは、標準的なホスホロアミダイトベースの固相合成法を使用して合成されることができる。あるいは、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡをファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター制御配列に作動可能に連結させることによりインビトロで合成されることができる。適切なファージプロモーター配列の例は、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６プロモーター配列、またはそれらのバリエーションを含む。ガイドＲＮＡが２つの別個の分子（すなわち、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む実施形態において、ｃｒＲＮＡは化学的に合成されることができ、ｔｒａｃｒＲＮＡは酵素的に合成されることができる。
（ＩＩＩ）核酸
本開示のさらなる局面は、セクション（Ｉ）で上に記載される融合タンパク質およびセクション（ＩＩ）で上に記載されるＣＲＩＳＰＲ複合体をコードする核酸を提供する。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、単一の核酸または複数の核酸によりコードされることができる。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、線形または円形、単一鎖または二本鎖であることができる。ＲＮＡまたはＤＮＡは、目的の真核細胞におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化できる。コドン最適化プログラムは、フリーウェアとして、または商業的なソースから入手できる。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ複合体の融合タンパク質またはタンパク質成分をコードする核酸は、ＲＮＡであることができる。ＲＮＡは、インビトロで酵素的に合成できる。このため、目的のタンパク質をコードするＤＮＡは、インビトロＲＮＡ合成のためにファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列に作動可能に連結されることができる。例えば、プロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列またはＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列のバリエーションであることができる。以下に詳述されるように、タンパク質をコードするＤＮＡは、ベクターの一部であることができる。かかる実施形態において、インビトロ転写されたＲＮＡは、精製され、キャップされ、および／またはポリアデニル化されることができる。他の実施形態において、複合体の融合タンパク質またはタンパク質成分をコードするＲＮＡは、自己複製ＲＮＡの一部であることができる（Yoshioka et al., Cell Stem Cell, 2013, 13:246-254）。自己複製ＲＮＡは、限られた数の細胞分裂のために自己複製可能な自己複製可能なプラス鎖単一鎖ＲＮＡであり、そして目的のタンパク質をコードするように修飾されることができる、非感染性の自己複製ベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルスＲＮＡレプリコン由来であることができる（Yoshioka et al., Cell Stem Cell, 2013, 13:246-254）。
他の実施形態において、融合タンパク質または複合体のＣＲＩＳＰＲタンパク質およびガイドＲＮＡをコードする核酸はＤＮＡであることができる。ＤＮＡコーディング配列は、目的の細胞における発現のための少なくとも１つのプロモーター制御配列に作動可能に連結されることができる。特定の実施形態において、ＤＮＡコーディング配列は、バクテリア（例えば、大腸菌）細胞または真核生物（例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物）におけるタンパク質またはＲＮＡの発現のためのプロモーター配列に作動可能に連結されることができる。適切な細菌プロモーターは、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペロンプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（ｔｒｐおよびｌａｃプロモーターのハイブリッド）、前述のいずれかのバリエーション、および前述のいずれかの組み合わせを含むが、これらに限定されない。適切な真核生物ＰｏｌＩＩプロモーターの非限定的な例は、構成的、調節された、または細胞または組織特異的プロモーターを含む。適切な真核生物構成的プロモーター制御配列は、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子（ＥＤ１）－アルファプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、その断片、または前述のいずれかの組み合わせを含むが、これらに限定されない。適切な真核生物調節プロモーター制御配列の例は、熱ショック、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールにより調節されるものを含むが、これらに限定されない。組織特異的プロモーターの非限定的な例は、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＮｐｈｓＩプロモーター、ＯＧ－２プロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、およびＷＡＳＰプロモーターを含む。プロモーター配列は、野生型であるか、またはより効率的または効果的な発現のために修飾されることができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡコーディング配列は、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナル等）および／または少なくとも１つの転写終結配列に連結されることもできる。ガイドＲＮＡをコードする配列は、真核細胞における発現のためのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター制御配列に作動可能に連結される。適切なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターの例は、哺乳動物Ｕ６、Ｕ３、Ｈ１、および７ＳＬ ＲＮＡプロモーターを含むが、これらに限定されない。場合によりは、複合体の融合タンパク質または成分は、細菌または真核細胞から精製されることができる。
種々の実施形態において、複合体の融合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲタンパク質およびガイドＲＮＡをコードする核酸は、ベクター中に存在することができる。適切なベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、および自己複製ＲＮＡを含む（Yoshioka et al., Cell Stem Cell, 2013, 13:246-254）。いくつかの実施形態において、複合体の融合タンパク質または成分をコードする核酸は、プラスミドベクター中に存在することができる。適切なプラスミドベクターの非限定的な例は、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、およびそれらのバリアントを含む。他の実施形態において、複合体の融合タンパク質または成分をコードする核酸は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター等）の一部であることができる。プラスミドまたはウイルスベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列等）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起源等を含むことができる。ベクターおよびその使用についての追加の情報は、「Current Protocols in Molecular Biology」 Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003または「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」 Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 第３版, 2001において見出されることができる。
（ＩＶ）キット
本開示のさらなる局面は、セクション（Ｉ）で上に詳述される融合タンパク質の少なくとも１つ、セクション（ＩＩ）で上に記載されるＣＲＩＳＰＲ複合体の少なくとも１つ、および／またはセクション（ＩＩＩ）で上に記載される核酸の少なくとも１つを含むキットを提供する。キットは、核酸導入試薬、細胞増殖培地、選択培地、インビトロ転写試薬、核酸精製試薬、タンパク質精製試薬、バッファー等をさらに含むことができる。ここで提供されるキットは、一般に以下に詳述される方法を実行するための指示を含む。キットに含まれる指示は、梱包材に添付されていても、または添付文書として含まれていてもよい。指示は典型的に書かれたまたは印刷されたものだが、それらに限定されない。かかる指示を保存し、それらをエンドユーザーに伝えることができる任意の媒体が、該開示により意図される。かかる媒体は、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤ ＲＯＭ）等を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される「指示」なる用語は、指示を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
（Ｖ）細胞
本開示は、セクション（Ｉ）で上に詳述される融合タンパク質の少なくとも１つ、セクション（ＩＩ）で上に記載されるＣＲＩＳＰＲ複合体の少なくとも１つ、および／またはセクション（ＩＩＩ）で上に記載される核酸の少なくとも１つを含む細胞をも提供する。一般に、細胞は真核細胞である。例えば、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または単一細胞真核生物であることができる。
（ＶＩ）標的化されたゲノム、転写、またはエピジェネティックな修飾の効率を増加させるための方法
本開示の別の局面は、染色体ＤＮＡにおけるその標的配列へのプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質のアクセシビリティを増加させることにより、真核細胞における標的化されたゲノム修飾、標的化された転写修飾、または標的化されたエピジェネティックな修飾の効率を増加させるための方法を包含する。いくつかの実施形態において、該方法は、セクション（Ｉ）で上に記載される融合タンパク質の少なくとも１つ、セクション（ＩＩ）で上に記載されるＣＲＩＳＰＲ複合体の少なくとも１つ、またはセクション（ＩＩＩ）で上に記載される融合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ複合体の少なくとも１つをコードする核酸、および所望によりドナーポリヌクレオチドを目的の真核細胞中に導入することを含む。
融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、染色体ＤＮＡの標的配列を認識してそれに結合するように操作され、そして融合タンパク質の１以上のヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、標的配列でのまたはその近くのヌクレオソームと相互作用し、ヌクレオソームおよび／またはクロマチン構造を変えるか改造する。結果として、ＤＮＡ修飾タンパク質は、標的染色体配列への増加したアクセスを有し、その結果ＤＮＡ修飾タンパク質による修飾の効率は増加される。特異的な実施形態において、融合タンパク質は、標的配列でのまたはその近くのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインおよびヌクレオソーム／クロマチンとの間の相互作用が標的化されたゲノム修飾への効率を増加させるように、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに連結される少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む（実施例１～８を参照）。
ゆえに、本明細書において開示される方法は、標的化されたゲノム編集（例えば、遺伝子校正、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン等）、標的化されたエピジェネティックな修飾、および標的化された転写調節の効率を増加させることができる。
（ａ）細胞中への導入
上記のように、該方法は、少なくとも１つの融合タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ複合体、または該融合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ複合体をコードする核酸（および、所望により、ドナーポリヌクレオチド）を細胞中に導入することを含む。様々な手段により、少なくとも１つの融合タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ複合体、または核酸は、目的の細胞中に導入されることができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、適切な分子（すなわち、タンパク質、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ）で核酸導入されることができる。適切な核酸導入方法は、ヌクレオフェクション（またはエレクトロポレーション）、リン酸カルシウムを介した核酸導入、カチオン性ポリマー核酸導入（例えば、ＤＥＡＥ－デキストランまたはポリエチレンイミン）、ウイルス形質導入、ウイロソーム核酸導入、ビリオン核酸導入、リポソーム核酸導入、カチオン性リポソーム核酸導入、免疫リポソーム核酸導入、非リポソーム脂質核酸導入、デンドリマー核酸導入、熱ショック核酸導入、マグネトフェクション（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、リポフェクション、遺伝子銃送達、インペイルフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、ソノポレーション、光核酸導入、および独自の薬剤増強核酸取り込みを含む。核酸導入法は、当技術分野で周知である（例えば、「Current Protocols in Molecular Biology」 Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 または「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」 Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 第3版, 2001を参照）。他の実施形態において、分子は、マイクロインジェクションにより細胞中に導入されることができる。例えば、分子は、目的の細胞の細胞質または核中に注入されることができる。細胞中に導入される各分子の量は変動することができるが、当業者は適切な量を決定する手段に精通している。
種々の分子は、同時にまたは連続して細胞中に導入されることができる。例えば、融合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ複合体（またはコード核酸）およびドナーポリヌクレオチドは、同時に導入されることができる。あるいは、一方が最初に導入され、次いでもう一方が後で細胞中に導入されることができる。
一般に、細胞は、細胞成長および/または維持に適した条件下で維持される。適切な細胞培養条件は当技術分野で周知であり、例えば、Santiago et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105:5809-5814; Moehle et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104:3055-3060; Urnov et al., Nature, 2005, 435:646-651; およびLombardo et al., Nat. Biotechnol., 2007, 25:1298-1306において記載される。当業者は、細胞を培養する方法が当技術分野で既知であり、細胞型に応じて変動することができ、そして変動するであろうことを理解する。全ての場合において、特定の細胞型に最良の技術を決定するために、定期的な最適化が使用されてもよい。
（ｂ）標的化されたゲノムまたはエピジェネティックな修飾
融合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ複合体の１以上のヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、標的染色体配列でのまたはその近くのヌクレオソームおよび／または染色体ＤＮＡと相互作用し、その結果ヌクレオソームおよび／またはクロマチン構造は変えられ／改造され、それにより、融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ複合体のＣＲＩＳＰＲタンパク質の標的染色体配列へのアクセシビリティが増加する。標的染色体配列への増加したアクセスは、標的化されたゲノム、転写、またはエピジェネティックな修飾の増加した頻度／効率をもたらす。
融合タンパク質が、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質を含む実施形態において、融合タンパク質は、標的化された染色体配列の一方または両方の鎖を開裂することができる。二本鎖破壊は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復プロセスにより修復されることができる。ＮＨＥＪはエラーが発生しやすいため、少なくとも１つの塩基対のインデル（すなわち、欠失または挿入）、少なくとも１つの塩基対の置換、またはそれらの組み合わせは、該破壊の修復中に生じることができる。したがって、標的化された染色体配列は、修飾され、変異され、または不活性化されることができる。例えば、コーディング配列のリーディングフレームにおける欠失、挿入、または置換は、変えられたタンパク質産物につながるか、またはタンパク質産物をなくすことができる（「ノックアウト」と呼ばれる）。いくつかの繰り返しにおいて、該方法は、標的染色体配列のいずれかの側に位置する配列に実質的配列同一性を有する配列が隣接するドナー配列を含むドナーポリヌクレオチド（以下を参照）を細胞に導入することをさらに含むことができ、その結果相同性指向修復プロセス（ＨＤＲ）による二本鎖破壊の修復中、ドナーポリヌクレオチドにおけるドナー配列は、標的染色体配列での染色体配列と交換またはその中に組み込まれることができる。外因性配列の組み込みは、「ノックイン」と呼ばれる。
したがって、種々の繰り返しにおいて、標的化されたゲノム修飾の効率は、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインに連結されない親のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に対して、少なくとも約０．１倍、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または約１００倍以上増加されることができる。
融合タンパク質が、非ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質を含む実施形態において、融合タンパク質は、標的染色体配列でのＤＮＡまたは関連タンパク質を修飾するか、または該標的染色体配列の発現を修飾することができる。例えば、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がエピジェネティックな修飾活性を含む場合、ヒストンのアセチル化、メチル化、リン酸化、アデニル化等の状態が修飾されるか、またはＤＮＡメチル化、アミノ化等の状態が修飾されることができる。例として、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がシチジンデアミナーゼ活性を含む実施形態において、標的染色体配列での１以上のシチジン残基は、ウリジン残基に変換されることができる。あるいは、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が転写活性化またはリプレッサー活性を含む場合、標的染色体配列での転写は増加または減少されることができる。
結果として生じるエピジェネティックな修飾または転写調節は、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインに連結されない親のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に対して、少なくとも約０．１倍、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍増、少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または約１００倍以上増加されることができる。
上に詳述される標的化されたゲノム、転写、エピジェネティックな修飾は、単独で実施されるかまたは多重化されることができる（すなわち、２つ以上の染色体配列が同時に標的化されることができる）。
（ｃ）所望のドナーポリヌクレオチド
融合タンパク質が、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質を含む実施形態において、該方法は、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを細胞中に導入することをさらに含むことができる。ドナーポリヌクレオチドは、単一鎖または二本鎖、線形または円形、および／またはＲＮＡまたはＤＮＡであることができる。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドはベクター、例えばプラスミドベクターであることができる。
ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも１つのドナー配列を含む。いくつかの局面において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、内因性または固有の染色体配列の修飾されたバージョンであることができる。例えば、ドナー配列は、ＤＮＡ修飾タンパク質により標的化された配列でのまたはその近くの染色体配列の一部と本質的に同一であることができるが、それは少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。ゆえに、固有の配列との組み込みまたは交換の際、標的化された染色体位置での配列は、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。例えば、該変化は、１以上のヌクレオチドの挿入、１以上のヌクレオチドの欠失、１以上のヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせであることができる。修飾された配列の「遺伝子校正」組み込みの結果として、細胞は、標的化された染色体配列から修飾された遺伝子産物を製造することができる。
他の局面において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は外因性配列であることができる。本明細書で使用される「外因性」配列は、細胞に固有ではない配列、または固有の位置が細胞のゲノムにおける異なる位置にある配列を指す。例えば、外因性配列は、タンパク質コーディング配列を含むことができ、これは、外因性プロモーター制御配列に作動可能に連結されることができ、その結果ゲノム中への組み込みの際、細胞は、組み込まれた配列によりコード化されたタンパク質を発現できる。あるいは、外因性配列は、その発現が内因性プロモーター制御配列により調節されるように、染色体配列中に組み込まれることができる。他の繰り返しにおいて、外因性配列は、転写制御配列、別の発現制御配列、ＲＮＡコーディング配列等であることができる。上記のように、外因性配列の染色体配列中への組み込みは「ノックイン」と呼ばれる。
当業者が理解できるように、ドナー配列の長さは、変動することができ、そして変動するであろう。例えば、ドナー配列は、数個のヌクレオチドから数百個のヌクレオチドまで数十万個のヌクレオチドまでの長さにおいて変動することができる。
典型的に、ドナーポリヌクレオチドにおけるドナー配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質により配列標的化された配列のそれぞれ上流および下流に位置する配列に対して実質的配列同一性を有する上流配列および下流配列に隣接している。これらの配列の類似性のため、ドナーポリヌクレオチドの上流および下流の配列は、ドナーポリヌクレオチドおよび標的化された染色体配列との間の相同組み換えを可能にし、その結果ドナー配列は、染色体配列中に組み込まれる（またはそれと交換される）ことができる。
本明細書で使用される上流配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質により標的化された配列の上流の染色体配列と実質的配列同一性を共有する核酸配列を指す。同様に、下流の配列を、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質により標的化された配列の下流の染色体配列と実質的配列同一性を共有する核酸配列を指す。本明細書で使用される「実質的配列同一性」なる語句は、少なくとも約７５％の配列同一性を有する配列を指す。ゆえに、ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的配列に対して上流または下流の配列と、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を有することができる。例示的な実施形態において、ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流の配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質により標的化された配列の上流または下流の染色体配列と、約９５％または１００％の配列同一性を有することができる。
いくつかの実施形態において、上流配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質により標的化された配列のすぐ上流に位置する染色体配列と実質的配列同一性を共有する。他の実施形態において、上流配列は、標的配列から約１００ヌクレオチド以内の上流に位置する染色体配列と、実質的配列同一性を共有する。ゆえに、例えば、上流配列は、約１から約２０、約２１から約４０、約４１から約６０、約６１から約８０、または約８１から１００ヌクレオチド標的配列の上流に位置する染色体配列と、実質的配列同一性を共有できる。いくつかの実施形態において、下流の配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質により標的化された配列のすぐ下流に位置する染色体配列と、実質的配列同一性を共有する。他の実施形態において、下流の配列は、標的配列から約１００ヌクレオチド下流に位置する染色体配列と、実質的配列同一性を共有する。ゆえに、例えば、下流の配列は、約１から約２０、約２１から約４０、約４１から約６０、約６１から約８０、または約８１から１００ヌクレオチド標的配列の下流に位置する染色体配列と、実質的配列同一性を共有できる。
上流または下流の各配列は、約２０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの範囲の長さであることができる。いくつかの実施形態において、上流および下流配列は、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、または５０００ヌクレオチドを含むことができる。特異的な実施形態において、上流および下流の配列の長さは、約５０から約１５００ヌクレオチドの範囲の長さであることができる。
（ｄ）細胞型
様々な細胞は、本明細書において開示される方法における使用に適している。一般に、細胞は真核細胞である。例えば、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または単一細胞真核生物であることができる。いくつかの実施形態において、細胞は単細胞胚であることもできる。例えば、非ヒト哺乳動物胚は、ラット、ハムスター、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、および霊長類の胚を含む。さらに他の実施形態において、細胞は、胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞等の幹細胞であることができる。ある実施形態において、幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。さらに、幹細胞は、その全体が本明細書に組み込まれているＷＯ２００３／０４６１４１またはChung et al.（Cell Stem Cell, 2008, 2:113-117）に開示された技術により作製されたものを含んでもよい。細胞は、インビトロまたはインビボ（すなわち生物内）であることができる。例示的な実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞または哺乳動物細胞系である。特定の実施形態において、細胞は、ヒト細胞またはヒト細胞系である。
適切な哺乳動物細胞または細胞系の非限定的な例は、以下を含む：ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；ヒトＵ２－ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＡ－４３１細胞、およびヒトＫ５６２細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、マウス胚線維芽細胞３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞；マウス黒色腫Ｂ１６細胞；マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞；マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞；マウス胚間葉Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２細胞；マウス癌ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞；マウス乳房ＥＭＴ６細胞；マウス肝癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞；マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞；マウス上皮ＭＴＤ－１Ａ細胞；マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞；マウス腎ＲｅｎＣａ細胞；マウス膵臓ＲＩＮ－５Ｆ細胞；マウス黒色腫Ｘ６４細胞；マウスリンパ腫ＹＡＣ－１細胞；ラット膠芽腫９Ｌ細胞；ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞；ラット神経芽細胞腫Ｂ３５細胞；ラット肝癌細胞（ＨＴＣ）；バッファローラット肝臓ＢＲＬ３Ａ細胞；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；イヌ乳腺（ＣＭＴ）細胞；ラット骨肉腫Ｄ１７細胞；ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞；サル腎臓ＳＶ－４０形質転換線維芽細胞（ＣＯＳ７）細胞；サル腎臓ＣＶＩ－７６細胞；アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ－７６）細胞。哺乳動物細胞系の広範なリストは、アメリカ培養細胞系統保存機関カタログ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）において見いだされてもよい。
（ＶＩ）特異的遺伝子座を検出するための方法
融合タンパク質が非ＤＮＡ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾を含むか、またはＣＲＩＳＰＲ複合体が非ヌクレアーゼ活性を有する触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む実施形態において、該融合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ複合体は、真核細胞における特異的ゲノム遺伝子座を検出または視覚化する方法において使用されることができる。かかる実施形態において、融合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲタンパク質は、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、Ｈａｌｏタグ、または適切な蛍光色素）、検出タグ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン等）、量子ドット、または金粒子等の少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含む。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ複合体のガイドＲＮＡは、ｉｎ ｓｉｔｕ検出用の検出可能な標識（例えば、ＦＩＳＨまたはＣＩＳＨ）をさらに含むことができる。融合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ複合体の少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、非ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはＣＲＩＳＰＲタンパク質の標的染色体配列へのアクセスを増加させ、それにより特異的ゲノム遺伝子座または標的化された染色体配列の検出が増強される。
該方法は、検出可能に標識された融合タンパク質、検出可能に標識されたＣＲＩＳＰＲ複合体、またはコード核酸を真核細胞中に導入し、標的染色体配列に結合した標識されたプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質または標識されたＣＲＩＳＰＲタンパク質を検出することを含む。該検出することは、動的生細胞イメージング、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、免疫蛍光、免疫検出、ＲＮＡ－タンパク質結合、タンパク質－タンパク質結合等を介してであることができる。検出工程は、生細胞または固定された細胞において実施されることができる。
該方法が生細胞においてクロマチン構造動力学を検出することを含む実施形態において、検出可能に標識された融合タンパク質または検出可能に標識されたＣＲＩＳＰＲ複合体は、タンパク質または核酸として細胞中に導入されることができる。該方法が、固定された細胞において標的化された染色体配列を検出することを含む実施形態において、検出可能に標識された融合タンパク質または検出可能に標識されたＣＲＩＳＰＲ複合体は、タンパク質（またはタンパク質－ＲＮＡ複合体）として細胞中に導入されることができる。細胞を固定および透過処理する手段は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態において、固定された細胞は、二本鎖染色体ＤＮＡを単一鎖ＤＮＡに変換するための化学的および／または熱変性プロセスを受けることができる。他の実施形態において、固定された細胞は、化学的および／または熱変性プロセスを受けない。
（ＶＩＩＩ）適用
本明細書において開示される組成物および方法は、様々な治療、診断、産業、および研究適用において使用されることができる。いくつかの実施形態において、本開示は、細胞、動物、または植物における目的の任意の染色体配列を修飾し、遺伝子の機能をモデル化および/または研究し、遺伝的またはエピジェネティックな目的の条件を研究し、または種々の疾患または障害に関与する生化学経路を研究するために、使用されることができる。例えば、疾患または障害をモデル化するトランスジェニック生物が作成されることができる。ここで、疾患または障害に関連する１以上の核酸配列の発現が変えられる。疾患モデルは、生物への変異の効果を研究し、疾患の発生および/または進行を研究し、疾患に対する薬学的活性化合物の効果を研究し、および/または潜在的な遺伝子治療戦略の効果を評価するために使用されることができる。
他の実施形態において、組成物および方法は、特定の生物学的プロセスに関与する遺伝子の機能および、遺伝子発現における任意の変化がどのように生物学的プロセスに影響を与えることができるのかを研究し、または細胞表現型と組み合わせてゲノム遺伝子座の飽和またはディープスキャニング突然変異導入を実施するために使用できる、効率的かつ費用効果の高い機能的ゲノムスクリーニングを実施するために使用できる。飽和またはディープスキャニング突然変異導入は、例えば遺伝子発現、薬剤耐性、疾患の反転に必要な機能要素の重要な最小特徴および個別の脆弱性を決定するために使用できる。
さらなる実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法は、疾患または障害の存在を確定する診断テストのため、および／または処置オプションの決定における使用のために使用できる。適切な診断テストの例は、がん細胞における特異的変異の検出（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２等における特異的変異）、特定の疾患に関連する特異的変異の検出（例えば、トリヌクレオチド反復、鎌状赤血球疾患に関連するβグロビンにおける変異、特異的ＳＮＰ等）、肝炎の検出、ウイルス（例えばジカ）の検出等を含む。
追加の実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法は、特定の疾患または障害に関連する遺伝的変異を修正するため、例えば、鎌状赤血球症またはサラセミアに関連するグロビン遺伝子変異を修正する、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）に関連するアデノシンデアミナーゼ遺伝子における変異を修正する、ＨＴＴ、ハンチントン病の疾患を引き起こす遺伝子の発現を減少させる、または色素性網膜炎の処置のためのロドプシン遺伝子における変異を修正するために使用できる。かかる修飾は、エクスビボで細胞において行われてもよい。
さらに他の実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法は、改善された特性または環境ストレスに対する増加した抵抗性を有する作物を生成するために使用できる。本開示は、改善された特性を有する家畜または製造動物を生成するためにも使用できる。例えば、ブタは、特に再生医療または異種移植において、生物医学モデルとしてａｔｔｒ活性をもたらす多くの特徴を有する。
（ＩＸ）列挙される実施形態
以下に列挙される実施形態は、本発明の特定の局面を実証するために示され、その範囲を限定することは意図されない。
１．プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に連結される少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む、融合タンパク質。
２．実施形態１の融合タンパク質であって、ここで、該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２、またはＨＭＧＢ３から選択される高移動度群（ＨＭＧ）ボックス（ＨＭＧＢ）タンパク質からのＤＮＡ結合ドメイン；ＨＭＧＮ１、ＨＭＧＮ２、ＨＭＧＮ３ａ、ＨＭＧＮ３ｂ、ＨＭＧＮ４、またはＨＭＧＮ５から選択されるＨＭＧヌクレオソーム結合（ＨＭＧＮ）タンパク質；ヒストンＨ１バリアントからの中央グロビュールドメイン；スイッチ／スクロース非発酵性（ＳＷＩ／ＳＮＦ）複合体、模倣スイッチ（ＩＳＷＩ）複合体、クロモドメイン－ヘリカーゼ－ＤＮＡ結合（ＣＨＤ）複合体、ヌクレオソームリモデリングおよびデアセチラーゼ（ＮｕＲＤ）複合体、ＩＮＯ８０複合体、ＳＷＲ１複合体、ＲＳＣ複合体、またはそれらの組み合わせから選択されるクロマチンリモデリング複合体タンパク質からのＤＮＡ結合ドメインである、融合タンパク質。
３．実施形態２の融合タンパク質であって、ここで、該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、ＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン、ＨＭＧＮ１タンパク質、ＨＭＧＮ２タンパク質、ＨＭＧＮ３ａタンパク質、ＨＭＧＮ３ｂタンパク質、ヒストンＨ１中央グロビュールドメイン、ＩＳＷＩタンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、ＣＨＤ１タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの組み合わせである、融合タンパク質。
４．実施形態１～３のいずれか一つの融合タンパク質であって、ここで、該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する、融合タンパク質。
５．実施形態４の融合タンパク質であって、ここで、該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、クラスター化規則的散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼまたはニッカーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼドメインに連結されるプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である、融合タンパク質。
６．実施形態１～３のいずれか一つの融合タンパク質であって、ここで、該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、非ヌクレアーゼ活性を有する、融合タンパク質。
７．実施形態６の融合タンパク質であって、ここで、該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、非ヌクレアーゼドメインに連結されるプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である、融合タンパク質。
８．実施形態７の融合タンパク質であって、ここで、該プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインが、全てのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾されたＣＲＩＳＰＲタンパク質、ジンクフィンガータンパク質、または転写活性化因子様エフェクターである、融合タンパク質。
９．実施形態７の融合タンパク質であって、ここで、該非ヌクレアーゼドメインが、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、シトルリン化活性、ヘリカーゼ活性、アミノ化活性、脱アミノ化活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、酸化活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、融合タンパク質。
１０．実施形態９の融合タンパク質であって、ここで、該非ヌクレアーゼドメインが、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、融合タンパク質。
１１．実施形態１～１０のいずれか一つの融合タンパク質であって、ここで、該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、化学結合を介して直接的に、リンカーを介して間接的に、またはそれらの組み合わせにより該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に連結される、融合タンパク質。
１２．実施形態１～１１のいずれか一つの融合タンパク質であって、ここで、該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、そのＮ末端、Ｃ末端、内部位置、またはそれらの組み合わせで該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に連結される、融合タンパク質。
１３．実施形態１～１２のいずれか一つの融合タンパク質であって、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、融合タンパク質。
１４．少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインに連結されるクラスター化規則的散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）タンパク質を含む、融合タンパク質。
１５．実施形態１４の融合タンパク質であって、ここで、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼである、または該ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼまたはニッカーゼである、融合タンパク質。
１５．実施形態１４の融合タンパク質であって、ここで、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、全てのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾され、かつ非ヌクレアーゼドメインに連結されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質、または全てのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾され、かつ非ヌクレアーゼドメインに連結されるＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１タンパク質である、融合タンパク質。
１７．実施形態１６の融合タンパク質であって、ここで、該非ヌクレアーゼドメインが、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、融合タンパク質。
１８．実施形態１４～１７のいずれか一つの融合タンパク質であって、ここで、該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、高移動度群（ＨＭＧ）ボックス（ＨＭＧＢ）ＤＮＡ結合ドメイン、ＨＭＧヌクレオソーム結合（ＨＭＧＮ）タンパク質、ヒストンＨ１バリアントからの中央グロビュールドメイン、クロマチンリモデリング複合体タンパク質からのＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの組み合わせである、融合タンパク質。
１９．実施形態１８の融合タンパク質であって、ここで、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、ＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン、ＨＭＧＮ１タンパク質、ＨＭＧＮ２タンパク質、ＨＭＧＮ３ａタンパク質、ＨＭＧＮ３ｂタンパク質、ヒストンＨ１中央グロビュールドメイン、模倣スイッチ（ＩＳＷＩ）タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、クロモドメイン－ヘリカーゼ－ＤＮＡタンパク質１（ＣＨＤ１）ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの組み合わせである、融合タンパク質。
２０．実施形態１４～１９のいずれか一つの融合タンパク質であって、ここで、該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、化学結合を介して直接的に、リンカーを介して間接的に、またはそれらの組み合わせにより該ＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結される、融合タンパク質。
２１．実施形態１４～２０のいずれか一つの融合タンパク質であって、ここで、該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、そのＮ末端、Ｃ末端、内部位置、またはそれらの組み合わせで該ＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結される、融合タンパク質。
２２．実施形態１４～２１のいずれか一つの融合タンパク質であって、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、融合タンパク質。
２３．実施形態１４～２２のいずれか一つの融合タンパク質であって、ここで、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)、Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9)、 Streptococcus pasteurianus (SpaCas9)、Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9)、Staphylococcus aureus (SaCas9)、Francisella novicida Cas9 (FnCas9)、Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9)、 Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9)、Francisella novicida Cpf1 (FnCpf1)、Acidaminococcus sp. Cpf1 (AsCpf1)、またはLachnospiraceae 細菌ND2006 Cpf1 (LbCpf1)である、融合タンパク質。
２４．実施形態１４～２３のいずれか一つの融合タンパク質であって、ここで、該融合タンパク質が、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、または配列番号：７９と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、融合タンパク質。
２５．実施形態１４～２４のいずれか一つの融合タンパク質であって、ここで、該融合タンパク質が、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、または配列番号：７９に記載のアミノ酸配列を有する、融合タンパク質。
２６．実施形態１４～２５のいずれか一つの少なくとも１つの融合タンパク質および少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む、複合体。
２７．実施形態１～２５のいずれか一つの融合タンパク質をコードする、核酸。
２８．実施形態２７の核酸であって、真核細胞における翻訳のためにコドン最適化される、核酸。
２９．実施形態２７または２８の核酸であって、ウイルスベクター、プラスミドベクター、または自己複製ＲＮＡの一部である、核酸。
３０．真核細胞における標的化されたゲノムまたはエピジェネティックな修飾の効率を増加させるための方法であって、該方法は、該真核細胞中へ、実施形態１～２５のいずれか一つにおいて記載される少なくとも１つの融合タンパク質、または実施形態２７～２９のいずれか一つにおいて記載される少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸を導入することを含み、ここで、該少なくとも１つの融合タンパク質の該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、標的染色体配列に標的化され、かつ該少なくとも１つの融合タンパク質の該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヌクレオソームまたはクロマチン構造を変え、その結果該少なくとも１つの融合タンパク質は該標的染色体配列への増加したアクセスを有し、それにより標的化されたゲノムまたはエピジェネティックな修飾の効率が増加する、方法。
３１．実施形態３０の方法であって、ここで、該該少なくとも１つの融合タンパク質の該ＤＮＡ修飾タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質を含み、かつ該方法は、少なくとも１つのガイドＲＮＡまたは該少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする核酸を該真核細胞中へ導入することをさらに含む、方法。
３２．実施形態３０または３１の方法であって、ここで、該方法は、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチド、少なくとも１つのドナー配列を含むドナーポリヌクレオチドを該真核細胞中へ導入することをさらに含む、方法。
３３．実施形態３０～３２のいずれか一つの方法であって、ここで、該真核細胞がインビトロである、方法。
３４．実施形態３０～３２のいずれか一つの方法であって、ここで、該真核細胞がインビボである、方法。
３５．実施形態３０～３４のいずれか一つの方法であって、ここで、該真核細胞が哺乳動物細胞である、方法。
３６．実施形態３０～３５のいずれか一つの方法であって、ここで、該真核細胞がヒト細胞である、方法。
３７．真核細胞における標的化されたゲノムまたはエピジェネティックな修飾の効率を増加させるための方法であって、該方法は、該真核細胞中へ、（ａ）少なくとも１つの融合タンパク質または少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸、ここで各融合タンパク質は、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインに連結されるＣＲＩＳＰＲタンパク質を含み、ここで該ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、（ｉ）ヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有するか、または（ｉｉ）全てのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾され、かつ非ヌクレアーゼドメインに連結される；および（ｂ）少なくとも１つのガイドＲＮＡまたは少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする核酸を導入することを含み；ここで、該少なくとも１つの融合タンパク質の該ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、標的染色体配列に標的化され、かつ該少なくとも１つの融合タンパク質の該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヌクレオソームまたはクロマチン構造を変え、その結果該少なくとも１つの融合タンパク質は該標的染色体配列への増加したアクセスを有し、それにより標的化されたゲノムまたはエピジェネティックな修飾の効率が増加する、方法。
３８．実施形態３７の方法であって、ここで、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１タンパク質である、方法。
３９．実施形態３７または３８の方法であって、ここで、該非ヌクレアーゼドメインが、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、方法。
４０．実施形態３７～３９のいずれか一つの方法であって、ここで、該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、高移動度群（ＨＭＧ）ボックス（ＨＭＧＢ）ＤＮＡ結合ドメイン、ＨＭＧヌクレオソーム結合（ＨＭＧＮ）タンパク質、ヒストンＨ１バリアントからの中央グロビュールドメイン、クロマチンリモデリング複合体タンパク質からのＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの組み合わせである、方法。
４１．実施形態３７～４０のいずれか一つの方法であって、ここで、該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、化学結合を介して直接的に、リンカーを介して間接的に、またはそれらの組み合わせにより該ＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結される、方法。
４２．実施形態３７～４１のいずれか一つの方法であって、ここで、該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および／または内部位置に連結される、方法。
４３．実施形態３７～４２のいずれか一つの方法であって、ここで、該少なくとも１つの融合タンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、方法。
４４．実施形態３７～４３のいずれか一つの方法であって、ここで、該少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸が、真核細胞における翻訳のためにコドン最適化される、方法。
４５．実施形態３７～４４のいずれか一つの方法であって、ここで、該少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸が、ウイルスベクター、プラスミドベクター、または自己複製ＲＮＡの一部である、方法。
４６．実施形態３７～４５のいずれか一つの方法であって、ここで、該方法は、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチド、少なくとも１つのドナー配列を含むドナーポリヌクレオチドを該真核細胞中へ導入することをさらに含む、方法。
４７．実施形態３７～４６のいずれか一つの方法であって、ここで、該真核細胞がインビトロである、方法。
４８．実施形態３７～４６のいずれか一つの方法であって、ここで、該真核細胞がインビボである、方法。
４９．実施形態３７～４８のいずれか一つの方法であって、ここで、該真核細胞が哺乳動物細胞である、方法。
５０．実施形態３７～４８のいずれか一つの方法であって、ここで、該真核細胞がヒト細胞である、方法。
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、該発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本発明で使用される用語の多くの一般的定義を提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology（第２版1994）; The Cambridge Dictionary of Science and Technology（Walker ed., 1988）; The Glossary of Genetics, 第５版, R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限り、それらに帰せられる意味を有する。
本開示またはその好ましい実施形態の要素を導入する場合、冠詞「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、「該（ｔｈｅ）」および「該（ｓａｉｄ）」は、該要素の１以上があることを意味するように意図される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」なる用語は、包括的であるように、そしてリストされた要素以外の追加の要素があってもよいことを意味するように意図される。
「約」なる用語は、数値ｘに関して使用される場合、例えばｘ±５％を意味する。
本明細書で使用される場合、「相補的」または「相補性」なる用語は、特異的水素結合による塩基対合による二本鎖核酸の関連を指す。塩基対合は、標準的なワトソン－クリック塩基対合（例えば、５’－ＡＧＴＣ－３’が、相補的な配列３’－ＴＣＡＧ－５’とペアになる）であってもよい。塩基対合は、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であってもよい。相補性は典型的に、二重領域に関して測定され、ゆえに、例えばオーバーハングを除く。二重領域の２本の鎖間の相補性は部分的であってもよく、塩基の一部（例えば７０％）のみが相補的である場合、パーセンテージ（例えば７０％）で表されてもよい。相補的でない塩基は「不一致」である。二重領域内の全ての塩基が相補的である場合、相補性は完全（すなわち１００％）であってもよい。
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲシステム」なる用語は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質（すなわち、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、または触媒的に死んだタンパク質）およびガイドＲＮＡを含む複合体を指す。
本明細書で使用される場合、「内因性配列」なる用語は、細胞に固有の染色体配列を指す。
本明細書で使用される場合、「外因性」なる用語は、細胞に固有ではない配列、または細胞のゲノム中の固有の位置が異なる染色体位置にある染色体配列を指す。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、かかる調節配列がコーディングおよび／または転写された配列に隣接しているかどうかに関わらず、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エクソンおよびイントロンを含む）、ならびに遺伝子産物の製造を調節する全てのＤＮＡ領域を指す。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位等の翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
「異種」なる用語は、目的の細胞にとって内因性または固有ではない実体を指す。例えば、異種のタンパク質は、外因性のソース由来であるか、またはもともと外因性のソース由来であった、外因的に導入された核酸配列等のタンパク質を指す。場合によりは、異種のタンパク質は通常、目的の細胞により製造されない。
「ニッカーゼ」なる用語は、二本鎖核酸配列の１本の鎖を開裂する（すなわち、二本鎖配列にニックを入れる）酵素を指す。例えば、二重鎖開裂活性を有するヌクレアーゼは、ニッカーゼとして機能し、二本鎖配列の１本の鎖のみを開裂するように、変異および／または欠失により修飾されることができる。
本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」なる用語は、二本鎖核酸配列の両方の鎖を開裂する酵素を指す。
「核酸」および「ポリヌクレオチド」なる用語は、直鎖または環状配座、および単一または二本鎖いずれかの形のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるべきではない。該用語は、天然のヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する；すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対合する。
「ヌクレオチド」なる用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）、ヌクレオチド異性体、またはヌクレオチド類似体であってもよい。ヌクレオチド類似体は、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基または修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、天然のヌクレオチド（例えば、イノシン、プソイドウリジン等）または非天然のヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分への修飾の非限定的な例は、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、ならびに塩基の炭素および窒素原子の他の原子（例えば、７－デアザプリン）での置換を含む。ヌクレオチド類似体は、ジデオキシヌクレオチド、２′－Ｏ－メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノも含む。
「ポリペプチド」および「タンパク質」なる用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質」なる用語は、染色体ＤＮＡ中の特異的標的配列に結合するように操作され、かつ該標的配列でのまたはその近くの該ＤＮＡまたはＤＮＡに関連するタンパク質を修飾するタンパク質を指す。
本明細書で使用される「配列同一性」なる用語は、実質的に等しい長さの２つの配列間の同一性の程度の定量的尺度を示す。核酸配列かアミノ酸配列かにかかわらず、２つの配列のパーセント同一性は、２つの整列した配列間の正確な一致の数をより短い配列の長さで除算し、１００を掛けたものである。核酸配列のおおよそのアラインメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)の局所相同性アルゴリズムにより提供される。該アルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAにより開発されたスコアリングマトリックスを使用して、アミノ酸配列に適用され、そしてGribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)により正規化されることができる。配列のパーセント同一性を決定するための該アルゴリズムの例示的な実装は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」実用出願におけるGenetics Computer Group (Madison, Wis.)により提供される。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の適切なプログラムは、一般に当技術分野で既知であり、例えば、別のアライメントプログラムはデフォルトのパラメータとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメータを使用して使用できる：genetic code=standard; filter=none; strand=both; cutoff=60; expect=10; Matrix=BLOSUM62; Descriptions=50 sequences; sort by=HIGH SCORE; Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋウェブサイトで見出すことができる。一般に、置換は保存的アミノ酸置換であり：グループ１：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；グループ２：セリン、システイン、スレオニン、およびメチオニン；グループ３：プロリン；グループ４：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；グループ５：アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミンのメンバー内の交換に限定される。
「標的配列」、「標的染色体配列」、および「標的部位」なる用語は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が標的化される染色体ＤＮＡ中の特異的配列、および該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がＤＮＡまたは該ＤＮＡと関連するタンパク質を修飾する部位を指すために、交換可能に使用される。
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術は、当該分野で既知である。典型的には、かかる技術は、遺伝子のためのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列は、該方法で決定され、そして比較されることもできる。
一般に、同一性は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列それぞれの正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、パーセント同一性を決定することにより比較されることができる。
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の細胞および方法において種々の変化がなされることができるため、上の説明および以下に与えられる実施例に含有される全ての事項が、限定的な意味ではなく、例示として解釈されるべきであることが意図される。
実施例
以下の実施例は、本開示の特定の局面を実証する。表１は、ヌクレオソーム相互作用ドメインのペプチド配列を列挙し、表２は、以下に示される実施例１～８において使用される標的染色体配列を示す。






実施例１．ヒトＨＭＧＢ１ボックスＡドメインを使用したStreptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)活性の改善
ヒトＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン（配列番号：４０）を、Ｃａｓ９およびＨＭＧＢ１ボックスＡドメインとの間のリンカーＬＥＧＧＧＳ（配列番号：１）を用いて、ヌクレアーゼカルボキシル末端でＳｐＣａｓ９（＋ＮＬＳ）と融合させた。ヒトＫ５６２細胞（１ｘ１０６）を、融合タンパク質または野生型ＳｐＣａｓ９タンパク質をコードするモル当量のプラスミドＤＮＡ（融合タンパク質および野生型Ｃａｓ９タンパク質それぞれについて、５．２および５．０μｇ）をヒトシトクロムｐ４５０酸化還元酵素（ＰＯＲ）遺伝子座におけるゲノム部位（＃１）を標的とするための３μｇのｓｇＲＮＡプラスミドと組み合わせて用いて、核酸導入した。核酸導入を、Ａｍａｘｉ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の３日後、細胞をＤＮＡ抽出溶液（ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＴＭ）を用いて溶解させ、標的化されたゲノム領域をＰＣＲ増幅した。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ標的開裂活性（％インデル）を、Ｃｅｌ－Ｉアッセイを使用して測定した。表３に示すように、ヒトＨＭＧＢ１ボックスＡドメインと抗原との融合は、標的部位でのＳｐＣａｓ９開裂効率を増加させた。

実施例２．ヒトＨＭＧＮ１、ＨＭＧＮ２、ＨＭＧＮ３ａ、およびＨＭＧＮ３ｂを使用したStreptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)活性の改善
ヒトＨＭＧＮ１、ＨＭＧＮ２、ＨＭＧＮ３ａ、およびＨＭＧＮ３ｂ（それぞれ配列番号：４１－４４）を、Ｃａｓ９および該ＨＭＧＮペプチドのそれぞれとの間のリンカーＬＥＧＧＧＳ（配列番号：１）を用いて、それぞれ、ヌクレアーゼカルボキシル末端でＳｐＣａｓ９（＋ＮＬＳ）と融合させた。ヒトＫ５６２細胞（１ｘ１０６）を、ヒトシトクロムｐ４５０酸化還元酵素（ＰＯＲ）遺伝子座におけるゲノム部位（＃１）を標的とするためのｓｇＲＮＡプラスミド３μｇと組み合わせて、融合タンパク質のそれぞれまたは野生型ＳｐＣａｓ９タンパク質をコードするモル当量のプラスミドＤＮＡ（融合タンパク質および野生型Ｃａｓ９タンパク質について、それぞれ５．２および５．０μｇ）を用いて核酸導入した。核酸導入を、Ａｍａｘｉ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の３日後、細胞をＤＮＡ抽出溶液（ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＴＭ）を用いて溶解させ、標的化されたゲノム領域をＰＣＲ増幅した。Ｃａｓ９標的開裂活性（％インデル）を、Ｃｅｌ－Ｉアッセイを使用して測定した。結果は、表４に要約されるように、ヒトＨＭＧＮペプチドのそれぞれのヌクレアーゼとの融合が、標的部位でのＳｐＣａｓ９開裂効率を増加させたことを示す。

実施例３．ヒトヒストンＨ１中央グロビュールドメインを使用したStreptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)活性の改善
ヒトヒストンＨ１中央グロビュールドメイン（配列番号：４５）を、Ｃａｓ９およびグロビュールドメインとの間のリンカーＬＥＧＧＧＳ（配列番号：１）を用いて、ヌクレアーゼカルボキシル末端でＳｐＣａｓ９（＋ＮＬＳ）と融合させた。ヒトＫ５６２細胞（１ｘ１０６）を、ヒトシトクロムｐ４５０酸化還元酵素（ＰＯＲ）遺伝子座におけるゲノム部位（＃１）を標的とするためのｓｇＲＮＡプラスミド３μｇと組み合わせて、融合タンパク質または野生型ＳｐＣａｓ９タンパク質をコードするモル当量のプラスミドＤＮＡ（融合タンパク質および野生型Ｃａｓ９タンパク質について、それぞれ５．２および５．０μｇ）を用いて核酸導入した。核酸導入を、Ａｍａｘｉｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の３日後、細胞をＤＮＡ抽出溶液（ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＴＭ）を用いて溶解させ、標的化されたゲノム領域をＰＣＲ増幅した。Ｃａｓ９標的開裂活性（％インデル）を、Ｃｅｌ－Ｉアッセイを使用して測定した。結果を表５に示す。ヒトヒストンＨ１中央グロビュールドメインのヌクレアーゼとの融合は、標的部位でのＳｐＣａｓ９開裂効率を増加させた。

実施例４．クロマチンリモデリングタンパク質ＤＮＡ結合ドメインを使用したStreptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)活性の改善
ＳｐＣａｓ９（＋ＮＬＳ）を、Ｃａｓ９およびＤＮＡ結合ドメインとの間のリンカーＴＧＳＧ（配列番号：２）を用いて、酵母ＩＳＷＩクロマチンリモデリング複合体ＡＴＰアーゼＩＳＷ１（配列番号：４６）のＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼアミノ末端で融合した。独立して、野生型ＳｐＣａｓ９を、ヒトシトクロムｐ４５０酸化還元酵素（ＰＯＲ）遺伝子座におけるゲノム部位（＃１）を標的とするためのｓｇＲＮＡプラスミド３μｇと組み合わせて、Ｃａｓ９およびＤＮＡ結合ドメインとの間のリンカーＬＥＧＧＧＳ（配列番号：１）を用いて、酵母クロモドメイン含有タンパク質１（ＣＨＤ１）（配列番号：４７）のＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼカルボキシル末端で融合した。ヒトＫ５６２細胞（１ｘ１０６）を、融合タンパク質のそれぞれまたは野生型ＳｐＣａｓ９タンパク質をコードするモル当量のプラスミドＤＮＡ（融合タンパク質および野生型Ｃａｓ９タンパク質について、それぞれ６．０および５．０μｇ）を用いて核酸導入した。核酸導入を、Ａｍａｘｉ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の３日後、細胞をＤＮＡ抽出溶液（ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＴＭ）を用いて溶解させ、標的化されたゲノム領域をＰＣＲ増幅した。Ｃａｓ９標的開裂活性（％インデル）を、Ｃｅｌ－Ｉアッセイを使用して測定した。結果は、表６に要約されるように、ＤＮＡ結合ドメインのそれぞれのヌクレアーゼとの融合が、標的部位でのＳｐＣａｓ９開裂効率を増加させたことを示す。

実施例５．ヌクレオソーム相互作用ドメインの組み合わせを使用したStreptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)活性の改善
ＳｐＣａｓ９（＋ＮＬＳ）を、ヒトシトクロムｐ４５０酸化還元酵素（ＰＯＲ）遺伝子座におけるゲノム部位（＃１、＃２、＃３）、またはヒト核受容体サブファミリー１グループＩメンバー３（ＣＡＲ）遺伝子座におけるゲノム部位（＃１）、またはヒト空白気門ホメオボックス１（ＥＭＸ１）遺伝子座におけるゲノム部位（＃１、＃２）を標的とするためのｓｇＲＮＡプラスミド３μｇと組み合わせて、Ｃａｓ９およびＨＭＧＮ１との間のリンカーＴＧＳＧ（配列番号：２）を用いて、ヒトＨＭＧＢ１（配列番号４１）とヌクレアーゼアミノ末端で、およびＣａｓ９およびタンパク質ドメインのぞれぞれの間のリンカーＬＥＧＧＧＳ（配列番号：１）を用いて、ヒトＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン（配列番号：４０）またはヒトヒストンＨ１中央グロビュールドメイン（配列番号：４５）または酵母クロモドメイン含有タンパク質１（ＣＨＤ１）ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号：４７）とヌクレアーゼカルボキシル末端で融合させた。ヒトＫ５６２細胞（１ｘ１０６）を、融合タンパク質のそれぞれまたは野生型ＳｐＣａｓ９タンパク質をコードするモル等量のプラスミドＤＮＡ（ＨＭＧＢ１ボックスＡおよびＨ１中央グロビュールドメイン融合タンパク質について５．４μｇ、ＣＨＤ１ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質について６．０μｇ、および野生型Ｃａｓ９タンパク質について５．０μｇ）を用いて核酸導入した。核酸導入を、Ａｍａｘｉ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の５日後、細胞をＤＮＡ抽出溶液（ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＴＭ）を用いて溶解させ、各標的化されたゲノム領域をＰＣＲ増幅した。Ｃａｓ９標的開裂活性（％インデル）を、Ｃｅｌ－Ｉアッセイを使用して測定した。結果は、表７に要約されるように、これらのタンパク質ドメインのヌクレアーゼとの組み合わせ融合が、標的部位でのＳｐＣａｓ９開裂効率を増加させたことを示す。

実施例６．ヌクレオソーム相互作用ドメインの組み合わせを使用したStreptococcus pasteurianus Cas9 (SpaCas9)活性の改善
Streptococcus pasteurianus Cas9（SpaCas9）（+NLS）を、ヒトシトクロムｐ４５０酸化還元酵素（ＰＯＲ）遺伝子座におけるゲノム部位（＃１、＃２）を標的とするためのｓｇＲＮＡプラスミド３μｇと組み合わせて、Ｃａｓ９およびＨＭＧＮ１との間のリンカーＴＧＳＧ（配列番号：２）を用いて、ヒトＨＭＧＮ１（配列番号：４１）とヌクレアーゼアミノ末端で、およびＣａｓ９およびタンパク質ドメインのそれぞれの間のリンカーＬＥＧＧＧＳ（配列番号：１）を用いて、ヒトＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン（配列番号：４１）またはヒトヒストンＨ１中央グロビュールドメイン（配列番号：４５）または酵母クロモドメイン含有タンパク質１（ＣＨＤ１）ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号：４７）とヌクレアーゼカルボキシル末端で融合させた。ヒトＫ５６２細胞（１ｘ１０６）を、融合タンパク質のそれぞれまたは野生型ＳｐａＣａｓ９タンパク質をコードするモル当量のプラスミドＤＮＡ（融合タンパク質および野生型Ｃａｓ９タンパク質について、それぞれ５．４および５．０μｇ）を用いて核酸導入した。核酸導入を、Ａｍａｘｉ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の３日後、細胞をＤＮＡ抽出溶液（ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＴＭ）を用いて溶解させ、標的化されたゲノム領域をＰＣＲ増幅した。Ｃａｓ９標的開裂活性（％インデル）を、Ｃｅｌ－Ｉアッセイを使用して測定した。表８に要約されるように、これらのタンパク質ドメインのヌクレアーゼとの組み合わせ融合は、標的部位でのＳｐａＣａｓ９開裂効率を増加させた。

実施例７．ヌクレオソーム相互作用ドメインの組み合わせを使用したFrancisella novicida Cpf1 (FnCpf1)活性の改善
Francisella novicida Cpf1（FnCpf1）（+NLS）を、Ｃｐｆ１およびＨＭＧＮ１との間のリンカーＴＧＳＧ（配列番号：２）を用いて、ヒトアミノＨＭＧＮ１（配列番号：４１）とヌクレアーゼアミノ末端で、およびＣｐｆ１およびタンパク質ドメインのそれぞれとの間のリンカーＬＥＧＧＧＳ（配列番号：１）を用いて、ヒトＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン（配列番号：４０）またはヒトヒストンＨ１中央グロビュールドメイン（配列番号：４５）または酵母クロモドメイン含有タンパク質１（ＣＨＤ１）ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号：４７）とヌクレアーゼカルボキシル末端で融合させた。ヒトＫ５６２細胞（１ｘ１０６）を、ヒトシトクロムｐ４５０酸化還元酵素（ＰＯＲ）遺伝子座におけるゲノム部位（＃１、＃２、＃３）を標的とするためのｓｇＲＮＡプラスミド３μｇとの組み合わせにおいて、融合タンパク質のそれぞれまたは野生型ＦｎＣｐｆ１タンパク質をコードするモル当量のプラスミドＤＮＡ（融合タンパク質および野生型Ｃａｓ９タンパク質のそれぞれで５．４および５．０μｇ）を用いて核酸導入した。核酸導入を、Ａｍａｘｉ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の３日後、細胞をＤＮＡ抽出溶液（ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＴＭ）を用いて溶解させ、標的化されたゲノム領域をＰＣＲ増幅した。Ｃａｓ９標的開裂活性（％インデル）を、Ｃｅｌ－Ｉアッセイを使用して測定した。結果は、表９に要約されるように、これらのタンパク質ドメインのヌクレアーゼとの組み合わせ融合が、標的部位でのＦｎＣｐｆ１開裂効率を増加させたことを示す。

実施例８．Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9)遺伝子編集効率の改善
Campylobacter jejuni Cas9(CjCas9)(+NLS)を、Ｃａｓ９およびＨＭＧＮ１との間のリンカーＴＧＳＧ（配列番号：２）を用いて、ヒトアミノＨＮＧ１（配列番号：４１）とヌクレアーゼアミノ末端で、およびＣａｓ９およびタンパク質ドメインのそれぞれとの間のリンカーＬＥＧＧＧＳ（配列番号：１）を用いて、ヒトＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン（配列番号：４０）またはヒトヒストンＨ１中央グロビュールドメイン（配列番号：４５）とヌクレアーゼカルボキシル末端で融合させた。野生型ＣｊＣａｓ９ ｇＲＮＡを、ｃｒＲＮＡ定常反復領域中にＵからＣへの変異を導入し、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の５’領域中に対応するＡからＧへの変異を導入することにより修飾した。修飾されたｓｇＲＮＡ配列は次のとおりである。
［ここで、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ部分における変異したヌクレオチドに下線が引かれる。］
ヒトシトクロムｐ４５０酸化還元酵素遺伝子（ＰＯＲ）における２つの異なる部位（＃１、＃２）を標的とするガイド配列を、それぞれ野生型および修飾されたＣｊＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ骨格にクローン化した。ｓｇＲＮＡの発現を、Ｕ６プロモーターの制御下にした。ヒトＫ５６２細胞（１ｘ１０６）を、ＣｊＣａｓ９プラスミドＤＮＡ４μｇおよびｓｇＲＮＡプラスミドＤＮＡ３μｇを用いて核酸導入した。核酸導入を、Ａｍａｘｉ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の３日後、細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔを用いて溶解させ、標的化されたゲノム領域をＰＣＲ増幅した。ＣｊＣａｓ９標的ＤＮＡ開裂活性（％インデル）を、Ｃｅｌ－Ｉアッセイを使用して測定した。結果は図１に示され、融合タンパク質が標的部位での開裂効率を増加させたこと、および修飾されたＣｊＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ骨格が標的部位でのＣｊＣａｓ９開裂効率を効果的に増加させたことを示す。
表１０は、特異的融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは太字で示され、リンカーは斜体で示され、ＮＬＳには下線が引かれている。









Claims (17)

  1. 少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインに連結されるクラスター化規則的散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、
    ここで該ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼであるかまたは、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼまたはニッカーゼであり、および
    ここで該融合タンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含み、および
    ここで該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、ＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン、ＨＭＧＮ１タンパク質、ＨＭＧＮ２タンパク質、ＨＭＧＮ３ａタンパク質、ＨＭＧＮ３ｂタンパク質、ヒストンＨ１中央グロビュールドメイン、模倣スイッチ（ＩＳＷＩ）タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、クロモドメイン－ヘリカーゼ－ＤＮＡタンパク質１（ＣＨＤ１）ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの組み合わせである、融合タンパク質。
  2. 該ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、全てのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾され、かつ非ヌクレアーゼドメインに連結されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質、または全てのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾され、かつ非ヌクレアーゼドメインに連結されるＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１タンパク質である、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 該非ヌクレアーゼドメインが、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、請求項２に記載の融合タンパク質。
  4. 該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、化学結合を介して直接的に、リンカーを介して間接的に、またはそれらの組み合わせにより該ＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結される、および/または該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、そのＮ末端、Ｃ末端、内部位置またはそれらの組み合わせで該ＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結される、請求項１－３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  5. 少なくとも１つの核局在化シグナルを含む、請求項１－４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  6. 該ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)、Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9)、Streptococcus pasteurianus (SpaCas9)、Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9)、 Staphylococcus aureus (SaCas9)、Francisella novicida Cas9 (FnCas9)、Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9)、Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9)、Francisella novicida Cpfl (FnCpf1)、Acidaminococcus sp. Cpfl (AsCpf1)、またはLachnospiraceae 細菌ND2006 Cpfl (LbCpf1)である、請求項１に記載の融合タンパク質。
  7. 該融合タンパク質が、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、または配列番号：７９と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する；または、該融合タンパク質が、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、または配列番号：７９に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
  8. 請求項１－７のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸であって、真核細胞における翻訳のためにコドン最適化され、および/またはウイルスベクター、プラスミドベクター、または自己複製ＲＮＡの一部である、核酸。
  9. 請求項１－７のいずれか一項に記載の少なくとも１つの融合タンパク質および少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む、複合体。
  10. 請求項１－７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項８に記載の核酸または請求項９に記載の複合体を含む、キット。
  11. 請求項１－７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項８に記載の核酸または請求項９に記載の複合体を含む、真核細胞。
  12. 真核細胞における標的化されたゲノムまたはエピジェネティックな修飾の効率を増加させるための方法であって、該方法は、該真核細胞中へ、
    （ａ）少なくとも１つの融合タンパク質または少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸であって、各融合タンパク質は、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインに連結されたＣＲＩＳＰＲタンパク質を含み、ここで該ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、（ｉ）ヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有するかまたは（ｉｉ）全てのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾され、かつ非ヌクレアーゼドメインに連結され、ここで該ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆｌタンパク質であり、およびここで該少なくとも１つの融合タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、融合タンパク質または核酸；
    （ｂ）少なくとも１つのガイドＲＮＡまたは少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする核酸を導入することを含み；
    ここで該少なくとも１つの融合タンパク質の該ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、標的染色体配列に標的化され、かつ該少なくとも１つの融合タンパク質の該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヌクレオソームまたはクロマチン構造を変え、その結果該少なくとも１つの融合タンパク質は該標的染色体配列への増加したアクセスを有し、それにより標的化されたゲノムまたはエピジェネティックな修飾の効率が増加し、
    ここで該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、ＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン、ＨＭＧＮ１タンパク質、ＨＭＧＮ２タンパク質、ＨＭＧＮ３ａタンパク質、ＨＭＧＮ３ｂタンパク質、ヒストンＨ１中央グロビュールドメイン、模倣スイッチ（ＩＳＷＩ）タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、クロモドメイン－ヘリカーゼ－ＤＮＡタンパク質１（ＣＨＤ１）ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの組み合わせであり、および
    ここで該真核細胞がインビボでありヒト細胞である場合を除く、方法。
  13. 該非ヌクレアーゼドメインが、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、請求項１２に記載の方法。
  14. 該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、化学結合を介して直接的に、リンカーを介して間接的に、またはそれらの組み合わせにより該ＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結される；および/または該少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、そのＮ末端、Ｃ末端、内部位置またはそれらの組み合わせで該ＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結される、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 該少なくとも１つの融合タンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナルを含む、請求項１２－１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 該少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸が、真核細胞における翻訳のためにコドン最適化される、および/または該少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸が、ウイルスベクター、プラスミドベクター、または自己複製ＲＮＡの一部である、請求項１２－１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 少なくとも１つのドナー配列を含む少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを該真核細胞中へ導入することをさらに含む、請求項１２－１６のいずれか一項に記載の方法。
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